虎杖蒽醌提取物抗锦鲤疱疹病毒作用效果研究

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分类号：Q942.2单位代码:10193密级：公开学号:20150424硕士学位论文虎杖蒽醌提取物抗锦鲤疱疹病毒作用效果研究AntiviralEffectsofanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatumagainstKoiHerpesvirus作者姓名：金晔学位类别：理学硕士专业名称：水生生物学研究方向：水生动物医学指导教师：周井祥教授所在学院：生命科学学院2018年5月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日导师签名：签字日期：年月日 摘要锦鲤疱疹病毒（Koiherpesvirus，KHV）是一种高传染性，高致病性，高死亡率的锦鲤疱疹病毒病（Koiherpesvirusdisease，KHVD）的病原体又称鲤疱疹病毒3型（Cyprinidherpesvirus3，CyHV-3）。自20世纪90年代末首次对KHV报道以来，这种病毒已经在世界范围内流行，对锦鲤和鲤鱼养殖产业造成重大经济损失。KHV作为水生动物疫病病毒越来越被重视。KHVD的诊断方法和相关防治措施的研究越来越深入，但至今仍未开发出有效治疗该病的药物和疫苗。虎杖提取物中蒽醌化合物具有多种药理作用包括抗病毒，抗菌，抗炎，抗癌等多种特性。多项研究已证实蒽醌类化合物对HSV-1、HSV-2、HIV、SARS、乙型肝炎病毒、流感病毒等均表现出一定的抑制作用。本研究旨在检测虎杖蒽醌提取物对KHV感染的抗病毒活性，试图发现用于治疗锦鲤疱疹病毒病有效药物制剂。研究内容及结果如下：1.虎杖蒽醌提取物及阳性对照药物利巴韦林在CCB细胞中最大安全浓度的测定。采用MTT法和CPE镜检法检测48h内虎杖蒽醌提取物和广谱性抗病毒药物利巴韦林对CCB细胞的毒性作用。设置8组不同浓度的虎杖蒽醌提取物1.96μg/ml、3.91μg/ml、7.28μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml的实验组，9组不同浓度的利巴韦7.28μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml、4000μg/ml及无药物作用的对照组。试验结果表明：虎杖蒽醌提取物浓度在31.25μg/ml时，细胞存活率达80%以上。虎杖蒽醌提取物和阳性对照药物利巴韦林在CCB细胞中的CC50分别为72.67±2.12μg/ml和2638.79±2.36μg/ml。31.25μg/ml的虎杖蒽醌提取物不会影响CCB细胞形态或细胞密度的明显变化，在细胞毒性试验中被认定为最大无毒浓度，同时低浓度范围内（≤31.25μg/ml）细胞毒性基本为零，且存在一定的促进CCB细胞增殖的情况。2.虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究。确定虎杖蒽醌提取物（1.96-31.25μg/ml）和利巴韦林（15.63-500μg/ml）最大无毒范围后进行病毒复制抑制试验。结果显示虎杖蒽醌提取物浓度为31.25μg/ml时达到最大抑制率为78.63±5.47%，IC50=13.67±0.47μg/ml，TI（Pc）=5.48±0.49；阳性对照药物利巴韦林IC50=492.15±2.13μg/ml，TI（R）=5.36±0.03。在直接杀灭病毒试验中，虎杖蒽醌提取物也显示出一定的直接杀灭KHV病毒粒子的能力，最高病毒抑制率为32.21%。预先给药孵育的CCB细胞未产生抗KHV病毒吸附的能力，CPE镜检发现药物预先孵育组，与阴性KHV病毒对照组无明显差异。同时RT-PCR结果显示在0.1TCID50KHV病毒感染组中31.25μg/ml虎杖蒽醌提取物显示出良好的抗KHV病毒的能力，完全抑制KHV生命周期相关基因的转录。在I 动物攻毒试验中，虎杖蒽醌提取物也显示出较高的抗KHV病毒活性，延长试验鲤鱼死亡数时间，提高攻毒鲤鱼存活率。关键词：虎杖；蒽醌类化合物；锦鲤疱疹病毒；抗病毒作用；II AbstractKoiherpesvirus(KHV)isapathogenthatcauseshighlycontagious,highlypathogenic,andhighmortalityofKoiherpesvirusdisease(KHVD),alsocalledCyprinidherpesvirus3(CyHV-3).SincethefirstreportonKHVinthelate1990s,thevirushasbecomeprevalentintheworld,causingmajoreconomiclossestokoiandcarpaquaculture.Asanaquaticanimaldiseasevirus,KHVhasreceivedmoreandmoreattention.TheresearchonthediagnosticmethodsandcontrolmeasuresofKHVDhasbecomemoreandmorein-depth,butnoeffectivedrugsandvaccineshavebeendevelopedtotreatthedisease.AnthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatumhavemanypharmacologicaleffectsincludingantiviral,antibacterial,anti-inflammatoryandanticancerproperties.SeveralreportshaveconfirmedthatanthraquinonehavecertaininhibitoryeffectsonHSV-1,HSV-2,HIV,SARS,hepatitisBvirus,andinfluenzaviruses.TheaimofthisstudywastodetecttheantiviralactivityofanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatumagainstKHVinfectionandtofindaneffectivepharmaceuticalpreparationforthetreatmentofKoiherpesvirusdisease.Thecontentsandresultsofthestudyareasbelow:1.DeterminationofmaximumsafeconcentrationinCCBcellsofanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatumandpositivecontrolleddrugribavirin.MTTassayandCPEmicroscopywereusedtodetectthecytotoxicityeffectsofanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatumandbroad-spectrumantiviraldrugribavirinonCCBcellswithin48hours.8groupsofexperimentalgroupsofdifferentconcentrationsofanthraquinoneextractofPolygonumcuspidatumweresetup,withtreatmentgroupsof1.96μg/ml、3.91μg/ml、7.28μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml,9groupsofdifferentconcentrationsofribavirin15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml、4000μg/mlandcontrolgroupwithoutdrugeffect.TheresultsshowedthatthesurvivalrateofanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatumwasover80%whentheconcentrationofanthraquinoneextractswas31.25μg/ml.PolygonumcuspidatumanthraquinoneextractsandpositivecontroldrugribavirininCCBcellsCC50were72.67±2.12μg/mland2638.7±2.36μg/ml.31.25μg/mlofanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatumdidnotaffectthesignificantchangesincellmorphologyorcelldensityofCCB,inthecelltoxicitytestwasidentifiedasthemaximumnon-toxicconcentrationandlowIII concentrationrange(≤31.25μg/ml)cytotoxicitywasbasicallyzero,andthereisacertainpromotingtheproliferationoftheCCBcells.2.StudyontheantiKHVvirusactivityofanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatum.ThevirusreplicationinhibitiontestwasperformedafterconfirmingthemaximumnontoxicrangeofanthraquinoneextractfromPolygonumcuspidatum(1.96-31.25μg/ml)andribavirin(15.63-500μg/ml).TheresultsshowedthatthemaximuminhibitionrateofanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatumwas31.25μg/ml,IC50=13.3±0.47μg/ml,TI(Pc)=5.48±0.49,andthepositivecontroldrugribavirinIC50=492.15±2.13μg/ml,TI(R)=5.36±0.03.InthevirucidalAssay,anthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatumhasapparentabilitytodirectlykillKHVvirusparticles,andthehighestvirusinhibitionrateis32.21%.Thepre-dosedCCBcellsdidnotproducetheanti-KHVvirusadsorptionability,CPEexaminationshowedthatthedrugpre-incubationgrouphadnosignificantdifferencewiththenegativeKHVviruscontrolgroup.TheresultsofRT-PCRshowedthat31.25μg/mlanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatuminthe0.1TCID50KHVvirus-infectedgroupshowedgoodanti-KHVvirusability,completelyinhibitingthetranscriptionofKHVlifecycle-relatedgenes.Intheanimalchallengeexperiment,anthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatumalsoshowedahigheranti-KHVvirusactivity,prolongingthenumberoftestcarpdeaths,andincreasingthesurvivalrateofchallengedcarp.Keywords:Polygonumcuspidatum;anthraquinone;Koiherpesvirus;antiviraleffectIV 目录摘要·························································································································IABSTRACT····················································································································1第一章前言··············································································································11.1锦鲤疱疹病毒研究进展..........................................................................................................................41.2KHVD的诊断及防治方法.....................................................................................................................61.3虎杖在动物药理作用的研究进展.......................................................................................................61.4本研究目的与意义...................................................................................................................................9第二章虎杖蒽醌提取物配制及在CCB细胞最大安全浓度的测定·······························102.1材料.............................................................................................................................................................102.2方法.............................................................................................................................................................122.3结果.............................................................................................................................................................162.4讨论.............................................