抗流感病毒中和抗体克隆与改造新方法探索研究

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分类号：R392密级：公开UDC：614.47编号：2015215087G硕士学位论文抗流感病毒中和抗体克隆与改造新方法探索研究研究生：张敏聪导师：陈凌研究员申请学位级别：理学硕士年级：二零一五级学科专业：生物化学与分子生物学研究方向：医学免疫学论文提交日期：2018年5月论文答辩日期：2018年5月学位类型：科研型学位授予单位：广州医科大学答辩委员：二〇一八年五月 学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。文中依法引用他人的成果、对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。本人如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果：1．交回学校授予的学位证书；2．学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报；3．本人按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道歉。4．本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。论文作者签名：日期：年月日学位论文知识产权权属声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属广州医科大学及附属单位。广州医科大学及附属单位享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为广州医科大学及附属单位。任何其他收存和保管本论文的单位和个人，未经本论文作者、导师授权，不得将本论文转借他人、复制、抄录或以其他任何方式传播，否则，引起有碍作者的著作权益问题，将会追究相应的法律责任。论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日学位论文使用授权声明1、学校可以保留本论文的原件及复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库，可以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存、汇编学位论文；2、本人授权学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。送交学位论文时间选择（请在下面相应栏内打“√”）：①答辩后即可送：是否②延迟一年后送：③延迟二年后送：④延迟三年后送：论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日 硕士学位论文抗流感病毒中和抗体克隆与改造新方法探索研究Researchoninfluenzavirusneutralizingantibodycloningandnewmethodformodification学位申请人：张敏聪学号：2015215087专业名称：生物化学与分子生物学研究方向：医学免疫学导师：陈凌研究员指导老师：李楚芳助理研究员导师单位：呼吸疾病国家重点实验室广州医科大学-广州二零一八年五月 目录主要缩略词....................................................................................................................I中文摘要........................................................................................................................1ABSTRACT..................................................................................................................3前言............................................................................................................................61流感病毒概述.........................................................................................................62流感单克隆抗体研发进展.....................................................................................93流感单克隆抗体筛选技术...................................................................................104双特异性抗体特点与应用...................................................................................12第一章荧光流感病毒微量中和试验筛选单克隆中和抗体..................................141.1材料与设备.......................................................................................................141.2试验方法............................................................................................................161.3结果...................................................................................................................311.4讨论与小结........................................................................................................38第二章构建抗流感病毒双特异抗体........................................................................402.1材料与设备........................................................................................................402.2实验方法............................................................................................................412.3结果...................................................................................................................482.4讨论与小结........................................................................................................50全文总结......................................................................................................................52参考文献......................................................................................................................53综述..........................................................................................................................59研究成果......................................................................................................................65致谢..........................................................................................................................66 广州医科大学硕士学位论文主要缩略词英文缩写英文全称中文全称MabMonoclonalAntibody单克隆抗体nAbsNeutralizingantibodies中和抗体HAHemagglutinin血凝素蛋白PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链反应BioluminescentbasedBMN荧光病毒微量中和试验microneutralizationassayEnzyme-LinkedImmunoSorbentELISA酶联免疫吸附测定AssaySodiumdodecylsμLfate十二烷基硫酸钠聚丙烯酰SDS-PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis胺凝胶电泳HAIHemagglutinationInhibitionTest血凝抑制试验EBVEpseeinbarrvirusEB病毒PBMCPeripherialbloodmononuclearcell外周血单核细胞DμLbecco'sModifiedEagle'sDMEM达尔伯克改良基础培养基MediumMDCKMadin-Derbycaninekidney日本犬肾细胞BSABovineSerumAlbumin牛血清白蛋白FBSFetalBovineSerum胎牛血清ODOpticaldensity光密度IL-6Interleukin6白介素6IL-21Interleukin21白介素21IgImmunoglobμLin免疫球蛋白I 广州医科大学硕士学位论文抗流感病毒中和抗体克隆与改造新方法探索研究专业：生物化学与分子生物学硕士研究生：张敏聪导师：陈凌研究员中文摘要研究背景流感是危害人类健康的重大社会公共卫生问题，每年在世界范围内造成25-50万人死亡[1]。近年来报道的H1N1、H5N1、H7N9等流感疫情，更是向流感病毒防治的研究发出严重挑战。由于流感疫苗保护效果的不稳定性，以及抗流感病毒药物的疗效受限于严重的耐药问题，特别是流感重症病患的救治缺乏有效的治疗措施，抗病毒中和抗体被认为是一种更具潜力的治疗手段，通过优化单克隆抗体分离克隆技术以及抗体改造，是获得更好保护效果的中和抗体的更有效的研发策略。当前，基于荧光素酶的病毒中和实验和双异性抗体改造技术是用于抗体研发的重要方法。研究目的与方法本研究主要利用荧光流感病毒（IAV-Luc）微量中和的抗体筛选方法（BMN），并结合浆细胞单细胞培养和单细胞PCR技术，分离克隆抗流感中和抗体。同时使用DVD-Ig和Cross-Mab双特异抗体构建技术，研发可中和两种流感病毒的双特异性抗体。1.从免疫了季节性流感疫苗的志愿者外周血中分离浆母细胞，在含有IL-6的浆细胞培养体系中进行单细胞体外培养，使用低病毒量的荧光流感病毒微量中和法（BMN）筛选培养上清，对具有中和活性的孔细胞进行单细胞PCR获得抗体基因，抗体表达后进行HAI、病毒中和、抗原结合等活性分析检测。2.利用DVD-Ig和Cross-Mabs两种双特异抗体构建技术，将分别针对1 广州医科大学硕士学位论文H1/California/7/2009和H5/HongKong/482/1997的中和抗体206与4E6的重链可变区和轻链可变区构建成双特异抗体，并比较单克隆抗体母本与双特异抗体的病毒中和和抗原结合活性的变化。研究结果：成功建立了利用BMN法测定单个浆细胞培养上清病毒中和活性的方法，并从病毒中和活性阳性的单个浆细胞中成功分离克隆获得了8株针对H1/CA09的中和抗体（Ab-2C、4E、3A、5A、B1、D5、4A、D7），而且Ab-2C、4E、3A、5A、B1、D5具有强中和H1/CA09病毒的活性，8个抗体均有H1/CA09HA蛋白的结合活性。Ab-2C、4E、3A、4A和5A具有血凝抑制活性，表明它们是抗HA球部抗体。利用DVD-Ig或Cross-Mab双特异性抗体构建技术，成功构建体具备了针对H1/CA09和H5/HK97两种亚型流感病毒的双特异中和抗体。与母本抗体相比，双特异性抗体的病毒中和活性下降，而且基于Cross-Mab技术的双特异性抗体下降更明显。结论：直接利用单细胞PCR从单个B淋巴细胞中克隆抗体基因工作量大、效率低，而使用荧光流感病毒微量中和法测定单个B淋巴细胞培养上清的抗病毒中和活性，再从具有中和活性的B细胞中克隆抗体基因，可以提高获得中和抗体的效率，降低工作量。为后续的抗流感病毒中和抗体研发提供了一个高效的工具。同时，成功构建了基于DVD-Ig和Cross-Mab技术的抗H1/CA09和H5/HK97双特异性中和抗体，为开发针对不同亚型流感病毒的广谱中和抗体奠定了技术基础。