山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析

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分类号：Ｓ８５８：１０４３４．３２授予学位单位代码学号：２０１５１１０４６２山东农业大学硕士学位论文山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其ＶＰ１基因的遗传分析ＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆＰｏｒｃｉｎｅＫｏｂｕｖｉｒｕｓｉｎＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＶＰ１Ｇｅｎｅ姓名：王玮学科专业：预防兽医学研究方向：分子病原学学院：动物科技学院指导教师：姜世金教授２０１８年６月５日 论文提交日期：2018.04.15论文答辩日期：2018.06.02学位授予日期：2018.06学科门类：农学答辩委员会主席：沈志强 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研宄所取得的成果。对在论文研宄期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以釆用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研宄所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：１７＋导师签＇名＾日期：２０１８．６．７ 符号说明英文缩略词英文全称中文全称AiVAichivirus爱知病毒BKVBovinekobuvirus牛嵴病毒bpbasepair碱基对cDNAcomplementarydeoxyribonucleicacid互补脱氧核糖核酸DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸DEPCdiethypyrocarbonate焦炭酸二乙酯dNTPdeoxyribonuleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸ELISAEnzyme-LinkedImmunosorbnentAssay酶联免疫吸附试验hhour小时ICTVInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses国际病毒分类委员会IRESinternalribosomeentrysite内部核糖体进入位点kbkilobase核酸分子中1000个碱基对Lliter升LBLuria-bertanimediumLB培养基mgmicrogram微克minminute分钟mLMilliliter毫升mRNAMessengerribonucleicacid信使核糖核酸ntnucleotide核苷酸数ORFOpenreadingframe开放性阅读框PBSPhosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PDCoVPorcinedeltacoronavirus猪德尔塔冠状病毒PEAVPorcineentericalphacoronavirus猪阿尔法冠状病毒PEDVPorcineepidemicdiarrheavirus猪流行性腹泻病毒pgpictogram皮克pHHydrogenionconcentration氢离子浓度指数 PKVPorcinekobuvirus猪嵴病毒RNAribonucleicacid核糖核酸rpmRoundperminute每分钟转数RT-PCRreversetranscriptionPCR反转录RCRRVRotavirus猪轮状病毒ssecond秒Taqthermusaquaticu水生热栖酶TGEVTransmissiblegastroenteritisvirusofswine猪传染性胃肠炎病毒UTRUntranslatedregion非编码区μLmicroliter微升 目录中文摘要.............................................................................................................................IAbstract............................................................................................................................III1引言.................................................................................................................................11.1微小核糖核酸病毒的研究进展...................................................................................11.2嵴病毒综述...................................................................................................................31.2.1嵴病毒的发现............................................................................................................31.2.2嵴病毒的生物学分类................................................................................................31.2.3嵴病毒的形态学结构................................................................................................41.2.4嵴病毒的理化特性....................................................................................................51.2.5嵴病毒的基因组结构................................................................................................51.2.6嵴病毒的蛋白结构及功能........................................................................................51.2.7嵴病毒的致病性........................................................................................................61.2.8PKV的流行情况.......................................................................................................71.2.9PKV的传播途径.......................................................................................................91.2.10PKV的检测.............................................................................................................91.3研究现状与展望.........................................................................................................111.4本研究的目的意义.....................................................................................................112材料与方法...................................................................................................................132.1材料.............................................................................................................................132.1.1病料样品..................................................................................................................132.1.2主要试剂..................................................................................................................132.1.3主要仪器..................................................................................................................132.1.4实验溶液配制..........................................................................................................132.1.5引物的设计与合成..................................................................................................142.2方法.............................................................................................................................152.2.1病料的处理..............................................................................................................152.2.2RNA的提取............................................................................................................162.2.3反转录与PCR扩增................................................................................................162.2.4基因目的片段的纯化回收......................................................................................17 2.2.5目的片段的连接和转化..........................................................................................182.2.6质粒的提取..............................................................................................................192.2.7质粒的酶切鉴定......................................................................................................202.8PKVVP1基因序列的同源性分析............................................................................203结果与分析...................................................................................................................213.1病料RT-PCR检测结果.............................................................................................213.2猪嵴病毒检测统计.....................................................................................................243.2.1腹泻猪群和非腹泻猪群PKV检测结果...............................................................243.2.2不同生长阶段猪群PKV检测结果........................................................................243.2.3不同季节PKV检测结果.......................................................................................253.2.4不同品种类型的PKV检测结果............................................................................253.2.5PKV与其它病毒的混合感染情况.........................................................................263.3PKVVP1基因的扩增和序列分析结果....................................................