................................................................................................................202.5小结.............................................................................................................................................................21第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究················································223.1材料.............................................................................................................................................................223.2方法.............................................................................................................................................................243.3结果.............................................................................................................................................................303.4讨论.............................................................................................................................................................363.5小结.............................................................................................................................................................37第四章结论············································································································38参考文献·······················································································································39作者简介·······················································································································47致谢·······················································································································48 吉林农业大学硕士学位论文第一章前言第一章前言1.1锦鲤疱疹病毒研究进展鲤(Cyprinuscarpio)养殖品种多、分布较为广泛、饲养历史悠久[1]、产量最高[2]的淡水鱼类之一[3]。上世纪90年代末，高传染率、高致病率、高死亡率的锦鲤疱疹病毒病（Koiherpesvirusdisease，KHVD）开始在锦鲤和鲤养殖业传播，给养鲤业带来严重的经济损失[4]。该病的病原为锦鲤疱疹病毒Koiherpesvirus，KHV）又称鲤疱疹病毒3型（Cyprinidherpesvirus3，CyHV-3）。1.1.1KHV的命名及系统分类该病的病原体最初由于它与疱疹病毒科（Herpesvirales）病毒的形态相似被称为锦鲤疱疹病毒（Koiherpesvirus，KHV）[5]，疾病被命名为锦鲤疱疹病毒病（Koiherpesvirusdisease，KHVD）。由于相关的病变，随后该病毒被称为鲤鱼间质性肾炎和鳃坏死病毒（Carpinterstitialnephritisandgillnecrosisvirus，CNGV）[6]。最后，在与先前描述的鲤科动物疱疹病毒的基因组同源性的基础上，该病毒也可称为鲤疱疹病毒3型（Cyprinidherpesvirus3，CyHV-3）[7]。2009年国际病毒分类学委员会（ICTV）根据形态学将CyHV-3归属为疱疹病毒目（Herpesvirales），异疱疹病毒科（Alloherpesviridae）[8]，鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus）[9]。同属成包括鲤疱疹病毒1型（Cyprinidherpesvirus1，CyHV-1；又称鲤鱼痘疱疹病毒）、鲤疱疹病毒2型（Cyprinidherpesvirus2，CyHV-2；又称金鱼造血器官坏死病毒）及鳗鱼疱疹病毒（Anguillidherpesvirus1，AngHV-1)[10]。1.1.2KHV基因组与蛋白质组学KHV为线性双股DNA病毒，大小295kb，在目前所测序的疱疹病毒中拥有最大的基因组[11,12]。已经确定了来自不同地理位置的四种CyHV-3毒株的完整DNA序列：以色列（CyHV-3I）、日本（CyHV-3J）[13]、美国（CyHV-3U）和中国（CyHV-3GZ11）[14]四种基因型。CyHV-3病毒颗粒的直径在感染细胞内为170-230nm[15]，在体内器官中为167-200nm[16]。与疱疹病毒目其他成员相同，CyHV-3病毒粒子由含有基因组的二十面体衣壳(100nm)，脂质囊膜及蛋白质非晶体层组成。通过相关蛋白质组学分析方法确定KHV共编码164个开放式阅读框（OpenreadingframeORF），其中包含8个末端重复ORF(ORF1-ORF8),编码结构蛋白和非结1 吉林农业大学硕士学位论文第一章前言构蛋白。40个结构蛋白:包括3个核衣壳蛋白（ORF72、ORF78、ORF92），13个囊膜蛋白（ORF25、ORF32、ORF59、ORF65、ORF81、ORF99、ORF99、ORF108、ORF115、ORF131、ORF131、ORF132、ORF136、ORF136、ORF148、ORF149），2个被膜蛋白（ORF62、ORF132）和22个未分类的蛋白质[17]。非结构蛋白共5个基因家族：ORF2家族（ORF2，ORF3，ORF9，ORF129，ORF130和ORF135），TNFR家族（编码与肿瘤坏死因子受体相关蛋白的ORF4和ORF12），ORF22家族（ORF22，ORF24和ORF137），ORF25家族（ORF25，ORF26，ORF27，ORF65，ORF148和ORF149，编码潜在的含有免疫球蛋白结构域的膜蛋白）和RING家族（ORF41，ORF128，ORF144和ORF150）。同属CyHV-1和CyHV-2中也存在这些基因家族，而AngHV-1只存在TNFR家族[18]。目前，KHV蛋白质组学研究还不够深入，仅有部分ORF确定了功能并成功克隆。其中3型膜蛋白ORF81研究的相对清楚一些，被认为是CyHV-3中最具免疫原性的囊膜蛋白。ORF16编码G蛋白偶联受体，ORF12和ORF134分别编码可溶性TNFR同系物和IL-10同系物是分泌量最高的病毒蛋白质之一，同系物可能和CyHV-3免疫逃避机制有关[19,20]。1.1.3地理分布和流行情况自1997年在德国首次爆发后[20]，KHV迅速在全球蔓延，目前已有28个国家报道过锦鲤疱疹病毒病，遍布欧（波兰，英国，奥地利，比利时，捷克共和国，丹麦，法国，匈牙利，意大利，卢森堡，荷兰，爱尔兰，瑞士，罗马尼亚，斯洛文尼亚，西班牙）[21-23]、美（加拿大，美国）[24]、亚（中国，日本，韩国，新加坡，马来西亚，印度尼西亚，泰国）[25-30]、非（南非）。仅剩南美和澳大利亚还未见KHVD或KHV检测的相关报道。人们提出关于KHV迅速传播主要原因：是由于之前未有检测KHV的技术手段及监管机构意识不足，导致携带KHV的患病锦鲤及鲤鱼由于进出口国际贸易等原因导致病原在全球传播。锦鲤疱疹病毒病具有很强的季节性，主要发生在18-28℃水温的春夏[31-32]。日本的实地调查中，CyHV-3爆发相关的最低温度是15.5℃[33]，我国相关研究报道在东北地区冬季冰下零下2-5℃爆发KHVD[34]。CyHV-3主要依靠水平传播方式，但也不排除存在垂直传播的可能。KHV水平传播有存在直接和间接传播两种。直接传播主要通过健康鲤鱼与感染CyHV-3的鲤科鱼类或携带CyHV-3的非鲤鱼类物种之间的皮肤接触，或者是患有锦鲤疱疹病毒病死亡的鲤鱼的尸体被健康鲤鱼吃食的行为会导致KHV的传播[35]；间接传播方式主要通过载体进行传递，相关载体包括粪便[36]、浮游生物、滤食性水生无脊椎2 吉林农业大学硕士学位论文第一章前言动物、食鱼鸟类、及最为重要的非生物载体—水环境。除了对普通鲤鱼和观赏锦鲤养殖产业的经济产生影响之外，CyHV-3还通过影响野生鲤鱼种群从而对环境产生负面影响。2003年，首次在日本的Yoshi河野生鲤鱼中爆发KHVD。病毒随后在几个淡水系统中传播，造成野生鲤鱼群体死亡。在琵琶湖，2004年约有70％的鲤鱼群体（超过10万条鱼）因CyHV-3感染而死亡。2003年，英国的钓鱼水域，2004年的纽约和南卡罗来纳，以及2007年加拿大安大略省的Kawartha湖地区，相继对野生鲤鱼感染KHV大规模死亡进行了报道。对日本江河和湖泊中CyHV-3的分布状况的监测表明，它可以持续存在于野生鲤鱼种群中，并随后可以传播给幼稚鱼。在对KHV历史的生活环境中进行研究表明，通的沉积物和水生无脊椎动物可以持续携带KHV。此外，病毒DNA不仅在疾病爆发期间可以在水中检测到，而且在群体死亡结束后至少3个月也能检测到[37-40]。1.1.4KHV宿主范围及易感性有证据表明，KHV可以感染多种物种，但它只会引起锦鲤和普通鲤鱼发病。锦鲤×金鱼及锦鲤×鲫鱼的杂交品种可以被KHV感染，死亡率分别为35％和91％[41]。常见的鲤鱼×金鱼杂交品种也对CyHV-3感染有一定的易感性，但死亡率相当有限（5％）[42]。对鲤科鱼类和非鲤鱼类物种以及淡水贻贝和甲壳类动物进行KHV的PCR检测表明，这些物种同样可以作为CyHV-3病毒的宿主[43]。多份研究表明KHV还可以潜伏在其他鱼种体内并间接传播给鲤科鱼类，包括：金鱼，丁鲷，欧鳊，美鳊，欧洲鲈鱼，梅花鲈，白斑狗鱼，银鲫，鲢鱼和草鱼）[44-45]。世界动物卫生组织(OIE)发布了一个易感染KHVD的物种(c.carpio及其杂交品种)）和几种疑似可携带KHV鱼类宿主（金鱼，草鱼，雅罗鱼，鲶鱼，俄罗斯鲟和大西洋鲟）。所有年龄段的鲤鱼都对KHV具有易感性，幼鱼（1-3个月龄，2.5-6g）似乎比成鱼（1龄，约230g）更容易受到感染[46]。2014年Ronsmans等人通过使用使用表达萤光素酶（LUC）的方法发现鲤鱼幼鱼在孵化后立即对KHV感染敏感，并且其敏感性随着发育阶段而增加[47]。1.1.5临床症状鲤在感染KHV后的3-7天可观察到临床症状，表现为受感染鱼通常聚集在池塘的进水口或池塘边，嗜睡，食欲不振，背鳍折叠，鳍的基部和腹部充血严重，鱼体发白粘液分泌增多，出现不规则斑块，鳞片脱落，皮肤溃烂有疱疹样病变。感染后期可观察到鱼鳃溃烂坏死，双眼凹陷，皮肤有粗糙感（砂纸样）粘液减少，部分受感染鱼难以维持自身平衡游动失常[48,49]。解剖后可见内部脏器颜色变暗并肿大，腹腔积液和腹部粘连等症状。此外，KHV感染的鱼更容易受到细菌，寄生虫或真菌病原体的继发感3 吉林农业大学硕士学位论文第一章前言染[50]。CyHV-3感染鱼的鳃，皮肤，肾脏为主要病理变化部位。皮肤病变可以在感染2天后观察到并随时间而恶化，病理组织切片显示杯状细胞数量减少50％，杯状细胞与表皮粘液分泌有关可以解释临床症状感染后期皮肤粗糙粘液减少，说明粘液已经释放并无法补充；鳃部病变涉及炎性细胞的浸润，增生，肥大，上皮细胞的变性和坏死（核碎裂，核固缩），由于增生显著，次级薄层间隙逐渐被细胞填充发生融合粘附；肾脏中肾小管炎性浸润明显，肾单位伴有血管充血和肾小管上皮变性[51]。1.1.6发病机制所有疱疹病毒科成员在其生物周期中表现出2个不同的阶段：裂解性复制和潜伏期。关于异样疱疹病毒科成员的研究也表明存在这两种类型的感染。对CyHV-3的大量研究显示水的温度可以影响潜伏期和裂解性复制之间的转换，反之亦然，即在温度不允许的情况下，病毒也可以在整个季节持续存在于宿主体内，不过不会引发疾病。最近的研究表明，病毒可能在白血细胞和其他组织中潜伏，保持在非常低的拷贝数并且可以通过温度压力再活化[52-53]。早期的报道中，基于感染初期（1-2天）便可在腮中检测到病毒颗粒和病毒基因组，推测鳃是CyHV-3入侵鱼体的首要入口[54-55]。最近使用体内生物发光成像系统（IVIS）研究表明CyHV-3主要通过皮肤（浸入感染性水）或咽部牙周粘膜感染[56]入感染性物质）入侵鱼体。1.2KHVD的诊断检测与防治方法1.2.1细胞分离鉴定KHV可以在普通鲤鱼脑细胞(CCB)、鳃细胞(CCG)、鳍条细胞[57-59]及相关衍生鲤鱼细胞系如由Wang等，Zhou等开发的鼻咽组织细胞系（MSC，KS）进行分离培养[60-61]。15℃-25℃为KHV最佳病毒生长温度，KHV引起典型细胞病变效应（CPE）包括细胞体积变大和形成空泡，随感染时间的增加，受感染的细胞形成特征性斑块。最后，被感染的细胞变圆从基底脱落，KHV病毒颗粒可从感染的细胞上清液中回收。KHV体外的分离和适应性与所使用的毒株和细胞系有关。良好适应的实验室菌株通常达到高达106-107pfu/ml的滴度。1.2.2分子生物学诊断技术PCR检测在水产病原菌鉴定中应用较为广泛，已经发表了许多常规的PCR测定法：PCR，巢式PCR，单管半巢式PCR，半定量PCR，实时TaqManPCR。这些方法都可以直接在鱼组织中或细胞培养物上清液中检测到CyHV-3DNA[62]。Gilad[63]和4 吉林农业大学硕士学位论文第一章前言Gray[64]等人的报道显示基于CyHV-3的TK基因扩增的PCR比其他已发表的PCR试验更敏感，能检测到10fg的CyHV-3DNA。诊断实验室大都倾向于使用qPCR分析来检测，其已经显示出在非常低拷贝数水平下便可进行检测和定量评估靶核酸序列，被广泛认为是最敏感的PCR方法。环介导等温扩增（LAMP）是一种不需要热循环仪的快速单步测定法，TK基因同样被开发用于LAMP法检测CyHV-3，并显示出与常规PCR分析具有相同的敏感性，且对仪器需要更少可用于现场池边诊断。纳入DNA杂交技术和抗原-抗体反应结合LAMP的试验也已经被开发并被报道具有提高的灵敏度和特异性。1.2.3免疫学诊断技术免疫诊断（基于抗体）分析用于诊断KHVD的方法很少。已经开发酶联免疫吸附剂试验（ELISA）以检测鲤鱼血清中的特异性抗KHV抗体。已经产生针对CyHV-3ORF68的单克隆抗体，并证明它可以特异性检测CyHV-3并且不与CyHV-1和CyHV-2发生交叉反应[65]。最近，研制出适用于野外条件下检测CyHV-3试剂盒（FASTestKoiHV试剂盒），可15分钟内检测到病死鱼鳃拭子中的CyHV-3[66]。1.2.4KHVD防治方法针对KHVD尚未出现切实有效的治疗手段，且尚无可用治疗药物，主要依靠水质监控及免疫接种等一些相关预防方法进行控制。1.2.4.1水环境监控对日本江河和湖泊中CyHV-3的分布状况的监测表明，它可以持续存在于野生鲤鱼种群中，并可以传播给稚鱼。研究人员认为，在高度混浊的水中，病毒可能通过附着在有机或无机颗粒上而逃脱降解。