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学校代码：10264研究生学号：M140107181上海海洋大学硕士学位论文牙鲆抗迟缓爱德华氏菌病F4代家系建立及世代抗病力题目：的分析AnalysisofresistancetoGenerationsandEstablishmentofF4generationfamilyofDiseaseResistancefor英文题目：EdwardsiellatardainJapaneseFlounder(Paralichthysolivaceus)专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：牙鲆抗病良种选育姓名：李泽宇指导教师：陈松林研究员二O一七年五月 上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论，是本人在导师的指导下文，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中己经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：曰期：＞１１年９月Ｍ曰上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密Ｗ学位论文作者签名指导教师签名：曰期：年曰曰期９月￥：如年，月Ｍ曰丨〕 上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注张国范中科院海洋研究所研究员主席包振民中国海洋大学教授委员尤峰中科院海洋研究所研究员委员杨官品中国海洋大学教授委员刘洪军山东省海洋生物研究院研究员委员李希红黄海水产研究所助理研究员秘书答辩地点黄海所1号楼4楼答辩日期2017-5-21 牙鲆抗迟缓爱德华氏菌病Ｆ４代家系建立及世代抗病力的分析ＡｎａｌｓｉｓｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｅｎｅｒａｔｉｏｎｓａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆＦ４ｙｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｆａｍｉｌｏｆｄｉｏｒＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａｔａｒｄａｉｎｇｙｉｓｅａｓｅｒｅｓｓｔａｎｃｅｆＪａａｎｅｓｅＦｌｏｕｎｄｅｒＰａｒａｌｉｃｈｔｈｓｏｌｉｖａｃｅｕｓｐ｛ｙ）学位论文完成时间：ＭＩｌＬＡ指导老师签字答辩委员会成员签字：Ｌ也１ｉ／ 上海海洋大学硕士学位论文牙鲆抗迟缓爱德华氏菌病F4代家系建立及世代抗病力的分析摘要牙鲆(Paralichthysolivaceus)在我国北方地区是重要的海水工厂化养殖品种之一。近年来，牙鲆的大规模工厂化养殖发展迅速，带动了许多地区的经济发展。高密度的工厂化养殖与近亲交配导致牙鲆种质退化，病害频发，产量下降，严重妨碍了牙鲆产业的长期可持续发展。牙鲆疾病通常采用抗生素治疗，但是抗生素使用过量会在鱼体内产生药物残留，导致细菌耐药性提高，污染水环境等问题，并危害消费者的身体健康。因此采用先进的水产育种技术手段，将各种先进育种技术与传统育种手段相结合，培育出本身抗病能力较强的牙鲆品种，有助于减少污染，提高牙鲆养殖过程中的存活率，增大经济效益。本实验通过家系选育、雌核发育等方法，以日本牙鲆群体、韩国牙鲆群体、2009年牙鲆家系、2010年牙鲆家系、2012年牙鲆家系、2013年牙鲆家系及2014年牙鲆家系为亲本，于2016年培育了牙鲆F4代家系28个，包括F3代家系4个、F4代家系23个和对照家系1个。经过60天的生长性状测定实验，将全长日增长率大于0.160cm/d的家系定为早期快速生长家系，共5个(F1639、F1621、F1661、F1606、F1648)，平均全长日增长率为0.168cm/d，占所有家系的17.9%；将全长日增长率在0.160~0.150cm/d之间的家系定为早期生长速度一般家系，共9个，平均全长日增长率为0.152cm/d，占所有家系的32.1%；将全长日增长率小于0.150cm/d的14个家系定为早期慢速生长家系，平均全长日增长率为0.142cm/d，占所有家系的50.0%。经过人工注射感染实验，F4代所有家系的存活率为15.24%-77.23%，平均存活率为44.48%。根据感染实验结果，F1639、F1601、F1633、F1635、F1657、F1606和F16317个家系（占总量的25.0%）的存活率均高于60%，定义为高抗病力家系；11个存活率介于30%-60%之间的家系（占比39.3%）定义为抗病力一般的家系；10个存活率低于30%的家系（占总量的35.7%）称为低抗病力的家系。对牙鲆F4代家系中生长性状与抗病性状进行皮尔森相关性分析，存活率与全长、体重、全长日增长率呈现正相关，相关系数为r全长0.496、r全长日增长率I 上海海洋大学硕士学位论文0.301、r体重0.432，说明存活率与全长、全长日增长率、体重之间呈现中等相关性。经过60天的生长性状测定实验与人工细菌感染实验，筛选出F1639为牙鲆F4代抗病、速生家系。根据世代的家系系谱图可以看出，F1639家系亲本源自F1421、F0927、F0750，均为抗病力强的家系。F1639、F1421为抗迟缓爱德华氏菌家系，其中F1639家系的人工注射迟缓爱德华氏菌感染存活率为77.23%，比F4代平均存活率44.48%高32.75%。F1421家系为F3代选育出的抗病力高家系，存活率为47.06%，比F3代平均存活率20.29%高26.77%。F0927、F0750为抗鳗弧菌家系，其中F0927家系为F2代筛选出的抗病力高家系，感染存活率为64.97%，比F2代平均存活率28.24%高36.73%。F0750为F1代选育出的抗病力高家系，感染存活率为64.05%，比F1代平均存活率32.60%高31.45%。经过F1至F4代的家系选育，将抗病力高家系抗病力逐代提高，抗病力从F1代遗传给下一代，实现了选育抗病家系的目的。本实验通过家系选育，建立的牙鲆F4代抗迟缓爱德华氏菌病家系，成功筛选得到抗病力高、生长快速的F4代家系（F1639），可以用于进一步的家系筛选。经过多代的家系选育，人工感染实验，牙鲆的抗病力得到逐代遗传，将遗传力较低的抗病力性状遗传给后代，为进一步培育出更高品质的牙鲆新品种奠定基础，具有重大的推广价值和广阔的推广前景。关键词：牙鲆，迟缓爱德华氏菌，世代，家系，抗病II 上海海洋大学硕士学位论文AnalysisofresistancetogenerationsandestablishmentofF4generationfamilyofdiseaseresistanceforEdwardsiellatardainJapaneseFlounder(Paralichthysolivaceus)ABSTRACTParalichthysolivaceusisoneoftheimportantmariculturalfishinnorthernChina.Inrecentyears,thelarge-scaleindustrializedbreedingofParalichthysolivaceushasdevelopedrapidly,whichhasledtotheeconomicdevelopmentinmanyregions.Thehighdensityoffactoryfarmingandinbreedingleadstofloundergermplasmdegradation,frequentoccurrenceofdiseases,thedeclineinoutput,seriouslyhamperthelong-termsustainabledevelopmentoftheindustryofflounder.Flounderdiseaseareusuallytreatedwithantibiotics,buttheextensiveuseofantibioticscanleadtodrugresiduesinfish,leadtobacterialresistanceincreased,waterpollutionandotherissues,andpotentialsafetyhazardstothehealthofconsumers.Therefore,theuseofadvancedbiotechnologymeans,avarietyofadvancedbreedingtechniquesandtraditionalbreedingmethodscombinedtodeveloptheirownstrongresistancetodiseasefloundervarieties,helptoreducepollution,improvethesurvivalrateofJapaneseflounderculture,Increaseeconomicefficiency.Inthisstudy,weusedthemethodsoffamilyselectionandnucleardevelopment,usedJapanesefloundergroup,Koreanfloundergroup,2009,2010,2012,2013,2014flounderfamilyasparent.In2016,28familiesofF4generationofParalichthysolivaceuswerebred,includingF3generation4families,F4generation23familiesand1contrastfamily.After60daysofgrowthtraits,thedailybodylengthgrowthrateofthefirst20%familiesintheF4generationwasdefinedasarapidgrowingfamilywithatotalof6,includeF1639,F1621,F1661,F1606,F1648,F1647,theaveragedailybodylengthgrowthrateis0.166cm/d.Thedailybodylengthgrowthrateofthelast30%familiesintheF4generationwasdefinedasaslowgrowingfamilywithatotalof9,theIII 上海海洋大学硕士学位论文averagedailybodylengthgrowthrateis0.142cm/d.Therestofthefamilydefinedasthegeneralgrowingfamilywithatotalof13,theaveragedailybodylengthgrowthrateis0.151cm/d.Afterartificialinfectionexperiment,thesurvivalrateofF4generationofallfamilieswas15.24%-77.23%,andtheaveragesurvivalratewas44.48%.Thesurvivalrateofthefirst20%familiesintheF4generationwasdefinedasdiseaseresistancehighfamilywithatotalof6,includeF1639,F1601,F1633,F1635,F1657,F1606,theaveragesurvivalrateis72.14%.Thesurvivalrateofthelast30%familiesintheF4generationwasdefinedasdiseaseresistancelowfamilywithatotalof9,theaveragesurvivalrateis22.38%.Therestofthefamilydefinedasdiseaseresistancegeneralfamilywithatotalof13,theaveragedailybodylengthgrowthrateis47.01%.PearsoncorrelationanalysisofgrowthtraitsanddiseaseresistancetraitsinF4generationflounderfamily.Survivalratewaspositivelycorrelatedwithbodylength,bodyweightandbodylength,correlationcoefficientarelength0.496,dailybodylengthgrowthrate0.301,reweight0.432.Theresultsshowedthattherewasamoderatecorrelationbetweensurvivalrateandbodylength,bodylengthandbodyweight.After60daysofgrowthtraitassayandartificialbacterialinfection,F1639wasscreenedforF4resistanceandfast-growingfamilies.Accordingtothefamilypedigreeofthegenerationcanbeseen,F1639familyofparentsfortheF1421,F0927,F0750,areresistanttostrongfamilies.F1639,F1421fortheresistancetoEdwardsiellafamily,thesurvivalrateofEdwardsiellainfectioninF1639familywas77.23%,whichwas32.75%higherthanthatofF4onaveragesurvivalrateof44.48%.TheF1421familywasselectedforthegenerationofF3resistantstrainsofhigh,thesurvivalratewas47.06%,whichwas26.77%higherthantheaveragesurvivalrateofF3of20.29%.F0927,F0750fortheresistancetoVibriofamily,thesurvivalrateofVibrioinfectioninF0927familywas64.97%,whichwas36.73%higherthanthatofF2onaveragesurvivalrateof28.24%.TheF0750familywasselectedforthegenerationofF1resistantstrainsofhigh,thesurvivalratewas64.05%,whichwas31.45%higherthantheaveragesurvivalrateofF3of32.60%.AfterF1toF4generationofbreedingfamilies,thediseaseresistanceofhighfamilyresistancetodiseasegenerationbygeneration,bytheF1generationof51.86%survivalrateincreasedtoF4generationof72.14%.IV 