关键词：流感病毒；单克隆抗体；广谱活性；荧光素酶；微量中和；双特异抗体2 广州医科大学硕士学位论文ResearchoninfluenzavirusneutralizingantibodycloningandnewmethodformodificationABSTRACTBackgroupInfluenzaisamajorsocialandpublichealthproblemwhichendangeringhumanhealth.Evenseasonalinfluenzakills25-50thousandspeopleworldwideeveryyear.Inrecentyears,theemergenceofH1N1,H5N1,H7N9epedemicchallengedtheepedemicpreventionandcontrol.Sincetheinfluenzavaccineprovideslimitedprotection,anti-influenzavirusmedicineissubjectedtoseriousdrugresistantmutation,especiallythereislackofeffectivetreatmentmeasuresforsevereinfluenzapatients,anti-viralneutralizationantibodyisconsideredtobeamorepotentialmedicine.Thestrategiesareimportanttodevelopneutralizingantibodieswithbetterprotectiveeffects,includingantibodymodificationandoptimizationofantibodyisolationandcloningtechnology.Currently,Luciferaseviralneutralizationassayandbispecificantibodymodificationareimportantmethodsforantibodyresearchanddevelopment.ObjectiveandMethodsInthisstudy,combinedwithsinglecellcultureofplasmacellandsinglecellPCRtechnique,themicroneutralizationantibodyscreeningassay(BMN)withinfluenzaLuciferasevirus(IAV-Luc)wasoptimizedtoisolateandcloneantiinfluenzaneutralizationantibody.Atthesametime,wedevelopeddoublespecificantibodyagainsttwosubtypesofinfluenzaviruswithDVD-IgandCross-Mabtechniques.1．Theplasmacellswereisolatedfromtheperipheralbloodofthevolunteersimmunizedwithseasonalinfluenzavaccine,andthesinglecellswerecultureinamediumwithIL-6.Theantiviralactivityofculturesupernatantwasdetectedbythe3 广州医科大学硕士学位论文microneutralizationassay(BMN)withalowtitervirus.TheantibodygenesinthewellwithneutralizationactivitywereclonedbysinglecellPCRandinsertedintoaexpressionvector.TheclonedantibodieswerecharacterizedbyHAI,virusneutralization,antigenbindingassay.2．ByusingvariableregionofheavychainandlightchainofantibodyA206(neutralizingH1/California/7/2009)and4E6(neutralizingH5/HongKong/482/1997),twobispecificantibodieswereconstructedwithtechniquesofDVD-IgorCross-Mabs.TheactivityofbispecificantibodieswerecomparedtoA206and4E6withtheviralneutralizationandantigenbindingassay.ResμLtsABMNassaywassuccessfullyestablishedtodeterminetheneutralizationactivityinthecμLturesupernatantofsingleplasmacell.Wecloned8neutralizationantibodiesagainstH1/CA09(Ab-2C,4E,3A,5A,B1,D5,4A,D7)fromthesingleplasmacellwithviralneutralizationactivity.Allthe8antibodiescouldbindHAproteinofH1/CA09andneutralizeH1/CA09virus.TheantibodiesAb-2C,4E,3A,4Aand5Ahadhemagglutinationinhibitoryactivity,whichindicatingthattheyrecognizedreceptorbindingsiteofHAsphere.UsingDVD-IgorCross-Mabtechnique,wesuccessfullyconstructedtwobispecificantibodiesagainsttwosubtypesofinfluenzavirusesH1/CA09andH5/HK97.Comparedtomaternalantibodies,thevirusneutralizationactivityoftwobispecificantibodiesdecreased,andwhichdecreasedmoresignificantlyofthebispecificantibodybasedonCross-Mabtechnique.ConclusionsThedirectuseofsinglecellPCRtocloneneutralizationantibodygenesfromasingleBlymphocytewasheavyworkloadandlowefficient.AfterscreeningneutralizationactivityofasingleBlymphocyteculturesupernatantbythemicroneutralizationassay,itreducedtheworkloadandimprovedefficienttocloneantibodygenefromtheBcellswithneutralizationactivity.Itprovidedanefficienttoolforthesubsequentresearchanddevelopmentofneutralizingantibodiesagainstinfluenzaviruses.Thesuccessfulconstructionofanti-H1/CA09andH5/HK974 广州医科大学硕士学位论文bispecificneutralizingantibodieswithDVD-IgandCross-Mabtechniqueslaidatechnicalbasis,whichwouldbehelpfultodevelopbroad-spectrumneutralizingantibodiesagainstdifferentsubtypeofinfluenzaviruses.Keyword：influenzavirus,monoclonalantibody,broad-spectrumactivity,Luciferase,microneutralization,dispecificantibody5 广州医科大学硕士学位论文前言1流感病毒概述1.1流感病毒的基本特点流行性感冒病毒(influenzavirus)，即流感病毒，是引起流感(influenza)的病原体[1]。流感病毒属于正粘病毒科（orthomyxoviridae），是一种单股、负链、分节段的RNA病毒[2]。流感病毒粒子大小在80-120nm，呈球状或者丝状，一般初次分离的病毒株为多形性，经过细胞或者鸡胚传代后的实验室适应株多为球状[3]。根据核蛋白（NP）和基质蛋白（M）的抗原性，流感病毒可分为三个种类型，分别为A、B和C型流感病毒，其中以A型流感毒流行性最强，能够引起季节性流感以及流感大流行。而A型流感病毒根据其表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同，进一步分为18个HA亚型（H1-H18）以及11个NA亚型（N1-N11）。同时，根据HA的系统进化关系可将A型流感病毒分为两组，分别为group1和group2（图1）[4][5]。目前，H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7已被确认能够感染人类[6]。A型流感病毒基因组由8条负链RNA节段组成，分别编码PB2、PB1、PB1F2、N40、PA、PA-X、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、NS2共13个流感病毒结构和非结构蛋白[7]（图2）。其中M2、HA和NA蛋白是研究的热点。M2蛋白分布于病毒包膜，具有离子通道活性，在病毒的脱衣壳和RNP释放过程中起着重要作用，最近研究发现M2蛋白能阻断宿主细胞自噬体跟溶酶体的融合，抑制细胞自噬体的降解[9][10]。因此，金刚烷胺和金刚乙胺可抑制M2离子通道活性而成为抗流感的重要治疗药物，但因广泛的耐药而停用。NA是一个具有催化活性的蘑菇状四聚体蛋白，能催化切开多种唾液酸残基，促使流感病毒释放和传播[11]。NA神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦、扎那米韦是临床上的重要抗流感药物。HA（血凝素）和NA（神经氨酸酶）是流感病毒粒子外表面的糖蛋白突起，是流感病毒的主要抗原蛋白，但是容易发生抗原漂移和抗原转换导致抗原性改变[12]。HA蛋白是一个三聚体分子，嵌合在病毒包膜上，主要介导流感病毒与宿主细胞表面唾液酸受体的结合，以及病毒粒子穿膜[13].在病6 广州医科大学硕士学位论文毒感染细胞过程中，无活性的HA0分子被裂解成HA1和HA2，从而介导病毒与细胞膜结合与融合，这一过程赋予流感病毒感染性[3]。HA蛋白成为目前流感疫苗研发的主要靶抗原，针对HA的中和抗体可阻断病毒的感染。因为流感病毒的高度变异性，针对HA的广谱中和抗体成为了近年来的研发焦点[14]。图1.1A型流感病毒分组[5]图1.2流感病毒粒子结构示意图[8]1.2流感病毒的流行病学与危害感染流感病毒可引起发热、流鼻水、咳嗽、咽喉痛、肌痛及头痛等症状，症状一般持续1-2周，少部分病例出现休克、高热、弥漫性血管内出血症状，还可能诱发次级细菌性肺炎、毒性肺炎等并发症[15][16]。每年流感季节，全球高达500万严重感染病例，造成25-50万人死亡[17]。除了季节性流感，流感病毒抗原转换可以引发流感大流行，人类历史上出现的多次流感大流行造成成千上万人死亡，特别是1918年的西班牙流感H1N1，超过5亿人患病，2000-5000万人死亡，超过了一战的死亡人数[18]。随后的1958年亚洲流感H2N2，1969年的香港流感H3N2，也造成100万人丧生[19]。而距今最近的2009年H1N1甲型流感（简称pdm09H1N1），蔓延214个国家，给人类的生命健康和经济造成重大损害[20]。近几年来，禽流感跨越种间屏障感染人的报道不断出现，如1997年香港H5N1禽流感，2013年安徽H7N9禽流感，死亡率甚至高于1918年西班牙流感[21]。因此，针对流感病毒的预防与治疗方面的研究极具挑战性，而且意义重大。7 广州医科大学硕士学位论文1.3流感的预防与治疗季节性流感与流感大流行对社会危害和造成的损失的严重性决定了流感防治研究工作的迫切性。人体普遍对流感病毒易感，其中儿童、孕妇、老年人和慢性基础疾病患者，病情容易发展为重症[22]。因此，做好流感预防与治疗方面的研究工作在公共卫生建设中尤为重要。接种流感疫苗是目前预防流感的主要手段，WHO从1973年开始，每年预测并推荐使用由不同亚型流感病毒株组成的多价疫苗[23]。目前我国主要使用季节性流感疫苗，是以H1N1、H3N2和B型流感为靶抗原的三价灭活疫苗(Trivalentinactivatedvaccine，TIV)，流感疫苗的广泛应用降低了全球范围内流感的发病率[24]。然而目前的流感疫苗依然存在不可忽视的缺点：1/WHO对新疫苗的预测存在误测可能性。2/疫苗研发时间长，易错失抗击疫情的最佳时机[23][25]。3/目前推荐使用的流感灭活疫苗主要通过诱导体液免疫实现保护作用，缺乏细胞免疫和粘膜免疫的诱导作用[26]，而且存在引起过敏反应的风险[25]。4/流感疫苗往往不能引起免疫能力低下人群产生有效的保护[27]。流感疫苗研究在保护效果广谱性和准确性上还有很长的路要走。临床上流感病毒的药物治疗的靶点主要是M2和NA蛋白，针对流感病毒M2离子通道蛋白的抑制剂金刚烷胺和金刚乙胺，以及针对流感病毒的NA抑制剂奥司他韦、扎那米韦等，分别通过抑制病毒的复制与释放来实现抗病毒作用[28][29]然而，随着这些药物的使用，流感病毒出现耐药的研究相继被报道。[30][31][32]，耐药株的出现让药物治疗受到了很大的限制。机体在感染流感病毒或者接受流感疫苗免疫后血清中会产生针对病毒的中和抗体。早在1891年，Geissler等首次使用白喉抗毒素血清治愈了白喉患儿，开创了血清治疗的先河[33]。抗血清治疗流感也早有报道，1918年西班牙流感大流行时，就有关于使用流感康复者血清治疗流感患者的观察性研究报道[34]。近年来也有报道使用康复者血清治疗成功救治SARS-CoV[35]、H5N1[36]、H7N9[37]和pdm09H1N1[38]患者。