持久性毒物对几种海洋生物的毒性效应

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分类号密级UDC编号硕士学位论文持久性毒物对几种海洋生物的毒性效应夏重大（1112014）指导教师姓名王媛专业名称水生生物学论文答辩日期2014年5月29日学位授予日期2014年6月 ThesisfortheDegreeofMasterToxicityeffectpersistenttoxiconseveralkindsofMarinelifeSupervisor：WangYuanMastercandidate：XiazhongdaCOLLEGEOFFISHERISEANDLIFESCIENCE,DALIANOCEANUNIVERSITY,DALIAN,LIAONING,P．R．CHINAAPRIL2014 摘要海洋对人类现代经济的发展和满足人们的福利需要方面正在起着越来越大的作用,近年来在世界范围内兴起的海洋开发热潮也日益高涨。与此同时也带来了海洋环境的污染问题,因此,开发海洋就必须保护海洋。有鉴于此，为了针对近些年海洋中持久性毒物对海洋生物的毒害,通过辛硫磷、高效氟氯氰菊酯以及有机锡（TBT、TPT）对海参、扇贝及几种海洋微藻的毒性作用，叙述了这几种持久性毒性物质对海洋生物的毒性效应；以及在生态监测方面作为生物标志物的作用。本文选取了扇贝、刺参、盐藻、金藻等海洋生物为研究对象，采用实验生态学和生物化学的检测方法，从个体及生理生化水平上较系统地研究了持久性毒性物质对海洋生物的毒性效应。主要研究内容与结果如下：1.辛硫磷对三种扇贝均具较高的毒性,其毒性随辛硫磷浓度及作用时间的增大而呈逐渐上升的趋势。栉孔扇贝、虾夷扇贝、海湾扇贝在96h的LC50分别为18.662μg/L、4.916μg/L、5.65μg/L。辛硫磷对三种扇贝幼贝的毒性大小顺序为：海湾扇贝>虾夷扇贝>栉孔扇贝。揭示了海湾扇贝幼贝可应用于海洋中若干环境污染物的生态监测。2.高效氟氯氰菊酯对刺参具较高的毒性,其毒性随高效氟氯氰菊酯浓度及作用时间的增大而呈逐渐上升的趋势。根据Bliss法，得出在24h、48h、72h、96h时的LC50分别为：20.850μg/L、16.084μg/L、7.786μg/L、5.014μg/L。揭示了刺参幼参的急性毒性实验具灵敏度高、指标明确、方法简便、取材方便、实验周期短等优点,可应用于海洋中若干环境污染物的生态监测。3.TBT和TPT胁迫会对盐藻的生长产生明显的影响，盐藻生长明显缓慢。有机锡对盐藻蛋白质含量和MDA含量具有极显著的影响；对叶绿素含量具有显著影响，故盐藻脂质过氧化(以丙二醛MDA量表示)可以作为监测海洋有机锡污染的生物标志物。2+2+4.Cd、Pb的毒性作用，导致湛江等鞭金藻的可溶性蛋白含量降低。抗氧化酶活性的降低和氧化还原状态的改变是重金属导致藻类死亡的重要原因，湛江等边金藻的脂质过氧化(MDA)可以作为监测海洋有机锡污染的生物标志物。结论：1.持久性毒物对海洋生物的毒性作用具有量效和时效关系；海洋生物对有机锡的毒性十分敏感，辛硫磷对三种扇贝均为剧毒作用，可见虾夷扇贝对辛硫磷最敏感。说明扇贝可以作为辛硫磷污染的指示生物。并且可知栉孔扇贝的LC50＞虾夷扇贝LC50＞海湾扇贝LC50。2．持久性毒物导致的海洋生物死亡过程是一个氧胁迫过程；抗氧化酶活性的降低和氧化还原状态的改变是有机锡导致海洋生物死亡的重要原因。3.TBT和TPT对盐藻蛋白质含量和MDA含量皆具有极显著的影响；对叶绿素含量具有显著影响。2+2+4.Pb对湛江等边金藻的MDA和GSH有显著影响；Cd对湛江等边金藻细胞内可溶性蛋白质和SOD活力有显著影响。关键词:急性毒性,持久性毒物,扇贝,刺参,微藻I AbstractOceanofhumanmoderneconomicdevelopmentandmeettheneedsofthepeople'swelfareaspectsisplayingamoreandmoreimportantrole,inrecentyearsworldwideriseofoceandevelopmentboomisalsogrowing.AtthesametimealsobroughttheMarineenvironmentpollutionproblem,therefore,thedevelopmentofMarinemustprotecttheocean.Persistencetoinrecentyears,becauseofthis,theoceanharmfulmaterialtotheMarinebiologicalpoison,throughphoxim,effectivechlorinefluorinewithesterandTBTandTPTinseacucumber,scallopandtoxiceffectsofseveralkindsofalgae,describestheseveralpersistenceharmfulsubstancesontheMarinebiologicaltoxicityeffect;Andastheroleofbiomarkersintermsofecologicalmonitoring.Biologicalselectionexperimentsforcommontypes,fromtheindividualdevelopmentandsystematicallystudiedthephysiologicalandbiochemicallevelpersistencepestsonMarinebiologicaltoxicityeffect.Themainresearchcontentsandresultsareasfollows:1.Phoximinthreekindsofscallopsarehighertoxicity,toxicityalongwiththeincreaseofconcentrationofphoximandactiontimeandgraduallyrisingtrend.ZhiKongscallops,shrimpscallops,bayscallopsin96hLC50were18.662mug/L,4.916mug/L,5.65mug/L.Phoximonthetoxicityofthreekindsofscallopschildishshellsizeorder:bayscallop>shrimpyiscallops>ZhiKongscallops.RevealsthehalfbayscallopshellcanbeusedinsomeMarineecologicalmonitoringofenvironmentalpollutants.2.Effectivechloricfluorinewithesterontrepanghightoxicity,toxicitywithesterwithhighchlorinefluorineconcentrationandactiontimeincreasesgraduallyrisingtrend.AccordingtothemethodofBliss,itisconcludedthatwithin24h,48h,72h,96hLC50are:20.850mug/L,16.084mug/L,7.786mumu,5.014g/Lg/L.Revealsthetrepangyoungandindexofacutetoxicityexperimentwithhighsensitivity,clear,simplemethod,conveniently,andtheadvantagesofshortexperimentperiod,canbeusedinsomeMarineecologicalmonitoringofenvironmentalpollutants.3.TheTBTandTPTstresscanproducesignificanteffecttosaltthegrowthofalgae,saltalgaegrowsmoreslowly.OrganictinsaltalgaproteincontentandMDAcontenthasasignificantimpact;Hasasignificantinfluenceonchlorophyllcontent,thesaltalgalipidperoxidation(expressedinmalondialdehydeMDAcontent)canbeusedasbiomarkersofmonitoringMarineorganotinpollution.4.ThetoxiceffectsofCd2+,Pb2+,inzhanjiangandotherwhipchrysophytesolubleproteincontentreduced.TheactivityofantioxidantenzymesandREDOXstatechangeisheavymetalleadtoalgaeoftheimportantcausesofdeath,lipidperoxide(MDA)inzhanjiangequilateralchrysophytebiomarkerscanbeusedasamonitoringMarineorganotinpollution.Conclusion:1.ThepersistenceofharmfulsubstancestothetoxiceffectsofMarinebiologicaleffectsandaging;Marinelifeisverysensitivetothetoxicityoforganictin,phoximeffectonthreekindsofscallopsarehighlyII