上海海洋大学硕士学位论文Inthisstudy,theF4familyoftheflounderwasresistanttoEdwardsiosis,andtheF1639familywithhighdiseaseresistanceandrapidgrowthcouldbescreenedforfurtherfamilyscreening.Afterseveralgenerationsofbreedingandartificialinfection,thediseaseresistanceofParalichthysolivaceuswasgraduallyimproved,andthegeneticbasisofthelowfertilityresistancewashomozygoustocultivatenewvarietiesoffineflounder.Thepromotionofvalueandbroadprospectsforthepromotion.KEYWORDSParalichthysolivaceus,Edwardsiellatarda,Generation,Families,Disease-resistanceV 上海海洋大学硕士学位论文目录摘要.......................................................................................................................IABSTRACT...........................................................................................................III目录..........................................................................................................................1引言......................................................................................................................1第一章文献综述..................................................................................................21鱼类常用育种技术......................................................................................21.1选择育种...........................................................................................21.2杂交育种...........................................................................................51.3分子标记辅助育种技术...................................................................52牙鲆概况......................................................................................................82.1种质资源退化...................................................................................82.2病害频发、渔药滥用.......................................................................93迟缓爱德华氏菌病概况..............................................................................9第二章牙鲆抗迟缓爱德华氏菌病F4代家系建立.............................................111材料与方法.................................................................................................111.1牙鲆F4代家系建立........................................................................111.2牙鲆F4代家系生长性状测定.......................................................131.3牙鲆F4代家系抗病性状测定.......................................................132结果与分析................................................................................................142.1牙鲆F4代家系的建立...................................................................142.2牙鲆F4代家系的生长性状..........................................................152.3牙鲆F4代家系的抗病性状...........................................................173讨论............................................................................................................20第三章牙鲆F4代家系生长性状与抗病性状的相关性分析............................221材料与方法................................................................................................221.1实验用鱼.........................................................................................221.2实验方法.........................................................................................231.3数据分析.........................................................................................232结果与分析................................................................................................232.1牙鲆F4代家系感染后各项表型值...............................................232.2牙鲆F4代家系中各项表型间相关性分析...................................243讨论............................................................................................................25第四章牙鲆世代家系抗病力分析及“鲆优2号”抗病性能验证.....................261材料与方法................................................................................................261.1实验用鱼.........................................................................................261.2实验方法.........................................................................................271 