但是，在遇到新发流感或者出现大批病患时，会出现没有康复者血清或者血清不足的情况。而动物如马来源的抗血清在治疗流感病毒感染上可能具有较好的预防和治疗效果，但作为异源性蛋白，来源于动物的血清可能会给患者带来副作用——血清病[39]。基于上述几种流感预防与治疗的不足之处，和流感病毒容易发生变异的特8 广州医科大学硕士学位论文点，流感单克隆抗体的研发工作逐渐成为了流感研究热点，特别是广谱中和抗体。2流感单克隆抗体研发进展流感抗体是机体在病毒感染或疫苗接种后产生的，以抵抗感染的主要免疫效应因子，而流感病毒HA蛋白是机体感染或者免疫后产生中和抗体的主要靶抗原。1975年杂交瘤技术的发明让获得单一表型免疫球蛋白（单克隆抗体）成为可能[40]。在随后的二三十年中，人单克隆抗体分离技术得到了快速的发展，一系列单克隆抗体已被分离出来，并在体内和体外验证功能活性。流感单克隆抗体结构学的研究对疫苗研制有重要的指导意义[41]。HA蛋白分成球部和茎部两部分区域，头部负责与宿主细胞的唾液酸受体结合，茎部介导低PH触发的病毒与细胞膜融合[12]，因此中和抗体与流感病毒HA蛋白的球部或者茎部结合，以抑制病毒与细胞结合或病毒与细胞膜融合[42][43]。针对HA球部的抗体主要靶向结合唾液酸受体结合区域RBS(receptor-bindingsite)，此类抗体体外一般能检测出血凝抑制（HAI）活性。由于HA球部存在容易突变的特性，因此此类抗体的广谱性差。虽然针对球部的广谱中和抗体也已有报道，但只能中和group1和group2的某些亚型的部分毒株[44-46]，这在很大程度上限制了其作为治疗性抗体的应用。HA蛋白的茎部是结构上相对保守的区域，针对茎部的抗体更容易获得更为广谱的中和活性（图3）。机体免疫流感疫苗或者感染流感后主要产生抗球部中和抗体，抗茎部抗体较少[47][48]。而在感染H1N1病毒后产生的抗茎部抗体以抗group1为主，抗group2抗体比例很小[49][50]。目前已报道的C179、F10、CR6261和A06等抗体都是针对group1流感病毒HA茎部的广谱中和抗体，它们靶向结合的茎部抗原表位较为相似，为Trp-1疏水区域和α-螺旋的保守部位[51-54]。针对group2HA茎部的广谱中和抗体：CR8020、CR8043和9H10的结合表位位于HA蛋白的膜近端区域[55-57]，而该区域在group1流感病毒HA蛋白上被高度保守的N-21多聚糖所覆盖，这使得兼有group1和group2广谱中和活性的抗体更加稀有。通过对CR9114,FI6,MEDI8852,39.29,CT149,56.a.09,31.b.09,16.a.26and31.a.831,6.g.07的X-射线结构分析发现，这些抗体能用多种9 广州医科大学硕士学位论文结合方式来应对HA氨基酸多样性以及由group1和group2特异的糖基化而形成的结构限制[58.45.59-62]。由此可见，HA蛋白茎部区域能更容易诱导产生广谱性更好的中和抗体，但是这类抗体的比例非常低，如何通过高效灵敏的方法大量筛选流感中和抗体，或者通过某种方法提高已有抗体的广谱性的探索，将有助于流感病毒广谱中和抗体研发。图1.3抗流感病毒中和抗体特征3流感单克隆抗体筛选技术Ce´sarMilstein和GeorgesJ.F.Ko¨hler于1975年发明杂交瘤技术后，使体外大量筛选Mabs的构想得以实现[40]，但局限于鼠源抗体可变区基因复杂性和多样性比人的低、HCDR3的长度比人的短、以及没有合适的人骨髓瘤细胞，10 广州医科大学硕士学位论文所以杂交瘤技术在人Mabs抗体筛选上应用受到了很大的限制[63]。因此新的分离技术继续发展，主要包括一下两种方法。噬菌体展示技术：将免疫或者感染了流感后的人IgG可变区编码基因克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使抗体表达在噬菌体表面，构建成噬菌体展示文库[64]。但这项技术存在最大的缺点，获得的抗体蛋白的VH和VL可变区的配对是随机产生的，所获得的抗体不能代表天然抗体谱[65]。此外噬菌体展示技术在使用的过程中遇到另外一个问题：抗体在哺乳动物细胞中表达有异于大肠杆菌或酵母[66]。单细胞克隆技术：通过对单个B细胞进行逆转录（RT-PCR），从单个细胞中克隆获得免疫球蛋白的VH和VL基因，并用293T或其他真核细胞表达系统表达完整的抗体以进行抗体功能验证[67]。此项技术很好的解决了噬菌体展示中VH与VL基因随机搭配的弊端，最大程度保证了重链和轻链来源于同一个细胞。基于这一技术，研究人员研究开发多种方法以提高分选单细胞的效率和准确度。1.用荧光标记的特异抗原结合相应的前体B细胞，通过流式分选单个细胞直接进行克隆[68]或者在Feeder细胞中增殖后再进行克隆[69]，单细胞克隆表达再筛选抗原特异性抗体。此法需要有纯化的构象完整的病毒抗原，以避免非特异结合。2.在人感染病毒或者免疫流感疫苗后5-7d（比例占B细胞1%）流式分选外周血单个浆细胞，直接对单个浆细胞进行单细胞克隆，表达后再筛选抗原特异性抗体[70]。此法不用特异抗原，但很难保证同一时期占优势的浆细胞是针对特异抗原或者病毒的。3.使用CPG和EBV[71]，或者使用逆转录病毒介导凋亡因子Bcl-6和Bcl-xL转导记忆B细胞[72]以实现永生化，再进行阳性单克隆筛选。此方法可以建立抗体表达细胞系，但存在抗体分泌水平逐渐下降的情况，限制了抗体某些功能验证试验的检测[72]。4.通过各种方式体外激活记忆性B细胞增值并表达抗体[73]，或者在免疫流感疫苗后5-7d（比例占B细胞1%）富集外周血浆母细胞进行体外培养[74]，然后通过ELISA检测筛选培养上清结合活性阳性孔，再抗体克隆表达和验证。例如：JingheHuang于2013年发表在《Natureprotocol》的B细胞培养技术[75]。经过ELISA检测结合活性的方法进行筛选后，再进行单细胞克隆以获得完整抗体的方法，很大程度上减少了抗体的克隆工作量，但要依然存在ELISA操11 广州医科大学硕士学位论文作繁琐不适合大批量筛选，以及依赖构象完整的纯化抗原的问题，而且结合抗体不一定具有中和活性[76]。如能直接筛选分泌中和活性抗体的B细胞，将为分离流感病毒中和抗体，甚至是广谱中和抗体的工作带来很大的便利。4双特异性抗体特点与应用双特异性抗体(bispecificantibodyBsAb，是人工制备出来的，同时具有结合两种抗原表位的双特异IgG样抗体，这一概念最初由Coloma等提出[77]。双特异抗体被认为具有很好的临床应用前景，多家大型生物制药公司投入到双特异抗体药物研发上。在临床应用上，双特异抗体主要应用于肿瘤的诊断与治疗[78]、免疫疾病的治疗[79]、辅助诊断[80]以及组织再生[81]方面。然而针对流感病毒的双特异性抗体的研究较少。相比较于单克隆抗体，双特异抗体避免了分别对两个单克隆抗体的作用效果和安全性分别评价的长周期，缩短开发时间和减少研发费用[82]，同时，双特异抗体往往具有比亲本抗体具有更强的作用，更低的解离速度等一些新的特性，而且随着新的bsAbs技术的出现，抗体的稳定性，产量和免疫原性等方面等到了很大的提升。从结构上分，双特异抗体主要分为两大类：含有Fc区和不含Fc区的双特异抗体[83]，其中含Fc的双特异抗体具有较好的稳定性和溶解性，以及ADCC和CDC效应，而便于使用通用抗体纯化平台进行制备。含FC区的双特异抗体技术主要包括TrioMab，CrossMab，DVD-Ig，DAF，IgG-scFV，Kλbody等[84]。综合多方面考虑，Cross-Mab与DVD-Ig技术在实际操作和技术难度上更具可行性。Cross-Mabs技术是基于Knobs-into-holes的同时将轻链恒定区结构域与相应重链CH1结构域的进行交换，以促进两个异源抗体重链轻链的正确装配[85]。DVD-Ig是通过适当的Linker将两个单克隆抗体的可变区串联连接，构建成一个能与两个靶点结合的IgG样分子，避免轻重链错配的同时具有更广的适用性。基于以上情况，本课题将通过两个方向着手，研发流感中和抗体。基于实验室现有的6株不同亚型的荧光素酶报告流感病毒（IAV-Luc）[86]，以及已建立的荧光病毒微量中和法（BMN），通过优化以可用于直接测定单个浆母细胞细胞培养上清的中和活性。并通过单细胞RT-PCR技术克隆获取单克隆抗体并进行功能验证，以此探讨新方法分离单克隆广谱中和抗体以及提高抗体筛选分12 广州医科大学硕士学位论文离效率的可行性。此外，通过DVD-Ig和Cross-Mab技术，将两个现有的针对不同亚型的单克中和抗体构建成双特异性抗体（bsAbs），通过比较双特异性抗体与亲本抗体，探索双特异性抗体技术提高流感中和抗体广谱性的可行性。这两方面的探索将为下一步研发流感中和抗体提供技术基础。13 广州医科大学硕士学位论文第一章荧光流感病毒微量中和试验筛选单克隆中和抗体荧光流感病毒是本实验室通过反向遗传技术，以H1N1(A/PuertoRico/8/1934)病毒为骨架，构建携带不同亚型HA、NA基因以及GaussiaLuciferase荧光素酶报告基因的重组流感病毒IAV-Luc[77]。一共成功构建了六株：H1/Ca09–Luc，H1/PR8-Luc，H3/Bj89–Luc，H3/Vic11–Luc，H5/HK97–Luc，H5N6/GD14–Luc，H7/Ah13–Luc。在前期的研究中发现，基于IAV-Luc建立的微量中和法（BMN）在灵敏度，简便度方面，均比广泛应用的基于ELISA法的微量中和法更好[78]。使用低病毒量BMN（2TCID50/孔）BMN检测4E6（H5N1中和抗体）时，在浓度6.7ng/mL依然能抑制90%的荧光值，0.45ng/mL时能抑制50%。每个浆细胞每天分泌约86pgIgG[79]，因此，以荧光病毒微量中和法（BMN）直接测定单个浆母细胞细胞培养上清的中和活性在理论上是可行的。本章研究通过分离人免疫流感疫苗后7天外周血的浆母细胞，进行体外单细胞培养，应用低病毒量（2TCID50）的BMN法对培养5天后的培养上清进行筛选，对于能中和H1/CA09-Luc流感病毒的阳性孔进行单细胞RT-PCR，获取单克隆抗体并进行后续的抗体功能验证。1.1材料与设备1.1.1荧光病毒：本实验室构建的六种携带GaussiaLuciferase报告基因的流感病毒：H1N1/A/PuertoRico/8/1934-Luc（H1/PR8-Luc）本实验制备H1/A/California/7/2009-Luc(H1/Cal-Luc)本实验制备H3N2/A/Beijing353/1989-Luc(H3/BJ-Luc)本实验制备H3N2/Victoria/361/2011-Luc(H3/VIC-Luc)本实验制备H5N1/HongKong/482/1997-Luc(H5/HK-Luc)本实验制备H5N6/A/duck/Guangdong/GD01/2014–Luc（H5/GD-Luc）本实验制备H7N9/A/Anhui/1/2013-Luc(H7/AH-Luc)本实验制备14 广州医科大学硕士学位论文1.1.2细胞Madin-Derbycaninekidney(MDCK)细胞购自ATCC人外周血浆母细胞本实验室志愿者HEK293T购自广州复能基因有限公司1.1.3试剂IL-6Peprotech公司IL-21Peprotech公司胎牛血清（FBS）Gibco公司anti-HumanCD3抗体GE公司anti-HumanCD19抗体GE公司anti-HumanCD20抗体GE公司anti-HumanCD27抗体GE公司anti-HumanCD38抗体GE公司GlutmaxIMDM细胞培养基Gibco公司rTaq和PrimerSTARDNA聚合酶TaKaRa公司AfeI、BsiWI、NheIKpnI酶TaKaRa公司IMDM培养基，Opti-MEM培养基Gibco公司0.25%Trypsin-EDTAGibco公司pCMV3-IgH,pCMV3-IgK,pCMV3-IgL载体本实验室提供DL2000DNAMarkerTaKaRa公司6×loadingbufferTaKaRa公司DNA胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒Magen感受态菌株：E.coliTop10北京全式金生物公司H1N1NP抗体义翘神州山羊抗鼠酶-HPR酶联抗体中杉金桥公司腔肠素BioGold公司15 广州医科大学硕士学位论文1.1.4主要仪器流式细胞仪BDFACSAriaII超净工作台苏净集团-20℃和4℃冰箱海尔集团-80℃冰箱日本SANYO公司细胞培养箱日本三洋公司酶标仪Bio-Teck公司梯度PCR仪Eppendorf公司1.2试验方法1.2.1荧光流感病毒感染力滴定（TCID50测定）1.2.1.1病毒感染1)实验前一天将MDCK细胞1：4传代于10cm培养皿，培养过夜至密度90%。用胰酶消化细胞后，加入适量的DMEM培养基将细胞稀释至1.5×105/mL，按100μL/孔接种于96孔透明培养板，培养16-20h细胞密度达70%-90%即可进行病毒感染。2)用虹吸泵吸弃96孔细胞培养板的细胞培养液，用200μL/孔PBS洗板2次。3)按稀释好的不同稀释度的病毒液，移入100μL/孔病毒滴至相应的细胞培养孔中，37℃，5%CO2孵箱中培养24h。（稀释方式如图.4所示）图2.1病毒梯度稀释方式1.2.1.2ELISA测定组织细胞半数感染剂量（TCID50）[87]1)用虹吸泵吸掉96孔微量培养板中的细胞培养上清液，PBS200μL/孔洗涤16 广州医科大学硕士学位论文细胞两次，在吸水纸上吸干液体。2)加入100μL/孔80%丙酮固定液，室温固定细胞10分钟。3)弃去固定液，在吸水纸上拍掉孔中固定液，让微量培养板室温干燥，用250μL/孔PBS洗涤微量培养板3次，以去除残余的丙酮。4)加入5%脱脂牛奶200μL/孔，室温封闭2h，弃去牛奶并在吸水纸上拍干，加PBST200μL/孔洗板3次。5)按1:2000比例用含1%BSA的PBS稀释一抗（义翘神州的Anti-InfluenzaAH1N1Nucleoprotein单克隆抗体），每孔加入100μL，室温孵育1小时后，用PBST洗涤液250μL/孔洗板7次，拍干洗液。6)按1:5000比例用含1%BSA的PBS稀释二抗（HRP标记的羊抗鼠IgG），每孔加入100μL，室温孵育1小时，用PBST洗涤液250μL/孔洗板7次，拍干洗液。