所以加强饲养管理，改善和优化养殖环境尤为重要。及时清除病死鱼，必要时可做清塘处理，保持优良水环境，作好有效的防护措施，避免疾病暴发带来的损失。1.2.4.2疫苗接种目前KHV暂无有效治疗药物，免疫接种是预防和控制KHV的主要措施。在鉴定KHV为KHVD的病原体后不久，开发了一种利用了KHV只有当温度在18℃和28℃之间时才诱导致命感染的原始方案，以诱导鲤鱼产生保护性适应性免疫应答[5。然而这种方法局限性非常大：水温难控制，且用该方法“接种疫苗”的鱼免疫原性差，再度被KHV感染。之后通过在致病性菌株在细胞培养中连续传代加紫外线照射开发出减毒活疫苗，目前，使用这种方法开发的减毒活疫苗已由KoVax有限公司（以色列耶路撒冷）生产，用于在以色列通过浸泡接种普通锦鲤和锦鲤来预防KHVD[67]。免疫效5 吉林农业大学硕士学位论文第一章前言果虽然不错，但具有散毒和返强的风险。由于分子生物学和分子病毒学的科学进展，减毒疫苗的发展开始从经验型向理性型转变。可以编辑病毒基因组以删除编码毒力因子的基因，从而可以排除毒性逆转。这种方法针对KHV已经对G蛋白偶联受体，TK，脱氧尿苷三磷酸酶和IL-10同系物进行编码来敲除ORF16，ORF55，ORF123和ORF134等毒力因子基因[68-70]。不幸的是，还没有相关文章对这些重组表达体疫苗相关安全性、功效性进行后续报道。ZHOU等人研制的编码包膜糖蛋白ORF25[71]和ORF81[72]的质粒组成的重组DNA疫苗，在实验条件下被证明具有良好的保护效果，但没有大规模生产实验。1.3虎杖在动物药理作用的研究进展虎杖（PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.），为蓼科（Polygonaceae）蓼属（PolgohumL.）多年生灌木状草本植物。又名大接骨、斑庄根，别名阴阳莲、土大黄、大叶蛇总管或日本蓼等，广泛分布于中国中南部（包括鲁、豫、陕、鄂、湘、赣、闽、云、贵、蜀等地）和日本，韩国等地。自1977年起，虎杖以干燥根茎和根入药，被列入中华人民共和国药典，包含该植物对的处方超过100种已被用于治疗疾病，具有治疗炎症，骨关节炎，黄疸，烫伤和高脂血症等药理作用。现代调查表明虎杖具有许多药理作用，包括抗病毒作用，抗菌作用，抗炎作用，抗癌作用，抗休克作用，脂质调节作用，肝脏保护作用等。1.3.1主要成份及理化性质自20世纪50年代初以来，在中国，日本，韩国和其他国家已经对该植物的根部进行了与植物化学有关的一系列研究。已从该植物中分离鉴定了超过67种化合物，主要含有蒽醌类化合物（包括：大黄素、大黄素甲醚等），二苯乙烯类化合物（包括：白藜芦醇、白藜芦醇苷等），鞣质和多糖等。1.3.2虎杖的药理作用1.3.2.1抗病毒作用多项研究表明，虎杖提取物具有有效的抗人体免疫缺陷病毒（HIV）的作用，虎杖的70％乙醇提取物在C8166淋巴细胞中具有抑制HIV-1诱导合胞体形成的作用，其有效浓度（EC50）为13.94±3.41μg/ml[73]；LIN等人发现虎杖中白藜芦醇提取物对HIV-1具有较强的抗病毒作用，EC[74]50为4.377±1.96μg/ml。此外，科研人员通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HBeAg和HBsAg的表达，显示虎杖乙醇提取物能有效抑制HBV的产生，有效最小剂量为10μg/ml[75]。同时虎杖提取物大黄素成分具有抗乙型肝炎病毒（HBV），疱疹性口炎病毒和单纯疱疹病毒（HSV-1、HSV-2）等作用。6 吉林农业大学硕士学位论文第一章前言1.3.2.2抗菌作用目前虎杖提取物抗菌作用研究较全面，该植物的水提取物（1g/ml，粗品药等效物）对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)，大肠杆菌(Escherichiacoli)，伤寒杆菌(Salmonellatyphi)，α链球菌和β链球菌具有广泛的抗菌作用，抑制区分别为1.22cm，1.113cm，1.112cm，1.127cm，0.903cm，0.800cm和0.929cm[76]。甲醇提取物还具有抗变形链球菌和链球菌的抗菌作用，最小抑制浓度（MIC）为0.5-4mg/ml。相关研究报道虎杖乙醇提取物和大黄素可以保护RAW264.7和Hela细胞免受创伤弧菌（V.vulnificus）诱导的细胞毒性作用，还可以抑制创伤弧菌在海水和心浸液中的生长和存活，对创伤弧菌感染的细胞具有显著的保护作用[77]。1.3.2.3抗炎作用炎症可引起机体产生多种疾病，如自身免疫性疾病，神经退行性疾病，心血管疾病及癌症等。相关学者研究表明，虎杖提取物同样在炎症治疗方面具有一定的应用价值。Bralley等人在虎杖乙酸乙酯提取物（TPA）对小鼠耳部炎症的抑制作用研究结果显示PCE以剂量依赖性方式显着降低小鼠耳水肿[78]。HAN等人在关节炎模型中以虎杖提取物（含20％白藜芦醇）以200mg/日剂量处理6周后，TNF-α，IL-6和C-反应蛋白mRNA表达量显着下降[79]。此外，虎杖活性成分大黄素能抑制iNOS，TNF-α，白细胞介素-10，IKB激酶（IKK）-α，IKK-γ等炎症相关基因的表达[80]。1.3.2.4抗癌作用虎杖复方提取物中白藜芦醇和大黄素等成分具有一定的抗癌、抗肿瘤作用。在Lin等人的研究发现该植物的乙醇提取物（0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml和0.8mg/ml）以剂量依赖性方式表现出对A549和H1650细胞的人肺癌细胞具有一定的抗增殖作用[81]。Kimura和Okuda的相关研究显示虎杖提取物中白藜芦醇成分具有抑制肿瘤DNA合成的功能并预防肺中肿瘤生长和转移的作用[82]。在另一项皮下和脑内神经胶质瘤的大鼠实验中，白藜芦醇（腹膜注射40mg/kg/天，历时150天）具有显着的抗肿瘤作用，可抑制肿瘤速度，延长动物存活时间并提高动物存活率[83]。这些机制被认为与其细胞毒性作用，增加的细胞凋亡和抑制血管生成有关。1.3.2.5抗休克作用体外实验中0.5%白藜芦醇可降低以脂多糖（LPS/内毒素）刺激的巨噬细胞上清液中肿瘤坏死因子（TNF）和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（NAG）的表达量[84-86]；体内以10mg/kg/次的剂量治疗用LPS攻击的大鼠中内毒素休克，可显著降低内毒素休克大鼠的多器官损伤[87]。7 吉林农业大学硕士学位论文第一章前言1.3.2.6脂质调节作用在对脂质调节作用方面研究中发现虎杖提取物中白藜芦醇成分可降低高脂血症家兔中的甘油三酯，总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）的水平[88]。Arichi给小鼠灌服白藜芦醇（50mg/kg），发现小鼠肝脏中14C-棕榈酸脂的脂肪生成量比对照低47%[88-89]。1.3.2.7肝保护作用虎杖水提取物具有一定的促进肝细胞并恢复肝功能的作用，Hong等人在2000年发现使用虎杖水提取物（400mg/只/d）治疗肝缺血损伤大鼠，在对其形态学观察中发现虎杖水提取物具有改善损伤肝组织的微循环，抑制白细胞的粘附[90]。同年，Mo和Shao发现白藜芦醇还具有保护肝细胞免受H[91]。最近，2O2诱导的氧化损伤的能力Zhang等人发现白藜芦醇苷（50mg/kg/d，100mg/kg/d）对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤具有显着的肝保护作用，其作用机制可能与其抗氧化应激和抗炎作用有关[92]。1.3.2.8其他药理作用Wang等人在2011年发现虎杖中白藜芦醇成分还具有一定的清除自由基和抗氧化作用，可以保护保护患帕金森病大鼠的多巴胺能神经元[93]。相关研究发现将白藜芦醇灌服给可辐射诱导的小鼠后，发现它可以逆转唾液分泌的减少，恢复唾液淀粉酶和SOD活性，免除唾液腺功能障碍。虎杖提取物白藜芦醇在作为临床放射性治疗恢复药物具有很大的潜力。1.3.3药代动力学虎杖提取物药代动力学大鼠试验中，以白藜芦醇为主要检测成分发现仅在胃部、十二指肠、肝脏和肾脏中被检测出，且含量少，大部分白藜芦醇可以作为代谢物被机体排出。在另一项以高效液相色谱法探究了虎杖中另一主要活性化合物大黄素，结果显示大黄素可随血液迅速流入分布于肝脏内[94]。1.3.4毒理学虎杖在中国传统药草已有数百年的历史，目前该植物的相关毒性和安全性还有待系统深入调查。相关报道在小鼠最大耐受试剂试验中，口服虎杖蒽醌类提取物（9g/kg），未致小鼠死亡，大黄素和白藜芦醇的LD50分别为249.57±34.3mg/kg和100.07±57.3mg/kg。Xu等人在给兔耳静脉和肌肉注射虎杖提取物，凝集反应为（0.39mg/ml），全身性过敏反应或被动性皮肤过敏反应（5.6mg/kg）均无溶血反应[95]。1.3.5虎杖在水产养殖中的应用8 吉林农业大学硕士学位论文第一章前言目前虎杖已经允许作为药物在市场销售，且在水产养殖上也有应用，一般常作常作抗菌剂在渔池泼洒，但在鱼类病毒性疾病的防治中的应用尚未见系统报道。1.4本研究目的与意义锦鲤疱疹病毒致病性强，是一种高传染性并致死的鲤科类病毒，对水产养殖业造成巨大损失且目前没有有效的治疗剂。虎杖为中国传统草药，广泛分布于中国境内，资源庞大且易获得，同时大量文献报道显示虎杖蒽醌提取物具有良好的抗病毒活性。本研究通过体内外试验探究虎杖蒽醌提取物最大安全浓度及抗锦鲤疱疹病毒有效安全剂量。对开发新型抗锦鲤疱疹病毒类药物提供一定的数据支持，为锦鲤疱疹病毒病的药物防治提供新思路。9 吉林农业大学硕士学位论文第二章虎杖蒽醌提取物配制及在CCB细胞最大安全浓度的测定第二章虎杖蒽醌提取物配制及在CCB细胞最大安全浓度的测定2.1材料1.1.1药物样品虎杖提取物由合作单位吉林省药物研究院赠予，经检测虎杖提取物蒽醌纯度达90%以上。1.1.2细胞与毒株锦鲤疱疹病毒吉林株（KHV-CJ）：经本研究室分离鉴定，液氮保存提供使用[96]。普通鲤鱼脑细胞（CCB）由中科院水生生物研究所赠予，本实验室传代并保存。1.1.3主要试剂胎牛血清（FCS）HyCloneL-15Leibovitz培养基HyClone青霉素HyClone链霉素HyClone两性霉素BHyClone利巴韦林（C8H12N4O5,＞98%）SigmaTrypsinSigmaEDTA-2NaSigmaMTTAmresco二甲基亚砜（DMSO）Amresco氯化钠国产分析纯氯化钾国产分析纯碳酸氢钠国产分析纯Na2HPO4·H2O国产分析纯磷酸二氢钠国产分析纯其他常规试剂国产分析纯1.1.4主要试验试剂配制10 吉林农业大学硕士学位论文第二章虎杖蒽醌提取物配制及在CCB细胞最大安全浓度的测定CCB细胞培养相关试验溶液（1）PBS缓冲液（pH7.2）NaCl8.00gNa2HPO4·H2O1.56gKCl0.20gKH2PO40.20g双蒸水定容至1.00L高温高压灭菌，4℃保存。（2）1mol/LNaOHNaOH4.00g双蒸水至100.00mL0.22μm滤菌,分装，4℃保存。（3）CCB消化液Trypsin0.25gEDTA-2Na0.02gPBS缓冲液100.00mL0.22μm滤菌,分装，-20℃保存。（4）5mg/mLMTT溶解液MTT粉末100.00mgPBS缓冲液20.00mL0.22μm滤菌，铝箔纸避光，分装，-20℃保存。（5）L-15细胞培养液：L-15液体培养基包含10%FCS。（6）L-15细胞维持液：L-15液体培养基包含3%FCS的。（7）细胞冻存液：含有30%FCS的L-15培养液中加入10%的细胞用DMSO。1.1.5主要试验仪器及设备MCA-15ACO2细胞培养箱（SANYO，日本）MLS-3780湿热高压灭菌锅（SANYO，日本）MOV-212干热灭菌箱（SANYO，日本）MCV-131BNFCT生物安全柜（SANYO，日本）HYC-90-80℃低温冰箱（Haier，上海）TD52水平离心机（凯达科学仪器有限公司，湖南）11 吉林农业大学硕士学位论文第二章虎杖蒽醌提取物配制及在CCB细胞最大安全浓度的测定IX51倒置显微镜（Olympus，日本）AL104分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，美国）680酶标仪（BIO-RAD，西班牙）Unique-R20多功能超纯水系统（锐思捷公司，上海）细胞培养相关耗材（Corning，美国）2.2方法2.2.1虎杖提取物的制备虎杖中含有的主要物质成份为蒽醌类化合物，其中大黄素为主要成份，其为醇溶性，难溶于水。所以先称取2.0g虎杖提取物粉末溶解与20mL的DMSO中，配制成20mg/ml的母液。充分搅拌待药品完全溶解后使用0.22μm的微孔滤器滤过除菌，常温保存，现用现配。同时阳性对照组选用广谱性抗病毒药物利巴韦林，配制方法同上，4℃保存。2.2.1CCB细胞复苏（1）试验前期准备工作：水浴锅提前预热至37℃，将事先高压灭菌后的离心管、枪头、干热灭菌的玻璃瓶等放入酒精棉球擦拭的工作台中，紫外灯照射（30min）；（2）将冻存在液氮灌内的CCB细胞迅速拿出，用镊子架于冻存管端部放置37℃水浴锅中并以一定频率不断晃动冻存管，约（1-2min）拿出观察解冻情况，待冻存管中冻存液全部解冻，用75%酒精棉球擦拭消毒后，放入超净台内；（3）将冻存管内的全部液体吸出，移入含有20%FCS的L-15的细胞培养瓶中，移液器将液体轻柔混匀，放置于25℃、5%CO2、细胞培养箱中；（4）12h后倒置显微镜观察CCB细胞贴壁情况，弃掉原有培养液，重新加入5mL新的L-15细胞培养液。2.2.3CCB细胞传代（1）试验前期准备工作：紫外灯照射超净台（30min），分装好的小剂量常用10%FCSL-15细胞培养液置于细胞培养箱内预热；（2）待CCB细胞长满至细胞瓶底部80%时可进行细胞传代，弃去培养液，用5mLPBS清洗细胞表面两次，洗去残留血清及未贴壁死细胞。加入1mL细胞消化液，注意不要让消化液直接冲洗到细胞，轻柔晃动细胞瓶约（1-2min），当观察到细胞瓶底部有雾化情况，竖起细胞瓶有细胞下滑现象，终止消化吸出细胞消化液。65℃反应水浴（5min），冰上放置（2min）；（3）在细胞瓶内加入预热好的10%FCSL-15细胞培养液10mL，移液器反复抽12 吉林农业大学硕士学位论文第二章虎杖蒽醌提取物配制及在CCB细胞最大安全浓度的测定吸吹打细胞瓶底部，将细胞悬液吸出5mL，转移至一个新的细胞培养瓶中。置于同样条件的细胞培养箱中培养，待CCB细胞重新长满至细胞瓶底部80%时，进行下一次传代。2.2.4CCB细胞冻存（1）试验前期准备工作：酒精棉球擦拭工作台，冻存的前一天给细胞进行换液，洗去老化脱落细胞。观察细胞生长状态，选择细胞形态良好，饱满生长状态良好的细胞进行冻存；（2）细胞冻存液的配制：L-15液体培养基：FCS：DMSO=6:3:1制成混合液（注：现用现配）；（3）选取状态良好（对数生长期）细胞，倒置显微镜观察，长满至细胞瓶底部90%时，加入1mlCCB消化液进行消化，移液器吸取CCB细胞置EP管内，1000r/min离心（6min），弃去上清液，加入冻存液混匀，分装至灭菌的冻存管中，标记细胞种类，冻存日期；（4）程序性降温：4℃，1h，-20℃（30min），后转入-80℃过夜，最后转入-196℃液氮罐中长期保持。2.2.5CCB细胞计数（1）试验前期准备工作：实验前期准备工作：酒精棉球擦拭消毒细胞计数板和盖玻片，在用擦镜纸将表面擦拭干净，放置超净台内，紫外照射（30min），备用；（2）移液器吸取10μLCCB细胞悬液（尽量混匀，避免产生细胞团），缓慢加入中央计数池内，静置片刻，避免在细胞计数板内产生气泡，影响计数，更不要让CCB细胞悬液流入两侧凹槽内；（3）倒置显微镜进行细胞计数，计数细胞计数板四角的4大方格细胞数量，计数原则：数上不数下，数左不数右（注：重叠细胞团，记为一个细胞）；（4）细胞计数公式：细胞数/ml=4大方格细胞总数/4×104。2.2.6KHV病毒扩增（1）试验前期准备工作：选择稳定传代细胞状态良好的CCB细胞，紫外照射超净台30min，细胞培养箱调至22℃；（2）当CCB细胞融合至80%-90%时，弃去细胞瓶内原有细胞培养液，并用PBS轻缓冲洗两次，洗去表面残留血清及死细胞（血清会影响病毒吸附入侵细胞的能力），接种KHV；（3）吸取KHV病毒原液800μL，加入到50m2细胞培养瓶中，轻缓平移晃动几13 吉林农业大学硕士学位论文第二章虎杖蒽醌提取物配制及在CCB细胞最大安全浓度的测定次，使病毒原液充分与细胞表面接触，放入22℃低温细胞培养箱内，每隔30min晃动细胞瓶一次，培养1.5-2h；（4）从低温培养箱内取出细胞瓶，并将培养箱温度重新调回25℃。