toxic,visibleshrimpscallopsissensitivetophoximmost.Explainscallopscanserveasindicatorsofphoximpollution.AndknowableZhiKongscallopsLC50>shrimpyiscallopsLC50>bayscallopLC50.2.ThepersistenceofharmfulsubstancesledtothedeathsoftheMarinebiologicalprocessisaprocessofoxygenstress;TheactivityofantioxidantenzymesandREDOXstatechangeisorganictinleadtoMarinelifeoftheimportantcausesofdeath,saltalgaproteinandlipidperoxidation(MDA)canbeusedasamonitoringMarineorganotinpollutionbiomarkers.Keywords：acutetoxicity,Persistentpersistenttoxic,scallops,trepang,microalgaeIII 摘要.....................................................................................................................................................I1前言................................................................................................................................................52辛硫磷对三种扇贝的急性毒性效应..........................................................................................122.1材料与方法.............................................................................................................................122.1.1实验器材............................................................................................................................122.1.2实验试剂.............................................................................................................................122.1.3实验方法............................................................................................................................132.1.4数据处理与分析................................................................................................................132.2实验结果.................................................................................................................................132.2.1实验动物的中毒症状........................................................................................................132.2.2辛硫磷对三种扇贝幼贝的急性毒性................................................................................142.2.3辛硫磷对三种扇贝幼贝的急性毒性实验结果比较.........................................................172.3讨论..........................................................................................................................................173高效氟氯氰菊酯对刺参的毒性效应..........................................................................................183.1材料与方法.............................................................................................................................193.1.1实验器材.............................................................................................................................193.1.2实验试剂.............................................................................................................................193.1.3实验方法............................................................................................................................193.1.4数据处理与分析.................................................................................................................203.2实验结果..................................................................................................................................203.2.1实验动物的中毒症状........................................................................................................203.2.2高效氟氯氰菊酯对刺参幼参的急性毒性实验结果........................................................203.2.3高效氟氯氰菊酯对刺参幼参的LC50计算.....................................................................213.3结论和讨论.............................................................................................................................214有机锡对盐藻理生化指标的影响..............................................................................................234.1材料与方法.............................................................................................................................244.1.2实验材料.............................................................................................................................244.1.3实验设备.............................................................................................................................244.2实验结果..................................................................................................................................274.2.1有机锡对盐藻生长的影响.................................................................................................274.2.2有机锡对盐藻蛋白质含量的影响.....................................................................................284.2.3有机锡胁迫对盐藻叶绿素含量的影响.............................................................................304.3结论和讨论..............................................................................................................................