7)加入100μL/孔TMB底物，避光室温孵育10分钟显色，加入1M硫酸100μL/孔终止反应，摇床上120rmp摇2分钟。8)用酶标仪（450纳米）测定读出样品孔OD值。9)若检测孔OD值大于阴性对照孔平均值的2.1倍，则确定为病毒生长阳性。病毒滴度计算时，使用Reed和Muench法，最终获得病毒浓缩液的滴度为TCID50/100μL。每次使用时，根据每个孔的病毒用量配置病毒稀释液。图2.2PBMC滴度离心17 广州医科大学硕士学位论文1.2.2荧光流感病毒微量中和试验筛选单克隆中和抗体1.2.2.1免疫流感疫苗实验室志愿者FYP和ZMC免疫2014-2015人流感疫苗，免疫前用干燥管抽半管血，静置2h后分离血清，留备检测中和效价。1.2.2.2人单个核细胞（PBMC）的分离1)免疫后7d后抽取志愿者外周血2*8mL，以及3mL真空干燥管。2)向15mL离心管加入5mL淋巴细胞分离液，吸取8mL全血轻轻铺于分离液上面，900g、20℃离心20-30min（水平转头，升降速调至3）。3)小心吸取血浆层与淋巴细胞分离液之间的淋巴细胞层（图.5），转移到新的15mL离心管，加入10mLRPMI1640培养轻轻混匀，300g，20℃离心10min，吸掉上清。重复洗涤1次。4)加入1mL2%FBS-PBS重悬细胞，进行细胞计数，取5×106PBMC用流式细胞术分选浆细胞。有多余的PBMC可以液氮冻存，以后有需要时复筛培养。冻存液（FBS：DMSO=9:1）1.2.2.3流式细胞术分选浆母细胞1)取5×106PBMC加入流式管中，350g、20℃离心10min，吸掉上清，100μL含2%FBS的PBS重悬细胞。2)将荧光标记抗体：anti-HumanCD3、anti-HumanCD19、anti-HumanCD20、anti-HumanCD27、anti-HumanCD38抗体混合。3)向PBMC中加入混合的荧光抗体，4℃孵育30min。4)用1mL含2%FBS的PBS洗涤细胞，吸掉上清，重复洗涤一次。5)最后细胞重悬于1mL含2%FBS的PBS中，并用滤网过滤后，以备进行流式分选。6)使用BDFACSAriaII流式细胞仪进行浆母细胞分选，分选荧光信号为CD3-CD19+CD20-/lowCD27++CD38++的细胞，浆母细胞分选打入1.5mL预先加入500μL浆细胞培养基的EP管中。1.2.2.4单个浆母细胞的培养1)浆母细胞培养体系[88]配制：18 广州医科大学硕士学位论文IMDMmedium265mLFBS（56℃灭活30min）30mL预先配好用0.22滤膜过滤PLS（双抗）3mLMycoZapPlus-PRkit600μLIL-610ng/mLIL-2150ng/mL300mL2)每个志愿者浆母细胞加入培养基，稀释至细胞的密度为1cell/150μL，各培养6块96孔U型板，5%CO2培养箱中培养6天。1.2.2.5荧光病毒微量中和试验检测细胞培养上清1)细胞准备：提前培养3皿10cm的培养皿的MDCK细胞，长满后用胰酶消化，并稀释至1.5×105/mL，按100μL/孔接种于96孔白底细胞培养板，共铺12块板。2)收集培养上清：浆细胞培养6天后，用排枪吸取60μL/孔的单个浆细胞培养上清，转移至新的96孔透明稀释板中，每个孔都要更换枪头，以防止交叉污染。3)病毒稀释液配制：从-80℃取出一管H1/CA09-Luc（原液滴度：106.75TCID50/100μL）储存液，取3.6μL病毒储存液加到6mL稀释液中，上下颠倒充分混匀配制到病毒稀释液，60μL/孔加到收集了培养上清后的稀释板中。4)中和反应：60μL培养上清与60μL病毒稀释液混合后，放置于37℃孵箱中孵育1h。5)感染细胞：孵育1h后，用虹吸泵吸走MDCK细胞的培养基，然后从稀释板上转移100μL/孔至细胞培养板里，37℃，5%CO2培养箱中培养48h。6)测值：配制腔肠素工作液（2μg/mL），用自动加样功能的酶标仪加25μL/孔并检测Luc值，根据病毒对照荧光值，计算样品孔的病毒抑制效率，筛选抑制达50%以上的细胞孔。19 广州医科大学硕士学位论文1.2.3中和活性阳性细胞孔单细胞克隆1.2.3.1阳性孔细胞逆转录1)将细胞培养板放于水平离心机，3500rmp/min，室温离心10min。2)把枪头斜插至U型孔曲面边缘，轻轻吸走大部分细胞培养上清，尽量避免把底部的浆细胞吸走。3)配制单细胞裂解体系，向流感病毒中和抗体阳性的单细胞孔中加入14μL裂解体系液，冰上静置30min，充分裂解细胞。单细胞裂解Lysis体系：试剂体积（μL/孔）×50孔5×buffer4200MgCl22.5125RNasin（RNase抑制剂）0.525CarrierpARNA(Qiagen)0.2512.5Igepal0.06253.125H2O7350总反应体积147004)将细胞孔中裂解产物转移到0.2mL的PCR管中。5)配制逆转录体系，向裂解产物中加入6μL逆转录体系，按照下面的条件将细胞中mRNA逆转录成cDNA。逆转录体系：试剂体积（μL/孔）×50孔RandomHexamer150dNTP（10mM）150GoScriptTranscripatse150去离子水3150总反应体积630020 广州医科大学硕士学位论文逆转录反应条件：温度时间循环次数42℃10min25℃10min150℃90min85℃5min1.2.3.2单细胞克隆NestedPCR扩增1)NestedPCR所有引物序列来源于KennethSmith在NatureProtocol[90]发表的文章，引物由生工公司合成。PCR可变区引物HeavyIGVH1a、IGVH1b、IGVH2、IGVH3、chainIGVH4、IGVH5、IGVH6、IGVH7、First-roundHC301.5constantKappaIGKV1、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5、PCRchainIGKV6、Kappa102constantLambdaIGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、chainIGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、HeavysVH1a、sVH2、sVH3vv、sVH3gl、sVH4、chainsVH5、sVH6、sVH7、SHeavyconstantSecond-roundsVK1、sVK2、sVK3、sVK4、sVK5、KappaPCRsVK6+SKappaconstantchainLambdasVL1、sVL2、sVL3、sVL4、sVL5、sVL6、chainsVL7、sVL8、sVL9、sLambdaconstant引物稀释：用ddH2O把每条引物稀释成50μM，等体积混合同一轮PCR的同一肽链的几条引物，成为混合引物。2)第一轮PCR扩增反应：扩增体系：21 广州医科大学硕士学位论文试剂体积（μL/孔）×50孔2xbuffer12.5625dNTP（10mM）5250IGVH/IGKV/IGLVMix2.25/1.75/2.5112.5/87.5/125KODFX0.525cDNA2.5——ddH2O2.25/2.75/2112.5/137.5/100总反应体积251125（22.5/管）TouchdownPCR扩增条件：温度（℃）反应时间循环数953min198-64-6810s-45s-2min;398-61-6810s-45s-2min;310s-45s-2min;98-58-68398-55-6810s-45s-2min;398-52-6810s-45-2min;30687min112forever13)第二轮PCR扩增反应反应体系：试剂体积（μL/孔）×50孔2xbuffer12.5625dNTP（10mM）5250sVH/sVK/sVLMix2.25/1.75/2.5112.5/87.5/125KODFX0.525第一轮扩增产物2.5——ddH2O2.25/2.75/2112.5/137.5/100总反应体积251125（22.5/管）扩增条件：22 广州医科大学硕士学位论文温度（℃）反应时间循环数953min198-60-6810s-45s-1min;50687min;112forever14)NestedPCR第二轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析25μL反应产物与5μL6×SYBRGreenLoaddingbuffer混合后全部上样。重链为500bp左右，轻链为300多bp，切出目的条带胶块并进行胶回收。1.2.3.2NestedPCR第二轮PCR产物回收（MagenDNA胶回收试剂盒）1)向1.5mLEP管中的凝胶加入300μLBufferGDP，55℃水浴7min，至凝胶完全溶解，期间上下颠倒两次加速溶胶。2)短暂离心后将溶解液加到HiPureDNAColumn柱中，套在2mL收集管中，12000×g离心1min。3)倒弃收集管中的滤液，把柱子套回收集管中，加入300μLBufferGDP至HiPureDNAColumn柱中，静置1min，12000×g离心1min。4)倒弃收集管中的滤液，把柱子套回收集管中，加入600μLBufferDW2（已用无水乙醇稀释），12000×g离心1min。重复一次，空离2min。5)把HiPureDNAColumn柱套到新的1.5mLEP管中，向滤膜中加入30μLddH2O，静置5min，12000×g离心2min，收集滤液即为胶回收的DNA产物。6)轻重链均有条带的样品送生工测序。1.2.3.4抗体基因同源重组接头扩增1)使用添加了重组臂的IgGV基因混合引物为上游引物，J基因混合引物为下游引物，将NestedPCR第二轮产物进行扩增，为抗体基因两端添加重组臂。PCR反应体系：23 广州医科大学硕士学位论文试剂体积（μL/孔）2xPrimeSTARMAX25PrimerFhHJ（H）（10μM）1PrimerRhHV（H）（10μM）1第二轮PCR纯化产物2去离子水21总反应体积50反应条件：温度（℃）反应时间循环数953min198-55-7210s-15s-5s30727min;112forever12)PCR扩增产物全部进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，重链条带大小为500bp左右，轻链大小是300多bp，切取目的基因条带凝胶，胶回收详细参照4.3.2.5，回收后检测DNA浓度。1.2.3.5抗体表达载体的制备抗体表达的载体：pCMV3-humanIgG1（CH1,2,3,4）；pCMV3-humankappa（CK1）和pCMV3-humanLambda，通过转化相应的菌种，并进行质粒中提，然后用相应的内切酶进行双酶后备用。1)配置酶切体系：24 广州医科大学硕士学位论文试剂体积（μL/孔）10xFastDigestBuffer5μLAfeI2.5μLNheI（H）/BsiWI（K）/KpnI（L）2.5μLpCMV3-H/K/L质粒5ug去离子水补充至50μL总反应体积50μL2)混合物置于37℃水浴酶切过夜；3)酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，并将目的条带切胶回收，详细参照4.3.2.5，检测浓度备用1.2.3.6抗体表达质粒构建1)抗体基因与pCMV3-vector载体重组配制同源重组体系：试剂体积（μL/孔）5×CEⅡbuffer2ExnaseⅡ1pCMV3-humanH/k/L-vector120ng抗体基因回收产物90ngddH2O补足10μL总反应体积10μL37℃水浴30mins，55℃水浴5min，放冰上备用。1.2.3.7重组产物转化1)取出Trans10感受态细胞于冰上融化，分装成30μL/管，加入重组产物，轻微混匀，冰上静置30min。2)于42℃热击90sec，然后冰浴2min。3)加入500μL无抗LB培养基，37℃，160rmp/min摇菌45min。4)吸取200μL均匀涂布于Amp+培养板上，37℃培养16h。25 广州医科大学硕士学位论文5)每块培养板挑取5个单克隆菌落接种于Amp+LB培养基，220rmp摇菌16h，进行菌液PCR筛选阳性菌落。1.2.3.8菌液PCR筛选阳性菌落1)使用TAKARA公司的rTaqPolymerase，进行菌液PCR。PCR反应体系：试剂体积（μL/孔）10×Buffer2dNTP2PrimerFJP-HLu（10μM）1PrimerRJP-H/K/L（10μM）1rTaq0.5菌液2去离子水11.5总反应体积20PCR反应条件：温度（℃）反应时间循环数953min198-55-7215s-30s-45s30725min;112forever12)PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳，条带700bp左右为阳性，取阳性菌样500μL送测序，用表达载体上的通用引物Hlu作为测序引物，100μL与50%甘油混匀于-80℃保存。1.2.4单克隆抗体表达1.2.4.1克隆菌液质粒小量抽提（Magen质粒小提试剂盒）1)测序后，经过IMGT比对正确的菌液，使用Magen的HiPurePlasmidEFMicroKit进行摇菌扩大培养和质粒小量抽提。2)收集5mL菌体于15mL离心管中，10000×g离心1min，倒弃培养基，在吸26 广州医科大学硕士学位论文水纸上吸干残液。3)加入500μLBufferE1/RNaseA，高速涡旋充分重悬细菌。4)加入500μLBufferE2，立即调到混匀8-10次。5)加入500μLBufferE3，立即调到混匀10-15次，13000×g离心10min.6)小心转移上清至新的2mL离心管中，加入500μLBufferE4至上清中，颠倒混匀6-8次。7)将HiPureEFMiniColumn套在收集管中，向虑柱中加入750μL混合液，10000×g离心1min，倒弃废液后继续将剩余的混合液加入虑柱进行离心。8)倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入650μLBufferE5至柱中，10000×g离心1min。9)倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入650μLBufferPW2至柱中，10000×g离心1min，倒弃滤液后继续空离2min。