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《苦杏仁苷对慢性阻塞性肺疾病小鼠肺组织上皮间质转化的作用及机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：Ｒ９６３单位代码：１０１８３研究生学号：２０１５７１２０６３密级：公开吉林大学硕士学位论文学术学位（）苦杏仁苷对慢性阻塞性肺疾病小鼠肺组织上皮间质转化的作用及机制研究ＴｈｅＥｆｆｅｃｔａｎｄＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＡｍｄａｌｉｎｏｎｙｇｔ－ｒｍａｔＥｌＭｅｓｅｎｃｈｌＴｒａｎｓｆｏｉｎｔｈｅＬｕｎｏｆＭｉｃｅｗｉｔｈｐｉｈｅｌｉａｙｍａｉｏｎｇＣｈｒｏｎｉｃＯｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅＰｕｌｍｏｎａｒＤｉｓｅａｓｅｙ姓名：方克勇专业：药理学研究方向：免疫药理学导师：乔萍副教授培养单位：基础医学院－２０１８年４月 苦杏仁苷对慢性阻塞性肺疾病小鼠肺组织上皮间质转化的作用及机制研究TheEffectandMechanismofAmygdalinonEpithelial-MesenchymalTransformationintheLungofMicewithChronicObstructivePulmonaryDisease作者姓名：方克勇专业名称：药理学指导教师：乔萍副教授学术类别：医学硕士答辩日期：2018524年月日 未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学博士或硕士）学位论文原创性声明（本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文？不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。：学位论文作者签名：〇沉年尸曰期：＞月沁日 摘要苦杏仁苷对慢性阻塞性肺疾病小鼠肺组织上皮间质转化的作用及机制研究慢性阻塞性肺疾病(ChronicObstructivePulmonaryDisease,COPD)是一种以持续性、进行性发展的气流受限为主要特征的慢性炎症性肺疾病。吸烟及环境污染是COPD发生的主要原因。预计到2020年COPD将成为全球第三大死亡原因。COPD的最重要的病理生理变化是气道重塑，它是COPD患者气流受限，肺功能持续进行性下降的重要原因。气道重塑的发生机制复杂，尚未完全阐明。多项研究表明COPD患者气道内存在上皮细胞间质转化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）现象，而且EMT和气道重塑的发生密切相关，因此抑制甚至逆转EMT过程，有望成为治疗COPD的新方法。苦杏仁苷（Amygdalin）是传统中药苦杏仁中有效成分，其药理作用广泛，研究表明苦杏仁苷在抑制肺纤维化、肝纤维化和肾间质纤维化等组织纤维化疾病方面作用显著，而组织纤维化的发生与EMT密切相关，我们推断苦杏仁苷可能抑制EMT过程。本论文旨在研究苦杏仁苷对COPD小鼠肺组织EMT发生的抑制作用并探讨其作用机制，为开发治疗COPD的药物打下基础。本研究首先通过香烟烟雾（CS）刺激人支气管上皮细胞株（BEAS-2B）72h，并同时用不同浓度苦杏仁苷干预，观察BEAS-2B细胞EMT水平。结果显示，CS处理后BEAS-2B细胞中上皮标志物E钙黏素(E-cadherin)表达显著下降，间质标志物波形蛋白(Vimentin)表达水平显著上升，加入苦杏仁苷干预后BEAS-2B中E-cadherin表达显著上升，Vimentin表达显著下降，转化生长因子β1(TransformingGrowthFactor-beta1，TGF-β1)、磷酸化的smad2/3(phosphorylatedsmad2/3，psmad2/3)表达显著下降。这表明苦杏仁苷在体外可以抑制由CS刺激引起的BEAS-2B细胞EMT过程，这种抑制作用可能是通过抑制TGF-β/smad通路实现的。然后，我们通过烟熏小鼠构建COPD模型，腹腔注射苦杏仁苷干预，通过肺功能仪检测各组小鼠肺功能变化，肺组织HE染色观察各组小鼠肺组织病理变化，肺组织免疫组化染色观察各组小鼠气道EMT水平，通过Elisa、Westernblot和real-timePCR检测各组小鼠肺组织TGF-β1、smad2、smad3、II p-smad2、p-smad3表达水平。结果显示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠肺功能下降，肺部大量炎症细胞浸润，组织损伤严重，气道上皮层E-cadherin表达显著下降、平滑肌层明显增厚，Vimentin表达显著上升，与模型组相比，苦杏仁苷治疗组小鼠肺功能增加，炎症细胞浸润减少，肺部病变减轻，气道上皮层E-cadherin表达显著上升、平滑肌层明显变薄，Vimentin表达显著下降，TGF-β1、p-smad2、p-smad3表达也显著下降。这表明一方面苦杏仁苷可以减轻COPD小鼠肺部炎症，另一方面苦杏仁苷可以抑制COPD小鼠肺组织气道内的EMT过程，这种抑制EMT的作用可能和苦杏仁苷抑制TGF-β1/smad通路有关。关键词：慢性阻塞性肺疾病，上皮间质转化，苦杏仁苷，香烟烟雾III AbstractTheEffectandMechanismofAmygdalinonEpithelial-MesenchymalTransformationintheLungofMicewithChronicObstructivePulmonaryDiseaseChronicobstructivepulmonarydisease(COPD)isachronicinflammatorypulmonarydiseasecharacterizedbycontinuous,progressiveairflowlimitation.Smokingandenvironmentalpollutionarethemaincausesofthis.ItisexpectedthatCOPDwillbecometheworld'sthirdleadingcauseofdeathby2020.ThemostimportantpathophysiologicalchangeofCOPDisairwayremodeling.ItisanimportantreasonfortherestrictedairflowandtheprogressivedeclineoflungfunctionofCOPDpatients.However,themechanismofairwayremodelingiscomplexandnotyetfullyunderstood.Recentstudieshaveshownthatthereareepithelialmesenchymaltransitions(EMT)intheairwayofpatientswithCOPD,andEMTiscloselyrelatedtoairwayremodeling.InhibitedorreversedtheEMTprocessisexpectedtobeanewtargetforthetreatmentofCOPD.AmygdalinistheeffectiveingredientinthetraditionalChinesemedicinebitteralmond,anditspharmacologicaleffectsareextensive.Itismainlyusedincoughandphlegm,immunosuppression,immuneregulation,anti-inflammatory,anti-tumorandotheraspects.Recentstudieshaveshownthatamygdalincanefficientlyinhibitpulmonaryfibrosis,liverfibrosis,renalinterstitialfibrosisandothertissuefibrosis.HoweretheoccurrenceoftissuefibrosisiscloselyrelatedtoEMT,weconjecturedthatamygdalinmayinhibitEMTprocess.Therefore,thispaperaimstostudytheroleandthemechanismofamygdalinintheoccurrenceofEMTinmicewithCOPD.Inthisstudy,weexposuredthehumanbronchialepithelialcellline(BEAS-2B)incigarettesmoke(CS)for72hours,andatthesametime,weuseddifferentconcentrationsofamygdalintotreament,andthenobservedtheEMTlevelofBEAS-2Bcells.TheresultsshowedthattheexpressionofE-cadherin,theepithelialIV marker,wassignificantlydecreased,andtheexpressionofvimentin,themesenchymalmarker,wassignificantlyincreased,aftertreatmentbyCS.Howere,comparedwithCS-treatedcells,E-cadherinexpressionoftheamygdalin-treatedcells,wassignificantlyincreased,andtheexpressionofvimentinwassignificantlydecreased.Inaddition,theexpressionofTGF-β1andphosphorylatedsmad2/3(p-smad2/3),intheamygdalin-treatedcells,wassignificantlydecreased.ItisindicatingthatamygdalincaninhibittheoccurrenceofEMT.AnditmayberelatedtotheinhibitionofTGF-β1/smadpathwaybyamygdalin.Then,webulitCOPDmodelbypassivesmokingonmiceandatthesametime,treatmentbyinjectingamygdalin.Threemonthesliter,weobservedthelungairwayEMTlevelsbyimmunohistochemicalstaining,andmeasuredtheexpressionofTGF-β1,smad2,smad3,psmad2,andpsmad3inmouselungtissuebyelisa,westernblot,andreal-timePCR.TheresultsshowedthattheexpressionofE-cadherinintheairwayofthemodelgroupmicewassignificantlydecreasedandthevimentinwassignificantlyincreased.Howere,comparedwiththemodelgroup,theexpressionofE-cadherinwassignificantlyincreasedandthevimentinwassignificantlydecreasedinthemicetreatedwithamygdalin.Inaddition,theexpressionofTGF-β1,psmad2,andpsmad3werealsodecreasedsignificantly.ThisindicatesthatthereisEMTphenomenoninlungtissueofCOPDmicecausedbycigarettesmoke,andamygdalincandelayorinhibitthisprocess,whichmayberelatedtotheinhibitionofTGF-β1/smadpathwaybyamygdalin.Keywords:COPD，EMT，Amygdalin，CigaretteSmokeV 