上海海洋大学硕士学位论文1.3数据分析.........................................................................................272结果与分析................................................................................................272.1牙鲆“鲆优2号”验证......................................................................272.2牙鲆F4代家系抗病速生家系系谱图...........................................282.3牙鲆世代抗病力分析.....................................................................293讨论............................................................................................................33参考文献................................................................................................................35硕士期间发表的论文............................................................................................42致谢....................................................................................................................432 上海海洋大学硕士学位论文引言牙鲆(Paralichthysolivaceus)是我国北方沿海地区重要海水养殖鱼类之一。自上世纪90年代第四次海水养殖浪潮开始，牙鲆人工养殖业开始蓬勃发展起来，深受市场欢迎，产生了巨大的经济效益，带动了许多地区的经济发展。然而工厂化的高密度养殖和长期的近亲交配导致牙鲆种质退化，病害频发，产量下降，严重妨碍了牙鲆养殖业的可持续发展。因此，培育牙鲆优良亲本，培育抗病力强的牙鲆新苗种才是解决当前危机的良好途径，也是实现牙鲆养殖业可持续发展的根本途径。近年来，国内外水产工作者和科研者相继开展了一系列牙鲆遗传改良工作，取得了一定成效。在国外，韩国早在2004年就开展了选育快速生长牙鲆的选育工作，到2008年，成功获得生长性状改良的牙鲆，生长速度比原来的牙鲆品系提高了1.2倍。在国内，陈松林等以杂交育种为基础，结合家系选育的方法，培育出了牙鲆“鲆优一号”新品种，比普通牙鲆生长速度快30%左右，养殖存活率高20%左右；刘海金等运用雌核发育技术和家系选育的方法，先后培育出了生长速度快的牙鲆新品种“北鲆1号”和“北鲆2号”等等。本研究通过家系选育，以2007年、2009年、2014年选育出的抗病牙鲆家系为亲本，建立了牙鲆抗迟缓爱德华氏菌病家系，成功筛选到抗病力强、生长快速的F4代家系(F1639)，为进一步培育抗病高产优质的牙鲆优良品种奠定了重要基础。本研究表明，经过多代的家系选育和攻毒感染实验，牙鲆的抗病力得到逐代提升，实现了抗病力性状向后代的稳定遗传。本研究结果对于其它鱼类抗病良种培育,具有重大的应用价值和广阔的推广前景。1 上海海洋大学硕士学位论文第一章文献综述1鱼类常用育种技术近年来，随着现代社会、经济的发展，人民生活条件得以改善，人们对水产品的数量和质量开始有了更高的追求，因而，现代的水产养殖产业业得以蓬勃发展。水产种质资源、饲料、水质是水产养殖产业的三大主要物质基础，对水产种质资源进行改良，可以提高水产品的产量、质量，增大经济效益，中国已经是世界上水产养殖规模最大的国家之一，水产优良品种的选育工作具有更加重要的作用和意义。1.1选择育种选择育种是根据现有品种在生殖繁育过程中的自身产生的可遗传的变异作为原始材料，选优汰劣，培育优良品种[1]。选择育种方法原理易于掌握，适合大规模传播推广，是最基本的育种方式，已经在农业、畜牧业和水产业的良种培育中发挥了重要作用，现在和将来，它仍然是水产品种改良的重要途径。水产动物可利用的变异量大，遗传力相对较高；陆生动物可利用的变异量低，家畜、家禽等恒温动物的遗传力相对较低，因此选择育种在水产生物良种选育中更为有效[2]。1949年解放后我国科技人员在鲤鱼杂交实验中，又选育出荷包红鲤、鳞鲤[3]、红镜鲤[4]。黄海水产研究所对中国对虾高健康虾进行了连续几年的选育，培育出生长快、抗逆性强的高健康种群。他们也对栉孔扇贝进行选育，仅两年产量提高20%左右，存活率提高50%。海带经自交和定向选择已培育出一系列高产优质的海带新品种，如海青1-5号及海带的高产高碘品种[5]。李梦军等[6]采用个体选育和家系选育相结合的方法对野生三角帆蚌的壳宽、体重2个重要经济性状进行了遗传改良，选育后代种群生产、育珠性能优良，能够生产培育出更大、更光、更圆的淡水珍珠。Donaldson等[7]先是成功地培育了多个鲑鳟鱼类新品种，Brzeski等[8]与2 上海海洋大学硕士学位论文Bolivar等[9]成功进行了罗非鱼的选育，又有超雄罗非鱼、全雌牙鲆鱼等新品系培育成功[10][11]。1.1.1个体选择个体选择是以个体为单位，将每一个体的表型值大小作为标准而进行的选择。在某一混合群体中，将所有入选个体全部混养在一起，任其自由交配，繁殖出子1代，然后从子一代中选择表型性状较为优良的个体繁育子2代，通过此方法反复进行选择，直至形成新品种。因此，个体选择又被人们称为混合选育或集体选育[12]。李健等[13]对中国对虾进行6代的群体选育，培育出具有生长快、抗逆性强等优良的经济性状的中国对虾快速生长新品种“黄海1号”。李太光等[14]将尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼进行杂交繁育出雄性率95%以上的杂交新种奥尼鱼。蒋湘等[15]以群体选育对中国九孔鲍进行遗传改良，中国养殖九孔鲍与日本野生九孔鲍群体培育杂交子二代，发现养殖群体的选择反应极显著。1.1.2家系选择家系选择是以家系为单位，根据不同家系所有个体或部分个体特定表型的平均值为标准，从而进行选择育种。在家系选育中，所有家系之间应该相互隔离或者进行标记区分，并且将所有家系的客观条件尽量保持一致，使它们具有更多相同的客观条件。家系选育的亲本系谱清晰、利于减缓近交衰退、缩短育种年限、具有良好的选育效果，从而成为近年来广泛应用的选择育种手段。家系选育可以隐性基因控制的优良性状在后代中进行纯合，并且淘汰不良基因，最终获得良好的经济性状。家系选育缺点是占用养殖资源过多，世代间隔长，可比条件要求苛刻等。