305重金属对湛江等鞭金藻的生理生化指标的影响......................................................................325.1材料与方法.............................................................................................................................335.2数据处理与分析......................................................................................................................375.3实验结果..................................................................................................................................375.4结论和讨论:.............................................................................................................................44参考文献：......................................................................................................................................46攻读硕士学位参与的研究项目与发表的论文..............................................47致谢.............................................................................................................48学位论文版权使用授权书.............................................................................50独创性说明......................................................................................................514 1前言海洋是人们自古依赖之场所，人类从海洋不断汲取所需之物，但海洋也是人类所产生的污染物主要的最终“收集所”。并且每年人工化合物以万记的速度在递增，这些产物的最后流向无疑[1]还是海洋。海洋污染半个世纪前开始出现,当时是以研究向海洋中倾倒放射性废物为起点。目前对于海洋污染的定义可以描述为人类直接或间接地把一些物质或能量引入海洋环境(包括河口),以至于产生损害生物资源、危及人类健康、妨碍包括渔业活动在内的各种海洋活动、破坏[2,3]海水的使用素质和舒适程度的有害影响。近年来，社会工业化步伐加快，经济迅速发展，与此同时大量环境污染物也随之产生，这些污染物经过各种渠道经地表渗透到土壤及水体中，破坏了水体原有的生存环境，对水生生物产生了极大的危害，因此有关环境污染物的防治以及处理已经引起了社会各界的广泛重视。一些化学物,如滴滴涕、多氯联苯、二口恶英等能够抵抗光分解、化学分解和生物降解作用,通过大气、淡水和海洋的流动发生远距离乃至全球范围的扩散转移,[4]表现为持久而广泛地分布于自然界中。实验表明,大多数此类物质具有高疏水性特征并且能够在生物体内形成生物富集,干扰机体内分泌系统的功能,影响体内激素的合成、释放、转运、代谢及结合等过程,干扰血浆中正常激素水平的维持,对机体的生殖发育障碍、肿瘤发生、神经系统、免疫系统等多方面产生影响;而且,此类物质可通过食物链产生生物放大效应。由于其具有持[5]久性、毒性等特征而被称之为持久性毒物(Persistenttoxicsubstance,PTS)。这是一类具有很强毒性,在环境中难以降解,并可通过食物链在动物和人体中富集和放大的污染物。如持久性有机污染物(Persistentorganicpollutants,POPs)和重金属等进入环境后,随大气沉降、降雨和地表径流等迁移并最终进入海洋环境。海洋持久性有害污染物会对海洋生物生化代谢产生影响；会对海洋生物生理行为产生影响；会对海洋生物生长繁殖长生影响；会对海产品实用价值产生影响；甚至会使大批海洋生物逃离或死亡。我国近海中一些持久性毒物含量严重超标（远远高于西方国家规定残留标准），污染严重。目前不只是水生生物受到持久性毒物污染，处于食物链最高营养级的鸟体内也发现了高浓度的持[6]久性毒物污染物。此外，海洋中易受到持久性毒物污染的软体动物(如牡蛎、贻贝、扇贝等)以及鱼（如鲑鱼、鲈鱼、鲤科鱼类等）都通过商业活动供人类食用。持久性毒物在食物链中的富集[7]和传递对人体健康具有潜在的风险。研究海洋生物中持久性毒物的毒性和富集状况，对控制海[8]洋环境的持久性毒物污染和保护人体健康具有重要意义。1.1持久性毒物的分类及来源环境中天然存在的PTS微少,多数伴随食物和水进入机体并残留体内。但PTSs的种类和数量繁多,包括许多化学结构、来源以及用途不同的化学物。目前,由于对PTSs研究的程度和侧重方向,国际学术界产生了诸多分类方法。1.1.1据美国GLBTS(greatlakesbinationaltoxicsstrategy)2002年度报告资料，根据各种毒物在环境中出现的频率及对水生生物或人类产生毒性作用的强弱不同分为两级。第一级持久性毒物包5 括汞,PCBs,二口恶英,呋喃妥因,六氯苯,苯并芘,八氯苯乙烯,烷基铅,艾氏剂,狄氏剂,全氯五环癸烷,氯丹,毒气萜(一种人工合成的氯代烃类杀虫剂),DDT;第二级包括镉及含镉化合物,1,4 ‐ 二氯苯,异狄氏剂(杀虫剂),七氯(杀虫剂),环氧七氯,3,3’‐ 二氯联苯胺,二硝基芘,六氯丁二烯,4,4′‐ 甲烷双(2 ‐ 甲苯胺),五氯苯,四氯苯,六氯环己烷,二氯苯胺,五氯酚(防腐剂),三丁基锡,邻苯二甲酸酯类,蒽,苯并(a)蒽等。1.1.2据毒物的来源不同①人工合成类:用于医药的已烯雌酚、右环十四酮醇及类固酮、苯甲酸雌二醇);②农药类:如有机氯类、有机锡、含氯三嗪类除草剂等;③工业原料和化合物类:如金属镉及其化合物;④其他:如多氯联苯类、二口恶英类(二口恶英及其副产品)、多乙氧基烷基酚类、双酚A、邻苯二甲酸酯类、避孕药等。1.1.3根据化学性质及其对人类的生物学作用：分为持久性有机污染物、环境内分泌干扰化学物和拟雌激素等。持久性有机污染物（PersistentOrganicPollutants，POPs）指的是能持久存在于环境中、具有很长的半衰期、会通过生物食物链（网）累积、并对人类健康和环境具有严重危害的天然或人工合成的化学物质。它具备五种特性：大流动性、持久性、生物积累性、高毒性以及亲脂憎水性。并且可通过各种环境介质（大气、水、生物体等）进行长距离迁移。即所谓的蚱[9]蜢效应。环境雌激素作为一种能模拟和干扰动物及人类内分泌机能的物质,在我们的生活中无处不在,其与体内天然激素一样,极微量(微摩尔级或更低)就可以引起细胞功能的显著改变。环境雌激素也称为“外因性扰乱内分泌化学物质”，它不是生物体自身分泌的雌激素，是外界物质，进入生物体后，与生物体自身分泌的雌激素起相同的作用。它扰乱了生物体内雌激素的正常分泌，使生物体的生殖功能或免疫功能出现异常。根据来源不同，环境雌激素可以分为合成雌激素、生物源雌激素和环境化学污染物等。在自然界，环境雌激素的污染被认为是动物，特别是水生动物生[10]殖功能异常、雌雄同体率升高、性比例失调、生殖器官变异的重要原因。并且水生态系统是许多环境污染物的最终汇。持久性有机污染物在水中难降解，对水生生物尤其是高位营养级生物乃[11]至人类健康都将产生深远影响。并且许多报道表明，在河流、湖泊、污水处理口等均有雌激素的富集其中环境雌激素类化合物，其可通过与雌激素受体结合而影响生殖和发育甚至造成水生生物多样性群体水平的改变，类雌激素物质包括自然的和合成的类固醇激素以及众多的人工合成的化合物，其中17B一雌二醇和17a一羟基雌二醇在水中浓度低至几个ng/L就可诱导鱼类产生明[12]显的雌激素效应。而且低剂量环境污染物的联合作用可能使毒性增强。邻苯二甲酸酯可以进入人体，通过食物链富集和长期停留在体内，持续的破坏干扰机体内分泌系统，从而导致内分泌紊乱。这种影响不仅会危害当代，甚至还会威胁到子孙后代。Funabashi等研究人员发现邻苯二甲酸甲苯基丁酯能使明显升高成年雌性大鼠下丘脑视前区和腺垂体孕酮[13][14]受体mRNA表达，其作用与天然雌激素雌二醇类似，表明其具有雌激素活性。靳秋梅等通过实验发现DBP可促进雌激素依赖性乳腺癌MCF-7细胞的增殖，其增殖效应与天然雌激素相似，浓度从低到高均有促进MCF-7细胞生长和增殖的作用，但不同浓度邻苯二甲酸二丁酯的促进程度不同，一定浓度范围内表现出剂量一反应关系，推断DBP具有拟雌激素作用。1.1.4按急慢性毒性的分类：6 类别：急性毒性196hrLC50（鱼类）≤1mg/L；和/或48hrEC50(甲壳纲动物)≤1mg/L；和/或72or96hrEC50（海藻或其它水生植物）≤1mg/L。[15]类别：慢性毒性196hrLC50都是下标，都改正过来（鱼类）≤1mg/L；和/或48hrEC50(甲壳纲动物)≤1mg/L；和/或72or96hrEC50（海藻或其它水生植物）≤1mg/L且该物质不能迅速降解，和/或Kow对数≥4（除非经试验确定的BCF＜500）。类别：慢性毒性2:96hrLC50（鱼类）＞1-≤10mg/L；和/或48hrEC50(甲壳纲动物)＞1-≤10mg/L；和/或72or96hrEC50（海藻或其它水生植物）＞1-≤10mg/L且该物质不能迅速降解，和/或Kow对数≥4（除非经试验确定的BCF＜500），除非慢毒性NOECs＞1mg/L。类别：慢性毒性296hrLC50（鱼类）＞1-≤10mg/L；和/或48hrEC50(甲壳纲动物)＞1-≤10mg/L；和/或72or96hrEC50（海藻或其它水生植物＞1-≤10mg/L且该物质不能迅速降解，和/或Kow对数≥4（除非经试[16][17]验确定的BCF＜500），除非慢毒性NOECs＞1mg/L。