弃去病毒液，加入5mL细胞维持液，同时设置细胞阴性对照组（最好为同批“一传二”的传代细胞）。放入25℃，5%CO2培养箱内继续培养；（5）每日倒置显微镜观察并记录细胞病变效应（CPE）：约5-8d可观察到75%细胞体积变大和形成空泡，待细胞变圆并有向下脱落的情况时，将细胞从细胞瓶底部吹打下来，全部收集到离心管内，-20℃冰箱反复冻融三次，释放病毒颗粒；（6）3000r/min离心（8min），保留上清液，弃去底部细胞碎片，分装冻存-80℃冰箱内。2.2.7TCID50方法测定KHV病毒滴度（1）试验前期准备工作：96孔细胞培养板放入超净台内紫外照射消毒，KHV病毒原液从-80℃冰箱内取出，放置4℃内融化；（2）准备CCB细胞：以每孔100μL细胞浓度2×105个/mL，加入96孔细胞培养板内，培养至每孔底部75%-85%（注：为避免“边缘效应”干扰实验，四周空加入100μLPBS）；（3）准备病毒稀释液：准备10个2mL灭菌EP管，标记1-10序号。病毒原液作连续10倍倍比稀释（10-1，10-2，…，10-10），1-10号EP内管各加入900μL无FCS的L-15液体培养基，吸取100μL的KHV病毒原液加至1号EP管内，移液器反复抽吸混匀后吸取100μL混合液加入2号管内，吸取100μL2号EP管混合液加至3号EP管内，按照上述操作，一直加至10号EP管；（4）使用排枪移去96孔细胞培养板内旧CCB细胞培养液，PBS冲洗一次后吸去PBS；（5）KHV病毒稀释液每孔100μL按稀释倍数逐次加入到96孔培养板中，并设置一列空白对照组，一列阴性正常细胞对照组；（6）96孔细胞培养办放入25℃，5%CO2培养箱内吸附（1-2h），弃掉细胞培养板内所有液体，重新在每孔中加入含3%FCSL-15细胞维持液，细胞培养箱内继续培养，观察每日病变情况，可根据细胞正常状态适当换液；（7）约5-8d可观察到CCB细胞病变效应。设置细胞病变5级标准：一、细胞正常，没有病变；二、每孔内病变面积在10%以内；三、每孔病变面积10%-40%；四、每孔病变面积40%-70%；五、每孔病变面积70%-100%，每日做好记录；（8）参照Reed-Muench两氏法计算TCID50。14 吉林农业大学硕士学位论文第二章虎杖蒽醌提取物配制及在CCB细胞最大安全浓度的测定2.2.8MTT法检测虎杖蒽醌提取物对CCB细胞毒性作用（1）试验前期准备工作：酶联免疫检测仪吸光度调至570nm，选择对数生长期、细胞形态良好的CCB细胞，MTT（5mg/mL）-20℃取出，避光常温融化；（2）通过细胞计数制备10mL，浓度为2×105个/ml细胞悬液，100μL/孔加入到96孔细胞培养板中，25℃、5%CO2的恒温细胞培养箱培养（24h），倒置显微镜观察细胞贴壁，增殖情况（注：为避免“边缘效应”干扰实验，四周空加入100μLPBS）；（3）配制实验用不同浓度的虎杖蒽醌提取物：用L-15细胞培养液将20mg/ml虎杖蒽醌提取物药物储备液倍比稀释为阶梯浓度药物：250μg/ml，125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.63μg/ml、7.28μg/ml、3.91μg/ml和1.96μg/ml（注：要预先查阅大量文献进行预实验，根据自己的初筛结果缩小浓度范围）；（4）CCB细胞铺满底部80%以上时，弃去细胞培养液，PBS冲洗细胞表面一次；（5）排枪加入事先配制好的系列梯度浓度虎杖提取物，每孔100μL，每个稀释浓度重复5个孔，设置一组正常细胞对照组（加100μL细胞维持液）和空白对照组（无细胞，100μL细胞维持液），按顺序标记，25℃、5%CO2的细胞培养箱培养；（6）培养48h后取出96孔细胞培养板，在药物梯度组、正常细胞对照组和空白对照组中各加入10μL的MTT（5mg/ml），放置25℃、5%CO2的细胞培养箱中继续孵育（4h）；（7）取出96细胞培养板，终止培养，弃去孔内所有液体（注：不要有残留，以免影响试验结果），100μL/孔DMSO，低速摇床震荡（10min）也可细胞培养箱内放置（30min），保证紫色结晶物完全溶解；（8）比色：空白孔进行调零，酶标仪检测570nm吸光值，计算各组平均OD值，为避免实验失误减少误差，本实验应重复3次以上；（9）虎杖蒽醌提取物最大安全范围可由细胞存活率计算公式得出，细胞存活率（%）=（实验孔OD平均值/对照组OD平均值）×100%，并计算50%细胞死亡的药物毒性剂量（CC50）。（10）阳性药物对照选用广谱性抗病毒药物利巴韦林浓度梯度为4000μg/ml、2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml和15.63μg/ml，实验方法同上。注：所有实验均重复三次以上。2.2.9统计学方法分析收集整理实验数据，采用SPSS19.0统计学分析软件进行数据分析。15 吉林农业大学硕士学位论文第二章虎杖蒽醌提取物配制及在CCB细胞最大安全浓度的测定2.3结果3.3.1CCB细胞培养CCB细胞与其他易贴壁细胞系生长状态相同，成纤维样，良好状态的CCB细胞呈梭形或椭圆形，形态饱满，均匀单层的完全贴壁于细胞瓶底部。图1.1正常CCB细胞（×100）Fig.1.1NormalCCBcells（×100）3.3.2KHV扩增将KHV病毒液接种于融合75%-85%CCB细胞上，22℃、5%CO2，孵育（2h）后，细胞维持液持续培养5-7d，可见明显CPE。图1.2KHV感染引起CCB细胞病变（×100）Fig.1.2CCBcellswithcytopathiceffectafterKHV（×100）16 吉林农业大学硕士学位论文第二章虎杖蒽醌提取物配制及在CCB细胞最大安全浓度的测定3.3.3KHV病毒效价测定结果表1-1KHVTCID50的测定Table1-1TitrationofKHVTCID50稀释CPE孔数无CPE孔数总CPE孔数总无CPE孔数累计CPE百分倍数比%10-180490100（49/49）10-280410100（41/41）10-380330100（33/33）10-480250100（25/25）10-58116194.1(16/17)10-6539375（9/12）10-7354833.3（4/12）10-82621511.8（2/17）10-9080230（0/23）10-10080310（0/34）阴性80对照空白08000对照17 吉林农业大学硕士学位论文第二章虎杖蒽醌提取物配制及在CCB细胞最大安全浓度的测定参照Reed-Muench方法测定KHVTCID50（1）距离比例=（稀释组内最小50%以上病变率百分比—50%）/（稀释组内最小50%以上病变率百分比—稀释组内最大50%以下病变率百分比）=（75%—50%）/（75%—33.3%）=0.60（2）lgTCID50KHV=距离比例×稀释度对数间差+稀释组内最小50%以上病变率的稀释度对数=0.60×（-1）+（-6）=-6.4（3）TCID50-6.4KHV=10/100μl（4）病毒感染复数（MOI）KHV=0.7×TCID503.3.4虎杖蒽醌提取物对CCB细胞毒性作用虎杖蒽醌提取物稀释浓度分别为1.96μg/ml、3.91μg/ml、7.28μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml处理CCB细胞，倒置显微镜镜下观察（48h），可明显的看出虎杖蒽醌提取物浓度越高对CCB细胞毒性作用越严重，细胞活力随着药物浓度的增加而降低，表现为细胞形态发生变化，聚缩变圆，从底部脱落，甚至部分细胞破碎裂解,游离在细胞培养液上清液中。而虎杖蒽醌提取物浓度≤31.25μg/mL基本不会造成CCB细胞形态或细胞密度的明显变化，在细胞毒性试验中被认定为最大无毒浓度。18 吉林农业大学硕士学位论文第二章虎杖蒽醌提取物配制及在CCB细胞最大安全浓度的测定图1.3不同虎杖提取物浓度对CCB细胞的毒性（A1-8）（×100）Fig.1.3ToxicityofdifferentconcentrationsofanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatumtoCCBcells（A1-8）（×100）回收试验CCB细胞通过MTT法检测CCB存活率，数据整理为表1-2、1-3，并根据表1-2、1-3绘制折线图（图1.4）。由数据及折线图发现，虎杖蒽醌提取物和利巴韦林均存在一定的细胞毒性，且随着虎杖蒽醌提取物药物浓度和阳性对照药物利巴韦林浓度的升高细胞毒性增强。虎杖蒽醌提取物药物浓度和阳性对照药物利巴韦林在CCB细胞中的CC50分别为72.67±2.12μg/ml和2638.79±2.36μg/ml。同时虎杖蒽醌提取物在低浓度范围内细胞毒性基本为零，且存在一定的促进CCB细胞增殖的情况。表1-2不同虎杖提取物浓度对CCB细胞的毒性Table1-2ToxicityofdifferentconcentrationsofanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatumtoCCBcells19 吉林农业大学硕士学位论文第二章虎杖蒽醌提取物配制及在CCB细胞最大安全浓度的测定不同虎杖蒽醌提取物浓度的细胞存活率虎杖浓度（μg/ml）25012562.531.2515.637.283.911.968.21±15.03±58.16±80.98±87.64±94.06±99.49±102.37±细胞存活率（%）1.562.882.521.933.212.032.783.44表1-3不同利巴韦林浓度对CCB细胞的毒性Table1-3ToxicityofdifferentconcentrationsofribavirintoCCcells不同利巴韦林浓度的细胞存活率利巴韦林浓度40002000100050025012562.531.2515.63（μg/ml）细胞存活率36.53±65.20±78.03±84.47±90.31±94.01±97.36±98.03±98.67±（%）2.472.622.312.552.772.111.781.591.33图1.4虎杖蒽醌提取物（A）和阳性对照物利巴韦林（B）对CCB细胞活力的影响Fig1.4CCBeffectofanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatum(A)andribavirin(B)oncellviabilityofCCBcells20 吉林农业大学硕士学位论文第二章虎杖蒽醌提取物配制及在CCB细胞最大安全浓度的测定2.4讨论在当今水产养殖业病毒性疾病成为阻碍产业增收增效可持续性健康发展的最大难题[95]。鲤科鱼类的养殖在水产养殖业占有很大比重，其中鲤鱼是中国食用鱼类中极其重要的物种，素有四大家鱼之一的美称。同时，在全球观赏鱼范围内锦鲤具有极高观赏价值和经济价值。随着养殖环境的恶化，各种传染病，特别是KHVD已经蔓延开来[96]。目前，鲤科鱼类在整个生命时期均可被KHV感染，且传染性极强死亡率高，已成为制约鲤养殖业可持续发展的最重要因素之一。目前，KHVD尚无有效治疗药剂，且相关研制疫苗均存在一定问题，尚无法投入到生产应用中。使用中草药治疗疾病在中国具有悠久是历史，且资源丰富，毒性低，具有极高的应用价值。因此，从中草药中筛选出抗病毒药物是极其有益的。虎杖于1997年被列入《中华人民共和国药典》具有安全性高，毒副作用小，药理作用丰富等优点，具有极高的开发利用前景。多项研究证实虎杖蒽醌提取物对单纯疱疹病毒，乙型肝炎病毒，严重急性呼吸系统综合症（SASR）冠状病毒等多种病毒，均具有一定的抑制效果。但目前中草药虎杖在水产病毒性疾病治疗方面的应用还不常见，相关科研进展也相对于哺乳动物研究较少。本研究首先使用CCB对KHV进行培养扩增，并确定KHVTCID50，然后使用MTT法测定虎杖蒽醌提取物及利巴韦林有效安全药物浓度范围为后续实验做准备。实验结果表明虎杖蒽醌提取及利巴韦林毒性作用与剂量依赖有关，浓度越大，药物毒性越强。虎杖蒽醌提取物浓度在31.25μg/ml时，细胞存活率达80%以上。在3.91μg/ml时基本不错在细胞毒性，且在15.63μg/ml时均在一定的促进CCB增殖生长的作用。同时相关镜检观察显示，在虎杖蒽醌提取物浓度为31.25μg/ml及以下浓度范围内时，细胞存活健康，生长正常，形态无变化。广谱性抗病毒药物利巴韦林也存在一定的细胞毒性，与虎杖蒽醌提取物相比毒性较低，在浓度为500μg/ml时，细胞存活率达80%以上。但低浓度时未出现促进CCB细胞生长的情况。与虎杖蒽醌提取物相似，药物毒性呈剂量依赖。2.5小结（1）在CCB细胞上成功培养并扩增KHV，并测定TCID50-6.54KHV=10/100μL；（2）虎杖蒽醌提取物相对药物安全浓度范围为31.25μg/ml以内；（3）利巴韦林相对药物安全浓度范围为500μg/ml以内。21 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究3.1材料3.1.1药物样品虎杖蒽醌提取物由合作单位吉林省药物研究院赠予，经检测虎杖提取物蒽醌纯度达90%以上。在试验开始前参照2.2.1方法将虎杖蒽醌提取物配制成20mg/ml，保存备用。3.1.2细胞与病毒普通鲤鱼脑细胞（CCB）由中科院水生生物研究所赠予，本实验室传代并保存。锦鲤疱疹病毒吉林毒株（KHV-CJ）：由本实验室分离鉴定，保存提供[96]。3.1.3试验动物吉林省某水库购置300尾，体长约10-12cm，体重120g-150g健康鲤鱼。试验前在25℃恒温充氧水族箱内暂养2-3周，使试验鲤鱼适应新环境（注：所用水族箱，加热棒等饲养仪器均要消毒后使用，每天投喂两次饲料）3.1.4主要试剂胎牛血清（FCS）HyCloneL-15Leibovitz培养基HyClone青霉素HyClone链霉素HyClone两性霉素BHyCloneTrypsinSigmaEDTA-2NaSigmaMTTAmresco二甲基亚砜（DMSO）Amresco氯化钠国产分析纯氯化钾国产分析纯碳酸氢钠国产分析纯焦磷酸二乙酯（DEPC）北京鼎国公司TRIzol®ReagentInvitrogen氯仿北京化工厂22 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究无水乙醇北京化工厂异丙醇北京化工厂100bpLadderTaKaRaDL2000MarkerTaKaRa反转录酶TaKaRaExTaqDNA聚合酶TaKaRadNTPTaKaRa10×ExTaqBufferTaKaRa其他常规试剂国产分析纯3.1.5试验试剂配制（1）PBS缓冲溶液（pH7.2）NaCl8.00gNa2HPO4·H2O1.56gKCl0.20gKH2PO40.20g双蒸水定容至1.00L高温高压除菌，4℃保存。（2）1mol/LNaOHNaOH4.00g双蒸水100.00mL0.22μm滤菌，分装，4℃保存。（3）CCB细胞消化液Trypsin0.25gEDTA-2Na0.02gPBS缓冲液100.00mL0.22μm滤菌,分装，-20℃保存。（4）5mg/mLMTT溶解液MTT粉末100.00mgPBS缓冲液20.00mL0.22μm滤菌，铝箔纸避光，分装，-20℃保存。（5）L-15细胞培养液：L-15液体培养基包含10%FCS。（6）L-15细胞维持液：L-15液体培养基包含3%FCS。23 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究（7）细胞冻存液：L-15培养液包含30%FCS中加入10%的细胞用DMSO。