新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及VP2蛋白在昆虫细胞中的表达

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分类号S852.6密级非密UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及VP2蛋白在昆虫细胞中的表达IdentificationofNovelDuckParvovirusDS15StrainandExpressionofVP2proteininInsectCells李琦指导教师姓名刘光清研究员（上海兽医研究所上海200241）吴润教授（甘肃农业大学兰州730046）学科专业名称预防兽医学研究方向兽医微生物学与免疫学论文答辩日期2017年5月22日学位授予日期2017年6月答辩委员会主席刘在新研究员评阅人孙晓林教授独军政副研究员2017年6月 ClassificationNo.:S852.6Secrecylevel:ZeroUDC:Schoolcode:10733GansuAgriculturalUniversityADissertationfortheMaster’sDegreeIdentificationofNovelDuckParvovirusDS15StrainandExpressionofVP2proteininInsectCellsPostgraduate:LiQiAdvisor:Prof.LIUGuang-qingProf.WuRunSpeciality:PreventiveVeterinaryScienceResearchField:VeterinaryMicrobiologyandImmunologySubmittedTime:June,2017Address:Lanzhou,China,730070 甘肃农业大学2017届硕士学位论文摘要摘要2014年以来，中国东部许多肉鸭养殖场发生了一种新的鸭病毒性传染病，临床上主要表现为雏鸭生长发育迟缓，上下喙萎缩，鸭舌头肿大外伸，行走困难。暂命名为鸭短喙侏儒综合症（Shortbeakanddwarfismsyndrome，SBDS）。该病病死率很低，但发病率10%~30%，部分鸭群发病率达到50%。给养鸭业造成较为严重的经济损失。由于这是一种在我国新出现的鸭传染病，其致病病原尚不清楚，更缺乏有效的疫苗或治疗性药物。为此，本研究对采自安徽省砀山县某养殖场发病鸭的病料进行了病原分离和鉴定，同时还对其全基因组序列进行了克隆和测序，此外我们还利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中尝试表达了病原的结构蛋白，为进一步研制新型疫苗或药物奠定基础。首先，对砀山发病鸭实质脏器进行了RT-PCR/PCR检测，在排除其他常见鸭病毒性传染病病原的前提下，初步确定该病病原为新型鸭细小病毒（Novelduckparvovirus，NDPV）。然后，将组织研磨液接种SPF鸭胚，盲传3代后鸭胚出现规律性死亡。在鸭胚尿囊液中-4.2检测到了新型鸭细小病毒，其病毒滴度（ELD50）为10/0.2mL。将感染鸭胚的尿囊液进行浓缩和纯化，在扫描电镜下可见直径20nm左右，正二十面体病毒粒子。用病毒液感染1日龄雏鸭，可复制出与临床症状相似的鸭短喙侏儒症状，进一步证实分离的鸭细小病毒是造成鸭短喙侏儒综合症的关键性病原。参照Genbank登录的鹅细小病毒（Gooseparvovirus,GPV）B株的基因序列，我们设计了6对特异性引物，对NDPVDS15株的全基因序列进行了分段扩增。试验结果显示，NDPVDS15株病毒基因组全长5104nt，结构与鹅细小病毒相似，两端为ITR，中间为两个大开放阅读框。与其他水禽细小病毒进行全基因组同源性比对，分析结果显示DS15株与鸭短喙侏儒症分离株GPVSDLC01同源性最高，达到99.8%，与其他GPV同源性在92.6%~97.2%之间，与番鸭细小病毒（Muscovyparvovirus，MDPV）同源性在81.2%~85.4%之间。DS15株NS1蛋白和VP1蛋白的氨基酸序列分析结果显示，与传统的GPV相比，我们分离到的NDPVDS15株和其他几株鸭短喙侏儒症分离株在NS1和VP1蛋白氨基酸水平具有极高相似性，氨基酸突变情况基本相同。系统发育进化树显示，水禽细小病毒分为GPV和MDPV两大分支，DS15株与其他几个SBDS分离株处于GPV分支且单独形成一个小分支。为了制备检测NDPV的多克隆抗体，本文用PCR法扩增NDPV的VP3基因，克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中，转化大肠杆菌BL21菌株，以IPTG诱导表达重组VP3蛋白，然后利用包涵体纯化方法纯化重组VP3蛋白，免疫试验兔获得多克隆抗体。Western-blot检测结果表明，该抗体能与重组的NDPVVP3蛋白及自然感染的NDPV发生反应，证明制备的抗体具有良好的抗原反应性。为给研发抗NDPV感染的亚单位疫苗提供候选抗原，我们用PCR方法扩增了DS15株VP2基因，然后将其插入供体质粒pFastBacHTA中，构建重组pFastBacHTA-VP2供体质粒。再转化DH10Bac感受态细胞，经蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒Bacmid-HTA-VP2。I 甘肃农业大学2017届硕士学位论文摘要用该重组质粒转染sf9细胞，48h后分别用间接免疫荧光和Westernblot试验检测靶基因的表达。结果表明我们在sf9细胞中成功表达出VP2蛋白，电镜负染结果进一步证明，所表达的重组VP2蛋白能够在昆虫细胞中自我组装形成病毒样颗粒。动物实验结果表明所制备的病毒样颗粒具有良好免疫原性。这些研究结果为进一步研制NDPV诊断抗原和病毒样颗粒疫苗奠定了基础。关键词:鸭短喙侏儒综合征；新型鸭细小病毒；全基因序列；多克隆抗体；病毒样颗粒II 甘肃农业大学2017届硕士学位论文SummarySummarySince2014,aninfectiousdiseasehasemergedincommercialbroilerduckbreedingfarmineasternChina.Thediseasedducksdisplayedsymptomssuchasshortbeakwithprotrudingtonguesandsignificantgrowthretardation.BasedontheClinicalsigns,thediseasewastentativelydesignatedshortbreakanddwarfismsyndrome(SBDS).Themorbidityamongduckshasbeen20%to30%.SBDShascausedsignificanteconomiclossesinthewaterfowlindustry.Thepathogenofthenewinfectiousdiseaseisnotclear.Effectivevaccineandtherapeuticdrugswerelackingforthisdisease.Inthisstudy,anovelduckparvoviruswasisolatedfromdiseasedducksinDangshan,Anhuiprovince.Thegenomeofthepathogenwasclonedandsequenced,andthenweusedbaculovirus-insectcellexpressionsystemtoexpressionstructuralproteinsofthepathogenandevaluatetheimmunogenicity.Thislaidagoodfoundationofdevelopingsubunitvaccine.Inthisstudy,wefirstanalyzedtissuesfromaffectedduckandpreliminarydetecteditwasanovelduckparvovirusafterothercommonduckviruswereexcluded.Thesupernatantofsplanchnictissueswasinoculatedintotheallantoiccavityof9-day-oldduckembryosafterfilteredthrough0.22μmfilter.The-4.2/embryoswerekilledafterthreepassagesandtheELD50was100.2mL.Theviruseswerepurifiedwithsucrosedensitygradientcentrifugationandwereobservedunderelectronmicroscopy,akindof22nmvirionswithclassicalparvoviruscharacterswasobservedbyelectronmicroscopy.ThesignsofSBDScouldbereproducedbyinoculationofallantoicfluidsin1-dayoldduckings.ThisfurtherprovedthatnovelduckparvovirusisanimportantpathogenoftheSBDS.BasedonthegenomeofGPVisolateB,sixpairsofprimerweredesignedtoamplifythecompletegenomeofNDPVDS15strain.Thesequencingresultsdemonstratedthatthefull-lengthgenomeofNDPVDS15strainwas5104nucleotidesinlength.Thefull-genomecontainstwomajoropenreadingframesandtwoinvertedterminalrepeat(ITR)atthe5'and3'endofthegenome,thisissimilartoGPV.TheDS15straingenomesharedthehighestidentity(99.8%)withtheSDLC01strain,whichisalsoisolatedfromSBDSofducks.TheDS15strainshared92.6%~97.2%homologywithotherreferenceGPVsand81.2%~85.4%homologywithMDPVs.TheaminoacidsequenceofNS1proteinsandVP1proteinswerepredictedfromthenucleotidesequenceofDS15.ComparedwithclassicGPV,DS15strainandotherSBDSisolatesshowedhighestsimilarityonaminoacidsequenceandtheysharedthesameaminoacidsubstitutions.ThephylogenetictreedisplayedthatDS15wasclusteredintoabranchwithotherSBDSisolatesandtheywereclusteredintoadistinctsubgroupincludedintheGPV-relatedviruslineage.InordertodevelopthepolyclonalantibodiestodetectNDPV,VP3genewasamplifiedbyPCRandclonedintotheplasmidpGEX-4T-1,thentherecombinantplasmidpGEX-VP3wastransformedintoE.coliBL21forexpressionandinducedwith1.0mMofIPTG.NDPVVP3proteinwaspurifiedbythepurificationmethodofinclusionbodyandvaccinatedintorabbittoproducepolyclonalantibodies.TheresultsofWesternblotshowedthatrecombinantVP3proteinhasgoodimmunogenicityandpolyclonalantibodiescanbeusedtodetectNDPV.III 甘肃农业大学2017届硕士学位论文SummaryToprovidecandidateantigensforsubunitvaccinesofNDPV.VP2genewasamplifiedbyPCRandinsertedintovectorpFastBacHTA.ThenthenewplasmidpFastBacHTA-VP2wastransformedintoDH10BacchemicallycompetentcellandtargetgeneinsertedintoBacmidplasmid.Afterwhite-blueplaqueselection,wegottherecombinantbacmidBacmid-HTA-VP2.Thenrecombinantbacmidtransfectedsf9insectcells.TheexpressionoftargetgenewasdetectedbyindirectimmunofluorescenceandWesternblotafter48hours,theresultsshowedthatVP2proteinwassuccessfullyexpressedinsf9insectcell.TheresultofnegativestainingelectronmicroscopefurtherprovethatrecombinantVP2proteinofNDPVwasabletoself-assembleintoVLPswithasizeandappearancesimilartothatofwild-typeofNDPVvirions.AnimalexperimentsshowedthatVLPshadgoodimmunogenicityforNDPV.ThisstudylaidagoodfoundationofdevelopingsubunitvaccineforNDPV.Keywords:shortbreakanddwarfismsyndrome；Novelduckparvovirus;completenucleotidesequence;polyclonalantibody;virus-likeparticlesIV 甘肃农业大学2017届硕士学位论文目录目录摘要................................................................................................................................................ISummary........................................................................................................................................III缩略词英汉对照表......................................................................................................................VIII第一章引言.................................................................................................................................11水禽细小病毒研究进展..............................................................................................................11.1水禽细小病毒病简介.......................................................................................................11.2水禽细小病毒病原学特征...............................................................................................11.2.1分类地位及形态结构............................................................................................11.2.2理化及血凝特性....................................................................................................21.2.3宿主范围及培养特性............................................................................................21.3水禽细小病毒分子生物学特征.......................................................................................21.3.1基因组结构............................................................................................................21.3.2结构蛋白................................................................................................................31.3.3非结构蛋白............................................................................................................31.4水禽细小病毒诊断方法..................................................................................................31.5水禽细小病毒病的预防..................................................................................................42杆状病毒表达系统概述.............................................................................................................52.1杆状病毒简介...................................................................................................................52.2杆状病毒表达系统简介...................................................................................................52.3杆状病毒表达系统在