1.2持久性毒物对动物和人类的毒性效应大部分持久性毒物具有脂溶性和半减期较的特点,能够在生物体内形成蓄积,产生生物富集与生物放大效应。早在上世纪30年代,Dodds等就发现二羟联苯的雌激素效应,但直到近几年,[18]国外科学家才开始进行动物及人群的相关研究。其研究主要集中在三个方面:①持久性毒物的评价;②持久性毒物暴露的动物和人群流行病学研究;③持久性毒物作用机制的研究。其中,PTS与动物和人类生殖、发育、神经内分泌及免疫系统疾病相关关系是当前关注的焦点。从整体动物、细胞及分子(蛋白质、基因)水平探索PTS对人类健康的损害途径、特征和机理对认识和甄别PTS、预防控制PTS对人类的危害具有重要的意义。PTS的种类繁多,结构各不相近,对人群的不良健康效应的发生有多种途径。尽管其在生殖发育障碍、肿瘤发生、神经系统及免疫系统等多方面的作用机制尚不十分明确,但诸多实验室工作在证明其生物学效应和机制方面已提供了大量参考依据。1.2.1持久性毒物的急慢性毒性研究海洋中DBP污染是邻苯二甲酸酯类物质中污染最严重的污染之一。在海上航行的轮船船体和建筑的塑料和其他材料中加入DBP，杀死附着在船只上的真菌、藻类和软体动物，以及沿海工业工厂的污水废物排放，是海洋环境中DBP的主要来源。除此之外，入海的陆地排污河和海边的污水处理设施(特别是造船厂废水的排放)也是沿海DBP污染的重要来源。有机锡化合物可对海洋生态系统造成严重的危害，以至于会带来不可逆转的破坏。水环境中TPT和TBT对水生生物具有很大毒性，浓度在微克级别时即能对敏感水生生物产生负影响，例如，TBT对最敏感的无脊椎动物[19](Eurytemoraffinis)的72h的EC50为0.6g.L-1，最敏感的鱼(Menidiaberyllina)的72h的EC50-1[20]-9-1-9-1为4.6g.L。TPTC对糠虾的半致死浓度为25×10g.L(24hLC50)和15×10g.L(48h7 [21]LC50)。Strmac将刚刚受精的斑马鱼卵暴露于TPT醋酸酯中96h，然后连续观察对胚胎和籽鱼在-1死亡率和致畸方面的影响以及肝脏的组织学和细胞学变化，结果发现在TPT浓度大于0.5g.L时-1[22]斑马鱼卵孵化延迟，浓度大于25g.L时死亡率上升。1.2.2持久性毒物的生殖毒性研究[23]大量动物流行病学研究结果显示,部分持久性毒物有拟雌激素作用,干扰体内雌激素的正常分泌,使生殖功能失常;并且通过生态学研究,在性功能异常发生频繁的野生动物栖息地同时发现PTS的高水平存在,亦支持其拟雌激素作用。野生动物生殖功能的变化主要包括雄性动物雌性化、生殖能力低下、孵化率低下、幼崽成活率下降、性激素分泌及活性下降、生殖行为异常[24]等。如果生物在发育初期暴露在化学物质下就可能出现生殖器异常,这可能是由于化学物质的雌性激素样作用影响了生殖器官的形态发育。[25]PTS的内分泌干扰功能不仅体现在雌激素上,在甲状腺素、儿茶酚胺、睾酮方面也具有显著干扰效应。Fox等6在对位于美国和加拿大的北美五大湖地区进行的生态环境监测中发现,该地区PCBs的浓度显著高于其他地区,继而进行的生态流行病学调查发现五大湖地区的底特律河、西部伊利湖、安大略湖的成年海鸥与十几年前本区的成年海鸥相比,甲状腺有较为明显的增大,[26]同时也与其他地区成年海鸥的甲状腺大小差异有显著性,而且,肝脏储存的视黄醇酯显著降低。这些研究结果对确定PTS是否存在广泛的内分泌干扰效应具有重大意义。邻苯二甲酸酯是一种特殊的酯类化合物，具有酯类的性质，也可以发生被碱或酸所促进的水解反应。DEHP作为其中的一员除主要被用作增塑剂以外还可以用于作为氯乙烯原料。目前，已有国内的外许多学者开展了邻苯二甲酸酯类化合物在食品、工业废水、土壤等物质的含量分析，以及对哺乳动物和水生[27]动物物等标准毒性试验动物的毒性研究。英国最近的研究表明，DHP和DEHP均能引起动物精子的密度、形态和活力的异常。有机锡是一类环境内分泌干扰物质，它能影响生物的生殖功能，干扰体内激素的分泌造成生[28]殖和遗传的不良后果。Inoue等报道了TBT对菲律宾蛤胚胎发育的毒性效应，发现TBT的浓度与蛤仔的发育成功率呈现明显的负相关。将受精后四小时的蛤仔受精卵暴露于对照，0.062，0.140，-10.320和0.640μg.L的不同浓度的TBT溶液中23h，发现胚胎的发育成功率也明显的低于对照组。GrzybK29等发现青鱼精子暴露TBT溶液6h后，5M浓度下,精子35%失去活力,而染毒TBT10M溶液中的精子超过90%失去活力.有机锡还会引起海洋生物的性畸变，致使其性别比例失调，出现[30][31]-1雄多雌少的情况，威胁到它们的族群生存。Waldock等在20世纪80年代时就发现在2ng.L的三丁基锡(TBT)就会干扰牡蛎(Crassostreagigas)的钙代谢和诱导织纹螺(Nucella[32]lapilus)发生性畸变。Horiguchi等用三丁基锡、二丁基锡、一丁基锡、三苯基锡、二苯基锡和一苯基锡对疣荔枝螺进行注射实验，发现三丁基锡和三苯基锡对引起性畸变有显著作用。[33]-1-1McAllister等发现新出生的斑马鱼暴露于0.1ng.L的TBT70d后，雄性的数目偏多，在10ng.L[34]浓度时，产生的所有精子都缺少鞭毛。Bryan的野外实验表明，狗岩螺成体在三丁基锡浓度为-7-110ngSn.L的环境中12个月后发生性畸变。[35]另有研究发现,在检测小鼠睾丸细胞DNA损伤的单细胞凝胶电泳试验中烷基酚类化合物8 对其睾丸细胞DNA有明显损伤。1.2.3持久性毒物的三致（致癌、致畸、致突变）毒性研究1982年美国国家毒理规划署的实验报告证实：小白鼠和大白鼠通过饮食长期吸收DEHP后，会引起肝癌，而同一时间DEHP的代谢单体邻苯二甲酸单乙基己基酯也可能导致睾丸间质细胞肿瘤。用大量邻苯二甲酸酯喂养啮齿类动物，发现这一些动物的肝脏和睾丸受到一定程度的损伤，且在最初的啮齿类动物研究也表明了肝致癌性，依据此结果，邻苯二甲酸酯类被IARC（国际癌症研究[36]机构）、EC和WHO列为可能的致癌物。1.2.4持久性毒物的神经和免疫毒性研究Kodavanti、Tilson等研究发现,PCBs对啮齿类动物的胎毒性剂量为20-26mg·kg-1-1-2-1-1·d;导致神经行为发育异常的暴露剂量为0.2mg·kg·d;低于此100倍的剂量就可致猴子出现神经行为异常。Yang等的研究也表明,蛋白激酶C(PKC)同工酶在小脑和海马细胞上的分布模式受发育过程中PCBs暴露的影响,不同PKC同工酶以及不同发育阶段呈特异性表现。有鉴于PKC信号传导系统对运动行为、学习记忆起重要作用,故认为PCBs介导的神经毒性可能通过改变脑发育关键时期PKC同工酶的亚细胞分布而发挥作用,PKC2α、β、γ可能是PCBs介导神经[37]毒性的靶分子。TBT和DBT对鱼类和哺乳动物的免疫能力具有抑制作用，这些化合物在动物体内富集会影响体[38][39]内吞噬细胞的活性，破坏动物的免疫能力。Tryphonas等研究发现TBT使大鼠自然杀伤细胞、T淋巴细胞和血清IgM、IgG水平均发生变化，同时观察到胸腺萎缩，表明其对体液和细胞免疫的[40]一些方面产生了影响，也对参与主体免疫监视的一些细胞产生了影响。Whalen等发现短期暴露[41]于TPT会造成人类自然杀伤细胞(NK)的细胞毒功能的不可逆抑制。唐小江等报道TMT对免疫系统亦具有毒性作用，将大鼠用TMT处理后2天，可见胸腺、脾重量下降，淋巴结减少。1.3持久性毒物对水生生物的毒性作用研究进展有机化合物和重金属等有毒物质在海域中累积，并通过海洋生物的富集作用，对海洋动物和以此为食的其他动物造成毒害。我国近海面积约37万平方公里，近年来随着海洋资源开发利用力[42]度不断加大，污染程度日益加剧。据不完全统计：我国海水三类水质以上占近岸海域面积约5.68%，一类水质仅为14.7%，近海海域受有机污染的程度正逐年加重，人工合成的有毒有机物质在近岸海水、沉积物和海洋生物体内普遍检出。环境专家指出，随着沿海经济的发展，污染物排海量近期内不会有明显减少，特别是新的难降解有机污染物入海量将呈增加趋势。因此，我国近海海域环境质量状况不容乐观，必须保持高度重视。在自然界，环境雌激素的污染被认为是动物，[42]特别是水生动物生殖功能异常、雌雄同体率升高、性比例失调和生殖器官变异的重要原因。持久性有机污染物在水中难降解，对水生生物尤其是高位营养级生物乃至人类健康都将产生深远影响。并且许多报道表明，在河流、湖泊、污水处理口等均有雌激素的富集，其中环境雌激素类化合物，其可通过与雌激素受体结合而影响生殖和发育甚至造成水生生物多样性群体水平的改变。近年来，随着大量生产以及广泛应用塑料制品，作为环境雌激素，邻苯二甲酸酯、有机锡、多氯9 联苯类化合物对人类和自然环境造成了极大的危害，也引起越来越多人们的关注。目前，一些持久性毒物在全球主要工业国的生态环境中已达到了普遍检出标准的程度，已经成为全球性的最普遍的污染物。因此，研究这类污染物在生态系统中的迁移、转化及生态效应和生态风险评价具有重要的理论意义和应用价值。当前，国内外许多学者已经开展了重金属、邻苯二甲酸酯、多氯联苯和有机锡类化合物在食品、污水、泥土等物质的含量分析，以及对哺乳动物和水生动物物等标准毒性试验动物的毒性研究。有机锡化合物对海洋的污染，不可避免地对海洋生态系统造成严重的影响。研究表明，有机锡能干扰牡蛎的钙代谢，使其贝壳畸形加厚，含肉量下降，从而降低或丧失牡蛎的市场价值，这最终导致法国阿卡琼海湾的牡蛎养殖业一度陷入瘫痪，幼蚝和成体都大幅度减产。在1977～1983[43]年，当地的直接经济损失共达8.8亿法郎。同时有机锡还能导致海产腹足类雌性个体产生雄性[44]的特征，也就是所谓的性畸变(Imposex)，严重时导致雌性个体生殖失败。TBT引起牡蛎壳畸[45]变的现象在美国、加拿大和英国等国家都有发现。上世纪80年代，日本的TBT污染也比较严重，[46]据当时对日本全国沿海的取样调查一半以上的样品超出了残留基准。韩国对镇海海湾水和太平洋牡蛎进行了测定，结果从所有牡蛎中都检出了丁基锡化台物，牡蛎中TBT和TPT含量分别为-1-1[47]95-885ngSng和155—678ngSn.g。自从80年代以来，尽管有些国家早已经发现了有机锡的污染并开始实施法律法规禁止使用有机锡制品，但是因为在水体中已经大量存在这种有机化合物，且降解速度缓慢，在水体中能够长期存留。