10)把柱子套在新的1.5mLEP管中，向滤膜中加入30μLddH2O，静置5min，10000×g离心2min洗脱DNA，检测质粒浓度。1.2.4.2轻重链配对的小量质粒转染表达1)提前准备好293T细胞，按照1×106个细胞/孔铺板，37℃，5%CO2培养箱中培养16h。2)提前1h更换培养基，换成1mLOpti-MEN培养基，防止细胞被吹起来。3)配对的轻重链各2μg跟100μL轻轻混合，室温避光静置5min。4)12μLPEI（1mg/mL）与100μL轻轻混合，室温避光静置5min。5)将4）加进3）中轻轻混合，室温避光静置30min，然后梅花状逐滴滴到细胞上清中，轻轻混匀，培养6h后更换成293freestyle培养基。6)转染3天后收取转染上清，3000×g离心5min，吸取上清备用。1.2.4.3SDS-PAGE胶拷马斯亮蓝染色验证1)配制12%分离胶，沿胶板边缘加入4mL分离胶液，加1mL异丙醇覆盖其上，20min后倒掉异丙醇，并用吸水纸吸掉残液。2)配制浓缩胶，沿胶板边缘加入浓缩液至填满，插入梳子，20min拔取梳子。27 广州医科大学硕士学位论文3)把胶板放入电泳槽，加入电泳缓冲液，拔出梳子，上样15μL（每个样品分别做两个孔，20μL表达上清+5μL5×LoadingBuffer，一种是LoadingBuffer加入巯基乙醇，适用于解开二硫键，检测轻重链；一种是没有加巯基乙醇，适用于检测完整抗体，沸水煮10min）4)设置电压为80V，大约30min至进入分离胶，改电压为120V，大约45min后直到溴酚蓝染液到达胶板底部1cm处停止。5)把胶小心从玻璃板上取出，加入拷马斯亮蓝染液染色1h。6)回收染液，用蒸馏水洗涤两遍，泡在水中用微波炉加热至沸腾两分钟，更换蒸馏水，继续重复煮两三遍至胶脱色完全。7)对照Marker观察条带大小。1.2.4.4荧光病毒微量中和检测表达上清中和活性检测小量转染表达上清其对H1/CA09-Luc的中和活性，详细操作参照4.2.3。1.2.4.5质粒大量抽提（MN公司质粒中提试剂盒）1)经过小量转染并初步验证拥有中和活性的抗体，进行质粒大量抽提，使用Macherey-Nagel的PlasmidDNApurification试剂盒进行抽提。2)按1:1000接种菌液至300mLLB培养基中，220rmp37℃摇菌12-16h，收集菌液10000×g离心5min，弃去培养基，在吸水纸上吸干废液。3)加入12mLBufferRES/RNaseA，充分重悬菌液。4)加入12mLLysisBufferLYS，轻轻上下颠倒6-10次至蓝色粘稠均匀透明状，室温静止5min。5)加入12mLNeutralizationBufferNEU，轻轻上下颠倒混匀6-10次至变成含有白色沉淀的混合液。6)沿套在DNA虑柱上的沉淀物过滤膜的边缘逐滴加入25mLEquilibrationBufferEQU活化滤膜，至全部液体滴完，将混合液沿沉淀物滤膜加入柱中，至液体完全滴完。7)沿滤膜边缘逐滴加入15mLBufferEQU，至液体全部滴完，移除套在柱子上的沉淀物滤膜。28 广州医科大学硕士学位论文8)向DNA虑柱中加入25mLBufferWash，至液体完全滴完。9)向虑柱中加入15mLElutionBufferELU（提前50℃预热）洗脱DNA，用50mL离心管接收洗脱液。10)向洗脱液中加入10.5mL异丙醇，上下颠倒充分混匀，用注射器将混合液滤过NucleoBondFinalizerLarge，并用4mL70%乙醇滤过洗涤两次，来回吸打注射器将滤膜吹干。用1mL注射器吸取300μLddH2O洗脱DNA，共洗脱两次。1.2.4.6抗体大量表达1)经过SDS-PAGE凝胶拷染和荧光病毒微量中和检测确定抗体轻重链配对表达成功后，进行抗体大量转染表达，以备后续的相关功能验证实验。2)每个抗体准备10皿293T细胞进行转染，转染详细操作步骤参照4.3.5.5，不同之处在于质粒和PEI的用量，每皿细胞为各15μg重链质粒加15μg轻链质粒。3)每三天收集一次表达上清，收两次共200mL，收集后离心取上清，放-80℃保存备用1.2.4.7抗体纯化1)准备填料，ProteinA填料的用量为10mL/1L抗体表达上清，分别用10倍体积的ddH2O和10倍体积的结合缓冲液洗涤填料。2)向200mL表达上清中加入5.2mLTris（2M，PH=8）和13mLNaCl（2.5M，PH=8）使得两者的终浓度为50mM和150nM。3)再向表达上清中加入2mLProteinA填料，室温摇床轻摇1h。4)把表达上清与ProteinA填料的混合液加到虑柱中，至所有混合液全部过滤完毕，滤过液收集好以防挂柱失败。5)用20倍体积于填料的结合缓冲液洗涤柱子中的填料，分四次冲洗，每次加5倍体积至全部流穿再加。6)加入3倍体积于填料的洗脱缓冲液，将抗体洗脱下来，用离心管收集洗脱液，重复洗脱一次。7)跑SDS-PAGE进行拷染验证纯化效果。29 广州医科大学硕士学位论文8)用50KD超滤管进行浓缩，将洗脱液加入到超滤管中，并加入PBS至刻度线，2000×g，4℃离心5min。9)倒掉废液，继续加入PBS至刻度线离心，重复5次，收集超滤管中的浓缩液，检测抗体浓度，分装保存到-80℃。10)依次用20倍体积洗脱缓冲液、20倍体积ddH2O、3倍体积6M盐酸胍、20倍体积ddH2O和5倍体积20%乙醇洗涤柱子，4℃保存可以重复使用。1.2.5单克隆抗体功能验证试验1.2.5.1抗体体外中和活性检测（荧光流感病毒）1)具体操作步骤参照4.2.3，但部分地方存在不同之处，如：培养上清换成固定起始浓度的抗体倍比稀释液，以及病毒用量和培养时间不一样。2)抗体稀释液：抗体从100ng/μL起5倍倍比稀释，即：100、20、4、0.8……，每个稀释度做两个复孔，共做12个稀释度。3)病毒稀释：检测H1/CA09-CLU，H1/PR8-Luc，H3/Vic-Luc，H3/BJ-Luc和H5/HK-Luc，H7/AH-Luc六种荧光流感病毒，病毒用量为100TCID50/孔，培养时间为24h。4)通过拟合曲线的方法求出抗体对病毒的IC50。1.2.5.2抗体的血凝抑制实验（HAI）1)用移液枪向96孔V形微量板第1~11列孔各加入25μLPBS，第12列孔加入50μLPBS。2)向第1列孔加入25μL待检抗体，抗体起始浓度为1mg/mL，充分混匀后依次向后一列移出25μL，倍比稀释至第10列孔，混匀后第10列孔弃去25μL，设第11和12列孔分别为病毒对照和红细胞对照。3)配制4单位抗原（引起100%血凝的病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位），向第1-11列孔各加入25μL4单位抗原轻，轻叩反应板，使反应物混合均匀，室温下静置30min。30 广州医科大学硕士学位论文4)自右向左依次加入25μL/孔1%的鸡红细胞悬液，将反应板置于微量振荡器上振荡1min，室温静置40min后观察结果，红细胞对照孔呈明纽扣状沉到孔底，即可判定结果。5)结果判定红细胞对照孔出现完全沉淀和病毒对照孔出现完全凝集时，将反应板倾斜45°，从反应板背侧观察。红细胞凝集完全被抑制的最大稀释倍数，判断为该抗体的血凝抑制滴度。1.2.5.3ELISA结合活性检测实验1)包被：用PBS把抗原H1N1（A/California/04/2009）HA稀释成1μg/mL，每孔100μL，4℃包被过夜。用200μL/孔PBS洗板三次。2)封闭：用PBS配制5%的牛奶，加入200μL/孔室温包被2h，200μL/孔PBS洗板3次，每次在干净的吸水纸上用力拍干。3)孵一抗：一抗为纯化的抗体，从起始浓度100ng/mL开始，做2倍倍比稀释，同稀释11个稀释度，每个稀释度做2个复孔，100μL/孔，37℃孵育2h后PBST（0.05%吐温-20）洗板5次，每次在干净的吸水纸上用力拍干。4)孵二抗（酶联抗体）：二抗用HRP-conjμgatedgoatanti-humanIgG，用含1%BSA的PBS1:5000稀释，37℃孵育1h后，PBST洗板6-8次，每次在干净的吸水纸上用力拍干。5)加底物显色：加入100μL/孔TMB显色，显色10min。6)终止反应：加入50μL/孔2M的H2SO4终止反应（蓝色—黄色），闭光稳定5min。7)测OD值：用酶标仪检测450nm的OD值，求出阴性对照孔的均值，大于阴性对照孔的均值2.1倍判断为阳性。1.3结果1.3.1免疫前后志愿者血清中和效价检测两位志愿者（FYP和ZMC）在接受流感疫苗免疫前后均收集了外周血血清，31 广州医科大学硕士学位论文使用本实验室建立的荧光流感病毒微量中和法（BMN），检测免疫前和免疫后7天的志愿者血清对四种流感病毒的中和效价，分别检测H1/CA09-Luc、H3/Vic-Luc、H5/HK-Luc和H7/AH-Luc，病毒用量为100TCID50。通过读取的荧光值拟合曲线算出IC50（图2.3A，2.3B），从表2.1可以看出，两名志愿者免疫流感疫苗后血清对H1/CA09的中和效价明显升高，FYP的效价（IC50）从无中和抗体升高至19395（稀释度），ZMC也从无中和抗体升高到24102（稀释度）；同时两者血清对H3的中和效价也略有升高，对H5和H7没有明显中和活性（表2.1）。由此可以确定志愿者免疫成功，诱导产生了高效价的中和抗体，可以用于下一步针对H1/CA09中和抗体的筛选。AB图2.3志愿者血清中和效价检。A.BMN检测FYP及ZMC免疫前后7天血清对H1/CA09-Luc的中和效价，病毒用量为100CID50。B.BMN检测FYP和ZMC免疫前后7天血清对H3/Vic-Luc的中和效价，病毒用量为100TCID50。表2.1两位志愿者免疫前后血清流感病毒中和效价（IC50）H1/CA09-LucH3/Vic-LucH5/HK-LucH7/AH-LucFYP-0d0312.400FYP-7d19395432.600ZMC-0d0521.600ZMC-7d241022432001.3.2荧光流感病毒微量中和试验筛选nAbs1.3.2.1单个浆母细胞培养上清BMN检测32 广州医科大学硕士学位论文两位志愿者免疫流感疫苗后第7天采全血，使用流式细胞术分选外周血中浆母细胞，进行单个浆母细胞培养。来源于FYP的浆母细胞接种6块96孔细胞板，来源于ZMC的浆母细胞接种30块，培养体系中加入IL-6[58]以维持浆母细胞的体外培养活性。培养后第4-5天收集培养上清60μL，用荧光病毒微量中和法检测（BMN）中和活性，分别检测H1/CA09-Luc和H5/HK-Luc（图2.4）。结果显示，对H1/CA09-Luc抑制50%以上的阳性孔共有80个，抑制90%以上的阳性孔有15个（表2.2）；同时培养上清没有检测到对H5/HK-Luc中和活性孔。图2.4BMN检测培养上清结果示例表2.2志愿者单个浆母细胞培养上清H1/CA09中和抗体阳性率IC90IC50总阳性孔数FYP3（0.54%）30（5.40%）33（6.00%）ZMC12（0.43%）35（1.27%）47（1.70%）1.3.2.2H1/CA09中和活性阳性孔IgG检测经过BMN检测后，H1/CA09-Luc病毒中和抗体阳性（IC50）细胞孔一共有80个，从中选取20个样本检测其IgG含量（图2.5A），检测结果显示，所有待检阳性孔培养上清均IgG阳性（图2.5B），最高浓度最达9.092ng/mL，最少也有1.348ng/mL，平均浓度为4.533ng/mL，即平均115pg/cell/day，这与文献报道的体外培养单个浆细胞产生50-100pg/cell/day相近。33 广州医科大学硕士学位论文AB图2.5ELISA检测20个阳性孔培养上清的IgG含量。A图为ELISA检测IgG显色展示板B图为ELISA检测阳性孔培养上清IgG含量1.3.3单克隆克隆与表达纯化1.3.3.1单克隆抗体克隆BMN检测到的80个阳性孔，从ZMC阳性孔中选取8个以及FYP所有阳性孔33个，经过逆转录、nestedPCR、测序和IMGT比对后，重链和轻链均成功克隆的一共有13对，最后经过配对转染表达后检测，存在H1/CA09-Luc中和活性的一共有8对抗体，8对抗体中7个重链为HV3家族，D7重链为HV5；轻链有7个是KV1-33家族，而4A的轻链是V1-5（表2.3）。表2.3nAbs可变区基因序列信息CDRCDRnAbVHJHDHVLJLLengthsLengthsV1-33*01or2CV3-43*02J3*01D7-27*018.8.7J5*016.3.8V1D-33*01J3*01orV1-33*01or4EV3-15*01D2-21*028.10.18J4*016.3.9J3*02V1D-33*01V1-33*01or3AV3-15*01J3*02D3-22*018.10.19J4*016.3.9V1D-33*014AV3-15*01J6*02D2-21*018.10.12V1-5*03J1*016.3.9V1-33*01or5AV3-15*01J4*02D5-12*018.10.13J4*016.3.9V1D-33*01V1-33*01orB1V3-43*02J4*02D3-16*028.8.9J4*016.3.8V1D-33*01V1-33*01orD5V3-43*02J4*02D3-16*028.8.9J4*016.3.8V1D-33*01V1-33*01orD7V5-51*03J6*02D1-14*018.8.17J5*016.3.9V1D-33*0134 广州医科大学硕士学位论文1.3.3.2抗体纯化产物SDS-PAGE胶拷染五对初步验证存在中和活性的抗体，进行质粒大量抽提，测序正确后进行大量转染表达，收集表达上清并使用proteinA纯化，浓缩后使用BCA试剂盒检测抗体浓度。把产物进行SDS-PAGE凝胶电泳，拷染验证抗体表达是否成功。拷染脱色后，经β-巯基乙醇和煮沸处理的样本孔存在两条带（图2.6），分别是55KDa左右的重链和25KDa左右的轻链。AB图2.6抗体纯化产物SDS-PAGE胶拷染图，图示245KD为完整抗体蛋白，55KD条带为抗体裂解后重链蛋白，25KD条带为抗体裂解后轻链蛋白。A图为B1、D5和D7抗体；B图为4E、2C、3A、4A和5A抗体1.3.4抗体功能验证试验1.3.4.1中和活性检测（IC50）抗体纯化后进一步检测筛选出来的抗体的中和效价。