VLPs生产上应用.........................................................................63研究目的及意义.........................................................................................................................6第二章新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及全基因组序列测定........................................71试验材料......................................................................................................................................71.1病料来源..........................................................................................................................71.2鸭胚及试验动物..............................................................................................................71.3主要试剂及试剂盒..........................................................................................................71.4主要仪器..........................................................................................................................72试验方法.....................................................................................................................................82.1病料处理..........................................................................................................................82.2病毒PCR/RT-PCR快速诊断............................................................................................82.2.1病毒核酸提取.......................................................................................................82.2.2引物设计与合成....................................................................................................82.2.3PCR扩增................................................................................................................92.3病毒分离...........................................................................................................................92.4病毒纯化及电镜观察......................................................................................................92.5病毒鸭胚半数致死量（ELD50）的测定..........................................................................92.6动物回归实验................................................................................................................102.7病毒全基因组测序及分析.............................................................................................102.7.1引物的设计与合成..............................................................................................10V 甘肃农业大学2017届硕士学位论文目录2.7.2PCR扩增各基因片段..........................................................................................102.7.3扩增片段的克隆..................................................................................................112.7.4序列拼接分析......................................................................................................113结果............................................................................................................................................123.1临床样品PCR检测结果................................................................................................123.2病毒的分离.....................................................................................................................123.3病毒电镜观察结果.........................................................................................................123.4鸭胚半数致死量测定（ELD50）....................................................................................123.5动物回归试验.................................................................................................................133.6全基因序列测定与分析.................................................................................................133.6.1NDPV各片段的PCR扩增...................................................................................133.6.2全基因组结构及分析.........................................................................................133.6.3NS1蛋白氨基酸序列分析..................................................................................153.6.4VP1蛋白氨基酸序列分析..................................................................................164讨论...........................................................................................................................................16第三章VP3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备.................................................................181实验材料...................................................................................................................................181.1毒株、菌株及载体及主要试剂....................................................................................181.2主要试剂及试剂盒........................................................................................................181.3主要溶液的配制............................................................................................................181.4实验动物........................................................................................................................192实验方法...................................................................................................................................192.1引物设计与合成............................................................................................................192.2VP3基因的扩增.............................................................................................................192.3重组质粒pGEX-VP3的构建与鉴定.............................................................................192.4VP3基因的诱导表达及鉴定.........................................................................................192.5重组VP3蛋白的纯化...................................................................................................202.6多克隆抗体的制备........................................................................................................202.7抗体特异性分析............................................................................................................203结果...........................................................................................................................................203.1VP3基因的克隆及表达载体的构建.............................................................................203.2重组VP3蛋白的诱导表达分析及纯化.......................................................................213.3重组VP3蛋白的Western-blot检测............................................................................223.4Western-blot鉴定多克隆抗体......................................................................................224讨论...........................................................................................................................................22第四章VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定.........................................................................241实验材料...................................................................................................................................241.1菌株、载体及细胞........................................................................................................241.2主要试剂及仪器.............................................................................................................242实验方法...................................................................................................................................242.1引物设计与合成.............................................................................................................242.2目的基因VP2的扩增...................................................................................................25VI 甘肃农业大学2017届硕士学位论文目录2.3重组供体质粒pFastBacHTA-VP2的构建与鉴定........................................................252.4重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-HTA-VP2的构建与鉴定...........................................252.4.1重组供体质粒转化感受态细胞..........................................................................252.4.2重组杆状病毒质粒的提取.................................................................................252.4.3.