目录第1章绪论..............................................................................................11.1引言.................................................................................................11.2COPD与EMT的系.......................................................................11.3苦杏仁苷与EMT的联系...............................................................3第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制究........................................................................................................42.1实验材料........................................................................................42.2主要仪器及试剂............................................................................42.2.1主要仪器.................................................................................42.2.2主要试剂.................................................................................52.3实验方法........................................................................................72.3.1BEAS-2B细胞的养.................................................................72.3.2CSE的备.................................................................................82.3.3CS和苦杏仁苷对BEAS-2B细胞的毒性验..........................82.3.4细胞的分组与处理.................................................................9VI 2.3.5细胞形态学观察.....................................................................92.3.6实时定量PCR（Real-timePCR）..........................................92.3.7免疫印迹试验（Westernblot）..........................................122.3.8数据的处理与统计学分析..................................................152.4实验结果.......................................................................................162.4.1CS对BEAS-2B细胞活性的响.............................................162.4.2苦杏仁苷对BEAS-2B细胞活性的响.................................162.4.3苦杏仁苷对CS诱导的BEAS-2B细胞形态的响...............172.4.4苦杏仁苷对CS诱导的BEAS-2B细胞中E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、smad2、smad3mRNA表达的影响........................................................................................182.4.5苦杏仁苷对CS诱导的BEAS-2B细胞中E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、smad2、p-smad2、smad3、p-smad3蛋白表达水平的影响........................................................20第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究..................................................................................................233.1实验材料.......................................................................................23VII 3.2主要试剂与仪器..........................................................................233.2.1主要仪器................................................................................233.2.2主要试剂................................................................................243.3实验方法......................................................................................243.3.1COPD小鼠模型的立............................................................243.3.2苦杏仁苷给药浓度的选择..................................................253.3.3实验动物的分组及处理......................................................253.3.4实验动物的肺功能测定......................................................253.3.5实验样本的收集与制备......................................................263.3.6HE染色.................................................................................263.3.7免疫组化染色（Immunohistochemistry，IHC）....................273.3.8Real-timePCR........................................................................283.3.9Westernblot...........................................................................293.3.10ELISA检测小鼠肺泡灌洗液中TGF-β1的含量...............303.3.11数据的处理和统计学分析..................................................313.4实验结果.......................................................................................32VIII 3.4.1苦杏仁苷给药浓度的选择....................................................323.4.2苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠的体重的响..................343.4.3苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺功能的响..................353.4.4苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织损伤的响..........363.4.5苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织中E-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响...................................................383.4.6苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺泡灌洗液中TGF-β1含量的响..............................................................................423.4.7苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织中TGF-β1、smad2、smad3mRNA的表达的影响...............................................423.4.8苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织中TGF-β1、smad2p-smad2、smad3、p-smad3蛋白的表达的影响................43第4章讨论.............................................................................................46第5章结论.............................................................................................49参考文献..................................................................................................50作者简介及在学期间所取得的科研成果..............................................56致谢..........................................................................................................57IX 