（8）50×TAEHAc57.10mLTris242.00g0.5mol/LEDTA(pH=8.0)100.00mL双蒸水定容1000.00mL室温密封保存（9）TE0.5mol/LEDTA(pH=8.0)200.00uL1mol/LTris-HCl1000.00uL双蒸水定容100.00mL高压灭菌4℃保存备用3.1.6主要仪器DK-8D电热恒温水浴锅（精宏实验设备有限公司，上海）PCR扩增仪（EppendorfAG，西班牙）WH-2漩涡振荡器（海龙试验仪器厂，北京）超净工作台（新苗医疗器械制造有限公司，上海）TG16B台式高速离心机（凯达科学仪器有限公司，湖南）AL104分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，美国)酶标仪（BIO-RAD，西班牙)DYY-10C电泳仪（六一仪器厂，北京）Gene凝胶成像分析系统（Syngene，美国）MLS-3780湿热高压灭菌锅（SANYO，日本）MCA-15ACO2细胞培养箱（SANYO，日本）MOV-212干热箱（SANYO，日本）3.2方法3.2.1虎杖蒽醌提取物体外抗KHV病毒活性研究3.2.1.1不同浓度虎杖蒽醌提取物对KHV病毒复制抑制情况（1）试验前期准备工作：96孔细胞培养板放入超净台内紫外照射消毒，KHV病毒原液从-80℃冰箱内去除，放置4℃内融化；（2）将2×105个/mLCCB细胞常规接种到96孔板内，长满底部75%-85%时弃去24 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究96孔板内原有细胞培养液，PBS冲洗两次；（3）每孔加入100TCID50/mL病毒液100μL，22℃、5%CO2细胞培养箱病毒孵育2h同样设有空白对照组，细胞对照组；（4）弃去病毒液，PBS冲洗两次，加入不同稀释浓度的虎杖提取物溶液（1.96μg/ml-31.25μg/ml）100μL，26℃、5%CO2的细胞培养箱持续培养；（5）约2-5天，直至病毒对照组典型的CPE出现为止，每孔加入10μL的MTT（5mg/ml）继续孵育（4h），弃去液体，加入DMSO，100μL，低速震荡（10min），上述MTT法测定各孔OD值，记录数据；计算抑制病毒百分之五十有效药物剂量（IC50），评估治疗指数（TI）=CC50/IC50；（6）阳性对照组利巴韦林操作方法同上。3.2.1.2不同浓度虎杖提取物药物溶液对KHV病毒直接杀灭作用测定（1）试验前期准备工作：96孔细胞培养板放入超净台内紫外照射消毒，KHV病毒原液从-80℃冰箱内去除，放置4℃内融化；（2）在96孔细胞培养板内加入100TCID50/ml的KHV病毒液100μL，并加入等体积的倍比稀释（1.96-31.25μg/ml）的虎杖提取物药物溶液（每组5个重复），同样设有纯病毒液对照组（100μL+100μLL-15细胞培养液）及空白对照组（200μLL-15），在4℃冰箱内共孵育（4h）；（3）4℃冰箱内取出96孔细胞培养板，将细胞培养板内的病毒液、病毒药物混合液及空白对照组L-15细胞培养液，逐列加入到每孔含融合75%-85%的CCB细胞96孔细胞培养板中（注：CCB细胞培养板内的原有液体弃去并PBS冲洗一次），25℃、5%CO2的细胞培养箱中吸附（2h）（注：为避免“边缘效应”干扰实验，四周空加入100μLPBS）；（4）弃去96细胞培养板内的所有液体，PBS小心清洗单层细胞一次，加入新的细胞维持液，25℃、5%CO2的细胞培养箱中持续培养；（5）倒置显微镜每日观察CPE并拍照记录。直至病毒对照组典型的CPE出现为止，每孔加入10μL的MTT（5mg/mL）继续孵育（4h），弃去液体，加入DMSO，100μL，低速震荡（10min），上述MTT法测定各孔OD值，记录数据；（6）计算不同浓度药物溶液对KHV的抑制率%=（实验组药物OD平均值-病毒对照组OD平均值）/（正常细胞对照组OD平均值-病毒对照组OD平均值）×100%。3.2.1.3不同浓度虎杖蒽醌提取物药物溶液对KHV病毒感染前的预处理（1）试验前期准备工作：96孔细胞培养板放入超净台内紫外照射消毒，KHV病毒原液从-80℃冰箱内去除，放置4℃内融化；（2）常规96孔细胞培养板培养CCB细胞（2×105个/ml）每孔100μL，待细胞25 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究融合75%-85%时，弃去细胞培养液，PBS重新1次，去除残留血清及死细胞（注：为避免“边缘效应”干扰实验，四周空加入100μLPBS）；（3）每孔加入不同浓度虎杖提取物药物溶液100μL，同样设置空白对照组（无细胞+100μlL-15）和细胞对照组（100μLL-15），25℃、5%CO2的细胞培养箱中药物孵育2h；（4）排枪吸去96孔板内所有液体，PBS冲洗一次，重新每孔加入100TCID50/ml病毒液100μL，细胞低温培养22℃，KHV吸附（2h）；（5）排枪吸去病毒液，PBS冲洗一次，每孔重新加入细胞维持液100μL，25℃、5%CO2的细胞培养箱持续培养；（6）约5-7天，直至典型的CPE出现为止，倒置显微镜拍照记录，CPE镜检方法评估虎杖蒽醌提取物对KHV病毒抑制效果。3.2.2RT-PCR探究虎杖提取物抗病毒机制（1）试验前期准备工作：24孔细胞培养板放入超净台内紫外照射消毒，KHV病毒原液从-80℃冰箱内去除，放置4℃内融化；（2）4×105个/mLCCB细胞200μL/孔平铺于24孔板内，26℃、5%CO2的细胞培养箱中培养（约24h），待长满底部75%-85%时弃去24孔板内原有细胞培养液，PBS冲洗两次；（3）每孔加入KHV病毒液，200μL，22℃、5%CO2细胞培养箱病毒孵育（2h）同样设有阴性KHV病毒对照组（选用两种KHV病毒滴度：低浓度0.1TCID50，高浓度1TCID50）；（3）弃去病毒液，PBS冲洗两次，加入最佳虎杖蒽醌提取物药物浓度200μL，26℃、5%CO2的细胞培养箱持续培养，直至病毒对照组典型的CPE出现为止，回收CCB细胞；（4）阳性对照组利巴韦林药物处理浓度选择31.25μg/ml，试验操作方法同上。3.2.2.1TRIzol法提CCB细胞总RNA（1）试验前期准备工作：使用DEPC水提前处理相关试验材料（例如：离心管，枪头等），取出RNase酶的干扰。酒精棉球蘸取DEPC水对超净工作台桌面进行全面擦拭，并紫外灯照射（30min）。EP管分装的异丙醇置于-20℃预冷，DEPC处理水将无水乙醇配制为75%浓度置于-20℃预冷。注：DEPC有致癌性，试验时注意做好保护措施；（2）回收2.4.1试验部分CCB细胞、IC50利巴韦林阳性对照组、阴性病毒对照组CCB细胞，分别置于事先做好标记的1.5mLEP管内，使用移液器加入200μL氯仿，26 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究上下颠倒充分混匀；（3）4℃、12000r/min离心（15min），注：从离心机取出时注意动作轻缓，避免摇晃；（4）移液器吸出上层水相置于新的EP管中加入等量体积的预冷的异丙醇，轻柔翻转混匀，冰盒放置（10min）；（5）4℃、12000r/min离心（10min），RNA沉淀；移除上清，保留沉淀；（6）加入10000μL事前用DEPC处理水配好预冷的75%乙醇，微量移液器抽吸吹打，洗涤沉淀；（7）4℃、8000r/min离心（5min），移除上清；（8）室温晾干约（3-5min），在晾干的EP管中加入30μLDEPC处理水溶解沉淀，置于-80℃保存。3.2.2.2反转录反应（1）试验前期准备工作：水浴锅温度分别调至30℃、42℃、65℃、70℃，超净工作台紫外灯照射（30min），在工作台内构建cDNA反转录体系100μL；DEPC处理水30μLdNTP5μLoligadT5μL总RNA10μL水浴65℃（5min），冰水混合物（2min）DEPC处理水25μLRiboLockRNasaInhibitor2.5μLRevertAidReverseTranscriptase2.5μL5×ReactioBuffer20μL水浴30℃（10min），水浴42℃（30min），水浴70℃（15min），冰上预冷，-20℃保存3.2.2.3KHV生命周期相关转录因子的检测选择（表2-1）寡核苷酸用作引物以鉴定KHVmRNAs和KHV转录物的存在，将下表引物序列送往上海生工生物有限公司进行合成。合成后的引物进行PCR扩增，扩增体系为25μL，无菌去离子水18.3μL、10×ExBuffer2.5μL、dNTP2μL、cDNA1μL、上游引物，下游引物各0.5μL、ExTaq0.2μL。注：ExTaq酶易降解，最后加入，在冰盒上操作。KHV目标基因（18S，TF，TK，GP，MCP，MP）PCR反应条件：35个循环体27 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究系，预变性95℃（5min），变性94℃（30s），PCR退火温度（58，58，65，65，63，58）℃（45s）、延伸72℃（1min）；后延伸72℃（10min）。反应结束后产物保存于4℃1%琼脂凝胶电泳分析PCR扩增结果，电泳后，在UV成像仪上检查凝胶并照相。表3-1用于RT-PCR的引物序列Table3-1SequencesofprimersforRT-PCR，，表达KHV引物名称引物序列5-3PCR产物PCR退周期目标基因大小（bp）火温度（℃）18S[97]18S-FCCTGTCGCCGCTGAATACC1805818S-RTCGCTTTCGTCCGTCTTGC即刻早期TF[98-99]ORF-3L/R-FAGAGGATGCTGGATGGTCAG20158（IE）ORF-3L/R-RGGTTCATGGTGCTCTCCTGT即刻早期TK[98-99]ORF55-FGGATCCATGGCTATGCTGGAACTGGT65065（IE）ORF55-RGGATCCGGCGCACCCAGTAGATTATG即刻早期GP[98-99]ORF56-FGGATCCCCCGTGTGTCCGTACTTTGT20065（IE）ORF56-RGGATCCCTCCGACCTGAATTGGTCAG早期（E）MCP[98-99]ORF92-FGGATCCCCAGGCGTACTTCATGTCCT22063ORF92-RGGATCCACGATGGGCACCAACTTTAG[98-99]50758晚期（L）MPORF114-FTACTCAGGCTCGTCATGTGGORF114-RAGATGAAGGTGTGGGACAGG3.2.3虎杖蒽醌提取物对KHV感染鲤鱼的保护效果为避免所购鲤鱼存在携带KHV的情况，在攻毒试验前对试验鲤鱼模型进行KHV检测。3.2.3.1试验鲤鱼基因组提取（1）试验前期准备工作：在300尾试验鲤鱼中随机选取10尾放置实验室养殖桶内，研钵提前置于-80℃预冷，水浴锅温度调至56℃，4℃冰箱内保存的Tris饱和酚置28 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究于室温，所用枪头，EP管提前高压灭菌；（2）处死试验鲤鱼，解剖鲤鱼用灭菌镊子摘取肾部组织，生理盐水冲洗后，置于预冷研钵内，反复研磨至粉末状后装入EP管内；（3）移液器分别吸取480μL裂解缓冲液和20μL蛋白酶K加入EP管内抽吸混匀，放置于56℃水浴锅内，间歇颠倒混匀（2h/次）；（4）（6h）后取出待恢复至室温后，移液器加入500μLTris饱和酚，轻缓翻转（5min），12000r/min离心（10min），吸取上清液至新的EP管内；（5）等体积加入24氯仿：1异戊醇，轻缓翻转（5min），12000r/min离心（10min），吸取上清液至新的EP管内；（6）加入3mol/L的NaAc（原上清液1/10体积）和-20℃冰箱内无水乙醇（原上清液2.5倍体积），4℃冰箱内放置（5h），12000r/min离心（10min），保留底部沉淀；（7）移液器吸取1000μL，-20℃70%乙醇，轻缓冲洗底部沉淀和管壁四周，12000r/min离心（5min），保留底部沉淀，室温干燥；（8）加入30μL具有RNaseA酶的TE，置于冰箱-20℃保存。3.2.3.2使用PCR方法检测样品以上文提取DNA为模版，本实验室设计并保存的锦鲤疱疹病毒ORF81为引物，进行PCR扩增检测，同时设KHV阳性对照。PCR扩增体系：25μL无菌ddH2O19.2μL10×ExBuffer2μLdNTP1.5μLDNA模板1.5μL引物P1，P2各0.5μLExTaq聚合酶0.3μL反应程序设置：95℃预变性（5min），94℃变性（40s），59.3℃退火（30s），72℃延伸（1min），72℃后延伸（10min），35个体系。反应完成后1%凝胶电泳检测成像。3.2.3.3鲤鱼分组及试验剂量确定PCR检测结果呈阴性后，将试验鱼随机分为A、B、C、D、E、F、G7组，每组30尾鲤鱼，根据体外细胞试验最佳安全浓度为31.25μg/ml，推测实验动物剂量范围：A组1g/kg虎杖蒽醌提取物灌服组，B组为1.5g/kg虎杖蒽醌提取物灌服组，C组为229 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究g/kg虎杖蒽醌提取物灌服组，D组2.5g/kg虎杖蒽醌提取物灌服组，E组3g/kg虎杖蒽醌提取物灌服组，F组为阳性对照组（KHV），G组为空白对照组（L-15）。3.2.3.4虎杖蒽醌提取物处理组安全性检测将试验鱼随机分为A、B、C、D、E、F、G7组，每组10尾鲤鱼，按3.2.3.3所设剂量组进行试验，固定时间早晚灌服2次，连续灌服5天，并持续观察15天，记录鲤鱼进食情况、游动情况和存活数量。3.2.3.5人工感染试验组（A、B、C、D、E）和阳性对照组（F）按强毒株（TCID-6.7550=10）腹腔注射0.4mL进行攻毒，空白对照组（G）注射同等剂量的无菌L-15细胞培养基。3.2.3.6用药方法试验组（A、B、C、D、E）和阳性对照组出现症状后,试验组按上述剂量进行,灌胃,固定时间早晚灌服2次，连续灌服5天，并持续观察15天，统计死亡率和死亡时间。3.2.4统计学方法分析收集整理实验数据，采用SPSS19.0统计学分析软件进行数据分析。3.3结果3.3.1虎杖蒽醌提取物体外抗KHV病毒活性研究结果3.3.1.1不同浓度虎杖蒽醌提取物对KHV病毒复制抑制情况将100TCID50KHV预先感染CCB细胞2h后，移除病毒液并PBS洗涤两次后加入倍比稀释的（1.96-31.25μg/ml）虎杖提取物药物溶液或利巴韦林（15.63-500μg/ml）共孵育。通过MTT法测定每种稀释液的抗病毒活性。结果（图3.1）显示虎杖蒽醌提取物药物浓度以剂量依赖方式抑制KHV病毒复制，随着虎杖蒽醌提取物浓度的增加抑制KHV病毒复制的能力就越强，当浓度为31.25μg/ml时达到最大抑制率78.63±5.47%（见图3.1）。30 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究图3.1虎杖蒽醌提取物（A）和利巴韦林（B）对CCB细胞中KHV的抗病毒作用Fig.3.1AntiviraleffectsofanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatum(A)andribavirin(B)againstKHVinCCBcells虎杖蒽醌提取物IC50=13.67±0.47μg/ml，TI（Pc）=（72.67±2.12μg/ml）/（13.67±0.47μg/ml）=5.48±0.49；阳性对照药物利巴韦林IC50=492.15±2.13μg/ml，TI（R）=（2638.79±2.36μg/ml）/（492.15±2.13μg/ml）=5.36±0.03，虎杖蒽醌提取物的药物治疗指数与阳性对照药物差异不显著，表明虎杖蒽醌提取物抗KHV活性与阳性对照药物利巴韦林相似（见表3-2）。表3-2虎杖蒽醌提取物和利巴韦林的IC50和TITable3-2TheCC50,IC50andTIofthedrugs药品IC50μg/mlTI虎杖13.67±0.475.48±0.49利巴韦林492.15±2.135.36±0.033.3.1.2不同浓度虎杖蒽醌提取物药对KHV病毒直接杀灭作用为了检测虎杖蒽醌提取物是否具有直接杀灭KHV病毒粒子的能力，将不同浓度的虎杖蒽醌提取物预先与KHV病毒共孵育，然后侵染CCB细胞。MTT法检测结果显示各浓度虎杖蒽醌提取物均具有一定的直接杀灭KHV病毒粒子的能力，浓度为31.25μg/ml时具有最高KHV病毒抑制率32.21%（见表3-3）。