重组杆状病毒质粒的鉴定..................................................................................262.5重组杆状病毒rBac-HTA-VP2的拯救...........................................................................262.5.1重组杆状病毒质粒转染sf9细胞......................................................................262.5.2重组杆状病毒的传代.........................................................................................272.5.3重组杆状病毒TCID50的测定...........................................................................272.6VP2在sf9细胞中的表达与检测...................................................................................272.6.1重组VP2蛋白的间接免疫荧光（IFA）检测...................................................272.6.2重组VP2蛋白的Western-blot检测.................................................................272.6.3重组VP2蛋白的纯化及电镜观察....................................................................272.7重组VP2蛋白免疫原性初步研究...............................................................................282.7.1VLPs油乳剂疫苗的制备.....................................................................................282.7.2动物免疫试验.....................................................................................................283结果...........................................................................................................................................283.1VP2基因的扩增.............................................................................................................283.2重组供体质粒的鉴定....................................................................................................283.3重组杆状病毒质粒Bacmid-HTA-VP2的PCR鉴定......................................................293.4重组杆状病毒rBac-HTA-VP2的构建...........................................................................293.5重组杆状病毒rBac-HTA-VP2毒价测定......................................................................303.6重组VP2蛋白的IFA检测............................................................................................303.7重组蛋白的Western-blot检测....................................................................................313.8VLPs的电镜观察............................................................................................................313.9VP2特异性抗体水平检测.............................................................................................324讨论...........................................................................................................................................32全文总结.......................................................................................................................................34参考文献.......................................................................................................................................35致谢.............................................................................................................................................40作者简介.......................................................................................................................................41导师简介.......................................................................................................................................42原创性声明......................................................................................................43VII 甘肃农业大学2017届硕士学位论文英文略缩表缩略词英汉对照表英文缩写英文全称中文名称AmpAmpicillin氨苄青霉素BSAAlbuminfrombovineserum牛血清白蛋白bpBasepair碱基对ddH2ODoubledistillateH2O双蒸水ELD50medianembryolethaldose胚半数致死量FBSFatalcalfserum胎牛血清FITCFluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素GenGentanmicin庆大霉素GPVGooseparvovirus鹅细小病毒HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶hhour小时IFAIndirectionImmunofluorescenceassay间接免疫荧光ITRinvertedterminalrepeats末端倒置重复序列KanKanamycin卡那霉素kDaKilodalton千道尔顿LLiter升MDPVMuscovyparvovirus番鸭细小病毒minminute分钟NDPVNovelduckparvovirus新型鸭细小病毒NSnon-structureprotein非结构蛋白ntnucleotide核苷酸ORFopeningreadingframe开放阅读框ODOpticaldensity吸光度PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液RNARibonucleicacid核糖核酸r/minRevolutionperminute转/分钟SDSsodiumdodecylsulfate,sodiumsalt十二烷基硫酸钠secSecond秒VIII 甘肃农业大学2017届硕士学位论文英文略缩表TetTetracycline四环素μLmicroliter微升μgmicrogram微克VPviralstructureprotein衣壳蛋白IX 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第一章引言第一章引言1水禽细小病毒研究进展1.1水禽细小病毒病简介水禽细小病毒病是由水禽细小病毒（Waterfowlparvovirus）引起的高发病率和高死亡[1-7]率的病毒性传染病，是当前危害养鹅业和养鸭业最常见的疫病。主要包含鹅细小病毒病、短喙侏儒综合症以及番鸭细小病毒病。鹅细小病毒病又称小鹅瘟、Derszy's病，是由鹅细小病毒引起的雏鹅和雏番鸭高度接[8]触性病毒性传染病。该病在临床上主要表现为：精神萎靡，食欲废绝，下痢，瘫痪，解剖肠道可观察到特征性的栓塞。5-22日龄之间尤其是9日龄以内雏鹅最易受到感染，发病[9]率可以达到100%。随着日龄增加，死亡率会降低。该病最早在我国发现并分离到病原，到目前为止，已经在多个国家陆续报道有此病流行，给养鹅业造成严重经济损失。番鸭细小病毒俗称“三周病”，是由番鸭细小病毒引起的以腹泻、喘气和双脚无力为主[10-12]要症状的鸭传染病。主要侵害7-21日龄小鸭，发病率25%~60%，死亡率20%~40%。患鸭精神沉郁，呼吸困难，发病后期出现神经症状，角弓反张衰竭死亡。愈后多生长不良，成为僵鸭。该病于1980年由林世堂最早发现并报道，随后在我国南方多省份陆续被报道。目前已经成为危害中国番鸭养殖业的最重要的疾病。鸭短喙-侏儒综合症又称“鸭大舌病”，近年来也被证明是由世系截然不同的鹅细小病毒[13,14]引起的传染病，该病主要症状为鸭喙畸形、萎缩变短，舌头肿大伸出并垂在喙外，[15]两腿无力、不愿行走，生长发育障碍，翅腿易折、羽毛凌乱。发病率10%~30%，部分[16]鸭群发病率最高可达50%，但死亡率相对较低。该病最早报道于法国，随后在波兰、[17-20][21]匈牙利和台湾等地均有流行。2014年在我国大陆首次被报道并造成巨大经济损失。1.2水禽细小病毒病原学特征1.2.1分类地位及形态结构水禽细小病毒（waterfowlparvovirus）主要包括鹅细小病毒（gooseparvovirus,GPV）[22]和番鸭细小病毒（Muscovyduckparvovirus，MDPV）。属于细小病毒科（Parvoviridae）[23]细小病毒亚科（Parvovirinae）依赖病毒属（Dependovirus）成员，本属还包括羊腺联病毒（Ovineadeno-associatedvirus）、马腺联病毒（Equineadeno-associatedvirus）、腺联病毒2型（Adeno-associatedvirus2）等。水禽细小病毒最初由于形态、生化和培养特性被划分为细小病毒属，因为与AAV-2在分子水平上同源性更高，最终被划分为细小病毒科依赖[24]病毒属成员。典型的鹅细小病毒粒子为球形或六角形，呈二十面体对称，直径20~25nm，蛋白质衣1 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第一章引言壳由32个长约3-4nm的壳粒构成，无囊膜。电镜下可观察到实心和空心两种粒子形态。空心粒子颗粒内径为12nm，不含核酸。在氯化铯密度梯度中，浮密度约为1.31~1.35g/ml，沉降系数90.5S。在蔗糖溶液中浮密度为1.0810~1.1764g/ml。番鸭细小病毒粒子略大于鹅细小病毒，直径22~25nm。1.2.2理化及血凝特性水禽细小病毒对外界因素具有非常强的抵抗力。病毒无囊膜且结构紧密，对乙醚、氯仿、n-丁醇、0.5%苯酚、脱氧胆酸钠盐、胰酶等均不敏感。在pH3溶液中也不被致弱，对热不敏感，56℃作用1h后仍具有活性。但是对紫外线较为敏感。与本属其他细小病毒[25]不同，水禽细小病毒不能凝集红细胞，但据报道鹅细小病毒可以凝集黄牛精子。1.2.3宿主范围及培养特性GPV的主要宿主是鹅和番鸭，口服和注射均能引起发病。MDPV自然宿主仅限于番鸭。与GPV相比，MDPV的致病性更为专一。二者自然发病仅限于30日龄以内的雏禽。引起鸭短喙侏儒综合症的新型鸭细小病毒目前已知的宿主有番鸭，半番鸭、绿头鸭、樱桃[26]谷肉鸭等。GPV和MDPV均属于自主性细小病毒，不需要借助其他病毒就可以在细胞内进行自[27]主增殖，其DNA必须在宿主细胞核内依赖宿主染色体的复制而复制。二者只能在鹅胚和番鸭内增殖，不能利用其他禽胚增殖。也可用鹅胚成纤维细胞或鸭胚成纤维细胞增殖病毒，但需要同步接毒。原代鹅胚成纤维细胞感染GPV一般3~4d后可观察到细胞病变，主要表现为折光性增强，细胞圆缩，最终脱落。细胞培养物利用伊红-苏木素染色后可观察[28][29]到核内包涵体和合胞体。有研究表明AAV-2可以增强GPV在鹅胚中的增殖能力。新型鸭细小病毒不能在鹅胚和鹅成纤维细胞上增殖。只能利用鸭胚和鸭胚成纤维细胞增殖。1.3水禽细小病毒分子生物学特征1.3.1基因组结构水禽细小病毒基因组为单链线状DNA，含有正链DNA和负链DNA的病毒粒子同时[30]存在且比例基本相同，在提取DNA时极易自发退火形成双链。GPV全长约5106nt，[31][32]MDPV全长5132nt，二者基因组结构基本相同。基因组两端为末端倒置重复序列（invertedterminalrepeats,ITR），两端ITR中间是两个大的开放阅读框（openreadingframe,ORF），两个ORF中间间隔18个碱基的非编码区。左侧ORF包含NS1基因和NS2基因，大小分别为1884nt和1356nt。分别编码非结构蛋白（non-structureprotein,NS）NS1和NS2。右侧ORF包含VP1基因，VP2基因和VP3基因，大小分别为2199nt、1764nt、1605nt。分别编码结构蛋白（viralstructureprotein,VP）VP1、VP2和VP3。非结构基因和结构基因均拥有各自单独的启动子区域。以鹅细小病毒为例，其基因组结构如图1.1。2 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第一章引言图1.1鹅细小病毒基因组结构示意图Fig.1.1Thesketch-mapofGPVgenomestructure1.3.2结构蛋白目前在水禽细小病毒中，关于GPV的研究较多。GPV基因组编码VP1、VP2和VP3三种蛋白，大小分别为82kDa、65kDa、58kDa。三种结构蛋白虽然起始于不同位置，但最终在同一位点终止。其中VP1包含VP2和VP3的全部氨基酸序列，而VP2又包含VP3[33]蛋白的全部氨基酸序列。三个结构蛋白拥有相同的羧基端，成为典型的套式构造。研究表明VP1不参与鹅细小病毒衣壳的形成，也不影响子代病毒的释放，但可能与宿主细胞表面相应受体结合，使病毒粒子进行有效感染。VP1蛋白氨基末端的独特区内含有大量的碱性氨基酸残基，而很多DNA结合蛋白都具有这个明显的特征，因此推测VP1蛋白有[34]促使病毒DNA通过核孔转运至宿主细胞核的功能。GPV的VP1蛋白B细胞线性表位[35]主要位于7个区域（AA35-71、AA123-198、AA423-444、AA474-491、AA531-566、AA616-669、AA678-732）。其中AA426–430(SQDLD)，540–544(DPYRS)，685–691(KENSKRW)是GPV和MDPV的共同抗原表位。VP2和VP3是病毒最重要的免疫性蛋白成分，其中VP3蛋白数量最多，占衣壳蛋白总量的80%。三维结构模拟显示主要是VP3蛋白的多肽链暴露在病毒表面，其他蛋白在表面的比例较少，表明VP3蛋白是GPV的最重要的免疫保护性抗原。HuanyuJu等人利用杆状病毒表达系统表达了分别表达了GPV的三个衣壳蛋白，结果显示三种蛋白均能独自形成GPV病毒样颗粒且具有很强的免疫原性，推测VP3蛋白可能在病毒粒子的形成和稳定性方面起到脚手架作用。1.3.3非结构蛋白水禽细小病毒基因组左侧ORF编码非结构蛋白NS1和NS2，均为磷酸化蛋白。NS蛋白又称Rep蛋白，通常出现在病毒复制的早期，主要功能是对病毒DNA的复制和基因[36]表达进行调控。研究显示GPV的NS蛋白B细胞线性表位主要位于羧基端（AA485-627），尤其是AA498-542。而MDPV和GPV在NS1蛋白区域拥有一个共同的抗原表位[37]RANEPKE（AA503-509）。目前已经证实NS1蛋白有ATP结合活性。NS1和NS2蛋白对细胞有毒性作用，NS2蛋白毒性相对较弱，NS2蛋白可以有效增强NS1蛋白对宿主细胞的毒性作用，也可能与病毒基因组复制和蛋白质的有效合成有关。1.4水禽细小病毒诊断方法目前，水禽细小病毒的检测方法多种多样，临床上可根据病鸭（鹅）的症状和病理变3 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第一章引言化进行初步判断，然后配合实验室诊断方法进一步的确定病原。分离培养病原是水禽细小病毒最经典的诊断方法。无菌研磨病禽内脏制成病毒悬液，接种鸭（鹅）胚尿囊腔或鸭（鹅）胚原代细胞。目前病毒分离培养只作为初步鉴定，进一步诊断仍需配合其诊断方法。[38]琼脂扩散试验和中和试验是传统的实验室血清学诊断方法。郑美玉等利用该方法对鹅细小病毒进行检测，取得良好的效果。酶联免疫吸附试验如今也常用于GPV和MDPV[39][40]的检测。尚绪增等以Rep2蛋白为检测抗原建立GPV间接ELISA方法。杜秋明等将兔抗鹅GPV单抗和抗GPV单抗结合，建立单抗双夹心ELISA方法，为小鹅瘟病毒的诊[41]断提供了简便的诊断方法。邵周伍林等建立的胶体金免疫层析法也为小鹅瘟的快速诊断提供给了新的办法。琼脂扩散实验虽然方法简便但灵敏性相对低，且需要消耗高效价抗血清和浓缩的病毒液。随着分子生物学技术的发展，水禽细小病毒的诊断技术也取得巨大进步，PCR技术和核酸探针技术因耗时更短，敏感性更高，特异性更好而成为分子实验室最常用的诊断方式，极具发展潜力和价值。国内外学者相继建立了更为简便、快速、准确的诊断方法。季艳菊[42][43]等建立了的番鸭三种细小病毒多联PCR检测方法。谢丽基等根据MDPV基因保守序列设计引物，建立了MDPV的LAMP检测法，敏感性达到10pg，是常规PCR敏感性的[44]10倍。余兵等利用建立的核酸斑点杂交法检测GPV，敏感性可达3pg。鸭短喙侏儒综合症的临床诊断较为简单，可根据临床症状做出诊断。该病病原与鹅细小病毒在核酸和氨基酸水平上同源性极高，且国内报道不足，相应的分子生物学诊断方法[45]较少。窦砚国等建立了NDPV套式PCR检测法并得到应用。NiuX等基于病毒VP3基因设计引物和Taq探针，建立了新型鸭细小病毒实时荧光定量PCR检测法，可对新型鸭细小病毒进行定性和定量分析。1.5水禽细小病毒病的预防水禽细小病毒病在治疗方面除抗血清外并没有特效药物，此类疾病以预防为主。控制该病最常用的方法是在产蛋前对种禽进行免疫，接种疫苗后再将抗体传给下一代，使其获得免疫力。目前水禽细小病毒疫苗主要分三大类：弱毒苗、灭活苗、基因工程疫苗。市场上以GPV弱毒苗为主，分为鸭用活疫苗和鹅用活疫苗。程晓霞等对MDPV和番鸭源GPV二联活疫苗的免疫效力的研究表明，此疫苗能诱导雏鸭产生良好的免疫应答，能够用于番[46]鸭水禽细小病毒病的预防。李陆梅等利用MDPVYBMDP株制备的番鸭细小病毒灭活疫苗高效安全，可保证子代母原抗体水平。弱毒苗有毒力返强的可能性，也可能在宿主体内发生基因重组等，具有潜在安全隐患，而灭活疫苗经常出现免疫效果不稳定的情况。因此目前水禽细小病毒疫苗的研究方向主要是基因工程疫苗。陈宗艳等利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的鹅细小病毒VP2衣壳蛋白可自行组装成GPV病毒样颗粒，能诱导产生良好的免疫应答。4 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第一章引言2杆状病毒表达系统概述2.1杆状病毒简介杆状病毒（Baculovirus）是已知的感染昆虫种群最主要的病毒，因其形似杆状故成杆状病毒。根据其来源的宿主，目前已分离到超过500种杆状病毒，其中大多数来源于节肢动物尤其是鳞翅目昆虫。杆状病毒早年常被人们用于控制苹果蠹蛾，梨豆夜蛾和棉铃虫等害虫的[47]数量。杆状病毒属于DNA病毒，基因组呈双链环状超螺旋结构，不同种类之间基因组差异很大，但是三十个核心基因在基因组中都是保守的。其基因组有很强的包容性，能允许大片段异源基因插入的同时基因表达互不干扰。杆状病毒的典型特征是拥有高水平的极晚期基因表达系统，因此适合作为异源基因表达的载体。最常用于表达外源基因的杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisvirus，AcMNPV）和家蚕核型多角体病毒（Bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus，BmNPV）。