《脊髓背角线粒体解偶联蛋白4（UCP4）参与小鼠神经病理性痛的机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号R322UDC611密级公开脊髓背角线粒体解偶联蛋白4（UCP4）参与小鼠神经病理性痛的机制研究王圣明培养类别全日制学位类型学术学位一级学科(专业类)基础医学二级学科(专业)人体解剖与组织胚胎学研究方向慢性痛的神经机制研究指导教师王亚云教授培养单位基础医学院人体解剖学教研室二O一八年五月 空军军医大学硕士学位论文目录缩略语表······························································································································1中文摘要······························································································································4英文摘要······························································································································6前言······························································································································9文献回顾····························································································································10正文····························································································································16第一部分：UCP4在小鼠脊髓的表达分布情况··························································161材料·························································································································161.1实验动物············································································································161.2主要试剂············································································································161.3主要液体的配制·······························································································171.4主要仪器···········································································································172方法·························································································································172.1小鼠灌注取材···································································································172.2脊髓腰段冰冻切片的制备···············································································182.3免疫荧光组织化学染色···················································································182.4图像采集和统计分析·······················································································193结果··························································································································193.1UCP4在脊髓的表达分布情况········································································193.2脊髓UCP4的表达细胞类型···········································································204讨论·························································································································21第二部分：神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角UCP4的表达变化情况······221材料·························································································································221.1实验动物············································································································221.2主要试剂············································································································221.3主要液体的配置·······························································································23 空军军医大学硕士学位论文1.4主要仪器···········································································································232方法·························································································································242.1SNI模型制备···································································································242.2痛的行为学检测·······························································································242.3脊髓背角组织及线粒体蛋白提取···································································252.4神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角RNA序列文库构建和测序······262.5WesternBlot检测·····························································································272.6RT-qPCR检测··································································································272.7线粒体生物学功能检测···················································································282.8统计学分析·······································································································293结果·························································································································303.1转录组测序验证神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角UCP4的变化303.2神经病理性痛模型（SNI）小鼠机械痛和热痛的行为学变化····················303.3神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角UCP4蛋白水平的表达变化····323.4神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角UCP4mRNA水平的表达变化333.5神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角线粒体生物学功能检测的变化334讨论·························································································································36第三部分：脊髓水平靶向干预UCP4表达后对小鼠痛行为学的影响·····················381材料·························································································································381.1实验动物···········································································································381.2主要药物和试剂·······························································································381.3主要液体的配置·······························································································391.4主要仪器···········································································································392方法·························································································································402.1UCP4相关病毒的制备····················································································402.2UCP4相关病毒脊髓背角浅层定位注射························································422.3SNI模型制备···································································································432.4UCP4病毒干预后小鼠痛行为学检测····························································432.5WesternBlot检测·····························································································44 空军军医大学硕士学位论文2.6RT-qPCR检测···································································································462.7线粒体生物学功能检测···················································································462.8统计学分析·······································································································463结果··························································································································463.1小鼠脊髓背角定位注射感染部位验证···························································463.2UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角UCP4mRNA水平的表达变化················483.3UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角UCP4蛋白水平的表达变化····················493.4UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角线粒体生物学功能的变化························503.5UCP4OE病毒能够上调神经病理性痛（SNI）模型小鼠机械痛阈值，UCP4RNAi病毒能够下调正常小鼠的机械痛阈值······················································534讨论·························································································································54小结····························································································································56参考文献····························································································································57个人简历和研究成果········································································································64致谢····························································································································66 