................283.3.1PKVVP1基因的扩增.............................................................................................283.3.2PKVVP1的酶切鉴定.............................................................................................293.3.3PKVVP1核苷酸序列分析及同源性分析.............................................................304讨论...............................................................................................................................354.1PKV的流行病学调查................................................................................................354.2PKVVP1基因序列分析............................................................................................385结论...............................................................................................................................406参考文献.......................................................................................................................41致谢..................................................................................................................................52攻读硕士学位期间发表论文情况..................................................................................53 山东农业大学硕士学位论文山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析中文摘要近年来，我国爆发了严重的猪腹泻疫情，对我国的养猪业造成了严重的经济损失。病毒细菌等病原微生物的感染、环境和饲养条件不当等都是引起猪腹泻的原因，其中病毒感染是引起猪腹泻的一个主要因素，常见的能引起猪腹泻的病毒主要有猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（RV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）。但近年来养猪业常用的PEDV/TGEV二联疫苗和PEDV/TGEV/RV三联疫苗经常出现免疫失败的现象。研究发现，一些新的病毒如猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）和猪阿尔法冠状病毒（PEAV）等也能够引起猪的腹泻；另外，还有一些可能与猪腹泻有关的病毒，如猪嵴病毒（PKV）。PKV属于微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）病毒，为单股正链RNA病毒，无囊膜，于2016年国际病毒分类委员会正式确立其为嵴病毒属（Kobuvirus）成员。2007年在匈牙利PKV首次被发现，随后在世界范围内均有检出，且检出率较高，但其是否致病、致病机制目前尚不清楚。大量研究证明，PKV在腹泻猪群中的检出率高于非腹泻猪群，多数研究者猜测，该病毒可能与猪的腹泻有关。但也有部分研究指出，该病毒在非腹泻猪群中的检出率高于腹泻猪群。本研究根据PKV的3D区保守序列设计的一对引物对来自山东省11个城市43所猪场的猪小肠内容物和粪便共计634份样品，进行RT-PCR检测和统计，调查了PKV在山东省部分县市的流行情况。结果显示，在634份样品中，PKV阳性率为39.91%（253/634），其中腹泻猪个体阳性率为28.90%（63/218），而非腹泻猪个体阳性率为45.67%（190/416）。数据显示，采集病料中PKV的检出率很高，说明PKV在山东省地区的感染十分普遍，而未发生腹泻猪群的PKV检出率远高于发生腹泻的猪群，本研究表明山东省范围内PKV感染与猪腹泻之间无必然联系，PKV在猪腹泻的爆发中可能并不是起主导作用的病原体。通过对采集样品的猪群不同的生长阶段统计可以看出，哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪及成年猪的PKV阳性率为48.31%（100/207）、34.78%（48/138）、27.75%（63/227）和67.74%（42/62），这说明PKV在山东猪群中各个日龄时期均有感染，且感染率普遍较高。对不同季节猪群PKV的检测统计可以看出，山东省猪群中PKV的携带率具有明显的季节差异，夏秋季节的PKV阳性率（53.42%，117/219）明显高I 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析于冬春季节（32.77%，136/415），与猪流行性腹泻爆发的季节相反，这进一步说明了PKV在猪腹泻中可能并不是起主导作用。对不同品种类型的猪群PKV检测结果统计发现，地方品种的阳性率最高为69.06%（96/139），其次是外三元，阳性率为33.73%（140/415），内三元的PKV阳性率在三者中最低，为21.25%（17/80）。本研究对PKV检测的同时，也对能够引起猪腹泻的PEDV、TGEV、RV、PDCoV和PEAV进行了检测。结果显示，PKV与PEDV、TGEV之间存在着明显的混合感染，对腹泻猪群和非腹泻猪群的混合感染数据比对显示，虽然PKV在非腹泻猪群中单独感染率远高于腹泻猪群，但非腹泻猪群PKV与PEDV和TGEV的混合感染率却明显低于腹泻猪群。由于PEDV和TGEV等病毒是引起猪腹泻的主要和常见原因，因此不能确定PKV在引起猪腹泻的过程是否发挥作用，推测PKV可能在猪腹泻的过程中作为协同病原发挥作用，而一般情况下并不具备单独感染导致猪腹泻的能力。本研究通过对PKVVP1基因两端的序列进行比对分析，设计了一对引物通过PCR方法扩增出完整的VP1基因，最终得到11个长度为762-765bp的VP1基因序列。通过与参考毒株比对发现，所扩增的11个VP1序列在713-715bp之间存在3nt的插入，而Liaocheng/160112在727-729bp之间还存在3nt的缺失，因此导致其长度有所不同。将本研究所得的11个VP1序列与GenBank中的参考毒株进行同源性分析，结果显示，分离的11个VP1序列之间的同源性在79.3-100%之间，其中，Ji’nan/Jiyang/171226与Tai’an/171222两条序列的同源性为100%，很可能是同一株病毒。本研究的11个VP1序列与参考毒株的同源性在78.0-88.6%之间，氨基酸同源性在79.9-97.6%之间，说明所分离的VP1序列与参考毒株之间存在着一定的变异。根据PKVVP1系统进化树，可以将其分为5个基因型（G1-G5），本研究所分离的11个VP1序列均处于G1中，并且处在三个分支上，表明PKVVP1序列的遗传和变异具有一定的地域性。关键词：猪嵴病毒；流行病学调查；猪腹泻；VP1基因II 山东农业大学硕士学位论文EpidemiologicalInvestigationofPorcineKobuvirusinShandongProvinceandGeneticAnalysisofVP1GeneAbstractInrecentyears,seriousoutbreaksofdiarrheainpigshavebeenreportedinChina,causingsevereeconomiclossestoChina'spig-breedingindustry.Diarrheainpigsiscausedbytheinfectionofviruses,bacteriaandotherpathogenicmicroorganisms,poorenvironment,andimproperfeedingconditions.Andvirusinfectionisamajorcauseofdiarrheainpigs.Thecommonvirusesthatcausediarrheainpigsareporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV),porcinerotavirus(RV)andporcinetransmissiblegastroenteritisvirus(TGEV).However,inrecentyears,thebigeminalvaccinesandrubellavaccineswhichwerecommonlyusedintheswineindustryhavefrequentlyexperiencedimmunefailure.Somenewviruses,suchasporcinedeltacoronavirus(PDCoV)andporcineentericalphacoronavirus(PEAV),werefoundthatcouldalsocausediarrheainpigs.Inaddition,porcinekobuvirus(PKV)mightbeassociatedwithdiarrheainpigs.PKVisthememberofthelargeandgrowingfamilyPicornaviridaeandisagenomicpositivesingle-strandedRNAviruswithoutenvelope.In2016,theInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses(ICTV)formallyestablisheditasamemberoftheKobuvirus.ItwasfirstdetectedinHungaryin2007,andsincethenwasdetectedworldwidewithhighdetectionrate.However,therelationshipbetweenthevirusanddiseasewasstillunclear.ItwasreportedinalargenumberofstudiesthatthedetectionrateofPKVindiarrheicpigswashigherthanthatofnon-diarrheicpigs.Mostresearchersspeculatedthatthevirusmightberelatedtodiarrheainpigs.However,somestudieshavepointedoutthatthedetectionrateofthevirusinnon-diarrheicpigswashigherthanthatofdiarrheicpigs.Inthisstudy,apairofprimerswasdesignedintheconservedsequenceofPKV3Dregions,andatotalof634samplesincludingswineintestinecontentsandfecesweredetectedbyRT-PCR,whichwerecollectedfrom43pigfarmsin11citiesofShandongProvince.AstatisticswasperformedtoinvestigatePKVinfectioninShandongProvince.Theresultsshowedthatin634samples,thepositiverateofPKVwas39.91%(253/634),ofwhichthepositiverateofdiarrheicpigswas28.90%(63/218),andthepositiverateofnon-diarrheicpigswas45.67%(190/416).ThedetectionrateofPKVwashighinthecollectedsamples,indicatingthattheinfectionofPKVinShandongProvincewasverycommon,andthepositiverateofnon-diarrheicpigswasmuchhigherthanthatofdiarrheicpigs.ThisstudyshowedthattherewasIII 