2.2杆状病毒表达系统简介杆状病毒表达系统（Baculovirusexpressionsystem）又称昆虫细胞表达系统，是以杆状病毒（主要是昆虫核型多角体病毒）作为外源基因载体，昆虫细胞或幼虫为作为受体的[48,49][50]真核表达系统。自1983年Smith首次利用杆状病毒系统表达人β-干扰素以来，经过科研人员30多年不断的改进，已经克服了发展初期耗时长、阳性率低、不易筛选、产物纯化困难等缺点。如今杆状病毒表达系统成为表达重组蛋白最常用的系统。重组杆状病毒的构建是本系统最重要的一步，Perkman等利用cre-loxp系统得到重组杆状病毒，能得到绝对数量较多的重组病毒，可用于高通量表达真核生物cDNA文库。[51]Lee等以果蝇的S2细胞为反应器构建杆状病毒-S2系统，优点是重组病毒感染和表达异[52]源蛋白不会导致宿主死亡。Luckow在杆状病毒基因组中引入细菌复制子，构建的新型杆状病毒穿梭载体既能在大肠杆菌中复制也能在昆虫细胞中复制，将此类质粒命名为bacmid，表示杆状病毒质粒，该系统又称为Bac-to-Bac系统，是目前构建重组杆状病毒最快的方法。Bac-to-Bac系统主要包括pFastBac供体质粒、E.col宿主（DH10Bac）和一个控制表[53]TM达的质粒。Invitrogen公司已经开发了多种适用于该系统的供体质粒，例如pFastBac1、TMTMTMpFastBacHTA,B,C、pFastBacDual。利用pFastBacHT供体产生的重组蛋白N-末端TMTM含有6个His标记可用于重组蛋白的鉴定和纯化，可用AcTEV蛋白酶切掉。pFastBacDual载体含有两个多克隆位点，能用于一次性表达2个异源基因。可根据实验需要选择适合的载体。DH10Bac菌株含有父本杆状病毒质粒和辅助质粒。辅助质粒主要编码转座酶，将转化进来的目的基因转座到父本质粒中，同时破环LacZ的表达，然后利用抗性和蓝白班筛选即可得到重组Bacmid用于转染昆虫细胞。5 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第一章引言[54,55]sf21细胞系、sf9细胞系和High-5细胞系是目前实验室最常用的昆虫细胞系。相对于大肠杆菌表达系统，昆虫杆状病毒表达系统主要有以下优势：生物安全性较高，杆状病毒只感染节肢动物，不感染其他动物。（1）即使进入非宿主细胞内其基因组也不能复制，具有严格的宿主专一性。（2）重组杆状病毒增殖快，方便大规模培养。（3）目的蛋白产量高，通常情况下表达的异源蛋白是可溶的并且方便从感染后期的细胞中回收。（4）表达的蛋白更准确。和大肠杆菌相比，昆虫细胞具有真核细胞独特的修饰功能，使目的蛋白结构和活性更接近天然蛋白。（5）便于大规模生产，目前使用昆虫细胞系能够进行悬浮培养，[56]可以在生物反应器内大规模培养。2.3杆状病毒表达系统在VLPs生产上应用病毒样颗粒（Virus-likeparticles，VLPs）是不含病毒遗传物质但是在结构和部分生物学功能上与自然病毒类似的蛋白质空壳。具有良好的安全性和免疫原性。VLPs可应用于嵌合疫苗，也可以作为载体呈递质粒DNA和蛋白表位。杆状病毒-昆虫细胞表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统等都可用于VLPs的生产。目前常用的四大表达系统都可应用于制备VLPs。已发表的文章显示，杆状病毒表达系统是最常用的VLPs表达系统。杆状病毒表达系统具有与高等真核细胞类似的翻译后修饰系统，包括糖基化、脂肪酸乙酰化及磷酸化系统，其表达的真核外源基因产物具有天然的活性形式，更容易正确折叠[57]形成VLPs，从而更好的模拟病毒抗原决定簇的自然空间构象。与变性和可溶性蛋白相[58][59,60]比，可以诱导更高效的免疫应答。这使VLPs在作为亚单位疫苗方面更具有优势。GSK公司利用该系统制备的二价人乳头瘤病毒样颗粒疫苗已被FDA批准上市并在临床上得到应用。未来将会有更多的病毒样颗粒疫苗能够得到应用。3研究目的及意义鸭短喙侏儒综合症是由新型鸭细小病毒引起的鸭传染病，由于国内缺乏相关报道，2015年在我国的大面积暴发让养殖户措手不及。新型鸭细小病毒虽然致死率很低，但是病毒感染雏鸭后造成大量残次鸭，给鸭养殖业带来极大的经济损失。成年鸭不表现任何临床症状，可将病毒垂直传播给下一代，给水禽养殖业造成极大的安全隐患。充分了解新型鸭细小病毒对疾病的预防控制至关重要。本实验从砀山养鸭场分离到病原，对其进行全基因组序列测序和遗传进化分析，使我们在分子水平上更加了解该病毒，为水禽细小病毒的预防控制和遗传进化研究提供了资料。同时根据病毒衣壳蛋白制备相应的多克隆抗体和病毒样颗粒，为新型鸭细小病毒的实验室研究和新型疫苗的开发奠定基础。6 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第二章新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及全基因组序列测定第二章新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及全基因组序列测定2015年在我国山东、安徽、江苏等地商品肉鸭群中大面积爆发了一种以鸭喙畸形、萎缩变短，舌头肿大外垂，两腿无力、不愿行走，生长发育障碍等为主要症状的传染病，俗称“鸭短喙-侏儒综合征”或“鸭大舌病”。该病多发于6-25日龄肉鸭，发病率为10%~30%，部分鸭群可达50%。患病鸭死亡率虽然相对较低，只有2%~6%，但是由于患鸭舌头肿大外伸，严重影响采食饮水，导致后期严重营养不良。患病鸭体重下降、羽毛凌乱，易发生骨折情况，出栏合格率明显下降。为了明确鸭短喙-侏儒综合征的发病原因，本实验室从安徽砀山发病鸭养殖场采集具有典型临床症状的患病鸭主要组织器官，结合前期流行病学调查、临床症状、剖检变化和一系列的实验室检测方法初步鉴定本病的病原为一种新型鸭细小病毒。1试验材料1.1病料来源2015年7月采集于安徽省砀山县某养鸭场，对发病鸭进行剖检，采集肝脏、脾脏、胰脏和肾脏。1.2鸭胚及试验动物SPF鸭胚购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心；1日龄无免疫麻鸭购自上海某鸭养殖场。1.3主要试剂及试剂盒表2.1主要试剂及试剂盒Table.2.1Primaryregentsusedinthisstudy试剂及试剂盒名称制造商DNA聚合酶、pMD-19T克隆载体TAKARA公司DNAMarker、Trans5α感受态细胞北京全式金生物PBS缓冲液Hyclone病毒DNA/RNA提取试剂盒北京天根生化M-MLV反转录试剂盒普洛麦格DNA凝胶回收试剂、质粒小量提取试剂盒Axygen1.4主要仪器全自动样品快速研磨仪（上海净信科技）、微电脑全自动孵化机控制器（德州市科裕孵化设备有限公司）、电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、JEM-1200EX型透7 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第二章新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及全基因组序列测定射电子显微镜（日本JEOL公司）、BeckmanL-100XP型超速离心机（美国Beckman公司）、-80℃超低温冰箱（青岛海尔股份有限公司）、M-309169型台式低温高速离心机（德国Eppendorf公司）、LabconcoPurifer生物安全柜（美国labconco公司）。2试验方法2.1病料处理取适病料组织，充分研磨后加5倍体积PBS缓冲液，同时加入终浓度为450U/mL的双抗。反复冻融3次，6000r/min离心25min，保留上层清夜，用0.22μm滤膜过滤后于-80℃保存备用。2.2病毒PCR/RT-PCR快速诊断2.2.1病毒核酸提取按照TIANGENTiampVirusDNA/RNAKit说明书提取DNA和RNA。具体步骤如下：（1）取200μL组织悬液，向其中加20μL蛋白酶K，混匀。（2）加200μLCarrierRNA,剧烈震荡15sec使之均匀后置于56℃孵育15min。（3）加250μL无水乙醇，剧烈震荡15sec，20℃静置5min。（4）溶液转移到RNase-Free吸附柱，6000g离心1min,弃过滤出的废液。（5）加500μLGD溶液，6000g离心1min。弃滤液（6）加600μLPW溶液，静置数分钟后离心。弃废液重复一次。（7）加500μL无水乙醇，离心弃废液后再次14000r/min离心去除残留乙醇。（8）吸附膜中央加60μLRNA-Free水，静置5min后离心收集DNA/RNA。按照M-MLV反转录试剂盒说明书对RNA进行反转录，反转录步骤如下：取15μlRNA与1μlRandom6mers混合，70℃孵育10min后迅速置于冰上冷却2min。离心数秒后向其中加入1μLM-MLVReverseTranscriptase、5.8μL5×ReactionBuffer、5μLdNTP、0.5μLRNA酶抑制剂。于37℃孵育10min，然后95℃孵育5min。获得cDNA保存在-20℃备用。2.2.2引物设计与合成参考文献合成8对特异性引物用于检测其他禽源疾病（表2.2），包括：鹅细小病毒、番鸭细小病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、鸭圆环病毒、I型鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、鸭黄病毒。引物由上海华津生物科技有限公司合成。表2.2PCR鉴定所需的引物Table.2.2PCRprimersusedinthisstudy病毒引物名称引物序列（5'-3'）virusPrimernamePrimersequenceGPV-FCCGGGTAGACCAGAAATGTAA鹅细小病毒GPV-RTAATTGTTCCTGCTTCTCTTAGMDPVF1TGTACCCTTCTATGGCTGTG番鸭细小病毒MDPVR1TTCTCCATATCATCAATAG8 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第二章新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及全基因组序列测定AIV-FTTCTAACCGAGGTCGAAAC禽流感病毒AIV-RAAGCGTCTACGCTGCAGTCCNDV-1200UCAGRTACTGGGCHATAAGRAC新城疫病毒NDV-1529LGCATTGTCTCCGAAGAAATAAGDuCV-FTATATTATTACCGGCGCYTGTA鸭圆环病毒DuCV-RTCAGGAATCCCTGMAGGTGADHAV-FACAATGACCCAGCCTTAGI型鸭肝炎病毒DHAV-RCCACTGTATCTTCCCTTCDRV-F1CTTGTCTTATAGTTCATTGGG呼肠孤病毒DRV-R2TCCCAGTACGGCGCCACACCDFV-FAGACTGCTGGTGCAATGAGAC鸭黄病毒DFV-RCGTCGTTCCCAGATTCCA2.2.3PCR扩增PCR反应体系如下：20μL反应体系中，加入2×TaqPlusMasterMix(DyePlus)10μL，上下游引物各1μL，模板DNA1μL，ddH2O7μL。反应条件为：95℃5min，94℃30sec，55℃30min，72℃1min，共34个循环，最后72℃10min。取15μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。2.3病毒分离将上述制备的组织研磨液过滤后，接种9日龄鸭胚尿囊腔，放于37.8℃温度下孵化，弃掉24h内非病毒感染死亡的鸭胚，继续培养6d。盲传三代，无菌收取死亡鸭胚尿囊液。2.4病毒纯化及电镜观察取收集的尿囊液300ml，3000r/min离心30min,取上清，加入PEG-6000溶液使其终浓度为12%（M/V），同时加入0.5MNaCl。4℃静置至少18h，10000r/min离心35min。一次性快速弃上清，倒扣于吸水纸上吸干残存液体。加入少量PBS重悬沉淀。得到的病毒悬液经蔗糖密度梯度（15%、25%、35%、45%、55%），40000r/min超速离心5h。收集蔗糖区带中的乳白的条带，用PBS稀释后于4℃，40000r/min离心5h脱糖。沉淀用PBS重悬。取30μL经磷钨酸负染后于透射电子显微镜下观察病毒粒子形态。2.5病毒鸭胚半数致死量（ELD50）的测定-1-8将第5代病毒鸭胚尿囊液做10倍系列稀释（10~10），接种9日龄鸭胚，0.2ml/枚。每个稀释度感染6枚鸭胚。同时设无菌生理盐水作为对照。接毒后的鸭胚继续放回孵化箱中孵化，每隔12h观察一次。连续观测6d，。计算每个稀释度的死亡率。按Reed-Muench9 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第二章新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及全基因组序列测定法计算该病毒ELD50。2.6动物回归实验取20只没有进行过任何免疫的1日龄健康雏鸭，随机平均分成2组，分别为对照组和攻毒组，攻毒组腿部肌肉注射0.5mlNDPV鸭胚尿囊液，对照组注射等量生理盐水。两组隔离饲养，每天观察生长情况。2.7病毒全基因组测序及分析2.7.1引物的设计与合成根据GenBank登录的标准参考株GPVB株（登录号：U25749）的基因序列，设计多对引物对分离株基因组核苷酸序列进行扩增，各扩增片段之间首尾重叠。引物由上海华津生物科技有限公司合成。引物序列见表2.3。表2.3全基因测序引物序列Table.2.3TheprimersusedtoamplifythecompletenucleotidesequenceofNDPV引物名称引物序列（5'-3'）目的片段大小（bp）PrimernamePrimersequenceTargetfragmentsizeGPV1FCTCATTGGAGGGTTCGTTCGTTCGAA204GPV1RGCATGCGCGTGGTCAACCTAACAGCGPV2FGCATGCGCGCGGTCAGCCCAATAG586GPV2RTTCGTCCTGGTTGAACTGATTGPV3FGTCGGAGAGATGGCACTTTCT1028GPV3RGTGGTGGCAGGTCCGTAGAGCGPV4FCTTCTTCAAATAATAGACAAGTG1137GPV4RTAGACATATCTGCTTTGAGTCGPV5FATGAACATGGGTGGTATGATT1299GPV5RAGTAGAATGCACTACGGTCATGPV6FAACCATTGGGGAATCAGACC1575GPV6RGCATGCGCGTGGTCAACCTAACAGC注：GPV2R和GPV6R序列相同，下划线“GCATGC”是处于ITR“泡状”区域的SphⅠ酶切位点。2.7.2PCR扩增各基因片段PCR反应采用50μL体系：上下游引物各1μL,模板DNA2μL，PremixTaq（LATaqVersion2.0plusdye）25μL，加ddH2O补至50μL。PRC反应条件：94℃5min，94℃50sec，53℃30sec，72℃0.5~1.5min，共35个循环。最后72℃5min。1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。在紫外光下切下含有目的片段的琼脂凝胶，参照Axygen胶回收试剂盒说明书对扩增产物进行纯化回收。10 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第二章新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及全基因组序列测定2.7.3扩增片段的克隆（1）各个片段的TA克隆将各回收纯化的片段连接至pMD-19T载体，连接体系：pMD-19TVector0.2μL、SolutionⅠ5μL、DNA4.8μL。使用PCR仪控温，16℃反应2h。（2）连接产的物转化将各连接产物分别加入到100μLTrans5α感受态细胞中，用移液枪轻轻吹打使其均匀，然后置冰上冷浴30min，再42℃热激45sec,然后于冰上冰浴1~2min。最后向离心管中加入400μL无抗性LB液体培养基，于37℃摇床上培养1h。1h后取200μL菌液均匀涂布于带有Amp抗性的LB琼脂平板上，37℃温箱静置培养10h。（3）阳性克隆的筛选LB平板培养10h后，每个克隆挑取7个单菌落于试管中进行扩大培养，菌液PCR鉴定。鉴定阳性的菌液按照Axygen质粒提取说明书提取质粒进行测序。测序由上海华津生物科技有限公司完成。2.7.4序列拼接分析利用DNAstar软件包中的SeqMan工具对序列进行拼接，得到NDPVDS15株的全基因序列。利用MegAlign对DS15株和GenBank上登录的部分经典水禽细小病毒基因序列进行比较分析（表2.4），构建系统发育进化树。表2.4水禽细小病毒参考毒株Table.2.4WaterfowlparvovirusreferencestrainsfromGenBank毒株登录号宿主临床症状地理来源StrainAccessiono.HostClinicalsignsGeographicoriginSDLC01KT343253.1樱桃谷鸭短喙矮小症中国QH15KT751090.1北京鸭短喙矮小症中国M15KU844283.1番鸭短喙矮小症中国82-0321VEU583389.1鹅疫苗中国台湾SYG61vKC996729.1鹅疫苗中国VG32/1EU583392.1鹅疫苗德国BU25749.1灰雁典型小鹅瘟匈牙利YZKR091960.1鹅典型小鹅瘟中国GDaGPVHQ891825.1鹅典型小鹅瘟中国MDPV-GX5KM093740.1番鸭番鸭“三周病”中国PKU844281.1番鸭番鸭“三周病”中国YYKX000918.1番鸭番鸭“三周病”中国SAAS-SHNHKC171936.1番鸭番鸭“三周病”中国11 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第二章新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及全基因组序列测定3结果3.1临床样品PCR检测结果以提取的DNA/cDNA为模板进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳显示，仅GPV的特异性引物能扩增出大小约465bp左右的特异性条带，而MDPV、AIV、NDV、DuCV、DHAV、ARV、DFV等其他鸭源病毒均为阴性（图2.1）。图2.1PCR检测鸭组织中的病毒Fig.2.1VirusesidentificationintissueofsickducksbyPCRM:DNA分子质量标准；1~8:鹅细小病毒、番鸭细小病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、鸭圆环病毒、I型鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、鸭黄病毒M:Trans2KplusⅡDNAMarker;1~8:GPV、MDPV、AIV、NDV、DuCV、DHAV、ARV、DFV3.2病毒的分离组织悬液接种9日龄鸭胚，盲传3代后鸭胚开始出现死亡，死亡时间集中在接毒后72~120h。感染的鸭胚尿囊膜不同程度地变厚粘稠，呈灰色，鸭胚胚体出血，肝脏发生病变。收取的尿囊液经检测为GPV阳性。3.3病毒电镜观察结果收获的鸭胚尿囊毒通过浓缩、纯化，取少量病毒浓缩液经负染后电镜观察。可观察到形似鹅细小病毒的颗粒，病毒粒子为球形，直径约20nm，没有囊膜（图2.2）。