1.4研究目的和意义海洋微藻广泛存在于海洋中，拥有繁多的种类，小个体，且生长繁殖迅速，故而在实验室易培养。且其实验周期短，对毒物的毒性敏感。作为初级生产者，海洋微藻能通过光合作用为浮游动物、底栖生物、鱼类等生物提供氧气和食物，是最主要的一种饵料。故而海洋微藻的种类多样性和初级生产量直接影响水生态系统的结构和功能，同时藻类也是监测与评价水环境质量的重要指标。因此海洋微藻是研究水生态毒理学很好的也是必不可少的材料之一。海洋微藻是海洋初级生产力的重要组成部分，是海洋食物链的基础，在海洋生态系统中发挥着重要的作用，并在水产养殖中发挥着不可替代的作用。两种种海洋微藻：湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)、和盐生杜氏藻（Dunaliellasalina）都是海产养殖中的常用优质饵料，作为经济藻种，其在甲壳类、双壳贝类的苗种生产中起着非常重要的作用，同时也是海洋浮游生物毒性测试中常用的实验材料。有机锡化合物尤其是三苯基锡和三丁基锡,能够引起雌性软体动物变性、哺乳细胞生殖毒性、以及人体免疫毒性等。有机锡化合物作为一种防污涂料被广泛应用于船体和海洋建筑等,因此导致了海产品中残留了大量的有机锡化合物,这些化合物可以通过食物链影响人体健康。人类食用了含有机锡化合物的海产品后,对人体健康可能造成的潜在危险,其危害机理尚需进一步研究。铅是一种广泛存在于生活环境的重金属,从开采到成品使用,与之相关的专业达百余种。铅污染在职业环境中较为明显。此外,含铅汽油、护肤美容品及建筑业中的油漆涂料和食品加工业10 的防腐剂等方面也都使用铅。在海洋中,铅污染成了海洋重金属污染中的一种重要金属,与铜、镉等金属相比,铅更容易被某些海洋生物所累积,并对生物造成不同程度的伤害,因而也成为[48]当前威胁海洋食品安全的重要因素。同时铅又是一种不能降解且广泛存在的重金属污染物,在加热到400-500℃时会有铅蒸汽逸出形成铅烟,在用铅锭制造铅粉和极板的过程中都会有铅尘散发,污染空气,当空气中铅烟尘达到一定浓度对人体是有害的。铅容易被某些海洋生物所累积,并对生物造成不同程度的伤害,因而也成为当前威胁海洋食品安全的重要因素。镉(Cd)是一种有毒重金属,具有高毒性、难降解、易残留等特点,是环境中的“五毒”之一。含镉废水主要来源于金属矿山的采选、冶炼、电解、农药、医药、油漆、合金、陶瓷与无机颜料制造、电镀、纺织印染、矿山排水及某些照相废液等[1]。传统的分离方法如：沉淀法、氧化还原法及铁氧体法适宜于处理高浓度含镉废水，但这些方法对化学试剂的消耗量很大，化学试剂对系统又产生二次污染，而且对重金属离子的分离不彻底，处理过的废水不能达到排放标准；离子交换法、膜分离法及活性炭吸附法成本较高，生化法操作周辛硫磷的国际通用名称为Phoxim，有肟硫磷等多种名称，是生产中常用的广谱性有机磷杀虫[49]剂。利用辛硫磷的胃毒、触杀和在黑暗条件下残效长等特性，防治天牛等蛀干性害虫，符合环[50]保、经济、安全和高效的原则。如今辛硫磷也被使用在渔业生产中,或者通过其他间接途径流入河海中,会造成海洋生物的逃离或者死亡。拟除虫菊酯农药是一类高效广谱杀虫剂,被广泛用于农业除虫,但由于其对水生生物具有[51]极强的毒性而被禁止在水稻田使用。故其在渔业生产中危害极大，本文采用了高效氯氟氰菊酯[52,53]为供试药剂。本研究从微藻生理生化角度探讨持久性毒物对海洋经济微藻的毒性效应，通过比较不同的海洋微藻对持久性毒物的耐受性，为进一步评价持久性毒物的环境行为和生物效应积累基础资料。在逆境胁迫下，植物体内会产生并积累过量的活性氧，而过量的活性氧最终会引起植物体的膜脂过氧化伤害，持久性毒物易使海洋微藻受到毒害，引起氧化应激，干扰其生理代谢，降低微藻的抗性，最终影响藻类的生长和繁殖。本文选用几种海洋生物扇贝、刺参、海洋微藻作为受试生物，选取在持久性毒物污染中常见的杀虫剂、有机锡和重金属为研究对象，研究了持久性毒物对几种测试生物的的急性毒性和生理生化相关指标的影响，从个体及生理生化水平上较系统地研究了持久性毒物对海洋生物的毒性效应及其致毒机制，这对以后消除海洋持久性毒物污染、保护海洋生物资源具有重要意义。11 2辛硫磷对三种扇贝的急性毒性效应农业上常利用农药、杀虫剂来清除敌害和保护植株，近年来随着农药的种类不断增加，农药的使用量也越来越大，农药随着土壤渗漏、地表径流和大气沉降进入到河流、湖泊和海洋，对水生生物造成很大的危害。由于有毒有机农药一般均为脂溶性的，溶解性小、易于和矿物质、有机质结合，进入水体后被水体颗粒物吸附或吸收后进入沉积物或水生生物体中。不但对水生生态系统带来长远危害，并且通过食物链的传递对人类健康造成严重影响。据世界卫生组织统计人类[54]80%的疾病与环境污染有关。尤其近年来,随着有关环境污染物导致的动物内分泌失调、生殖功能障碍、性别逆转及生态环境恶化、生物多样性降低等报道的增加,环境污染物的毒理作用成[55]为一个人们不得不重视的问题。有机磷农药曾是我国使用最广泛的农药,但是由于其对环境、人畜都有较大的毒性,许多种[56,57]的有机磷农药都已被禁止使用,但一些种类如辛硫磷、甲基异硫磷等目前仍在使用。它们[58,59]在环境中的残留使人们面临愈加严重的大气、土壤和水资源的污染问题。本研究选取我国优质海水养殖品种栉孔扇贝（Chlamysfarreri）、虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)、海湾扇贝（Argopectenirradians）为检测生物。海湾扇贝又称大西洋内湾扇贝，隶属软体动物门，瓣鳃纲，异柱目，扇贝科，Argopectens属，学名Argopectensirradias(Lamarck)。栉孔扇贝学名Chlamys(Azumapecten)Farreri，命名人JonesetPreston。俗名干贝蛤（其闭壳肌制成）、海扇，属软体动物门、瓣腮纲、珍珠贝目Pterioida、扇贝科Pectinidae、扇贝属。虾夷扇贝原产于日本和朝鲜。现已引进我国，并已在山东、辽宁等北方沿海进行人工养殖、增殖生产。此三种扇贝皆为常见经济种贝类。2.1材料与方法2.1.1实验器材电子天平、烧杯、容量瓶、玻璃棒、微量进样器、移液枪、玻璃水槽、充气泵等。试验用水取自天然海水，经黑暗沉淀、砂滤，曝气后使用。扇贝幼贝饵料：小球藻。实验前用f/2培养液培养至对数生长期待用。2.1.2实验试剂丙酮（ACE）、辛硫磷购买自北京顺意生物农药厂。辛硫磷(英文通用名：phoxim)又名腈肟磷、肟硫磷、倍腈松。高温下易分解，光解速度快，在黑暗或遮光条件下分解慢，残效期可达l～12 2个月。2.1.3实验方法实验前用ACE做助溶剂，以1：1的比例配制浓度为10g/L辛硫磷储备液。扇贝幼贝在每个玻璃水槽中充气培养。培养所用海水经过滤、煮沸消毒，盐度为30，pH8.6。试验期间的养殖管理与暂养期间完全相同。实验步骤：1．根据预试验结果，确定试验的毒液浓度范围。在显微镜下观察试验用幼贝，挑取个体大小相当，游泳活泼，健壮，发育良好的幼贝。将准备好的幼贝分别培养在装有100mL砂滤海水的200mL烧杯，每个烧杯中放入10个个体。试验共设6个组，1个空白对照组，5个实验组。其中5个实验组分别加入不同量的辛硫磷母液，使培养海水中辛硫磷最终浓度为分别为50μg/L，100μg/L，200μg/L，400μg/L，800μg/L。其中助溶剂ACE含量不超过0.1%。2．实验动物在水温20℃±3℃的条件下以静水方法培养，试验时间96h，实验期间不投饵，不充气。3．定时观察，及时捡出死贝。扇贝幼贝的死亡判断标准是：扇贝的外套膜全部收缩，张口，用玻璃棒触碰外套膜，不反应者定为死贝。记录三种扇贝幼贝在五种辛硫磷浓度中不同时间的死亡数目，分别计算其24h、48h、72h、96h的LC50。2.1.4数据处理与分析所有结果以4次重复试验数据平均值±标准差表示。统计学分析采用Excel2000、SPSS13软件完成。2.2实验结果2.2.1实验动物的中毒症状水生动物处于高浓度有机磷中主要发生急性中毒。幼贝在不同实验浓度下表现不同的中毒症状。一般中毒症状表现为：开始可能出现急躁不安，有狂游冲撞等剧烈现象，然后游泳不稳定，呼吸困难，最后痉挛麻痹，失去平衡，直至昏迷致死。随着不同浓度的加入，扇贝幼贝对药物的刺激各有不同，越是高浓度反应越剧烈。12h时，50μg/L梯度的活动性良好，与对照组比较无明显变化；100μg/L、200μg/L梯度的扇贝幼贝活动性减弱，部分贴壁，无死亡；400μg/L、800μg/L梯度的扇贝幼贝贴壁，但附壁不牢固，用玻璃棒碰触仍有反应，外套膜舒张，少量死亡13 个体外套膜收缩，张口。24h时，50μg/L、100μg/L梯度的扇贝幼贝均贴壁，但不太牢固，开始出现假死亡个体，即壳长时间张开，外套膜收缩，不游动，但用玻璃棒轻触仍有反应；200μg/L、400μg/L、800μg/L梯度的大量出现假死状态个体，而且轻触时反应时间延长，越来越缓慢，死亡数增加。48h时观察，50μg/L、100μg/L的个体已经出现死亡个体；200μg/L、400μg/L、800μg/L这个浓度范围内的个体开始大量死亡。72h时观察，50μg/L、100μg/L也已出现大量死亡。2.2.2辛硫磷对三种扇贝幼贝的急性毒性2.2.2.1辛硫磷对栉孔扇贝幼贝急性毒性辛硫磷在栉孔扇贝体内的蓄积及其安全质量浓度评价：(1)由表2-1知，辛硫磷在24h，48h，72h，96h的LC50，分别为：182.007、94.743、25.514、18.662-1μg.L。对照组和自然海水对照组在96h均无死亡情况出现，并且活力正常。表2-1辛硫磷对栉孔扇贝急性毒性剂量一反应相关关系LC5O时间回归方程95%置信区药品LC50SC2-1（h）RegressionPχN(μg.L)-1-1Drugs(μg.L)(μg.L)Timeequationconfidencelimit24Y=6．485x-9．0670．9970．20240182．007n．c．辛硫48Y=1．925x-2．4500．9950．0704094．74356．945～0.667磷72Y=2．695x-2．6370．9960．0574025．51412．003～96Y=4．373x-3．6020．6471．6554018．6626．949～14 图2-1不同浓度辛硫磷对栉孔扇贝平均死亡率的影响LC50随试验时间的延长而减少，表明致毒能力均随试验时间的延长而明显增强，说明其存在较为明显的蓄积急性致毒效果。