中英文对照英文缩写英文全称中文缩写BALFBronchoalveolaLavageFluid肺泡灌洗液BCABicinchoninicAcid聚氰基丙烯酸正丁酯BSABovineSerumAlbumin牛血清白蛋白COPDChronicObstructivePulmonaryDisease慢性阻塞性肺疾病CSCigarettesmoke香烟烟雾DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜ECLElectrochemiluminescence电化学发光ElisaEnzyme-linkednimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验EMTEpithelial-mesenchymaltransition上皮细胞间质转化FEV0.1（ForcedExpiratoryVolumein100ms第0.1秒用力呼气容积FRCFunctionalResidualCapacity肺功能残气量H&EHematoxylin&Eosin苏木素&伊红IHCImmunohistoochemistry免疫组织化学ICSInhaledcorticosteroid糖皮质激素LAMAlongactingmuscarinicanticholinergic长效抗胆碱能药LABALongactingbeta2adrenergicagonist长效β2受体激动剂mRNAMessengerRibonucleicacid信使核糖核酸X MTT3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-二苯甲基联氨diphenyl-2-H-tetrazoliumbromidePBSPhosphateBufferSaline磷酸盐缓冲液PMSFPhenylmenthanesulfonylFluoride苯甲基磺酰氟PCRPolymerasechainreation聚合酶链式反应PVDFPoluvinylideneFluoride聚偏氟乙烯RIAirwayResistance气道阻力RIPARadioImmunoprecipitationAssayRIPA裂解液RT-PCRReverseTranscriptionPCR逆转录PCRSDSSodiumDodecylSulfate十二烷基苯磺酸钠TBSTTrisBufferedSalinewithTween-20Tris缓冲溶液TEMEDN,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine四甲基乙二胺TGF-β1Transforminggrowthfactor-beta1转化生长因子-β1XI 第1章绪论第1章绪论1.1引言慢性阻塞性肺疾病(ChronicObstructivePulmonaryDisease,COPD)是一种以[1]持续性、进行性发展的气流受限为主要特征的慢性炎症性肺疾病。吸烟及环境[2]污染是COPD发生的主要原因。呼吸道长期接触香烟烟雾等有害颗粒，会造成反复的炎症损伤和组织修复，进而造成气道管腔狭窄，引发持续的渐进的气流受[3]限。目前，全世界有6亿多的COPD患者。随着环境污染的加重，患病率会继[4]续增高，预计到2020年COPD将成为全球第三大死亡原因。长期药物维持和自我管理是当前治疗COPD的主要方法，药物治疗以长效抗胆碱能药(longactingmuscarinicanticholinergic，LAMA)、糖皮质激素(inhaledcorticosteroid，ICS)、长效β2受体激动剂(longactingbeta2adrenergicagonist，LABA)或者3药联用为[5]主，然而人们总是谈激素色变，导致依从性差，再加上此类药物的副作用及易产生耐受性，使得患者病情频繁急性加重。因此，寻找COPD的新的治疗靶点和新型药物意义深远。1.2EMT与COPD的关系COPD的最重要的病理生理变化是气道阻塞，可引起气流受限及阻塞性通气功能障碍，这与长期的气道炎症直接或间接引起的气道壁结构改变，即气道重塑，[6]密切相关。气道重塑主要表现为气道上皮下纤维化导致网状基底膜增厚，细胞外基质沉积，肌成纤维细胞增生气道中新生血管形成及血管重构，气道平滑肌增生肥大，气道上皮杯状化生等，这是COPD患者气流受限，肺功能持续进行性[7,8]下降的重要原因。但是气道重塑的发生机制十分复杂，尚未完全明了，最近有研究表明上皮细胞间质转化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）在气[9]道重塑发生过程中发挥重要作用。EMT是指上皮细胞在特殊条件下转化成间质细胞的过程。这个概念最早由Greenbreg等在1982年提出，他们指出上皮细胞在胶原凝胶中会失去极性，丢失细胞间的紧密连接，细胞骨架重排，细胞拉长，形成伪足，变成具有间质细胞形[10]态和特性的细胞，获得浸润和迁移的能力。研究证实，EMT参与了胚胎发育、[11]神经嵴、原肠胚、心脏和其他器官的形成等生理过程。在EMT过程中上皮细1 第1章绪论胞失去细胞间粘着和细胞极性，上皮细胞标志物，如E-cadherin、紧密连接蛋白(ZonulaOccluden1,ZO-1)，表达下调，而间质细胞标志物，如Vimentin、α-平滑[12]肌激动蛋白(α-SMA)，表达上调。EMT可分为3型，Ⅰ型与胚胎发育和器官形成有关，Ⅱ型与创伤愈合、组织再生和器官纤维化有关，Ⅲ型是肿瘤细胞获得[12]迁移和侵袭能力的重要方式之一。其中Ⅱ型EMT与炎症密切相关，在炎症或者创伤激活后，诱导产生纤维细胞及其他相关细胞，发挥创伤修复作用，而气道重塑主要与气道炎症引起的气道上皮细胞反复损伤和修复相关。目前有较多的研[13]究表明COPD气道重塑过程中存在EMT现象。Javier等研究发现，吸烟的COPD患者小支气管上皮细胞中典型的EMT表达谱增多，包括上皮标志物E-钙黏素、紧密连接蛋白、细胞角蛋白5/18表达下降，而间质标志物波形蛋白、α平滑肌激动蛋白、I型胶原蛋白表达增多；体外研究显示，通过香烟烟雾刺激支气管上皮细胞，可通过调节TGF-β1通路以及ROS和cAMP的水平诱导支气管上皮细胞[14]EMT的发生。Wang等也发现，将人小支气管上皮细胞暴露在香烟烟雾中可引起上皮标志物E钙黏素和α连环蛋白表达下调，而间质标志物N钙黏素和α平滑肌激动蛋白表达明显上调，表明小气道上皮细胞发生了EMT过程。基底膜是上皮细胞和内皮细胞的基底部，将细胞与结缔组织分隔开，基底膜增厚是气道重[15,16]塑的主要特征之一。Sohal等研究发现COPD患者气道重塑过程中，基底膜会发生破裂增殖、形状拉长厚度不一，并出现典型的EMT表达谱增多现象（间质标志物Vimentin、MMP-9表达上调），进一步取吸烟的COPD患者气管活组织做切片观察，在基底上皮和网状基底膜中表达间质标志物成纤维细胞蛋白的细胞明显增多。目前COPD中EMT的发生机制尚未完全阐明，但是普遍认为TGF-β1[17][18]在此过程中发挥主要作用。已经有研究表明，COPD患者气道中TGF-β1表达增多，而TGF-β1是EMT的最重要的感应器，提示COPD患者极有可能通过TGF-β1介导EMT过程。在气道上皮细胞中TGF-β1介导EMT主要通过经典途径[19]和非经典途径两种方式。经典途径是指TGF-β1通过smad信号通路，促进smad2/3的磷酸化继而上调snail1/2，而snail1和snail2两种转录因子可以抑制E[20,21]钙黏素和紧密连接蛋白的表达。非经典途径是指TGF-β1还可以通过激活[22,23]MAPK、ERK1/2等信号通路诱导EMT的发生。COPD中EMT的发生还与[24]ROS和cAMP有关。研究发现，香烟烟雾刺激支气管上皮细胞72h后，细胞2 第1章绪论内ROS含量显著增加cAMP含量减少，并且这一作用可被cAMP类似物抑制。鉴于cAMP类似物，如磷酸二酯酶4（PDE-4）抑制剂、β受体拮抗剂，可干扰[25]间质细胞增多抑制上皮标志物的丢失，Milara等选用PDE-4抑制剂罗氟司特进行研究，发现在吸烟的COPD患者支气管上皮细胞体外实验中，罗氟司特可以减少间质细胞增加上皮表型标志物，减慢上皮细胞EMT的进程。在这一过程中，人支气管上皮细胞中TGF-β1表达增多，这一效应可被罗氟司特抑制。此外，尿激酶纤维蛋白溶酶原激活受体（UrokinasePlasminogenActivatorReceptoru，[26]uPAR）、MMP-9等也参与了COPD中EMT的发生。综上所述，在COPD气道炎症修复的过程中，气道上皮细胞通过TGF-β1介导的信号通路诱导了EMT的发生，参与气道重塑过程，在COPD患者持续性渐进性气流受限的发展过程中起到重要作用。因此，抑制甚至逆转EMT过程有望成为COPD治疗的新途径。1.3苦杏仁苷与EMT的联系苦杏仁苷是传统中药苦杏仁中有效成分，为一种含氰基的糖苷类化合物，广[27]泛存在于蔷薇科植物的种仁中。苦杏仁苷本身无毒，但是经过β-葡萄糖苷酶[28]酶解后会产生有毒的氰化物，对机体造成损伤。苦杏仁苷药理作用广泛，主要[29-36]用于止咳化痰、免疫抑制、免疫调节、抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等方面。[37,38]在欧美，苦杏仁苷是非常流行的抗癌辅助药，苦杏仁苷还是活血通路冻干注射粉（HTLPI）的主要成分之一，用于治疗脑出血中风过程中出现的严重血瘀[39][40]阻塞症状。有研究表明，苦杏仁苷在抗组织纤维化方面作用明显，如Du等通过构建大鼠博来霉素肺纤维化模型，腹腔注射给予苦杏仁苷，28天后发现苦杏仁苷组大鼠肺Ⅰ、Ⅲ型胶原表达均低于博来霉素组，显示良好的抗肺纤维化作[41]用；GUO等采用单侧输尿管阻塞法构建大鼠肾间质纤维化模型，灌胃给予苦杏仁苷，发现苦杏仁苷组大鼠肾脏纤维化程度明显低于单侧输尿管阻塞组，大概[42]降低30%左右；还有研究发现，苦杏仁苷、绞股蓝总皂苷、冬虫夏草菌丝体多糖配伍使用可以通过抑制TGF-β/smad通路抑制肝纤维化。组织纤维化和EMT密切相关，而苦杏仁苷在治疗组织纤维化方面疗效显著，那么苦杏仁苷是否能够抑制COPD中EMT的进程呢？因此本论文从体内外水平研究了苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用，并对其作用机制进行探讨。3 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究第2章苦杏仁苷在CS诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究2.1实验材料人支气管上皮细胞株（BEAS-2B），由吉林大学基础医学院病原生物学系提供。