陈松林等[16]对中国牙鲆进行人工感染鳗弧菌，选育出中国本地的抗病群体，然后将中国本地的抗病群体与日本引进的牙鲆群体进行杂交，获得养殖成活率高、生长较快的群体，将其作为母本，以韩国引进牙鲆群体作为父本进行杂交，得到的三杂交后代，即该品种为牙鲆“鲆优1号”新品种[17]。刘永新等[18]于2009年成功筛选出2个具有结构较好的生长构成性状和较高的性状表型值的牙鲆家系，可作为培育快速生长型牙鲆新品种的候选家系。廖愚等[19]选育出两个生长速度快，而且体型较长、生长整齐，具有较大的选育潜力的广西鲤鱼F2代家系。李伟业等[20]3 上海海洋大学硕士学位论文对红鳍东方鲀选育家系的构建与标准化培育技术进行研究，发现红鳍东方鲀比较适合构建父系半同胞家系。姜海滨等[21]采用杂交选育和半同胞家系选育的方法对黑鲪野生地理群体与家系选育群体进行选择育种，获得了优良杂交群体和优良半同胞家系。彭张明等[22]构建了马氏珠母贝全同胞家系，选育出综合评定值Pi最大的两支性状优良家系。黄永春等[23]对凡纳滨对虾连续进行4代家系选育，提高了凡纳滨对虾抗WSSV性能，降低死亡率，推迟死亡高峰。马爱军等[24]基于家系选育选育出5个抗病力较强的大菱鲆抗鳗弧菌优良家系。1.1.3同胞选择有些性状不能在那些入选亲本的个体上直接度量，借助同胞或者半同胞的表型值作为依据，这种以同胞表型的情况作为判断依据的选择称为同胞选择。因为同胞选择是根据现有的全同胞或半同胞来估计入选对象的育种值，所以同胞选择无论在什么群体中都较易做到。Gjedrem[25]利用家系选择在鲑科(Salmonid)鱼类中研究具有较大遗传变异性的肉质性状，涉及含脂率、肉色、脂肪的分布。宋传文等[26]研究结果表明紫贻贝的生长性状遗传方差较大，紫贻贝有较大的遗传改良潜力，比较适合进行选择育种。徐如卫等[27]测定了凡纳滨对虾半同胞家系与全同胞家系的9个生长性状，发现全同胞家系与半同胞家系的表型与遗传相关极显著，表明凡纳滨对虾的生长情况比较适合改良。栾生等[28]以全同胞组内相关法发现刺参耳状幼体体长的加性遗传方差较大，在刺参幼体早期生长阶段具有较大的品种改良潜力。1.1.4后裔测定后裔测定是通过对子代表型平均值进行测定，从而确定选择亲本和亲本组合。实际上凭借子代表型情况进行选择，仍然属于家系选择的范畴。后裔测定的原理虽然简单，但在实际生产中的应用却很麻烦，主要困难是必须在相同环境中同时饲养很多组合的后代，才能得出可比的结果。实际情况是池塘间有差异，这后一种差异往往引起竞争的差异，从而掩盖生长速度和成活率的遗传差异。后裔测定的可靠性高于其他鉴定方法，其缺点是所需的世代间隔太长，在子代表型平均值尚未达到测定标准之前，无法对亲本的进行选择。田永胜等[29]利用后裔性状测定和分析一些牙鲆半同胞家系的生长性能，发现了3个父本及54 上海海洋大学硕士学位论文个母本产生的家系生长较快。1.1.5综合选择综合选择是将个体选择和家系选择结合起来进行选择育种。前苏联人在选育罗普莎鲤鱼时，采用综合选择法[30]。1.2杂交育种杂交育种是以杂交方法培育优良品种或利用杂种优势，是水产生物的品种改良和生产的重要方法，是生物育种的基本途径之一。杂交可以使遗传物质在种群间转移，有助于增加生物变异性。杂交是将现有种群的基因和性状进行重新组合，并不产生新基因。吴清江等[4]利用兴国红鲤与苏联红鲤按照增殖杂交育种方法培育出红色散鳞镜鲤。建鲤是由荷包红鲤♀×元江鲤♂的杂种，按增殖杂交育种法，经4代家系选育形成新品种的雏形，然后与子2代的连续雌核发育子2代交配，经选育培育成建鲤，其个体大、生长速度比荷元鲤还要快29.4%-30.8%[31]。燕敬平等[32]以日本盘鲍与皱纹盘鲍杂交产生的鲍苗的壳长和存活率明显大于我国的皱纹盘鲍自交鲍苗。王楚松等[33]利用尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼的杂交产生生长速度快、抗逆性强后代奥尼鱼。钟建兴等[34]使用双斑东方鲀与红鳍东方鲀进行杂交，获得可在福建、广东、海南等南方沿海地区推广养殖的东方鲀苗种。1.3分子标记辅助育种技术Jeffreys等[35]发现物种在DNA水平上存在高度的特异性，DNA分子标记逐渐成为遗传研究中主要的研究工具[36]。分子标记辅助选择技术，利用生物DNA分子标记与数量遗传学相结合，通过对生物品种间DNA分子标记的差异性进行分析，确定某种特定基因型，达到选择目标性状的目的。在亲本亲缘关系鉴定、杂种后代的选择、杂种优势的预测及品种纯度鉴定等各个育种环节的具有明显优势。在国内，目前主要正处于筛选分子标记阶段，已经在草鱼、鲤、鲢、鳙、银鲫、大菱鲆、真鲷等鱼类上分离了大量的微卫星标记[37][38]。董晓丽等[39]筛选了大菱鲆基5 上海海洋大学硕士学位论文因组序列，获得部分SNP标记。1.3.1限制性酶切片段长度多态性(RFLP)RFLP是利用基因型之间限制性片段长度的差异，使用同一种限制性内切酶酶解时，酶切长度片段会出现差异，显示的杂交带位置也有差异。但是RFLP对DNA的量要求大、检测步骤较为繁琐，多态检出率低，提供的信息有限等，因此在实际生产中应用较少。张辉等[40]用RFLP发现9种酶在鲫鱼种系间或种系内产生限制性片段长度多态性。樊连春等[41]通过RFLP发现在银鲫雌核发育系间存在多态性差异，有助于银鲫进化遗传学的研究。李娴等[42]发现线粒体12SrRNA在尼罗罗非鱼埃及品系、美国品系和吉富品系以及奥利亚罗非鱼、尼奥罗非鱼间是相当保守的。1.3.2随机扩增多态性DNA（RAPD）RAPD是以基因组DNA为模板，使用人工合成的随机多态核苷酸序列作为引物，在DNA聚合酶作用下，进行PCR扩增。扩增产物经过电泳分离、染料染色后，可以检测出多态性。陈国生等[43]应用RAPD筛选出对黑脊倒刺鲃和黄颡鱼RAPD反应重复性好、带型清晰明亮的引物，有助于对黑脊倒刺鲃和黄颡鱼进行分子育种。邱晴等[44]用RAPD技术对马口鱼卵巢DNA和精巢DNA进行扩增，获得马口鱼性别DNA标记将有助于探究马口鱼的性别分化机制，有利于马口鱼进行遗传育种。许玉德等[46]用RAPD技术证明尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼杂交子代基因杂合性增强，会产生杂种优势。孙昭宁等[45]使用RAPD和SSR两种分子标记技术，将中国对虾雌、雄遗传连锁图谱进行绘制分析。1.3.3扩增片段长度多态性(AFLP)AFLP是利用特定引物诱导DNA扩增后得到的DNA多态性做为一种分子标记。AFLP在构建遗传连锁图谱、快速鉴别与目的基因紧密连锁的分子标记、甲基化研究等方面有着广泛的应用前景。李静等[48]利用扩增片段长度多态性(AFLP)技术，成功筛选到与半滑舌鳎性别6 上海海洋大学硕士学位论文相关的AFLP分子标记，有助于半滑舌鳎性别决定机制的研究。马洪雨等[47]利用选择性引物组合从半滑舌鳎中筛选到一条雌性特异的AFLP标记，研究表明该标记是雌性特异的，可以用于半滑舌鳎个体遗传性别鉴定。徐营等[49]对半滑舌鳎的不同群体进行微卫星标记分析，发现养殖群体的遗传多样性明显高于减数分裂雌核发育群体。刘洋等[50]筛选半滑舌鳎共显性性别特异微卫星标记，成功获得了半滑舌鳎性别特异SCAR标记，可用于雌雄鱼的快速检测。王志勇等[51]用AFLP指纹技术对中国沿海真鲷群体进行遗传多态性分析，发现大多数位点在群体内或群体间呈现多态。韩志强等[52]对青岛和厦门黄姑鱼群体进行AFLP分析，发现两地群体的遗传结构相似，没有明显的遗传差异，存在着明显的基因交流。Liu等[53]对斑点叉尾鮰和长鳍鮰的亲本及后代进行了AFLP分析，发现斑点叉尾鮰和长鳍鮰正反交后代的AFLP标记呈现孟德尔遗传、AFLP指纹图谱类似。1.3.4重复序列长度多态性（SSLP）SSLP是一系列不同长度的重复序列，不同的等位基因含有不同数目的重复单位，通过PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。范彩霞等[54]对牙鲆的抗淋巴囊肿病相关SSR标记进行了筛选，成功筛选到与牙鲆抗淋巴囊肿病相关的微卫星标记。