空军军医大学硕士学位论文缩略语表缩略词英文全称中文全称ATPAdenosinetriphosphate三磷酸腺苷Adenosinemonophosphate-activatedAMPK腺苷酸激活蛋白激酶proteinkinaseADAlzheimersdisease阿尔兹海默症CCIChronicconstrictioninjury慢性压迫性损伤CNSCentralnervoussystem中枢神经系统dDay天DRGDorsalrootganglia背根神经节dsRNADouble-strandedRNA双链RNAddH2ODoubledistilledwater双蒸水ERKExtracellularregulatedproteinkinases细胞外调节蛋白激酶GSH-PxGlutathioneperoxidase谷胱甘肽过氧化物酶GABAGamma-aminobutyricacidγ-氨基丁酸GFAPGlialfibrillaryacidicprotein胶原纤维酸性蛋白GSK-3Glycogensynthasekinase3糖原合酶激酶3FGFluoro-Gold荧光金HPHydroperoxide过氧化氢hHour小时-1- 空军军医大学硕士学位论文InternationalAssociationforIASP国际疼痛研究协会theStudyofPainInternationalClassificationofICD国际疾病分类DiseasesIonizedcalcium-bindingadapterIba1离子钙接头蛋白抗原molecule1LTPLong-termpotentiation长时程增强+-KCCPotassium-chlorideco-transporterK-Cl共转运体MEGSMitochondrialenergy-generatingsystem线粒体能量产生系统MMPMitochondrialmembranepotential线粒体膜电位MPTPMitochondrialpermeabilitytransitionpore通透性转换孔minMinute分钟mtDNAMitochondrialDNA线粒体DNA2+2+MCUMitochondrialCauptake线粒体Ca摄取NPNeuropathicpain神经病理性疼痛NACN-Acetyl-L-cysteineN-乙酰-L-半胱氨酸NGFNervegrowthfactor神经生长因子OEOver-expression过表达OFQOrphaninFQ孤啡肽PBSPhosphatebuffersolution磷酸盐缓冲液PBNN-tert-Butyl-a-phenylnitroneN-叔丁基-a-苯基硝酮PBPhosphatebuffer磷酸缓冲剂PAParaformaldehyde多聚甲醛-2- 空军军医大学硕士学位论文PKBProteinkinaseB蛋白激酶BPWMTPawwithdrawalmechanicalthreshold机械缩足反射阈值PWTLPawwithdrawalthermallatency热缩足反射潜伏期ROSReactiveoxygenspecies活性氧簇RNAiRNAinterferenceRNA干扰技术ReversetranscriptasequantityRT-qPCR反转录聚合酶链反应polymerasechainreactionSecSecond秒SNISparednerveinjury坐骨神经选择性损伤S.CSubcutaneousinjection皮下注射SODSuperoxidedismutase超氧化物歧化酶SDHSuperficialdorsalhorn脊髓背角浅层含吐温20的tris缓冲TBSTTrisbuffersalineplustween20液4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethypiperidine-1-TEMPOL四甲基哌啶氧oxylTCATricarboxylicacidcycle三羧酸循环UCPUncouplingprotein解偶联蛋白WWeek周-3- 空军军医大学硕士学位论文脊髓背角线粒体解偶联蛋白4（UCP4）参与小鼠神经病理性痛的机制研究硕士研究生：王圣明导师：王亚云教授空军军医大学人体解剖学教研室暨梁銶琚脑研究中心，西安710032资助基金项目：国家自然科学基金面上项目（No.81272555）中文摘要背景与目的：神经病理性痛是一种以神经系统损伤或功能障碍为原发因素的疼痛，由于其机制不明致使临床缺乏有效的镇痛手段。通过转录组测序和蛋白质谱分析发现，线粒体解偶联蛋白4（Uncouplingprotein4，UCP4）通过介导线粒体可塑性参与脊髓水平慢性痛调控。本实验在神经病理性痛模型（Sparednerveinjury,SNI）小鼠上，综合运用形态学、行为学以及线粒体功能检测等方法，探讨脊髓背角线粒体UCP4参与神经病理性痛的过程，以期为临床镇痛提供新的策略。方法：1.利用免疫荧光组织化学染色方法，观察小鼠腰段脊髓UCP4的表达分布情况，及其与星形胶质细胞特异性标志物GFAP（Glialfibrillaryacidicprotein，胶原纤维酸性蛋白）和小胶质细胞特异性标志物Iba1（Ionizedcalcium-bindingadaptermolecule1，离子钙接头蛋白抗原）的双标情况。2.利用神经病理性痛SNI小鼠模型建立、动物痛行为学检测、转录组测序、Western-Blot、RT-qPCR以及线粒体生物学功能检测等方法，观察SNI小鼠脊髓背角UCP4的表达变化以及线粒体功能的改变。3.利用脊髓背角浅层UCP4病毒定位注射的方法干预UCP4的表达水平，然后利用-4- 空军军医大学硕士学位论文动物痛行为学检测和线粒体生物学功能检测方法，观察UCP4对小鼠痛行为学及线粒体生物学功能的影响。结果：1.免疫荧光组织化学染色结果显示，脊髓背角UCP4主要表达于神经元中，且UCP4表达水平呈神经元体积依赖型。同时可见部分星形胶质细胞表达UCP4，但是在小胶质细胞中未见UCP4表达。2.Western-Blot、RT-qPCR、动物痛行为学检测以及线粒体生物学功能检测结果显示，与sham组小鼠相比较，SNI小鼠脊髓背角UCP4蛋白和mRNA表达明显上调；同时伴随线粒体功能障碍，表现为：ATP产生降低、氧自由基清除能力降低以及线粒体膜电位水平降低。3.Western-Blot、RT-qPCR、动物痛行为学检测以及线粒体生物学功能检测结果显示：正常小鼠脊髓背角浅层定位注射UCP4过表达（UCP4Over-expression,UCP4OE）OE病毒14d后建立SNI模型，SNI14d后检测发现，与SNI小鼠相比较，UCP4OE病毒注射小鼠脊髓背角UCP4蛋白和mRNA水平均显著增加，而线粒体ATP产生、氧自由基清除能力以及线粒体膜电位水平显著升高，小鼠机械缩足反射阈值（Pawwithdrawalmechanicalthreshold,PWMT）明显提高。4.Western-Blot、RT-qPCR、动物痛行为学检测以及线粒体生物学功能检测结果显示：正常小鼠脊髓背角浅层定位注射UCP4干扰（UCP4RNAinterference,UCP4RNAi）病毒14d后结果发现，与正常小鼠相比较，UCP4RNAi病毒注射小鼠脊髓背角UCP4蛋白和mRNA水平显著降低，而线粒体ATP产生、氧自由基清除能力以及线粒体膜电位水平相比降低，小鼠机械缩足反射阈值明显降低。结论：1.UCP4表达于所有脊髓神经元和部分星形胶质细胞中，几乎不表达于小胶质细胞中，而且UCP4表达模式呈神经元体积依赖性分布。2.脊髓背角线粒体UCP4可能通过控制ATP产生效率、清除氧自由基以及维持线粒体膜电位稳定性等神经元保护作用缓解神经病理性痛的发生和发展。关键词：神经病理性痛；解偶联蛋白4；脊髓背角；线粒体功能；氧化应激；小鼠-5- 空军军医大学硕士学位论文Theroleofmitochondrialuncouplingprotein4(UCP4)ofspinaldorsalhorninthedevelopmentofneuropathicpainofmiceCandidateformaster:WangShengMingSupervisor:Prof.WangYaYunDepartmentofAnatomy＆K.K.LeungBrainResearchCentre,AirForceMedical,University,Xian710032,ChinaSponsoredPrograms:NationalNaturalScienceFoundationofChina(No.81272555)AbstractBackgroundandpurpose:Neuropathicpain,inducedbythedamageordysfunctionofthenervoussystem,isthemostcommontypeofchronicpaininclinicalpractice,however,lacksofeffectivetreatmentbecauseofunclearmechanism.Basedontranscriptomesequencingandproteinprofilingstudies,wehavefoundthatthemitochondrialuncouplingprotein4(UCP4)atthespinalcordlevelmayplayanimportantroleintheregulationofneuropathicpainbymediatingmitochondrialplasticity.thepresentexperimentistoexploretheeffectofmitochondrialUCP4atthespinalcorddorsalhorninneuropathicpainmodel(SNI)ofmice,byusingthecombinationoftheneuronalmorphology,behavioralandmitochondrialfunctionmethods.Thepurposeofthestudyistoprovidenewideasforclinicalanalgesia.Methods:1.ToclarifytheexpressionpatternofUCP4atthespinaldorsalhorn,thestainingof-6- 空军军医大学硕士学位论文UCP4anditsco-localizationswithspecificmarkersforastrocyte(GFAP)andformicroglia(Iba1)weredetected.2.ToclarifythechangesoftheexpressionsofUCP4bothattheproteinandmRNAlevelsandthechangesofthemitochondrialfunction,atthespinaldorsalhornofthemicewithneuropathicpain(SNI)animalpainbehaviortests,transcriptomesequencing,WesternBlot,RT-qPCRandmitochondrialbiologicalfunctiontestswereused.3.LocalizationofTheUCP4virusinsuperficialdorsalhornofspinalcordwasusedtodetecttheeffectsofUCP4onthepainbehaviorandmitochondrialbiologicalfunctioninmice.Results:1.ImmunofluorescencehistochemicalstainingshowedthattheexpressionofUCP4inthedorsalhornofthespinalcordwasmainlyexpressedinneurons,andtheexpressionlevelofUCP4wasneuronvolumedependent.Atthesametime,someastrocytesexpressedUCP4,butnoUCP4expressionwasfoundinmicroglia.2.WesternBlot,RT-qPCR,painbehaviortestsandmitochondrialbiologicalfunctiontestswereusedhaveshownthat:comparedwiththeshamgroup,theexpressionofUCP4proteinandmRNAinthedorsalhornofthespinalcordofSNImicewasobviouslyup-regulated,andaccompaniedbymitochondrialdysfunction,whichshowedthedecreaseofATPproduction,thedecreaseofoxygenfreeradicalscavengingabilityandthedecreaseofmitochondrialmembranepotentiallevel.3.WesternBlot,RT-qPCR,painbehaviortestsandmitochondrialbiologicalfunctiontestswereusedhaveshownthat:themiceSpinaldorsalhornswereintrathecallyinjectedwithUCP4overexpressionvirusfor14daysandthenSNImodelwasestablished.ProteinlevelsandmRNAlevelswereverifiedtoincreaseUCP4expression;mitochondrialATPproductionefficiency,abilitytoscavengeoxygenfreeradicals,andmitochondrialmembranepotentialwereincreasedcomparedwiththeemptyvirusmodelgroupmice,andthemechanicalpainthresholdwasincreased.4.WesternBlot,RT-qPCR,painbehaviortestsandmitochondrialbiologicalfunction-7- 空军军医大学硕士学位论文testswereusedhaveshownthat:UCP4wasdown-regulatedinspinalcorddorsalhornbydown-regulatingvirus,bothinproteinlevelsandmRNAlevels.UCP4expressionwassignificantlyreduced;mitochondrialATPproductionefficiency,abilitytoscavengeoxygenfreeradicals,andmitochondrialmembranepotentialweredecreasedcomparedwithmiceinthecontrolgroup.Moreover,themechanicalpainthresholdissignificantlyreduced.Conclusion：1.UCP4wasexpressedinallspinalneuronsandsomeastrocytes,almostnotexpressedinmicroglia,andthepatternofUCP4expressionwasavolumedependentdistributionofneurons.2.MitochondrialUCP4inthespinaldorsalhornofthespinalcordcanalleviatetheoccurrenceanddevelopmentofneuropathicpainbycontrollingtheprotectionofATPproductionefficiency,scavengingoxygenfreeradicals,andmaintainingthestabilityofmitochondrialmembranepotential.Keywords:Neuropathicpain;Uncouplingprotein4;Spinaldorsalhorn;Mitochondrialfunction;Oxidativestress;Mice-8- 空军军医大学硕士学位论文前言慢性痛是目前临床上最常见的一类慢性疾病，神经病理性痛是慢性痛分类中较[1]常见的一种，国际疼痛研究协会（InternationalAssociationfortheStudyofPain,IASP）将神经病理性痛描述为是“由机体感觉神经系统疾病或者神经系统损伤而引起的疼痛”，其主要临床特征是自发性疼痛（Spontaneouspain）、痛觉过敏（Hyperalgesia）和感觉异常（Paresthesia）。