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析nonecessaryrelationbetweenPKVinfectionandporcinediarrheainShandongprovince.Inotherwords,PKVmightnotbethedominantvirusinporcinediarrhea.ThepositiverateofPKVinsucklingpiglets,weaningpiglets,fatteningpigsandadulthoodpigswas48.31%(100/207),34.78%(48/138),and27.75%(63/227)and67.74%(42/62),whichwasshowninthestatisticsofthedifferentgrowthstagesofthecollectedpigs,indicatingthatPKVinfectedallofagegroupsinShandongpigs,andtheinfectionratewasgenerallyhigh.ThepositiverateofPKVinpigsinShandongProvincehadobviousseasondifferencesinthestatisticsofPKVdetectionindifferentseasonsofpigs,andthepositiverateofPKVinsummerandautumn(53.42%,117/219)wassignificantlyhigherthanthatinwinterandspring(32.77%，136/415),contrarytotheoutbreakseasonofporcineepidemicdiarrhea,whichdeeplyexplainedthatPKVmightnotplayadominantroleinporcinediarrhea.StatisticalanalysisofPKVresultsofdifferentbreedsofpigsfoundthatthelocalbreedshadthehighestpositiveratewith69.06%(96/139),followedbytheoutersanyuanwith33.73%(140/415),theinnersanyuanhasthelowestpositiverate,whichwas21.25%(17/80).PEDV,TGEV,RV,PDCoVandPEAV,whichcouldcauseporcinediarrhea,werealsodetectedinthisstudy,andtheco-infectionofPKVandtheseviruseswascounted,showingaclearmixedinfectionbetweenPKVandPEDV,TGEV.TherateofPKVsingle-infectedinnon-diarrheicpigswassignificantlyhigherthanthatofdiarrheicpigs,buttheco-infectionrateofPKVwithPEDVandTGEVinnondiarrheicpigswassignificantlylowerthanthatindiarrheapigs.SincebothPEDVandTGEVwerethemainandcommoncausesofdiarrheainpigs,itisnotpossibletodeterminewhetherPKVplayedaroleintheprocessofcausingdiarrheainpigs.ItwasspeculatedthatPKVmightactasasynergisticpathogenintheprocessofdiarrheainpigs,andtherewasnoabilitytocausediarrheainpigswithPKVsingle-infectedingeneral.Inthisstudy,wedesignedapairofprimerscontainingVP1genebycomparingthesequencesofthetwoendsofVP1geneofPKV,and11VP1genesequenceswereobtainedwithalengthof762-765bp.Bycomparisonwithreferencestrains,therewasa3ntinsertionbetween713-715bpinthe11VP1sequencesanda3ntdeletionbetween727-729bpinLiaocheng/160112,resultingindifferentlengths.The11VP1sequencesobtainedinthisstudywerecomparedwithreferencestrainsinGenBank.Theresultsshowedthatthehomologybetweenthe11VP1sequenceswasbetween79.3-100%,amongwhich,thehomologybetweenJi'nan/Jiyang/171226andTai'an/171222was100%,mostlikelythesamestrain.Thehomologybetweenthe11VP1sequencesandthereferencestrainswasbetween78.0-88.6%andtheaminoacidhomologywasbetween79.9-IV 山东农业大学硕士学位论文97.6%,indicatingthattherewasacertainvariationbetweentheisolatedVP1sequenceandthereferencestrain.AccordingtoPKVVP1phylogenetictree,itwasdividedinto5largegroups.Allofthe11VP1sequenceswereintheGroup1andwerelocatedonthreebranches,indicatingthatthePKVstrainspopularinShandongProvincemightevolvefromoneorseveraloriginalstrainsafteralongperiodofvariation.Keywords:Porcinekobuvirus;epidemiologicalinvestigation;porcinediarrhea;VP1geneV 山东农业大学硕士学位论文1引言自2012年以来，我国养猪业爆发了严重的腹泻疾病，给养猪业的经济和发展带来了巨大的打击。引起猪腹泻的原因有很多，如病毒、细菌等的感染，环境和饲养条件不当等等。其中病毒感染是导致猪腹泻的一个主要因素，其特点是发病急、传播快、感染面积大、死亡率高，仔猪发病死亡率常常高达100%。常见的能引起猪腹泻的病毒主要有猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）、猪轮状病毒（Rotavirus,RV）和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirusofswine,TGEV）。养猪用户经常使用PEDV/TGEV二联疫苗或者PEDV/TGEV/RV三联疫苗来控制腹泻疫情，但近年来经常出现免疫失败的现象，达不到控制疫情的效果。研究发现，一些新的病毒如猪德尔塔冠状病毒（Porcinedeltacoronavirus,PDCoV）（Wangetal.,2014）和猪阿尔法冠状病毒（Porcineentericalphacoronavirus,PEAV）（Panetal.,2017）也能够引起猪的腹泻；另外，还有一些病毒可能与猪的腹泻有关，如猪嵴病毒（Porcinekobuvirus,PKV）。1.1微小核糖核酸病毒的研究进展微小核糖核酸病毒（即微小RNA病毒,Picornaviruses），是动物RNA病毒中已知的最小的病毒。根据2016年国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV）的最新分类报告中，微小核糖核酸病毒科共有35个属，分别为口蹄疫病毒属（Aphthovirus）、心病毒属（Cardiovirus）、禽肝病毒属（Avihepatovirus）、肠病毒属（Enterovirus）、马鼻病毒属（Erbovirus）、肝病毒属（Hepatovirus）、嵴病毒属（Kobuvirus）、札幌病毒属（Sapelovirus）、双埃柯病毒属（Parechovirus）、塞内卡病毒属（Senecavirus）、捷申病毒属（Teschovirus）、震颤病毒属（Tremovirus）、Aquamavirus、Cosavirus、Dicipivirus、Megrivirus、Salivirus、Ampivirus、Avisivirus、Gallivirus、Harkavirus、Hunnivirus、Kunsagivirus、Limnipivirus、Mischivirus、Mosavirus、Oscivirus、Pasivirus、Passerivirus、Potamipivirus、Rabovirus、Rosavirus、Sakobuvirus、Sicinivirus和Torchivirus，其中后18个病毒属为2016年新增属目。微小核糖核酸病毒科病毒为单股正链RNA病毒，无囊膜和突起，病毒形态为圆形的裸露核衣壳，呈近球形，衣壳由60个亚单位组成，相对分子质量为（2.4-2.7）×106，病毒粒子对醚类和有机溶剂不敏感（Adamsetal.,2014）。微小核糖核酸病毒核酸长度1 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析为7209-8450bp，除了双歧病毒属的CadicivirusA（Wooetal.,2012），其基因组具有一个共同的基因结构：VPg-5’UTR-L/P1-P2-P3-3’UTR-poly(A)。5’端含有连接一个小分子蛋白VPg，用来当做RNA复制的引物，3’端带有一个poly(A)尾（Palmenbergetal.,2010）。基因组两端还各有一段保守的非编码区或非翻译区（Untranslatedregion,UTR），5’UTR包含多个茎环结构，是一个高度结构化的区域。5’UTR的这些高度结构化区域可以阻碍宿主细胞核糖体扫描并介导的翻译起始机制，因此，病毒必须使用一种不同于核糖体扫描的机制来招募核糖体到RNA上。但由于缺少一个7-甲基-鸟氨酸帽子结构，使得细胞mRNA帽复合物无法加入，所以病毒的翻译起始采用了不依赖帽子结构的方式（Chaseetal.,2012）。通常微小核糖核酸病毒是由5’UTR的茎环结构组成的IRES介导翻译起始，病毒基因组在5’UTR存在非真实的的启动密码子，自主形成IRES元件介导细胞内部核糖体的进入，使真核细胞的核糖体直接同RNA翻译起始位点结合，在真实起始密码子处开始翻译的起始。目前，在微小核糖核酸病毒中已知5种IRES类型（I型至V型）（HellenanddeBreyne,2007;Sweeneyetal.,2012）。病毒基因组有且仅有一个开放阅读框（Openreadingframe,ORF），编码一个长度为2178-2332个氨基酸的多聚蛋白，多聚蛋白在翻译过程中会被随即切割成前体蛋白和成熟蛋白，参与RNA的复制：P1编码病毒衣壳蛋白;P2和P3编码非结构蛋白（Knowlesetal.,2012;Palmenbergetal.,2010）。另外，大多数微小核糖核酸病毒在P1区之前编码前导序列（L）蛋白。在基因组的3'末端有一个3'UTR和一个poly（A）尾巴。微小RNA病毒基因组由几个额外的二级RNA结构组成（如顺式作用复制元件（CRE），“杠铃”状结构）（Borosetal.,2012,2014;McKnightandLemon,1998;SteilandBarton,2009;Yangetal.,2008）。已经确定了CREs的基因组位置及其对病毒RNA复制的贡献，并且已经在一些微小核糖核酸病毒中研究了“杠铃”样结构（Borosetal.,2012;SteilandBarton,2009;Pankovicsetal.,2015）。微小核糖核酸病毒包括范围广泛的病原体，并已发现于各种脊椎动物宿主物种，包括人和海洋哺乳动物（Kapooretal.,2008），鸟类（Borosetal.,2014;Pankovicsetal.,2015），爬行类（Heuseretal.,2014;Ngetal.,2015），两栖类（Reuteretal.,2015）和鱼类（Fichtneretal.,2013;Barbknechtetal.,2014;Phelpsetal.,2014）。其成员在各种脊椎动物宿主中引起皮肤粘膜，脑，心，肝，消化道，神经和呼吸系统疾病（Tracyetal.,2006;Wangetal.,2015）。脊髓灰质炎病毒是目前研究最多的的微小核糖核酸病毒，人类是脊髓灰质炎病毒的唯一天然宿主，通常该病毒侵犯的主要部位是中枢神经系统，2 山东农业大学硕士学位论文使得脊髓前角运动神经细胞受到损害，从而导致肢体松弛型麻痹（Pfeiffer，2010）。肠道病毒71型能够引起手足口病，该病毒具有感染性强、致病率高等特点，尤其能够引起神经系统方面的并发症，肠道病毒71型曾在亚洲大面积爆发，造成超过20名儿童的死亡，主要是由脑部感染或者心脏和肺部的并发症引起的（Wangetal.，2009）。鸭甲肝病毒能够引起鸭的病毒性肝炎，在雏鸭群体中传播迅速且高度致死，临床可见角弓反张等神经症状，剖检可见肝脏出血肿大（Woolcock,2003）。口蹄疫病毒可经呼吸道和消化道感染，引起偶蹄动物一种急性、热性、高度接触性和可快速远距离传播的疾病，以呼吸道感染为主，口蹄疫传播迅速，可以引起世界范围内的大流行（谢庆阁等,2004）.1.2嵴病毒综述1.2.1嵴病毒的发现爱知病毒（Aichivirus,AiV）是最早发现的一种嵴病毒，是一种新型的RNA病毒，Yamashita等人于1997年从一位肠胃炎病人的粪便样品中首次被分离出来，由于该病人来自于日本爱知（Aichi）县，因此将这一新发现的病毒命名为爱知病毒（Yamashitaetal.,1997）。通过基因分析证明，该病毒是一种微小核糖核酸病毒，根据基因型可分为A、B、C三个亚型，在前两种亚型之间，其同源性高达90%（Ambertetal.,2008）。2003年，牛嵴病毒（Bovinekobuvirus,BKV）（Yamashitaetal.,2003）在健康牛群的血清和粪便样品中被检测出来，病毒株U-1（序列号为AB084788）的全基因序列也被首次测序。猪嵴病毒于2007年在匈牙利的猪粪样品中首次被发现，S-1-HUN/2007/HUN（序列号为EU787450）的全基因组序列也被首次测序和命名，并作为PKV的参考毒株（Reuteretal.,2008），随后该病毒又相继在中国（Yuetal.,2009,2011）、泰国（Khamrinetal.,2009）、日本（Khamrinetal.,2010）、韩国（Parketal.,2010）、巴西和荷兰（Barryetal.,2011）等地区被检测到。此外，在牛、猪、羊、蝙蝠、鼠和犬的粪便样品中发现了类似的病毒，新的嵴病毒也在其后被发现和检测出来，包括Kagovirus1、兔嵴病毒、蝙蝠嵴病毒等（Yamashitaetal.,2000,2003;Reuteretal.,2008;Yuetal.,2011;Reuteretal.,2010;Lietal.,2011;Chungetal.,2013;Smitsetal.,2013;Bullmanetal.,2014;Dietal.,2014;Amimoetal.,2014）。1.2.2嵴病毒的生物学分类经基因序列分析发现，嵴病毒与人类的艾滋病病毒有一定的同源性（万遂如,2012）。1999年，嵴病毒属作为一种新的属，从属于微小核糖核酸病毒科中。2009年，3 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析在第9次病毒分类报告中，国际病毒分类委员会再次确立了嵴病毒属的生物学地位，其中仅包含了爱知病毒和牛嵴病毒两个成员，在2012年病毒分类报告中，猪嵴病毒被列为嵴病毒属的待定成员，到了2016年病毒分类报告中，猪嵴病毒被命名为AichivirusC正式列入嵴病毒属中，同时列入嵴病毒属的还有Kagovirus1、兔嵴病毒（Rabbitkobuvirus）和蝙蝠嵴病毒（Batkobuvirus）。目前，嵴病毒属包含6个分支，即AichivirusA-F，其中，AichivirusA是之前的爱知病毒；AichivirusB是之前的牛嵴病毒；AichivirusC就是猪嵴病毒；AichivirusD是Kagovirus1，于2016年由日本学者Otomaru等人在日本黑牛体内发现并报道（Otomaruetal.,2016）；AichivirusE是兔嵴病毒，于2016年在匈牙利首次被检测和发现（Pankovicsetal.,2016），AichivirusF是蝙蝠嵴病毒，由LinlinLi等人和ZhiqiangWu等人先后发现并报道（Lietal.,2010;Wuetal.,2016）。