王景伟等[55]利用高密度的半滑舌鳎微卫星遗传连锁图谱来分析半滑舌鳎性别决定机制，发现了5个标记组合附近的基因与半滑舌鳎的性别决定相关。孙效文等[56]利用RAPD与SSLP技术建立了的鲤鱼遗传连锁图谱。周莉等[63]对银鲫雌核发育不同系间的个体进行微卫星DNA标记分析，发现扩增图谱呈现出高度的遗传异质性，说明不同雌核发育系间的存在亲缘关系。王晓清等[64]对大黄鱼和鮸的杂交亲本和子代进行微卫星和AFLP标记分析，发现杂交子代与母本大黄鱼之间具有极高的遗传同质性。颉晓勇等[57]对9年9代选育的新吉富罗非鱼群体进行微卫星标记分析发现罗非鱼世代间遗传分化较小，表明新吉富罗非鱼在遗传上更为稳定。1.3.5遗传连锁图谱基因连锁图谱是根据遗传重组的结果，将基因在染色体上的相对位置表现出来，在生物基因组研究中，基因连锁图谱是重要的组成部分。7 上海海洋大学硕士学位论文张俊杰等[58]在半滑舌鳎已有的物理图谱和遗传图谱的基础上，进行了半滑舌鳎性别连锁标记的物理定位，最终得到100个标记的准确定位，有利于精确组装半滑舌鳎性染色体基因组序列。牛余泽等[59]利用SSR标记构建了牙鲆遗传连锁图谱，并对牙鲆生长性状进行QTL定位分析。庞仁谊等[60]利用基因组测序得到的大量微卫星序列，构建了牙鲆微卫星标记(SSR)遗传连锁图谱。王宣朋等[61]以单核苷酸多态性（SNP）为主要标记，微卫星和表达序列标签为辅助标记，构建了鲤的遗传连锁图谱。2牙鲆概况牙鲆隶属于硬骨鱼纲，鲽形目，鲽亚目，牙鲆科，牙鲆属。牙鲆在我国北方地区俗称牙片、偏口，是重要的海水工厂化养殖品种之一。牙鲆为冷温性底栖鱼类，身体呈卵圆形、扁平，体型硕大，深受消费者的喜爱。牙鲆养殖产业具有较高经济效益，市场十分广阔，是较有前途的养殖品种。陈松林等[17]对中国牙鲆进行人工感染鳗弧菌，选育出中国本地的抗病群体，然后将中国本地的抗病群体与日本引进的牙鲆群体进行杂交，获得养殖成活率高、生长较快的群体，将其作为母本，以韩国引进牙鲆群体作为父本进行杂交，得到的三杂交后代，即该品种为牙鲆“鲆优1号”新品种。牙鲆“北鲆1号”是以经选育的优良雌核发育家系为母本，以另外一个雌核发育家系经高温诱导成的伪雄鱼为父本交配而得。该品种雌性率高，生长速度快，规格整齐，互相残食少，成活率高。2.1种质资源退化牙鲆是我国北方沿海地区重要的人工养殖品种之一，养殖规模在水产业中占有很大一部分比重。现阶段，我国的牙鲆工厂化养殖普遍以捕捞的野生牙鲆作为亲本，但是亲本资源匮乏，亲本老化问题较为严重[62]，往往导致生长速度下降、苗种孵化率和出苗率降低、品种衰退、抗病力下降等问题产生[65]。在野生环境中，牙鲆种群密度小，饵料鲜活，大规模死亡情况较少发生，但是8 上海海洋大学硕士学位论文在大规模工厂化养殖过程中，养殖密度大、生活条件差，往往会导致牙鲆出血性败血病、腹水病、鳗弧菌病等易导致大规模死亡疾病的发生[66]。2.2病害频发、渔药滥用渔药是水产养殖产业的重要物质条件，是水产疾病防治过程中的关键性因素，特别是现今水产病害频发的情况下。但是，我国的水产养殖行业中普遍以小规模池塘养殖为主，整体素质不高，科技含量较低，渔药生产企业研发能力较弱，渔药管理不规范，往往造成养殖过程中渔药的滥用。养殖过程中不规范使用渔药会导致渔药残留，对人类和环境有累积性、慢性、长期的危害，会诱导耐药菌株的产生等[67]。3迟缓爱德华氏菌病概况迟缓爱德华氏菌病，俗称腹水病，是由迟缓爱德华氏菌（Edwardsiellatarda）引起水生动物疾病的统称，可以导致鱼类肠道败血症和肝肾坏死病等，还可引起人体肠炎、腹泻等症状，是人畜共同感染的细菌，迟缓爱德华氏菌病为我国的三类水生动物疫病[68]。迟缓爱德华氏菌病在发病初期，鱼体无明显症状，早期治疗比较困难，在病情的中后期，可以观察到鱼体腹部膨胀，发病程度较深时，鱼体会出现“脱肛”现象，因为腹腔内压力过高导致一部分肠道脱垂于肛门外，打开腹腔后会发现大量浓液状腹水，但肠道内无腹水[69]。七八月份，水温高于20℃时是迟缓爱德华氏菌病发病高峰期，而且随海水温度升高，死亡率越大，迟缓爱德华氏菌病的日死亡率不高，但是后期累计死亡率非常高[70]。迟缓爱德华氏菌属于肠杆菌科，爱德华菌属[71]。鳗鱼迟缓爱德华氏菌病呈世界性分布，是鳗鱼最严重的病害之一，对我国台湾和日本的鳗鱼养殖产业造成巨大危害[72]。李宁求等[73]通过基因重组技术构建鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕，并对菌蜕制备条件进行了优化，为鳗源迟缓爱德华氏菌病疫苗开发奠定了基础。陈昌福等[74]对从日本鳗鲡上分离出的迟缓爱德华氏菌进行致病力测试，注射菌液后的发病症状与自然发病的日本鳗鲡症状相同。宣云峰等[75]对从加州鲈鱼分离纯化出的迟缓9 上海海洋大学硕士学位论文爱德华氏菌进行药敏实验，发现该菌对恩诺沙星、氟苯尼考、头孢哌酮等相对敏感。王波等[76]研究发现皮下坏死毒素、溶血素、过氧化氢酶、软骨素酶等是迟缓爱德华氏菌的致病因子。迟缓爱德华氏菌主要通过鱼类消化道、表皮受伤破损处、鳃进入鱼体，也可通过接触患病鱼体、摄入携带迟缓爱德华氏菌的食物或生物饵料而相互感染[77]。10 上海海洋大学硕士学位论文第二章牙鲆抗迟缓爱德华氏菌病F4代家系建立陈松林等[16]、徐田军等[78]、王磊等[79]分别于2007、2009及2012年建立了大量牙鲆家系，通过鳗弧菌感染实验，已经选育出牙鲆抗鳗弧菌家系。陈松林等[17]对中国牙鲆进行人工感染鳗弧菌，选育出中国本地的抗病群体，然后将中国本地的抗病群体与日本引进的牙鲆群体进行杂交，获得养殖成活率高、生长较快的群体，将其作为母本，以韩国引进牙鲆群体作为父本进行杂交，得到的三杂交后代，即该品种为牙鲆“鲆优1号”新品种。张英平等[80]、孙何军等[81]和郑卫卫等[82]分别利用迟缓爱德华氏菌对牙鲆家系进行感染，筛选出了一些抗迟缓爱德华氏菌家系，为培育抗迟缓爱德华氏菌牙鲆新品种奠定了基础。齐文山等[83]研究表明冷冻保存的异源精子可以诱导建立牙鲆卵裂雌核纯系，有助于构建牙鲆优良纯系。侯吉伦等[84]对牙鲆两代雌核发育的个体为亲本，再度诱导雌核发育，获得三代雌核发育后代，结果显示雌核发育后代个体的纯合度、平均遗传相似度进一步提高。本实验通过家系选育、雌核发育等方法，以2007年、2009年、2014年的优质抗病牙鲆为亲本，于2016年培育出F4代抗迟缓爱德华氏菌病牙鲆品种。1材料与方法1.1牙鲆F4代家系建立1.1.1精子、卵子采集与人工受精亲鱼来源包括：日本牙鲆群体(JapaneseflounderStocks)、韩国牙鲆群体(KoreanflounderStocks)、2009年牙鲆家系、2010年牙鲆家系、2012年牙鲆家系、2013年牙鲆家系及2014年牙鲆家系。亲鱼的培育、苗种繁育等在山东海阳黄海水产有限公司进行。所有实验用亲鱼自2016年1月起开始进行控温控光，亲鱼使用电子标记进行个体识别，将电子标记注射于鱼体肌肉较厚的背部，同世代家系养殖在同一水泥池中（30m2方形养殖池）。保持循环水养殖。一月份时每天保持光照8h，黑暗16h，之后每5天增加光照时间0.5h，直至光照14h。水温控制从9℃开始，11 上海海洋大学硕士学位论文每5天提高0.5℃，直至水温12.5℃。随时观察亲鱼性发育程度，避免自然排卵和过熟致死。2016年4月开始，进行2016年牙鲆家系建立。先进行卵子采集，对发育成熟的雌鱼进行电子标记扫描，确定雌鱼所属家系，再对雌鱼进行人工挤压腹部挤出卵子，使用无海水、干净的量杯收集排出的卵子。然后再对发育成熟的雄鱼进行电子标记扫描并人工挤压排出精液，使用吸管收集精液，由于精子遇到海水便会激活，需要使用擦净雄鱼生殖孔附近的海水。最后按照家系建立方案进行人工受精，将精子加入到卵子中，加入海水进行激活受精，5min后加满海水，受精卵会上浮，死卵或未受精卵会沉底。将上浮的受精卵使用筛绢过滤，洗去受精卵上的粘液等。洗卵后将受精卵放入孵化网箱内进行孵化，孵化时水温应保持在(18.5±0.5)℃，每天使用虹吸法洗除沉底死卵[85]。