由于其发病机制不清，临床缺乏有效治疗手段。脊髓背角（Spinaldorsalhorn）是疼痛传导的门户。脊髓背角浅层（superficialdorsalhorn）对疼痛等伤害性信息向大脑的传递起重要的整合和敏化作用，其可塑性改变是[2]神经病理性痛产生和维持的重要机制之一。一般所说的脊髓背角包括Rexed分层I-VI层，但是目前在疼痛研究领域主要关注I-III层。原因在于初级传入主要终止于I层II外层（IIo），且有明确的实验结果证明I-III层神经元参与了炎性痛和神经病理[14]性痛的产生和发展，而这些结果在大鼠、小鼠和其他种属相似度很高。线粒体（Mitochondrion）是真核细胞中由双层膜包被的细胞器，是重要的“能量工厂”；最近的研究表明，线粒体的功能紊乱参与了慢性痛的发生和发展过程，可能与能量产生系统功能障碍、通透性转换孔异常、活性氧簇产生过多、线粒体膜电位降低以及细胞凋亡通路激活等因素有关。课题组前期基于蛋白质组学的方法，筛选出线粒体解耦联蛋白4（Uncouplingprotein4,UCP4）可能在线粒体介导慢性痛发生和发展的过程中起着重要作用。基于以上内容，本实验提出以下假设：脊髓背角中线粒体UCP4能够通过调节线粒体膜电位、清除自由基、控制ATP生成等神经细胞保护作用起到缓解神病理性痛的发生和发展。本论文综合利用动物痛行为学检测、转录组测序、神经形态学、线粒体功能检测及分子生物学等研究方法，以神经病理痛模型小鼠为研究对象，探究了神经病理性痛模型小鼠脊髓背角中线粒体UCP4的表达变化以及线粒体功能的改变；并在此基础上进一步利用病毒载体在体干预脊髓背角中UCP4的表达水平，观察其对小鼠痛行为学的影响，以期为临床提供慢性痛治疗新策略、干预新靶点。-9- 空军军医大学硕士学位论文文献回顾1、慢性痛机制的研究进展国际疼痛研究协会（InternationalAssociationfortheStudyofPain,IASP）对疼痛[1,65]的定义是组织损伤（明确或潜在）引起的不愉快的情感认知和社会经历；它通常与实际的或潜在的组织损伤有关。国际疾病分类（InternationalClassificationof[3]Diseases,ICD）方法将慢性痛分为：慢性原发性疼痛、慢性癌性疼痛、慢性术后痛及创伤后疼痛、神经病理性疼痛、慢性头部及颌面部疼痛、慢性内脏疼痛、慢性骨骼肌疼痛。神经病理性疼痛是慢性痛中较常见的一种类型，为外周神经病理性疼痛[4]和中枢神经病理性疼痛；其主要临床特征是自发性疼痛（spontaneouspain）、痛觉过敏（hyperalgesia）和感觉异常（paresthesia）。目前临床上治疗神经病理性疼痛的方法主要是对症治疗，包括：镇痛药、局部的封闭介入、手术、高压氧、心理治疗等方法；但这些方法只能提供缓解症状，临床治疗效果不理想，而且具有很多副作用。因此从机制上研究神经病理性疼痛的发病机理，开发新型镇痛药物，对患者和[5-6]社会都具有十分重要的意义。慢性痛通常由初级感觉神经元的功能失调导致脊髓和大脑痛觉相关神经环路产生中枢敏化作用（centralsensitization）。其中脊髓背角（spinaldorsalhorn）是躯体感[2]觉信息整合的关键部位，这里交织分布着多种类型的神经元：兴奋性投射神经元、兴奋性中间神经元、抑制性中间神经元等；在这些结构的信息处理是相对隔离的，传递伤害性痛觉信息的纤维主要分布在浅层，传递低阈值的机械性信息主要在深层。[7,73]慢性痛机制的研究最初起源于经典的“闸门控制学说”,“闸门”的开关受到粗、[8-10]细两类神经纤维的影响，绝大多数粗的、有髓传入神经都是来自皮肤的低阈值机械性感受器的A纤维，它能够对触觉以及毛发的运动刺激产生反应；细的有髓纤维[69]（A纤维）和无髓纤维（C纤维）是温度感受器或伤害性感受器。这个模型假说解释了机械触诱发痛的一个机制，但是我们对于环路的很多部分我们依然有很多未知方面，例如神经元的参与特质以及微环路是如何组织运行的。目前中枢敏化机制和外周敏化机制也是被广泛接受认同的机制学说；中枢敏化是指在脊髓和（或）脊髓以上的水平的疼痛相关的神经元兴奋性以及突触的传递增强。参与疼痛传递的主-10- 空军军医大学硕士学位论文要递质有乙酰胆碱、去甲肾上腺素、前列腺素、阿片肽、多巴胺、组织胺、P物质（SP）以及γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyricacid,GABA）等。[69]触诱发痛和痛觉敏感的发生机制与脊髓背角环路相关，其中涉及两类中间神经元，即抑制性神经元和兴奋性神经元。抑制性中间神经元具有多种功能，其去抑制产生触诱发痛、痛觉敏感和自发痛。兴奋性中间神经元接受低阈值机械性感受器的传入，并向I层投射神经元传递，现在证明，对该类中间神经元的抑制性效应缺失[69]能够导致这些神经元痛信息编码的错乱，最终产生触诱发痛。Moore等证明，坐骨神经慢性压迫性损伤模型（chronicconstrictioninjury,CCI）和坐骨神经选择性损伤（sparednerveinjury,SNI）两种引发触诱发痛和痛觉敏感的神经病理性痛模型中，对初级传入产生抑制性突触后电流的脊髓背角II层神经元（代表这是抑制性神经元）的数量减少。CCI模型2w后可见脊髓背角GABA能神经元几乎全部消失（90-100%），[11]后期有所恢复，说明这些神经元没有死亡。神经病理性痛后GABAA受体数量并没+--有改变，但是，由于KCl共转运体（KCC2）的下调，Cl跨膜梯度发生改变，GABA[12]和glycine的去极化作用减弱甚至翻转。外周神经损伤可能导致初级传入C纤维与抑制性中间神经元之间的突触联系发生微小的减少，从而产生去抑制效应。[13]兴奋性中间神经元性质改变的分子机制之一是ERK下游靶分子Kv4.2磷酸化。多种伤害性刺激后可见ERK（extracellularregulatedproteinkinases）激活，导致IA电流减小，增加神经元兴奋性。由于Kv4.2特异性表达于II层神经元而非I层神经元，而且IA电流相关的放电模式特异性指代II层兴奋性中间神经元，因此，该机制主要指的是兴奋性中间神经元固有可塑性的改变。兴奋性中间神经元的传递增强通过突触后机制增加I层投射神经元的活性，可能是炎性痛后痛觉过敏的机制。同时，兴奋性中间神经元多含有生长抑素（somatostatin），其释放会使周围的抑制性中间神经元发生超极化反应，最终产生去抑制效应。2、神经病理性痛的脊髓背角环路调控机制研究脊髓背角是疼痛信息传递的关键门户，这里分布着高度复杂的神经突触环路。几乎所有的神经元均接受来自于外周初级传入的突触传入，同时接受抑制性或兴奋性中间神经元的突触传入。大量研究结果证明，几乎没有来自于外周的痛信息仅在脊髓中继就简单地向上位脑结构传递。原始的机械痛背角环路的模型重点完全关注在连接的神经元传递触觉到脊髓背角的浅层。这个环路开始于PKCγ神经元，然后-11- 空军军医大学硕士学位论文兴奋IIi层的中央细胞和IIo的垂直细胞，最后到I层的投射神经元。目前能够肯定的是，脊髓背角存在较为复杂的神经环路，该环路的传入是不同类型的初级传入纤维，该环路内部包括不同层次不同类型的神经元，该环路的传出较为单一，是投射神经元，但是这些投射纤维不仅向传统神经解剖学概念上痛信息第三级神经元丘脑投射，更多的投射纤维涉及其它多个脑区。有人提出机械痛的脊髓背角环路由低阈值传入诱发前馈抑制，从而防止接触变得更加疼痛。这个概念已经引起兴趣，这是疼痛闸门控制学说的中心，在这个模型，回顾最近的综述，这个“闸门”代表着一类抑制性的中间神经元（促进疼痛环路），它还能阻止触摸相关信息从深部神经元向浅层的疼痛加工细胞传递。PKCγ表达的神经元II内层连接着触觉和痛觉，被认为是疼痛环路非常重要的组成部分。当受到伤害，抑制性控制活动减少时，“闸门”打开时，这些细胞已经被建模的启动激活脊髓背角直接通路将触觉转换为疼痛。对II层神经元的研究最多，由此可见它在痛觉研究中的重要地位。目前广为接受的是Perl等提出的分类方式。他们利用的方法主要是电生理记录后注入biocytin，然后进行形态学分析，所研究的种属包括豚鼠、小鼠和大鼠。他们根据神经元树突的形态，将II层神经元分为四种类型：岛细胞，中央型细胞，垂直状细胞和放射状细胞。其中，岛细胞全部是GABA能神经元，放射状细胞都是谷氨酸能神经元，大部分垂直状细胞是谷氨酸能神经元，中央型细胞可为两种类型。进一步研究提出，以上四种类型细胞中，每一种类型内部的30%均属于不典型细胞。IA型电流基本上都位于谷氨酸能中间神经元，与此一致的是，Kv4.2和Kv4.3通道多表达于含有钙网膜蛋白（calretinin）的谷氨酸能中间神经元。形态学分类的功能学意义：这个问题比较复杂。岛细胞几乎全部是抑制性神经元。放射状细胞和大部分垂直状细胞是谷氨酸能神经元。但是还包括很难界定其功能的中央型细胞，抑制性垂直样细胞以及非典型细胞。以上结果反映了中间神经元的异质性。利用神经元所表达的肽的类型将脊髓背角常用神经化学物质对其进行功能学分类。在脊髓背角已经得到确认的标志物包括以下物质。谷氨酸能神经元标志物：生长抑素（somatostatin）、神经加压素（neurotensin）、P物质（SP），神经激肽B（neurokininB），这些物质专一表达于谷氨酸能神经元。神经肽Y（neuropeptideY）和甘丙肽（galanin）专一表达于GABA能神经元。脑啡肽（enkephalin）和强啡肽（dynorphin）在两种类型神经元中均有表达。同时，钙结合蛋白小清蛋白（parvalbumin）和神经-12- 空军军医大学硕士学位论文元一氧化氮合成酶（nNOS）主要限于脊髓背角抑制性神经元。另两种钙结合蛋白calbindin和calretinin以及PKC主要限于谷氨酸能神经元。同时，目前得到共识的是，脊髓背角环路功能改变参与了炎性痛和神经病理性痛的产生和维持；阻断脊髓[15]背角中抑制性神经元传递将导致触诱发痛（allodynia）。因此，慢性痛的脊髓背角神经环路是由许多微环路叠加而来，搞清脊髓背角局部环路的组成和功能在痛觉领域具有重要意义。3、线粒体参与慢性痛的机制研究进展[16]线粒体（mitochondrion）是早在150年前就被发现和命名的一种细胞器，它由两层膜包被，直径在0.5-10μm左右，形态一般呈短棒状或圆球状，有时也可呈现线状、环状、扁盘状等形态结构，包括内膜、外膜、膜间隙和基质四个功能分区；它是真核生物能量合成的工厂，产生能量的系统主要是电子传递链和三羧酸循环反应，其中电子传递链是线粒体内膜上的一组酶复合体，由复合物Ⅰ-Ⅴ组成，主要功能是电子的传递和氧的利用。除了提供能量外，线粒体还参与了细胞信息传递、分化以及细胞凋亡等过程，而且还具有调控细胞周期和细胞生长的能力；线粒体虽然有着自己的遗传基因，但是缺少组蛋白结构的保护修复机制，容易受到损伤。线粒2+体受到损伤后常见病理变化包括：线粒体形态结构的改变、膜电位的变化、Ca通透性变化以及解耦联蛋白的变化。最新研究表明，慢性痛的发生和发展与线粒体都有着密切的关系；慢性痛与线粒体的能量产生系统（电子传递链、三羧酸循环等）、氧化应激、线粒体通透性转换[17-21,78]孔以及线粒体的凋亡通路等都有着密切的关系。多种疼痛状态下能够引起线[79]粒体相关物质发生变化。疼痛传递相关阿片类物质孤啡肽FQ（orphaninFQ，OFQ）正常表达表于小鼠脑组织和脊髓神经元内线粒体膜上；当在脊髓鞘内给予OFQ时能够引发小鼠出现触诱发痛行为；提示孤啡肽FQ可能引起神经元线粒体功能失调进[22]一步导致疼痛的中枢敏化过程。临床上化疗药物紫杉醇能够诱导大鼠产生冷诱发痛行为反应，并且伴随线粒体活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)生成明显增多、[23]谷胱甘肽酶过氧化物酶（Glutathioneperoxidase，GSH-Px）明显降低；相反，当外源性给予线粒体毒性物质鱼藤酮（线粒体呼吸链复合物I抑制剂）、寡霉素（ATP合成酶抑制剂）、金诺芬（线粒体抗氧化物硫氧蛋白-硫氧还蛋白还原酶抑制剂）能够[24]显著加剧紫杉醇或奥沙利铂引发的触诱发痛及机械性痛敏；提示线粒体功能异常-13- 空军军医大学硕士学位论文可能是痛觉敏化的重要机制之一。前期我们课题组研究发现，正常小鼠脊髓背角中线粒体形态为散在、颗粒状；而疼痛状态下的线粒体形态为集合、簇状，坐骨神经选择性损伤SNI模型下被标记为线粒体Mito-Red阳性的细胞数显著变多，胞浆内可观察到典型的成簇状线粒体，[25]可能代表线粒体的亚细胞聚集，提示线粒体功能可能发生了改变。通过调控线粒体功能能够实现镇痛效应：目前很多实验证实线粒体抗氧化物质或者线粒体呼吸功能调节分子能够在整体动物水平发挥镇痛效应。当腹腔或鞘内给予H2O2清除剂TEMPOL（4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethypiperidine-1-oxyl）或ROS（Reactiveoxygenspecies）非特异性清除剂PBN（N-tert-Butyl-a-phenylnitrone）均能[26]显著改善紫杉醇所致的机械性痛敏行为学表现。线粒体内钙离子紊乱时，会出现突触前钙离子的内流增加，引起谷氨酸释放增加，进而导致突触可塑性的受损，增2+加了伤害性信息的传递；阻断线粒体Ca摄取能够明显抑制机械性痛敏及其伴随的脊髓背角长时程增强反应（long-termpotentiation，LTP），提示线粒体参与疼痛慢性2+[27]化的机制之一可能是线粒体Ca库调控机制。除此以外研究还发现，线粒体呼吸链抑制剂、线粒体ROS清除剂等都能起着缓解疼痛的作用，参与的信号通路分子包括ERK、AMPK（adenosinemonophosphate-activatedproteinkinase）、PKB（protein[28]kinaseB）、GSK-3（glycogensynthasekinase3）、NGF（nervegrowthfactor）等。