2.2主要仪器及试剂2.2.1主要仪器表2.1主要仪器及生产厂家Table2.1Themaininstrumentsandmanufactures仪器名称生产厂家仪器型号超净工作台苏洁净化（中国）SW-CJ-2F常温离心机BeckmanCoulter(德国)Microfuge16低温高速离心机Thermo（美国）Fresco21倒置显微镜Olympus（日本）CKX41高压灭菌锅Zealway(美国)GI54DWS电热恒温干燥箱上海医用恒温设备厂DHG-9053A冰箱Haier（中国）BCD-216ST超低温冰箱Haier（中国）DW-86L578J微量移液器Eppendorf（德国）Reference2全波长酶标仪Bioteck(美国)Epoch4 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究Real-timePCR仪ABS（美国）StepOne蛋白电泳仪Tanon(中国)EPS300多功能凝胶成像仪Tanon(中国)5200细胞培养箱Sanyo(日本)MC01752.2.2主要试剂表2.2主要试剂及生产厂家Table2.2Themainreagentsandmanufacturers试剂名称生产厂家生产批号丙烯酰胺GEN-VIEW（美国）GA006-500G过硫酸铵鼎国（中国）DH019-1TEMED鼎国（中国）DH-338-1吐温20EUROIMMUN（中国）ZF1110-0102Tris-basesigma（德国）T1378丽春红染色液solarbio（中国）P0012BCA蛋白浓度测定试剂Beyotime(中国)P0010盒超敏ECL化学发光试剂Beyotime(中国)P0018-1盒蛋白分子量MarkerThermo（美国）26616PMSFsolarbio(德国)P01005 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究磷酸酶抑制剂Cocktailbimake（中国）B15001电泳转膜液Beyotime(中国)P0021BPVDF膜Immobilon-P（美国）NO:IPVH00010牛血清白蛋白(BSA)Beyotime(中国)ST023甘氨酸ABONE（中国）G01623-1KGTRIzolambion（美国）15596-026逆转录试剂盒Thermo（美国）K1622实时定量PCR试剂盒Roche（瑞士）04913-001焦炭酸二乙酯（DEPC）Biotopper（中国）1609-47-8PBSEuroimmun(中国)AF1100-1000BEGM培养基Lonza（美国）cc-3171andcc-4175MTTBeyotime（中国）C0009二甲基亚砜（DMSO）北京化工厂RIPARIPA裂解液Beyotime(中国)P1003B蛋白LoadingBufferTRANSGEN（中国）DL101MouseTGF-β1ElisaKit联科生物(中国)EK2812/2-96T小鼠抗GAPDH单抗中杉金桥（中国）17AF0410Anti-TGF-beta1antibadyAbcom（美国）ab64715[2Ar2]Anti-VimentinantibodyAbcom（美国）ab925476 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究Smad3RabbitmAbCST（美国）9523Phospho-Smad3RabbitCST（美国）9520mAbSmad2RabbitmAbCST（美国）5339Phospho-Smad2antibodyCST（美国）3108RabbitmAbAnti-E-cadherinantibodyAbcom（美国）ab76055[M168]GoatAnti-RabbitAbcom（美国）ab6721IgGH+L(HRP)Amygdalinsolarbio(中国)No.SA8250HRP标记山羊抗小鼠IgGBeyotime(中国)A0216（H+L）2.3实验方法2.3.1BEAS-2B细胞的培养(1)复苏液氮中取出冻存的BEAS-2B细胞，37℃快速溶化，1000r/min离心5min，超净工作台内弃去液体，加入1mlBEGM培养液重悬细胞，将细胞转移到无菌青瓶内加入9ml培养液混合均匀后转移到细胞培养皿中，放入细胞培养箱（37℃、5%CO2）培养。7 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究(2)传代待细胞生长到80%~90%时，进行细胞传代。弃去培养基，PBS洗2遍，加入2ml胰酶，37℃放置1min，吸去胰酶，加入终止液5ml，移液枪吹打下培养皿上的细胞，转移到离心管内，1000r/min离心5min，弃去上清，PBS重悬细胞，1000r/min离心5min，弃去上清，加入BEGM培养液，按1传4的比例进行传代，细胞培养箱（37℃、5%CO2）中培养。2.3.2CS的制备取10mlBEGM培养基于500ml细口瓶中，点燃一支雄狮牌香烟（浙江中烟工业有限公司），通过负压装置将烟通满细口瓶，封闭细口瓶，4℃静置半小时，将培养基取出，调节pH到7.4左右，0.22μm滤膜过滤除菌，320nm处测得吸光度值（OD），将OD0.30±0.02记为100%CS浓度。2.3.3CS和苦杏仁苷对BEAS-2B细胞的毒性实验(1)取对数生长期的BEAS-2B细胞，按10000个/孔铺96孔板，每孔培养液的量为100μl。(2)将96孔板放入细胞培养箱（37℃、5%CO2）培养24h,让细胞贴壁。(3)将配置好的CS溶液或苦杏仁苷溶液加入相应孔内，放入孵箱中继续培养。(4)72h后，将孔板内的液体吸净，每孔加入用培养基配制的终浓度为0.05%的MTT溶液100μl，放入孵箱内继续培养4h。(5)取出96孔板，吸净MTT溶液，每孔加入200μlDMSO，震荡5min，570nm处测得吸光度值。(6)按照（实验组OD值/对照组OD值）×100%计算细胞的相对活性，选取最适CS浓度和苦杏仁苷浓度进行后续试验。2.3.4细胞的分组与处理8 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究取对数生长期的BEAS-2B细胞，铺细胞培养皿，按照实验设计将细胞分为5组，即对照组、CS模型组、苦杏仁苷高、中、低剂量组，除对照组外其余四组均加入含有终浓度为40%CS的BEGM培养基，苦杏仁苷高、中、低剂量组分别在加入CS前1h加入终浓度为400、200、100μg/ml的苦杏仁苷处理，对照组加入与其余四组等量的BEGM培养基，37℃、5%CO2条件下孵育72h，进行后续处理。2.3.5细胞形态学观察各组细胞孵育72h后于显微镜下观察各组细胞的形态学变化2.3.6实时定量PCR（Real-timePCR）（1）BEAS-2B细胞总RNA的提取a)取BEAS-2B细胞，用预冷的PBS洗2遍，加入500μltrizol，将细胞吹下，转移入2mlEP管内，静置5minb)加入0.1ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min；c)4℃，10000g离心10min，取上层无色水相于新的1.5mlEP管；d)加入等体积异丙醇，混匀，室温放置5min；e)4℃，10000g离心10min，移去上清；f)加75%乙醇1ml洗涤RNA，4℃，7500g离心5min，弃上清；g)放于通风橱中室温干燥沉淀的RNA，待没有醇味后加入Rnase-Free水50ul溶解RNA，冰上暂存，或者-80℃冰箱长期保存。h)RNA浓度测定，取2μl样品与Rnase-Freewater（空白对照）分别加在Take3板上，酶标仪上检测RNA浓度及260/280比值，260/280比值在2.0左右表示样品纯度很好，可进行后续实验。（2）逆转录9 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究如下配制逆转录反应体系totalRNA2μgOligo(dT)18primer1μl5×ReactionBuffer4μlRiboLockRnaseInhibition(20U/ul)1μl10mMdNTPMix2μlRevertAidM-MuLVRT(200U/ul)1μlnuclease-freewaterto20μul轻轻混匀，掌上离心机离心15sPCR仪中反应，程序如下42℃60min70℃5min4℃—-80℃长期保存所合成的cDNA（3）Real-timePCR以下操作冰上进行real-timePCR反应体系如下配制2×FaststartuniversalSYBRGreenmaster10μl(ROX)ForwardPrimer(10uM)0.75μlReversePrimer(10uM)0.75μl10 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究cDNA2μlNuclease-Freewater6.5μlTotal20μl轻轻混匀，离心4℃避光放置如下设置real-timePCR反应程序(1)95℃10min(2)95℃15s(3)60℃30s(4)95℃15s(5)60℃60s(6)95℃15s步骤2、3循环40次步骤5至6每秒升温0.3℃运用相对定量法计算各mRNA的表达差异各引物序列如下表基因序列vimentin-FAGTCCACTGAGTACCGGAGACvimentin-RCATTTCACGCATCTGGCGTTCsmad3-FCGTGCGGCTCTACTACATsmad3-RCATCCTGGTGGGATCTTGsmad2-FCCGACACACCGAGATCCTAAC11 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究smad2-RGAGGTGGCGTTTCTGGAATATAAEcadherin-FATTTTTCCCTCGACACCCGATEcadherin-RTCCCAGGCGTAGACCAAGATGF-β-FCTGGCGATACCTCAGCAACCTGF-β-RCTAAGGCGAAAGCCCTCAATβ-actin-FAAGAGCTACGGGCTGCCTGAβ-actin-RAGCACTGTGTTGGCGTACAG2.3.7免疫印迹试验（Westernblot）（1）BEAS-2B细胞总蛋白提取a)裂解液的配制：每1mlRIPA裂解液加入10μlPMSF（100mM）和磷酸酶抑制剂CocktailA、B各10μl，4℃放置备用每隔1h重新加一次PMSFb)取BEAS-2B细胞，用预冷的PBS洗两遍，加入裂解液600μl，反复吹打细胞，转移入1.5mlEP管内。c)置于冰上裂解30min，每10min震荡一次，使裂解充分d)4℃，12000rpm离心20min，取上清于新EP管，4℃短期保存，-80℃长期保存备用。（2）蛋白浓度测定（BCA法）a)将工作液A与B按50:1的体积比混匀，每孔200μl加入96孔板中b)分别配制0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025、0mg/ml的蛋白标准品c)取上述各蛋白标准品及蛋白样品20μl分别加入到工作液中12 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究d)37℃孵育30mine)562nm波长处测得吸光度值，建立标准曲线，计算出各样品浓度。（3）WesternBlota)分离胶的配制ddH2O1.6ml30%聚丙烯酰胺2.0ml1.5MTrist（pH8.8）1.3ml10%SDS50ul10%过硫酸铵50ulTEMED5ulb)浓缩胶配制ddH2O2.1ml30%聚丙烯酰胺0.5ml1.5MTrist（pH6.8）0.38ml10%SDS30μl10%过硫酸铵30μlTEMED3μlc)电泳缓冲液的配制Tris-base3.0gGlycine18.8g13 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究SDS1.0gddH2O定容至1Ld)蛋白样品的预处理取细胞蛋白于EP管，加入1/5体积的6×LoadingBuffer，于沸水中加热变性3min，冷却，置于4℃备用e)上样将胶与电泳槽组装好,加入电泳液,注意内槽要加满,并且液面要高于外槽,在上样孔中加入处理好的蛋白样品,样品两侧的孔中加入预染marker。f)电泳分离接通电源，首先设置80V恒压使样品浓缩到同一起点线，待跑到浓缩胶边缘时，将电压调到120V，当溴酚蓝跑到胶的下缘时停止电泳。g)转膜把转膜用的海绵、滤纸预先放在转膜液里浸泡，PVDF膜用时先在甲醇中活化20s，将胶切下，按照海绵-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵的顺序组装转膜夹，注意胶放负极，PVDF膜放正极，将转膜夹放入转膜槽，加入转膜液，冰浴、恒流110mA转膜60min。h)封闭转膜完成后取出PVDF膜，用TBST轻轻冲洗一下，放入5%BSA的TBST溶液中室温封闭2hi)一抗孵育封闭完成后倒掉封闭液，加入预先用5%BSA稀释好的一抗，4℃过夜孵育j)洗膜回收一抗，PVDF膜用TBST洗3次，每次15分钟14 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究k)二抗孵育倒掉TBST，加入预先稀释好的二抗，室温孵育1-2h倒掉二抗，TBST洗3次，每次15minl)显影PVDF膜浸入新配的ECL显影液中，于多功能凝胶成像仪中显影。m)灰度值分析用ImageJ软件对各蛋白条带进行灰度值分析，计算各蛋白的相对表达量。2.3.8数据的处理与统计学分析实验结果均为3次以上独立重复实验所得，实验数据均以均数±标准差（mean±SD），采用Graphpad6.0软件进行统计学分析。所有数据资料在确定方差齐后采用单因素方差分析（one-wayANOVA），各组间多重比较采用LSD法，如果方差不齐则采用Welch法，组间多重比较采用Dunnett’sT3检验。