48h后收集受精卵，放在2.5m3玻璃钢养殖池内进行孵化出膜。1.1.2牙鲆鱼苗培育受精卵转移至2.5m3玻璃钢养殖池约12h后出膜。出膜后2天内，鱼苗可以依靠自身携带的营养物质提供能量不需要吃食，48h后开始少量投喂适量的小球藻与轮虫。小球藻可以控制池中光照强度，并作为轮虫的食物。轮虫是牙鲆仔稚鱼的开口活体饵料，一直投喂至鱼苗全部变态伏底（孵化后30d左右）。孵化后12d开始投喂卤虫，卤虫为卤虫卵人工孵化出的去壳的无节幼体，应尽量避免鱼苗食入卤虫壳，同时随着卤虫投喂量的增加逐步减少轮虫投喂量。未避免牙鲆幼鱼营养不良，产生白化苗，需要对轮虫、卤虫使用裂壶藻强化剂进行营养强化，从而增加幼鱼二十碳五烯酸（EPA）和二十碳六烯酸（DHA）的摄入量。由于轮虫与卤虫均为商业生产的活体饵料，会携带一些病菌，需要每次投喂前使用氟苯尼考进行消毒杀菌。孵化后15d开始投喂微粒子饲料对幼鱼进行驯化，前期投喂饲料量需要严格控制，避免败坏水质。随着幼鱼体型增长，逐步增大饲料规格型号，保持幼鱼快速摄食。饲料为山东升索饲料公司生产的牙鲆、大菱鲆、鲽类专用系列饲料，饲料规格直径为S1:150-250μm；S2:250-480μm；S3：480-750μm；S4：750-1000μm；S5:1.0mm；S6：1.3mm；S7：1.6mm；S8：2.0mm；P1：2.5mm；P2；3.0mm；P3：3.5mm；P4：4.5mm；P5：6.0mm。12 上海海洋大学硕士学位论文在养殖过程中，需要每天清理池底的残饵粪便等。前期鱼苗未伏底时，可以采用虹吸法吸出池底的残饵、粪便、死鱼。待鱼苗全部伏底后，可以在每天排水时将池底杂物推至排水口顺水排出。为避免清理过程中对鱼苗造成伤害，清底动作需要轻柔，清底完成后全池泼洒土霉素进行消毒。牙鲆鱼苗生长至15d时，开始进行第一次数量标准化，清理缸内发育畸形、伤残、白化的鱼苗，统一所有养殖缸内鱼苗数量至10000尾左右。当牙鲆鱼苗生长至45d、75d时，再对所有家系进行数量标准化，控制鱼苗数量在5000尾、2000尾。1.2牙鲆F4代家系生长性状测定2016年7月15日至9月15日，在山东莱州明波水产公司进行牙鲆家系生长性状测定实验。2016年7月份，牙鲆鱼苗生长至69-90日龄，由于前期鱼苗较小，难以测量单个鱼苗的体重，故只进行了鱼苗体长测定。所以每个家系随机抽取30尾测量全长，然后将所有家系随机抽取300尾，饲养在水体积为2.5m3的圆形玻璃钢养殖桶中，保持水温（22±0.5）℃、长流水、24h光照，每天定时投喂4次，每次均为饱食投喂。60d后，随机抽取每个家系中50尾鱼，测量体重、全长(从吻端到尾鳍末端)。1.3牙鲆F4代家系抗病性状测定1.3.1迟缓爱德华氏菌培养本实验使用的迟缓爱德华氏菌菌种为本实验室-80℃下保存的菌种，采用同一批菌种分装冷冻保存。经复苏后，无菌条件下接种在已灭菌的胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，28℃，180r/min，振荡培养至少24h后，检测600nm波长下吸光值大于1便可4℃保存待用。1.3.2人工感染实验半致死浓度测定从所有28个牙鲆F4代家系中，每个家系挑选1条鱼，共28条鱼为一组，重13 上海海洋大学硕士学位论文复8组，分别饲养在0.3m3的玻璃钢桶内，进行预感染实验。将培养好的迟缓爱德华氏菌菌液以5000r/min进行离心5min，去除上清液，使用1×PBS缓冲液吹洗，重复3次，直至清除培养基，检测600nm波长下吸光值，使用1×PBS缓冲液将OD600稀释为1。最后使用1×PBS缓冲液将OD600=1的菌液稀释0倍、10倍、100倍、1000倍、5000倍、10000倍、50000倍共7个浓度梯度。采用腹腔注射法向牙鲆腹腔注射菌液，注射剂量按照鱼体重0~10g注射0.1mL，11~20g注射0.2mL，以此类推。以腹腔注射1×PBS缓冲液作为对照组。注射后每隔6h观察鱼体状况，统计死亡情况。1.3.3正式人工感染实验半致死浓度确定后，从每个家系中选取100尾大小相近的个体，采用腹腔注射法注射半致死浓度的菌液，注射剂量与预实验相同，并用1×PBS缓冲液注射作对照组。实验时水温控制在(22±1)℃，注射后每隔6h察看并取样，及时清理死鱼，记录每条鱼的死亡时间，家系号，测量死鱼的体重、全长（从吻端到尾鳍末端的距离）、体宽（鱼体左右侧的最大距离）。注射感染后12d，各家系发病死亡情况基本消失，终止实验，统计每个家系的存活鱼苗数量，测量每个家系所有存活鱼的体重、全长、体宽。1.3.4数据处理用SPSS19.0软件计算各家系的平均全长、体宽和体重，统计死亡与存活数量，计算各个家系的存活率。2结果与分析2.1牙鲆F4代家系的建立本实验室2016年成功培育了28个牙鲆家系，包括F3代家系4个、F4代家系23个和对照家系1个。对照家系来自山东海阳黄海水产公司同时期繁育的野生牙14 上海海洋大学硕士学位论文鲆鱼苗。表2-1牙鲆亲鱼组合方式Tab.2-1Thecombinationmodesofflounderbrooders母本父本MaleFemaleF1317F1401F1406F1411F1413F1417F1421F1422F1437F1446F0927*F1002*F1013*F1260**F1263*F1325*F1342*F1413*F1419*F1421*F1423*F1430**F1432**F1444*F1446*JS***表示这两个家系的组合建立了实验家系，JS为日本群体*meansthatthecombinationofthesetwofamilywasmated,JS:Japanesestocks2.2牙鲆F4代家系的生长性状由于前期鱼苗较小，难以测量单个鱼苗的体重，故只进行了鱼苗体长测定。生长性能测定时间为60d，测定时鱼苗较小，故筛选的速生家系属于早期生长快速的家系，对速生家系的筛选具有参考意义。根据60天的早期生长性状实验后（表2-2、图2-1），将全长日增长率大于0.160cm/d的家系定为早期快速生长家系，共5个(F1639、F1621、F1661、F1606、F1648)，平均全长日增长率为0.168cm/d，占所有家系的17.9%；将全长日增长率在0.160~0.145cm/d之间的家系定为早期生长速度一般家系，共14个，平均全长日增长率为0.152cm/d，占所有家系的50.0%；将全长日增长率小于0.145cm/d的9个家系定为早期慢速生长家系，平均全长日增长率为0.142cm/d，占所有家系的32.1%。15 上海海洋大学硕士学位论文表2-228个牙鲆家系的全长日增长率Tab.2-2Dailylengthgainrateof28FlounderF4families标准家系号初始全长/cm最终全长/cm全长日增长率/cm·d-1FamilyPrimarylengthOriginallylengthDailylengthgainrate16392.10±0.3412.54±1.010.17416212.95±0.4213.34±1.340.17316612.55±0.3912.48±1.200.16616062.53±0.4212.41±1.370.16516482.03±0.2811.80±0.850.16316471.94±0.1911.38±0.730.15716462.61±0.2712.01±0.980.15716152.73±0.3112.12±0.640.15716382.46±0.4511.76±0.810.15516552.11±0.2511.37±0.740.15416342.33±0.2111.50±0.870.15316351.80±0.2010.92±0.910.15216332.29±0.4211.34±1.130.15116312.40±0.3711.45±0.720.15416402.44±0.3911.37±1.250.14916502.14±0.2710.99±0.720.14816032.51±0.3211.34±0.940.14716162.70±0.3411.49±0.770.14616522.46±0.2811.18±0.860.14516362.63±0.3211.28±0.630.14416013.42±0.6612.05±1.050.14416672.46±0.3311.04±0.530.14316142.43±0.4210.97±0.810.14316272.74±0.3311.26±1.260.14216572.42±0.3810.92±0.960.14216252.87±0.2911.30±0.740.14016452.57±0.2710.91±0.740.13916292.21±0.2210.50±1.030.138平均值Mean2.44±0.4711.54±1.110.15116 上海海洋大学硕士学位论文图2-1F4代牙鲆家系的全长日增长率Fig.2-1DailylengthgainrateofF4flounderfamilies2.3牙鲆F4代家系的抗病性状2.3.1人工感染实验半致死浓度测定预实验水温为(23.0±0.6)℃，实验鱼体重(13.9±4.4)g。