通过本实验室构建的基于荧光流感病毒的微量中和法，使用100TCID50/孔的病毒量与倍比稀释的抗体共孵育，以检测8个抗体nAb-4E、2C、3A、4A、5A、B1、D5和D7的对六种荧光流感病毒的中和效价，包括：H1/CA09-Luc、H1/PR8-Luc、H3/Vic-Luc、H3/BJ-Luc、H5/HK-Luc和H7/AH-Luc。经检测8个抗体都只对H1/CA09-Luc有中和活性（图2.7），其中nAb-4E、2C、3A、5A、B1和D5的效价非常强，在0.1-2ng/mL之间，比对照抗体MEDI8852高1000-2500倍；而nAb-4A对H1/CA09-Luc的中和效价较低，IC90为382.9ng/mL，只略低于8852的965.3ng/mL（表2.4）。8对抗体对其余五个亚型流感病毒均无中和活性。35 广州医科大学硕士学位论文图2.7微量中和检测8个nAbs对H1/CA09-Luc病毒中和活性，病毒用量为100TCID5036 广州医科大学硕士学位论文表2.4nAbs对H1/CA09-Luc流感病毒中和效价4E2C3A4A5AB1D5D7MEDI8852IC501.801.251.24368.50.550.440.2126.6965.3（ng/mL）1.3.4.2结合活性检测（EC50）验证BMN筛选出的5个nAb对6中亚型的流感荧光病毒，特别是H1/CA09-Luc的中和效价的同时，也验证它们对多种亚型的HA蛋白的结合活性，包括：H1N1(A/California/04/2009)、H1N1(A/PuertoRico/8/1934)、H3N2(A/Perth/16/2009)、H5N1(A/HongKong/5052/2007)、H5N1(A/Indonesia/5/2005)、H5N6(A/duck/Guangdong/GD01/2014)、H7N9(BFH/Y98F/2013)、H7N9(GQ/TFH/2017)和H10N8(A/Jiangxi-Donghu/346/2013)的HA蛋白。使用ELISA的方法检测5对抗体对以上HA蛋白有无结合能力以及结合活性EC50的大小（图2.8）。以广谱抗体MEDI8852作为阳性对照，结果显示MEDI8852对H1/CA09的EC50是349.2ng/mL，nAb-4A和D7的结合能力较差，其EC50比MEDI8852大。而其余4个抗体的结合活性均优于MEDI8852，其EC50是MEDI885215-20分之一（表2.5）。然而，5个抗体对除H1/CA09外的其余几种亚型的HA均无结合能力。图2.8检测8个nAbs对H1/CA09病毒HA蛋白结合活性表2.5nAbs对HA/H1/CA09结合活性检测4E2C3A4A5AB1D5D7MEDI8852EC5018.116.822.6513.419.64.53.02964349.2(ng/mL)37 广州医科大学硕士学位论文1.3.4.3血凝抑制试验（HAI）检测抗体中和滴度和血凝抑制试验是一种用于检测带有血凝素的某一病毒或者亚型的中和抗体滴度的一种方法，流感病毒就是含有血凝素（HA）的病毒，HA蛋白的头部区域（RBS）能与人或动物红细胞上的唾液酸受体结合，引起凝集现象。这种方法能检测血清或抗体针对某亚型病毒中和滴度的同时，还能验证抗体是否与HA蛋白的RBS区域结合实现对病毒的中和作用。MEDI8852是一个与茎部结合的广谱中和抗体，作为对照，MEDI8852对病毒引起红细胞的凝集现象没有抑制作用，但是5个nAbs均抑制血凝效应，而且滴度相对大小与其中和活性一致。nAb-4A血凝抑制活性较差，效价为125μg/mL，其余四个抗体具有较高的血凝抑制活性（表2.6），说明5个抗体均与H1/Ca09亚型HA蛋白的RBS区域结合。表2.6nAbs对H1/CA09HAITiters4E2C3A4A5AMEDI8852HAITiter0.3120.3120.3121250.625—（μg/mL）1.4讨论与小结本研究利用本实验室构建的基于荧光素酶报告流感病毒微量中和法（BMN）和单细胞PCR技术从单个浆母细胞克隆抗体基因。通过荧光素酶报告流感病毒微量中和法（BMN）筛选，从36块96孔板培养的单个浆母细胞中，获得了对H1/CA09-Luc抑制50%以上的阳性孔共有80个，抑制90%以上的阳性孔有15个。选取20个进行IgG含量检测，结果显示所有待测孔均有IgG产生，平均浓度为4.533ng/mL，即平均115pg/cell/day，这与文献报道的体外培养单个浆细胞产生50-100pg/cell/day相近。成功从40个具有中和活性的单个浆细胞中克隆出8个（Ab-2C、4E、3A、5A、B1、D5、4A、D7）对H1N1/CA09-Luc流感病毒有中和活性的单克隆抗体，而且中和效价（IC50）差别较大，效价最高的为nAb-D5：0.21ng/mL，最低是nAb-4A：368.5ng/mL，但均比作为对照的广谱茎部抗体MEDI8852（965.3ng/mL）的效价高。表明，经过荧光素酶报告流感病毒微量中和法（BMN）筛选后可以大大提高获得中和抗体的效率，降低工作量。38 广州医科大学硕士学位论文并初步验证了荧光素酶报告流感病毒微量中和法（BMN）结合单个浆母细胞培养及单细胞PCR技术用于抗流感病毒中和抗体研发的可行性。而且，在8个单克隆nAbs中，D7是一个结合活性较差（EC50=2964ng/mL）中和活性较好的抗体，这种抗体若用ELISA检测培养上清结合活性的方法筛选有可能会漏筛，而且有结合活性的抗体不一定有中和活性，BMN法直接筛选有中和活性B细胞，可以大大减少了后期的抗体克隆工作量。人感染流感病毒或者免疫疫苗后以头部抗体为主，因此要获得茎部广谱抗体，必须建立在大批量筛选的基础上，而我们建立的这种方法将大大减少人力物力的浪费。虽然此次尝试没能筛出具有广谱活性的抗体，但结合我们构建的六种IAV-Luc病毒，并加大筛选量，很大机会能达到这一目标。更进一步，我们还可把这种筛选方法优化用到从单个培养的记忆性B细胞克隆中和抗体。由于记忆性B细胞体外培养经历细胞增殖的过程，培养上清中IgG含量更高，有利于中和活性筛选，而且因细胞增殖，RT-PCR的成功率更高。这样我们可能够获得更多高效价中和抗体。39 广州医科大学硕士学位论文第二章构建抗流感病毒双特异抗体双特异性抗体(bispecificantibody，bsAb)，是人工制备出来的，同时具有结合两种抗原表位的双特异IgG样抗体。双特异抗体的应用研究一直是热点课题。目前，双特异抗体主要应用于肿瘤的诊断与治疗[78]、免疫疾病的治疗[79]、辅助诊断[80]以及组织再生[81]方面，针对流感病毒的双特异性抗体的研究较少。双特异抗体具有很多单克隆抗体所不具备的优点，而且随着新的bsAbs技术的出现，抗体的稳定性，产量和免疫原性等方面等到了很大的提升。本章的研究主要是利用Cross-Mabs和DVD-Ig两种双特异性抗体技术，把本实验室分离的两个单克隆抗体（nAb-206和nAb-4E6）构建成两株206/4E6-BsAb，通过检测比较两种技术构建的BsAb与它们的两个亲本抗体的活性，来探讨双特异抗体是否能获得亲本抗体的功能，以此探索双特异抗体技术用于提高流感抗体中和广谱性的可行性。2.1材料与设备2.1.1抗体Ab-206本实验室分离制备Ab-4E6本实验室分离制备2.1.2试剂胎牛血清（FBS）Gibco公司rTaq和PrimerSTARDNA聚合酶TaKaRa公司AfeI、BsiWI、NheIKpnI酶TaKaRa公司Opti-MEM培养基Gibco公司0.25%Trypsin-EDTAGibco公司pCMV3-IgH,pCMV3-IgK,pCMV3-IgL载体本实验室提供DL2000DNAMarkerTaKaRa公司6×loadingbufferTaKaRa公司40 广州医科大学硕士学位论文DNA胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒Magen感受态菌株：E.coliTop10北京全式金生物公司山羊抗鼠酶-HPR酶联抗体中杉金桥公司腔肠素BioGold公司2.2实验方法2.2.1引物设计引物名称序列1FCTGCCCCCATGCCGGGATGAGCTGACCAAG1RGGTGTACACCTGTGGTTCTCGGGGCTGCCCTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCT2FCCTGGTTCTTGGTCAGCTCATCCCGGCATG2R3FAGCCTGTCCTGCGCGGTCAAAGGCTTCTAT3RGACCTGGTTCTTGGTCAGCTCATCC4FGTCCTGCGCGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCG4RAGGCTGACCTGGTTCTTGGTCAGCTCATC5FTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGAC5RGAAGGAGCCGTCGGAGTCCAGCACGG6FGGTGTGCACCCTGCCCCCATCCCGGGAT6RTGTGGTTCTCGGGGCTGCCCTTTGGCTTTGGAG7FACCAGGGTGCTGAGCGCTggtaccaagctgacagtgctcggccTGTGTGAGTTTTGTCgctacactcagtgggggccacggtct7R8FGACAAAACTCACACATGCCCACCG8RttcggcggccgcCTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC9FACAGGAGTGCATAGCGCTGCTAGCACCAAGGGCCCATC9RccgaattcggcggccgcTTAACAAGATTTGGGCTCAACTTTC10FGCTACCAGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTC10RGACCGATGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCG11FGGCTACCAGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGA11RcgagcactgtcagcttggtaccTGAGGAGACGGTGACCAGGG12FCAGCCACAGGAGTGCATAGCTCTTATGAGCTGACACAGCCGC41 广州医科大学硕士学位论文12RGATGGGCCCTTGGTGCTAGCTAAAACGGTGAGCTGGGTC13FCCAGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGTAGTGGAAAGACGGAAGGACCTTTAGTACTTGCTGAAGAGAC13RGGTGACCGTACTAAAGGTCCTTCCGTCTTTCCACTAGCGCCGGAGGTGCAG14FCTGGTGGAG14RGATGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGAC15FGATGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGAC15RtgTccTagTacAgtgagTttAgtTccTAGGACGGTCAGCTTGGTC16FctcacTgtActAggAcaAccTaaAgcGTCTTATGAGCTGACACA16RcactgtcagcttggtaccTAAAACGGTGAGCTGGG2.2.2CrossMab双特异抗体构建2.2.2.1CrossMab双特异抗体设计CrossMab是一种2价双特异IgG抗体，在Knobs-into-holes技术（杵臼技术）加入了Crossover技术（交叉技术）改进而来。X-射线晶体衍射显示，CH3区之间的相互作用在重链Fc段分子间缔合过程中起主导作用，因此在CH3区进行定点突变，组装形成一个“杵臼”结构，从而实现了不同来源的两条重链形成稳定的异源二聚体（如图3.1所示）。AB图3.1CrossMab技术示意图，图A为CrossMab在序列水平的处理方法；图B为CrossMab技术空间结构变化图42 广州医科大学硕士学位论文2.2.2.2载体改造1)载体IgH（A)knobs构建S354C定点突变：模板：IgH载体引物：1F+1RT366W定点突变：模板：IgH载体（S经354C突变后）引物：2F+2R2)载体IgH（B）-holes构建1/T366S定点突变：模板：IgH载体引物：3F+3R2/L368A定点突变：模板：IgH载体（经T366S突变后）引物：4F+4R3/Y407V定点突变：模板：IgH载体（经T366S、L368A突变后）引物：5F+5R4/Y349C定点突变：模板：IgH载体（经T366S、L368A、Y407V突变）引物：6F+6R5/PCR进行定点突变PCR体系：试剂体积（μL/孔）QSMIX12.5F'Primer1.25R'Primer1.25Template（10ng）1去离子水9总反应体积2043 广州医科大学硕士学位论文PCR条件：温度（℃）反应时间循环数953min198-55-7215s-30s-45s30725min;112forever1构建好质粒后进行转化，并挑菌送测序。测序正确后提质粒，IgH-（A)knobs并进行AfeⅠ、NheⅠ双酶切。3)载体IgH（B）-CL-holes的构建1/CL片段PCR扩增：模板：IgL载体引物：7F+7R2/CH2+3片段PCR扩增：模板：IgH（T366S、T366S、L368A、Y407V突变）引物：8F+8R3/CL片段与CH2+3OverlapPCR：模板：CL与CH2+3引物：7F+8R4/CL-CH2+3片段克隆进IgH载体（IgH经AfeⅠ和NotⅠ双酶切）5/PCR扩增扩增体系：试剂体积（μL/孔）2xPrimeSTARMAX25PrimerF（10μM）1PrimerR（10μM）1模板DNA2去离子水21总反应体积5044 广州医科大学硕士学位论文扩增条件：温度（℃）反应时间循环数953min198-55-7210s-15s-1Kb/min30727min;112forever14)载体IgL（B）-CH1构建1/CH1片段PCR扩增：模板：IgL载体引物：9F+9R2/PCR扩增详见2.2.2.2的3）5/3/将CH1片段克隆进IgL载体（IgL经AfeⅠ和NotⅠ双酶切）4/构建好IgL（B）-CH1质粒后进行转化，并挑菌送测序，测序正确后提质粒并进行AfeⅠ、NheⅠ双酶切。