1.2.3嵴病毒的形态学结构嵴病毒，其名称“kobu”是基于日文的单词凸出、隆突之意，该病毒粒子在电镜下表面凹凸不平（图1），与中文中的“嵴”意思相近，因此命名为“嵴病毒”（代洪波等,2012）。嵴病毒是单股正链的RNA病毒，病毒颗粒直径为27-30nm，无囊膜，衣壳呈二十面体对称，为单层结构，由12个衣壳蛋白组成，在电镜下可见（Yamashitaetal.,1998;刘建等,2013）。图1-1病毒粒子电镜图（引自Yamashitaetal.,2003）Fig.1-1Virusparticleelectronmicroscope（Yamashitaetal.,2003）4 山东农业大学硕士学位论文1.2.4嵴病毒的理化特性和其它的微小核糖核酸病毒一样，嵴病毒在体外也相对比较稳定，不管是在pH3.5的酸性环境下还是对一些化学处理，包括氯仿、乙醚和非离子型去垢剂均有抵抗力，但病毒耐热性较差，在60℃加热30min时病毒便失去活性（Yamashitaetal.,1998）。1.2.5嵴病毒的基因组结构嵴病毒属病毒的基因组结构基本一致，基因组大小为8.2kb-8.3kb，GC含量高，可高达59%。嵴病毒基因组由5’UTR，一个编码多聚蛋白的ORF，3’UTR和poly(A)尾组成（图2），其5’端附近的茎环结构与RNA的复制和衣壳化密切相关，3’UTR非常长，最长可达到240bp。ORF包含位于5’端的起始密码子、无剪切活性的前导蛋白L基因、结构蛋白P1基因、非结构蛋白P2和P3基因以及位于3’端的终止密码子，其编码的多聚蛋白可被自身的活性区域逐级裂解为相应的结构蛋白和非结构蛋白（Reuteretal.,2011）。其中，PKV作为小RNA病毒科的一员，虽然关于该病毒编码区内部基因重组情况尚不明确，但其基因重组现象却比较常见（Wangetal.,2012）。图1-2嵴病毒的基因结构Fig.1-2Genestructureofkobuvirus1.2.6嵴病毒的蛋白结构及功能研究表明，嵴病毒多聚蛋白的剪切位点与其他微小核糖核酸病毒科病毒十分相似，即剪切位点经常位于谷氨酸（glutamine）和其他氨基酸之间，而该氨基酸通常为丙氨酸（alanine,A），丝氨酸（serine,S）或甘氨酸（glycine,G），少数为半胱氨酸（cysteine,C），苏氨酸（threonine,T）或组氨酸（histidine,H）（Sasakietal.,2003）。VPg蛋白与其基因组5’端共价相连，可能与病毒亚基因组结构的稳定性和病毒的细胞核定位性有关（梁越等,2009）；前导蛋白L位于多聚蛋白N端，包含170-195个氨基酸，无自我剪切活性，可能参与病毒衣壳蛋白的形成和RNA的复制过程（Greningeretal.,2012）。ORF所编码的多聚蛋白经自身活性区域逐级裂解为组成病毒结构的VP0、VP3、VP1蛋白和2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D等非结构蛋白（杨德全等,2012）。5 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析研究证明，嵴病毒5’UTR长度约为576-808nt，其复杂的二级或三级结构可能与病毒的复制有关（Sasakietal.,2001）；VP1蛋白暴露在病毒粒子的表面，承受的选择压力最大，使得VP1最容易发生变异，是嵴病毒的优势免疫蛋白，也是参与中和作用的主要蛋白（Yamashitaetal.,2003）；2A蛋白与人双埃柯病毒、禽脑脊髓炎病毒一样，含有属于网状蛋白家族H-rev107的保守的模体（H-box、NC和跨膜结构域），可能参与病毒RNA的复制（Sasakietal.,2008）和控制细胞增殖（Hughesetal.,2000）；但2B蛋白的功能在不同种属的微小核糖核酸病毒中各不相同；目前，嵴病毒2B蛋白的具体功能尚不明确。在已有的研究中，嵴病毒属中的爱知病毒、牛嵴病毒和猪嵴病毒，2C蛋白的氨基酸同源性较高，由此我们推测2C蛋白可能进化上比较保守，在AiV、BKV和PKV三种病毒之间，2C蛋白的氨基酸同源性高达68%-77%（Anetal.,2011）；3A基因编码的蛋白含有90-95个氨基酸；3B基因则编码与5’UTR共价结合的VPg蛋白，其氨基酸个数在27-34之间，该蛋白广泛存在于动植物病毒中，其作用是可以稳定病毒基因组结构。3C蛋白作为半胱氨酸蛋白酶，含有保守的三肽序列：组氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸，可在多聚蛋白的所有剪切位点发挥作用；3D区为病毒RNA依赖的RNA聚合酶，也含有高度保守的氨基酸模体KDELR、YGDD和FLKR，可参与病毒RNA的复制过程（Yuetal.,2011），虽然该区基因相对保守，但不同毒株之间也存在差异（Yamashitaetal.,1991）。1.2.7嵴病毒的致病性Kobuvirus属成员能够感染人类、家畜、鸟类和野生动物，如犬科动物、猫科动物、鼠科动物、禽类、绵羊、牛、雪貂、山羊、猪、野猪、兔和蝙蝠等（Yamashitaetal.,1998,2003;Lietal.,2009;Chungetal.,2015;Phanetal.,2011;Pankovicsetal.,2015;Reuteretal.,2009,2010;Oemetal.,2014），但是否具有跨种间传播有待进一步证实。根据各个病毒成员的相关报道，人们对嵴病毒的致病性和致病机理目前尚无定论，对嵴病毒的研究仍然处于初步探索的时期。爱知病毒自1991年被发现以来，许多国家相继报道了该病毒的检测，包括瑞典（Jonssonetal.,2012）、匈牙利（Reuteretal.,2009）、法国（Ambertetal.,2008）、中国（吴冰珊等,2011）、日本（Phametal.,2007）、突尼斯（Sdiri-Loulizietal.,2008）、芬兰（Kaikkonenetal.,2010）等国家。截至目前，爱知病毒在世界范围内均能够检测到，但主要是在亚洲对该病毒的检测进行了报道。爱知病毒在肠胃炎的散发6 山东农业大学硕士学位论文病例中发病率很低，虽然很多国家都有报道称爱知病毒引起胃肠炎，但是却没有引起大规模的传播扩散。牛嵴病毒目前在泰国（Khamrinetal.,2008）、韩国（Jeoungetal.,2011）、日本（Yamashitaetal.,2003）、比利时（Mauroyetal.,2009）、匈牙利（Reuteretal.,2009）等国家采集的牛的粪便样品中均被检测到。血清学调查表明，日本59.7%（43/72）的牛血清针对U-1株的中和抗体阳性，然而针对U-1的抗体在人、猴子、猪、马、犬和猫上并未检测到（Yamashitaetal.,2003）。牛嵴病毒已造成牛的普遍感染，并且呈地方性流行，但到目前为止仍没有证据表明该病毒与胃肠炎疾病有直接关系。猪嵴病毒自2007年在匈牙利首次发现以来，在世界各地均有检出，多数报道显示，在具有腹泻症状猪群的病料样品中该病毒的检出率明显高于无症状猪群，因此许多科研人员猜测其可能与猪腹泻有关，但需要进一步的研究证实这种猜测。Kagovirus于2016年在日本鹿儿岛（Kagoshima）县中的日本黑牛腹泻个体体内被检测和发现，但该病毒在牛中的致病潜力尚不清楚（Otomaruetal.,2016）。兔嵴病毒是匈牙利学者Pankovics等人通过对2010-2014年间收集的56份健康兔粪便进行检测而发现的病毒，对于其致病性目前仍在进一步的探究中（Pankovicsetal.,2016）。蝙蝠嵴病毒分别在2010年由LinlinLi等人和2016年ZhiqiangWu等人先后发现和报道，但其致病性尚不清楚（Lietal.,2010;Wuetal.,2016）。1.2.8PKV的流行情况1.2.8.1国外PKV的流行情况自2007年，在匈牙利首次发现以来，许多国家都报道出PKV的检出。目前有大量数据和报道证明，该病毒广泛存在世界各地猪场中。泰国、日本、韩国、巴西、荷兰、美国、捷克斯洛伐克等国家均有PKV被检测出的报道，该病毒从粪便样本中检出率为16%-99%不等。2007年2月份，Reuter等在匈牙利东部一个猪场内采集60份猪粪便样品中有39份粪便样品检测为PKV阳性，其阳性率为65%。2008年11月份分别采集了60份血清样本和粪便样品,结果显示,有32份粪便样品呈阳性，有16份血清样品呈阳性，其阳性率分别为53.3%和26.6%（Reuteretal.,2008）。两份关于泰国PKV感染情况的流行病学调查显示，其检出率高达99%（97/98）（Khamrinetal.,2009）和97%（121/131）（Okitsuetal.,2012）。2010年，日本的28个猪场共计293份健康猪群的猪粪样品中7 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析PKV检出率为45.4%（133/293）（Okitsuetal.,2012）；2009-2010年，韩国的腹泻猪群中PKV检出率为84.5%（71/84），而非腹泻猪群PKV检出率为19.3%（16/83）（Parketal.,2010.）；2010-2011年，巴西的猪群中PKV检出率为53%（61/115），荷兰猪群的PKV检出率则为16.7%（3/18）（Barryetal.,2011）；来自美国的PKV流行病学调查报道，该病毒在其腹泻猪群中的检出率为21.9%（25/114），健康猪群中的检出率为21.7%（10/46）（Vermaetal.,2013）；在捷克斯洛伐克的猪群中，PKV的总检出率达到87.2%（171/196）（Dufkovaetal.,2013）。1.2.8.2国内PKV的流行情况2009年，Yu等人在检测杯状病毒时，发现一条类似于BKV3D片段的，大小约为1000bp的非特异性条带，同源性高达73%。为了验证进一步的结果，他们重新设计了一对片段大小为443bp的特异性引物，并用这对引物检测了322份15日龄以内的仔猪粪便样品，结果其阳性率达到30.12%（Yuetal.,2011）。2010年底，胡军勇等人对来自湖北省54个规模化养殖猪场共计165份仔猪粪便样品进行了检测，其中腹泻仔猪的PKV检出率达到82.5%，非腹泻仔猪的PKV检出率为13.23%（胡军勇等,2012）。2011年，王长松等在上海周边采集样品进行PKV的流行病学调查，发现其阳性率为32.4-46.7%（Wangetal.,2011）。2012年，张莎等检测了来自24个省市84个猪场的236份样品，共有63份样品检测为PKV阳性，检出率为36.69%，分别来自于36个猪场，猪场阳性率为42.85%（张莎等,2013）。2012年，甘肃省PKV检出率为41.5%（Fanetal.,2013）。2012年，李淞等人对来自四川的123份腹泻仔猪粪便进行了检测，结果共有73份PKV阳性病料，检出率为59.3%（李淞等,2012）2013年，陈蕾等对四川地区PKV的感染情况进行了报道，其阳性率为53.4%（87/163），其中腹泻猪群PKV检出率为64.3%（72/112），健康猪群的PKV检出率则为29.4%（15/51）（Chenetal.,2013）。在江西省2013年的一份PKV流行病学调查中指出，在检测2010年江西省100份PEDV阳性病料中，PKV的检出率为42.86%（张文波等,2013）。2014年，姬郭彪等利用RT-PCR方法检测了来自河南地区84个猪场173份猪粪便样品，检测结果显示，其PKV感染率为82.1%，其中腹泻猪群的PKV检出率为80%（姬郭彪等,2014）。8 山东农业大学硕士学位论文在2016年的一份流行病学调查中，来自吉林、河南、江苏、上海和广东等省市的314份猪粪样品被检测，结果显示，PKV阳性率为29.9%（Zhaoetal.,2016）。2018年，谢荣辉等人利用荧光定量RT-PCR对浙江的139份猪粪便样品进行检测，检测结果显示PKV阳性的有43份，阳性率为30.94%，其中41份与普通RT-PCR检测结果一致，另外2份样品荧光定量RT-PCT检测为阳性而普通RT-PCR检测为阴性，其Ct值分别为34.51和33.79，PKV含量均较低（谢荣辉等,2018）。1.2.8.3PKV的感染日龄研究发现PKV在猪群不同生长阶段均有感染，国内外对此均有报道。匈牙利学者Reuter等人对一个猪场不同生长阶段（10日龄、21日龄、4月龄、6月龄）猪群肛门拭子样品检测，该病毒感染率分别为100.0%、93.3%、20.0%和46.7%（Reuteretal.,2008）。王长松等人在中国上海三个猪场采集小于42日龄和大于12周龄的猪群肛门拭子样品，PKV检出率为49.3%和19.5%，前者明显高于后者（Wangetal.,2011）。韩国有文献报道，21日龄以下猪群PKV感染率为育肥猪的五倍多（Anetal.,2011）。大量数据表明3周龄以下仔猪PKV感染率明显高于生长育肥猪以及母猪感染率。1.2.9PKV的传播途径目前，PKV通过何种途径传播尚不清楚。Reuter等人曾在猪血清中检测到该病毒（Reuteretal.,2010），表明该病毒不仅能存在于胃肠道系统，也可以进入血液系统。粪-口、哺乳、血液等均有可能是PKV的传播途径，仍有待进一步研究。已有的研究结果表明，PKV在牛、山羊、绵羊中被检测出（Leeetal.,2012;Reuteretal.,2010）。另外，嵴病毒也在人、牛、猪、养、蝙蝠、狗及小数等多种动物源样品中被检测到，显示了其具有广泛的感染宿主。但嵴病毒到底是通过何种方式传播，有待更多的研究成果的证明。1.2.10PKV的检测1.2.10.1病毒的分离培养鉴定病原最直接有效的方法是病毒分离培养，但其缺点是病毒的分离培养周期长，并且需要找到易感病毒的细胞系。根据已有的报道，爱知病毒可以在Vero细胞和BS-C-1细胞（Yamashitaetal.,1991）上成功增殖并能观察到明显的细胞病变，但在Hela细胞、RD细胞和乳鼠细胞等细胞系上无法生长（Sasaki,2007）。牛嵴病毒U-1株第一次被分离出来使用被牛嵴病毒污染的Hela细胞培养液接种Vero细胞，观察到明显的细胞病变，继而测定了全基因组序列。然而目前科研者们通过尝试将PKV接种于Vero、9 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析CHO、Marc-145、PK-15、BHK-21等细胞系中，没有观察到明显的细胞病变（祝俊鹏等,2015），因此仍然没有找到能够适应PKV生长的易感细胞系和培养方案，不能将该病毒进行分离培养。这些因素导致对病毒的复制、组装及致病机理等方面的进一步研究都无法进行。因此找到PKV的分离方法是目前急需解决的重要难题。1.2.10.2血清学和免疫学检测方法酶联免疫吸附试验（ELISA）作为实验室常用的一种检测技术，具有快速、简便、灵敏、载体易标准化等优点，经常被应用于检测大分子抗原和特异性抗体等。