4、线粒体解偶联蛋白UCP4的结构和功能研究进展线粒体解偶联蛋白（Uncouplingprotein，UCP）是1997年发现的定位表达在细胞线粒体内膜上的一种质子载体蛋白家族，它的主要功能是消除线粒体内膜两侧的跨膜质子浓度差，从而使氧化磷酸化进程（由质子浓度差驱动）减缓，进一步阻碍[29,70]了ATP的正常产生。解偶联蛋白目前共有5个亚型:UCP1、UCP2、UCP3、UCP4、UCP5，各亚型组织分布不同；UCP1仅表达在棕色脂肪组织中,UCP2分布广泛在人体的各个组织，包括骨骼肌、脑和脊髓、白色脂肪组织、肝脏等组织，在脑组织中尤其分布在小脑、下丘脑和脑室系统内；UCP3仅在骨骼肌和心脏中表达，UCP4专一表达在中枢神经系统，主要是脑组织中、脊髓、胼胝体、黑质等；UCP5在脑、睾丸和肝等组织中有表达。UCP家族在中枢神经系统内的高表达提示其可能起着重要的生理学功能。前期研究提示解偶联蛋白家族在中枢神经系统疾病中发挥着重要的病理生理作用，例如在老年性痴呆、帕金森病以及多发性硬化中起着重要的角色，-14- 空军军医大学硕士学位论文UCP2可拮抗鱼藤酮诱导引起的黑质多巴胺神经元的死亡，UCP4可以保护神经元免[30]受氧化应激的损伤。UCP4基因的表达下调可能导致机体能量消耗不足而肥胖的发生；既往研究发现应用cDNA微阵列技术来分析肥胖大鼠基因表达谱，发现在肥胖状态下UCP4的表达明显下调（差异达6倍以上）,而当UCP4过表达时可以增加胰岛素的敏感性和降低细胞内的甘油三脂含量；提示UCP4可能与肥胖发生的病理生[31]理过程有关。[32-34,75-76]在神经系统中，UCP4主要通过以下几个方面进行神经细胞保护：（1）通过线粒体的解耦联作用；（2）通过清除自由基进而调控细胞的氧化应激水平；（3）2+通过调控Ca的稳态来发挥神经元的保护作用；可见UCP4能够直接影响中枢神经系统内的神经传递、神经元的变性以及突触可塑性。在星形胶质细胞中，UCP4能够[77]通过调控线粒体内的PH值来增强神经元的存活能力。在培养的神经元中,UCP4的高表达能够降低线粒体活性氧簇（reactiveoxygenspecies,ROS）生成，ROS的产生过量能够引起蛋白质、核酸和脂质的过氧化，从而使细胞膜结构遭到破坏，细胞[35]的崩解和线粒体的变性。UCP4可以作为调控线粒体复合物Ⅱ和ATP输出的潜在靶点。在培养的神经母细胞瘤细胞中，UCP4的过表达能够通过线粒体复合物Ⅱ来增[74]加ATP的产量；而线粒体膜电位的平衡是其进行氧化磷酸化产生ATP的先决条件,它主要依靠内膜两侧质子浓度差产生电位差,因此,推测UCP4的激活能够维持线粒体的膜电位稳定。综上所述根据慢性痛条件下线粒体结构和生物学功能的改变，推测UCP4可能通过调控ATP生成、防止钙超载、清除自由基、调节线粒体膜电位和神经细胞保护作用来缓解神经病理性疼痛。前期我们课题组研究发现在SNI模型小鼠机械性痛敏和热痛敏行为学变化最为明显时脊髓背角中线粒体UCP4阳性神经元的数量是减少的，这就预示着线粒体UCP4蛋白的下调可能与神经病理性痛的中枢敏化机制有关。但是脊髓背角中线粒体UCP4在慢性痛的发生发展过程中是如何发挥其保护作用的机制尚不清楚，需要我们进一步的研究。-15- 空军军医大学硕士学位论文正文第一部分：UCP4在小鼠脊髓的表达分布情况1材料1.1实验动物选取8-10周龄健康雄性C57BL/6小鼠，体重为（22±2）g，由学校实验动物中心提供。小鼠提前适应周围环境一周，昼夜交替节律为12小时，室温控制在22-26℃左右，饮食和饮水自由充足，所有操作和处理都遵循学校伦理道德委员会和国际疼[36、71]痛研究协会（InternationalAssociationfortheStudyofPain,IASP）的指导方针。1.2主要试剂多聚甲醛（天津科密欧化学试剂有限公司）；磷酸氢二钠Na2HPO4·12H2O（上海实验试剂有限公司）；磷酸二氢钠NaH2PO4·2H2O（上海实验试剂有限公司）；氢氧化钠NaOH（上海实验试剂有限公司）蔗糖（上海实验试剂有限公司）；去离子水（实验室自制）；水合氯醛（上海山浦化工有限公司）；生理盐水（西安双鹤药业）；甘氨酸（Sigma公司）；驴血清（Millipore公司）；UCP4抗体（SCBT公司）；GFAP抗体（Millipore公司）；Iba1抗体（Abcam公司）；DAPI（Sigma公司）。-16- 空军军医大学硕士学位论文1.3主要液体的配制1)4%多聚甲醛溶液（1000ml）：多聚甲醛40g0.2MPB500ml去离子水定容至1000ml；2)0.2MPB溶液(550ml)：31.91gNa2HPO4·12H2O3.26gNaH2PO4·2H2O去离子水定容至550ml，用NaOH或HCl调pH至7.4；3)30%蔗糖溶液（100ml）：蔗糖30g0.2MPB50ml去离子水定容至100ml，置4℃冰箱储存；4)0.01mol/LPBS缓冲液（5000ml）：NaCl45.0g14.5gNa2HPO4·12H2O1.45gNaH2PO4·2H2O去离子水定容至5000ml，用NaOH或HCl调节pH至7.4；5)7%水合氯醛（100ml）：水合氯醛7.0g去离子水定容至100ml，室温储存；6)抗体稀释液（100ml）：TritonX-100（300μl）叠氮钠(NaN3)0.03g角叉菜胶0.1g正常血清5ml，0.01MPBS定容至100ml，4℃冰箱保存；7)荧光封片剂（100ml）：甘油50mlDABCO2.50g0.01MPBS50ml定容至100ml，4℃冰箱保存。1.4主要仪器百分之一克天平（德国SartoriusBA110S）；移液枪（美国RAININ）；激光共聚焦显微镜（日本Olympus）；冰冻切片机（日本Leica）；JB-2定时双向磁力加热搅拌器（江苏金坛市荣华仪器制造有限公司）；动物手术器械（深圳沃瑞德生命科技有限公司）。2方法2.1小鼠灌注取材在灌注室内，给予小鼠腹腔内注射7%水合氯醛深度麻醉后，用剪刀剪开小鼠的胸部和腹部，暴露整个心脏和肝脏，小心切勿伤及肺脏及心脏；将连接灌流液的针头插入左心室（注意针尖进入的方向和深度），剪开右心耳，用0.01mol/LPBS缓冲液快速充血，直至肝脏组织颜色变白后，快速灌注含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB）-17- 空军军医大学硕士学位论文30ml，然后缓慢滴注70ml(1滴/秒)，持续时间约30min，直到小鼠四肢僵硬伸直；灌流完毕后快速取出腰段脊髓（L3-6）放入装4%多聚甲醛的EP管中，后固定2-4h（后固定的时间不宜过长，以免会影响抗原表位的暴露），而后将4%多聚甲醛溶液换成含30%蔗糖的PB缓冲液中，脱水，放在4℃冰箱直到组织沉底（至少一天）。2.2脊髓腰段冰冻切片的制备待4℃冰箱中脊髓组织完全沉底后，提前将冰冻切片机预冷至﹣20℃后，把组织表面的液体用滤纸吸干，切取腰段脊髓组织约3mm，放于样品托上涂上OCT胶包埋剂，冰冻20min后，连续横断切片，切片厚度为25μm，将切好的脊髓片放于盛有0.01mol/LPBS（PH7.4）的六孔板中。2.3免疫荧光组织化学染色1)挑选不同腰段脊髓片9张；2)0.01MPBS洗10min3次：六孔板接取适量0.01MPBS，用挑钩将片子挑入PBS中，放摇床洗10min，摇床速度约100r/min；3)10%小牛血清封闭30min：取1.5mlEP管，用移液枪依次加入540μl0.01MPBS和60μl牛血清，混合均匀；4)分三组进行染色：a.分别加一抗Rab-A-UCP4（1:200）过夜（18h）；b.分别加一抗Rab-A-UCP4（1:200）+Mou-A-GFAP（1:400）过夜（18h），b.取EP管加500μl抗体稀释液+2.5μlUCP4+1.25μlGFAP，混匀；c.分别加一抗Rab-A-UCP4（1:200）+Mou-A-lba1（1:500）过夜（18h），c.取EP管加500μl抗体稀释液2.5μlUCP4+1.0μlGFAP，混匀；5)0.01MPBS洗15min3次；6)加二抗，UCP4标记红色，GFAP和lba1标记绿色（二抗稀释比例均为1:500），6)600μl抗体稀释液1.2μl594-A-Rab；600μl抗体稀释液1.2μl488-A-Mou混匀，分别按照分组加入抗体板，室温摇床上孵育两小时，注意避光保存；7)DAPI（1:1000）染色15min：600μl0.01MPBS0.6μlDAPI混匀，依次加入抗体板，室温孵育15min；8)0.01MPBS洗15min3次；-18- 空军军医大学硕士学位论文9)裱片、抗荧光淬灭试剂封片：注意不要损伤脊髓片，封片时注意不要产生气泡，以免影响拍片效果。2.4图像采集和统计分析每个标本随机选取五张脊髓片，在激光共聚焦显微镜（Olympus）下观察各分组UCP4在脊髓背角的表达分布情况以及在脊髓背角内UCP4与GFAP和lba1的共标情况；并拍摄在不同倍数下的图片。后期使用Image-ProPlus软件进行分析处理，最后用统计软件SPSS19.0进行分析数据，在符合正态性检验后采用单因素方差分析进行数据分析，当P0.05视为差异具有统计学意义。3结果3.1UCP4在脊髓的表达分布情况图1-1正常小鼠模型腰段脊髓UCP4的表达分布。图A所示为腰段脊髓的DAPI染色，图B为线粒体UCP4抗体染色标记，图C为UCP4和DAPI免疫荧光组织化学染色的共标情况；图D-F为脊髓背角I层的UCP4和DAPI共标情况，图G-I为脊髓背角V层UCP4和DAPI免疫荧光组织化学染色的共标情况，图J统计学方法分析所示脊髓背角各层UCP4的分布情况；图K为脊髓背角各层中UCP4体积变化情况。标尺100μm（AC）；10μm（D–I）。-19- 空军军医大学硕士学位论文为了观察UCP4在脊髓背角中的表达分布情况，我们对正常小鼠腰段脊髓进行了灌注取材，并进行UCP4和DAPI的免疫荧光组织化学染色。通过激光共聚焦显微镜拍片观察发现，正常小鼠模型下线粒体UCP4在腰段脊髓各层均有分布；根据实验目的我们研究重点关注在脊髓背角的I-V层，而且从I-V层，UCP4的分布数量逐渐越多，这与脊髓背角分层区域呈正相关。3.2脊髓UCP4的表达细胞类型AB图1-2脊髓背角UCP4的表达细胞类型。图A示脊髓背角组织中UCP4、GFAP、DAPI免疫荧光组织化学染色结果；图B示脊髓背角组织内UCP4分别与GFAP、Iba1的免疫荧光组织化学染色共标情况。标尺100μm（A）；10μm（B）。-20- 空军军医大学硕士学位论文为了进一步观察脊髓背角中UCP4与胶质细胞的关系，同时进行星形胶质细胞特异性标志物GFAP（胶原纤维酸性蛋白）和小胶质细胞特异性标志物Iba1（离子钙接头蛋白抗原）的免疫荧光组织化学染色。激光共聚焦显微镜观察可见，UCP4部分表达于星形胶质细胞中，几乎不表达于小胶质细胞中。提示UCP4可能主要在神经元中参与慢性痛的发生发展过程。4讨论通过腰段脊髓免疫荧光组织化学染色发现，正常小鼠线粒体UCP4在脊髓背角各层均有分布，且UCP4表达与脊髓背角分层区域呈相关性。前期课题组研究发现在疼痛模型中脊髓背角中线粒体大部分分布在神经元中，更多聚集在能量需求较高的突触等结构中；而此时疼痛状态下的脊髓背角神经元中的线粒体的形态和功能都发生了变化，提示脊髓背角神经元中的线粒体介导的中枢敏化可能痛觉敏化机制之一。既往研究发现活性氧可激活脊髓胶质细胞进而导致中枢敏化，而且脊髓背角中星[37-39]形胶质细胞的激活在痛觉敏化中发挥重要的作用，本实验观察到：UCP4部分表达于星形胶质细胞特异性标志物GFAP（胶原纤维酸性蛋白）中，几乎不表达于小胶质细胞特异性标志物Iba1中，结果提示，中枢神经系统受损或出现外周慢性刺激（炎性、机械性等）时，能够通过产生活性氧刺激星形胶质细胞释放促炎性细胞因子以[40]及神经活性物质等，进而促使神经病理性痛严重化,证明星形胶质细胞在脊髓伤害[66-67]性信息的处理、传递以及敏化过程都起着非常重要的作用。而此过程需要“能[68]量工厂”线粒体提供能量支持，而UCP4又在线粒体能量供应体系中发挥着十分重要的作用。基于以上实验结果，我们认为小鼠脊髓背角浅层中的线粒体UCP4可能主要通过影响了脊髓背角神经元功能进而参与了神经病理性痛的发生和发展过程；既往仅报道过UCP2与疼痛的相关文献，但在神经病理性痛模型小鼠中UCP4的作用尚无报道，后续研究将通过动物行为学检测、神经分子生物学、线粒体结构与功能的检测等实验方法来进一步探索UCP4在疼痛调控中所扮演的角色。-21- 空军军医大学硕士学位论文第二部分：神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角UCP4的表达变化情况1材料1.1实验动物选取8-10周龄健康雄性C57BL/6小鼠，体重为（222）g，由学校实验动物中心提供。小鼠提前适应周围环境一周，昼夜交替节律为12小时，室内温度控制在22-26℃左右，饮食和饮水自由充足，所有操作和处理都遵循学校伦理道德委员会和国际疼[36、71]痛研究协会（IASP）的指导方针。1.2主要试剂β-actin(中杉金桥公司)；UCP4多克隆抗体（SantaCruz公司）；HRP(中杉金桥公司)；GAPDH（中杉金桥公司）；QproteomeMitochondriaIsolationKit（QIAGEN公司）；RIPA裂解液(强)（购自碧云天生物技术研究所）；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（购自碧云天生物技术研究所）；SDS-PAGE凝胶配制试剂（购自碧云天生物技术研究所）；COXIV线粒体内参抗体（Abbkine公司）；PierceBCAProteinAssayKi（ThermoScientific公司）；PageRulerPrestainedProteinLadder（ThermoScientific公司）；线粒体提取试剂盒（LysisBuffer1、MediumBuffer、WashBuffer、LysisBuffer2、100磷酸酶抑制剂、100蛋白酶抑制剂、PMSF）（QIAGEN公司）；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（购自南京建成生物工程研究所）；ATP酶测试盒（购自南京建成生物工程研究所）；BCAProteinAssayKit（ThermoScientific公司）；-22- 空军军医大学硕士学位论文微量还原型谷胱甘肽（GSH）测试盒（购自南京建成生物工程研究所）；PVDF膜（上海君创生物科技有限公司）；ECL发光液（ADVANSTA公司）。1.3主要液体的配置1）Loadingbuffer（SDS缓冲液）：6loading：0.5MTris.HCl（PH6.8）30ml；SDS5g；甘油15ml；溴酚蓝0.1g；加ddH2O（Doubledistilledwater）定容至50ml5loading：1ml6loading；200μlβ巯基乙醇（4℃冰箱存放）1loading：5loading加ddH2O稀释2）碧云天SDS-PAGE试剂（4℃冰箱存放）；3）电泳缓冲液：Tris3.02g、甘氨酸18.8g、SDS1g，加1000mlddH2O搅拌溶解（试剂均在WesternBlot试剂柜中存放）；4）转膜缓冲液：Tris3.03g；甘氨酸14.48g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml，配好之后需要预冷；5）固相载体：PVDF尼龙膜或NC膜（硝酸纤维素薄膜）。（PVDF膜需要用甲醇浸泡激活1分钟才能使用）；6）TBS-T（pH7.6）：TrisBase4.846g、NaCl16g；ddH2O160ml、加浓盐酸调节PH为7.6。每100ml需要用水稀释至1L，并加1ml吐温20；7）封闭液（5%脱脂奶粉，现用现配）：脱脂奶粉1.0g溶于20ml的TBST中（4℃冰箱存放）；8）显色液（现配，避光）：化学发光剂ADVANSTA，ECL发光液，A液和B液等体积混合，每张膜显色大约需要用200ml混合液，4℃冰箱存放；9）抗体稀释液：根据抗体说明书配制，溶剂为TBST，4℃冰箱存放；10)加入PageRulerPrestainedProteinLadder。