以P﹤0.05为差异的有效统计学意义。15 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究2.4实验结果2.4.1CS对BEAS-2B细胞活性的影响用不同浓度CS刺激BEAS-2B细胞72h后，通过MTT法检测CS对BEAS-2B细胞活性的影响，结果显示，随着CS浓度的增大，BEAS-2B细胞活性降低，当CS浓度在40%时细胞活性下降50%左右，如图2.1。为保证细胞足够的活性和CS足够的效用，我们选择40%CS浓度作为后续刺激BEAS-2B细胞病变的浓度。100细胞80相对活60性（%)402000%%0%0%0%10%230%4050%670800%1CS浓度图2.1CS对BEAS-2B细胞活性的影响Figure2.1EffectofCSontheactivityofBEAS-2Bcells图2.1中横坐标表示CS的浓度；纵坐标表示细胞的相对活性，计算方法为细胞的相对活性=（实验组OD值/对照组OD值）×100%2.4.2苦杏仁苷对BEAS-2B细胞活性的影响用不同浓度苦杏仁苷处理BEAS-2B细胞72h，用MTT法检测苦杏仁苷对BEAS-2B细胞活性的影响，结果显示，当苦杏仁苷浓度在400μg/ml以内时，对BEAS-2B细胞活性没有影响（P>0.05），如图2.2。因此我们选择对细胞活性无16 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究影响的最大苦杏仁苷浓度即400μg/ml作为后续实验中的最高浓度，将100μg/ml和200μg/ml作为后续实验的低浓度和中浓度。150细胞相100*对**活性**（%）50**000500010020040060080000102苦杏仁苷浓度（μg/ml)图2.2苦杏仁苷对BEAS-2B细胞活性的影响Figure2.2EffectofamygdalinontheactivityofBEAS-2Bcells图2.2中*表示与对照组（0μg/ml）相比P<0.05，**表示与对照组（0μg/ml）相比P<0.01。2.4.3苦杏仁苷对CS诱导的BEAS-2B细胞形态的影响对照组BEAS-2B细胞呈典型多角形或者卵圆形的上皮样细胞形态，模型组经CS处理72h后，细胞变成长梭形的纤维样细胞形态，苦杏仁苷中、低剂量组细胞与模型组相比细胞形态没有明显变化，苦杏仁苷高剂量组细胞与模型组相比细胞较短较圆，与对照组细胞形态相近，如图2.3。结果提示CS处理BEAS-2B细胞后，细胞形态发生了类似上皮间质转化的变化，而苦杏仁苷可以抑制这一变化。17 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究ABCDE图2.3苦杏仁苷对CS诱导的BEAS-2B细胞形态的影响Figure2.3EffectofamygdalinonCS-inducedBEAS-2BcellmorphologyA为对照组，B为模型组（40%CS），C为苦杏仁苷低剂量组（40%CS+100μg/ml苦杏仁苷），D为苦杏仁苷中剂量组(40%CS+200μg/ml苦杏仁苷)，E为苦杏仁苷高剂量组(40%CS+400μg/ml苦杏仁苷)。18 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究2.4.4苦杏仁苷对CS诱导的BEAS-2B细胞中E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、smad2、smad3mRNA表达的影响本实验通过real-timePCR法检测苦杏仁苷对CS诱导的BEAS-2B细胞中EMT相关基因mRNA表达的影响，结果显示，与对照组相比，模型组细胞E-cadherinmRNA表达水平显著下降（P<0.05），Vimentin、TGF-β1mRNA表达显著上升（P<0.01），smad2和smad3mRNA表达水平没有显著性变化；与模型组相比200μg/ml和400μg/ml苦杏仁苷组细胞E-cadherinmRNA表达水平显著上升（P<0.01），三组加苦杏仁苷处理的细胞Vimentin、TGF-β1mRNA表达都显著下降（P<0.05），100μg/ml组和400μg/ml组下降更明显（P<0.01），smad2和smad3mRNA表达水平没有显著性变化，如图2.4。上述结果显示CS处理BEAS-2B细胞后，细胞内E-cadherinmRNA表达水平下降Vimentin表达水平上升，同时TGF-β1表达水平也上升，而苦杏仁苷可以抑制这一过程。2.02.0▲▲*****1.51.5**相对表达量相对表达量**1.0▲1.00.50.5VimentinmRNAE-cadherinmRNA0.00.0s0olc0010020040cs1002040ntrolcontrcs+amygdalin(μg/ml)cocs+amygdalin(μg/ml)AB2.51.5▲▲2.01.0相对表达量1.5*相对表达量**1.0**0.51mRNAβ0.5smad2mRNATGF-0.00.0s0olcs0olc1002004010020040contrcs+amygdalin(μg/ml)contrcs+amygdalin(μg/ml)CD19 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究1.51.0相对表达量0.5smad3mRNA0.0s0olc10020040contrcs+amygdalin(μg/ml)E图2.4苦杏仁苷对CS诱导的BEAS-2B细胞EMT相关基因mRNA表达的影响Figure2.4EffectofamygdalinonEMT-relatedgenemRNAexpressioninCS-inducedBEAS-2Bcells图2.4中，A、B、C、D、E分别为E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、smad2、smad3mRNA相对表达量统计图；各图中▲表示与对照组相比P<0.05,▲▲表示与对照组相比P<0.01，*表示与模型组相比P<0.05，**表示与模型组相比P<0.01。2.4.5苦杏仁苷对CS诱导的BEAS-2B细胞中E-cadherin、Vimentin、TGF-β1、smad2、p-smad2、smad3、p-smad3蛋白表达水平的影响本实验通过westernblot法检测苦杏仁苷对CS诱导的BEAS-2B细胞中EMT相关蛋白表达的影响，结果显示，与对照组相比，模型组细胞E-cadherin蛋白表达显著性下降（P<0.05），Vimentin、TGF-β1、p-smad2蛋白表达显著增加（P<0.01）p-smad3蛋白表达也显著性上升（P<0.05），smad2、smad3蛋白表达无显著性变化；与模型组细胞相比苦杏仁苷干预组细胞内E-cadherin蛋白表达显著性上升（P<0.05），Vimentin蛋白表达下降，200μg/ml和400μg/ml苦杏仁苷组下降明显（P<0.01），TGF-β1、p-smad3蛋白表达下降，但只有400μg/ml苦杏仁苷显著性下降（P<0.05），三组苦杏仁苷干预组细胞p-smad2表达均显著性下降（P<0.05），smad2、smad3蛋白表达无明显变化，如图2.5。以上结果显示CS处理BEAS-2B细胞72小时后，使细胞E-cadherin的表达减少Vimentin的表达增多，同时TGF-β1表达增多，smad2和smad3的磷酸化水平增高，而苦杏仁苷可以抑制这一过程。20 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究A41.5▲▲量***3*1.0*▲2蛋白相对表达**蛋白相对表达量0.51VimentinE-cadherin0.00s0olccs00100200401002004ntrolcontrcs+amygdalin(μg/ml)cocs+amygdalin(μg/ml)BC▲▲2.01.5**1.5****1.01.0蛋白相对表达量蛋白相对表达量0.50.5smad2p-smad20.00.0s000s0colctrol10204010020040concs+amygdalin(μg/ml)contrcs+amygdalin(μg/ml)DE21 第2章苦杏仁苷在CSE诱导BEAS-2B细胞上皮间质转化中的作用及机制研究2.02.5▲2.01.51.5*1.0蛋白相对表达量蛋白相对表达量1.00.50.5smad3p-smad30.00.0s000olccs10020040trol1020040contrcs+amygdalin(μg/ml)concs+amygdalin(μg/ml)FG3▲*2蛋白相对表达量11βTGF-0cs001002004ntrolcs+amygdalin(μg/ml)Hco图2.5苦杏仁苷对CS诱导的BEAS-2B细胞EMT相关蛋白表达的影响Figure2.5EffectofamygdalinonEMT-relatedproteinexpressioninCS-inducedBEAS-2Bcells图2.5中，A为EMT相关蛋白westernblot条带图，B、C、D、E、F、G、H分别为E-cadherin、Vimentin、p-smad2、smad2、smad3、p-smad3、TGF-β1蛋白的相对表达量统计图。各图中▲表示与对照组相比P<0.05，▲▲表示与对照组相比P<0.01；*表示与模型组相比P<0.05，**表示与模型组相比P<0.01。22 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究3.1实验材料雌性BALB/c小鼠，7周龄左右，约16-18g，购买于辽宁长生生物技术股份有限公司。动物的操作参考GuidefortheCareandUseofLadoratoryAnimals执行，符合相关伦理道德委员会要求。动物处死均采用颈椎脱臼法，动物尸体由吉林大学统一处理。3.2主要试剂与仪器3.2.1主要仪器表3.1主要仪器及生产厂家Table3.1Themaininstrumentsandmanufactures仪器名称生产厂家仪器型号微量移液器Eppendorf（德国）Reference2小动物肺功能检测仪DSI(美国)BuxcoPFTController石蜡切片机Leica(德国)RM2245组织摊片机Leica(德国)HI1220组织烘片机Leica(德国)HI1210组织包埋机Leica(德国)EG1150H低温高速离心机Thermo（美国）Fresco21组织匀浆机GeringTissuePrepTP-24掌上离心机Kylin-BellLX-300全波长酶标仪Bioteck(美国)Epoch23 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究常温高速离心机BeckmanCoulter(德国)Microfuge16蛋白电泳仪Tanon(中国)EPS300多功能凝胶成像仪Tanon(中国)5200其他仪器同前。3.2.2主要试剂表3.2主要试剂及生产厂家Table3.2Themainreagentsandmanufacturers试剂名称生产厂家生产批号伊红染液solarbio(中国)G1100苏木素染液鼎国（中国）AR0712DAB显色试剂盒福州迈新（中国）P0202SP免疫组化试剂盒福州迈新（中国）Kit-p7104%多聚甲醛biosharp（中国）BL539A红旗渠香烟河南中烟工业有限责任公司戊巴比妥钠MERCK（德国）C11H17其他试剂同前。3.3实验方法3.3.1COPD小鼠模型的建立[43]采用被动吸烟联合脂多糖(LPS)诱导法建立BALB/c小鼠COPD模型。将小鼠置于自制的密闭烟雾暴露箱（65cm*40cm*25cm）内，箱体顶部有6个直径1cm的通气孔，箱体侧面有一个进烟孔，香烟点燃后通过打气泵将烟雾送进箱内，24 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究每次连续通两根香烟的量，完成后开启通气孔，计时10min，之后打开熏烟箱，散尽烟雾，让小鼠休息10min，重复上述步骤4次,如此每周烟熏6天，共计10周，在烟熏的第1天和第14天每只小鼠按50mg/kg的剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠，待小鼠麻醉后固定小鼠，气管滴注30μlLPS的生理盐水溶液(含20μgLPS)，各组小鼠每周称重一次，称重前12h禁食。