国内学者陈蕾等对PKV的主要结构蛋白即中和抗体结合蛋白VP1蛋白进行了表达，并对其主要的抗原表位，二级及三级结构进行了分析，其结果为PKV特异性抗原的ELISA以及其他免疫学方法的建立提供了科学的参考依据（陈蕾等,2012）。目前已有关于PKV间接ELISA检测方法建立的相关文献报道（朱庆贺等,2017）。1.2.10.3电镜技术电子显微镜技术是一种快速、直观的了解病毒粒子的方法，广泛地应用于动植物病毒的检测和研究。通过该技术我们不但能够对病毒粒子的大小、形态进行观察，还可以将病毒粒子表面的蛋白亚单位和内部的核壳等超微结构有效区分。但该技术无法区分形态特征相近或相同的病毒，所以必须与其他技术配合使用才能对病毒粒子作出准确判断。1.2.10.4PCR技术及测序分析PCR技术具有敏感性高、特异性强、对起始材料质量要求低、产物生成量大等特点，因此被广泛应用。根据PKV基因组结构特点，由于PKV的3D基因高度保守（陈如敬等,2012），因此通过设计该基因的片段特异性引物进行RT-PCR扩增，可以快速、准确的对猪嵴病毒进行检测。张文波等运用PKV的3D基因保守序列建立RT-PCR检测方法,其最小检测量可达2.3pg,重复性和特异性良好（张文波等,2013）。该方法可用于PKV的分子流行病学调查和临床病例的快速诊断。在已有的文献中，对PKV的检测大都采用了RT-PCR的方法，分子生物学技术目前仍是用于实验室检测PKV的最常用的技术。荧光定量PCR可以在反应过程中对累积扩增产物进行分析和检测。在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的比例增加来反映DNA量的增加，从而完成PCR产物的实时检测。试验结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，大大节省了试验时间，提高了试验效率。刘孟良等建立的PKV的SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测方法，灵10 山东农业大学硕士学位论文敏性很高，最低可以检出100拷贝数，具有良好的稳定性和较高的精确度（刘孟良等,2013）。1.3研究现状与展望目前对于PKV的研究，还仅限于基因组序列分析和流行病学调查等基础研究。大量PKV的流行病学调查数据显示，该病毒在世界范围内和我国国内的检出率都很高，足以引起科研工作者的高度重视。多数研究表明腹泻猪群猪嵴病毒的感染率高于健康猪群，因此人们推测其可能与猪腹泻有某种联系。迄今为止，PKV的传染源、传播机制等尚不清楚，虽然尚未发现它可在不同物种之间交叉感染的报导，但却不能排除这一可能。由于在对PKV的分离培养方面的困难，我们对其病理生理学、临床症状、致病机理等仍不清楚。PKV在世界范围内广泛流行，感染率普遍较高，许多关于PKV的问题也亟待解决：PKV是否致病、其致病机理如何、长期存在于猪的体内是否会对机体产生影响、是否与其他病毒之间有某种联系而使得其在特定条件下引起疾病等等。科研工作者们需要对该病毒进行足够的重视和进一步的探索，其中最重要的工作应是找到PKV的易感细胞系，为后续的深入研究奠定坚实的基础和有力的依据。1.4本研究的目的意义近年来，我国爆发了大规模的猪腹泻疫情，给我国养猪业造成巨额的经济损失。其中猪病毒性腹泻是一类主要的疾病，PEDV、TGEV和RV是引起猪病毒性腹泻主要的病原体；研究证实，许多新病毒也能引起猪的病毒性腹泻，如猪德尔塔冠状病毒、猪阿尔法冠状病毒；而PKV作为疑似引起猪腹泻的病原体，在腹泻猪群和非腹泻猪群中均被检测到，且检出率比较高。因此，在对于能够引起猪腹泻的主要病原的研究的同时，对PKV的研究也十分关键。数据表明在具有腹泻症状的猪群中，PKV阳性率明显高于无腹泻症状的猪群，可能暗示其对猪具有一定的致病性。但也有报道显示，没有腹泻症状的猪群PKV检出率比腹泻猪群高：Zhou等人通过检测来自奥地利、德国、匈牙利、西班牙、瑞典五个欧洲国家的猪粪样品统计发现，奥地利（腹泻猪群43.8%、健康猪群50%）和瑞典（腹泻猪群17.4%、健康猪群60.8%）的样品中，腹泻猪群猪嵴病毒的检出率低于健康猪群（Zhouetal.,2016）。尽管如此，PKV是否与肠道疾病有关，目前尚无定论，关于致病机制方面的研究成果也未见报道。但是PKV在猪粪样品中检出率较高，长期处于隐性感染状态，可能对宿主产生不利影响。11 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析山东省作为全国畜牧业的大省，每年养猪量数目巨大，对于猪流行性腹泻的防控尤为重要。在对于引起猪腹泻的主要病原体的研究基础上，对于PKV的研究也十分关键。PKV还不能成功分离培养，对其病毒的复制、组装及致病机理等方面的深入研究无法开展，目前对于PKV的探索还局限于流行病学调查和基因组序列分析。本实验室在研究引起猪腹泻的相关病毒的过程中发现，PKV作为一种疑似引起猪腹泻的病毒在病料中检出率较高，因此对PKV进行了相关的流行病学调查和研究。对来自山东省部分县市的634份粪便、肛门拭子及肠道组织等样品进行PKV的流行病学调查，并根据不同地区、不同症状、不同采样时间、不同日龄、不同品种类型和与其他病毒的混合感染情况等方面对PKV阳性病料进行统计和分析，为山东省猪嵴病毒的流行病学提供了较为详细的参考数据，同时39.91%（253/634）的PKV检出率也足以引起相关部门和专家学者们的重视。12 山东农业大学硕士学位论文2材料与方法2.1材料2.1.1病料样品实验室保存的猪腹泻病料共计116份，另外去不同猪场采取猪粪及肛门拭子共计518份。样品分别来自于济南、德州、泰安、莱芜、潍坊、烟台、青岛、聊城、临沂等地不同县市，样品采集时间为2014年冬季至2018年春季。2.1.2主要试剂RNA提取TRIzol、限制性内切酶BamHI、HindIII、pMD18-T载体均购自于宝生物公司；反转录酶、RNA酶抑制剂均购自于Thermo公司；PCR相关试剂购自于北京全式金公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自于北京康为世纪生物科技有限公司；大肠杆菌DH5α感受态菌株由本实验室保存。2.1.3主要仪器PCR仪（HealForceThermalCyclerT960，中国上海力康生物医疗科技控股有限公司）；高速冷冻离心机（Sigma1-14，德国）；电热恒温培养箱（DNP-9162，中国上海习仁科学仪器有限公司）；电泳仪（JUNYIJY600C，中国北京君意东方电泳设备有限公司）；凝胶紫外分析仪（JY02S型，中国北京君意东方电泳设备有限公司）；凝胶成像系统（INFINITY3026，法国）；电子分析天平（JA2003，中国上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；超净工作台（SW-CJ中国苏州净化设备有限公司）。2.1.4实验溶液配制2.1.4.1琼脂糖凝胶电泳溶液（1）50×TAE：称取242gTrisbase，37.2g乙二胺四乙酸二钠置于1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。然后加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，最后加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。使用时，取20ml50×TAE贮存液，加入980ml去离子水充分稀释成1×TAE电泳缓冲液。（2）1%琼脂糖凝胶：称取0.9g琼脂糖，加入90ml1×TAE电泳缓冲液，在微波炉中加热熔化后，冷却到60-70℃时加入3μLGelStain核酸染料，倒入封好的凝胶槽，厚度约3-5mm，在距底板0.5-1mm的位置放置样品，检查梳子齿间有无起泡，可用吸管小心吸出起泡，待冷却成形后取出梳子及隔板备用。2.1.4.2菌株培养试剂的配制13 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析（1）LB液体培养基：称取酵母提取物5.0g，NaCl10.0g，胰蛋白胨10.0g置于1L烧杯中，倒入约800ml去离子水中，充分搅拌溶解，滴加10MNaOH溶液调节pH至7.2-7.6，然后加入去离子水将溶液定容至1L，分装后高压灭菌室温或4℃保存备用。（2）50mg/mL氨苄青霉素（Ampicillin）贮存液：取0.5g氨苄青霉素溶于10ml灭菌去离子水中，充分混匀。用灭菌的0.22子水孔径滤器过滤除菌后，分装至灭菌的1.5ml离心管中，置于-20中保存备用。（3）LB固体培养基（含氨苄青霉素）：取100ml配好的LB液体培养基，加入1.5g琼脂粉，高压灭菌。待其温度降至50℃时，加入约200μL50mg/mL氨苄青霉素，充分混匀后倒入灭菌的玻璃平皿中，室温下水平放置，待培养基凝固后置于4℃保存备用。2.1.4.3病料处理的缓冲液配制PBS缓冲液：分别称取8g氯化钠、0.2g氯化钾、3.58g十二水合磷酸氢二钠、0.27g磷酸二氢钾，加入约800mL的去离子水搅拌均匀使其充分溶解，最后加入去离子水定容至1000mL，室温保存，备用。2.1.5引物的设计与合成2.1.5.1腹泻相关病毒检测引物根据各个病毒的保守序列，设计如下引物对病毒进行检测。将设计好的引物序列发送到上海生工生物技术有限公司合成。合成后的引物根据所提供的浓度，用超纯水稀释成浓度为0.25mM，存放于4℃备用。表2-1PKV及其它病毒的检测引物Table2-1Primersusedfordetectingtheviruses引物名称序列（5'to3'）片段长度（bp）PKV-FGCCGCCGACCTTTACTTCTCTA358PKV-RGTCCACCAAGCAGCATCCTACCDn-FCAGGTCCCAGAGGAAATCTTAA456Dn-RCCATACCCGTCTTCTCAGTGTCPe-FGCTTTCAGGTCAACTGGGTC347Pe-RACGACCAACACGTCCGTAGA14 山东农业大学硕士学位论文Tg-FACTCGCTATCGCATGGTGAA779Tg-RGATGGACGAGCATAGGCATTRV-FTAGTCGTACTTGCACCGCTCAT510RV-RCTGTAGTCGAACATCCTATCCCPEAV-FGTTCCGACAGGTAAAGGCACTC280PEAV-RGGTCTGGTGGTAATTGAAACCC2.1.5.2PKV的VP1全基因序列扩增引物根据PKVVP1基因两端序列，设计如下引物对PKVVP1基因进行扩增。将设计好的引物序列发送到上海生工生物技术有限公司合成。合成后的引物根据所提供的浓度，用超纯水稀释成浓度为0.25mM，存放于4℃备用。表2-2PKVVP1基因的扩增引物Table2-2PrimersusedforamplifyingtheVP1geneofPKV引物名称序列（5'to3'）片段长度（bp）V-FAACATGGCCAACCAGAAYTC1204V-RTATTAGTAGCAGAGTAGTCCCAACG2.2方法2.2.1病料的处理（1）粪便的处理取少量粪便置于1.5mL离心管中，加入500μLPBS缓冲液，震荡2min，反复冻融三次。然后12000rpm离心5min，取上清200μL用于提取RNA。（2）肠道组织的处理剪取豆粒大小的病料组织置于1.5ml离心管中，加入200μLPBS缓冲液，先用眼科手术剪将剪取的病料组织充分剪碎，然后再用研磨棒将其充分研磨，用于提取RNA。（3）肛门拭子15 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析直接吸取浸泡肛门拭子的PBS缓冲液200μL用于提取RNA。2.2.2RNA的提取采用常规TRIzol法提取病毒RNA，提前准备用0.1%DPEC水处理过的1.5ml离心管、蓝枪头、黄枪头、白枪头以及PCR管，高温灭菌后烘干备用。RNA提取过程在超净台中进行，超净台提前紫外照射0.5-1h，提取RNA的过程中必须佩戴口罩和手套。（1）向已经处理好的200μL病料样品中加入800μLTRIzol，充分混匀后，室温静置5min；（2）加入200μL氯仿，剧烈震荡30s后室温静置3min，然后4℃、12000rpm离心15min；（3）小心吸取上清透明水相液体约500μL，置于新的1.5ml离心管（经0.1%DEPC水处理）中，加入500μL异丙醇（用于沉淀RNA），颠倒混匀后，室温静置10min；（4）4℃、12000rpm离心10min，然后弃掉上清，加入250μLDEPC处理水和750μL事先置于-20℃的无水乙醇，颠倒混匀；（5）4℃、7500rpm离心5min，然后弃掉上清，将离心管倒置于吸水纸上晾干管内残余液体；（6）每管加入50μLDEPC处理水，充分溶解附着在管壁上的RNA，置于-20℃保存备用。2.2.3反转录与PCR扩增2.2.3.1反转录反转录体系为10μL反应体系：反应体系组分体系（μL）DEPC处理水0.75RTBuffer2dNTP（10mM）1RandomPrimer0.5反转录酶0.5RNase抑制剂0.25模板（RNA）5反应条件为：42℃1h；72℃15min。2.2.3.2PCR扩增16 山东农业大学硕士学位论文PCR反应体系为25μL体系：反应体系组分体系（μL）Buffer2.5dNTP（2.5mM）2上游引物1下游引物1Taq酶0.2模板（cDNA）1超纯水17.3检测PKV、PEDV、RV、PDCoV的PCR反应条件为：预变性95℃5min；预变95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，32个循环；终延伸72℃10min；4℃低温保存。检测TGEV的PCR反应条件为：预变性95℃5min；预变95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，32个循环；终延伸72℃10min；4℃低温保存。检测PEAV的PCR反应条件为：预变性95℃5min；预变95℃45s，退火52℃45s，延伸72℃30s，32个循环；终延伸72℃10min；4℃低温保存。2.2.3.3琼脂糖凝胶核酸电泳分析（1）提前制备好浓度为1%的琼脂糖凝胶，向PCR产物中加入1/5体积的LoadingBuffer（约6μL），混匀，取约20μL左右加入凝胶点样孔中，并加入6-8μL的DL2000DNAMarker；（2）将加完样品的琼脂糖凝胶放入1×TAE缓冲液中，电泳至溴酚蓝移出样品槽到胶板的2/3距离时，关闭电源；（3）取出凝胶块，置于凝胶紫外分析仪上观察，并在凝胶系统下拍照记录。