1.4主要仪器热辐射刺激仪（北京凯辉盛达科技发展有限公司）；TissueRuptor（QIAGEN公司）；VonFrey纤维丝（深圳瑞沃德公司）；-23- 空军军医大学硕士学位论文新芝生物超声波细胞震碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；TECAN酶标仪（瑞士TECAN公司）；湘仪TGL-16离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；移液器（美国Gilson公司）；电子天平（德国Sartoriou公司）；TP22普通摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）；荧光显微镜（BX60，Olympus公司）；流式细胞仪（美国BeckmanCoulter公司）；紫外分光光度计（美国伯乐BIO-RAD公司）；凝胶成像系统（UniversalHood,美国伯乐BIO-RAD公司）；Olympus显微镜(Olympus-K02130；Olympus公司）；有机玻璃箱、铁丝网、高架台、玻璃板、配胶夹、电泳仪、转膜槽等由学校教保中心提供。2方法2.1SNI模型制备[41、42]按照Decosterd等方法制备SNI模型：1）7％水合氯醛（20mg/kg）腹腔注射麻醉；2）依次分离左后肢股外缘侧面皮肤层和肌肉层（股二头肌）；3）显示出坐骨神经主干及其3个分支：依次为胫神经、腓总神经以及腓肠神经；4）用6-0丝线分别双重结扎胫神经和腓总神经，并在中间将其切断，注意保护腓肠神经免受损伤。假手术组只切开皮肤、肌肉后只暴露坐骨神经干及其三个分支而不做切断处理；5）术后逐层缝合伤口，动物在行为学测试前恢复一天。2.2痛的行为学检测[42、71]机械痛阈值测定：参照Dixon方法进行机械痛阈值的测定，将小鼠置于升高的金属网上，并盖以透明的有机玻璃罩，适应周围环境30min，用vonFrey纤维丝由弱到强（0.008g、0.02g、0.04g、0.07g、0.16g、0.40g、0.60g、1.0g、1.4g、-24- 空军军医大学硕士学位论文2.0g）刺激左侧足底腓肠神经支配皮肤敏感区域，逐渐加压使之成为“S”形并持续约6-8S，观察小鼠是否出现快速的抬足、舔足以及抖足等阳性反应。给予间断刺激10次，将能够诱发出4-6次抬足、舔足以及抖足等阳性反应统计为50%的反应率，其压力的平均值视为阈值。热痛阈测定：小鼠热辐射刺激潜伏期使用RYT-1型热痛刺激仪来进行测定。[43]参照Hargreaves等方法将小鼠置于铁架的玻璃板上，罩以透明的有机玻璃罩，适应环境20min后进行测试。功率设定为25W，刺激足底正中央，记录小鼠出现缩足反应的时间（s），注意同一足底两次刺激的时间间隔应大于10min。单次照射足底时间不能超过30s（避免热辐射对小鼠足底造成灼伤），每只小鼠照射3次，结果取其平均值。2.3脊髓背角组织及线粒体蛋白提取1)将新鲜切除的组织约20mg置于冰上,用1ml生理盐水冲洗样品；32)用手术刀将样本切为约2mm的小块，将组织块放入2ml的离心管，加500μl裂解液（LysisBuffer）；3)样品匀浆需要使用tissueruptor转子定子均质机，并将其设置在最低速度匀浆10秒；4)将1.5ml裂解液（LysisBuffer）注入离心管并将其放在摇床上10分钟（4℃）；5)4℃，1000g离心10分钟；6)移除上清液，注意：上清主要包含胞浆蛋白；7)向沉淀加入1.5ml冰浴的DisruptionBuffer（分裂缓冲液）并用1ml移液管上下用吹吸使细胞悬浮。完整细胞的裂解需要使用钝头针头和注射器，即将裂解混合液吸到注射器并一次吹出，重复此步骤10次；8)1000g裂解混合液离心10分钟，4℃，将上清转移至1.5ml离心管中；9)步骤8取得的上清，4℃，6000g离心10分钟；10)移除上清。注意：沉淀颗粒包含线粒体。上清液内有微粒体成分；11)向步骤10取得的沉淀中加入750μlMitochondriaPurificationBuffer(线粒体纯化液)并用1ml移液管上下用吹吸使线粒体悬浮；12)4℃，14000g离心15分钟。离心后，在离心管的中下部分形成含有线粒体的-25- 空军军医大学硕士学位论文分层带；13)吸出1.5ml上清液。线粒体层很软，取上清液时应小心以防止线粒体颗粒不丢失或破坏，保留上清液用作进一步分析；14)吸取离心管底部剩余的0.5ml溶液，并将其转移到新的离心管中；15)用1.5mlMitochondriaStorageBuffer（线粒体储存液）稀释从步骤14中获取的混悬液。4℃，8000g离心10分钟；16)除去1.5ml上清液，用1.5mlMitochondriaStorageBuffer稀释剩余的混悬液，4℃，8000g离心10分钟；17)重复步骤16一直到线粒体颗粒在离心管底部沉积；注意：此过程须重复直至线粒体形成管底部的小球，颗粒很软，应确保除去上清液时，颗粒不丢失；18)向步骤17取得的沉淀中加入MitochondriaStorageBuffer以作进一步分析；19)纯化线粒体沉淀，用凯基试剂盒提取线粒体蛋白；a.在每ml预冷的LysisBuffer2加入1μl蛋白酶抑制剂，5μl100mMPMSF，和5μl磷酸酶抑制剂，注意混匀；b.每20μl线粒体压积中，加入200μl上述提前配制好的预冷LysisBuffer2；c.置于4℃摇床平台上，温和振荡15min；d.14000rpm，4℃离心15min；e.取上清放在冰浴的离心管中备用，弃沉淀；f.用BCA试剂盒测定蛋白含量。2.4神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角RNA序列文库构建和测序取正常对照组小鼠和神经病理性痛模型（SNI）组14d小鼠分别各三只；取腰段脊髓背角组织，利用Trizol试剂分别提取正常对照组和神经病理性痛模型（SNI）组小鼠脊髓背角组织总RNA，利用紫外分光光度计测定样品RNA总浓度。用于测序的每个样品的总RNA量为2μg，测序建库使用nebnext®超™RNA提取试剂盒Illumina®生产的（#E7530L，NEB，美国）。使用Poly-T寡附磁珠纯化总RNA，利用离子高温在NEBNext第一链合成反应缓冲液（5）中将RNA打成片段，利用随机引物和RNaseH合成cDNA第一链，随后使用缓冲液，dNTPs，DNA聚合酶I和RNaseH合成第二链cDNA，用QIAquickPCR试剂盒和洗脱缓冲液纯化文库片段，-26- 空军军医大学硕士学位论文然后进行末端修复、a-tailing添加。通过PCR和琼脂糖凝胶电泳得到目标产物，文库构建完成（AnnoroadGeneTechnologyCo.,Ltd,Beijing,China）。在IlluminaHiSeq[44-46]4000平台对文库进行测序，150bp的配对末端读取生成（由安诺优达基因科技北京有限公司进行测序）。2.5WesternBlot检测UCP4蛋白水平的表达检测：1)分别提取腰段脊髓背角全组织和线粒体中的蛋白，蛋白定量采用BCA方法；2)加样（目的蛋白）、SDSPAGE电泳（80V,30min；120V，60min）、转膜（PVDF膜）；3)封闭（5%脱脂奶粉脱色，摇床上最慢速，室温2-3h），洗膜（TBST，10min×3次）；4)加一抗：按照抗体说明书和条带序列依次对应加入β-actin抗体(小鼠抗，1:5000)、UCP4抗体（小鼠抗，1:200）、GAPDH抗体(兔抗，1:5000)，密封自封袋在4℃过夜；5)加二抗：将一抗孵育好的膜取出，用TBST清洗10-15min3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1:5000）、HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1:5000），室温震荡孵育1.5h；6)TBST洗膜10min3次后目的条带进行ECL化学发光（发光液现用现配）；7)蛋白相对灰度值使用ImageJ软件进行计算分析。2.6RT-qPCR检测UCP4mRNA表达水平的检测分析：1）提取腰段脊髓背角组织，提取脊髓背角组织的总RNA（采用Trizol试剂法），测定RNA浓度（紫外分光光度计法）；并用1%琼脂糖凝胶80V,15min电泳鉴定提取RNA的完整性；2）合成cDNA（以RNA为模板），RT-qPCR检测；UCP4引物序列为：Forward:5'–CTCAGAGCCAACCGAATAGC–3'Reverse:5'–GGCTGACAGATGCAACAGAA–3'，设定内参为GAPDH（购自生工生物工程有限公司，北京）；-27- 空军军医大学硕士学位论文3）反应条件：设定程序按照两步法来进行Real-time定量：（1）预变性温度为95℃，时间为15s；（2）之后每一步变性温度为95℃，时间为5s，退火，并延伸60℃30s，共进行40个循环；4）扩增后做溶解曲线以检测产物的均一性；-△△Ct5）计算相对含量采用2方法进行统计分析。2.7线粒体生物学功能检测线粒体生物学功能检测内容主要包括：（1）线粒体能量合成功能检测；（2）线粒体的氧化应激功能检测；（3）线粒体膜结构稳定性的检测。线粒体能量合成检测方包括法：NADH（complexI）、琥珀酸-辅酶Q还原酶（complexII）、细胞色素C还原酶（complexIII）、环氧酶COX（complexIV）、ATP酶（complexV）活性、ATP含量均为ELISA试剂盒进行紫外或荧光检测；ATP酶是位于细胞膜以及细胞器膜上的一种蛋白酶，它起着物质运输、信息传递以及能量转换的作用。线粒体氧化应激功能检测方法：DCSF荧光ELISA检测ROS水平、酶标仪检测谷胱甘肽微量还原型谷光甘肽（GSH）、可见分光光度计测定超氧化物歧化酶（SOD）-含量。GSH为一种低分子自由基的清除剂，它可以清除O2、H2O2等，并且能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅助因子受到氧化损伤的作用。线粒体膜结构稳定性检测方法：线粒体膜电势的破坏是导致线粒体膜结构稳定性降低的重要原因，常用的检测方法包括mtDNAPCR检测、JC-1染色流式细胞仪检测线粒体膜电位（MMP）、Mito-tracker荧光探针激光共聚焦显微镜观察等。1）ATP能量合成检测：a)取小鼠腰段脊髓背角进行组织匀浆或提取线粒体；b)标准品按测定浓度进一步稀释目的浓度；c)加样：设空白对照孔、待测样品孔；d)37℃温育30min、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、终止反应；e)测定：以空白孔调零，测量各孔的OD值（在450nm波长下）；根据标准曲线计算ATP含量。-28- 空军军医大学硕士学位论文2）超氧化物歧化酶（SOD）及还原型谷胱甘肽（GSH）测试：根据超氧化物歧化酶（SOD）测试盒说明书和微量还原型谷胱甘肽（GSH）测试盒说明书（南京建成生物工程研究所）来测定GSH及SOD的含量。a)样本前期处理：组织样本上清液的制备（参照说明书）；b)加样：设定空白、对照、待测样品孔等；c)测定：以空白孔调零，用酶标仪、可见分光光度计测量各孔的OD值，根据标准曲线进行计算；d)计算公式见下：3）线粒体膜电位检测：线粒体膜稳定性检测包括mtDNAPCR检测、JC-1染色流式细胞仪检测线粒体膜电位(MMP)、Mito-tracker荧光探针激光共聚焦显微镜观察；JC-1检测试剂盒可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化，检测细胞的线粒体膜电位变化需要模拟氧化应激损伤模型（使用流式细胞仪检测）。具体实验操作步骤如下：a)配制JC-1染色工作液，并用JC-1缓冲液稀释；b)加入脊髓背角线粒体/细胞；c)流式细胞仪检测；d)分析结果。2.8统计学分析所有数据采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据资料按均数标准误(MeanSEM)表示，组间比较采用One-WayAVOVA单因素方差分析，若总体结果具有统计学意义，则采用SNK-q检验进行组间两两比较，P0.05为差异有统计学意义。-29- 空军军医大学硕士学位论文3结果3.1转录组测序验证神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角UCP4的变化AB图2-1转录组测序验证SNI模型小鼠脊髓背角UCP4的表达变化。图A：SNI模型小鼠脊髓背角发生明显改变的基因类聚分析图；图B：SNI模型小鼠脊髓背角发生明显改变的基因分类示意图。n3只。如图2-1所示：我们进行了神经病理性痛模型（SNI）组小鼠（n3只）和正常对照小鼠（n3只）的转录组测序，从中筛选出与疼痛相关的基因，通过基因的聚类分析发现与对照组相比，SNI模型组中有上万个基因的表达发生了变化，从中分别筛选出与线粒体、内质网、ROS、GTP酶、微管蛋白及微丝蛋白相关的基因数（图2-1B）。其中与线粒体相关的基因数有236个，与微丝蛋白相关基因有163个，与GTPase相关的基因有53个，与微管蛋白相关的基因有31个，但与内质网和ROS相关的基因只有15个和14个，提示神经病理性疼痛的基因变化与线粒体功能障碍密切相关。而后从这些基因中筛选出差异表达显著的28个基因进行聚类分析（图2-1A）其中表达上调的基因16个，表达下调的基因12个，其中上调的包括UCP家族,而且在测序结果中发现在神经病理性痛模型小鼠中，脊髓背角UCP4的表达是上调的，反映在神经病理性痛模型中，脊髓背角线粒体保护机制的启动，这些与文献中报道UCP4可能通过调节线粒体膜电位、清除自由基、防止钙超载、控制ATP生[47-48]成和神经元细胞保护作用来缓解神经病理性疼痛相吻合。3.2神经病理性痛模型（SNI）小鼠机械痛和热痛的行为学变化如图2-2所示：我们建立了神经病理性痛（SNI）模型小鼠（n8只），同时也建-30- 空军军医大学硕士学位论文立了假手术组（sham）模型小鼠（n8只）进行对照；术后恢复一天后分别对SNI模型组小鼠和sham组小鼠进行机械痛和热痛的检测。结果提示与假手术（sham）组相比,SNI模型组术后的第1、3、5、7、10、14d小鼠神经损伤侧后足出现明显的机械痛阈值的降低，差异具有统计学意义（P0.05）；，而SNI术后小鼠的损伤侧后足在第1天就出现明显的机械痛阈值降低，在7天左右达到峰值，而且至少持续两周；而假手术（sham）组术后机械痛阈值与术前无明显变化，约0.65g左右（图2-2A）。[49]提示小鼠在SNI术后出现持续的触诱发痛现象，与之前文献报道相符合。同时我们也进行了热反应潜伏期的行为学检测（图2-2B），结果提示与假手术（sham）组相比,SNI模型组术后的第1、3、5、7、10、14d小鼠神经损伤侧后足出现明显的热反应潜伏期的降低（P0.05）；，而SNI术后小鼠的损伤侧后足第1天就出现明显的热敏痛阈值降低，在5天左右达到峰值，而且至少持续两周；而假手术（sham）组术后热反应潜伏期与术前无明显变化，约9.6s左右。A0.80.60.4SNIipsiPawwithdrawal0.2SHAMipsimechanicalthreshold(g)0013571014BDaysaftersurgery121086SNIipsi4PawwithdrawalSHAMipsithermallatency(s)20013571014Daysaftersurgery图2-2SNI模型小鼠机械痛敏和热痛敏行为学的改变。图A示：SNI模型小鼠机械痛敏的行为学*检测；图B示：SNI模型小鼠热痛敏的行为学检测。与sham组比较，P0.05。n8只。ipsi：刺激侧，ipsilateral。-31- 空军军医大学硕士学位论文如图所示：与假手术组（sham组）相比较，SNI组术后第1、3、5、7、10、14d小鼠神经损伤侧的后足出现了明显的机械痛阈值和热反应潜伏期阈值的减低（P0.05）。3.3神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角UCP4蛋白水平的表达变化图2-3SNI模型小鼠脊髓背角UCP4变化的Western-Blot检测。图A示SNI模型14d小鼠、正常对照组（CONTROL）、假手术组（SHAM）小鼠脊髓背角组织胞浆内的UCP4蛋白Western-Blot检测。图B示SNI模型14d小鼠与正常对照组（CONTROL）和假手术组（SHAM）小鼠相比*脊髓背角组织胞浆内的UCP4蛋白表达量明显上调。