图2.2电镜下观察到的细小病毒样粒子Fig.2.2Observationofparvovirus-likeparticlesbyelectronmicroscopy3.4鸭胚半数致死量测定（ELD50）第5代鸭胚尿囊液经10倍比稀释后接种鸭胚，按照Reed-Muench法计算ELD50为-4.210/0.2mL。12 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第二章新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及全基因组序列测定3.5动物回归试验病毒尿囊液经腿部肌肉感染1日龄雏鸭，15d左右，攻毒组3只雏鸭可观察到明显的生长发育迟缓，鸭喙严重萎缩症状（如图2.3），发病率30%，无死亡情况。PBS对照组鸭正常。图2.3攻毒雏鸭临床症状Fig.2.3Clinicalsignsofinfectedduckings3.6全基因序列测定与分析3.6.1NDPV各片段的PCR扩增利用6对引物进行PCR扩增，经过凝胶电泳，在204bp、585bp、1028bp、1137bp、1299bp、1603bp处分别出现特异性条带（图2.4），与预期大小相同。3.6.2全基因组结构及分析各基因片段经测序、拼接后得到DS15株全基因序列。DS15株全长图2.4NDPV各片段的扩增的扩增5104nt，基因组两侧为ITR，中间包Fig.2.4FragmentsofNDPVgenomeamplifiedbyPCR含两个大的ORF。左侧ORF大小为M:DNA分子质量标准；1~6：NDPV片段1~6M:Trans2KplusⅡDNAMarker;1~6：Fragment1~6ofNDPV1884nt，编码NS1蛋白（627个氨基genome酸）。右侧ORF大小为2199nt，编码VP1蛋白（732个氨基酸）。两个ORF之间为18nt的非编码区。利用MegAlign将NDPVDS15株全基因序列与GenBank上发表的其他水禽细小病毒核酸序列进行比较，结果显示：NDPVDS15株与其他水禽细小病毒核苷酸序列同源性在81.2%~99.8%之间（图2.5），与DPVSDLC01株同源性最高达到99.8%，与DPVQH15株同源性达到99.3%，与M15株同源性达到96.9%。而这四个毒株都是从短喙侏儒综合症13 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第二章新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及全基因组序列测定鸭体内分离得到的。DS15株与普通的GPV病毒核酸同源性在92.6%~97.2%之间，其中与GPV疫苗株82-0321v同源性达到97.2%。相比之下，DS15株与MDPV核酸同源性较低，在80%左右。利用MEGA6.0软件绘制系统进化树发现，DS15株与其他两个SBDS分离毒株处于同一支，亲缘关系最近。它们与其他普通GPV处在同一大分支上，而与MDPV毒株亲缘关系则相对较远（图2.6）。图2.5DS15株全基因核苷酸序列同源性比较Fig.2.5HomologyanalysisofDS15basedoncompletegenomicsequencesofDPVGPVstrainGDaGPV10072GPVstrainSYG61v84GPVstrainYZGPVstrainB67100GPVstrainVG32/186GPVstrain82-0321VGPVstrainQH15DPVstrainDS1510099DPVstrainSDLC01GPVstrainM15MDPVstrainSAAS-SHNHMDPVstrainGX5100MDPVstrainP54100MDPVstrainYY0.02图2.6NDPVDS15株全基因组核苷酸序列进化树分析Fig.2.6PhylogenetictreeofNDPVDS15strainbasedoncompletegenomicsequences14 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第二章新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及全基因组序列测定3.6.3NS1蛋白氨基酸序列分析NS1蛋白氨基酸序列与表2.4中的13株水禽细小病毒进行同源性比对（图2.7），结果显示，DS15株NS1蛋白氨基酸序列与QH15株NS1蛋白氨基酸同源性高达100%,其次是SDLC01株，同源性达到99.5%，与M15株达到98.7%。与普通GPV氨基酸同源性在95.7%~97.8%之间，与MDPV毒氨基酸同源性在89.5%~90.1%之间。对其氨基酸序列进一步分析显示，与普通GPV的NS1蛋白氨基酸序列比对发现，DS15株和其他3株SBDS分离株在NS1蛋白区域的突变情况具有高度相似性（I50T，K131R，A140S，E250D，A350V，V468I，E498R，R553K，N555T，E573Q，D594Y，K605T，V617A）。其中140S同样存在与4株MDPVNS1中。利用MEGA6构建NS1蛋白氨基酸系统进化树，结果显示：DS15株、QH15株、SDLC01株和M15株处于同一分支，都处在GPV大分支上，与MDPV亲缘关系较远。图2.7DS15株NS1蛋白氨基酸同源性分析Fig.2.7HomologyanalysisofDS15basedonNS1protein图2.9DS15株VP1蛋白氨基酸同源性分析Fig.2.9HomologyanalysisofDS15bansedonVP1protein15 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第二章新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及全基因组序列测定GPVBNS1GPVGDaGPVVP165100GPVYZNS189GPVSYG61vVP187GPV82-0321VNS1鹅细小病毒98GPVYZVP173GPVVG32/1NS135GPV82-0321VVP1GPVGDaGPVNS189GPVBVP1100GPVSYG61vNS161GPVVG32/1VP1GPVM15NS1GPVQH15VP1DPVSDLC01NS1100DS15VP199鸭短喙侏儒症分离株10079DS15-NS178DPVSDLC01VP165GPVQH15NS1GPVM15VP1MDPVPNS1MDPVPVP1100MDPVYYNS1MDPVYYVP1100番鸭细小病毒50MDPVGX5NS1MDPVGX5VP176MDPVSAAS-SHNHNS198MDPVSAAS-SHNHVP10.010.01图2.8DS15株NS1蛋白氨基酸的进化树分析图2.10DS15株VP1蛋白氨基酸的进化树分析Fig.2.8PhylogenetictreeofDS15strainbasedFig.2.10PhylogenetictreeofDS15strainonNS1proteinaminoacidsequencebasedonVP1proteinaminoacidsequence3.6.4VP1蛋白氨基酸序列分析DS15株VP1基因全长2199nt，共编码732个氨基酸，与普通细小病毒相似。VP1氨基酸序列与表2.4中的13株水禽细小病毒同源性比较结果显示，DS15株VP1蛋白氨基酸序列与SDLC01株VP1蛋白氨基酸同源性高达100%,其次是QH15株，同源性达到99.5%，与M15株达到98.4%。与普通GPV同源性在95.9%~98.2%之间，其中与GPV疫苗株同源性达到98.2%。与MDPV毒氨基酸同源性在88.4%~92.6%之间。对其氨基酸序列进一步分析显示，和普通GPV相比，DS15株和其他3株SBDS分离株在VP1蛋白区域的突变情况具有高度相似性（Q89L，D114H，Q116H，D142E，A180V，S450N，S498N，H660N）。其中，第142E和660N同样存在于MDPVVP1氨基酸序列的相同位置。450N在MDPVGX5和MDPVSAAS-SHNH的VP1氨基酸序列相同位置也存在。而S498N突变所处的471-632氨基酸区间被认为是受体结合位点。在GPV和MDPV的VP1蛋白共同抗原表位区域并没有发生氨基酸突变。显示NDPV可能会与GPV和MDPV存在抗原交叉。4讨论我国是世界上水禽养殖量最大的国家，年出栏量20多亿只。2015年暴发的鸭短喙侏16 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第二章新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及全基因组序列测定儒症给鸭养殖业造成巨大经济损失。2000年在我国东南个别省份零星发生过该病，2014年末在江苏、安徽等地也发生此病，发病率不足5%，未能引起重视。到2015年中旬已蔓延至山东、河北、河南、湖北、安徽、江西等肉鸭养殖大省。据文献报道，1971~1972年在法国南部的杂交鸭曾发生过一种短喙和矮小综合症，鸭群发病率为10~30%，病鸭表现为严重的短喙和跗骨生长障碍。研究人员根据血清型调查结果推测该病是由鹅细小病毒引起的，但是并没有分离到病原。1989年台湾、波兰等地相继报道有该病发生。匈牙利学者Paly等人对发生在法国的病例进行病毒分离和鉴定，确定病原为GPV变异株。本实验室从安徽砀山某养鸭场采集具有典型临床症状的患病鸭主要组织器官，经过研磨处理后，对病料进行PCR检测，只检测到GPV阳性。随后尝试利用鸭胚和鸡胚分离病毒，传代多次后只能在鸭胚尿囊液中检测到GPV，该病毒能在鸭胚上稳定增殖，在鸡胚上不能增殖。将病毒同步接毒至本实验室自制的原代鸭胚成纤维细胞，传代多次后PCR[21]仍可检测到病毒，但是并没有观察到细胞病变。陈浩等研究结果也显示该病毒只能在鸭胚和鸭胚成纤维细胞上增殖，不能利用鸡胚和鹅胚以及鹅胚成纤维细胞上复制。利用1日龄雏鸭成功复制出短喙矮小症状，但是鸭舌外伸情况并没有临床生产中那么严重。可能鸭实际生产中的大舌症状还受到环境因素的影响。我们根据GPVB株的全基因序列和基因结构特点设计引物，分段扩增获得DS15株基因片段，测序拼接得到DS15株全基因核苷酸序列。同源性和系统进化分析显示我们分离到的DS15株与鸭短喙侏儒症分离毒株（DPVSDLC01株、GPVQH15株、GPVM15）同源性极高，亲缘关系最近。与普通GPV虽然处于同一大分支，却独自形成一支。DS15株在VP1蛋白氨基酸同源性上与SDLC01株和QH15株最为接近，而M15株则在系统发育进化树上被划分为另一分支。值得注意的是，与普通GPV相比，这四株病毒都在VP1蛋白氨基酸序列上存在8个共同突变。其中4个突变发生在VP1蛋白氨基端独特区域[61]（VP1u）内。研究显示这个区域具有磷脂酶活性，与成熟病毒粒子感染性有关。在第[62,63]498位S突变为N，而这段区域被认为是GPV的受体结合位点。这些突变在DS15病毒株对樱桃谷鸭的致病力上的作用还有待深入研究。DS15NS1在氨基酸同源性上也与QH15和SDLC01最为接近，而M15株也被划分在同一分支，明显区别于其他GPV。NS1蛋白具有DNA结合能力，能和ITR特定序列相结合，对病毒基因组的复制进行调节，DS15株NS1蛋白氨基酸的突变是否对病毒的复制过程产生影响还有待进一步研究。目前国内外对水禽细小病毒分子生物学研究还不够深入，研究热点主要集中在抗体、血清和疫苗制备以及基因表达方面，对GPV的复制，转录和翻译过程及机制几乎一无所知，对NS蛋白的结构和功能大多停留在猜测阶段。而对于鸭短喙侏儒症分离株的研究更少，GenBank上仅有少量新型鸭细小病毒的部分基因片段（D146/02，AY496906.1；D479/12/04，EU938702.1；D518/3/05，EU938703.1；D523/2/05，EU938704.1；D657/306，EU938705.1；D697/3/06，EU938706.1；D176/02(France)and90219(Taiwan)），只有4株新型鸭细小病毒的全基因序列（SDLC01，QH15，DS15，M15）。且大多数毒株分离自同一区域，还需要积累更多的数据来能才能对NDPV的遗传变异做出客观的分析。17 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第三章VP3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备第三章VP3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备NDPV具有与GPV相似的基因组结构和组成，全基因组包含两个主要开放阅读框，其中，左侧ORF编码非结构蛋白NS1和NS2，右侧ORF编码结构蛋白VP1,VP2和VP3。NDPV编码的三种结构蛋白的核苷酸数目分别为2199nt、1764nt和1605nt。3种蛋白起始密码子分别位于不同位置，但终止密码子位于同一位置。VP3蛋白大小约58ku，是病毒的主要衣壳蛋白，约占衣壳蛋白总量的80%，含有病毒主要抗原表位成分，是主要保护性抗原，能够诱导机体产生具有中和作用的抗体。本研究对NDPVDS15株的VP3基因进行克隆和原核表达，免疫实验兔获得NDPV的多克隆抗体，为进一步研制NDPV检测方法和亚单位疫苗等奠定了基础。1实验材料1.1毒株、菌株及载体及主要试剂NDPVDS15株、鹅细小病毒NS株和原核表达载体pGEX-4T-1均由中国农业科学院上海兽医研究所保存。1.2主要试剂及试剂盒表3.1主要试剂及试剂盒Table3.1Primaryregentsandinstruments试剂名称制造商pMD-19T克隆载体宝生物工程（大连）有限公司Trans5α，TransBL21感受态细胞北京全式金生物技术有限公司限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶NEB中国BCA蛋白定量制剂碧云天生物科技有限公司抗GST标签鼠单克隆抗体杰克森公司凝胶回收和质粒提取试剂盒Axygen公司HRP标记的山羊抗兔IgG二抗北京康为世纪公司弗氏佐剂Sigma公司ECL显色液赛默飞（中国）公司1.3主要溶液的配制8M尿素溶液：尿素（8M），氯化钠（0.5M），磷酸氢二钠（20mM），磷酸二氢钠（20mM），调节pH至7.4。洗液Ⅰ：120g尿素，2.92g氯化钠，0.05g乙二胺四乙酸，1mltriton100，加PBS至总体积为1000ml。18 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第三章VP3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备洗液Ⅱ：120g尿素，1mltriton100，加PBS至最终体积为1000ml。1.4实验动物清洁级新西兰大白兔购自青岛康大生物科技有限公司。2实验方法2.1引物设计与合成根据本实验室获得的NDPVDS15株全基因组序列（GenbankNo.KX384726.2），利用Primer5.0软件设计一对特异性引物以扩增完整的VP3基因片段（表3.1），上下游引物中引入BamHⅠ酶切位点和XhoⅠ酶切位点（下划线）。预期扩增片段大小1620bp，引物由上海华津生物科技有限公司合成。表3.2VP3序列扩增引物Table3.2PrimersforVP3gene引物名称引物序列（5'-3'）PrimernamePrimersequenceVP3-FCGCGGATCCATGGCAGAGGGAGGAGGVP3-RCCGCTCGAGCAGATTTTGAGTTAGATATCTGG2.2VP3基因的扩增以保存的DS15株DNA为模版扩增VP3基因，PCR扩增体系为:上下游引物各（10umol/L）1μL，LATaqVersion2.0plusdye25μL，模版2μL，加ddH2O补至50μL。PCR反应条件：95℃5min；94℃45sec，52℃50sec，72℃1.5min，共30个循环；最后72℃10min。目的VP3基因片段经1%琼脂糖凝胶电泳后回收纯化。2.3重组质粒pGEX-VP3的构建与鉴定将纯化的PCR产物与原核表达质粒载体pGEX-4T-1用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切，回收目的片段后，16℃连接过夜，转化Trans5α感受态细胞，提取质粒进行双酶切鉴定后，将阳性质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pGEX-VP3。2.4VP3基因的诱导表达及鉴定阳性重组质粒pGEX-VP3转化BL21感受态细胞，挑取单个菌落于37℃培养至OD600值达到0.6时加入IPTG至终浓度为1.0mM，诱导表达4h。离心收集菌体，加适量ddH2O重悬，进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot分析以检测重组蛋白表达情况。超声波裂解菌体，分离上清和沉淀，对重组蛋白的可溶性进行分析。同时设置空载体转化BL21细胞同步诱导作为对照。将表达出的蛋白命名为GST-VP3。19 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第三章VP3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备2.5重组VP3蛋白的纯化对表达重组蛋白的菌株进行大量培养、诱导。按照包涵体粗纯化方法对重组VP3蛋白纯化后，经10%SDS-PAGE检测纯化蛋白并分析纯化效果。纯化蛋白经透析复性，用BCA蛋白测定试剂盒测定复性蛋白的浓度。纯化后的GST-VP3蛋白溶液经10%SDS-PAGE检测纯化效果后，用BCA蛋白测定试剂盒测定复性蛋白的浓度。包涵体纯化方法如下：首先将菌液置于50ml离心管中4000r/min离心，收集菌体沉淀。用10ml20MmTris-Cl(pH8.0)悬起沉淀，然后于-80℃反复冻融三次，超声破碎到均匀不黏稠为止。再于-80℃反复冻融三次，1000r/min离心25min，轻轻吸取上层清液。向沉淀中加入5ml洗液Ⅰ，用枪反复吹打混匀包涵体，随后9000r/min离心20min，此过程重复2次。然后再向包涵体沉淀中加入5ml洗液Ⅱ，移液枪反复吹打以洗涤包涵体，9000r/min离心20min，此过程也重复2次。最后用适量8M尿素溶解蛋白包涵体沉淀，13000r/min离心10~20min。将上清转移至透析袋中，置于浓度逐步降低的尿素溶液中低温透析，避免透析袋中出现沉淀。2.6多克隆抗体的制备将纯化的GST-VP3重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，选取普通清洁级新西兰大白兔进行背部皮下多点注射免疫，免疫剂量为每只1mg。此后,2次免疫均使用弗氏不完全佐剂，免疫周期为1周。第四次耳缘静脉注射0.5mg纯化的GST-VP3蛋白进行免疫，7d后心脏采血分离血清，-20℃保存备用。2.7抗体特异性分析将NDPV-DS15株的鸭胚尿囊毒、正常鸭胚尿囊液、纯化的重组蛋白以及GPV鹅胚尿囊毒经10%SDS-PAGE电泳后转印至NC膜上，浸入3%BSA中4℃封闭过夜。一抗为1：500稀释的抗血清，室温孵育2h。二抗为1：5000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG，室温孵育1h。用ECL化学发光试剂法显色。3结果3.1VP3基因的克隆及表达载体的构建PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在大约1600bp左右出现明显条带，与预期大小（1620bp）相符（图3.1）。重组质粒pGEX-VP3经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后得到约为5kb和1.6kb的两条目的条带。与预期片段大小相符，说明重组VP3表达质粒构建成功(图2)。