2.2.4基因目的片段的纯化回收（1）将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入干净的2ml离心管中；（2）向胶块中加入BufferPG，液体覆盖胶块即可；（3）55℃水浴孵育，期间温和地上下颠倒离心管几次，待胶块完全溶解，液体中无可见的未溶胶块时，将离心管置于冰水混合物中使其冷却；17 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析（4）柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱（SpinColumnsDM）中加入200μLBufferPS，室温静置5min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；（5）将步骤（3）所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中（注：吸附柱容积为750μL，若样品体积大于750μL可分批加入）；（6）向吸附柱中加入750μLBufferPW（已加入无水乙醇），室温静置2min后，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；（7）12000rpm空离2min，倒掉收集管中的液体；（8）将吸附柱置于37℃温箱中烘干，5-10min，同时将BufferEB放置于55℃水浴锅中预热；（9）将吸附柱放到一个新的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40μLBufferEB，然后置于55后水浴锅中孵育10min，12000rpm离心3-5min；（10）收集溶液，再次悬空加入吸附柱中，12000rpm离心3-5min，收集溶液，4℃保存备用，长期保存放置于-20℃冰箱中。2.2.5目的片段的连接和转化2.2.5.1目的片段的连接连接体系为10μL体系：反应体系组分体系（μL）胶回收产物4.5pMD18-T载体0.5SolutionI5反应条件为：16℃连接过夜。2.2.5.2DH5α感受态的制备（1）在长试管中加入15ml灭菌的LB液体培养基，加入50μLDH5α菌液，在37℃摇床里震荡培养至对数期，即半混浊状态；（2）将菌液分装至灭菌的1.5ml离心管中，8000rpm离心1min；（3）弃掉上清，并小心吸弃管内剩余液体，然后分别加入200μL过滤除菌的0.1M氯化钙溶液（于-20℃保存），将沉淀重悬，放置于冰水混合物中保存备用。感受态细胞在冰水混合物中保存6h后再进行转化操作，最长保存时间为7天。18 山东农业大学硕士学位论文2.2.5.3转化（1）取5μL连接产物，加入到事先做好的DH5α感受态中，置于冰水混合物中冰浴30min；（2）将离心管放入42-43℃水浴中，热激90s，随后迅速将离心管移至冰水混合物中冰浴2-3min；（3）加入800μLLB液体培养基，37℃水浴中孵育45min；（4）离心至8000rpm，弃掉部分上清，留下约100-200μL培养基；（5）将沉淀重悬，轻轻混匀，取100μL菌液均匀涂布到含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，将平板倒置于37℃温箱中过夜培养，次日挑取单个菌落于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃摇床中震荡培养。2.2.6质粒的提取（1）取1-5ml过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm离心1min，收集菌体沉淀，吸弃上清；（2）向离心管中加入250μLBufferP1（已加入RNaseA），使用移液器将沉淀重悬，并充分混匀；（3）向离心管中加入250μLBufferP2，温和地上下颠倒混匀4-6次，充分混匀使菌体裂解，此时溶液变得清亮粘稠；（4）向离心管中加入350μLBufferN3，立即温和地上下颠倒混匀8-10次，溶液中出现白色絮状沉淀，室温静置5min，然后12000rpm离心10min；（5）将上清液转移至已装入收集管的吸附柱（SpinColumnsDM）中，室温静置2min后，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；（6）向吸附柱中加入150μLBufferPB，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；（7）向吸附柱中加入750μLBufferPW（已加入无水乙醇），室温静置1min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；（8）12000rpm空离2min，倒掉收集管中的液体；（9）将吸附柱置于37℃温箱中烘干，5-10min，同时将BufferEB放置于55℃水浴锅中预热；（9）将吸附柱放到一个新的1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40μLBufferEB，然后置于55℃水浴锅中孵育10min，12000rpm离心3-5min；19 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析（10）收集溶液，再次悬空加入吸附柱中，12000rpm离心3-5min，收集溶液，4℃保存备用，长期保存放置于-20℃冰箱中。2.2.7质粒的酶切鉴定酶切反应体系为20μL体系：反应体系组分体系（μL）Buffer2BamHI1HindIII1质粒8超纯水837℃水浴中孵育30min，所得的酶切产物用1%的琼脂糖凝胶进行核酸电泳分析（参照步骤2.3.3）。若出现目的条带，则将对应质粒送往上海生工生物工程有限公司进行测序。2.3PKVVP1基因序列的同源性分析将PCR扩增的11个包含PKVVP1基因序列的目的片段在NCBI数据库中进行Blast比对，确定其正确性；然后根据GenBank中的PKV参考毒株，在所扩增的目的片段中定位VP1的序列位置。用DNAStar软件将所得的11个VP1序列与参考毒株进行比对，分析其同源性，并用MEGA6.06软件绘制PKVVP1的系统进化树。20 山东农业大学硕士学位论文3结果与分析3.1病料RT-PCR检测结果以病料样品提取的总RNA为模板，反转录合成cDNA，并以此为模板进行PCR检测，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果PKV检测条带目的片段约为358bp，与预期大小一致（图3-1）.同时对PEDV检测得到约为347bp目的片段，与预期大小一致（图3-2），对TGEV检测得到约为779bp目的片段，与预期大小一致（图3-3），对RV检测得到约为511bp目的片段，与预期大小一致（图3-4），对PDCoV检测得到约为456bp目的片段，与预期大小一致（图3-5）和对PEAV检测得到约为280bp目的片段，与预期大小一致（图3-6）。病料样品中PKV的检测结果如图3-7所示。图3-1PKV的RT-PCR检测Fig.3-1DetectionofPKVbyRT-PCRM.DNAMarkerDL2000;1.RT-PCRproductofPKV图3-2PEDV的RT-PCR检测Fig.3-2DetectionofPEDVbyRT-PCRM.DNAMarkerDL2000;1.RT-PCRproductofPEDV21 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析图3-3TGEV的RT-PCR检测Fig.3-3DetectionofTGEVbyRT-PCRM.DNAMarkerDL2000;1.RT-PCRproductofTGEV图3-4RV的RT-PCR检测Fig.3-4DetectionofRVbyRT-PCRM.DNAMarkerDL2000;1.RT-PCRproductofRV图3-5PDCoV的RT-PCR检测Fig.3-5DetectionofPDCoVbyRT-PCRM.DNAMarkerDL2000;1.RT-PCRproductofPDCoV22 山东农业大学硕士学位论文图3-6PEAV的RT-PCR检测Fig.3-6DetectionofPEAVbyRT-PCRM.DNAMarkerDL2000;1.RT-PCRproductofPEAV图3-7病料样品中PKV的检测结果Fig.3-7PKVtestresultsindiseasesamplesM.DNAMarkerDL2000;1-10.Thediseasesamples;11-12:PositivecontrolofPKV表3-1腹泻猪群和非腹泻猪群PKV检测结果Table3-1DetectionofPKVindifferentregionsinShandongprovince阳性率(%)阳性猪场数/总数阳性率(%)临床表现地区阳性数/总数PositivePositivePositiveClinicalsymptomsRegionsPositive/Totalrates(%)farms/Totalrates(%)德州4/850.003/650.00济南24/11021.806/1060.00济宁4/1330.772/2100.00莱芜3/1030.001/1100.00腹泻猪群聊城17/4537.782/366.67临沂1/250.001/1100.00青岛1/616.671/1100.00泰安4/944.442/366.6723 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析潍坊2/633.331/1100.00烟台1/520.001/1100.00枣庄2/420.002/2100.00小计63/21828.9022/3170.97济南73/19737.064/580.00莱芜100/13971.943/3100.00非腹泻猪群泰安17/8021.252/450.00小计190/41645.679/1275.00总计253/63439.9131/4372.093.2猪嵴病毒检测统计利用上述RT-PCR方法，将本实验室保存的小肠及内容物和去不同猪场采集的猪粪及肛门拭子进行PKV的检测。病料样品共计634份，PKV阳性数253份，阳性率为39.91%；病料样品来自于山东省不同县市共计43个猪场，其中有31个猪场的样品检测到PKV，猪场阳性率为72.09%（表3-1）。数据表明，PKV在山东省猪群内普遍流行，且携带率较高。3.2.1腹泻猪群和非腹泻猪群PKV检测结果对腹泻猪样品和非腹泻猪样品进行分类统计，其中腹泻猪群样品共有218份，检出63份PKV阳性样品，阳性率为28.90%；腹泻样品来自31个猪场，其中有22个猪场检出PKV，阳性率为70.97%。而非腹泻猪群样品共有416份，其中有190份为PKV阳性样品，阳性率为45.67%；非腹泻样品来自12个猪场，9个猪场检出PKV，阳性率为75%（表3-1）。表明猪嵴病毒在山东省腹泻猪群和非腹泻猪群中均有较高的感染率，而非腹泻猪群的猪嵴病毒感染率高于腹泻猪群则表明山东省范围内猪嵴病毒感染与猪腹泻之间无必然联系。3.2.2不同生长阶段猪群PKV检测结果根据猪群的不同生长阶段进行统计，采集的病料样品中哺乳仔猪样品有207份，PKV阳性数为100份，阳性率为48.31%；断奶仔猪样品有138份，检出48份阳性样品，阳性率为34.78%；育肥猪样品有227份，其中有63份为阳性，阳性率为27.75%；成年猪有62份，其中有42份阳性，阳性率为67.74%（表3-2）。结果表明，山东省不同生长阶段的猪群均有较高的PKV的阳性率，其中成年猪的个体阳性率最高，其次24 山东农业大学硕士学位论文是哺乳仔猪、断奶仔猪，育肥猪的个体阳性率最低。PKV在成年猪和哺乳仔猪中的感染率较高，流行更广泛。表3-2不同日龄猪群PKV检测结果统计Table3-2DetectionofPKVindifferentgrowthperiod生长阶段样品数阳性数阳性率AgeGroupNumberPositivePositiverates哺乳仔猪20710048.31%断奶仔猪1384834.78%育肥猪2276327.75%成年猪624267.74%总计63425339.91%3.2.3不同季节PKV检测结果根据采样时间对病料的PKV阳性率进行统计显示，夏秋季节（5-10月份）样品共有219份，117份检测为阳性，阳性率为53.42%，冬春季节（11-次年4月份）样品共有415份，136份检测为阳性，阳性率为32.77%（表3-3）。这表明山东省猪群中PKV的携带率具有明显季节差异，夏秋季节猪的个体阳性率明显高于冬春季节，并且这种季节性与猪流行性腹泻爆发的季节恰好相反，从而进一步说明，PKV不是引起猪腹泻的主要因素。表3-3不同季节PKV检测结果统计Table3-3DetectionofPKVindifferentseasons采样时间样品数阳性数阳性率SamplingNumberPositivePositiveratesseasons夏秋季节21911753.42%冬春季节41513632.77%3.2.4不同品种类型的PKV检测结果采集的样品根据品种类型可以分为外三元、内三元和地方品种三种类型，山东省猪群从品种类型上也大致可以分为这三大类型。从数量统计来看，山东省养殖的猪主要以外三元为主，采集外三元样品的数量为415份，PKV检测呈阳性的有140份，其阳性率为33.73%；内三元样品数为80份，PKV检测呈阳性的仅有17份，阳性率为21.25%；地方品种主要是莱芜黑猪和鲁莱黑猪，样品数为139份，而PKV阳性数为9625 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析份，阳性率高达69.09%，这可能是由于莱芜黑猪和鲁莱黑猪猪场与其他品种猪之间隔绝，养殖环境比较封闭，PKV在种群内部相互传播所致（表3-4）。表3-4不同品种类型PKV检测结果Table3-4DetectionofPKVindifferentbreeds品种类型样品数阳性数阳性率BreedNumberPositivePositiverates外三元41514033.73%内三元801721.25%地方品种1399669.06%总计63425339.91%3.2.5PKV与其它病毒的混合感染情况本研究中对采集的病料进行PKV检测的同时，也对PEDV、TGEV、RV、PDCoV、PEAV这几种病毒进行了检测，并对PKV与这几种病毒的混合感染情况进行了统计。其中PEDV、TGEV、RV、PDCoV、PEAV的检出率如表3-5所示。在这几种病毒中，PEDV检出率最高为8.36%（53/634），其中腹泻猪群样品的检出率为31.65%（69/218），非腹泻猪群样品的检出率为3.37%（14/416）；TGEV检出率次之，为4.42%（28/634），其中，腹泻猪群样品的检出率为10.09%（22/218），而非腹泻猪群样品的检出率仅为1.44%（28/634）；RV和PDCoV检出率较低，分别为1.10%（7/634）和0.95%（6/634），并且仅在非腹泻猪样品中检出；PEAV在所有病料样品中均未检出。表3-5PEDV、TGEV、RV、PDCoV和PEAV的检测结果Table3-5ThedetectionresultofPEDV,TGEV,RV,PDCoVandPEAV病毒检出率临床表现DetectionrateofdifferentvirusClinicalsymptomsPEDVTGEVRVPDCoVPEAV腹泻猪群31.65%(69/218)10.09%(22/218)0(0/218)0(0/218)0(0/218)非腹泻猪群3.37%(14/416)1.44%(6/416)1.68%(7/416)1.44%(6/416)0(0/416)总计8.36%(53/634)4.42%(28/634)1.10%(7/634)0.95%(6/634)0(0/634)由于PEDV和TGEV在病料样品中的检出率较高，而RV和PDCoV的检出率很低，不具有代表性，所以本研究对PKV与PEDV、TGEV之间的混合感染情况进行了统计。