由表2-1知，并利用Bliss法，得出辛硫磷对栉孔扇贝24h，48h，72h，96h的LC50分别为：182．007、94．743、25．514、18．662μg.L-1；并计算出栉孔扇贝最高无毒浓度为0.01022μg.L-1，故辛硫磷对栉孔扇贝表现为剧毒。2.2.2.2辛硫磷对虾夷扇贝幼贝的急性毒性辛硫磷在虾夷扇贝体内的蓄积及其安全质量浓度评价：由图2-2知，辛硫磷在24h，48h，72h，96h的LC50，分别为：39.333、15.986、7.888、-14.916μg.L。对照组和自然海水对照组在96h均无死亡情况出现，并且活力正常。虾夷扇贝平均死亡率如下:15 图2-2不同浓度辛硫磷对虾夷扇贝平均死亡率的影响LC50随试验时间的延长而减少，表明致毒能力均随试验时间的延长而明显增强，说明其存在较为明显的蓄积急性致毒效果。由表2-4知，辛硫磷对虾夷扇贝在24h，48h，72h，96h的LC50，-1-1分别为：39.333、15.986、7.888、4.916μg.L。计算得出虾夷扇贝最高无毒浓度：0.00874μg.L，故辛硫磷对虾夷扇贝表现为剧毒。2.2.2.3辛硫磷对海湾扇贝幼贝的急性毒性-1由图2-3知，辛硫磷在24h，48h，72h，96h的LC50，分别为：44.594、22.345、11.273、5.65μg.L。对照组和自然海水对照组在96h均无死亡情况出现，并且活力正常。图2-3不同浓度辛硫磷对海湾扇贝平均死亡率的影响16 LC50随试验时间的延长而减少，表明致毒能力均随试验时间的延长而明显增强，说明其存在较为明显的蓄积急性致毒效果。有表2-3知，辛硫磷对海湾扇贝24h、48h、72h、96h的LC50，分-1-1别为：44.594、22.345、11.273、5.65μg.L。海湾扇贝的最高无毒浓度：0.0757757µg.L，故辛硫磷对海湾扇贝表现为剧毒。2.2.3辛硫磷对三种扇贝幼贝的急性毒性实验结果比较利用SPSS13.0软件处理辛硫磷对栉孔扇贝急性毒性实验数据。表2-5辛硫磷对三种扇贝幼贝的急性毒性实验结果比较半致死浓度绝对致死浓度种类（μg/L）（μg/L）栉孔扇贝幼贝18.662a3247.15231a虾夷扇贝幼贝4.916b1770.34907b海湾扇贝幼贝5.65b247.72778c注：不同小写字母代表组间差异;绝对致死浓度是在急性吸入毒性实验中,全组染毒或给药的试验动物全部死亡的最小浓度为绝对致死浓度，常用锌>铅>铜。(2)铅对海洋动物毒性效应研究铅对海洋动物毒性效应研究有关铅对海洋动物的毒性研究,国内外已有较多报道,主要是[89]针对海洋铅污染对贝类、鱼类和其他较低等动物致死率或对其个体发育过程的影响。陈金堤等在研究重金属对褶牡蛎(Alectryonellaplicatula)胚胎及幼体发育的毒性效应时发现,铅离子对胚胎的半致死质量浓度(48hLC50)为2.52mg/L,而对幼体发育的96hLC50为3.59mg/L。高象贤等[90,91]分别研究了铅对刺参(Apostichopusjaponicus)和栉孔扇贝(Chlamysfarreri)的影响,发现[92]当铅离子质量浓度达到0.32mg/L时,刺参耳状幼虫会出现大量畸形,而当铅离子质量浓度达到0.5mg/L时,稚参已无法正常发育;而铅对栉孔扇贝幼贝的96hLC50为1.27mg/L。32 （3）镉对海洋动物毒性效应研究海洋微藻是海洋中的初级生产力，是多种海洋动物的饵料，在海洋生态系统中发挥着重要的作用，研究镉离子对海洋微藻的毒害作用及机理对阐明镉离子的生态毒理机制和维护海洋生态平衡具有重要的理论意义。湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)：属于金藻门(Chrysophyta)、普林藻纲、金胞藻目(Chrysomonadales)等鞭金藻属(Isochrysis)，没有细胞壁，个体微小，有两条比藻体略长的鞭毛,两鞭毛几乎等长、光滑、无突起和纤毛。藻体表面无鳞片包被。细胞内有一整块杯形色素体,细胞核在杯形色素体中,白糖素1～2个位于细胞中前部。细胞内有线粒体、内质网和高[93]尔基体,还有由两个椭圆形小体组成的眼点都位于细胞的前端，该种藻类常以细胞纵分裂增加个体。湛江等鞭金藻多分布淡水水体，生活于透明度较大，温度较低，有机质含量低的水体。对温度变化灵敏，多在寒冷季节，如早春和晚秋生长旺盛。在水体中多分布于中、下层。湛江等鞭金藻营养丰富，是一种重要的被广泛利用的海洋单胞藻，是双壳类软体动物和海参类幼虫的优质饵料。本研究以湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)为材料，选取在海洋重金属污染中常2+2+2+见的Pb和Cd，研究不同浓度和时间的Cd胁迫对金藻细胞生长曲线、蛋白含量及抗氧化酶活性2+的影响；研究不同浓度的Pb胁迫对金藻的细胞生长、可溶性蛋白含量、过氧化氢(H2O2)含量、丙二醛(MDA)含量以及谷胱甘肽(GSH)含量的影响。文探讨了重金属离子毒害植物的机制，寻求利[94]用水生植物进行污水净化的有效途径。并进一步分析了海洋微藻生理生化指标应用于海洋污染监测的可行性，可为评价重金属对海洋生物的影响、海洋防治重金属污染的执法管理以及海洋防污提供参考依据。5.1材料与方法5.1.1实验器材实验藻种湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)：属于金藻门(Chrysophyta)、普林藻纲、金胞藻目(Chrysomonadales)等鞭金藻属(Isochrysis)，没有细胞壁，个体微小，有两条比藻体略长的鞭毛,两鞭毛几乎等长、光滑、无突起和纤毛。藻体表面无鳞片包被。细胞内有一整块杯形色素体,细胞核在杯形色素体中,白糖素1～2个位于细胞中前部。细胞内有线粒体、内质网和高尔基体,还有由两个椭圆形小体组成的眼点都位于细胞的前端，该种藻类常以细胞纵分裂增加个体。湛江等鞭金藻多分布淡水水体，生活于透明度较大，温度较低，有机质含量低的水体。对温度变化灵敏，多在寒冷季节，如早春和晚秋生长旺盛。在水体中多分布于中、下层。湛江等鞭金藻营养丰富，是一种重要的被广泛利用的海洋单胞藻，是双壳类软体动物和海参类幼虫[95][96]的优质饵料。因此，对湛江等鞭金藻饵料的培养成为水产动物育苗系统工作的重要环节之2+一。本文研究了Pb离子不同浓度对常用海洋单胞藻湛江等鞭金藻的生理生化及营养影响。33 实验仪器光学显微镜(X53-G，重庆光学仪器厂)，荧光显微镜(OLYMPUSVANOX-S)，光照培养箱(HPG-280B，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)，超净工作台，高压灭菌锅(YXQ-LS-30S11，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，可见光分光光度计，恒温水浴锅，离心机，酶标板(96孔)。实验器皿烧杯、三角烧瓶、盖玻片、载玻片、血球计数板、一次性塑料滴管、离心管、微量加样器、刻度移液管、移液枪。实验试剂2+戊二醛，重金属离子Pb，考马斯亮蓝溶液(2-8℃保存)，1mg/ml蛋白质标准液(－20℃保存)，0.9%生理盐水，过氧化氢检测试剂(－20℃保存)，过氧化氢标准溶液(1M，－20℃保存)，过氧化氢检测裂解液(－20℃保存)，还原型谷胱甘肽试剂盒，营养盐为Convey配方，煮沸消毒过的天然过滤海水，冷却后加入营养盐(海水：营养盐=1000：1)。5.1.2实验方法（1）湛江等鞭金藻细胞培养以250mL三角瓶为培养瓶，洗净后用手提式压力蒸汽灭菌锅灭菌，注入经煮沸消毒过的天然过滤海水，加入营养盐。在培养瓶中接种一定数量生长状况良好的湛江等鞭金藻，接种的体积为100mL,使水体呈浅绿色，以干净滤纸和橡皮筋扎住瓶口。置于光照强度为3500lx，温度为21-23℃，光暗时间比L:D=12h:12h的光照培养箱中培养。使湛江等鞭金藻细胞始终处于旺盛的对数生长期，以备实验之用。（2）金藻细胞生长曲线的绘制2+设定不加重金属离子处理的对照组，和重金属离子Pb处理湛江等鞭金藻细胞的实验组。实2+2+2+2+验组分别加入终浓度为0.01mmol/LPb、0.1mmol/LPb、0.5mmol/LPb、1mmol/LPb、5mmol/L2+Pb。仍保留培养时的光照，处理金藻细胞。滴加重金属溶液需缓慢滴加，边加边不断摇瓶，防止局部过浓，造成金藻细胞死亡。每个处理设三个重复，取平均值。处理完毕之后继续培养一周时间，每天定时摇瓶三次，防止金藻细胞贴壁生长。自处理时开始每隔24小时用血细胞计数板于光学显微镜下定时计数。每次取样计数之前要将藻液充分摇匀，由于湛江等鞭金藻细胞具有鞭毛，游动速度较快，所以在记数之前需加少许戊二醛固定细胞。处理完毕后培养一周，然后每隔24小时进行细胞计数，七天为一个周期，细5-1胞密度（×10cells·mL）为纵坐标，绘制湛江等鞭金藻细胞生长曲线。34 （3）金藻细胞内可溶性蛋白含量测定方法[97]本实验采用Bradford的考马斯亮蓝G一250法测定湛江等鞭金藻可溶性蛋白的含量，标准品蛋白为牛血清白蛋白(BSA)。其实验原理为：考马斯亮蓝G一250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰由465nm变为595nm，而且消光系数更大，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。由于在一定蛋白质浓度范围内（1～1000µg/ml），蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。2+首先设定不加重金属离子处理的对照组，和重金属离子Pb处理金藻细胞的实验组。实验组2+2+2+分别加入终浓度为0.01mmol/LPb、0.1mmol/LPb、0.5mmol/LPb。从冰箱中取出考马斯亮蓝溶液，平衡至室温并混匀，预热分光光度计20分钟，然后按照试剂盒说明书制作蛋白标准曲线，然后对准备好的四组湛江等鞭金藻细胞培养液进行蛋白质的提取，然后按照说明书进行蛋白质含量的测定，根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋白含量。计算公式为：样品蛋白质含量（µg/g鲜重）＝a(µg)×提取液总体积(ml)/[测定所取提取液体积（ml）×样品鲜重（g）]。