P0.05。图C示SNI模型14d小鼠、正常对照组（CONTROL）、假手术组（SHAM）小鼠脊髓背角组织线粒体内的UCP4蛋白Western-Blot检测。图D示SNI模型14d小鼠与正常对照组（CONTROL）和假手术组（SHAM）小鼠相比-32- 空军军医大学硕士学位论文*脊髓背角组织线粒体内的UCP4蛋白表达量明显上调。P0.05。n6只。Cyto，胞浆，cytosol；Mito，线粒体，mitochondria。Western-Blot分别检测神经病理性痛模型（SNI）组（n6只）、假手术组（n6只）以及正常对照组小鼠（n6只）脊髓背角胞浆和线粒体中UCP4蛋白的表达变化。结果发现无论是在胞浆还是在线粒体中，sham组和正常对照组之间UCP4的表达无明显变化，但是SNI组14d后无论是胞浆还是线粒体中UCP4表达明显增强，差异具有统计学意义（P0.05）。上述结果提示在神经病理性痛刺激后，小鼠脊髓背角UCP4的表达反馈性上调，开始启动UCP4的保护机制。3.4神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角UCP4mRNA水平的表达变化为进一步验证神经病理性痛模型（SNI）小鼠中UCP4在mRNA水平的表达变化，我们分别提取SNI组（n3只）、sham组（n3只）脊髓背角组织中的RNA。从图2-4分析结果可以看出：sham组和正常对照组之间UCP4的mRNA表达水平无明显变化（P0.05），但是SNI14d后与正常对照组和sham组相比UCP4mRNA表达水平明显升高（P0.05）。2.0*1.51.0UCP4/GAPDH0.50.0SNISHAMCONTROL图2-4SNI模型小鼠脊髓背角UCP4变化的RT-qPCR检测。图示SNI模型14d小鼠与与正常对照组（CONTROL）和假手术组（SHAM）小鼠相比较，脊髓背角组织UCP4mRNA表达水平明*显上调。P0.05。n3只。3.5神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角线粒体生物学功能检测的变化1）神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角线粒体ATP产生效率降低在神经病理性痛模型（SNI）小鼠14d时，我们分别提取了SNI模型组（n3-33- 空军军医大学硕士学位论文只）、假手术组（n3只）、正常对照组（n3只）腰段脊髓背角中的线粒体，利用ATP检测试剂盒进行ATP产生效率的检测。结果提示sham组和正常对照组之间ATP产生效率无明显变化（P0.05），但是SNI14d后与正常对照组和sham组相比ATP产生效率明显降低（P0.05）。ATP产生效率的降低提示线粒体能量合成功能的障碍,提示线粒体的能量产生系统与神经病理性痛有着密切的关系。0.40.30.2*efficiency0.10.0mitochondrialATPgenerationSNISHAMCONTROL图2-5SNI模型小鼠脊髓背角线粒体内ATP产生效率水平的变化。图示SNI模型14d小鼠与与正常对照组（CONTROL）和假手术组（SHAM）小鼠相比较，脊髓背角线粒体内ATP产生效率*明显降低。P0.05。n3只。2）神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角线粒体氧化应激功能的变化AB815610/mgprot)4*5GSH(2*SOD(U/mgprot)00SNISNISHAMSHAMCONTROLCONTROL图2-6SNI模型小鼠脊髓背角线粒体内GSH（A）及SOD（B）水平的变化。图示SNI模型14d-34- 空军军医大学硕士学位论文小鼠与与正常对照组（CONTROL）和假手术组（SHAM）小鼠相比较，脊髓背角线粒体内GSH*（图A）和SOD（图B）活性水平明显降低。P0.05。n3只。在神经病理性痛模型（SNI）小鼠14d时，我们分别提取了SNI模型组（n3只）、假手术组（n3只）、正常对照组（n3只）腰段脊髓背角中的线粒体，利用GSH检测试剂盒和SOD检测试剂盒分别进行GSH和SOD活性水平的检测。结果提示sham组和正常对照组之间GSH和SOD活性水平无明显变化（P0.05），但是SNI模型组14d后与正常对照组和sham组相比GSH和SOD活性水平明显降低（P0.05）。GSH和SOD活性水平的降低提示神经病理性痛模型小鼠机体清除氧自由基的能力下降，进一步说明在神经病理性痛状态下引起了脊髓背角中线粒体的功能障碍，最终会损害神经元的结构和功能。3）神经病理性痛模型（SNI）小鼠脊髓背角线粒体膜电位水平的变化ABC1.51.0*MMP0.50.0SNICONTROLControlSNI线粒体膜电位检测图2-7SNI模型小鼠脊髓背角线粒体膜电位水平的变化。图A和图B分别显示正常对照组（CONTROL）和和SNI模型14d小鼠的线粒体膜电位MMP（Mitochondrialmembranepotential）的流式细胞仪检测结果。图C是A和B的统计学分析结果。结果显示，与CONTROL组相比较，*SNI组脊髓背角线粒体膜电位水平明显降低。P0.05。n3只。分别提取纯化SNI模型（n3只）和正常对照组小鼠（n3只）脊髓背角线粒体，将稀释好备用的JC-1染色工作液中加入0.1ml总蛋白量为10-100μg纯化的线粒体（储存于storagebuffer，0.9ml5工作液加入0.1ml线粒体）在流式细胞仪上进行检测，结果提示与正常对照组小鼠相比，神经病理性痛(SNI)模型小鼠脊髓背-35- 空军军医大学硕士学位论文角线粒体膜电位出现了一定程度的降低（P0.05）；提示在神经病理性痛模型下小鼠脊髓背角线粒体的膜结构稳定性下降,可能会进一步诱导神经元出现细胞凋亡和坏死，从而影响脊髓背角神经元的结构和功能。4讨论我们课题组前期的研究发现发现持续性炎性痛和神经病理性痛等慢性痛状态下，小鼠脊髓背角浅层（I-II层）和深层（III-V层）内神经元线粒体发生形态可塑性改变，即散在、颗粒状转变为聚合、簇状。对于神经元来说，线粒体动力学过程能够保证对神经元不同的电活动提供能量支持，同时保证神经元内线粒体库中大部分线粒体处于正常工作状态，因此具有十分重要的生物学意义。而线粒体的形态可塑性势必会影响到线粒体的功能，那么在神经病理性疼痛的情况下，线粒体功能如何改变，一直以来都没有深入的研究报道。本研究通过流式细胞技术及多种生化手段，检测脊髓背角线粒体ATP产生效率、氧化应激产物（丙二醛、活性氧和过氧化氢）水平、线粒体膜电位变化及线粒体解偶联蛋白表达，发现在慢性痛状态下线粒体ATP产生效率下降、氧化应激水平上升、线粒体功能出现损伤，线粒体解偶联蛋白开启保护性机制。既往研究发现，腹腔注射ROS清除剂PBN（50mg/kg）能够缓解福尔马林炎性痛模型的痛行为；NAC（N-Acetyl-L-cysteine）当剂量为200mg/kg能够缓解痛行为，但剂量若为100mg/kg时则不能；TEMPOL当剂量为200mg/kg时能缓解痛行为，而当剂量为50mg/kg时，不仅不能够缓解痛行为，而且在慢性期反而会加重痛行为。结合我们的研究，进一步证实了线粒体氧化应激水平与疼痛的因果关联，同时我们发现了线粒体潜在的自我保护关键分子，但是这种自我保护机制是否能够达到镇痛效果依然未知。而明确UCP4对于线粒体开启自我保护机制参与疼痛调控过程对于我们深入理解慢性痛的脊髓机制至关重要，同时可能为临床提供新的干预靶点。同时，我们发现神经病理性痛模型（SNI）小鼠14d脊髓背角线粒体UCP4的表达量反馈性的上调，而此时的线粒体功能ATP产生效率反而降低，清除氧自由基能力也随之降低，线粒体膜电位水平降低；线粒体保护机制的失代偿现象可能是神[50]经病理性痛的重要机制之一，这也提示在神经病理性痛状态下线粒体的功能在14d失代偿，而UCP4的反馈性上调尚还没能达到缓解线粒体功能障碍的水平。我们设-36- 空军军医大学硕士学位论文想能否通过过表达脊髓背角浅层UCP4来改善神经病理性痛状态下的线粒体功能障碍进而缓解神经病理性痛呢？下一步实验我们将通过病毒干预脊髓背角浅层线粒体UCP4的方法来研究对神经病理性痛的影响。-37- 空军军医大学硕士学位论文第三部分：脊髓水平靶向干预UCP4表达后对小鼠痛行为学的影响1材料1.1实验动物选取8-10周龄健康雄性C57BL/6小鼠，体重为（222）g，由学校实验动物中心提供。小鼠提前适应周围环境一周，昼夜交替节律为12小时，室温控制在22-26℃左右，饮食和饮水自由充足，所有操作和处理都遵循学校伦理道德委员会和国际疼[36、71]痛研究协会的指导方针。1.2主要药物和试剂Mito-trackerRedCMXRos（vitrogen公司）；4%荧光金（Fluorochrome公司）；单克隆小鼠抗TH抗体（Sigma公司）；Alexa488驴抗小鼠抗体（Invitrogen公司）；UCP4干扰病毒（UCP4RNAi）pLKD-CMV-eGFP-U6-UCP4shRNA（滴度：84.5310V.G./ml,和元生物技术（上海）股份有限公司）；UCP4上调病毒（UCP4OE）pAAV-CMV-MTS-UCP4-EGFP-3FLAG（滴度：131.4910V.G./ml，和元生物技术（上海）股份有限公司）；β-actin(中杉金桥公司)；UCP4多克隆抗体（SantaCruz公司）；HRP(中杉金桥公司)；GAPDH（中杉金桥公司）；线粒体提取试剂盒（QIAGEN公司）；ATP酶测试盒（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（南京建成生物工程研究所）；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（碧云天生物技术研究所）；-38- 空军军医大学硕士学位论文PVDF膜（上海君创生物科技有限公司）；ECL发光液（ADVANSTA公司）；线粒体分离试剂盒（QIAGEN公司）。1.3主要液体的配置1）Loadingbuffer（SDS缓冲液）：6loading：0.5MTrisHCl（PH6.8）30ml；SDS5g；甘油15ml；溴酚蓝0.1g；加ddH2O定容至50ml；5loading：1ml6loading；200μlβ巯基乙醇（4℃冰箱存放）；1loading：5loading加ddH2O稀释2）碧云天SDS-PAGE试剂，4℃冰箱存放；3）电泳缓冲液：Tris3.02g，甘氨酸18.8g、SDS1g，加1000mlddH₂O搅拌溶解；4）转膜缓冲液：Tris3.03g，甘氨酸14.48g，甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml，配好之后需要冷藏；5）固相载体：NC膜（硝酸纤维素薄膜）；6）TBS-T（pH7.6）：TrisBase4.846g，NaCl16g，ddH2O160ml，加浓盐酸调节pH为7.6。每100ml需要用水稀释至1L，并加1ml吐温20；7）封闭液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g溶于20ml的TBST中（4℃冰箱存放）；8）显色液（现配，避光）：化学发光剂ADVANSTA，ECL发光液，A液和B液等体积混合，每张膜显色需要用200ml混合液；9）抗体稀释液：根据抗体说明书配制，溶剂为TBST（4℃冰箱存放）。1.4主要仪器热辐射刺激仪（北京凯辉盛达科技发展有限公司）；移液器（美国Gilson）；VonFrey纤维丝，（深圳沃瑞德公司）；电子天平（德国Sartoriou公司）；TP22普通摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）；流式细胞仪（美国BeckmanCoulter公司）；-39- 空军军医大学硕士学位论文紫外分光光度计（美国BIO-RAD公司）；荧光共聚焦显微镜(FV1000，Olympus公司）；凝胶成像系统（UniversalHood,美国伯乐BIO-RAD公司）；1μl微量注射器（美国Hamilton公司）；立体定位仪（深圳瑞沃德公司）；恒冷箱切片机（CM-1950，德国Leica公司）。2方法2.1UCP4相关病毒的制备使用neuro-2a神经瘤细胞进行病毒转染，建立稳定的病毒转染体系，根据基因水平和蛋白水平的结果筛选出将目的基因RNAi和OE的最优的质粒，送公司进行病毒包装。此处以UCP4干扰病毒载体为例进行说明，RNA干扰技术（RNAi）是指在进化的过程中高度保守的、由双链RNA（dsRNA）诱发的同源mRNA高效的特异性[72]降解的现象。RNAi具有很高的特异性和表达抑制基因的效率。设计针对鼠UCP4的shRNA干扰片段（见表1），主要是通过分子生物学手段将该干扰片段构建加入慢病毒载体（pLKD-CMV-eGFP-U6-shRNA）的U6启动子下游，该载体的优点是可以实现在干扰UCP4基因的同时表达绿色荧光蛋白EGFP基因，便于观察载体工作状态（见表2、3）。除了可以直接瞬时转染细胞用于UCP4基因的干扰，该载体更可以包装慢病毒用于稳定株的筛选以及在动物水平干扰UCP4基因的表达。表1siRNA序列MarkerGeneGeneIDTargetSeqGC%Y3342UCP4NM-028711GGATGATGGCTGGTGTCAT52.6Y3343UCP4NM-028711GCAGGCTGGATACCCAATA52.6Y3344UCP4NM-028711CCCACGGCTTATCCAGTTT52.6Y004NCTTCTCCGAACGTGTCACGT52.6-40- 空军军医大学硕士学位论文表2病毒载体构建框架NO.5’STEMLoopSTEM3’Y3342-GGATGATGGCTGGTcTCAAGAGATGACACCAGCCATTTTCcggFGTCATATCATCCTTgY3342-GGATGATGGCTGGTTCTCTTGAATGACACCAGCCAaattcaaaaaaRGTCATgTCATCCY3343-GCAGGCTGGATACCcTCAAGAGTATTGGGTATCCATTTTCcggFCAATAAGCCTGCTTgY3343-GCAGGCTGGATACCTCTCTTGATATTGGGTATCCAaattcaaaaaaRCAATAgGCCTGCY3344-CCCACGGCTTATCCcTCAAGAGAAACTGGATAAGCTTTTCcggFAGTTTACGTGGGTTgY3344-CCCACGGCTTATCCTCTCTTGAAAACTGGATAAGCaattcaaaaaaRAGTTTgCGTGGGTTCTCCGAACGTGTTTCAAGAACGTGACACGTTCTTTTY004-FCCGGCACGTGAGGAGAATTGAATTCAAATTCTCCGAACGTGTTCTCTTGAACGTGACACGTTCY004-RAAACACGTAGGAGAA表3DNA引物片段Y3342-FCcggGGATGATGGCTGGTGTCATcTCAAGAGAATGACACCAGCCATCATCCTTTTTTgY3342-RaattcaaaaaaGGATGATGGCTGGTGTCATTCTCTTGAgATGACACCAGCCATCATCCY3343-FCcggGCAGGCTGGATACCCAATAcTCAAGAGATATTGGGTATCCAGCCTGCTTTTTTgY3343-RaattcaaaaaaGCAGGCTGGATACCCAATATCTCTTGAgTATTGGGTATCCAGCCTGCY3344-FCcggCCCACGGCTTATCCAGTTTcTCAAGAGAAAACTGGATAAGCCGTGGGTTTTTTgY3344-RaattcaaaaaaCCCACGGCTTATCCAGTTTTCTCTTGAgAAACTGGATAAGCCGTGGGY004-FCCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTGAATTCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAY004-RA-41- 空军军医大学硕士学位论文图3-1UCP4病毒载体构建示意图。图示：设计针对mouseUCP4的shRNA干扰片段。