统计发现，在所有的253份PKV阳性病料样品中，PKV单独感染的样品有216份，26 山东农业大学硕士学位论文PKV与PEDV混合感染的样品有21份，PKV与TGEV混合感染的有5份，PKV与PEDV、TGEV混合感染的有11份。其中，腹泻猪群样品中PKV阳性共有63份，PKV单独感染的样品数有34份，PKV与PEDV混合感染的样品有15份，PKV与TGEV混合感染的样品有5份，PKV、PEDV与TGEV混合感染的样品有9份。而非腹泻猪群样品中PKV阳性共有190份，PKV单独感染的样品数有182份，PKV与PEDV混合感染的样品有6份，PKV与PEDV、TGEV混合感染的样品有2份，PKV与TGEV之间没有混合感染。表3-6PKV与PDEV、TGEV的混合感染情况Table3-6Theco-infectionbetweenPKV,PEDVandTGEV病毒感染情况临床表现PKV感染总数Co-infectionbetweenPKV,PEDVandTGEVClinicalPositivesymptomsnumberofPKVPKVPKV+PEDVPKV+TGEVPKV+PEDV+TGEV腹泻猪群63341559非腹泻猪群190182602合计25321621511根据上述数据，分析PKV和PEDV、TGEV在腹泻猪群和非腹泻猪群的的混合感染数所占总数比例，将结果进行比对显示，PKV单独感染在非腹泻猪群样品的比例为43.75%，远高于PKV单独感染在腹泻猪群样品中的比例（15.60%），而PKV与PEDV、PKV与TGEV、PKV与PEDV和TGEV的混合感染在腹泻猪群样品中所占的比例（分别为6.88%、2.29%、4.13%）均高于非腹泻猪群（分别为1.44%、0、0.48%）（图3-8）。由此可见，引起猪腹泻的主要病原体仍然是PEDV、TGEV等，而PKV在猪腹泻的过程中是否发挥作用不能确定。27 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析图3-8PKV与PEDV、TGEV的混合感染情况Fig.3-8Theco-infectionofPKV,PEDVandTGEV3.3PKVVP1基因的扩增和序列分析结果3.3.1PKVVP1基因的扩增以病料样品提取的总RNA为模板，反转录合成cDNA，并以此为模板，用VP1特异性引物进行PCR扩增，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果目的片段约为1204bp，与预期大小一致（图3-9）。图3-9PKVVP1基因的RT-PCR扩增Fig.3-9AmplificationofPKVVP1genebyRT-PCRM.DNAMarkerDL2000;1.VP1geneofPKV28 山东农业大学硕士学位论文3.3.2PKVVP1的酶切鉴定将上述RT-PCR扩增产物进行回收，胶回收产物与pMD18-T载体16℃连接过夜，然后转化到DH5α感受态细胞中，经过涂板、挑菌、摇菌后，将得到的菌液提取质粒，将该质粒用BamHI和HindIII两种酶进行酶切鉴定，阳性质粒pMD18-VP1鉴定结果如图3-10所示。并将酶切结果为阳性的质粒送往生工测序。图3-10PKVVP1基因的酶切鉴定Fig.3-10EnzymeidentificationofpMD18-VP1M.DNAMarkerDL5000;1,2.pMD18-VP1/BamHI+HindIII表3-7PKV参考毒株Table3-7ThereferencestrainsofPKV序列名称序列号来源国家DX/2012/CHKJ452348.1中国HNXX-4/2012/CHJX401523.1中国HZ/2011/CHJX827598.1中国KB-1/2014/CHKM051987.1中国CH441/2012/CHKF539763.1中国GS-1/2012/CHKC424639.1中国GS-2/2012/CHKC424640.1中国JS-01/2013/CHKP144318.1中国JS-02a/2014/CHNC_027054.1中国JXAT/2015/CHKY234499.1中国JXJC/2015/CHKY234500.1中国K-4/2012/CHKC424638.1中国29 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析K-11/2012/CHKC414936.1中国SH-W/2010/CHNC_016769.1中国XX/2011/CHKC204684.1中国S-1/2007/HUNEU787450.2匈牙利K-30/2008/HUNGQ249161.1匈牙利WB-1/2011/HUNJX177612.1匈牙利OH/RV50/2011/USKM977675.1美国CMP01/2007/THAAB624490.2泰国CMP17/2007/THAAB624504.2泰国CMP03/2007/THAAB624492.2泰国T247/2009/JPAB624502.2日本T182/2009/JPAB624500.2日本T093/2009/JPAB624498.2日本AichivirusAB040749.1-AichivirusBU-1AB084788.1-3.3.3PKVVP1核苷酸序列分析及同源性分析3.3.3.1参考毒株在NCBI上选取具有代表性的参考毒株如表3-7所示，其中包括15株来自中国的PKV参考毒株，3株匈牙利PKV毒株，3株日本PKV毒株，3株泰国PKV毒株和1株美国PKV毒株。此外，还包括了Aichivirus和牛嵴病毒U-1参考毒株。3.3.3.2PKVVP1的同源性分析将PCR扩增获得的具有代表性的11株包含PKVVP1基因的序列进行测序，将测序结果通过Blast比对，证明所扩增的片段是PKV中的目的片段。利用DNAStar软件，通过比对GenBank中的参考毒株，在所扩增的片段中定位VP1基因位置，最终得到11个VP1基因序列（表3-8）。表3-8本研究中获得的11个PKVVP1基因序列Table3-8TheVP1geneofPKVinthisstudy序列基因长度(bp)采样地点采样时间SequenceLengthofVP1geneSamplinglocationSamplinglocationJi’nan/Jiyang/171226765济南济阳2017.12.2630 山东农业大学硕士学位论文Ji’nan/Zhangqiu/171205765济南章丘2017.12.05Ji’nan/Zhangqiu/180201765济南章丘2018.02.01Dezhou/151121765德州2015.11.21Laiwu/151111765莱芜2015.11.11Laiwu/161025765莱芜2016.10.25Weifang/151103765潍坊2015.11.03Ji’ning/151115765济宁2015.11.15Liaocheng/160112762聊城2016.01.12Tai’an/171222765泰安2017.12.22Tai’an/180125765泰安2018.01.25根据样品采集地和采集时间分别将这11个PKVVP1序列命名为Ji’nan/Jiyang/171226（济南济阳）、Ji’nan/Zhangqiu/171205（济南章丘）、Ji’nan/Zhangqiu/180201（济南章丘）、Dezhou/151121（德州）、Laiwu/151111（莱芜）、Laiwu/161025（莱芜）、Weifang/151103（潍坊）、Ji’ning/151115（济宁）、Liaocheng/160112（聊城）、Tai’an/171222（泰安）、Tai’an/180125（泰安）。其所得到的片段长度为762-765bp。其中，10个PKVVP1基因序列长为765bp，仅有Liaocheng/160112片段长度为762bp。从截取的部分变异区域图（图3-11）可以看到，本研究所分离的11个PKVVP1序列均在713-715bp之间有3nt的插入，参考毒株中DX/2012/CH、HNXX-4/2012/CH、HZ/2011/CH、JS-01/2013/CH、JS-02a/2014/CH、JXAT/2015/CH、OH/RV50/2011/US、CH441/2012/CH、KB-1/2014/CH、CMP17/2007/THA等毒株在该位置也均存在3nt的插入；而仅有Liaocheng/160112中727-729bp之间有3nt的缺失。31 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析图3-11PKVVP1基因的插入和缺失Fig.3-11TheinsertionanddeletionofPKVVP1gene用DNAStar软件将这11个PKVVP1基因序列与GenBank中的PKVVP1序列进行比对，比对结果显示，11个VP1基因序列之间的同源性为79.3-100%之间，其中Ji’nan/Jiyang/171226与Tai’an/171222两条序列完全相同，可能是同一株病毒。本研究的11个VP1基因序列与GenBank中的VP1序列之间的同源性在78.0-88.6%之间：其中，11个VP1基因序列与来自中国的15个参考毒株的同源性在78.9-88.6%；与美国毒株OH/RV50/2011/US的同源性在78.0-82.9%之间；与泰国毒株CMP01/2007/THA、CMP17/2007/THA、CMP03/2007/THA的同源性在78.0-82.6%之间；与日本毒株T247/2009/JP、T182/2009/JP、T093/2009/JP的同源性在79.3-84.8%之间；与匈牙利毒株S-1/2007/HUN、K-30/2008/HUN、WB-1/2011/HUN的同源性在80.1-85.0%。将11个PKVVP1基因序列推导翻译成氨基酸序列，然后进行比对。比对结果显示，11个VP1基因推导的氨基酸之间的同源性为82.0-100.0%之间。与GenBank中的VP1序列推导的氨基酸序列之间的同源性在79.9-97.6%之间：其中，11个VP1基因推导的氨基酸序列与来自中国的15个参考毒株对应片段推导的氨基酸序列的同源性在32 山东农业大学硕士学位论文81.5-97.6%之间；与美国毒株OH/RV50/2011/US的氨基酸同源性在80.8-91.0%之间；与泰国毒株CMP01/2007/THA、CMP17/2007/THA、CMP03/2007/THA的氨基酸同源性在80.7-91.8%之间；与日本毒株T247/2009/JP、T182/2009/JP、T093/2009/JP的氨基酸同源性在82.3-92.9%之间；与匈牙利毒株S-1/2007/HUN、K-30/2008/HUN、WB-1/2011/HUN的氨基酸同源性在79.9-90.9%。该结果证明，虽然PKVVP1基因核苷酸变异较大，但由于同义翻译，推导氨基酸同源性仍然较高。3.3.3.3PKVVP1的系统进化树利用MEGA6.06软件制作本实验所分离的11个VP1序列与25株PKV参考毒以及Aichivirus、BKVU-1的系统进化树（图3-12）。从PKVVP1基因的系统进化树中可以看到，11个PKVVP1序列与Aichivirus和BKVU-1均不在同一分支，而与25株PKV参考毒株存在于同一分支，证明所分离的11个序列是PKVVP1序列。将所有的PKVVP1序列分为5个基因型（Genotype，G），即G1-G5，其中G1又细分为2个亚型及G1-I和G1-II。其中，G1由23个毒株组成，本研究所分离的11个VP1序列全部在该基因型中：其中Ji’nan/Jiyang/171226、Tai’an/171222、Laiwu/151111、Dezhou/151121、Ji’nan/Zhangqiu/171205同存在于G1-I亚型中，并处于同一分支，与中国毒株DX/2012/CH相近；Liaocheng/160112、Ji’ning/151115、Weifang/151103、Ji’nan/Zhangqiu/180201、Laiwu/161025、Tai’an/180125同存在于G1-II亚型中，Liaocheng/160112单独处于一个分支，剩余五株VP1序列处于同一分支中，与中国毒株JS-01/2013/CH相近。另外来自美国的毒株OH/RV50/2011/US和泰国的毒株CMP18/2007/THA也在其中，并且处于同一分支中。G2仅包含HZ/2011/CH一株。G3包含9株毒，其中匈牙利的3个毒株和日本的3个毒株均存在于该基因型中。G4包含了两个泰国毒株CMP01/2007/THA和CMP03/2007/THA。G5仅包含K-4/2012/CH一株。33 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析图3-12PKVVP1的系统进化树Fig.3-12PhylogenetictreeofPKVVP1gene34 山东农业大学硕士学位论文4讨论近年来，我国爆发了严重的仔猪腹泻，给养猪业造成了严重的经济损失。细菌、病毒、饲养条件和环境因素等都可能引起猪群腹泻。其中病毒作为主要病原体引起的猪病毒性腹泻具有发病急、传播快、感染面积大、死亡率高等特点，并且各个日龄段的猪群都可以感染。引起猪病毒性腹泻的病原体主要有猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒，同时其它病毒如肠病毒、猪腺病毒、星状病毒、杯状病毒、细小病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒的感染也会引起猪群不同程度的腹泻。另外，一些新病毒的出现也能导致猪群的腹泻，如2014年2月份美国爆发流行的猪德尔塔冠状病毒、2017年2月份在中国广东流行的猪阿尔法冠状病毒等。还有一些疑似与猪腹泻有关的病毒也引起了科研学者们的普遍关注，如猪嵴病毒。2007年，匈牙利学者Reuter在猪粪中检测诺瓦克病毒（Norovirus）和札幌病毒（Sapovirus）时发现和报道了猪嵴病毒，并对其全基因组进行了测序（S-1/2007/HUN）。从那以后，世界多个国家相继报道了猪嵴病毒的检出，并且都呈现出较高的检出率。到目前为止，由于PKV并不能被成功分离培养，其是否致病、致病机制、传播途径等尚不清楚。目前对于PKV的研究多以流行病学调查和全基因组的序列分析为主。大量的流行病学调查研究证明，PKV在腹泻猪群中的检出率高于非腹泻猪群，Park等人报道在腹泻样品中检测到PKV单独感染，其他肠道病原菌和肠道病毒检测均为阴性，因此怀疑PKV可能在腹泻发生的过程中起到一定的作用，且临床样品检测结果经统计学处理后显示，腹泻样品PKV感染率与健康样品PKV感染率有显著差异性（Parketal.,2010），AlineF.Barry等人也有类似报道（Barryetal.,2011）。多数研究者也因此猜测，该病毒可能与猪的腹泻有关。但也有部分研究指出，该病毒在非腹泻猪群中的检出率高于腹泻猪群。PKV是否与猪的腹泻有关需要进一步的研究证明。4.1PKV的流行病学调查3D基因表达蛋白为病毒RNA依赖的RNA聚合酶，含有高度保守的氨基酸模体，可参与病毒RNA的复制过程。