20 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第三章VP3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备图3.1NDPVVP3基因片段PCR扩增图3.2重组质粒pGEX-VP3的双酶切鉴定Fig.3.1PCRamplificationofVP3Fig.3.2DoubleenzymesdigestionidentificationgeneoftherecombinantplasmidpGEX-VP3M:DNA分子质量标准；1：GPVVP3基因；2：M:DNA分子质量标准；1：空质粒pGEX-4T-1；2：重NDPVVP3基因；3：阴性对照组质粒pGEX-VP3的BamHⅠ+XhoⅠ双酶切产物M:Trans2KplusⅡDNAMarker;1:PositiveM:Trans2KplusⅡDNAMarker;1:TheplasmidpGEX-4T-1control;2:TargetgeneVP3;3:Negativecontrolascontrol;2:ProductsfrompGEX-VP3digestedwithBamHⅠandXhoⅠ130ku图3.3重组蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3.3AnalysisofrecombinantproteinbySDS-PAGEM:蛋白质分子质量标准；1：pGEX-VP3诱导后；2：pGEX-VP3诱导前；3：pGEX-4T-1空载体诱导后；4：pGEX-4T-1空载体诱导前；5：pGEX-VP3超声上清；6：pGEX-VP3超声沉淀；7：未纯化的重组蛋白；8：纯化的重组蛋白M:ProteinmolecularweightMarker;1:AfterinducedpGEX-VP3;2:BeforeinducedpGEX-VP3;3:pGEX-4T-1inducedwithIPTG;4:pGEX-4T-1withoutinduce;5:SupernatantsofpGEX-VP3;6:SedimentationsofpGEX-VP3;7:Unpurifiedrecombinantprotein;8:Purifiedrecombinantprotein3.2重组VP3蛋白的诱导表达分析及纯化用IPTG诱导重组菌表达，并用pGEX-4T-1空载体转化BL21感受态细胞同步诱导作为对照。SDS-PAGE结果显示，获得大小约84ku的蛋白，与预测的蛋白大小一致。可溶性分析显示，重组GST-VP3蛋白以包涵体形式存在。用包涵体粗纯化方法对重组GST-VP321 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第三章VP3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备蛋白进行纯化，SDS-PAGE结果显示纯化效果较好，与未纯化的重组GST-VP3蛋白相比，杂蛋白少且目的条带清晰（图3.3）。BCA蛋白测定试剂盒测定纯化后蛋白的浓度为3mg/ml。3.3重组VP3蛋白的Western-blot检测由于本研究中的重组VP3蛋白含有GST标签，用抗GST标签的鼠源单抗作为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG作为二抗进行130kuWestern-blot分析，实验结果显示，在84ku处出现特异性条带，大小与预期的重组蛋白大小相符（图3.4）。3.4Western-blot鉴定多克隆抗体多抗血清的Western-blot结果显示，纯化图3.4重组蛋白的Western-blot检测的GST-VP3蛋白在蛋白标准分子质量约84kuFig.3.4Western-blotanalysisofthe处出现特异性条带，NDPV尿囊毒在58ku处出recombinantVP3proteinM:蛋白质分子质量标准；1：pGEX-VP3诱导后；2：现明显的特异性条带（图3.5），表明制备的兔pGEX-VP3诱导前；3：pGEX-4T-1空载体诱导后；4：抗GST-VP3多克隆抗体能与NDPV尿囊毒反pGEX-4T-1空载体诱导前应。而抗原交叉性检测结果显示，鹅细小病毒M:ProteinmolecularweightMarker;1:Afterinduced在相应80ku、65ku、58ku处也出现条带，分别pGEX-VP3;2:BeforeinducedpGEX-VP3;3:pGEX-4T-1inducedwithIPTG;4:pGEX-4T-1without对应GPV的VP1，VP2，和VP3蛋白。induce130ku130ku图3.5多克隆抗体的Western-blot鉴定Fig.3.5Western-blotidentificationofpolyclonalantibodyofVP3M:蛋白质分子质量标准；1,4：NDPV尿囊毒；2：正常尿囊液对照；3：纯化后的蛋白；5：GPV尿囊毒M:ProteinmolecularweightMarker；1,4:NDPV；2：negativecontrol；3：Purifiedrecombinantprotein；5：GPV4讨论新型鸭细小病毒基因组为单链线状DNA，大小约5000nt，主要编码非结构蛋白（NS）和结构蛋白（VP）。结构蛋白包括VP1、VP2和VP3，是由同一段基因通过可变剪接形成22 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第三章VP3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备不同的翻译模板所产生。其中VP3蛋白是病毒的主要结构蛋白，对GPV衣壳蛋白三维结构模拟比较分析显示，暴露于衣壳表面的9个氨基酸区域均位于VP3段，推测VP3可能[64]是主要免疫保护性抗原。因此VP3基因是GPV和MDPV基因工程疫苗的首选靶基因。李书光等利用大肠杆菌对GPV结构蛋白VP3优势抗原表位区进行表达，表达产物具有良好的产生中和抗体的能力。白翠玲等构建重组腺病毒表达的VP3蛋白具有良好的免疫原性，可作为病毒活载体疫苗用于鹅细小病毒病的免疫预防。鉴于NDPV所致疫病是一种新发现的鸭传染病，建立一种快速检测该病抗体的方法很有必要。大肠杆菌表达系统作为基因表达技术中发展最早，应用最广泛的经典表达系统，具有表达水平高，培养周期短等优点。因此，本研究将NDPV的VP3基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1，利用大肠杆菌中表达获得包涵体形式存在的VP3重组蛋白，Western-blot检测显示我们表达的重组NDPVVP3蛋白拥有良好的抗原性。将重组VP3包涵体纯化后作为免疫原免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。Western-blot结果显示重组GST-VP3蛋白在84ku处有明显反应条带，NDPV尿囊毒在蛋白标准分子质量约58ku处有明显反应条带，表明本研究制备的多克隆抗体可与新型鸭细小病毒衣壳蛋白VP3发生反应。由于NDPV和GPV结构蛋白氨基酸序列同源性极高，抗原交叉性检测显示该多克隆抗体也可识别GPV，显然两种病毒之间存在抗原交叉性，水禽细小病毒衣壳蛋白之间本来就存在抗原交叉反应。因此，建议研发单克隆抗体用于鉴别NDPV和其他水禽细小病毒。本研究为建立NDPV抗体检测方法和进一步研究VP3蛋白的生物学功能提供了参考资料。23 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第四章VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定第四章VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定水禽细小病毒VP1、VP2和VP3基因编码的衣壳蛋白参与病毒感染的整个过程，尤其是VP2和VP3蛋白同时也是病毒重要的免疫原性蛋白，有研究报道GPV的三种衣壳蛋白均能自行组装成VLPs，NDPV与GPV结构蛋白氨基酸序列相比，发生了部分氨基酸突变，是否影响其VLPs的形成尚不清楚。我们尝试利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备新型鸭细小病毒样颗粒，并对其免疫原性进行初步分析。为鸭短喙侏儒综合症亚单位疫苗的研发奠定了基础。1实验材料1.1菌株、载体及细胞Trans5α感受态细胞购自全式金生物科技，DH10Bac感受态细胞、昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA购自Invitrogen公司，sf9细胞由本实验室保存。1.2主要试剂及仪器表4.1主要试剂及仪器Table4.1Primaryregentsandinstuments试剂及仪器名称制造商CellfectinⅡReagentInvitrogenGrace’sInsectMedium；Sf-900ⅡSFM（1×）GibcoT4DNA连接酶；XhoⅠ、KpnⅠ内切酶NEBFITC标记的山羊抗兔IgGInvitrogenHRP标记的山羊抗兔IgG康为世纪ECL显色液赛默飞（中国）公司全自动倒置显微镜；荧光倒置显微镜Nikon无二氧化碳培养箱SANTN公司TMMONTANIDEISA71VG法国SEPPIC公司2实验方法2.1引物设计与合成根据本实验室测得的NDPV全基因序列，设计一对引物以扩增VP2基因，上游引物引入XhoⅠ，下游引物引入KpnⅠ酶切位点。同时合成M13通用引物。引物由上海华津生物科技有限公司合成。24 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第四章VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定表4.2目的基因的引物序列Table4.2Theprimersusedtoamplifythetargetgene引物名称序列（5'-3'）PrimernamePrimersequenceVP2-FCCGCTCGAGGACGGCTCCTGCAAAAAAAAVP2-RCGGGGTACCTTACAGATTTTGAGTTAGATATCTGGM13ForwardCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGM13ReverseAGCGGATAACAATTTCACACAGG2.2目的基因VP2的扩增以保存的NDPVDNA为模板，扩增VP2基因。PCR反应体系如下：50μL反应体系中，加入PremixTaq（LATaqVersion2.0Plusdye）25μL,上下游引物各1μL，模板DNA1μL，ddH2O22μL。反应条件为：95℃5min；94℃30sec,55℃30min，72℃1min,共35个循环；72℃10min。扩增所得VP2基因片段鉴定正确后用回收纯化。2.3重组供体质粒pFastBacHTA-VP2的构建与鉴定将回收的VP2基因片段与杆状病毒表达载体pFastBacHTA用限制性核酸内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，酶切后的VP2片段和线性化载体用T4DNA连接酶于16℃过夜连接。次日将连接产物转化克隆Tran5α感受态细胞，挑取数个单独菌落扩大培养并提质粒进行双酶切鉴定，将阳性的质粒送至上海华津生物科技有限公司测序，测序正确的质粒命名为pFastBacHTA-VP2。2.4重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-HTA-VP2的构建与鉴定2.4.1重组供体质粒转化感受态细胞参照DH10BacChemicallyCompetentCell说明书，取测序正确的pFastBacHTA-VP2质粒2μL加入50μL融化的DH10Bac感受态细胞中，用移液枪轻轻混匀,冰浴25min,42℃水浴热激46sec，再冰浴3min。加入400μL不无任何抗生素的LB液体培养液体，混匀后于37℃摇床210r/min震荡培养增殖4h。4h后5000r/min离心1min，留250μL上清培养基，重悬菌体并涂布到预热的含有卡那霉素，庆大霉素，四环素抗性的三抗LB琼脂平板上（Kanamycin50μg/ml、Gentamicin7μg/ml、Tetracycline10μg/ml、X-gal100μg/ml、IPTG40μg/ml），37℃培养48h。待平板长出菌落后，挑出单个白色菌落，再次划线筛选培养。重复两次。重新挑取白色菌落，经三抗LB培养基培养后挑取白色单菌落扩大培养，提取质粒。2.4.2重组杆状病毒质粒的提取经过PCR鉴定为阳性的菌落扩大培养，采用传统碱裂解法提取重组Bacmid质粒，步25 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第四章VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定骤如下：（1）将菌液转移至1.5mL离心管中，12000r/min离心1min，弃上清LB培养基，保留菌体。（2）向离心管中加入300μL溶液Ⅰ（15mMTris-HCl，10MmEDTA，100ug/mLRNaseA），用移液枪充分吸打重悬菌体沉淀，不留小菌块。再加入等体积溶液Ⅱ（0.2NNaOH，1%SDS），轻轻上下颠倒混合。（3）沿管壁缓缓增添1/2体积的3M醋酸钾（pH5.5）溶液，溶液开始出现白色沉淀。颠倒数次后冰上静置7min。（4）12000r/min离心15min，轻轻上清转移至含有800μL异丙醇和500μL去内毒素洗液的新离心管中，缓慢上下颠倒5~10次后，于冰上静置7min。（5）12000r/min离心15min，弃去上清液。向离心管中加入500μL70%乙醇，缓慢上下颠倒数次混匀，12000r/min离心5min。（6）重复步骤5（7）室温静置10~15min，待乙醇挥发后，用50μLEndotoxin-FreeH2O溶解。测浓度后与-20℃保存备用。2.4.3.重组杆状病毒质粒的鉴定利用M13通用引物和NDPVVP2引物进行PCR鉴定，50μL体系如下：PremixTaq（LATaqVersion2.0Plusdye）25μL,M13Forward、M13Reverse各1μL，模板DNA1μL，ddH2O22μL。反应条件为：93℃3min；94℃45sec,55℃45s，72℃5min共35个循环；最后72℃8min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确的质粒命名为Bacmid-HTA-VP2。2.5重组杆状病毒rBac-HTA-VP2的拯救2.5.1重组杆状病毒质粒转染sf9细胞利用Invitrogen公司的CellfectinⅡRegent转染试剂将重组杆状病毒质粒转染至Sf9细胞，具体操作步骤如下：（1）转染前一天将Sf9细胞传至6孔细胞培养板，2ml/well，确保细胞贴壁且在培养皿中分布均匀，待单层细胞长到70%~80%时即可准备转染。（2）取8μLCellfectinIIReagent转染试剂经Grace基础培养基稀释至总体积为100μL，轻轻转动混均匀后室温静置25min。（3）取3μg重组杆状病毒质粒稀释于100μLGrace基础培养基，混合均匀后室温静置30min。（4）将稀释后的重组杆状病毒质粒加入稀释后的转染试剂中，充分混合均匀，25℃静置25min，使重组质粒与转染试剂充分作用。26 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第四章VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定（5）弃去六孔细胞板中的旧培养基，将DNA脂质体复合物一滴一滴加入六孔板，再补充800μLGrace基础，28℃静置培养4.5h。（6）转染5h后，吸弃上清，重新加入2mlGrace完全培养基（含10%FBS），置于28℃细胞培养箱静置72h直至看到细胞病变。（7）收获细胞培养物，离心去除细胞碎片，取上清分装保存于4℃，此为P1代种子毒，重组杆状病毒命名为rBac-HTA-VP2。2.5.2重组杆状病毒的传代重组杆状病毒P1代病毒含量少，滴度较低。需要扩增使其达到一定滴度才能用于蛋白表达。在6孔细胞培养板中接种sf9细胞，利用Sf-900ⅡSFM（1×）无血清培养基培养至单层细胞达到80%，按照1:50体积接种细胞，27℃静置培养5d左右，观察到明显病变后收集上清保存。连续传至第3代。2.5.3重组杆状病毒TCID50的测定利用TCID50法对重组病毒毒价进行测定，具体操作如下：取处于对数生长期且活力大于95%的sf9细胞，用Sf-900ⅡSFM（1×）培养基稀释细胞，分至96孔板，使细胞密5度达到4×10cells/ml，静置培养2h使细胞充分贴壁。将含有P3代重组病毒sf9细胞培养-1-8上清连续10倍比稀释（10~10），分别加入96孔板，每一个病毒稀释度设8个重复，同时设置空白对照组。置于28℃培养箱静置培养。5d后统计每个稀释度发生细胞病变的孔数。按Reed-Muench法计算重组杆状病毒的TCID50。2.6VP2在sf9细胞中的表达与检测2.6.1重组VP2蛋白的间接免疫荧光（IFA）检测将第三代病毒液接种于6孔板，感染生长良好的sf9细胞，于28℃细胞培养箱中培养72h，待出现明显细胞病变后，吸弃培养基，用PBS洗涤3次，每次5min。加4%多聚甲醛37℃固定15min。PBS洗4次，加5%脱脂乳溶液于37℃温箱封闭1.5h。弃掉封闭液，加1：500稀释的兔抗NDPVVP3多克隆抗体，37℃孵育1.5h，弃一抗，PBS洗4次，加入1：200稀释的FITC标记的山羊抗兔IgG，室温避光孵育1h，PBS洗5次。荧光倒置显微镜下观察，拍照。2.6.2重组VP2蛋白的Western-blot检测重组感染重组病毒感染sf9细胞至出现病变，离心分别收取细胞和细胞培养上清。细胞沉淀用适量ddH2O重悬，5×SDS上样缓冲液煮沸10min。经过SDS-PAGE电泳后，进行Western-blot检测。2.6.3重组VP2蛋白的纯化及电镜观察重组病毒感染sf9细胞至出现病变，1100r/min离心6min，弃去上层培养基，向细胞27 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第四章VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定沉淀中加100μL无菌ddH2O吹打重悬。-80℃反复冻融三次时细胞裂解。12000r/min于4℃离心20min，取20μL上清，磷钨酸负染后于透射电子显微镜下观察。2.7重组VP2蛋白免疫原性初步研究2.7.1VLPs油乳剂疫苗的制备重组杆状病毒感染sf9细胞72h后，收集sf9细胞，置于冰上超声裂解细胞。4℃3500r/min离心15min后收集细胞裂解上清。利用蔗糖密度梯度离心法纯化并收集VLPs。TM向VLPs悬液中加入等体积油乳佐剂（MONTANIDEISA71VG）混合均匀制成油乳制剂，4℃保存备用。2.7.2动物免疫试验将40只1日龄健康樱桃谷肉鸭随机分为4组，每组10只。分别标记为VLPs组、NDPV灭活苗组、鹅细小病毒弱毒苗组、PBS对照组。免疫方案见表4.3。首次免疫一周后用同样剂量疫苗加强免疫。分别于一免后第一周、第二周、第三周、第四周对雏鸭进行颈静脉采血，分离血清。利用间接ELISA方法检测血清中抗体水平变化情况。表4.3鸭免疫方案Table4.3Schemeofduckimmunization组别疫苗免疫剂量免疫途径GroupvaccineDoesRouteAVLPs50μg/只腿部皮下BNDPV灭活苗1只份腿部皮下CGPV弱毒苗1只份腿部皮下DPBS200μL腿部皮下3结果3.1VP2基因的扩增以实验室保存的NDPVDNA为模板，VP2-F、VP2-R为引物进行PCR。核酸电泳结果显示，在大约1764左右有明显条带，与预期大小相符合（图4.1），说明成功扩增到目的基因。