式中a为从标准曲线上查得的蛋白质含量，单位为µg。（4）金藻细胞内过氧化氢（H2O2）含量测定方法[98]本实验中采用过氧化氢检测试剂盒进行H2O2含量的测定，其基本原理是通过过氧化氢氧99化二价铁离子产生三价铁离子，然后和xylenolorange在特定的溶液中形成紫色的产物，从而实现对过氧化氢浓度的测定。操作步骤如下：2+一、设定不加重金属离子处理的对照组，和重金属离子Pb处理金藻细胞的实验组。实验组2+2+2+分别加入终浓度为0.01mmol/LPb、0.1mmol/LPb、0.5mmol/LPb。二、对四组金藻培养液分别进行细胞样品的制备，按照每六孔板一个孔(大约相当于100万个细胞)加入200微升裂解液的比例加入裂解液，裂解细胞。通常不足1分钟即可完全裂解细胞。4℃约12000g离心3-5分钟，取上清，用于后续测定。制备好的细胞样品如果不立即测定，可以在-20℃冻存。培养细胞的上清液可以直接用于后续的测定。三、根据说明书测定标准曲线。四、过氧化氢浓度的测定（5）金藻细胞内丙二醛（MDA）含量测定方法[100]本实验采用丙二醛(MDA)测定试剂盒对湛江等鞭金藻细胞中的MDA含量进行测定。其主要原理为过氧化脂质降解产物中的丙二醛(MDA)可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物[101]，在532nm处有最大吸收峰。35 （6）金藻细胞内谷胱甘肽（GSH）含量测定方法本实验采用还原型谷胱甘肽试剂盒测定湛江等鞭金藻的GSH含量。其主要实验原理为：用纯化的GSH抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的GSH[102]抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物(TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的GSH呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。结果计算：各标准品及样本OD值扣除空白孔OD值后作图（七点图），如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标（对数坐标），OD值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘出标准曲线。根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。（7）SOD活性的测定-[103]通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O2），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧负离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。按从南京建成生物工程研究所购买的试剂盒的顺序测定SOD活性，设定不加重金属离子处理2+2+的对照组，和加重金属离子Cd处理金藻细胞的实验组。实验组分别加入终浓度为0.1mmol/LCd、2+0.5mmol/LCd。对照管加1.0ml试剂一、0.2ml蒸馏水，测定管加1.0ml试剂一、0.2ml样品，然后均加0.1ml试剂二、0.1ml试剂三、0.1ml试剂四；用旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40分钟；分别加入2ml显色剂；混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。（8）POD活性的测定利用POD催化过氧化氢反应的原理，通过测定吸光度的变化得出其酶活性。按从南京建成生物工程研究所购买的试剂盒的顺序测定POD活性，设定不加重金属离子处理2+2+的对照组，和加重金属离子Cd处理金藻细胞的实验组。实验组分别加入终浓度为0.5mmol/LCd。测定管和对照管均加2.4ml试剂一、0.3试剂二；然后测定管加0.2ml试剂三应用液，对照管加0.2ml双蒸水；测定管和对照管均加入0.1ml样本；37℃水浴准确反应30分钟；再均加1.0ml试剂四。混匀后，3500转/分离心10分钟，取上清于420nm处，1cm光径测定OD。定义：在37℃条件下，每毫克组织蛋白分钟催化产生1µl的底物的酶量定义为一个酶活力单位。按下式计算POD活力，计算公式：POD活力（U/mgport）={（测定OD-对照OD）/（12×比色光径（1.0cm））}×{反应液总体积36 [104]（ml）/样本量（ml）}÷反应时间（30分钟）÷10%组织匀浆蛋白含量（mg/ml）×1000（9）CAT活性的测定CAT分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速终止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，可计算出CAT的活力。2+设定不加重金属离子处理的对照组，和加重金属离子Pb处理金藻细胞的实验组。实验组2+2+2+分别加入终浓度为0.5mmol/LCd、1mmol/LCd、5mmol/LCd。按从南京建成生物工程研究所购买的试剂盒的顺序测定；组织匀浆的制备：准确称取组织重量，加9倍生理盐水制成10%的组织匀浆，2500转/分离心10分钟，取上清，再用生理盐水稀释成最佳取样浓度，待测。对照管加1.0ml试剂一（37℃预温）、0.1ml试剂二（37℃预温），测定管加0.05ml组织匀浆、1.0ml试剂一（37℃预温）、0.1ml试剂二（37℃预温）；混匀，37℃准确反应1分钟（60秒）；对照管加1.0ml试剂三、0.1ml试剂四、0.05ml组织匀浆，测定管加1.0ml试剂三、0.1ml试剂四。混匀，0.5cm光径，405nm处，蒸馏水调零，侧各管吸光度定义：每毫克组织蛋白每秒钟分解1µmol的H2O2的量为一个活力单位。按下式计算CAT活力，计算公式：组织匀浆中CAT活力（U/mgport）=（对照管OD值-测定管OD值）×271﹡×（1/60×取样量）÷匀浆蛋白含量（mgport/ml）注：﹡271为斜率的倒数5.1.3数据处理与分析所有结果以4次重复试验数据平均值。统计学分析采用Excel2003软件完成。5.2实验结果2+（一）Pb对湛江等鞭金藻生理生化指标的影响2+Pb对湛江等鞭金藻生长的影响2+通过采用不同浓度的Pb胁迫处理的湛江等鞭金藻生长曲线图如图1所示。37 2+图5-1不同浓度Pb处理的湛江等鞭金藻细胞生长曲线由图5-1可以看出，对照组的金藻生长属于S型曲线，在培养过程中基本符合对数生长规律。2+2+当Pb的浓度小于0.1mmol/L时，细胞死亡率很低,说明Pb的细胞毒性没有对金藻造成伤害，尤2+其当Pb浓度比较低时(0.01mmol/L)，会促进金藻的生长，金藻生长较快，藻的细胞数量甚至高2+2+2+于对照组，这说明金藻对Pb有较强的忍耐力，可能是Pb容易从细胞壁排出或较高浓度的Pb容2+2+易沉淀所致。但当Pb浓度大于0.1mmol/L时，Pb对金藻的生长形成抑制作用，细胞生长缓慢，2+且细胞死亡数随浓度的增加而增加，当Pb的浓度为5mmol/L时，金藻细胞全部死亡(图中未示)。2+5.2.1Pb对湛江等鞭金藻可溶性蛋白含量影响通过采用考马斯亮蓝试剂盒测定金藻细胞内的可溶性蛋白含量，我们可以看到在不同浓度2+Pb离子胁迫处理下，金藻的可溶性蛋白含量发生了很大变化，如图5-2所38 2+图5-2不同浓度Pb对金藻细胞可溶性蛋白含量的影响2+从图5-2中我们可以看出当Pb浓度为0.01mmol/L时，在初始阶段(0～3d)，湛江等鞭金2+藻的可溶性蛋白含量还高于对照组，可之后却出现了极其显著的下降。当处理的Pb浓度为0.1mmol/L时，初始阶段(0～3d)的金藻可溶性蛋白含量呈上升趋势，而后几天变化不大，蛋2+白含量始终低于对照组。而当胁迫处理的Pb浓度为0.5mmol/L时，金藻在初始阶段(0～3d)2+可溶性蛋白含量急剧下降，而后几天成上升趋势，但仍旧低于对照组。总的来说，Pb的胁迫作用，导致湛江等鞭金藻的可溶性蛋白含量降低。2+5.2.2Pb对湛江等鞭金藻过氧化氢含量影响2+采用过氧化氢检测试剂盒分别测定四组不同浓度Pb处理的湛江等鞭金藻的H2O2含量，四组藻液第七天的H2O2含量比较如图5‐3所示。2+图5-3不同浓度Pb对金藻细胞H2O2含量的影响2+从图5-3中我们可以看到Pb浓度为0.01mmol/L和0.1mmol/L的两组藻液的过氧化氢2+含量都比对照组高，当Pb浓度为0.5mmol/L时，较对照组的过氧化氢含量则明显降低，这2+2+样看来当藻液中的Pb浓度低于在0-0.1mmol/L范围内时，Pb对金藻中的H2O2含量起到促2+2+进作用，并且H2O2含量随Pb浓度增加而增加，但是当Pb浓度大于0.1mmol/L时，金藻中2+的H2O2含量急剧下降。可能是由于过高的Pb浓度造成湛江等鞭金藻大量死亡造成的。39 2+5.2.3Pb对湛江等鞭金藻丙二醛含量影响采用丙二醛(MDA)测定试剂盒测定湛江等鞭金藻细胞内的丙二醛(MDA)含量，我们可以看2+到在不同浓度Pb离子培养条件下，金藻的丙二醛(MDA)含量发生了明显的变化（见图4）。2+图5-4不同浓度Pb对湛江等鞭金藻细胞MDA含量的影响2+从图5-4中可以看出，湛江等鞭金藻在不添加Pb时，即对照组，金藻的丙二醛(MDA)含2+量很低，并呈现下降趋势；当胁迫处理的Pb离子浓度为0.01mmol/L时，金藻的丙二醛(MDA)2+含量同样也比较低，但略微呈现上升趋势；当胁迫处理的Pb离子浓度为0.1mmol/L时，金藻的丙二醛(MDA)含量在初始阶段很高，之后出现大幅度下降，后期含量变化不大，且与2+2+0.01mmol/LPb离子处理组的丙二醛含量接近；当胁迫处理的Pb离子浓度为0.5mmol/L时，金藻的丙二醛(MDA)含量较高，并且在前期大幅升高，但后期出现了大幅度的下降。总的来2+2+说丙二醛(MDA)含量与Pb离子浓度呈明显正相关，Pb离子浓度越高，丙二醛(MDA)含量越高；我们还可以看到对照组与三个实验组都存在的共性：随着培养时间的推移，各组中丙二醛(MDA)含量都呈现减少趋势。