通过分子生物学手段将该干扰片段构建入慢病毒载体（pLKD-CMV-eGFP-U6-shRNA）的U6启动子下游，该载体可以实现干扰UCP4基因的同时表达绿色荧光蛋白EGFP基因。2.2UCP4相关病毒脊髓背角浅层定位注射按照实验流程示意图将小鼠进行以下分组：（1）SNI模型组小鼠（n8只）；（2）sham组小鼠（n8只）；（3）正常对照组（n8只）；（4）SNI模型+UCP4OE病毒（n8只）；（5）正常对照组+RNAi病毒（n8只）。在给予UCP4OE病毒两周后[51]进行SNI造模。参照文献脊髓背角浅层定位注射UCP4病毒过程如下：清洁消毒手术器械，微量注射器，立体定位仪，冰上融化病毒，微量注射器吸取1μl，麻醉后沿中线切开皮肤，行L4椎板切除术，暴露脊髓（注意避免损伤脊髓），注射器置于后正中沟上方，侧向移动尖端300-400μm，从脊髓表面向下进针80-100μm,缓慢注入病毒0.2μl,速度50nl/min，注射后静置5min收回注射器；依次缝合筋膜，皮肤；将小鼠放在温度合适（约25℃左右）的地方（如恒温加热板）恢复，待清醒即可放回笼子中。病毒感染成功后进行小鼠脊髓背角UCP4蛋白和mRNA水平表达变化检测、线粒体生物学功能检测以及痛行为学检测；技术路线图如下：图3-2脊髓背角UCP4病毒定位注射技术路线图。图示：根据实验目的将动物分为SNI模型组小鼠（n8只）；sham组小鼠（n8只）；正常对照组（n8只）；SNI模型+UCP4OE病毒（n8-42- 空军军医大学硕士学位论文只）；正常对照组+RNAi病毒（n8只），对模型组小鼠脊髓背角浅层分别定位注射UCP4OE（Over-expression）、UCP4RNAi（RNAinterference）病毒；在病毒感染成功后分别进行痛行为学、分子生物学以及线粒体功能的检测。2.3SNI模型制备[41、42]按照Decosterd等方法制备SNI模型：1)7％水合氯醛（20mg/kg）腹腔注射麻醉;2)依次分离左后肢股外缘侧面皮肤层和肌肉层（钝性分离开股二头肌）；3)显示出坐骨神经主干及其3个分支：依次为胫神经、腓总神经和腓肠神经；4)用6-0丝线分别双重结扎胫神经和腓总神经，并在中间将其切断，注意保护腓肠神经免受损伤。假手术组只切开皮肤、肌肉后只暴露坐骨神经干及其三个分支而不做切断处理；5)术后逐层缝合伤口，动物在痛行为学测试前恢复一天，以免影响测试结果。2.4UCP4病毒干预后小鼠痛行为学检测根据不同病毒在小鼠体内感染情况的不同，慢病毒（LV,UCP4RNAi）在定位注[52]射5-7天后可进行行为学检测，而腺相关病毒（AAV,UCP4OE）为两周。[42,71]机械痛阈值测定：参照Dixon方法进行。将小鼠置于升高的金属网上，并盖以透明的有机玻璃罩，适应周围环境30min，用vonFrey纤维丝由弱到强（0.008g、0.02g、0.04g、0.07g、0.16g、0.40g、0.60g、1.0g、1.4g、2.0g）刺激左侧足底腓肠神经支配皮肤敏感区域，逐渐加压使之成“S”形持续约6-8s，观察小鼠是否出现快速的抬足、舔足以及抖足等阳性反应。给予间断刺激10次，将能够诱发出4-6次抬足、舔足以及抖足等阳性反应统计为50%的反应率，其压力的平均值视为阈值。热痛阈测定：小鼠热辐射刺激潜伏期使用RYT-1型热痛刺激仪来进行测定。参[43]照Hargreaves等方法将小鼠置于铁架的玻璃板上，罩以透明的有机玻璃罩，适应环境20min后进行测试。功率设定为25W，刺激足底正中央，记录小鼠出现缩足反应的时间s，注意同一足底两次刺激的时间间隔应大于10min。单次照射足底时间不能超过30s。避免热辐射对小鼠足底造成灼伤。每只小鼠照射3次，结果取其平均值。-43- 空军军医大学硕士学位论文2.5WesternBlot检测UCP4蛋白水平的表达检测：1)分别提取腰段脊髓背角全组织和线粒体中的蛋白，蛋白定量采用BCA方法；2)加样（目的蛋白）、SDSPAGE电泳（80V,30min；120V，60min）、转膜（PVDF膜）；3)封闭（5%脱脂奶粉脱色，摇床上最慢速，室温2-3h），洗膜（TBST，10min×3次）；4)加一抗：按照抗体说明书和条带序列依次对应加入β-actin抗体(小鼠抗，1:5000)、UCP4抗体（小鼠抗，1:200）、GAPDH抗体(兔抗，1:5000)，密封自封袋在4℃过夜；5)加二抗：将一抗孵育好的膜取出，用TBST清洗10-15min3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1:5000）、HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1:5000），室温震荡孵育1.5h；6)TBST洗膜10min3次后目的条带进行ECL化学发光（发光液现用现配）；7)蛋白相对灰度值使用ImageJ软件进行计算分析。2.6RT-qPCR检测UCP4mRNA表达水平的检测分析：1）提取腰段脊髓背角组织，提取脊髓背角组织的总RNA（采用Trizol试剂法），测定RNA浓度（紫外分光光度计法）；并用1%琼脂糖凝胶80V,15min电泳鉴定提取RNA的完整性；2）合成cDNA（以RNA为模板），RT-qPCR检测；3）UCP4引物序列为：Forward:5'–CTCAGAGCCAACCGAATAGC–3'；Reverse:5'–GGCTGACAGATGCAACAGAA–3'，设定内参为GAPDH（购自生工生物工程有限公司，北京）；4）反应条件：设定程序按照两步法来进行Real-time定量：（1）预变性温度为95℃，时间为15s；（2）之后每一步变性温度为95℃，时间为5s，退火，并延伸60℃30s，共进行40个循环；5）扩增后做溶解曲线以检测产物的均一性；-44- 空军军医大学硕士学位论文-△△Ct6）计算相对含量采用2方法进行统计分析。2.7线粒体生物学功能检测线粒体生物学功能检测内容主要包括：（1）线粒体能量合成功能检测；（2）线粒体的氧化应激功能检测；（3）线粒体膜结构稳定性的检测。线粒体能量合成检测方包括法：NADH（complexI）、琥珀酸-辅酶Q还原酶（complexII）、细胞色素C还原酶（complexIII）、环氧酶COX（complexIV）、ATP酶（complexV）活性、ATP含量均为ELISA试剂盒进行紫外或荧光检测；ATP酶是位于细胞膜以及细胞器膜上的一种蛋白酶，它起着物质运输、信息传递以及能量转换的作用。线粒体氧化应激功能检测方法：DCSF荧光ELISA检测ROS水平、酶标仪检测谷胱甘肽微量还原型谷光甘肽（GSH）、可见分光光度计测定超氧化物歧化酶（SOD）-含量。GSH为一种低分子自由基的清除剂，它可以清除O2、H2O2等，并且能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅助因子受到氧化损伤的作用。线粒体膜结构稳定性检测方法：线粒体膜电势的破坏是导致线粒体膜结构稳定性降低的重要原因，常用的检测方法包括mtDNAPCR检测、JC-1染色流式细胞仪检测线粒体膜电位（MMP）、Mito-tracker荧光探针激光共聚焦显微镜观察等。1）ATP能量合成检测：a)取小鼠腰段脊髓背角进行组织匀浆或提取线粒体；b)标准品按测定浓度进一步稀释目的浓度；c)加样：设空白对照孔、待测样品孔；d)37℃温育30min、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、终止反应；e)测定：以空白孔调零，测量各孔的OD值（在450nm波长下）；根据标准曲线计算ATP含量。2）超氧化物歧化酶（SOD）及还原型谷胱甘肽（GSH）测试：根据超氧化物歧化酶（SOD）测试盒说明书和微量还原型谷胱甘肽（GSH）测试盒说明书（南京建成生物工程研究所）来测定GSH及SOD的含量。a)样本前期处理：组织样本上清液的制备（参照说明书）；-45- 空军军医大学硕士学位论文b)加样：设定空白、对照、待测样品孔等；c)测定：以空白孔调零，用酶标仪、可见分光光度计测量各孔的OD值，根据标准曲线进行计算；d)计算公式见下：3）线粒体膜电位检测：线粒体膜稳定性检测包括mtDNAPCR检测、JC-1染色流式细胞仪检测线粒体膜电位(MMP)、Mito-tracker荧光探针激光共聚焦显微镜观察；JC-1检测试剂盒可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化，检测细胞的线粒体膜电位变化需要模拟氧化应激损伤模型（使用流式细胞仪检测）。具体实验操作步骤如下：a)配制JC-1染色工作液，并用JC-1缓冲液稀释；b)加入脊髓背角线粒体/细胞；c)流式细胞仪检测；d)分析结果。2.8统计学分析所有数据采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据资料按均数标准误（MeanSEM）表示，组间比较采用One-WayAVOVA单因素方差分析，若总体结果具有统计学意义，则采用SNK-q检验进行组间两两比较，P0.05为差异有统计学意义。3结果3.1小鼠脊髓背角浅层定位注射感染部位验证1）脊髓背角浅层定位注射荧光金确定感染部位：在小鼠脊髓背角浅层定位注射4%荧光金（生理盐水），注射位点（脊髓正中线-46- 空军军医大学硕士学位论文旁开300-400μm，从脊髓表面向下进针80-100μm,缓慢注入荧光金0.2μl）（示意图见图3-3A），注射完成后原位留针五分钟。第二天进行后灌注取材、切片、裱片后在荧光显微镜下观察（激发光波长为350-395nm,发射光波长为430nm）注射区域的准确性（见图3-3B），进而确定脊髓背角注射位点的坐标。2）脊髓背角浅层UCP4病毒感染情况按照实验分组分别进行UCP4相关病毒的脊髓背角浅层的定位注射，在UCP4过表达（UCP4OE）病毒感染两周后，UCP4干扰（UCP4RNAi）病毒感染一周后灌注取材观察病毒在腰段脊髓背角浅层的感染情况。通过荧光共聚焦显微镜拍片可见（见图3-3C）UCP4病毒绝大部分都感染在了脊髓背角的浅层，主要集中在脊髓背角的Ⅰ-Ⅱ层，一小部分表达在Ⅳ-Ⅴ层；说明病毒注射部位准确，为后续的进一步实验打下基础。3）脊髓背角UCP4病毒与Mito-Marker共标情况图3-3脊髓背角浅层定位注射UCP4病毒感染示意图。图A，显示小鼠脊髓背角浅层的立体定位注射模式图；图B，显示脊髓背角定位注射荧光金摸索注射坐标；图C，显示UCP4病毒在脊髓背角浅层的定位感染；图D，显示脊髓背角浅层Mito-Marker的表达分布；图E，显示脊髓背角浅层UCP4病毒的表达分布；图F，显示脊髓背角浅层中UCP4病毒与Mito-Marker共标情况。标尺200μm（B）；100μm（C）；40μm（D-F）。为进一步观察线粒体UCP4病毒感染部位的准确性，我们将UCP4RNAi病毒和线粒体标记物Mito-Marker的混合液进行脊髓背角浅层的定位注射；其中Mito-Marker-47- 空军军医大学硕士学位论文先溶于DMSO溶液，使用浓度为100nM。在注射7-10天左右进行灌注、取材、切片、裱片等一系列过程后在荧光共聚焦显微镜下进行拍片。UCP4RNAi病毒是绿色荧光（见图3-3E），而Mito-Marker是生物素标记的红色荧光（见图3-3D）,可以看到两者绝大部分是共标（见图3-3F），证实UCP4病毒感染在线粒体上的准确性，为后续进一步的行为学检测和线粒体生物学功能检测打下基础。3.2UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角UCP4mRNA水平的表达变化为进一步验证UCP4病毒干预后脊髓背角线粒体UCP4mRNA水平的表达变化，我们分别提取SNI组（n3只）、SNI+UCP4OE组（n3只）、CONTROL组（n3只）、CONTROL+UCP4RNAi组（n3只）脊髓背角组织的RNA进行RT-qPCR的检测，从图3-4分析结果可以得知：SNI+UCP4OE组与SNI组相比UCP4mRNA表达水平明显升高（P0.05）（见图3-4A）；而CONTROL+UCP4RNAi组与CONTROL组相比UCP4mRNA表达水平明显降低（P0.05）（见图3-4B）AB1.52.0*1.51.01.0*0.5UCP4/GAPDH0.5UCP4/GAPDH0.00.0SNICONTROLSNI+UCP4OECONTROL+UCP4RNAi图3-4UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角UCP4mRNA水平的变化。图A显示脊髓背角内注射UCP4OE病毒后，小鼠脊髓背角UCP4mRNA水平的变化：SNI+UCP4OE组与SNI组相比UCP4*mRNA表达水平明显升高。P0.05；图B显示脊髓背角内注射UCP4RNAi病毒后，小鼠脊髓背角UCP4mRNA水平的变化：CONTROL+UCP4RNAi组与CONTROL组相比UCP4mRNA*表达水平明显降低。P0.05。n3只。-48- 空军军医大学硕士学位论文3.3UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角UCP4蛋白水平的表达变化图3-5UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角UCP4蛋白水平的变化。图A示UCP4OE病毒干预后小鼠脊髓背角UCP4蛋白水平的Western-Blot检测。图B示UCP4RNAi病毒干预后小鼠脊髓背角UCP4蛋白水平的Western-Blot检测。图C示SNI+UCP4OE组小鼠脊髓背角线粒体中UCP4蛋*白表达量与SNI组、SNIUCP4OE(BLANK)组相比有一定程度升高。P0.05。图D示CONTROL+UCP4RNAi组小鼠脊髓背角线粒体UCP4蛋白表达量与CONTROL+UCP4(BLANK)组以及*CONTROL组相比出现了明显的下降。P0.05。n6只。WesternBlot分别检测神经病理性痛模型（SNI）组（n6只）、SNIUCP4OE(BLANK)（空病毒）组（n6只）、SNIUCP4OE组（n6只）、CONTROLUCP4RNAi组（n6只）、CONTROLUCP4RNAi(BLANK)组（n6只）以及CONTROL组（n6只）组小鼠腰段脊髓背角线粒体中UCP4蛋白的表达变化。结果发现SNI+UCP4OE组小鼠脊髓背角线粒体中UCP4蛋白表达量与SNI组、SNIUCP4OE-49- 空军军医大学硕士学位论文(BLANK)组相比有一定程度升高，差异具有统计学意义（P0.05）（如图3-5A、C）；而CONTROLUCP4RNAi组小鼠脊髓背角线粒体UCP4蛋白表达量与CONTROLUCP4RNAi(BLANK)组以及CONTROL组相比出现了明显的下降（P0.05）（如图3-5B、D）。WesternBlot检测结果验证病毒注射能够有效的干预脊髓背角UCP4蛋白的表达。3.4UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角线粒体生物学功能的变化1）UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角线粒体ATP产生效率的变化AB0.3*0.40.30.2*efficiency0.2efficiency0.10.10.00.0mitochondrialATPgenerationmitochondrialATPgenerationSNICONTROLSNI+UCP4OECONTROL+UCP4RNAi图3-6UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角线粒体ATP产生效率水平的变化。UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角线粒体ATP产生效率水平的变化：图A示SNI+UCP4OE组与SNI组相比ATP产生*效率明显升高。P0.05。图B示CONTROL+UCP4RNAi组与CONTROL组相比ATP产生效*率明显降低。P0.05。n3只。在UCP4病毒干预后脊髓背角线粒体ATP合成功能的检测中，我们分别提取SNI组（n3只）、SNI+UCP4OE组（n3只）、CONTROL组（n3只）、CONTROL+UCP4RNAi组（n3只）腰段脊髓背角中的线粒体，利用ATP检测试剂盒进行ATP产生效率的检测。