3.3.2苦杏仁苷给药浓度的选择将48只BALB/c小鼠（雌性，6-8周龄）按体重随机分为4组，分别以0、10、20、40mg/kg的量腹腔注射苦杏仁苷，每天一次，每周6次，持续6周，分别观察不同浓度苦杏仁苷对小鼠体重、肺部损伤、肺功能的影响。根据实验结果确定最适给药浓度。3.3.3实验动物的分组及处理60只BALB/c小鼠（雌性，6-8周龄）按体重随机分为5组，分别为：正常对照组（control组）、模型组（model组）、苦杏仁苷低、中、高剂量组（low、middle、high组），每组12只。模型组和苦杏仁苷组小鼠每天烟熏1次，每次40min，每周烟熏6天，共计10周并且在烟熏并且在烟熏的第1和14天气管滴注30ulLPS的生理盐水溶液(含20μgLPS)；苦杏仁苷低、中、高剂量组在烟熏4周后每次烟熏前1h腹腔注射苦杏仁苷，浓度依次为5、10、20mg/kg/d，持续6周，对照组和模型组组分别在烟熏前1h腹腔注射等量生理盐水，持续6周。3.3.4实验动物的肺功能测定小鼠称重后，根据体重按50mg/kg剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠，麻醉小鼠。10min后将小鼠仰卧固定在鼠板上，剪开颈部皮肤分离气管，在气管环上段剪一横切小口，插入气管插管并用手术线结扎固定；小动物肺功能仪用前按说明书校准，将气管插管后的小鼠放入肺功能仪的鼠仓内，插管连接在肺功能仪上，点击开始，检测小鼠肺功能相应指标，包括第0.1秒用力呼气容积（ForcedExpiratoryVolumein100ms，FEV0.1）、气道阻力（AirwayResistance，RI）、肺功能残气量（FunctionalResidualCapacity，FRC）等相关参数，连续测3次。25 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究3.3.5实验样本的收集与制备（1）小鼠肺泡灌洗液的收集小鼠检测完肺功能后，取一注射器吸取1ml预冷的PBS，经气管切口处插入，结扎，将PBS打入肺中，然后吸回，反复3次，将吸回的液体转移入1.5mlEP管内，4℃，3000r/min离心5min，取上清，-80℃冻存备用。（2）小鼠肺组织样本的收集将小鼠置于冰上，快速剪开胸腔暴露心脏和肺组织，用4℃的生理盐水对小鼠心脏灌流，注射器从左心尖插入，剪开左心耳，注射生理盐水，直至整个肺变白色，停止灌流。剪下整个肺组织，一部分锡纸包裹后直接放入液氮，一部分放于4%多聚甲醛中固定，备用。3.3.6HE染色待肺组织于4%多聚甲醛中固定72h后，经乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片后制成石蜡切片，进行苏木素-伊红染色（HE染色），染色步骤如下：(1)脱蜡水化：依次将载玻片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、PBS。在每个溶液中放置时间3-5min。(2)将石蜡切片放入伊红染液中染色5-10min，流水小心冲洗多余染液。(3)将肺组织石蜡切片放入苏木素染液中染色5min，流水冲洗掉多余染液。(4)1%盐酸-乙醇溶液分化1-3s，流水冲洗掉多余酸液。(5)将石蜡切片依次放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ，每个溶液放置3-5min。(6)中性树胶封片。(7)于显微镜下观察各组小鼠肺组织结构的变化并拍照。26 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究3.3.7免疫组化染色（Immunohistochemistry，IHC）取各组肺组织石蜡切片，按如下步骤进行E-cadherin和Vimentin的免疫组化染色。(1)脱蜡水化：依次将载玻片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、PBS。在每个溶液中放置时间3-5min。(2)抗原修复：配制0.01M（pH=6.0）柠檬酸缓冲液，放入石蜡切片，缓慢加热至95-98℃，保持2min，后慢慢冷却至室温，PBS冲洗干净。(3)擦干组织周围的PBS，加入阻断剂（A液）阻断内源性过氧化物酶，约30min，PBS冲洗3次，每次2min，加入10%羊血清室温封闭2h，PBS冲洗3次，每次2min。(4)用吸水纸擦干载玻片上的液体，加入预先稀释好的一抗，4℃过夜，PBS冲洗3次，每次2min。(5)二抗孵育：用吸水纸吸干载玻片上的PBS，加入预先稀释好的二抗（B液）室温反应10min，PBS冲洗3次，每次2min。(6)加入抗体放大液（C液），室温反应10min，PBS冲洗3次，每次2min。(7)加入HRP聚合物（D液），避光、室温反应10min，PBS冲洗3次，每次2min。(8)吸水纸吸干载玻片上的液体，加入预先配置好的DAB显色剂（E液），室温反应数分钟，PBS冲洗3次，每次2min。(9)将载玻片放入苏木素中染色数秒，流水冲洗多余染液。(10)1%盐酸酒精分化1-3s，流水冲洗掉多余酸液。(11)将石蜡切片依次放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ，每个溶液放置3-5min。27 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究(12)中性树胶封片(13)显微镜下观察，每张切片随机采集5个视野下的图像，采用MoticImagesAdvanced3.2图像分析软件分析。3.3.8Real-timePCR（1）按如下步骤提取各组小鼠肺组织总RNAa)液氮中取出肺组织，取30-50mg于2mlEP管，加入500μltrizol及磁珠5颗，组织匀浆仪中选用最高速档匀浆3min；b)将匀浆制品室温放置5min，使核酸蛋白复合物分离；c)4℃，10000g离心10min，取上清于新的1.5mlEP管中；d)加入0.1ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min；e)4℃，10000g离心10min，取上层无色水相于新的1.5mlEP管；f)加入等体积异丙醇，混匀，室温放置5min；g)4℃，10000g离心10min，移去上清；h)加75%乙醇1ml洗涤RNA，4℃，7500g离心5min，弃上清；i)放于通风橱中室温干燥沉淀的RNA，待没有醇味后加入Rnase-Free水80μl溶解RNA，冰上暂存，或者-80℃冰箱长期保存。j)取2μl样品与Rnase-Freewater（空白对照）分别加在Take3板上，酶标仪上检测RNA浓度及260/280比值，260/280比值在2.0左右表示样品纯度很好，可进行后续实验。(2)RT-PCR和RealtimePCR步骤同2.3.728 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究各基因引物序列如下表基因序列TGF-β1-FTGGTGGACCGCAACAACGTGF-β1-RGCACTGCTTCCCGAATGTCsmad2-FAAGCCATCACCACTCAGAATTGsmad2-RCACTGATCTACCGTATTTGCTGTsmad3-FACACCGATTCCACTCAACsmad3-RCGATACACCACCTGTTAGTTCgapdh-FAACGACCCCTTCATTGACCTgapdh-RCACCAGTAGACTCCACGACA3.3.9Westernblot（1）按如下步骤提取各组小鼠肺组织蛋白a)液氮中取出肺组织，放入2mlEP管中，每50mg肺组织加入600ul裂解液，放入5颗磁珠，组织匀浆仪中快速匀浆5min；b)置于冰上裂解30min，每10min震荡一次，使裂解充分c)4℃，12000rpm离心20min，取上清于新EP管，4℃短期保存，-80℃长期保存备用。（2）蛋白浓度测定（BCA法）蛋白浓度测定方法见2.3.8（3）Westernblot29 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究步骤同2.3.83.3.10ELISA检测小鼠肺泡灌洗液中TGF-β1的含量(1)样本的活化：取40ul肺泡灌洗液样本，加入20ul1NHCl混合均匀，室温孵育10min，加入20ul1NNaOH中和多余的酸，混合均匀。(2)取活化样本20μl，加入480ulAssayBuffer，备用(3)将试剂盒中的微孔板取出，加入300ul1×洗液浸泡30s，弃掉洗液，在吸水纸上将微孔板拍干，立即进行后续步骤，不要让微孔板干燥；(4)标准品孔加入100μl2倍倍比稀释的标准品，样本孔中加入50μl1×检测缓冲液和50μl预稀释的活化样本，空白孔中加入100μl1×检测缓冲液；(5)每孔加入50μl稀释的检测抗体，保证步骤4/5/6连续加样，加样过程在15min内完成；(6)使用封板膜封板，300转/分钟震荡，室温孵育1.5h；(7)弃掉液体，每孔加入300μl洗液洗板，洗涤6次，每次洗板，在吸水纸上拍干；(8)每孔加入100μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；(9)使用新的封板膜封板，300转/分钟震荡，室温孵育30min(10)重复步骤8(11)每孔加入100μl显色底物TMB，避光，室温孵育5-30分钟；(12)每孔加入100μl终止液，混合均匀；(13)在30min之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和570nm参考波长下的OD值，校准后的OD值为450nm的测定值减去570nm处测定值，标准曲线法计算出样品中TGF-β1的浓度。30 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究3.3.11数据的处理和统计学分析各实验数据都用均数±标准差(`x±s）表示，采用SPSS16.0软件进行统计学分析。所有数据资料在确定方差齐后采用单因素方差分析（one-wayANOVA）,各组间多重比较采用LSD法，如果方差不齐则采用Welch法，组间多重比较采用Dunnett’sT3检验，以P﹤0.05为差异的有效统计学意义。31 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究3.4实验结果3.4.1苦杏仁苷给药浓度的选择为确定合适的苦杏仁苷给药浓度，本实验通过腹腔注射不同浓度苦杏仁苷分别观察对小鼠体重、肺部损伤、肺功能的影响。结果显示，与对照组（0mg/kg组）相比，40mg/kg苦杏仁苷组小鼠6周后体重明显减轻（P<0.01），10mg/kg和20mg/kg组小鼠体重未见明显变化（P>0.05），如图3.1。与对照组（0mg/kg组）相比，40mg/kg苦杏仁苷组小鼠FRC明显增加（P<0.05），RI明显增大（P<0.05），FEV0.1减小但没有显著性差异（P>0.05）；10mg/kg和20mg/kg组小鼠6周后肺功能（FEV0.1、FRC、RI）均没有显著变化（P>0.05），如图3.2。小鼠肺组织HE染色结果显示，四组小鼠肺组织均无明显病变，支气管上皮组织结构完整，肺泡壁完整，如图3.3。以上结果表明，40mg/kg的苦杏仁苷对小鼠的体重、肺功能都用一定的影响，而20mg/kg的苦杏仁苷对小鼠无影响，因此我们选择20mg/kg为后续实验的最高给药浓度。