2+5.2.4Pb对湛江等鞭金藻谷胱甘肽含量影响采用还原型谷胱甘肽试剂盒测定湛江等鞭金藻的GSH含量。我们可以看到在不同浓2+Pb离子培养条件下，金藻的谷胱甘肽(GSH)含量发生了明显的变化（见图5‐5）。2+图5-5不同浓度Pb对湛江等鞭金藻GSH含量的影响40 2+由图5-5可以看出，在不添加Pb时，湛江等鞭金藻的GSH含量较低，在培养后期，GSH含2+量呈小幅上升趋势；当采用浓度为0.01mmol/L的Pb离子胁迫处理时，金藻的GSH含量在2+初期一直很低，但从第五天开始突然大幅攀升；采用浓度为0.1mmol/L的Pb离子胁迫处理时，金藻在初始阶段的GSH含量很高，但很快就大幅下降，到了后期，GSH含量又大幅升高；2+采用浓度为0.5mmol/L的Pb离子胁迫处理时，起初金藻的GSH含量较高，后期同样也出现小幅下降。通过三个实验组与对照组的比较，不难发现，三个实验组的GSH含量都高于对照2+组，因此可以推断Pb离子胁迫对湛江等鞭金藻的GSH含量起促进作。2+通过对不同浓度的重金属离Pb对湛江等鞭金藻细胞生长、可溶性蛋白含量、过氧化氢2+(H2O2)含量、丙二醛(MDA)含量以及谷胱甘肽(GSH)含量的影响的测定。结果表明，重金属Pb2+的确会对湛江等鞭金藻的各项生理生化指标产生影响，并且根据胁迫处理的Pb浓度的不同，产生的影响也有所不同。2+2+当Pb的浓度小于0.1mmol/L时，细胞死亡率很低,说明Pb的细胞毒性没有对金藻造成2+伤害，尤其当Pb浓度比较低时(0.01mmol/L)，会促进金藻的生长，金藻生长较快，藻的细2+2+胞数量甚至高于对照组，这说明金藻对Pb有较强的耐受力，可能是Pb容易从细胞壁排出或2+[22]2+2+较高浓度的Pb容易沉淀所致。但当Pb浓度大于0.1mmol/L时，Pb对金藻的生长形成抑2+制作用，细胞生长缓慢，且细胞死亡数随浓度的增加而增加，当Pb的浓度达到5mmol/L时，金藻甚至全部死亡。2+当胁迫处理藻液的Pb浓度小于0.01mmol/L时，在藻液培养的初始阶段(0～3d)可溶性2+蛋白含量还比较高，可之后却出现了极其显著的下降。当胁迫处理的Pb浓度大于0.1mmol/L2+时，湛江等鞭金藻的细胞生长受到抑制，可溶性蛋白含量也相应的比较少。总的来说，Pb的毒性作用，导致湛江等鞭金藻的可溶性蛋白含量降低。（二）Cd2+对湛江等边金藻抗氧化酶活性的影响Cd2+对湛江等边金藻生长曲线的影响2+图1为不同浓度的重金属离子Gd处理金藻细胞生长曲线。41 2+图5-6Gd处理金藻细胞生长曲线2+2+由图5-6可以看出，用Cd处理金藻细胞，当Cd的浓度在很低的情况下，仅仅为0.1mmol/L，第一天到第三天，对于金藻细胞的生长无不良影响。第四天开始细胞密度就比同期对照组的低。其中，虽然第五天细胞密度突然升高，但之后立即降低，表现出了一定的2+抑制作用。当Cd的浓度大于0.1mmol/L，细胞游动速度缓慢或停止，对金藻藻的生长有不同程度的抑制作用，这种生长的抑制主要表现在细胞增长速度减慢。2+5.2.5Cd胁迫对蛋白质含量的影响2+图5-7为不同浓度的重金属Cd胁迫下金藻细胞蛋白质含量的影响。2+图5-7不同浓度Cd胁迫对金藻蛋白质含量的影响2+由图5-7可以看出，当Cd浓度为0.1mmol/L时，在初始阶段(0-3d)，处理组细胞可溶性蛋白含量高于对照组细胞，但一直处于迅速下降的趋势，第三天后细胞可溶性蛋白含量2+较稳定且一直低于对照组。当Cd浓度为0.5mmol/L时，在初始阶段(0-3d)，处理组细胞可溶性蛋白含量也高于对照组且一直处于迅速下降的趋势，并在第3天低于对照组，虽然第2+3-5天出现小幅上升但始终低于对照组，随后又开始下降。当Cd浓度为1mmol/L时，在初始阶段(0-3d)，可溶性蛋白含量一直低于对照组，并且变化不大，第3-5天出现小幅上升42 不过始终低于对照组，随后又开始下降。2+5．2.6Cd胁迫对SOD的影响2+图5‐8为Cd胁迫对金藻SOD活性的影响。2+图5-8不同浓度Cd胁迫对湛江等边金藻SOD活性的影响2+由图5‐8可以看出，总的来讲两个浓度Cd处理组的SOD活性都明显高于对照组，并有随2+浓度和时间增加而增加的趋势。0.1mmol/LCd作用下SOD活性在初始时期(0‐3d)低于对照2+组，第3‐5天呈上升趋势并一直高于对照组；当Cd浓度为0.5mmol/L时，处理组SOD活性在第1‐3天上升在第3‐5天出现小幅下降不过始终高于对照组活性，第5天后开始稳步上升，在观察期没有出现下降。2+5.2.8Cd胁迫对POD的影响2+图5-9为Cd胁迫对金藻POD活力的影响。2+图5‐9不同浓度Cd胁迫对湛江等边金藻POD活力的影响43 由图5-9可以看出，处理后的前三天，两个处理组的POD酶活性迅速上升，且大于对照。第3天后开始下降，但一直高于对照组活性。处理后的前三天，两个处理组的POD酶活性迅速上升，且大于对照。2+5.2.9Cd胁迫对CAT的影响2+图5‐10为Cd胁迫对金藻CAT活力的影响。2+图5‐10不同浓度Cd胁迫下CAT活力的影响2+2+由图5‐10可以看出，总的来讲Cd处理组的CAT活性要高于对照组．当Cd浓度为0.5mmol/L时，第一天CAT活力较对照组要低一些且变化不大，第1‐3天CAT活性呈上升趋势并2+超过对照组，第3天后开始下降不过始终高于对照组；当Cd浓度为1mmol/L时，CAT活性在第一天出现短暂的上升，第1‐3天活性没有变化，第3天后又开始上升，在观察期内始终高于对照组。5.3结论和讨论:藻类是海洋生态系统中主要的初级生产者，重金属则是主要的水体污染物之一。本研究2+通过不同浓度的重金属离Pb对湛江等鞭金藻细胞生长、可溶性蛋白含量、过氧化氢(H2O2)2+含量、丙二醛(MDA)含量以及谷胱甘肽(GSH)含量的影响。研究结果表明，重金属Pb的确会2+对湛江等鞭金藻的各项生理生化指标产生影响，并且根据胁迫处理的Pb浓度的不同，产生2+2+的影响也有所不同。通过对水体污染较普遍的重金属Cd胁迫金藻，研究不同剂量的Cd在不同胁迫时间内对金藻生长曲线、蛋白含量、SOD、POD和CAT活性的影响，探讨重金属胁迫植物的生理机制。为研究重金属对藻类生长代谢的影响可为环境污染的预防、控制和消除提供理论依据。2+2+（1）当Pb的浓度小于0.1mmol/L时，细胞死亡率很低,说明Pb的细胞毒性没有对金2+藻造成伤害，尤其当Pb浓度比较低时(0.01mmol/L)，会促进金藻的生长，金藻生长较快，2+2+藻的细胞数量甚至高于对照组，这说明金藻对Pb有较强的忍耐力，可能是Pb容易从细胞2+[105]2+2+壁排出或较高浓度的Pb容易沉淀所致。但当Pb浓度大于0.1mmol/L时，Pb对金藻的生2+长形成抑制作用，细胞生长缓慢，且细胞死亡数随浓度的增加而增加，当Pb的浓度达到5mmol/L时，金藻甚至全部死亡。2+当胁迫处理藻液的Pb浓度小于0.01mmol/L时，在藻液培养的初始阶段(0‐3d)可溶性蛋44 2+白含量还比较高，可之后却出现了极其显著的下降。当胁迫处理的Pb浓度大于0.1mmol/L2+时，湛江等鞭金藻的细胞生长受到抑制，可溶性蛋白含量也相应的比较少。总的来说，Pb的毒性作用，导致湛江等鞭金藻的可溶性蛋白含量降低。2+2+（2）在进行Cd胁迫对金藻生长影响的试验中发现，当Cd浓度在0‐0.1mmol／L时，金2+藻细胞数量没有明显变化，说明Cd没有对金藻细胞造成损害；当浓度在0.1‐0.5mmol／L时2+细胞数量显著降低，说明Cd对金藻细胞造成了损害，且浓度越高对金藻细胞损害越大；当2+浓度大于0.5mmol/L时细胞几乎全部死亡。整体来看金藻细胞对Cd胁迫较敏感。出现这种2+现象的原因可能是当浓度低于0.1mmol/L时金藻细胞对Cd产生耐受应激反应，在这种应激反应下，金藻细胞仍可正常生长；但当浓度大于0.1mmol/L时超过了金藻的耐受范围使金藻的生理生化结构遭到破坏，造成生长受到抑制甚至停止。2+Cd对蛋白质含量变化的影响也比较显著，可以使蛋白质含量显著降低，可能是由于其与一SH基结合导致蛋白变性而降解，也可能是蛋白质合成酶的失活或DNA转录翻译途径受阻，影响了蛋白质的合成。SOD是植物体内清除自由基的最关键的酶之一。它能催化生物体内分子氧活化的第一个‐中间产物O2。发生歧化反应，生成O2和H2O2。因此它对过多的活性氧必然会产生一定应激反应。2+在对POD活性测定的实验中发现，两个浓度Cd处理组的SOD活性都明显高于对照组，并2+有随浓度和时间增加而增加的趋势。0.1mmol/LCd作用下SOD活性在初始时期(0‐3d)低于2+对照组，第3‐5天呈上升趋势并一直高于对照组；当Cd浓度为0.5mmol/L时，处理组SOD活性在第1‐3天上升在第3‐5天出现小幅下降不过始终高于对照组活性，第5天后开始稳步上升，在观察期没有出现下降。出现这种现象的原因可能是植物体内所有的活性氧清除酶系统和具生理抗性特征的生理活动被诱导而加快，SOD在此诱导下，其活性逐渐增加，用以清除重金属胁迫导致的植物体内过多的超氧阴离子自由基。说明藻细胞试图通过增加其SOD等抗氧化防御系统成分的能力来削弱活性氧的影响。在低浓度的活性氧作用下，藻细胞的SOD活性不仅没有下降，反而略有上升，说明藻细胞试图通过增加其SOD等抗氧化防御系统成分的能力来削弱活性氧的影响。在高浓度的活性氧作用下，藻细胞的SOD活性表现出降低趋势，细胞清除活性氧的能力进一步下降，[107]进而有可能对细胞造成更大的损伤，李培峰等的研究也证实了这一点。在对POD活性测定的实验中发现，处理后的前三天，两个处理组的POD酶活性迅速上升，且大于对照，第3天后开始下降。处理后的前三天，两个处理组的POD酶活性迅速上升，且大2+于对照。说明在低浓度下Cd浓度越大对POD活性的促进作用越大。这种现象说明金藻能够积极的调动其防御系统抵抗胁迫，而在持续的的胁迫下，POD活性随时问延长而逐步降低，可能是由于受害严重，细胞受损过大，防御能力逐步下降，而且随着时间的延长，其抗性也逐步降低。随胁迫时间的延长，重金属对这3种酶活性的影响和重金属种类、胁迫剂量有关，并且金藻对低剂量的重金属有一定的耐受力，这和其他报道一致。SOD、POD和CAT被称为植物体内的保护酶，能清除体内自由基，重金属胁迫下，这三种酶活性的变化可反应出植物防御机制的运行规律。实验将为进一步探讨重金属离子对水生植物的毒害机制提供佐证。45 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