2.2.2.3表达质粒的构建1)Ab-206：IgH-H206Ab-4E6：IgH-H4E6IgL-L206IgL-L4E62)CrossMab-M1质粒：IgL-L2063)CrossMab-M2质粒：IgH-H206-knobs1/V(H206）片段PCR扩增：模板：IgH-H206引物：10F+10R2/V(H206）片段与IgH（A）knobs载体连接构建成IgH-H206-knobs4)CrossMab-M3质粒：IgH（B）-H4E6-CL-holes1/V(H4E6）片段PCR扩增：模板：IgH-H4E6引物：11F+11R2/V(H4E6）片段与IgH（B）-CL-holes载体连接构建成IgH（B）-H4E6-CL-holes5)CrossMab-M4质粒：IgL（B）-L4E6-CH11/V(L4E6）片段PCR扩增：模板：IgL-L4E645 广州医科大学硕士学位论文引物：12F+12R2/V(L4E6）片段与IgL（B）-CH1载体连接构建成IgL（B）-L4E6-CH12.2.3DVD-Ig双特异性抗体构建2.2.3.1结构设计我们选择了H1/CA09中和抗体Ab-206与H5/HK97中和抗体Ab-4E6，DVD-Ig具有双可变区，由Linker短肽结构将一个单抗的VL和VH连接到另一个单抗VL和VH的N端，成为一个4价双特异性IgG抗体分子，其每一侧Fab臂都可以结合两个抗原。我们选择了将V/Ab-206（在外）通过Linker连接到V/4E6N端的方向（如图3.2所示）。图3.2DVD-Ig技术示意图，两个抗体可变区在序列水平和空间结构上的处理2.2.3.2Linker的设计我们选择人IgGCL和CH1区N端的5-6个氨基酸作为DVD的linker结构。具有良好的柔韧性，同时不会形成影响结构和功能的二级结构。序列如下：重链：ASTKGPSVFPLAPGCAAGTACTAAAGGTCCTTCCGTCTTTCCACTAGCGCCG轻链：RTVAAPSVFIFPCGAACCGTAGCCGCTCCTTCAGTATTTATATTTCCC2.2.3.3DVD-Ig双可变区串联的表达质粒构建1)IgH-DVD-H206-H4E6质粒构建1/H206片段扩增：模板：IgH-H20646 广州医科大学硕士学位论文引物：13F+13R2/H4E6片段扩增：模板：IgH-H4E6引物：14F+14R3/H206片段与H4E6片段进行OverlapPCR：模板：H206+H4E6引物：13F+14R4/H206-H4E6片段克隆进IgH载体（经AfeⅠ、NheⅠ双酶切）2)Ig-L-DVD-L20-L4E6质粒构建：1/L206片段扩增：模板：IgL-L206引物：15F+15R2/L4E6片段扩增：模板：IgL-L4E6引物：16F+16R3/L206片段与L4E6片段进行OverlapPCR：模板：L206+L4E6引物：15F+16R4/L206-L4E6片段克隆进IgL载体（经AfeⅠ、KpnⅠ双酶切）2.2.4抗体表达转染详细操作步骤参照4.3.5.5转染质粒搭配：（1皿10厘米培养皿）Ab-206：15ugH206+15ugL206Ab-4E6：15ugH4E6+15ugL4E6DVD-Ig：15ugIgH-DVD-H206-H4E6+15ugIgL-DVD-L20-L4E6CrossMab：15ugM1（IgL-L206）+‘’15ugM2（IgH-H206-knobs）+15ugM3（IgH（B）-H4E6-CL-holes）+15ugM4（IgL（B）-L4E6-CH1）2.2.5表达上清纯化（proteinA）详细操作参照1.2.4.747 广州医科大学硕士学位论文2.2.6纯化产物进行SDS-PAGE凝胶电泳并拷染详细操作参照1.2.4.32.2.7结合活性检测（ELISA）详细操作参照1.2.5.32.2.8中和活性检测（BMN）详细操作参照4.2.32.3结果2.3.1抗体纯化产物SDS-PAGE胶考染由纯化抗体产物的拷染图（图3.3）可以看出，DVD-Ig双特异抗体的轻重链成功表达，DVD-Ig-H大小约70KD左右，DVD-Ig-L在40KD左右（图3.3A），明显比两个亲本抗体大。而CrossMab由于IgH（B）-H4E6-CL-holes中的CH1被CL替换了，蛋白大小会比IgH-H206-knobs小，所以在还原条件下会看到两条重链两条轻链（图3.3B）。AB图.3.3双特异性抗体纯化产物SDS-PAGE胶考染。图A为DVD-Ig与两个亲本单抗拷染结果图；图B为CrossMab与两个亲本单抗拷染结果48 广州医科大学硕士学位论文2.3.2双特异抗体结合活性检测经过ELISA检测两个双特异抗体以及两个亲本抗体对H1N1/CA09和H5N1/HK97病毒的HA蛋白的结合活性（图3.4），两个双特异性抗体对两个亚型的结合能力跟亲本相当，或略低于亲本。H5图3.4双特异抗体与亲本单抗对流感病毒H1N1和H5N1的HA结合活性检测。图A&B为DVD-Ig和两亲本抗体H1及H5结合活性检测；图C&D为CrossMab和两亲本抗体H1及H5结合活性检测2.3.3双特异抗体中和活性检测使用BMN微量中和试验检测两个双特异抗体以及两个亲本抗体对病毒H1/CA09-Luc和H5/HK97-Luc（100TCID50）两种病毒的中和效价。由（表7）可见两种双特异抗体对两个亚型病毒的中和活性都出现明显的降低，但是CrossMab(206/4E6)较DVD-Ig(206/4E6)下降明显。而DVD-Ig(206/4E6)对H1/CA09中和活活性明显优于对H5/HK97的中和活性。49 广州医科大学硕士学位论文AB图3.5双特异抗体中和活性检测。图A为DVD-Ig、CrossMab与两亲本单抗对H1/CA09-Luc的中和活性检测；图B为DVD-Ig、CrossMab与两亲本单抗对H5/HK97-Luc的中和活性检测表3.1DVD-Ig与CrossMab与两亲本单抗对H1及H5中和活性检测IC50(ng/mL)Ab-206Ab-4E6CrossMab(206/4E6)DVD-Ig(206/4E6)H1/CA09-Luc1.27—63.17.71H5/HK-Luc—1.9536.722.22.4讨论与小结双特异抗体(bispecificantibody,BsAb)是指可以特异性结合两种不同抗原的抗体。因为具有天然IgG结构的双特异抗体表达和纯化工艺和单抗相似，具有Fc效应且体内半衰期长，同时避免了引入非天然肽段而引起的免疫原性问题，因此本研究尝试利用DVD-Ig和CrossMab两种技术构建了针对H1/CA09和H5/HK97的双特异抗体。DVD-Ig具有双可变区，由Linker短肽结构将一个单抗的VL和VH连接到另一个单抗VL和VH的N端，成为一个4价双特异性IgG抗体分子，其每一侧Fab臂都可以结合两个抗原。DVD-Ig在体内非常稳定，具有良好的理化性质和药代动力学特性。抗体结构中Linker的选择是DVD构建的核心问题，我们选择人IgGCL和CH1区N端的5-6个氨基酸作为DVD的linker结构。这样的linker呈一种柔性环样折叠，具有良好的柔韧性，同时不会形成影响结构和功能的二级结构，此特征非常适合作为抗体结构域间的linker。此外该linker是IgG分子的天然组分，与非天然IgG来源的氨基酸序列所带来的结构不稳定性和免50 广州医科大学硕士学位论文疫原性相比具有明显的优势。CrossMab是一种二价双特异抗体，该抗体的Fab都有正确的轻重链配对，结构上呈Y型和天然IgG分子具有极其相似的结构。为了保证轻重链的正确配对，CrossMab利用了两种技术，分别是杵臼技术（Knobs-into-holes技术）和交叉技术（Crossover技术）。一侧抗体臂不变，将另一侧抗体的CL和CH1交叉，避免了两个抗体轻链的错配。X-射线晶体衍射显示，CH3区之间的相互作用在重链Fc段分子间缔合过程中起主导作用，因此在CH3区进行定点突变，组装形成一个“杵臼”结构，从而实现了不同来源的两条重链形成稳定的异源二聚体。杵臼的结构所需定点突变包括一侧抗体重链的T366W和另一侧抗体重链的T366S、L368A、Y407V突变，此外我们在抗体重链一侧引入S354C突变另一侧引入Y349C突变，引入的两个半胱氨酸残基形成二硫键，使抗体结构更稳定。本研究利用本实验室筛选获得的流感病毒中和抗体构建了以上两种类型的双特异抗体。验证了利用DVD-IG和CrossMab两种方法构建流感病毒双特异抗体的可行性。通过载体改造、分子克隆、抗体表达纯化、SDS-PAGE电泳鉴定、ELISA检测抗体结合活性、荧光病毒检测抗体中和效价，结果表明双特异抗体构建成功，具有结合两种特异性抗原并中和两种亚型流感病毒的能力，但在其广谱性提高的同时中和效价有所下降。CrossMab(206/4E6)较DVD-Ig(206/4E6)下降明显，CrossMab对H1和H5中和活性分别下降50倍和19倍，DVD-Ig分别下降7倍和11倍，由此可见，CrossMab中CL和CH1的互换会对4E6的活性有一定影响；而DVD-Ig中，在抗体V区在外端的Ab-206活性影响会更小，这将为或许的研究提供很好的参考。在抗病毒药物研发中主要围绕“广谱”和“高效”两个主题。单抗鸡尾酒（monoclonalantibodycocktails）治疗方法主要涉及各单抗组分之间的配比和稳定性和相互作用，双特异抗体与之相比很好的解决了这些问题，但如何在提高广谱性的同时提高效价是抗病毒双特异中和抗体未来面临的问题。51 广州医科大学硕士学位论文全文总结综合以上研究结果，本文总结出以下结论：1.基于荧光流感病毒（IVA-Luc）建立的微量中和试验筛选方法用于抗流感中和抗体研发，可明显提高流感单克隆抗体筛选工作的效率，大大降低筛选和后期克隆工作，而且加上其他亚型的荧光病毒，筛选流感广谱抗体的机率大大升高，这为我们的抗体研发工作带来很大的便利。2.成功了构建针对两种亚型流感病毒的双特异性抗体，并通过与亲本抗体的功能对比发现，双特异抗体对病毒的中和能力出现不同程度的下降，但是DVD-Ig对抗体活性影响明显比CrossMab小，而且跟研究报道的情况一致，DVD-Ig两个V区基因的串联方式以及CrossMab中的CL与CH1互换，对抗体的活性有一定的影响。通过针对两种亚型流感病毒的双特异性抗体研究的尝试，为后续的抗体优化改造研究提供了可贵的经验和依据。52 广州医科大学硕士学位论文参考文献[1]Palese,P.,Influenza:oldandnewthreats.NatMed,2004.10(12Suppl):p.S82-7.[2]LiH,CaoB.PandemicandAvianInfluenzaAVirusesinHumans:Epidemiology,Virology,ClinicalCharacteristics,andTreatmentStrategy.ClinChestMed2017;38:59-70[3]WebsterRG,BeanWJ,GormanOT,etal.EvolutionandecologyofinfluenzaAviruses.MicrobiolRev1992;56:152-179[4]Gamblin,S.J.andJ.J.Skehel,Influenzahemagglutininandneuraminidasemembraneglycoproteins.JBiolChem,2010.285(37):p.28403-9.[5]HashemAM.ProspectsofHA-baseduniversalinfluenzavaccine[J].BioMedresearchinternational,2015,2015.[6]Radomski,J.P.,etal.,MappingoftheinfluenzaAhemagglutininserotypesevolutionbytheISSCORmethod.ActaBiochimPol,2014.61(3):p.441-51.[7]UrbaniakK,Markowska-DanielI.Invivoreassortmentofinfluenzaviruses.ActaBiochimPol2014;61:427-431[8]WebsterRG,BeanWJ,GormanOT,etal.EvolutionandecologyofinfluenzaAviruses.MicrobiolRev1992;56:152-179[9]RenY,LiC,FengL,etal.ProtonchannelactivityofinfluenzaAvirusmatrixprotein2contributestoautophagyarrest[J].Journalofvirology,2016,90(1):591-598.[10]PintoLH,HolsingerLJ,LambRA.InfluenzavirusM2proteinhasionchannelactivity[J].Cell,1992,69(3):517-528.[11]Palese,P.,etal.,Characterizationoftemperaturesensitiveinfluenzavirusmutantsdefectiveinneuraminidase.Virology,1974.61(2):p.397-410.[12]CoxNJ,SubbaraoK.Globalepidemiologyofinfluenza:pastandpresent.AnnuRevMed2000;51:407-421[13]Wang,W.,etal.,IntermonomerInteractionsinHemagglutininSubunitsHA1andHA2AffectingHemagglutininStabilityandInfluenzaVirusInfectivity.JVirol,2015.89(20):p.10602-11.