图3.1不同浓度苦杏仁苷对小鼠体重的影响Figure3.1Effectofdifferentconcentrationsamygdalinontheweightofmice图3.1中，**表示与对照组（0mg/kg）相比P<0.0132 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究2.01.0*1.5*0.81.51.00.6RI1.0FRC0.4FEV0.10.50.50.20.00.00.0000001020410204010204苦杏仁苷浓度（mg/kg）苦杏仁苷浓度（mg/kg）苦杏仁苷浓度（mg/kg）图3.2不同浓度苦杏仁苷对小鼠肺功能的影响Figure3.2Effectsofdifferentconcentrationsamygdalinonlungfunctionofmice图3.2中，*表示与对照组（0mg/kg）相比P<0.05ABC33 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究D200×400×图3.3不同浓度苦杏仁苷对小鼠肺组织的影响Figure3.3Effectofdifferentconcentrationsamygdalinonlungtissueofmice图3.3中，A：对照组，B：10mg/kg苦杏仁苷组，C：20mg/kg苦杏仁苷组，D：40mg/kg苦杏仁苷组3.4.2苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠的体重的影响与对照组小鼠相比，模型组小鼠在第4周开始体重持续下降，第十周时体重显著减轻（P<0.01）;与模型组相比，中、高剂量组小鼠体重从第4周开始增加；高剂量组第10周时体重较模型组显著增加（P<0.01），如图3.4和3.5所示。以上结果提示烟熏小鼠会使小鼠体重降低，给予苦杏仁苷可以缓解这一变化。体重/克24controlmodel225mg/kg2010mg/kg1820mg/kg16141201234567891011时间/周图3.4实验期间小鼠体重变化图Figure3.4Thechangesofthemouseweightduringtheexperiment34 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究图3.4表示各组小鼠实验期间体重的变化情况，对照组小鼠正常饲养10周，模型组小鼠烟熏10周，5、10、20mg/kg组小鼠分别在烟熏4周后给予相应量的苦杏仁苷25体重/g**20*▲▲151050500cs12ontrolcs+amygdalin(mg/kg)c图3.5实验结束时小鼠终体重统计图Figure3.5Thefinalweightofmiceattheendoftheexperiment图3.5中，▲▲表示与control组相比P<0.01，*表示与cs组相比P<0.05，**表示与cs组相比P<0.01。3.4.3苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺功能的影响与对照组相比组小鼠第0.1秒用力呼气容积（FEV0.1）明显降低，肺功能残气量（FRC）显著增加，气道阻力（RI）明显增加。与模型组相比，10mg/kg组小鼠FEV0.1有所升高（P>0.05），20mg/kg组小鼠FEV0.1显著性增高（P<0.01）。10mg/kg组和20mg/kg组小鼠FRC和RI均有所下降，但是10mg/kg组小鼠下降不明显(P>0.05)，20mg/kg组小鼠FRC和RI均明显下降（P<0.05），如图3.6所示。以上结果显示小鼠长期暴露于CS中后出现了肺功能出现下降，而苦杏仁苷对其有保护作用。35 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究1.51.5▲▲**▲▲1.01.0*FRCFEV0.10.50.50.00.0s5s50c1020c102ntrolntrolcs+amygdalin(mg/kg)cs+amygdalin(mg/kg)cocoAB2.0▲▲1.5*RI1.00.50.0s5c1020ntrolcs+amygdalin(mg/kg)coC图3.6苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺功能的影响Fig.3.6EffectofamygdalinonlungfunctioninCS-inducedCOPDmice图3.6中，▲表示与control组相比P<0.05，▲▲表示与control组相比P<0.01，*表示与cs组相比P<0.05,**表示与cs组相比P<0.01。3.4.4苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织损伤的影响本实验通过肺组织HE染色观察苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织损伤的影响。结果显示：对照组小鼠肺组织无明显病变，支气管上皮组织结构完整，肺泡壁完整，偶见有炎症细胞浸润；模型组和苦杏仁苷低剂量组小鼠肺组织肺组织病变严重，可见大量炎症细胞浸润，尤以中性粒细胞最多，肺泡腔内可见大量浆细胞浸润，肺泡隔增厚，肺泡扩张，支气管上皮脱落、缺失；苦杏仁苷中、高剂量组小鼠肺组织病变较模型组小鼠明显减轻，炎症细胞浸润明显减少，支气管上皮相对完整，肺泡相对正常，其中高剂量组小鼠肺组织病变更轻，如图3.7。36 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究以上结果显示小鼠长期暴露于CS后出现典型的肺组织病理变化，结合肺功能数据，提示COPD模型构建成功，而苦杏仁苷可以保护肺组织，延缓COPD进程。ABCDE200×400×200×400×图3.7苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织损伤的影响Figure3.7EffectofamygdalinonlunginjuryinCS-inducedCOPDmice图3.7中，A为对照组，B为模型组（CS），C为苦杏仁苷低剂量组（CS+Amygdalin5mg/kg），D为苦杏仁苷中剂量组（CS+Amygdalin10mg/kg）,E为苦杏仁苷高剂量组（CS+Amygdalin20mg/kg）。37 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究3.4.5苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织中E-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响本实验通过免疫组化染色检测苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织E-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响。结果显示，与对照组相比模型组小鼠支气管上皮层E-cadherin表达明显减少（P<0.01）；与模型组相比，苦杏仁苷中、高剂量组小鼠支气管上皮层E-cadherin表达上调，但中剂量组上调不明显，无显著性差异（P>0.05），而高剂量组显著性上调（P<0.05）；如图3.8和3.10。与对照组相比模型组小鼠支气管Vimentin表达明显增多（P<0.05），并可见平滑肌层增厚，与模型组相比，苦杏仁苷中、高剂量组小鼠支气管Vimentin表达减少，但中剂量组下调不明显（P>0.05），而高剂量组显著性下调（P<0.05），且可见高剂量组小鼠支气管平滑肌层变薄，如图3.9和3.10所示。以上结果提示COPD小鼠肺组织内存在EMT现象，而苦杏仁苷可以抑制这一过程AB38 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究CDE200×400×图3.8苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织中E-cadherin表达的影响Figure.3.8EffectofamygdalinontheexpressionofE-cadherininthelungtissuesofCS-inducedCOPDmice图3.8中，A为对照组，B为模型组（CS），C为苦杏仁苷低剂量组（CS+Amygdalin5mg/kg），D为苦杏仁苷中剂量组（CS+Amygdalin10mg/kg）,E为苦杏仁苷高剂量组（CS+Amygdalin20mg/kg）。39 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究ABCD40 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究E200×400×图3.9苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织中Vimentin表达的影响Figure.3.9EffectofamygdalinontheexpressionofVimentininthelungtissuesofCS-inducedCOPDmice图3.9中，A为对照组，B为模型组（CS），C为苦杏仁苷低剂量组（CS+Amygdalin5mg/kg），D为苦杏仁苷中剂量组（CS+Amygdalin10mg/kg）,E为苦杏仁苷高剂量组（CS+Amygdalin20mg/kg）250▲▲200200**150150▲灰度值灰度值10010050Vimentin50E-cadherin0050012500cscs12ntroltrolcocs+amygdalin(mg/kg)cs+amygdalin(mg/kg)conAB图3.10E-cadherin和Vimentin免疫组化灰度值分析结果Figure3.10Gray-scaleanalysisofE-cadherinandVimentinimmunohistochemical图3.10中纵坐标表示灰度值，横坐标表示不同组小鼠；▲表示与control组相比P<0.05,▲▲表示与control组相比P<0.01,*表示与cs组相比P<0.05。41 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究3.4.6苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺泡灌洗液中TGF-β1含量的影响与对照组小鼠相比，模型组小鼠肺泡灌洗液TGF-β1含量显著升高（P<0.01），与模型组相比苦杏仁苷低剂量组小鼠肺泡灌洗液TGF-β1含量没有明显变化（P>0.05），中、高剂量组小鼠肺泡灌洗液TGF-β1含量显著降低（P<0.05），高剂量组降低更为明显（P<0.01），如图3.11。以上结果显示CS处理小鼠后可以是小鼠肺内TGF-β1水平升高，而苦杏仁苷可以抑制这一变化。150单位(pg/ml)▲▲100含量***1β50TGF-050cs102ntrolcs+amygdalin(mg/kg)co图3.11苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺泡灌洗液中TGF-β1含量的影响Figure3.11EffectofamygdalinonTGF-β1expressioninalveolarlavagefluidofCS-inducedCOPDmice图3.11中control表示对照组，cs表示模型组，▲▲表示与control组相比P<0.01，*表示与cs组相比P<0.05,**表示与cs组相比P<0.013.4.7苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织中TGF-β1、smad2、smad3mRNA的表达的影响与对照组相比，模型组小鼠TGF-β1mRNA表达显著上升（P<0.05），smad2和smad3mRNA表达水平没有显著性变化(P>0.05)；与模型组相比苦杏仁苷中、高剂量组小鼠小鼠TGF-β1mRNA表达显著下降（P<0.05），低剂量组无明显变化，低、中、高剂量组smad2和smad3mRNA表达水平均没有显著性变化（P>0.05），42 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究如图3.12。以上结果显示CS处理小鼠后可以使小鼠肺内TGF-β1mRNA水平上升，而苦杏仁苷可以抑制这一变化。