31 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究表3-3不同浓度虎杖蒽醌提取物的KHV病毒抑制率（%）Table3-3TheKHVinhibitoryrateofanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatum不同浓度虎杖蒽醌提取物的KHV病毒抑制率虎杖浓度（μg/ml）31.2515.637.283.911.960细胞存活率（%）32.21±1.2325.31±2.6112.43±1.0310.11±2.586.21±1.542.67±1.793.3.1.3不同浓度虎杖蒽醌提取物药物对KHV病毒感染前的预处理为探究预先给药孵育的CCB细胞是否具有预防KHV病毒吸附，使CCB细胞产生抑制KHV病毒吸附的能力，CPE镜检发现药物预先孵育组，与阴性KHV病毒对照组无明显差异，且不同药物浓度梯度的虎杖蒽醌提取物之间也无明显差异。没有观察到明显的抗CCB病毒吸附的效果，且虎杖蒽醌提取物药物预处理组CPE产生的时间与阴性KHV病毒对照组CPE产生时间相仿，未产生延迟CCB产生CPE的现象。下图为以虎杖蒽醌提取物药物最大安全浓度31.25μg/ml为例，记录的CCB细胞病变时间图与阴性对照CCB细胞病变图（图3.2）32 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究图3.2A：阴性对照组感染KHVCCB细胞（A1：1d，A2：3d，A3：6d，A4：9d，A5：11d）（×100）；B：试验组31.25μg/ml虎杖蒽醌提取物CCB细胞（A1：1d，A2：3d，A3：6d，A4：9d，A5：11d）（×100）Fig.3.2A:CytopathologyofCCBcellsinfectedwithKHV（A1:1d，A2:3d，A3:6d，A4:9d，A5:11d）(×100);B:AgainstKHVof31.25μg/mlanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatum（A1:1d,A2:3d,A3:6d,A4:9d,A5:11d）(×100)3.3.2RT-PCR检测虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒RT-PCR结果下图3.3所见，浓度为31.25μg/ml的广谱性抗病毒药物利巴韦林处33 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究理组RT-PCR显示：KHV生命周期相关基因（ORF56，ORF92和ORF114）的不同时期：即刻早期（IE），早期（E）和晚期（L）均可表达，与1TCID50KHV感染对照组结果相似（图3.3，AB）。相反，同剂量的31.25μg/ml虎杖蒽醌提取物显示出良好的抗KHV病毒的能力，在0.1TCID50KHV病毒感染组均显示出完全抑制KHV基因的转录（图3.3，C），在高浓度病毒滴度1TCID50下，可以检测到KHV基因的转录。ABCD图3.3A：0.1TCID50KHV病毒对照组，18d；B：31.25μg/ml利巴韦林对照组（0.1TCID50），18d；C：31.25μg/ml虎杖蒽醌药物治疗组（0.1TCID50），18d；D：31.25μg/ml虎杖蒽醌药物治疗组（1TCID50），12d；M：1000bpLadder；1：阴性对照；2：阳性对照CCB18SPCR产物，180bp；3：KHVORF3L/R-IEPCR产物，201bp；4：KHVORF55-IEPCR产物，650bp；5：KHVORF56-IEPCR产物，200bp；6：KHVORF92-EPCR产物，220bp；7：KHVORF114-LPCR产物，509bpFig.3.3A:CCBcontrolcultureinfectedat0.1TCID50KHV,18d;B:31.25μg/mlribavirin（0.1TCID50）,18d;C:31.25μg/mlanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatum（0.1TCID50）,18d;D:31.25μg/mlanthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatum（1TCID50）,12d;M:1000bpDNALadder;1:Negativecontrol;2:Positivecontrol,productofCCB18SPCR,180bp；34 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究3:ProductofKHVORF3L/R-IEPCR,201bp;4:ProductofKHVORF55-IEPCR,650bp;5:ProductofKHVORF56-IEPCR,200bp;6:ProductofKHVORF92-EPCR,220bp;7:ProductofKHVORF114-LPCR,509bp3.3.3虎杖蒽醌提取物对KHV感染鲤鱼的保护效果3.3.3.1试验鲤鱼的PCR检测在300尾试验鲤鱼中随机选取10尾试验鲤鱼，PCR检测结果显示10尾鲤鱼呈阴性，未携带KHV，可以进行后续试验。图3.4鲤鱼PCR检测Fig.3.4ThePCRdetectionsofdetectedcarpM：DNA分子质量标准；1：阳性对照；2-11：鲤鱼DNAPCR结果；M:DL2000DNAMarkers;1:positivecontrol;2-11:ThePCRproductsofcarptissueDNA3.3.3.2虎杖蒽醌提取物处理组安全性检测药物剂量组（A、B、C、D、E）与阳性对照组（F）和空白对照组（G），共70尾鲤鱼经过15天持续观察后发现，七组鲤鱼进食情况均正常，生活状态良好，且未出现死亡情况，体表无任何异常可以进行下一步的试验。3.3.3.3虎杖蒽醌提取物对KHV感染鲤鱼的保护作用记录攻毒治疗试验15天内的结果显示：A治疗组的试验鲤鱼死亡率为46.7%，死亡时间在3-7d，B治疗组死亡率为20%，死亡时间在5-10d，C治疗组死亡率为6.7%，死亡时间6-12d，D治疗组仅有一条试验鲤鱼在11d死亡，E治疗组无死亡。这些数据表明：虎杖蒽醌剂量相对较低的A、B、C组对攻毒鲤鱼的保护作用相对较低，死亡时间相对较早，而高剂量治疗组D、E显示出较好的保护作用。35 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究表3-4虎杖蒽醌提取物（A、B、C、D、E）保护率测定及试验鲤鱼死亡时间Table3-4AnthraquinoneextractsfromPolygonumcuspidatum（A、B、C、D、E）protectionrateandcarpdeathtime组别尾数免疫TCID50死亡尾数死亡率（%）死亡时间（d）A组30100TCID501446.73-7B组30100TCID506205-10C组30100TCID5026.76-12D组30100TCID5013.311E组30100TCID50000阳性对照组30100TCID50301002-12空白对照组300.4ml0003.4讨论虎杖提取物中蒽醌化合物具有多种药理作用包括抗病毒，抗菌，抗炎，抗癌等多种特性。多项研究已证实蒽醌类化合物对HSV-1、HSV-2、HIV、SARS、乙型肝炎病毒、流感病毒等均表现出一定的抑制作用[99-102]。本试验通过MTT法检测不同浓度梯度虎杖蒽醌提取物对KHV-感染CCB细胞的保护作用，及检测虎杖蒽醌提取物是否具有直接杀灭KHV和抗病毒吸附的能力。试验结果发现感染后加入虎杖蒽醌提取物抗病毒活性增强，IC50为13.67±0.47μg/ml，TI为5.48±0.49。同时广谱性抗病毒药物利巴韦林IC50为492.15±2.13μg/ml，约是虎杖蒽醌提取物的36倍，与虎杖蒽醌提取物相比抗KHV病毒活性较低，这表明利巴韦林是一种非选择性的病毒抑制剂，因此利巴韦林不适宜作为抗锦鲤疱疹病毒药物使用。虎杖蒽醌提取物（1.96-31.25μg/ml）抗KHV病毒复制试验中显示出最佳治疗浓度为31.25μg/ml，虎杖蒽醌提取物药物浓度以剂量依赖方式抑制KHV病毒复制，随着虎杖蒽醌提取物浓度的增加抑制KHV病毒复制的能力就越强，同时虎杖蒽醌提取物还具有一定的直接杀灭KHV病毒粒子的能力，但抗病毒吸附效果不明显。为了更深入的了解虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒作用机制，使用RT-PCR检测KHV生命周期相关基因的表达。试验结果显示低浓度的广谱性抗病毒药物利巴韦林不能预防，抑制或减少感染0.1TCID50的CCB细胞培养物中KHV的复制，但同浓度的虎杖蒽醌提取物显示出较强的抗病毒能力完全抑制KHV基因的转录，但在高浓度1TCID50病毒滴度可以检测到KHV病毒转录。在攻毒保护试验中，虎杖蒽醌提取物同样显示出较高抑制锦鲤疱疹病毒病发病，36 吉林农业大学硕士学位论文第三章虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究延迟试验鱼死亡时间，同时高剂量2.5g/kg和3g/kg虎杖蒽醌提取物治疗组具有极高的保护效果，与体外试验相似，体内研究中虎杖蒽醌提取物同样以剂量依赖性方式抑制感染后KHV的复制。蒽醌类化合物作为虎杖提取物中的主要成分，有望成为潜在的抗锦鲤疱疹病毒感染治疗药物。3.5小结1.成功测定虎杖蒽醌提取物最佳治疗浓度为31.25μg/ml，IC50=13.67±0.47μg/ml，TI=5.48±0.49；2.在低浓度病毒滴度0.1TCID50条件下31.25μg/ml虎杖蒽醌提取物能够预防，抑制或减少CCB细胞培养物中的KHV复制；3.将高剂量虎杖蒽醌提取物2.5g/kg和3g/kg注灌服攻毒鲤鱼后，2.5g/kg剂量组15天观察期间仅有一尾死亡，保护率为96.7%，3g/kg剂量组未出现试验鱼死亡。37 吉林农业大学硕士学位论文第四章结论第四章结论1.根据CPE镜检法和MTT法确定在低浓度范围内（≤31.25μg/ml），虎杖蒽醌提取物对CCB细胞基本无毒性作用，安全性好；2.虎杖蒽醌提取物具有一定的直接杀灭KHV病毒粒子的能力，虎杖蒽醌提取物浓度为31.25μg/ml时可以有效抑制KHV在CCB细胞中的复制；3.在动物试验中，虎杖蒽醌提取物也显示出较高的抗KHV病毒活性，延长试验鲤鱼死亡数时间，提高攻毒鲤鱼存活率。38 吉林农业大学硕士论文参考文献参考文献[1]BalonEKB.Originanddomesticationofthewildcarp,Cyprinuscarpio:fromRomangourmetstotheswimmingflowers[J].Aquaculture,1995,129:3-48[2]StatisticsandInformationServiceoftheFisheriesandAquacultureDepartment:FisheryandAquacultureStatistics2010.Rome:FAO.[3]张涛，宋文华,富俪静等.锦鲤疱疹病毒病鲤组织病理观察[J].水产学杂志2015,8,(4):24-27.[4]BretzingerA,Fischer-ScherlT,OumounaM,etal.Massmortalityinkoicarp,Cyprinuscarpio,associatedwithgillandskindisease.BullEurAssocFishPathol1999,（19）:182−185.[5]WaltzekTB,KelleyGO,StoneDM,etal.Koiherpesvirusrepresentsathirdcyprinidherpesvirus(CyHV-3)inthefamilyHerpesviridae[J].JournalofGeneralVirology,2005,86(Pt6):1659-1667.[6]IlouzeM,DavidovichM,DiamantA,etal.TheoutbreakofcarpdiseasecausedbyCyHV-3asamodelfornewemergingviraldiseasesinaquaculture:areview[J].EcologicalResearch,2011,26(5):885-892.[7]FAO(FoodandAgricultureOrganizationoftheUnitedNations).Thestateofworldfisheriesandaquaculture2010.FAO;Rome:2010.[8]WaltzekTB,KelleyGO,AlfaroME,etal.PhylogeneticrelationshipsinthefamilyAlloherpesviridae[J].DisAquatOrg,2009,（84）:179−194.[9]RonenA,PerelbergA,AbramowitzJ,etal.EfficientvaccineagainsttheviruscausingalethaldiseaseinculturedCyprinuscarpio[J].Vaccine,2003,（21）:4677–4684.[10]DavisonA.J,KurobeT,GathererD,etal.Comparativegenomicsofcarpherpesviruses[J].Virology,2013,87(5),2908–2922.[11]Mettenleiter,T.C.Buddingeventsinherpesvirusmorphogenesis[J].VirusResearch,2014,106(2),167-180.[12]MiyazakiT,KuzuyaY,YasumotoS,YasudaM,etal.HistopathologicalandultrastructuralfeaturesofKoiherpesvirus(KHV)infectedcarpCyprinuscarpio,andthemorphologyandmorphogenesisofKHV[J].DisAquatOrgan,2008,80:1-11.[13]IshiokaT,YoshizumiM,IzumiS,SuzukiK,etal.DetectionandsequenceanalysisofDNApolymeraseandmajorenvelopeproteingenesinkoiherpesvirusesderivedfromCyprinuscarpioinGunmaprefecture,Japan[J].VeterinaryMicrobiology,2005,110(1–2),27–331.[14]LiW,LeeX,WengS,etal.Whole-genomesequenceofanovelChinesecyprinidherpesvirus3isolaterevealstheexistenceofadistinctEuropeangenotypeinEastAsia[J].Veterinarymic39 吉林农业大学硕士学位论文参考文献robiology,2015,175(2):185-194.[15]MiwaS,ItoT,SanoM,eyal.Morphogenesisofkoiherpesvirusobservedbyelectronmicroscopy.JournalofFishDiseases,2007,30(12),715–722.[16]MiyazakiT,KuzuyaY,YasumotoS,etal.HistopathologicalandultrastructuralfeaturesofKoiherpesvirus(KHV)infectedcarpCyprinuscarpio,andthemorphologyandmorphogenesisofKHV[J].DisAquatOrgan2008,80:1–11.[17]MichelB,LeroyB,RajSV,etal.Thegenomeofcyprinidherpesvirus3encodes40proteinsincorporatedinmaturevirions[J].JournalofGeneralVirology2010,91:452–462.