3.2重组供体质粒的鉴定重组供体质粒经限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后得到约为4.8kb和1.7kb的两条目的条带。与预期结果相符，表明含有VP2基因的重组供体质粒构建成功(图4.2)。28 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第四章VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定图4.1NDPVVP2基因片段图4.2重组质粒pFastBac图4.3重组杆状病毒质粒的PCR扩增HTA-VP2的双酶切鉴定PCR鉴定Fig.4.1PCRamplificationFig.4.2DoubleenzymesFig4.3IdentificationofofVP2genedigestionidentificationoftherecombinantBacmidM:DNA分子质量标准；1:NDPVrecombinantplasmidpFastBacM:DNA分子质量标准；1：M13VP3基因；2:阴性对照HTA-VP2引物鉴定；2：VP2引物鉴定M:Trans2KplusⅡDNAM:DNA分子质量标准；1：空质粒M:Trans2KplusⅡDNAMarker;1:Marker;1:TargetgeneVP3;pFastBacHTA；2：重组质粒pFastBacPCRidentificationwithM132:NegativecontrolHTA-VP2的XhoⅠ+KpnⅠ双酶切产物primers;2:PCRidentificationwithM:Trans2KplusⅡDNAMarker;1:TheVP2primersplasmidpFastBacHTAascontrol;2:ProductsfrompFastBac3.3重组杆状病毒质粒Bacmid-HTA-VP2的PCR鉴定以提取的重组杆状病毒质粒rBacmid-HTA-VP2为模板，利用M13通用引物PCR扩增的到大小约4194bp的条带（图4.3），表明重组杆状病毒质粒Bacmid-HTA-VP2构建成功。3.4重组杆状病毒rBac-HTA-VP2的构建重组杆状病毒质粒Bacmid-HTA-VP2转染sf9细胞，在28℃培养5d后，细胞出现病变。离心收集细胞上清培养基，即得到第一代重组杆状。继续传代至第3代，sf9细胞病变更加明显。与正常sf9细胞相比，受到感染的细胞生长速度下降，细胞间隙增大。单个细胞明显变大变圆，细胞中出现折光性颗粒。出现大量细胞死亡脱落情况（图4.4）。29 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第四章VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定3.5重组杆状病毒rBac-HTA-VP2毒价测定-5.5经过测定，第三代重组杆状病毒TCID50为10/0.1ml。AB图4.4重组杆状病毒感染sf9细胞结果（200×）Fig.4.4Resultsofsf9cellsinfectedwithrecombinantbaculovirus(200×)A:感染重组杆状病毒的细胞；B：正常sf9细胞A：sf9cellsinfectedwithrecombinantbaculovirusrBac-HTA-VP2;B:Uninfectedsf9cells3.6重组VP2蛋白的IFA检测重组杆状病毒rBac-HTA-VP2感染sf细胞72h后，以本实验室制备的抗NDPVVP3多克隆抗体为一抗，进行间接免疫荧光分析。结果显示，感染重组病毒的sf9细胞能检测到明亮的特异性红色荧光，正常sf9细胞无特异荧光（图4.5）。这说明重组VP2蛋白在昆虫细胞中成功表达。AB图4.5重组蛋白表达的IFA检测Fig.4.5DetectionoftheexpressionofrecombinantproteinbyIFAA:感染重组杆状病毒的细胞；B：正常sf9细胞A：sf9cellsinfectedwithrecombinantbaculovirusrBac-HTA-VP2;B:Uninfectedsf9cells30 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第四章VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定3.7重组蛋白的Western-blot检测收集细胞裂解液和细胞培养上清，分别处理后经SDS-PAGE电泳后转至NC膜，分别用自制的兔抗VP3蛋白多克隆抗体和鼠抗his标签IgG为一抗，进行Western-blot检测。AntiHis-TagAntiVP3图4.6表达产物的Westernblot检测Fig.4.6DetectionoftheexpressedproductbyWesternblotM：蛋白质分子质量标准；1：正常sf9细胞裂解液；2、4：重组杆状病毒感染细胞裂解液；3、5：重组杆状病毒感染细胞上清M:proteinmarker;2,4:sf9cellslysisbufferinfectedwithrecombinantbaculovirus;3,5:sf9cellssupernatantinfectedwithrecombinantbaculovirus3.8VLPs的电镜观察电子显微镜下可观察到直径大约20nm的空心颗粒，与天然病毒粒子相似。表明重组VP2蛋白能够自行装配成VLPs。图4.7透射电镜观察VP2蛋白形成的VLPsFig.4.7ElectronmicrographsofNDPVVLPsderivedfromVP231 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第四章VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定3.9VP2特异性抗体水平检测将乳化的VLPs、NDPV灭活苗、GPV弱毒苗和PBS分别腿部皮下注射免疫樱桃谷肉鸭，收集不同时间的血清，利用间接ELISA方法检测免疫后不同时间抗体水平。数据统计分析显示，免疫一周后，VLPs组、灭活苗组和弱毒苗组鸭血清中特异性抗体水平明显高于PBS组。随着时间推移，这三个组鸭子体内抗体水平逐渐增加，而PBS组在各个时间点抗体水平几乎没有变化。图4.8鸭血清中抗VP2特异性抗体变化情况Fig.4.8HistogramofVP2-specificantibodyresponseinvaccinatedducks4讨论Bac-to-Bac杆状病毒表达系统作为一种成熟的真核细胞表达系统，已经广泛应用于各种外源蛋白的表达。相对于原核表达系统，该系统拥有独特的优势，借助真核细胞完整的翻译后加工修饰系统和转移功能，能使异源蛋白更接近天然活性。所以该系统广泛应用于多功能蛋白，尤其是用于病毒样颗粒VLPs的表达生产。VLPs是不含病毒遗传物质但是在结构和部分生物学功能上与自然病毒类似的蛋白质空壳。很多病毒的衣壳蛋白都能自行折叠拼装成VLPs。VLPs能高密度的展示外源性表位，能够高效激活机体的免疫功能，具备成为安全疫苗的潜力。目前病毒的VLPs疫苗研制已经成为研究热点，如流感病毒样颗粒、肝炎病毒样颗粒、人乳头瘤病毒样颗粒等，部分病毒的VLPs已经作为疫苗成功应用于临床。有研究显示GPV的三种衣壳蛋白虽然均能在鹅细胞中诱导细胞免疫应答，但VP1相对较弱。VP2蛋白作为GPV的衣壳蛋白，在诊断和抗病毒感染方面有很大的开发潜力，大量制备具有良好生物活性的VP2蛋白在病毒的基础和应用研究方面都有重要意义。[65]Ghislaine等首次利用杆状病毒表达系统表达了鹅细小病毒的VP2衣壳蛋白，并得到病32 甘肃农业大学2017届硕士学位论文第四章VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定[66]毒样颗粒。HuanyuJu等利用杆状病毒表达系统分别表达鹅细小病毒的三种结构蛋白，结果显示三种结构蛋白均能自我组装成与天然鹅病毒相似的病毒样颗粒，且具有良好的免疫原性。本实验将新型鸭细小病毒VP2基因克隆至pFastBacHTA载体，在DH10Bac感受态细胞内进行转座，利用蓝白班筛选和SF9细胞转染试验获得表达NDPVVP2蛋白的重组杆状病毒，VP2蛋白在重组病毒感染的昆虫sf9细胞内成功表达，并且形成病毒样颗粒。我们对病变的sf9细胞进行Western-blot检测，结果显示目的蛋白具有良好的免疫原性，主要在细胞内表达，分泌到胞外的很少，细胞培养上清几乎检测不到。有研究表明宿主细[67,68][69]胞对密码子的嗜性是影响外源基因表达效率的一个重要原因。Cao等通过优化O型口蹄疫病毒衣壳蛋白基因，利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达得到VLPs，而未经优[70]化的基因无法产生VLPs。Chen等在不改变氨基酸序列的基础上根据sf9细胞对密码子的偏爱性对GPV衣壳蛋白编码基因进行优化，能够显著提高蛋白的表达量。后期我们可以对NDPV的VP2基因进行优化，以提高病毒样颗粒的产量。动物试验显示本研究制备的VLPs免疫鸭子后能够显著提高鸭血清中抗NDPV抗体水平，说明VLPs具有较好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答。这为新型鸭细小病毒病毒样颗粒疫苗的研发奠定了基础。33 甘肃农业大学2017届硕士学位论文全文总结全文总结1.本研究从鸭短喙侏儒综合症鸭病料中分离并鉴定出一株新型鸭细小病毒，命名为NDPVDS15株。2.对NDPVDS15株全基因序列进行了克隆与序列测定，结果表明，NDPVDS15株全基因序列长度为5104nt。基因组两侧为ITR，中间为两个大ORF。左侧ORF大小为1884nt,右侧ORF大小为2199nt。两个ORF之间是18nt的非编码区域。NDPVDS15株全基因序列与DPVSDLC01株同源性达到99.8%，与鹅细小病毒同源性最高可达97.2%。3.对DS15株VP3蛋白进行了原核表达，所表达的蛋白具有良好免疫原性，在此基础上制备了抗NDPV的特异性多克隆抗体。4.利用昆虫-杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了NDPVVP2蛋白，该蛋白在昆虫细胞中可以自我组装成病毒样颗粒且具有良好的免疫原性，为进一步研制新型鸭细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。34 甘肃农业大学2017届硕士学位论文参考文献参考文献[1]BrownKE,GreenSW,YoungNS.Gooseparvovirus--anautonomousmemberofthedependovirusgenus?[J].Virology,1995,210(2):283-291.[2]GlavitsR,ZolnaiA,SzaboE,etal.Comparativepathologicalstudiesondomesticgeese(Anseranserdomestica)andMuscovyducks(Cairinamoschata)experimentallyinfectedwithparvovirusstrainsofgooseandMuscovyduckorigin[J].ActaVetHung,2005,53(1):73-89.[3]HolmesJP,JonesJR,GoughRE,etal.GooseparvovirusinEnglandandWales[J].VetRec,2004,155(4):127.[4]JanssonDS,FeinsteinR,KardiV,etal.EpidemiologicinvestigationofanoutbreakofgooseparvovirusinfectioninSweden[J].AvianDis,2007,51(2):609-613.[5]LiuHM,WangH,TianXJ,etal.CompletegenomesequenceofgooseparvovirusYstrainisolatedfromMuscovyducksinChina[J].VirusGenes,2014,48(1):199-202.[6]PooniaB,DunnPA,LuH,etal.IsolationandmolecularcharacterizationofanewMuscovyduckparvovirusfromMuscovyducksintheUSA[J].AvianPathol,2006,35(6):435-441.[7]WangS,ChengXX,ChenSY,etal.GeneticcharacterizationofapotentiallynovelgooseparvoviruscirculatinginMuscovyduckflocksinFujianProvince,China[J].JVetMedSci,2013,75(8):1127-1130.[8]KisaryJ.Derzsy'sdiseaseofgeese[J].VirusInfectionofBirds,1993:157-162.[9]方定一.“小鹅瘟”的介绍[J].中国畜牧兽医,1962,(08):19-20.[10]LiuH,LiZ,WangY,etal.IsolationandidentificationofaMuscovyducklingparvovirus[J].ChineseJournalofVirology,1993.[11]TakeharaK,HyakutakeK,ImamuraT,etal.Isolation,identification,andplaquetitrationofparvovirusfromMuscovyducksinJapan[J].AvianDis,1994,38(4):810-815.[12]WoolcockPR,JestinV,ShivaprasadHL,etal.EvidenceofMuscovyduckparvovirusinMuscovyducklingsinCalifornia[J].VetRec,2000,146(3):68-72.[13]PalyaV,ZolnaiA,MatoT,etal.由世系截然不同的鹅细小病毒引起的杂交鸭的短喙和矮小综合征(SBDS)[C]//由世系截然不同的鹅细小病毒引起的杂交鸭的短喙和矮小综合征(SBDS).第15届世界禽病大会、中国畜牧兽医学会2007年学术年会,中国畜牧兽医学会,中国北京.1.[14]LiC,LiQ,ChenZ,etal.NovelduckparvovirusidentifiedinCherryValleyducks(Anasplatyrhynchosdomesticus),China[J].InfectGenetEvol,2016,44:278-280.[15]李传峰,李琦,陈宗艳,等.鸭短喙-侏儒综合征病原的初步鉴定[J].中国动物传染病学报,2015,(06):1-6.[16]宁康,王丹,王府民,等.樱桃谷北京鸭短喙和侏儒综合征的初步研究[J].中国兽医杂志,2015,(10):7-10+13+50.[17]Tatar-KisT,MatoT,MarkosB,etal.PhylogeneticanalysisofHungariangooseparvovirusisolatesand35 甘肃农业大学2017届硕士学位论文参考文献vaccinestrains[J].AvianPathol,2004,33(4):438-444.[18]PalyaV,ZolnaiA,BenyedaZ,etal.Shortbeakanddwarfismsyndromeofmuleduckiscausedbyadistinctlineageofgooseparvovirus[J].AvianPathol,2009,38(2):175-180.[19]ChangPC,ShienJH,WangMS,etal.PhylogeneticanalysisofparvovirusesisolatedinTaiwanfromducksandgeese[J].AvianPathol,2000,29(1):45-49.[20]LuYS,LinDF,LeeYL,etal.Infectiousbillatrophysyndromecausedbyparvovirusinaco-outbreakwithduckviralhepatitisinducklingsinTaiwan[J].AvianDis,1993,37(2):591-596.[21]ChenH,DouY,TangY,etal.IsolationandGenomicCharacterizationofaDuck-OriginGPV-RelatedParvovirusfromCherryValleyDucklingsinChina[J].PLoSOne,2015,10(10):e0140284.[22]CotmoreSF,Agbandje-MckennaM,ChioriniJA,etal.ThefamilyParvoviridae[J].ArchVirol,2014,159(5):1239-1247.[23]CotmoreSF,AgbandjemckennaM,ChioriniJA,etal.ThefamilyParvoviridae[J].ArchVirol,2014,159(5):1239-1247.[24]ZádoriZ,StefancsikR,RauchT,etal.AnalysisoftheCompleteNucleotideSequencesofGooseandMuscovyDuckPervovirusesIndicatesCommonAncestralOriginwithAdeno-AssociatedVirus2[J].Virology,1995,212(2):562-573.[25]SchettlerCH.Virushepatitisofgeese3.Propertiesofthecausalagent[J].AvianPathology,1973,2(3):179-193.[26]陈浩,窦砚国,唐熠,等.樱桃谷肉鸭短喙长舌综合征病原的分离鉴定[J].中国兽医学报,2015,(10):1600-1604.[27]BullerRML,JanikJE,SebringED,etal.HerpesSimplexVirusTypes1and2CompletelyHelpAdenovirus-AssociatedVirusReplication[J].JournalofVirology,1981,40(1):241-247.[28]KisaryJ,DerzsyD.ViraldiseaseofGoslings.IV.Characterizationofthecausalagentintissueculturesystem[J].ActaVetAcadSciHung,1974,24(3):287-292.[29]MalkinsonM,WinocourE.Adeno-associatedvirustype2enhancesgooseparvovirusreplicationinembryonatedgooseeggs[J].Virology,2005,336(2):265.[30]JanssonDS,PalyaV.EpidemiologicInvestigationofanOutbreakofGooseParvovirusInfectioninSweden(InvestigaciónepidemiológicadeunbrotedeinfecciónconparvovirusdelgansoenSuecia)[J].AvianDis,2007,51(2):609.[31]LeGall-ReculeG,JestinV.Biochemicalandgenomiccharacterizationofmuscovyduckparvovirus[J].ArchVirol,1994,139(1-2):121-131.