42.5▲2.031.5相对表达量相对表达量*2*1.01mRNAβ10.5TGF-smad2mRNA00.050s5cs102c1020ntrolcs+amygdalin(mg/kg)ntrolcs+amygdalin(mg/kg)cocoAB2.52.01.5相对表达量1.00.5smad3mRNA0.050cs102trolcs+amygdalin(mg/kg)conC图3.12苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织EMT相关基因mRNA表达的影响Figure3.12EffectofamygdalinonexpressionofEMTrelatedgenemRNAinthelungtissueofcs-inducedCOPDmice图3.12中，A、B、C分别为各组小鼠TGF-β1、smad2、smad3mRNA相对表达量统计图，各图中▲表示与control组相比P<0.05，*表示与cs组相比P<0.05。3.4.8苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织中TGF-β1、smad2、p-smad2、smad3、p-smad3蛋白的表达的影响与对照组相比模型组小鼠TGF-β1、p-smad2、p-smad3蛋白表达显著性上升（P<0.05），smad2、smad3蛋白表达无显著新变化(P>0.05)；与模型组小鼠相比，43 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究苦杏仁苷低、中剂量组小鼠TGF-β1、p-smad3蛋白表达下降，但没有显著性变化（P>0.05）,高剂量组小鼠TGF-β1、p-smad3蛋白表达显著下降（P<0.05），低剂量组小鼠p-smad2表达无明显变化(P>0.05)，中、高剂量组p-smad2蛋白表达显著性下降（P<0.05）；低、中、高剂量组小鼠smad2、smad3蛋白表达均无明显变化，如图3.13。以上结果显示CS处理小鼠后可以使小鼠肺组织内TGFβ1表达水平增高，smad2和smad3的磷酸化水平也显著上升，而苦杏仁苷可以抑制这一变化。A2.0▲▲31.5**21.0蛋白相对表达量蛋白相对表达量0.51smad2p-smad20.0050cs10250trolcs102cs+amygdalin(mg/kg)ntrolconcocs+amygdalin(mg/kg)BC44 第3章苦杏仁苷在COPD小鼠EMT发生中的作用及机制研究4▲1.531.02蛋白相对表达量*蛋白相对表达量0.51smad3p-smad300.05050cs102cs102trolntrolcs+amygdalin(mg/kg)cs+amygdalin(mg/kg)coconDE4▲32*蛋白相对表达量1β1TGF-050cs102ntrolcs+amygdalin(mg/kg)coF图3.13苦杏仁苷对CS诱导的COPD小鼠肺组织中EMT相关蛋白表达的影响Figure3.13EffectofamygdalinonexpressionofEMTrelatedproteinsinthelungtissueofcs-inducedCOPDmice图3.13中，A为EMT相关蛋白westernblot条带图，B、C、D、E、F分别为各组小鼠smad2、p-smad2、smad3、p-smad3、TGF-β1蛋白相对表达量统计图。各图中▲表示与control组相比P<0.05，▲▲表示与control组相比P<0.01，*表示与cs组相比P<0.05。45 第4章讨论第4章讨论COPD是一种常见的慢性呼吸道疾病，其发病机制较为复杂，尚未完全阐明。目前对于COPD的研究大多建立在构建COPD动物模型上。CS作为公认的引起[44]COPD的最主要因素，常被用来构建COPD动物模型。虽然单一的CS刺激小鼠基本能够形成COPD的一些典型的特征，如体重减轻、肺功能下降、中性粒[45]细胞聚集、气道重塑等，但是存在不稳定、耗时长、花费高等诸多缺点。有[46]研究证实熏烟联合气管内注入LPS用于建立COPD动物模型明显优于单纯烟雾暴露和单纯气道内注入LPS，因此本研究以烟熏联合气管滴注LPS构建小鼠COPD模型。烟熏小鼠10周后，小鼠出现了体重减轻，肺功能下降，肺部可见大量炎症细胞浸润，尤以中性粒细胞最多，肺泡腔内可见大量浆细胞浸润，各级支气管上皮脱落、肺泡隔增厚、肺泡破裂融合等经典的COPD病理生理变化，表明COPD模型构建成功。EMT是指特殊条件下上皮细胞失去极性转化成具有间质细胞特性的细胞的[46]过程。EMT发生的重要标志是上皮标志物（如E-cadherin、ZO-1等）的丢失[47]和间质标志物（如Vimentin、N-cadherin、α-SMA等）的获得。关于EMT的研究，目前主要集中在肿瘤的恶性转化方面，认为EMT是肿瘤细胞恶化获得浸[48][49]润和转移能力的主要原因。但是最近研究证实，COPD患者肺组织中存在EMT现象，并且EMT现象在气道重塑发生发展过程中起重要作用。COPD患者气道内发生EMT转化的上皮细胞会经由破裂的基底膜转移至固有层，导致网状基底膜增厚，迁移至固有层的细胞会逐渐转变成成纤维细胞，导致成纤维细胞增生，产生大量胶原蛋白沉积，引起气道重塑，而气道重塑是引起COPD患者气[50]流受限的主要原因。因此，抑制甚至逆转EMT的发生有望成为治疗COPD的新途径。[51]苦杏仁苷是一种从苦杏仁中提取出来的活性单体化合物，研究表明，苦杏仁苷在抑制组织纤维化方面疗效显著，而组织纤维化的发生和EMT密切相关，因此我们推测苦杏仁苷在抑制COPD患者EMT发生中可能也起作用。所以我们将苦杏仁苷作为研究目标，研究它在COPD患者EMT发生中的作用。结果我们46 第4章讨论发现，BEAS-2B细胞暴露在CS中72h后，发生了典型的EMT表达谱变化，即E-cadherin表达显著下调、Vimentin表达显著上调，同时用苦杏仁苷干预后这种变化被抑制，这表明在体外苦杏仁苷可以抑制由CS引起的BEAS-2B细胞EMT过程。通过COPD模型小鼠的肺组织免疫组化染色结果，我们观察到，模型组小鼠气道内上皮结构紊乱，平滑肌层增厚，上皮标志物E-cadherin表达较对照组显著下降而间质标志物Vimentin表达显著上升，说明COPD中发生了EMT过程；而苦杏仁苷治疗组小鼠和模型组相比这种现象被明显抑制，这说明在体内苦杏仁苷可以抑制由CS引起的COPD小鼠气道内的EMT过程。如前所述，EMT在气道重塑中发挥重要作用，抑制EMT的发生能够减慢气道重塑的进程，进而改善COPD患者的肺功能，这与我们的研究结果相符，我们的研究发现，经苦杏仁苷治疗的COPD模型小鼠的肺功能（包括FRC、FEV0.1、RI）得到明显改善。EMT的发生涉及许多信号通路，如TGF-β信号通路、Wnt信号通路、ILk信号通路、uPAR信号通路等，其中TGF-β被普遍认为是EMT的最主要诱导因[52-56]素。TGF-β结合它的受体TGF-βR1、2、3，导致samd2和smad3的磷酸化激活，激活后的smad2和smad3与smad4形成三聚体并转移入核内，激活相应转录因子如snail、ZEB、Twist，这些转录因子可以引起上皮标志物E-cadherin[57][18]等表达下调，间质标志物Vimentin等表达上调而发生EMT。有研究表明，COPD患者气道内TGF-β1的表达明显增多，这提示COPD患者气道内的EMT[42]现象可能与TGF-β/smad通路有关。Li等发现苦杏仁苷、绞股蓝总皂苷、冬虫夏草菌丝体多糖配伍使用可以通过抑制TGF-β/smad通路抑制肝纤维化，这表明苦杏仁苷在抑制TGF-β/smad通路中发挥作用。本研究发现，BEAS-2B细胞暴露于CS中72h后，TGF-β1表达显著升高，虽然smad2和smad3的表达没有显著变化，但是p-smad2和p-smad3的表达显著上升；当同时加苦杏仁苷干预后，TGF-β1表达减少，samd2、3的磷酸化也被抑制，表明在体外苦杏仁苷可以通过降低CS诱导的BEAS-2B细胞TGF-β1的表达，减少smad2和smad3的磷酸化激活从而抑制TGF-β/smad通路。动物实验结果显示，模型组小鼠肺泡灌洗液中TGF-β1含量较对照组明显增多，肺组织中TGF-β1、p-smad2、p-smad3的表达也明显增高，而苦杏仁苷干预组与模型组相比，这一趋势被抑制，这同样说明表明47 第4章讨论苦杏仁苷可以通过抑制COPD小鼠肺组织中TGF-β1的表达，减少smad2和smad3的磷酸化激活从而抑制TGF-β/smad通路。综上我们推测苦杏仁苷对COPD小鼠肺组织中EMT过程的抑制作用可能是通过抑制TGF-β/smad通路实现的。虽然之前有研究发现苦杏仁苷可以抑制LPS引起的小鼠神经胶质细胞的炎[31]症反应、可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α和IL-1β的表达从而抑[28][32]制炎症反应、可以改善角叉菜胶引起的大鼠足趾肿胀，显示出良好的抗炎作用，但是未见苦杏仁苷可以抑制COPD肺部炎症的报道，我们研究发现经苦杏仁苷干预后，COPD模型小鼠肺部炎症明显减轻，中性粒细胞明显减少，肺部损伤明显降低，显示苦杏仁苷在抑制COPD小鼠肺部炎症反应中有一定的作用，但其抗炎机制有待进一步研究。目前治疗COPD的药物基本都是喷剂，这样可以直接作用于患者呼吸道，见效快、副作用小，尽管我们研究发现苦杏仁苷有望成为治疗COPD的潜在新药物，但是苦杏仁苷经胃肠道内的β葡萄糖苷酶酶解后会产生有毒的氰化物，严重会有致死性，而注射给药又会使药物疗效降低副作用增大，这给苦杏仁苷的带来一定的困难，因此需要进行必要的结构修饰从而消除苦杏仁苷的代谢毒性。综上所述，我们证明苦杏仁苷可以体外抑制香烟烟雾引起的BEAS-2B细胞EMT过程，体内也可以抑制COPD小鼠中EMT过程，这可能和它能抑制TGF-β1的表达，抑制smad2和smad3的磷酸化从而抑制TGF-β/smad通路有关，此外苦杏仁苷在抑制COPD模型小鼠肺部炎症中也发挥一定作用。苦杏仁苷可以作为一种治疗COPD的潜在药物。48 第5章结论第5章结论1.本研究证明在体外苦杏仁苷可以抑制由CS刺激引起的BEAS-2B细胞的EMT过程，这可能是通过苦杏仁苷抑制TGF-β1的表达，抑制smad2和smad3的磷酸化水平从而抑制TGF-β/smad通路实现的。2.在体内苦杏仁苷可以抑制COPD模型小鼠肺组织的上皮间质转化过程，这种作用可能是通过苦杏仁苷抑制TGF-β1的表达，抑制smad2和smad3的磷酸化水平，从而抑制TGF-β/smad通路实现的。3.苦杏仁苷可以减轻COPD小鼠肺部炎症。49 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作者简介及在学期间所取得的成果作者简介及在学期间所取得的科研成果作者简介：方克勇，男，1992年4月出生于山东省临清市，汉族；2010年至2014年就读于山东大学药学院药学专业，并取得学士学位，2015年至2018年于吉林大学基础医学院药理学系攻读硕士学位。在学期间发表论文：(1)LiuJ,PangZ,WangG,GuanX,FangK,WangZ,etal.AdvancedRoleofNeutrophilsinCommonRespiratoryDiseases[J].JournalofImmunologyResearch(2017),2017:6710278.(2)JunyingLu,KeyongFang,ShijiWang,LingxinXiong,ChaoZhang,ZhongminLiu,XuewaGuan,etal.Anti-InflammatoryEffectofColumbianetinonLipopolysaccharide-StimulatedHumanPeripheralBloodMononuclearCells[J].MediatorsofInflammation,2018,2018.56 致谢致谢三年时间匆匆而过，在此毕业之际，我要衷心的感谢乔萍老师三年里对我学习和生活上的帮助；感谢王放老师为我提供了优越的实验环境，教我为人处事的道理，也感谢温得中老师、郑静彤老师在我迷茫时的答疑解惑，还要感谢实验室的师兄师姐，师弟师妹以及同窗好友，感谢你们三年里给予我的帮助以及带来的快乐的回忆。我还要感谢基础医学院，感谢基础医学院各位老师们三年来对我的培育。最后我要感谢我的家人，感谢多年来的养育与支持。57