[18]DavisonAJ,KurobeT,GathererD,etal.Comparativegenomicsofcarpherpesviruses[J].Virology,2013,87(5),2908–2922.[19]KattlunJ,Menanteau-LedubleS,El-MatbouliM.Non-structuralproteinpORF12ofcyprinidherpesvirus3isrecognizedbytheimmunesystemfthecommoncarpCyprinuscarpio[J].DisAquteOrg,2014,111(3):269-273.[20]SunartoA,LiongueC,McCollKA,etal.Koiherpesvirusencodesandexpressesafunctionalinterleukin-10[J].Virol,2012,86(21):11512-111520.[21]TaylorNG,DixonPF,JefferyKR,etal.Koiherpesvirus:distributionandprospectsforcontrolinEnglandandWales[J].JournalofFishDiseases,2010,33(3):221–230.[22]KempterJ,BergmannSM.Detectionofkoiherpesvirus(KHV)genomeinwildandfarmedfishfromNorthernPoland[J].Aquaculture,2007,272:S275.[23]PiačkováV,FlajšhansM,PokorováD,etal.Sensitivityofcommoncarp,CyprinuscarpioL.,strainsandcrossbreedsrearedintheCzechRepublictoinfectionbycyprinidherpesvirus3(CyHV-3;KHV)[J].JournalofFishDiseases,2012,36(1):75–80.[24]GarverKA,Al-HussineeL,HawleyLM,etal.MassmortalityassociatedwithkoiherpesvirusinwildcommoncarpinCanada.[J].JournalofWildlifeDiseases,2015,46(4):1242-51.[25]刘荭,史秀杰,高隆英,等.进口锦鲤暴发病病原的nested—PCR鉴定[J].华中农业大学学报,2002,21(5):414-418.[26]刘世超.锦鲤疱疹病毒Nested-PCR检测方法的建立及初步应用[D].南京农业大学,2012.[27]GomezDK,JohSJ,JangH,etal.Detectionofkoiherpesvirus(KHV)fromkoi(Cyprinuscarpiokoi)broodstockinSouthKorea[J].Aquaculture,2011,311(1–4):42-47.[28]ChengL,ChenCY,TsaiMA,etal.Koiherpesvirusepizooticinculturedcarpandkoi,CyprinuscarpioL.,inTaiwan[J].Journaloffishdiseases,2011,34(7):547-554.[29]MinamotoT,HonjoMN,YamanakaH,etal.NationwideCyprinidherpesvirus3contaminationinnaturalriversofJapan[J].Researchinveterinaryscience,2012,93(1):508-514.[30]ShchelkunovIS,ShchelkunovaTI,ShchelkunovAI,etal.Firstdetectionofaviralagentc40 吉林农业大学硕士学位论文参考文献ausingdiseaseinfarmedsturgeoninRussia[J].Diseasesofaquaticorganisms,2009,86(3):193-203.[31]TakaharaT,HonjoMN,UchiiK,etal.EffectsofdailytemperaturefluctuationonthesurvivalofcarpinfectedwithCyprinidherpesvirus3[J].Aquaculture,2014,433(1):200-206.[32]LinL,ChenS,RussellDS,etal.AnalysisofstressfactorsassociatedwithKHVreactivationandpathologicaleffectsfromKHVreactivation[J].VirusRes,2017,240:2661-2667.[33]YuasaK,ItoT,SanoM.Effectofwatertemperatureonmortalityandvirussheddingincarpexperimentallyinfectedwithkoiherpesvirus[J].FishPathol2008,43:83-85.[34]邢程,王好,周井祥,等.一例冰下低温爆发的锦鲤疱疹病毒病的鉴定[J].水产学杂志,2014(1):46-49.[35]IlouzeM,DavidovichM,DiamantA,etal.TheoutbreakofcarpdiseasecausedbyCyHV-3asamodelfornewemergingviraldiseasesinaquaculture:areview.[J]EcolRes2011,26:885-892.[36]DishonA,PerelbergA,Bishara-ShiebanJ,etal.Detectionofcarpinterstitialnephritisandgillnecrosisvirusinfishdroppings[J].ApplEnvironMicrobiol,2005,71:7285-7291.[37]MinamotoT,HonjoMN,YamanakaH,etal.Detectionofcyprinidherpesvirus-3DNAinlakeplankton[J].ResVetSci2011,90:530-532.[38]KielpinskiM,KempterJ,PaniczR,etal.DetectionofKHVinfreshwatermusselsandCrustaceansfrompondswithKHVhistoryinCommonCarp(Cyprinuscarpio)[J].AquacBamidgeh2010,62:28-37.[39]ShimizuT,YoshidaN,KasaiH,etal.Survivalofkoiherpesvirus(KHV)inenvironmentalwater[J].FishPathol2006,41:153-157.[40]HaramotoE,KitajimaM,KatayamaH,etal.DetectionofkoiherpesvirusDNAinriverwaterinJapan[J].FishDiseases,2007,30(1),59-61.[41]HedrickRP,WaltzekTB,McDowellTS,etal.Susceptibillityofkoicarp,commoncar,goldfish,andgoldfishXcommoncarphybridstocyprinidherpesvirus-2andherpesvirus-3[J].AquatAnimHealth,2005,18(1):26-34.[42]BergmannSM,LutzeP,SchuetzeH,FischerU,etal.Goldfish(carassiusauratus)isasusceptiblespeciesforkoiheresvirus(KHV)butnotforKHVdisease(KHVD)[J].BullEurAssnFishP,2010,30(2):74-84.[43]KempterJ,KielpinskiM,PaniczR,etal.Horizontaltransmissionofkoiherpesvirus(KHV)frompotentialvectorspeciestocommoncarp[J].BullEurAssocFishPathol,2012,32:212-219.[44]BergmannSM,SadowskiJ,KielpinskiM,etal.Susceptibilityofkoixcruciancarpandkoi41 吉林农业大学硕士学位论文参考文献xgoldfishhybridstokoiherpesvirus(KHV)andthedevelopmentofKHVdisease(KHVD)[J].JFishDis,2010,33(3):267-272.[45]GiladO,YunS,Zagmutt-VergaraFJ,etal.Concentrationsofakoiherpesvirus(KHV)intissuesofexperimentallyinfectedCyprinuscarpiokoiasassessedbyreal-timetaqmanPCR[J].DisAquatOrg,2004,60(3):179-187.[46]FabianM,BaumerA,SteinhagenD.Dowildfishspeciescontributetothetransmissionofkoiherpesvirustocarpinhatcheryponds[J].JournalofFishDiseases,2013,36(5):505-514.[47]Ronsmans,M,Boutier,M,Rakus,K,etal.SensitivityandpermissivityofCyprinuscarpiotocyprinidherpesvirus3duringtheearlystagesofitsdevelopment:Importanceoftheepidermalmucusasaninnateimmunebarrier[J].VeterinaryResearch,2014,45(1),100.[48]HaenenOLM,WayK,BergmannSM,etal.TheemergenceofkoiherpesvirusanditssignificancetoEuropeanaquaculture.BullEurAssocFishPathol2004,24:293-307.[49]PerelbergA,SmirnovM,HutoranM,DiamantA,BejeranoY,KotlerM:EpidemiologicaldescriptionofanewviraldiseaseafflictingculturedCyprinusCarpioinIsrael[J].AquacBamidgeh2003,55:5-12.[50]McDermottC,PalmeiroB.Selectedemerginginfectiousdiseasesofornamentalfish[J].VeterinaryClinicsofNorthAmerica:ExoticAnimalPractice,2013,16(2):261-282.[51]Miyazaki,T.,Kuzuya,Y.,Yasumoto,S.,Yasuda,M.,&Kobayashi,T.(2008).HistopathologicalandultrastructuralfeaturesofKoiherpesvirus(KHV)-infectedcarpCyprinuscarpio,andthemorphologyandmorphogenesisofKHV[J].DiseasesofAquaticOrganisms,2008,80(1):1-11.[52]EideK,Miller-MorganT,HeidelJ,etal.ResultsoftotalDNAmeasurementinkoitissuebyKoiHerpesvirusreal-timePCR[J].VirolMethods2011,172:81-84.[53]EideKE,Miller-MorganT,HeidelJR,etal.Investigationofkoiherpesviruslatencyinkoi.JVirol2011,85:4954-4962.[54]HedrickRP,McDowellT.Passivetransferofserawithantivirusneutralizingactivityfromadultchannelcatfishprotectsjuvenilesfromchannelcatfishvirusdisease[J].TransactionsoftheAmericanFisheriesSociety1987,116:277-281.[55]CostesB,RajVS,MichelB,etal.ThemajorportalofentryofkoiherpesvirusinCyprinuscarpioistheskin[J].Journalofvirology,2009,83(7):2819-2830.[56]FournierG,BoutierM,StalinRajV,etal.FeedingCyprinuscarpiowithinfectiousmaterialsmediatescyprinidherpesvirus3entrythroughinfectionofpharyngealperiodontalmucosa[J].VetRes,2012,43(6).[57]NeukirchM,B€ottcherK,BunnajrakulS.Inoculationofcyprinidherpesvirus3(CyHV-3)oncommoncarpbraincells-influenceofprocessparametersonvirusyield[J].InVitroCellDevBiol42 吉林农业大学硕士学位论文参考文献Anim,2017,53(7):579-585.[58]ImajohM,FujiokaH,FurusawaK,etal.EstablishmentofanewcelllinesusceptibletoCyprinidherpesvirus3(CyHV-3)andpossiblelatencyofCyHV-3bytemperatureshiftinthecells[J].FishDiseases,2014,19(5):221-224[59]NeukirchM,Kunz,U.Isolationandpreliminarycharacterizationofseveralvirusesfromkoi(Cyprinuscarpio)sufferinggillnecrosisandmortality[J].BulletinoftheEuropeanAssociationofFishPathologists,2001,21(4):125–135.[60]ZhouJ,WangH,ZhuX,etal.Theprimarycultureofmirrorcarpsnoutandcaudalfintissuesandtheisolationofkoiherpesvirus[J].InVitroCellularandDevelopmentalBiology:Animal,2013,49(9):734–742.[61]WangY,ZengW,LiY,etal.Developmentandcharacterizationofacelllinefromthesnoutofkoi(CyprinuscarpioL.)fordetectionofkoiherpesvirus[J].Aquaculture,2015,435:310–317.[62]BergmannSM,RiechartM,FichtnerD,etal.Investigationonthediagnosticsensitivityofmoleculartoolsusedfordetectionofkoiherpesvirus[J].VirolMethods2010,163:229−233.