研究表明，PKV3D区较为稳定，可以作为检测的靶基因（张莎等,2013;Zhangetal.,2013）。因此，本研究根据PKV的3D区保守序列设计的一对引物，对2014年冬季至2018年春季的来自山东省济南、泰安、莱芜、德州等11个城市43所猪场的猪小肠内容物、肛门拭子以及粪便共计634份样品进行RT-PCR检测和统计，调查了PKV在山东省猪群中的流行情况。结果显示，在634份样品中检35 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析测到253份PKV阳性样品，阳性率为39.91%；样品分别来自于43个猪场，检测到PKV的猪场有31个，猪场阳性率为72.09%；数据显示，采集病料中PKV的检出率很高，说明PKV在山东省地区广泛流行，感染十分普遍。根据猪的发病情况，对PKV进行统计发现，腹泻猪个体阳性率为28.90%（63/218），猪场阳性率为70.97%（22/31），而非腹泻猪个体阳性率为45.67%（190/416），猪场阳性率为75.00%（9/12）。未发生腹泻猪群的PKV检出率远高于发生腹泻的猪群，虽然这一结果与大多数研究的数据不同，但非腹泻猪PKV检出率高于腹泻猪的结果已有过报道。本研究表明山东省范围内猪嵴病毒感染与猪腹泻之间无必然联系，猪嵴病毒在猪腹泻的爆发中可能并不是起主导作用的病原体，在猪的体内多呈隐性感染。但过高的携带率应当引起人们的警惕：猪嵴病毒与猪腹泻之间的关系现在仍未确定，猪嵴病毒是否会在一定条件的作用下单独引起发病、是否与PEDV、TGEV、RV等病原体相互作用协同发病、是否会引起胃肠疾病或者其他疾病等问题仍需要进一步的研究和探索。通过对采集样品的猪群不同的生长阶段统计可以看出，成年猪的PKV阳性率为67.74%远高于哺乳仔猪、断奶猪群以及育肥猪的48.31%、34.78%和27.75%。以往的研究报道中，哺乳仔猪的PKV感染率最高，而在本次统计中成年猪的PKV阳性率超过了哺乳仔猪，但哺乳仔猪中也有近半数的样品呈现PKV阳性。虽然不曾有过猪嵴病毒是否能够垂直传播的报道，但成年猪的PKV高携带率很有可能通过母婴、母乳、接触传播等方式将其传染给新生仔猪，而在猪流行性腹泻爆发的过程中，发病仔猪的死亡率高达100%，这其中除了PEDV、TGEV和RV的致病作用之外，PKV是否发挥了协同作用需要进一步的研究和探讨，在仔猪群体中如此高的PKV检出率需要科研人员的严谨对待。病毒引起的猪腹泻主要在冬春季节爆发和流行，对此，我们根据采样时间对病料的PKV阳性率进行统计，统计结果表明，山东省猪群中PKV的携带率具有明显季节差异，夏秋季节猪的个体阳性率（53.42%）明显高于冬春季节（32.77%），这与猪流行性腹泻的爆发季节正好相反，这也进一步说明了猪嵴病毒在猪腹泻中可能并不是起主导作用的病原体。当前，养猪生产发展中存在的出栏率低、胴体重低、瘦肉率低、猪与粮食比价不合理，严重制约着养殖业规模化和集约化的发展。我国地方猪种的特点是繁殖力和抗逆性强，肉质较好，性情温驯，能大量利用青粗饲料，但生长缓慢，屠宰率偏低，瘦36 山东农业大学硕士学位论文肉率少。而三元杂种猪具有生长快、饲料利用率高、瘦肉率高、经济效益明显等特点，适宜大力推广。三元猪有内三元猪和外三元猪。内三元杂种猪主要是以我国地方品种猪为母本，与引进的国外肉用型品种猪为父本的杂交一代猪作母本，再与引进的国外肉用型品种猪作终端父本杂交而产生。外三元杂种猪则全部选用外来品种杂交而成。山东省养殖猪的品种类型主要以外三元为主。根据不同品种类型的PKV检测结果可以看出，外三元猪的PKV阳性率为33.73%（140/415），内三元猪的阳性率为21.25%（17/80），而本研究所采集的地方品种的样品主要是莱芜黑猪和鲁莱黑猪，其PKV阳性高达69.09%（96/139），这可能是由于其养殖环境比较封闭，PKV在其品种内部相互感染。而外三元猪的PKV检出率高于内三元，间接说明本地猪PKV携带率较低，而引进的国外品种是否携带PKV并将其传播到本地，需要进一步的数据证明和研究，但结合PKVVP1系统进化树，本研究分离的11个VP1序列所处的G1群组中也包含了泰国毒株CMP17/2007/THA和美国毒株OH/RV50/2011/US，这一假设是可能存在的。在引起猪腹泻的病毒性病原体中，PEDV、TGEV和RV起主要作用，另外已被证实的新病毒PDCoV和PEAV也能引起猪腹泻，因此本研究在检测PKV的同时，对这几种病毒也进行了检测。其中，PEDV和TGEV在腹泻猪群样品中检出率较高，分别为31.65%（69/218）和10.09%（22/218），而在非腹泻猪群样品找那个检出率较低，分别为3.37%（14/416）和1.44%（6/416），说明PEDV和TGEV在引起猪腹泻中仍是主要因素；RV在腹泻猪群样品中没有检出，而仅在非腹泻猪群样品中检出7份，RV作为同样能够引起猪腹泻的主要因素之一，在近年来采集的病料中检出率较低，并且在腹泻猪群样品中没有检出，可能是由于其毒力降低或者疫苗作用相对PEDV和TGEV明显的缘故；而作为新发现并证实可以导致猪腹泻的病毒，PEAV没有检出，PDCoV仅在非腹泻猪群中检出6份，值得注意的是，检出PDCoV的这6份样品均来自于2017年冬季所采取的病料，可能是由于这两种病毒在山东省内尚未流行，而PDCoV在近期内被检出，可能在未来的几年作为山东省猪群发生流行性腹泻的又一重要因素出现，需提早加以防范。我们对PKV与PEDV、TGEV的混合感染情况进行了统计分析。由统计可知，虽然PKV在非腹泻猪群中单独感染率（43.75%，182/416）远高于腹泻猪群（15.60%，34/218），但非腹泻猪群PKV与PEDV和TGEV的混合感染率却明显低于腹泻猪群。由于PEDV和TGEV等病毒是引起猪腹泻的主要和常见原因，并且在本研究中病料样品中PEDV和TGEV的检测结果显示PEDV和TGEV在腹泻猪群样品中的检出率明显37 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析高于非腹泻猪群，因此不能确定PKV在引起猪腹泻的过程是否发挥作用，推测PKV可能在猪腹泻的过程中作为协同病原发挥作用，而一般情况下并不具备单独感染导致猪腹泻的能力，亦或PKV与猪腹泻无必然关联，需要进一步的研究和证明。总之，PKV在山东省猪群中检出率很高，流行十分普遍。由于到目前为止，PKV不能被成功培养，尝试将该病毒接种于Vero、CHO、Marc-145、PK-15、BHK-21等细胞系中，没有观察到明显的细胞病变，因此感染实验不能进行，对PKV的病理生理学、临床症状和致病机理等仍不清楚，因此PKV在引起猪腹泻的过程是否发挥作用目前尚不能定论。对于PKV的研究，目前的首要任务是找到能够适合PKV培养的易感细胞系和培养方法，在此基础上探究PKV的致病机理和作用机制，从而确定PKV在猪腹泻过程中的作用，及时对该病毒可能造成的危害采取防范措施，降低损失。4.2PKVVP1基因序列分析VP1基因编码的VP1蛋白可刺激宿主并促使机体产生中和抗体，是衣壳蛋白中的主要免疫蛋白，裸露于病毒颗粒的表面。陈蕾等曾对一株猪嵴病毒CHN-2012a（序列号JX294863）的VP1基因进行生物学分析，结果表明，VP1蛋白属于稳定蛋白，不稳定系数35.93，属信号肽，无跨膜，具有氨基酸选择偏向性（陈蕾等，2012）。先前对于爱知病毒的VP1序列的研究证明，VP1区是衣壳基因中变异最大的区域（Phametal.,2008），对于PKVVP1的研究也表明该基因的高度变异，因此VP1基因成为研究PKV的重要对象。对于微小核糖核酸病毒来说，VP1蛋白是重要的中和位点，很多微小核糖核酸病毒科的病毒都是根据VP1基因来确定病毒的血清型和基因型。爱知病毒仅有一个血清型，PKV可能和爱知病毒不一样，但由于PKV至今仍没有在体外成功培养，而且VP1基因的序列来源主要集中于日本、泰国、匈牙利和中国，数量有限，因此根据VP1基因对PKV血清型和基因型的确定需要进一步的研究，VP1基因核苷酸突变以及氨基酸的改变对病毒生物学特性的意义也不能确定。爱知病毒是根据3C/3D区部分序列分为A、B和C三种基因型（Yamashitaetal.,2000;Ambertetal.,2008），对于PKV来说，用VP1基因还是用3C/3D基因，或者其他基因区域来确定基因型，都需要对这些基因区域更多的分子生物学方面的研究。本研究通过对VP1两端的序列进行比对，设计了一对包含VP1基因的引物，将其扩增出来，并送往测序。将测序结果通过Blast比对，证明所扩增的片段是PKV中的目的片段，特异性良好。利用DNAStar软件，通过比对GenBank中的参考毒株，在所扩增的片段中定位VP1基因位置，最终得到11个长度为762-765bp的VP1基因序列。38 山东农业大学硕士学位论文通过与参考毒株比对发现，所扩增的11个PKVVP1序列中存在713-715bp之间3nt的插入，另外Liaocheng/160112在727-729bp之间还存在3nt的缺失，因此导致其长度有所不同。将所分离的11个VP1序列与参考毒株进行同源性分析，分析结果显示，分离的11个VP1序列之间的同源性在79.3-100%之间，其中，Ji’nan/Jiyang/171226与Tai’an/171222两条序列的同源性为100%，很可能是同一株病毒；与此同时，Dezhou/151121、Ji’nan/Jiyang/171226和Tai’an/171222、Ji’nan/Jiyang/171226、Laiwu/151111之间的同源性均在95%以上，说明这几株PKV很有可能是由某一株病毒演化而来。本研究的11个VP1序列与参考毒株的同源性在78.0-88.6%之间，氨基酸同源性在79.9-97.6%之间，说明所分离的VP1核苷酸序列与参考毒株之间存在着较大的变异，但由于同义翻译，推导氨基酸同源性仍然较高。根据PKVVP1的系统进化树，可以将其分为5个基因型，即G1-G5。本实验所分离的11个VP1序列全部在G1中。将G1划分为两个基因亚型：Ji’nan/Jiyang/171226、Tai’an/171222、Laiwu/151111、Dezhou/151121、Ji’nan/Zhangqiu/171205同存在于G1-I亚型中，并处于同一分支，与中国毒株DX/2012/CH相近；Liaocheng/160112、Ji’ning/151115、Weifang/151103、Ji’nan/Zhangqiu/180201、Laiwu/161025、Tai’an/180125同存在于G1-II亚型中，Liaocheng/160112单独处于一个分支，Ji’ning/151115、Weifang/151103、Ji’nan/Zhangqiu/180201、Laiwu/161025、Tai’an/180125处于同一分支中，与中国毒株JS-01/2013/CH相近。分析其原因，山东省内流行的PKV毒株可能是由一株或几株毒变异演化而来的。G1中除了美国毒株OH/RV50/2011/US和泰国毒株CMP18/2007/THA外，其余均是中国毒株。而首次发现并报道PKV的匈牙利毒株均处于G3中，同时还包括了来自日本的三株参考毒。这说明PKVVP1序列的遗传和变异具有一定的地域性。39 山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析5结论5.1对来自山东省11个城市43所猪场共计634份样品进行PKV检测结果显示，PKV阳性率为39.91%，其中非腹泻猪个体阳性率（45.67%）高于腹泻猪个体阳性率（28.90%）；成年猪的PKV阳性率（67.74%）远高于哺乳仔猪、断奶猪群以及育肥猪的48.31%、34.78%和27.75%；夏秋季节的阳性率（53.42%）明显高于冬春季节（32.77%）；地方品种的阳性率（69.06%）明显高于外三元和内三元的33.73%和21.25%；PKV在非腹泻猪群中单独感染率（43.75%）远高于腹泻猪群（15.60%），而非腹泻猪群PKV与PEDV和TGEV的混合感染率却明显低于腹泻猪群。PKV与山东省猪腹泻无必然联系，在猪腹泻的过程中并不是主导因素。5.2本研究将所分离的11个PKVVP1序列之间的同源性在79.3-100%，与参考毒株的同源性在78.0-88.6%之间，氨基酸同源性在79.9-97.6%之间，说明所分离的VP1核苷酸序列与参考毒株之间存在着较大的变异。5.3VP1基因系统进化树分析表明，本研究所分离的11株PKV与25株PKV参考毒可分为5个基因型（G1-G5），本研究所分离的11个VP1序列全部在G1中，表明PKVVP1序列的遗传和变异具有一定的地域性。40 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山东省猪嵴病毒的流行病学调查及其VP1基因的遗传分析致谢本研究是在导师姜世金教授的悉心指导下完成的。由衷感谢我的导师姜世金教授，感谢导师三年来对我的教导、宽容和照顾。姜老师不仅在学术研究中给予我莫大的支持和帮助，开拓我的研究思路，培养我的科学精神和钻研能力，更在为人处世方面对我产生深刻的影响，教会我很多道理。学习中，老师言传身教、认真负责、治学严谨；生活中，老师豁达宽广、正直诚实、以身作则。每当我遇到困难时，导师总能够为我伸出援手，循循善诱，引导我积极解决问题，克服困难，走向成功。施恩厚重，无以为报，唯有铭记在心，不忘初心，砥砺前行。在攻读硕士期间，感谢实验室的陈君豪师兄和张瑞华师姐的耐心指导和示范，感谢林少莉师姐、蓝晶晶师姐、刘凤芝师姐、丛日超师兄、李海娥师姐、高沙沙师姐、郭程程师姐、田野师兄、刘海源师兄、宫艳杉师姐、张琳师姐、李鹏飞、宋莎莎、李金丽、刘兆路，以及师弟师妹薛文湘、王敬渝、杨晓雪、孙大鹏、宋楠楠、连彩余、杨育鹏、李汉卿、仝帅、徐菲等人在科研学习中提供的实验指导和宝贵建议，在生活中的支持和帮助，使我的课题顺利完成。同时也感谢各位同学和朋友们对我的关心和帮助。在攻读硕士期间，还得到了动科院的各位领导和预防兽医学系的崔治中教授、赵孝民教授、谢之景教授、柴同杰教授、朱瑞良教授、刁有祥教授、常维山教授、崔言顺教授、孙淑红教授、胡敬东副教授、柴家前副教授等老师们和泰山医学院王玉老师的指导和帮助，在此一并表示感谢！特别感谢我的父母和家人，感谢多年以来对我的理解、支持和鼓励。感谢我的女朋友刘洋洋，在我心情低落的时候给我鼓励和安慰，给予我继续前行的动力。最后，衷心感谢所有曾审阅过我的毕业论文的审稿人对我论文所提出的宝贵意见。52 山东农业大学硕士学位论文攻读硕士学位期间发表论文情况[1]王玮,刘海源,李鹏飞,宋莎莎,张瑞华,陈君豪,蓝晶晶,谢之景,姜世金*.2014年至2016年山东省猪嵴病毒流行病学调查[J].中国预防兽医学报，已录用.[2]LiP,LiJ,ZhangR,ChenJ,WangW,LanJ,XieZ,JiangS*.Duck“beakatrophyanddwarfismsyndrome”diseasecomplex:Interplayofnovelgooseparvovirus-relatedvirusandduckcircovirus?TransboundaryandEmergingDiseases,2018,65:345–351.[3]李鹏飞，张瑞华，宋莎莎，王玮，陈君豪，蓝晶晶，谢之景，姜世金*.鸭源新型鹅细小病毒核酸探针的制备与应用.中国兽医学报，已录用53