结果提示SNI+UCP4OE组与SNI组相比ATP产生效率明显升高（P0.05）（见图3-6A）；而CONTROL+UCP4RNAi组与CONTROL组相比ATP产生效率明显降低（P0.05）（见图3-6B）。提示脊髓背角中线粒体UCP4的变化能够影响线粒体能量合成的功能。-50- 空军军医大学硕士学位论文2）UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角线粒体氧化应激功能的变化图3-7UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角线粒体氧化应激水平的变化。UCP4相关病毒干预后小鼠脊髓背角线粒体氧化应激水平的变化：SNI+UCP4OE组和SNI组之间相比GSH（图A）和SOD*（图B）活性水平明显出现了上调，P0.05。CONTROL+UCP4RNAi组和CONTROL组相比*较GSH（图C）和SOD（图D）活性水平出现了明显的降低。P0.05。n6只。在UCP4病毒干预后脊髓背角线粒体氧化应激功能的检测中，我们分别提取SNI组（n6只）、SNI+UCP4OE组（n6只）、CONTROL组（n6只）、CONTROLUCP4RNAi组（n6只）腰段脊髓背角中的线粒体，利用GSH检测试剂盒和SOD检测试剂盒分别进行GSH和SOD活性水平的检测。结果提示（1）SNIUCP4OE组和SNI组之间相比GSH和SOD活性水平明显出现了上调（P0.05）（见图3-7A,B）；-51- 空军军医大学硕士学位论文（2）CONTROLUCP4RNAi组和CONTROL组相比较GSH和SOD活性水平出现了明显的降低（P0.05）（见图3-7C,D）；提示在脊髓背角给予病毒干预后能够改变脊髓背角线粒体的氧化应激功能，ROS在慢性痛的发生发展过程中起着重要的作用，[54、55、56]今后有可能成为疼痛治疗中的靶点之一。3）UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角线粒体膜电位水平的变化AB1.5*1.0MMP0.50.0SNISNISNI+UCP4OESNI+UCP4OECD1.51.0*MMP0.50.0CONTROLCONTROL+UCP4RNAiCONTROLCONTROL+UCP4RNAi图3-8UCP4病毒干预后小鼠脊髓背角线粒体膜电位水平的变化。图A示流式细胞仪检测SNI+UCP4OE组和SNI组小鼠脊髓背角线粒体膜电位；图B示UCP4OE干预后小鼠脊髓背角线粒体膜电位水平的变化：SNI+UCP4OE组和SNI组之间相比线粒体膜电位水平明显出现了上调-52- 空军军医大学硕士学位论文*P0.05；图C示流式细胞仪检测CONTROL+UCP4RNAi组和CONTROL组小鼠脊髓背角线粒体膜电位；图D示CONTROL+UCP4RNAi组和CONTROL组相比较线粒体膜电位水平出现*了明显的降低。P0.05。n3只（MMP:Mitochondrialmembranepotential）。分别提取纯化神经病理性痛（SNI）模型小鼠（n3只）和正常对照组小鼠（n3只）脊髓背角的线粒体，将稀释好备用的JC-1染色工作液中加入0.1ml总蛋白量为10-100μg纯化的线粒体（储存于storagebuffer，0.9ml5工作液加入0.1ml线粒体）在流式细胞仪上进行检测。分析结果提示（1）SNIUCP4OE组和SNI组之间相比线粒体膜电位水平明显出现了上调（P0.05）（见图3-8A,B）；（2）CONTROLUCP4RNAi组和CONTROL组相比较线粒体膜电位水平出现了明显的降低（P0.05）（见图3-8C,D）；提示在脊髓背角给予UCP4病毒干预后能够改变脊髓背角线粒体的膜电[57、58、59]位水平，即细胞膜的结构稳定性，这与之前文献中报道的相吻合。3.5UCP4OE病毒能够上调神经病理性痛模型（SNI）小鼠机械痛阈值，UCP4RNAi病毒能够下调正常小鼠的机械痛阈值1）在脊髓背角浅层注射UCP4OE病毒两周后进行SNI模型的制备,同时设置不给予UCP4OE病毒的SNI组和sham组；术后恢复一天后分别对SNI+UCP4OE病毒组小鼠、SNI模型组小鼠和sham组模型小鼠进行机械痛行为学的检测。结果提示假手术（sham）组术后机械痛阈值与术前无明显变化，约0.65g左右；与假手术（sham）组相比,SNI模型术后的第1、3、5、7、10、14d小鼠神经损伤侧后足出现明显的机械痛阈值的降低（P0.05）。而SNIUCP4OE病毒组小鼠与SNI组小鼠机械痛阈值相比有一定幅度的回升（P0.05），说明在给予UCP4OE病毒干预后，SNI模型小鼠的机械痛敏得到一定程度的缓解，提示UCP4的上调能够缓解神经病理性痛所导[53]致的机械痛敏（见图3-9A）。2）在脊髓背角浅层定位注射给予UCP4RNAi病毒后，与正常对照组小鼠分别进行机械痛敏的检测。结果发现在给予UCP4RNAi病毒注射后的前五天机械痛敏的检测与正常对照组没有统计学差异（P0.05），这可能与UCP4RNAi病毒在脊髓背角尚处于感染阶段有关。在第7、10、14d的机械痛敏检测中发现，与正常对照组相比，注射UCP4RNAi病毒组小鼠机械痛阈值下降到了0.4g左右，具有统计学差异（P0.05）；提示小鼠腰段脊髓背角浅层中UCP4的下调能够导致机械痛敏的发生和-53- 空军军医大学硕士学位论文发展（见图3-9B）。A)0.90.80.70.60.5sham0.40.3SNI0.2SNI+UCP4OEPawwithdrawal0.1mechanicalthreshold(g0.0013571014DaysaftersurgeryB0.80.70.6CONTROL0.50.4CONTROL+0.3UCP4RNAi0.2Pawwithdrawal0.1mechanicalthreshold(g)0.0013571014Daysaftersurgery图3-9UCP4病毒干预后小鼠机械痛行为的变化。图A示在脊髓背角给予UCP4OE病毒后小鼠的机械痛行为学的变化；图B示在脊髓背角给予UCP4RNAi病毒后小鼠的机械痛行为学的变化*P0.05。n8只。4讨论本部分实验综合运用病毒干预、行为学、分子生物学以及线粒体生物学功能的检测方法观察了在小鼠脊髓背角UCP4病毒干预后UCP4的表达变化、线粒体生物学功能的变化以及疼痛行为学的改变。结果发现：（1）造模14天后取材发现无论是[60]蛋白水平还是mRNA水平，给予UCP4上调（UCP4OE）病毒后小鼠与神经病理性痛（SNI）模型组小鼠相比表达量都明显的提高；脊髓背角线粒体ATP产生效率，清除氧自由基能力，线粒体膜电位水平与单纯神经病理性痛模型组小鼠相比均有所-54- 空军军医大学硕士学位论文提高，机械痛阈值有所提高。（2）当给予脊髓背角浅层定位注射UCP4下调（UCP4RNAi）病毒，同时与正常对照组小鼠进行比较。发现造模14天后取材检测：无论是蛋白水平还是mRNA水平，给予UCP4下调病毒后小鼠与正常对照组小鼠相比表达量都明显的降低；脊髓背角线粒体ATP产生效率，清除氧自由基能力，线粒体膜电位水平与正常对照组小鼠相比均有所较低，机械痛阈值明显降低。由以上结果可以得知脊髓背角浅层线粒体中UCP4能够通过控制ATP产生效率、清除氧自由基、维持膜电位的稳定性等神经细胞的保护作用来缓解神经病理性痛。之前文献报道UCP家族能够通过调节钙离子的通量、ATP含量、氧自由基的产生以及线粒体膜结构的稳定性来影响神经递质的传递、突触可塑性、神经元的凋亡以及神经退行性变[61-63]过程；而神经元的凋亡、ROS的紊乱又在慢性痛的发展进程中起着重要的作用[64]。而小鼠脊髓背角浅层线粒体中UCP4正是通过控制ATP产生效率，清除氧自由基，调控线粒体膜电位水平等途径来缓解神经病理性痛。但是脊髓背角浅层线粒体UCP4在缓解神经病理性痛的机制中是如何影响到下游分子通路的尚需要利用基因敲除小鼠联合神经分子生物学、行为学、形态学等技术进一步研究。-55- 空军军医大学硕士学位论文小结本实验在神经病理性痛（SNI）模型小鼠基础上，综合运用了神经形态学、行为学、转录组测序、分子生物学、病毒干预以及线粒体功能检测等方法观察UCP4在脊髓背角的表达变化以及病毒干预后对小鼠痛行为学的影响；得出如下小结：（1）脊髓背角UCP4主要表达于神经元中，且UCP4表达水平呈神经元体积依赖型；部分星形胶质细胞表达UCP4，小胶质细胞中未见UCP4表达。（2）与sham组小鼠相比较，SNI小鼠脊髓背角UCP4蛋白和mRNA表达明显上调；同时伴随线粒体功能障碍，表现为：ATP产生降低、氧自由基清除能力降低以及线粒体膜电位水平降低。（3）脊髓背角线粒体UCP4可能通过控制ATP产生效率、清除氧自由基以及维持线粒体膜电位稳定性等神经元保护作用缓解神经病理性痛的发生和发展。-56- 空军军医大学硕士学位论文参考文献[1]LoeserJD,TreedeRD.TheKyotoprotocolofiaspbasicpainterminology.Pain,2008,137(3):473-477.[2]WuSX，WangW，LiH，etal．Thesynapticconnectivitythatunderliesthenoxioustransmissionandmodulationwithinthesuperficialdorsalhornofthespinalcord.ProgNeurobiol,2010,91:38-54.[3]TreedeRD,RiefW,BarkeA,etal.AclassificationofchronicpainforICD-11.Pain,2015,156:1003-1007[4]Sivilotti,L.andC.J.Woolf.ThecontributionofGABAAandglycinereceptorstocentralsensitization:disinhibitionandtouch-evokedallodyniainthespinalcord.JNeurophysiol,1994,72(1):169-179.[5]潘凌立，潘达，廖卫兵,等.线粒体靶向药物的研究进展.医学综述,2015,21（1）：37-39.[6]DongJX，ZhaoGY，YuQL，etal.Mitochondrialdysfunctioninducedbyhonokiol.JMembrBiol,2013，246(5):375-385.[7]MelzackR,WallPD.Painmechanisms:Anewtheory.Science,1965,150:971-979.[8]DuanB,ChengL,BouraneS,etal.Identificationofspinalcircuitstransmittingandgatingmechanicalpain.Cell,2014,159,1417-1432.[9]LuY,DongH,GaoY,Gong,etal.Afeed-forwardspinalcordglycinergicneuralcircuitgatesmechanicalallodynia.J.Clin.Invest,2013,123:4050-4062.[10]BasbaumAI,BautistaDM,ScherrerG,etal.Cellularandmolecularmechanismsofpain.Cell,2009,139(2):267-284.[11]GrahamBA,AMBrichta,andRJCallister.Movingfromanaveragedtospecificviewofspinalcordpainprocessingcircuits.JNeurophysiol2007,98(3):1057-1063.-57- 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空军军医大学硕士学位论文个人简历和研究成果个人简历王圣明，男，汉族，中共党员，1987年12月出生于河南郸城。2005，08-2010，06：空军军医大学临床医学专业，获学士学位。2010，07-2013，12：陆军第54集团军直属工兵团舟桥营卫生所，军医。2013，12-2015，08：解放军郑州第153中心医院超声科，军医。2015，08-至今：空军军医大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学教研室，硕士研究生。研究成果1.王圣明，拜云虎，吴菲菲,王东辉，王嘉琪，戴春秋，杨雁灵，王亚云（通讯作者）。急性肝衰竭小鼠线粒体分裂蛋白DRP1在肝脏和大脑皮层的表达变化.神经解剖学杂志，2017，33(3):311-316。2.王圣明，王亚云（通讯作者），冯宇鹏，张明明，陈晶，寇珍珍，李云庆，杨雁灵。超声成像技术在解剖学实验教学中的新应用.解剖学杂志，2017，40（5）：646-647。3.王嘉琪，王圣明（共同第一作者），严育东，孔牧，罗世城，杨静，戴春秋，杨雁灵，王亚云（通讯作者）。脊髓背角I-III层疼痛神经环路的研究进展.神经解剖学杂志，2017，33(4):469-475。4.拜云虎，王圣明，谢祥军，吴菲菲，王亚云（通讯作者），杨雁灵。解耦联蛋白在肝性脑病小鼠黑质和前额叶皮层中表达变化.神经解剖学杂志，2018，34(1):9-14。5.罗婷婷，王嘉琪，王圣明，戴春秋，拜云虎，王亚云，武胜昔。基于FISH技术研究线粒体分裂蛋白Drp1mRNA在小鼠杏仁复合体的分布［J］.神经解剖学杂志，2017,33（2）：149-154。6.ZhengChenxi,WangShengming,BaiYunhu,WangYayun.Lentiviralvectorsandadeno-associatedvirusvectors:usefultoolsforgenetransferinpainresearch.The-64- 空军军医大学硕士学位论文anatomicalrecord,2018,301:825-836.7.DaiChunqiu,LuoTingting,LuoShicheng,WangJiaqi,WangShengming,WangYayun.P53andmitochondrialdysfunction:novelinsightofneurodegenerativedisease.JBioenergBiomembr,2016,48(4):337-347.-65- 空军军医大学硕士学位论文致谢光阴荏苒，三年的硕士研究生学习生涯即将结束，在这三年紧张而又充实的学习期间，我得到了很多老师、同学、同事和朋友的关心和支持。在学位论文即将完成之际，我要向所有在硕士研究生三年期间给予我鼓励和帮助的人表示我最衷心的感谢和诚挚的敬意。首先，我要深深感谢我的导师王亚云教授，本实验是在您的指导下完成的，从课题的设计、实验的进程到论文的完成无不凝聚着您的汗水和心血；您严谨的治学态度，敏锐的观察力和强烈的责任心无时无刻都在激励着我前进，并对我以后的工作和学习生活产生深远的影响。借此机会，我谨向我的导师王亚云教授致以深深的谢意。其次，我要感谢第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室李辉主任、李云庆教授、李金莲教授、张富兴教授、陈涛教授、史娟副教授、董玉琳副教授、冯宇鹏老师、张勇老师、张婷老师、陈晶老师、黄静老师、张明明老师、寇珍珍老师、陈琨老师在我学习、实验和生活中对我无私的帮助和关照；感谢教研室革军博士后、王舰、万发萍、尹俊滨、孙毅、张春奎、吴振宇、白杨、任丹等博士，王晓东、李佳妮、杨罡、腾孝宇、陈晏冰等硕士，吴菲菲、张沁、高迎颖等实验员，马小莉、吴晓华、冯小莉等老师在我的实验工作和生活上给予的极大的帮助。感谢郭保霖、拜云虎、谢祥军等硕士在我硕士研究生期间给予的无私帮助。同时感谢我所在单位科室的主任和同事们，是你们的帮助和支持让我在学校安心读书；也衷心感谢我的家人和朋友，是你们的支持和鼓励让我顺利完成学业。最后，我要感谢参与我毕业论文评阅和答辩的各位老师，十分感谢你们百忙之中抽出时间评阅论文；是你们给了我总结和展示这三年学习成果的机会，同时也让我明确了自己今后的职业规划和发展方向，谢谢你们对我的指导和帮助。我将在今后的工作和学习中加倍努力，用更好的成绩报答所有支持和帮助过我的人。-66-
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