[63]GiladO,YunS,AndreeKB,etal.Initialcharacteristicsofkoiherpesvirusanddevelopmentofapolymerasechainreactionassaytodetectthevirusinkoi,Cyprinuscarpiokoi[J].DiseasesofAquaticOrganisms,2002,48(2),101-108.[64]GrayWL,MullisL,LaPatraSE,etal.DetectionofkoiherpesvirusDNAintissuesofinfectedfish[J].FishDiseases,2002,25,171-178.[65]AokiT,TakanoT,UnajakS,etal.GenerationofmonoclonalantibodiesspecificforORF68ofkoiherpesvirus[J].CompImmunolMicrobiolInfectDis2011,34:209−216.[66]VranckenR,BoutierM,RonsmansM,etal.LaboratoryvalidationofalateralflowdeviceforthedetectionofCyHV-3antigensingillswabs[J].VirologicalMethods,2013,193(2):679-682.[67]ArielRonena,AyanaPerelberg,JuliaAbramowitz,etal.EfficientvaccineagainsttheviruscausingalethaldiseaseinculturedCyprinuscarpio[J].Vaccine,2003,21:4677–4684.[68]FuchsW,FichtnerD,BergmannSM,etal.Generationandcharacterizationofkoiherpesvirusrecombinantslackingviralenzymesofnucleotidemetabolism[J].Archivesofvirology,2011,156(6):1059-1063.[69]BoutierM,RonsmansM,OuyangP,etal.Rationaldevelopmentofanattenuatedrecombinantcyprinidherpesvirus3vaccineusingprokaryoticmutagenesisandinvivobioluminescentimaging[J].PLoSPathog,2015,11(2):e1004690.[70]CostesB,FournierG,MichelB,etal.Cloningofthekoiherpesvirusgenomeasaninfectious43 吉林农业大学硕士学位论文参考文献bacterialartificialchromosomedemonstratesthatdisruptionofthethymidinekinaselocusinducespartialattenuationinCyprinuscarpiokoi[J].JournalofVirology,2008,82(10),4955–4964.[71]JingxiangZhou,JiangdongXue,QiujuWang,etal.VaccinationofplasmidDNAencodingORF81geneofCJstrainsofKHVprovidesprotectiontoimmunizedcarp[J].InVitroCell.Dev.Biol.—Animal(2014)50:489–495.[72]J-XZhou,HWang,X-WLi,XZhu,W-LLuandD-MZhang.ConstructionofKHV-CJORF25DNAvaccineandimmunechallengetest[J].JournalofFishDiseases2014,37,319–325.[73]HWLin,MXSun,YHWangetal.Anti-HIVactivitiesofthecompoundsisolatedfromPolygonumcuspidatumandPolygonummultiflorum[J].PlantaMedica,2010,76（9）：889-892.[74]LinHW,SunMX,WangYH,etal.Potentbacterialneuraminidaseinhibitors,anthraquinoneglucosidesfromPolygonumcuspidatumandtheirinhibitorymechanism.[J].Ethnopharmacol2016,12,193:283-292.[75]JSChang,HWLiu,KCWang,etal.EthanolextractofPolygonumcuspidatuminhibitshepatitisBvirusinastableHBV-producingcellline[J].AntiviralResearch,2005,66（1）:29-34.[76]WangQL,LiBY,QiuSC,etal.StudyonantibacteriaeffectinvitroofPolygonumcuspidatumSieb[J].LishizhenMedicineandMaterialMedicaResearch,2006,17,762-763.[77]JRKim,DR.Oh,MHCha,etal.ProtectiveeffectofpolygonicuspidatiradixandemodinonVibriovulnificuscytotoxicityandinfection[J].Microbiology,2008,46（6）:737-743,2008.[78]BralleyEE,GreenspanP,HargroveJL,etal.Topicalanti-inflammatoryactivityofPolygonumcuspidatumextractintheTPAmodelofmouseearinflammation[J].Inflammation2008,8,5,1.[79]JHHan,WKoh,HJLee,etal.AnalgesicandantiinflammatoryeffectsofethylacetatefractionofPolygonumcuspidatuminexperimentalanimals[J].ImmunopharmacologyandImmunotoxicology,2012,34（2）:191-195.[80]HLLi,HLChen,HLietal.RegulatoryeffectsofemodinonNF-γactivationandinflammatorycytokineexpressioninRAW264.7macrophages[J].InternationalJournalofMolecularMedicine,2005,16（1）:41-47.[81]LinYW,YangFJ,ChenCL,etal.FreeradicalscavengingactivityandantiproliferativepotentialofPolygonumcuspidatumrootextracts[J].NaturalMedicines2010,64,146-152.[82]KimuraY,OkudaH..ResveratrolisolatedfromPolygonumcuspidatumrootpreventstumorgrowthandmetastasistolungandtumor-inducedneovascularizationinLewislungcarcinoma-bearingmice[J].Nutrition,2001,131,1844–1849.[83]TsengSH,LinSM,ChenJC,etal.Resveratrolsuppressestheangiogenesisandtumorgro44 吉林农业大学硕士学位论文参考文献wthofgliomasinrats[J].ClinicalCancerResearch2004,10,2190-2202.[84]ZhangM,JinLJ,JinCH.Protectiveeffectofpolydatinonmultipleorganinjuryinratswithendotoxicshock[J].ChineseCriticalCareMedicine1995,7,352-387.[85]ZhangM,JinLJ,JinCHetal.Theeffectofpolydatinonendotoxicshockinrats[J].ChinesePathophysiology,1997,13,245-248.[86]WuKY,HuangQB.RelationshipbetweendisturbancesofmicrocirculationandTNFduringburnshock[J].ChineseJournalofPlasticSurgery,1996,12,41-44.[87]ZhangM,LeY,JinLJ,etal.Theeffectofpolydatinonendotoxin-activatedperitonealmacrophagesinmice[J].ChineseJournalofPathophysiology,1995,11,242-245.[88]DuJ,SunLN,,XingWW,HuangBK,etal.Lipid-loweringeffectsofpolydatinfromPolygonumcuspidatuminhyperlipidemichamsters[J].Phytomedicine,2009,16,652-658.[89]XingWW,WuJZ,JiaM,etal.EffectsofpolydatinfromPolygonumcuspidatumonlipidprofileinhyperlipidemicrabbits[J].Biomedicine&Pharmacotherapy,2009,63,457-462.[90]HongZY,GaoY,ZhanXH.TheprotectiveeffectofPolygonumcuspidatumsiebonliverischemicinjuryinrats[J].WorldChineseJournalofDigestology8,2000,162-164.[91]MoZX,ShaoHX.Protectiveeffectsofpolydatinonmousehepatocyteinjuryinducedbyhydrogenperoxideinvitro[J].ChinesePharmacologicalBulletin,2000,16,519–521.[92]ZhangH,YuCH,JiangYP,etal.ProtectiveeffectsofpolydatinfromPolygonumcuspidatumagainstcarbontetrachlorideinducedliverinjuryinmice[J].PlosOne7,2012,e46574.[93]WangYC,XuHL,FuQ,etal.ProtectiveeffectofresveratrolderivedfromPolygonumcuspidatumanditsliposomalformonnigralcellsinParkinsonianrats[J].NeurologicalScience,2011,304,29-34.[94]LinSP,ChuPM,TsaiSY,etal.Pharmacokineticsandtissuedistributionofresveratrol,emodinandtheirmetabolitesafterintakeofPolygonumcuspidatum[J].Ethnopharmacology,2012,144,671-676.[95]XuXW,QiuGQ,LiMZ,etal.Studyonhemolysis,allergicreactionandstimulationofpoladatininjection[J].TraditionalChineseDrugsResearch&ClinicalPharmacology,2008,19,174-177.[96]朱霞,李新伟,王好,等.一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报,2011,33(5):340-343.[97]MReichert,SMBergmann,JHwang,etal.AntiviralactivityofexopolysaccharidesfromArthrospiraplatensisagainstkoiherpesvirus[J].JournalofFishDiseases,2017,8,40(10):1441-1450.[98]AokiT,HironoI,KurokawaK,etal.Genomesequencesofthreekoiherpesvirusisolatesrepresentingtheexpandingdistributionofanemergingdiseasethreateningkoiandcommoncarp45 吉林农业大学硕士学位论文参考文献worldwide[J].Virology,2007,81,5058-5065.[99]IlouzeM.,DishonA.&KotlerM.Coordinatedandsequentialtranscriptionofthecyprinidherpesvirus-3annotatedgenes[J].VirusResearch,2012,169,98–106.46 吉林农业大学硕士论文作者简介作者简介姓名金晔性别女民族汉籍贯辽宁省抚顺市政治面貌团员入学时间2015-09申请学位类别理学硕士论文答辩日期2018-05-27授予学位月2018-06就业信息就业单位就业单位性质就业单位地址联系方式（个人/办公）学习（工作）经历2011年9月-2015年6月吉林农业大学动物科学技术学院水产养殖学农学学士2015年9月-2018年6月吉林农业大学生命科学学院水生生物学理学硕士攻读学位期间发表与学位论文的科研成果信息署名发表情况发表学术论文题目刊物名称（级别）署名单位次序(刊出时间/录用)鲤HSP90作为锦鲤疱疹病毒核酸疫苗大连海洋大学学报1吉林农业大学2018年4月免疫佐剂的研究效（核心）果锦鲤疱疹病毒病的科学养鱼（核心）1吉林农业大学2018年4月防治及诊断措施获奖署名名称成果级别署名单位发表情况项目次序及专利47 吉林农业大学硕士论文致谢致谢岁月如斯夫，不舍昼夜，转眼间已在吉林农业大学度过了美好的7年时光。起笔行文时，思绪万千，有太多的不舍，太多的留恋。在研究生三年期间，实验室生活的点点滴滴，都让我成长使有我有所收获。从起初的初学乍道，懵懂无知到后来的轻车驾熟，独当一面。我的每一步成长都离不开老师和师兄师姐的帮助与关心。在结束研究生生涯，开启新的征途时，以此文道一声感谢。首先感谢的是我的导师周井祥教授，和王好副教授在我硕士期间给我的学习上的指导和生活上的帮助，同时感谢合作单位刘艳辉老师和祖岫杰老师，是你们的无私帮助让我能够顺利毕业，愿您身体安康，幸福永久。感谢水产教研室是所有老师：张东鸣老师，王桂芹老师，夏艳杰老师，吴莉芳老师，黄权老师，单晓峰老师，陈玉珂老师，葛晨霞老师。感谢实验室朝夕相伴的马悦师姐、袁海延师姐、张瑞雪师姐、王钊师兄、于慧师姐，同窗黄东东，李志师弟，王茁宇师弟等人在我实验工作和学术问题上的探讨和帮助；感谢我的好朋友潘雪梅，邹阳，杨兰，田佳鑫，瞿子惠，甘旭有了你们才使我在三年求学生涯中多了更多的快乐。感谢我的父（金先生）母（王女士）亲朋，是你们一直默默陪伴在我的身边，给与我经济上和身心上的关怀，在此我要向你们道一声，您辛苦了，未来的日子里我会挑起身上的担子，成长为一个无愧自己也无愧亲友的有用之人。最后感谢各位专家、老师不辞辛苦评阅我的论文，并给予我指导和建议。48