[14]NeuKE,HenryDC,WilsonPC.Heads,stalksandeverythingelse:howcanantibodieseradicateinfluenzaasahumandisease?CurrOpinImmunol2016;42:48-55[15]ToKW,LaiA,LeeKC,etal.Increasingthecoverageofinfluenzavaccinationinhealthcareworkers:reviewofchallengesandsolutions.JHospInfect2016;94:133-142[16]Jain,S.,etal.,Hospitalizedpatientswith2009H1N1influenzaintheUnitedStates,April-June2009.NEnglJMed,2009.361(20):p.1935-44.[17]LozanoR,NaghaviM,ForemanK,etal.Globalandregionalmortalityfrom235causesofdeathfor20agegroupsin1990and2010:asystematicanalysisfortheGlobalBurdenofDiseaseStudy2010.Lancet2012;380:2095-212853 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广州医科大学硕士学位论文综述抗流感病毒广谱中和抗体的研发进展张敏聪综述陈凌（审校）前言：在全球范围内，流感每年引起数百万严重感染病例，并造成约50万人死亡，给全球经济和人类公共卫生带来巨大损失。由于免疫保护效果不稳定、抗流感药物耐药等问题，抗体治疗成为研究热点。在过去十年中，多种单克隆抗体筛选方法的出现和不断完善，让一系列单克隆抗体，特别是具有广谱中和活性的单克隆抗体得以被分离出来。为应对流感病毒容易突变的特点，通过有效的手段获得广谱性更强的抗流感病毒单克隆抗体，并研究抗体的特性，是科研人员共同努力的目标。本文综述，主要介绍目前抗流感病毒广谱中和抗体的研发情况，概述广谱中和抗体的共同特点，为分离获取广谱流感中和抗体的研究工作提供重要参考。关键词：流感病毒单克隆中和抗体广谱活性血球凝集素流行性感冒病毒(influenzavirus)，即流感病毒，是引起流感(influenza)的病原体[1]。流感病毒可分为三个种类型，分别为A、B和C型流感病毒，其中以A型流感毒性和流行性最强，能够引起季节性流感以及流感大流行[2]。每年流感季节，全球高达500万感染流感病例，造成25-50万人死亡[3]。流感病毒表面蛋白，血凝素糖蛋白（HA）是A型和B型流感病毒的疫苗设计与抗体反应的主要抗原。根据HA的系统发生关系可将A型流感病毒分为两组，分别为group1和group2[4][5]。HA蛋白是一个三聚体分子，嵌合在病毒包膜上，主要介导流感病毒与宿主细胞表面唾液酸受体的结合，以及病毒粒子与宿主细胞膜的融合[6].在病毒感染细胞过程中，无活性的HA0分子被裂解成HA1和HA2，从而介导病毒与细胞膜结合与融合，这一过程赋予流感病毒感染性[3]。HA蛋白上含有多个抗原表位，抗HA抗体能中和流感的感染力，因此HA蛋白成为目前流感疫苗研发的主要靶抗原，针对保守抗原表位的广谱中和抗体也成为了流感抗体研发焦点[7]。59 广州医科大学硕士学位论文临床上流感病毒的药物治疗的靶点主要是M2和NA蛋白抑制剂[8][9]，但是耐药报道越发增多[10][11]。SARS冠状病毒[12]、1918[13]和2009H1N1[14]大流行病毒，以及H5N1[15]人畜共患甲型流感病毒引起的严重病毒性肺炎的临床研究表明，使用康复者的血浆具有很好的治疗效果，特别是在症状发作后早期给药，但血浆来源是一个很大的问题。近年来，从浆细胞或记忆B细胞中分离的抗流感A和B病毒HA蛋白（血球凝集素）的广谱中和抗体，可成为一种安全和负担得起的方法，替代使用患者来源的康复血浆。一．抗流感病毒HA球部抗体研发由于容易变异的特性，HA的球形头部抗体的广谱性受到了很大的限制。对HA球部的抗体主要靶向结合唾液酸受体结合区域RBS(receptor-bindingsite)，此类抗体体外一般能检测出HAI活性。球部抗体只能识别某个HA亚型内抗原性相似的流感病毒株，一系列针对A型流感(例如H1，H3，H5与H7)同一亚型中几个病毒株的单克隆抗体已有报道[16][17][18]。另外一组类似的抗体，如CR8033是对B流感病毒多种亚型均有中和活性的广谱抗体，其结合位点跨越HA的RBS部位。此外，还有一组球部抗体，CR8071,5A7和46B8的结合位点主要位于HA蛋白球部的底部[19][20][21]。有文献报道，针HA蛋白球部的一组较为稀有的广谱单克隆抗体也成功被分离。它们的作用靶点是HA蛋白球部相对保守的唾液酸结合位点，如C05[22]，S139/1和[23]F045-092[24]等。然而这一类的广谱性还是有限，只能中和group1和group2的若干个亚型的某些病毒株(S139/1:H1,H2,H3,H13,H16)(F045-092:H1,H2,H3,H13)。由于球部区域的容易突变，针对HA球部的抗体难以产生广谱性很强的抗体，需要寻找结构上更为保守的位点。二．抗流感病毒HA茎部抗体研发相比于HA的球部，其茎部是一个相对保守的区域，靶向HA茎区的抗体很少，其中和病毒能力较低，但在体外和体内实验中显示能够诱导受感染细胞有效的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）[25-27]，针对HA茎区域的抗体通常能中和A型流感病毒跨组的多个亚型。这一类抗体与抗HA头部抗体相比，最常见的茎部广谱抗体是针对group1的病毒的抗体，可通过H1N1亚型疫苗接种或感60 广州医科大学硕士学位论文染诱导产生[28]，例如CR6261、F10、C179和A06等抗体，他们的靶位主要是Group1HA蛋白Trp21疏水位点与α-螺旋区中的保守残基[29-32]。但该位点在Group2HA蛋白上被N-38的糖基化所遮挡，针对group2HA茎部的广谱中和抗体：CR8020、CR8043和9H10的结合表位位于HA蛋白的膜近端区域[33-35]，然而Group1HA的近膜端区域被N-21糖基化所遮挡。基于以上两个原因，分离出能够同时对Group1和2的各亚型具备中和活性的广谱中和抗体变得更加困难。随着越来越多的力量和技术投入到抗流感中和抗体的筛选工作中，能够同时具有Group1和2跨组型的广谱中和活性的流感中和抗体逐渐被分离出来，通过对CR9114,FI6,MEDI8852等一系列广谱中和抗体的X-射线结构分析发现，这些抗体能通过多种结合方式，来应对HA氨基酸多样性以及由group1和group2特异糖基化而形成的构象限制[36.20.37]。尽管这些抗体中和的广谱性比较强，但依然会存在部分逃逸的亚型或者分离株，例如CR9114，能够与多个亚型的A型流感病毒和B型流感病毒结合，但只能中和A型流感病毒。即使是被认为广谱性较好的MEDI8852抗体，原始分离时不具备中和A型流感Group2H3亚型的活性，经过后期亲和成熟等优化后，使它获得了同时对A型流感所有亚型的中和活性。由此可见，中和活性能覆盖所有亚型流感病毒的抗HA中和抗体是非常稀有的，因此能够获得具有广谱性的中和抗体，并对抗体表位研究、抗体发育成熟过程、抗体保护效果等方面的研究，对流感疫苗设计研发工作具有重要的指导意义。三．抗流感中和抗体研发的展望抗流感病毒HA中和抗体在体内的保护作用，主要是通过四种机制来实现，除了阻断流感病毒与细胞膜上的受体结合，还可以通过抑制病毒与内涵体的膜融合；抑制子代病毒颗粒从宿主细胞释放和抑制胞外蛋白水解酶的活性。而抗HA中和抗体对病毒的中和方式主要取决于抗体与HA蛋白的结合位点。抗HA球部抗体主要依赖阻断病毒进入细胞而其保护作用，但是茎部抗体还能依靠ADCC、DCD和ADCP等Fc段引起的细胞效应来增强其保护效果[38-40]。因此在评价流感抗体的效果时除了体外中和效价，还要进行ADCC、DCD和ADCP等检测和动物体内保护效果验证。61 广州医科大学硕士学位论文抗流感病毒广谱中和抗体具有比抗头部抗体更大优势，使得如何获得广谱性更好的单克隆抗体成为研究的热点。但无论是筛选分离单克隆抗体还是对现有抗体进行改造优化都是一项艰巨的任务，特别是单克隆抗体的筛选工作，如何为这项大海捞针搬的工作开发高效特异的手段以提高筛选的效率，一直是科学家努力尝试解决的问题。基于上述情况，我们尝试利用本实验室成功构建的携带了荧光素酶报告基因的重组流感病毒（IVA-Luc），建立荧光流感病毒微量中和检测方法，基于该方法高灵敏度，操作简便，适合高通量筛查的特点，加上体外单个浆细胞体外培养技术，进行抗流感单克隆中和抗体筛选，直接筛选出分泌中和抗体的B细胞并进行单细胞克隆，探究这种筛选方法的可行性以及优势，为筛选广谱中和抗体打下坚实基础。参考文献[1]Palese,P.,Influenza:oldandnewthreats.NatMed,2004.10(12Suppl):p.S82-7.[2]LiH,CaoB.PandemicandAvianInfluenzaAVirusesinHumans:Epidemiology,Virology,ClinicalCharacteristics,andTreatmentStrategy.ClinChestMed2017;38:59-70[3]LozanoR,NaghaviM,ForemanK,etal.Globalandregionalmortalityfrom235causesofdeathfor20agegroupsin1990and2010:asystematicanalysisfortheGlobalBurdenofDiseaseStudy2010.Lancet2012;380:2095-2128[4]Gamblin,S.J.andJ.J.Skehel,Influenzahemagglutininandneuraminidasemembraneglycoproteins.JBiolChem,2010.285(37):p.28403-9.[5]HashemAM.ProspectsofHA-baseduniversalinfluenzavaccine[J].BioMedresearchinternational,2015,2015.[6]Wang,W.,etal.,IntermonomerInteractionsinHemagglutininSubunitsHA1andHA2AffectingHemagglutininStabilityandInfluenzaVirusInfectivity.JVirol,2015.89(20):p.10602-11.[7]NeuKE,HenryDC,WilsonPC.Heads,stalksandeverythingelse:howcanantibodieseradicateinfluenzaasahumandisease?CurrOpinImmunol2016;42:48-55[8]Wharton,S.A.,etal.,RoleofvirionM2proteinininfluenzavirusuncoating:specificreductionintherateofmembranefusionbetweenvirusandliposomesbyamantadine.JGenVirol,1994.75(Pt4):p.945-8.[9]Wang,C.,etal.,IonchannelactivityofinfluenzaAvirusM2protein:characterizationoftheamantadineblock.JVirol,1993.67(9):p.5585-94.62 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广州医科大学硕士学位论文研究成果JiashunLi,MincongZhang,PeihaiChen,LingChen.DetectingHA-subtypespecificneutralizingantibodiesusingengineeredbioluminescentinfluenzaAviruses.(inpreparation)XieH,LiC,ZhangM,ZhongN,ChenL.AssociationbetweenIRGMpolymorphismsndtubercμLosisrisk:Ameta-analysis.Medicine(Baltimore).201765 广州医科大学硕士学位论文致谢指尖在键盘穿梭，思绪已如期而至。三年时光转眼即逝，追忆往昔，彷如昨日。三年硕士学习让我受益良多，我的知识在这里得得以丰富，我的能力在这里获得锻炼，我的视野在这里变得开阔，如今我又再一次站在人生十字路口，此次，我信心满满，斗志昂扬，这一切因为有陪我一路走来的你们。在这里，我以至诚之心感谢三年学习生活中给予我帮助和支持的每一位。首先，感谢我的导师陈凌老师。是陈老师给我靠近科研，了解科研的机会，让我能感受到生命科学之奇妙。也是陈老师的谆谆教导，培养我不断开拓思维，勇敢尝试，细心求证的科研素养。他勤勉的工作态度，严谨的学术精神，开阔的学术视野，无不深深影响着我。其次，我要感谢我的指导老师李楚芳老师。感谢他在我三年的学习和研究中对我悉心培养。李老师在科研和生活上都给我很多宝贵的指导和支持，教会我很多实验技巧以及思考问题的能力，此外还教会我很多为人处事的道理。感谢牛学锋博士、潘蔚绮博士、李平超师兄、梁任山师兄、李嘉祺师兄、冯玉鹏师兄和吕惠彬，感谢他们为我课题顺利进行给予的莫大支持，感谢他们在单细胞克隆，荧光病毒实验，流式细胞分选和双特异抗体技术等方面的慷慨帮助。感谢李嘉顺师姐在荧光病毒微量中和实验研究中的前期工作，为本论文的顺利完成打下坚实基础。感谢谢范文霞师姐、谢浩俊师兄、揭飞龙师兄，孙西魁师兄、李娜对我实验技能的耐心教导，感谢王羽钦、盛才敏和周苏琼给我实验上的帮助。感谢陈凌实验室大家庭的每一位成员对我照顾和帮助。感谢实验室成员冯立强师兄、徐伟师兄、汪乾师姐、彭娇娇师姐、王洋师兄、陈培海师兄、龙柳芬、张帆、冯嘉敏、雷慧、董记、蔡雅媛、刘晓琳、陈志锋，陈润生、杨彦嘉、邓琳等师兄师姐、师弟师妹对我的关心和支持。是你们的包容和帮助陪伴我度过了这充实精彩的三年。感谢我的研究生同学兼好友：龚韩湘、罗连民、黄宏轩、陈东、给我三年硕士生活增添很多欢乐和美好回忆。66 广州医科大学硕士学位论文最后衷心的感谢一直体谅我、鼓励我和支持我的家人。在我遇到困难的时候是你们给我勇气和动力，让我能安心学业。67