[32]ChuCY,PanMJ,ChengJT.Geneticvariationofthenucleocapsidgenesofwaterfowlparvovirus[J].JVetMedSci,2001,63(11):1165-1170.[33]YinX,ZhangS,GaoY,etal.Characterizationofmonoclonalantibodiesagainstwaterfowlparvoviruses36 甘肃农业大学2017届硕士学位论文参考文献VP3protein[J].VirologyJournal,2012,9(1):288.[34]StrassheimML,GruenbergA,VeijalainenP,etal.Twodominantneutralizingantigenicdeterminantsofcanineparvovirusarefoundonthethreefoldspikeoftheviruscapsid[J].Virology,1994,198(1):175-184.[35]YuTF,MaB,GaoMC,etal.LocalizationoflinearB-cellepitopesongooseparvovirusstructuralprotein[J].VetImmunolImmunopathol,2012,145(1-2):522-526.[36]YuTF,MaB,WangJW.IdentificationoflinearB-cellepitopesongooseparvovirusnon-structuralprotein[J].VetImmunolImmunopathol,2016,179:85-88.[37]LiM,YuTF.Immunologiccross-reactivitybetweenMuscovyduckparvovirusandgooseparvovirusonthebasisofepitopeprediction[J].BrazJMicrobiol,2013,44(2):519-521.[38]郑玉美,李俊宝,王永坤.琼脂扩散试验对小鹅瘟病毒检测的研究[J].畜牧与兽医,1987,(04):148-149.[39]尚绪增,张雅为,王兆鹏,etal.鹅细小病毒NS2蛋白间接ELISA方法的建立[J].中国预防兽医学报,2010,(08):595-598.[40]杜秋明.鹅细小病毒单克隆抗体的制备及单抗双夹心ELISA检测方法的建立[D].City:延边大学,2011.[41]邵周伍林.鹅细小病毒传代致弱毒株的培育及胶体金免疫层析检测方法的建立[D].City:中国农业科学院,2015.[42]季艳菊,王林川.番鸭三种细小病毒多联PCR检测方法的建立与初步应用[J].中国动物检疫,2016,(04):85-90.[43]谢丽基,谢芝勋,刘加波,等.番鸭细小病毒LAMP可视化检测方法的建立[J].中国动物检疫,2013,(02):46-48.[44]余兵,王永坤,朱国强.应用核酸斑点杂交法检测鹅细小病毒(GPV)[J].中国兽医学报,2002,(05):453-454.[45]NiuX,ChenH,YangJ,etal.DevelopmentofaTaqMan-basedreal-timePCRassayforthedetectionofNovelGPV[J].JVirolMethods,2016,237:32-37.[46]李陆梅,宫晓,徐保娟,等.一种番鸭细小病毒灭活疫苗及其应用[M].2014.[47]VanOersMM.Opportunitiesandchallengesforthebaculovirusexpressionsystem[J].JInvertebrPathol,2011,107Suppl:S3-15.[48]FelberbaumRS.Thebaculovirusexpressionvectorsystem:Acommercialmanufacturingplatformforviralvaccinesandgenetherapyvectors[J].BiotechnolJ,2015,10(5):702-714.[49]KostTA,KempCW.FundamentalsofBaculovirusExpressionandApplications[J].AdvExpMedBiol,2016,896:187-197.[50]SmithGE,SummersMD,FraserMJ.Productionofhumanβ-interferonininsectcellsinfectedwithabaculovirusexpressionvector.Mol.Cell.Biol.3,2156-2165[J].Biotechnology:reading,Mass,1992,37 甘肃农业大学2017届硕士学位论文参考文献24(12):434-443.[51]LeeDF,ChenCC,HsuTA,etal.Abaculovirussuperinfectionsystem:efficientvehicleforgenetransferintoDrosophilaS2cells[J].JournalofVirology,2000,74(24):11873-11880.[52]LuckowVA,LeeSC,BarryGF,etal.Efficientgenerationofinfectiousrecombinantbaculovirusesbysite-specifictransposon-mediatedinsertionofforeigngenesintoabaculovirusgenomepropagatedinEscherichiacoli[J].JournalofVirology,1993,67(8):4566-4579.[53]PosseeRD,KingLA.BaculovirusTransferVectors[J].MethodsMolBiol,2016,1350:51-71.[54]KnudsonDL,TinsleyTW.ReplicationofanuclearpolyhedrosisvirusinacontinuouscellcultureofSpodopterafrugiperda:purification,assayofinfectivity,andgrowthcharacteristicsofthevirus[J].JVirol,1974,14(4):934-944.[55]GoodwinRH.Insectcellculture:improvedmediaandmethodsforinitiatingattachedcelllinesfromtheLepidoptera[J].InVitro,1975,11(6):369-378.[56]EliasCB,JardinB,KamenA.Recombinantproteinproductioninlarge-scaleagitatedbioreactorsusingthebaculovirusexpressionvectorsystem[J].MethodsMolBiol,2007,388:225-246.[57]AucoinMG,JacobD,ChahalPS,etal.Virus-likeparticleandviralvectorproductionusingthebaculovirusexpressionvectorsystem/insectcellsystem:adeno-associatedvirus-basedproducts[J].MethodsMolBiol,2007,388:281-296.[58]EiblR,SteigerN,WellnitzS,etal.FastSingle-UseVLPVaccineProductionsBasedonInsectCellsandtheBaculovirusExpressionVectorSystem:InfluenzaasCaseStudy[J].AdvBiochemEngBiotechnol,2014,138:99-125.[59]Yu-Chenhu.Baculovirusasahighlyefficientexpressionvectorininsectandmammaliancells[J].中国药理学报,2005,26(4):405-416.[60]WeyerU,PosseeRD.AbaculovirusdualexpressionvectorderivedfromtheAutographacalifornicanuclearpolyhedrosisviruspolyhedrinandp10promoters:co-expressionoftwoinfluenzavirusgenesininsectcells[J].JournalofGeneralVirology,1991,72(Pt12)(72(Pt12)):2967.[61]KronenbergS,BöttcherB,CwVDL,etal.Aconformationalchangeintheadeno-associatedvirustype2capsidleadstotheexposureofhiddenVP1Ntermini[J].JournalofVirology,2005,79(9):5296-5303.[62]GrifmanM,TrepelM,SpeeceP,etal.IncorporationofTumor-TargetingPeptidesintoRecombinantAdeno-associatedVirusCapsids[J].MolecularTherapytheJournaloftheAmericanSocietyofGeneTherapy,2001,3(6):964-975.[63]ShienJH,WangYS,ChenCH,etal.IdentificationofsequencechangesinliveattenuatedgooseparvovirusvaccinestrainsdevelopedinAsiaandEurope[J].AvianPathol,2008,37(5):499-505.[64]鞠环宇,卫娜,尚绪增,等.鹅细小病毒野毒株VP3基因的原核表达及抗原性检测[J].中国兽医科学,2009,39(6):492-497.38 甘肃农业大学2017届硕士学位论文参考文献[65]LeGRG,JestinV,ChagnaudP,etal.Expressionofmuscovyduckparvoviruscapsidproteins(VP2andVP3)inabaculovirusexpressionsystemanddemonstrationofimmunityinducedbytherecombinantproteins[J].JournalofGeneralVirology,1996,77(9):2159-2163.[66]JuH,WeiN,WangQ,etal.Gooseparvovirusstructuralproteinsexpressedbyrecombinantbaculovirusesself-assembleintovirus-likeparticleswithstrongimmunogenicityingoose[J].Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2011,409(1):131.[67]GustafssonC,GovindarajanS,MinshullJ.Codonbiasandheterologousproteinexpression[J].TrendsinBiotechnology,2004,22(7):346-353.[68]ZhouJ,LiuWJ,PengSW,etal.PapillomavirusCapsidProteinExpressionLevelDependsontheMatchbetweenCodonUsageandtRNAAvailability[J].JournalofVirology,1999,73(6):4972-4982.[69]CaoY,PuS,FuY,etal.Formationofvirus-likeparticlesfromO-typefoot-and-mouthdiseasevirusininsectcellsusingcodon-optimizedsyntheticgenes[J].BiotechnologyLetters,2010,32(9):1223-1229.[70]ChenZ,LiC,ZhuY,etal.Immunogenicityofvirus-likeparticlescontainingmodifiedgooseparvovirusVP2protein[J].VirusResearch,2012,169(1):306-309.39 甘肃农业大学2017届硕士学位论文致谢致谢本论文是在上海兽医研究所刘光清研究员和甘肃农业大学吴润教授悉心指导下完成的，值此论文完成之际，衷心的向我最尊敬的刘光清老师和吴润老师表示感谢。感谢二位恩师三年来对我的栽培，让我无论在学习还是科研方面都有了长足的进步。他们严谨的治学态度，敏捷清晰的科研思路，宽阔的视野，深厚的学术功底让我印象深刻，并将受益终生。谢谢老师们长期以来对我的关怀，由衷地祝愿二位恩师身体健康，工作顺心，桃李满天下！同时感谢中国农业科学院上海兽医研究所李传峰老师和陈宗艳老师。无论在工作学习还是生活中都给予我无微不至的关怀，为我提供及时的帮助。感谢朱杰、郭慧敏师兄以及唐井玉、李丹丹师姐对我实验上的指导和生活中的关心。感谢同窗谭永贵、刘柱、吴巧梅、宫晓华同学，陪我一起奋斗，一起度过这段快乐的时光。感谢刘腾师弟、张莉师妹，谢谢你们给我带来的快乐和感动。感谢我的家人，他们在学习和生活上给予的大力支持和无微不至的关怀，感谢他们无私的爱和无尽的帮助，向我的家人表示最深情的敬意！特别是我的父母，他们的支持与鼓励是我走到现在并继续前进的动力。衷心感谢动物医学院和研究生处各位老师的关心和帮助。最后向参加论文评阅和答辩的专家、教授致以衷心的感谢和崇高的敬意。40 甘肃农业大学2017届硕士学位论文作者简介作者简介姓名：李琦性别：男民族：汉族出生日期：1992年7月16日籍贯：山西省永济市学习经历：2010~2014年，甘肃农业大学动物医学院动物医学专业农学学士2014~2017年，甘肃农业大学动物医学院预防兽医学专业农学硕士2015~2017年，上海兽医研究所完成硕士课题研究工作。发表论文：[1]李琦,李传峰,唐井玉,刘柱,宫晓华,陈宗艳,王桂军,吴润,刘光清.新型鸭细小病毒VP3基因的原核表达及多克隆抗体的制备[J].中国兽医科学,2016,(06):717-72241 甘肃农业大学2017届硕士学位论文导师简介导师简介刘光清，男，汉族，1968年生，安徽砀山人。现任职于中国农业科学院上海兽医研究所，研究员，预防兽医学博士。2004年作为动物病毒学科带头人受聘于浙江省农业科学院工作，任动物病毒学课题组组长。曾为浙江省农业科学院“人才奔腾计划”第一层次和浙江省“151”人才工程第三层次培养人才；是浙江师范大学、安徽农业大学、甘肃农业大学的硕士研究生导师。2009年入职中国农业科学院上海兽医研究所参与国家水禽重点实验室的构建。现担任禽传染病研究室－水禽病毒病研究课题组组长。上海市闵行区领军人才，中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学会理事。工作经历：1991年7月，大学毕业后分配至安徽省砀山县畜牧兽医站工作，主要从事兽医临床和养殖技术推广等技术工作。2004年7月，作为动物病毒学科学术带头人被引进到浙江省农业科学院工作，任动物病毒学课题组长；2008年英国帝国理工大学进行学术交流和研究；2009年至今，在上海兽医研究所工作，任水禽病毒病课题组组长，主要从事兔瘟、鸭病毒性肝炎和呼肠孤等水禽病毒病的基础和应用研究。研究方向：长期从事猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、兔瘟以及鸭病毒性肝炎病毒等分子生物学、基因工程疫苗和分子诊断技术等方面的研究。擅长运用反向遗传操作技术研究动物病毒的基因组结构/基因功能以及病毒与宿主之间的互相作用等。主要成果：先后在Journalofvirology、JournalofGeneralVirology、VirusResearch、ArchivesofVirology和《科学通报》等国内、外学术刊物上发表学术论文70余篇，主持编写专著1部，参与编写著作2部。获得授权专利3项；获浙江省科学技术进步三等奖2项。主持和参加的科研项目主要有：国家自然科学基金、浙江省科技厅重大农业专项、浙江省自然科学基金、国际合作项目、农业部公益性行业专项和国家“863”计划等10余项。42 甘肃农业大学2017届硕士学位论文导师简介导师简介吴润，男，汉族，1958年7月29日生，甘肃定西市人。1974年参加工作，1982年毕业于甘肃农业大学兽医专业、获学士学位，2004年6月毕业于甘肃农业大学基础兽医学专业、获博士学位。1982年7月至今在甘肃农业大学动物医学院任助教、讲师、副教授和教授。1991年8月～1992年元月援藏，任西藏农牧学院讲师。现为甘肃农业大学动物医学院党委委员，预防兽医学系教授，博士生导师。社会兼职：中国实验动物学会理事，中国免疫学会兽医免疫分会委员，甘肃省实验动物学会副理事长，甘肃省免疫学会常务理事，甘肃省微生物学会常务理事，甘肃省实验动物管理委员会专家委员会委员，甘肃省重大动物疫病防控专家委员会委员，甘肃省动物防疫专家委员会委员，甘肃出入境检验检疫局技术专家，甘肃省牛羊产业协会专家委员，微生物学报、畜牧兽医学报、微生物通报、中国兽医科学和甘肃农业大学学报等杂志审稿专家。曾任甘肃省科技进步奖第四届评委会行业组评委。教学与研究：从1995年至今，已独立指导硕士生78名、博士生24名，73名硕士生、17博士生已获学位；联合指导硕士生22名、博士生23名，已获学位硕士19名、博士23名。指导硕士生论文中，2篇分别获2006年、2011年全国兽医专业学位优秀硕士学位论文；指导预防兽医学专业研究生学位论文中，2篇博士论文、6篇硕士论文获甘肃农业大学研究生优秀学位论文奖。已完成“新设《食品卫生微生物学检验》课教学体系研究”、“加强系内教学管理改革，大力促进专业教育发展”等教育教学研究，现进行“预防兽医学专业研究生教育培养体系改革和课程建设”调研。科研与奖励：研究方向动物病原微生物分子生物学及其致病机理、食品卫生微生物学检验、微生物酶工程及中草药抗微生物机制。主持完成国家自然科学基金项目“空肠弯曲菌毒力特征及其畜禽腹泻致病机制的研究”、教育部博士点基金项目“绵羊体内朊蛋白等位基因表达机制的研究”、省自然科学基金项目“经济动物空肠弯曲菌的研究”、甘肃省自然科学研究基金项目（1107RJZA198）、甘肃省科技支撑计划项目（1204NKCA103）、甘肃省农业科技专项（06223006）及家畜疫病病原生物学国家重点实验室基金项目和农业部畜禽病毒学重点实验室基金项目等12项，副主持完成省农业生物技术研究与应用开发项目1项，主要参加完成省攻关项目、省基金项目3项。现主持国家自然科学基金项目（31160510）等3项。获省级、厅级各类科学和教学研究奖4项，申报发明专利3项，获国家发明专利1项（专利号：ZL201110450742.0，证书号：第1268304号）。2001荣获甘肃省普通高等学校第八届青年教师成才奖，2010年获2008-2009年度甘肃省实验动物科技管理工作“先进个人”荣誉称号。专著与论文：在国内外学术刊物上发表学术论文170余篇，其中独作、一作或通讯作者发表论文96篇（SCI收录7篇，CSCD核心库收录50篇）。参译《病毒的分类与命名》第四次报告（科学出版社，1987），主编《食品卫生微生物学检验》（甘肃科学技术出版社，1997），参编《牛羊病诊断彩色图谱》（中国农业出版社，2004）、《畜禽疾病诊断指南》（中国农业出版社，2010）等专（译）著；参编国家级规划教材《兽医微生物学》(中国农业出版社，2001年第三版，2007年第四版)，主编《动物性食品卫生微生物学检验》（甘肃农业大学，1993），副主编“十一五”国家级规划教材《动物性食品卫生病原体检验》（中国农业出版社，2009）。43 44