根据预实验结果(表2-3)，将1×10-5OD作为半致死浓度，经测定，半致死浓度LD450为6.48×10CFU/mL。表2-3注射不同浓度菌液牙鲆的感染情况Tab.2-3ThemortalityofJapaneseflounderinjectedwithdifferentconcentrationofbacteria分组感染数/尾死亡总数/尾死亡/%24h48h72h96h120h144hGroupinfectedfishtotalityofdeadfishmortalityPBS000000280015174010282796.41/100716300282692.91/100011980028281001/1000002961281864.31/5000010486281967.91/10000000239281450.01/500000000022827.117 上海海洋大学硕士学位论文2.3.2F4代不同家系感染迟缓爱德华氏菌结果对28个家系共约2800尾牙鲆163d日龄鱼苗进行迟缓爱德华氏菌人工注射感染实验后。注射后24h-72h，所有家系鱼摄食量减少，活力下降，出现白色粪便，部分鱼表现腹水症状。第3天开始出现死亡，死亡的个体体色发黑，腹部肿胀，部分个体有肠道外露现象。第4、5天开始大规模死亡，死亡持续到第12天逐渐稳定，各家系的存活率如图2-2所示，总体平均存活率为(44.48±19.36)%。表2-4所示的为28个F4代牙鲆家系的平均全长、平均体宽、平均体重及感染存活率。图2-2感染各牙鲆家系存活率统计Fig.2-2Statisticoffamilysurvivalrateintheinfection18 上海海洋大学硕士学位论文表2-4牙鲆F4家系存活率和注射感染鱼数量Tab.2-4SurvivalrateandInfectedfishnumberofF4flounderfamilies家系感染鱼数/尾存活率/%家系感染鱼数/尾存活率/%FamilyInfectedfishsurvivalrateFamilyInfectedfishsurvivalrateF163910177.23%F16467441.89%F16019774.23%F161510239.22%F16334273.81%F16559739.18%F16359970.71%F16489436.17%F16579869.39%F164710527.62%F16068367.47%F16259726.80%F16319666.67%F165010026.00%F16345054.00%F16169825.51%F16679753.61%F166110224.51%F165210553.33%F16279623.96%F16389052.22%F16368221.95%F16219652.08%F160310118.81%F16149251.09%F162910218.63%F164010044.00%F164510515.24%平均Mean9344.48%感染后28个家系的平均存活率为(44.48±19.36))%，最低为15.24%，最高为77.23%。按照存活率从高到低排序，如图2-2所示，其中F1639、F1601、F1633、F1635、F1657、F1606和F16317个家系（占总量的25.0%）的存活率均高于60%，定义为高抗病力家系；11个存活率介于30%-60%之间的家系（占比39.3%）定义为抗病力一般的家系；10个存活率低于30%的家系（占总量的35.7%）称为低抗病力的家系。2.3.3F4代不同抗病力家系发病情况分析注射迟缓爱德华氏菌后，易感家系在第2-3天开始出现发病死亡情况，第5天进入死亡高峰期，第9-10天即达到稳定状态；抗病家系在第4-5天开始出现发病死亡情况，存活率下降较为平缓，第10天达到稳定状态(图2-3)。易感家系注射迟缓爱德华氏菌后，发病迅速，发病症状表现明显，存活率较低；抗病家系注射后发病较慢，发病程度较轻，存活率较高。高抗病力家系的存活率比低抗病力家系存活率高49.76%。19 上海海洋大学硕士学位论文图2-3感染迟缓爱德华氏菌后不同抗病力家系存活率的变化Fig.2-3SurvivalratesofdifferentdiseaseresistancefamiliesafterEdwardsiellatardainfection3讨论牙鲆等多种水产养殖动物感染迟缓爱德华氏菌后会出现摄食量和活力明显下降，腹腔膨大，腹膜软化出血，内脏肿大甚至外漏，肝、肾等组织局灶性坏死等临床症状，这些临床症状与本研究所观察到的结果基本一致[86]。另外，比较人工腹腔注射感染与自然感染，人工注射感染的发病症状表现突出，发病情况较为普遍，不同家系之间的抗病力差异区分明显。2016年本研究共建立了28个牙鲆家系，包括F3代家系4个、F4代家系23个和对照家系1个。通过迟缓爱德华氏菌人工注射感染实验，成功筛选出抗迟缓爱德华氏菌F3家系2个(F1601、F1606)，F4代家系4个(F1633、F1635、F1639、F1657)。分析表明，2016年抗病力强的家系的父本来自2014年抗迟缓爱德华氏菌病家系(F1406、F1421、F1422)，其祖先或祖先之一67%来自抗鳗弧菌家系。由此可见，近年来本实验室不断选育的牙鲆抗病家系成果明显。在抗病力高的6个家20 上海海洋大学硕士学位论文系中，F1639家系的全长日增长率(0.174cm/d)最高，为早期快速生长家系；F1606为早起快速生长家系，F1633、F1635为生长速度一般家系。综合比较这些家系的抗病和生长性能可以看出，F1639在抗病和早期生长性状方面都优于其他家系，可作为以后研究的F4代重点家系。21 上海海洋大学硕士学位论文第三章牙鲆F4代家系生长性状与抗病性状的相关性分析由于基因的连锁性与多效性，在实际的生产实践中，生物体的各种性状间往往会相互关联，存在一定相关性。鱼类的某些性状的表型值比较容易测得，有些表型值往往不容易直接获得，因此可以通过测得某些较容易获得的表型值而达到测定与其相关性较高的性状。刘贤德等[87]研究表明在大黄鱼不同生长时期各形态性状与体重的相关性不同，13月龄时要注意体高和体长的挑选，而在20月龄时对体高、体长和全长均要考虑，才能够保证选择良好的选择效果。林先智等[88]研究了盐度胁迫对遮目鱼幼鱼各性状的相关性分析，遮目鱼幼鱼的对体重受体长、全长和体高的影响最大，且体长、全长和体高在不同盐度胁迫下对幼鱼体重的决定作用不同。刘小林等[89]对凡纳对虾分析了形态性状对体重的影响效果，结果表明体长、头胸甲长、胸宽是直接影响体重的重要指标。王辉等[90]研究南海毛蚶壳厚、壳高等表型值对体重的影响，结果显示壳厚、壳高是影响体重最主要因素且都具有育种意义。佟雪红等[91]比较了建鲤及黄河鲤正反杂交子代各项性状，认为体长和体高在影响体重的增长方面具有决定性作用。霍堂斌等[92]对0龄至4龄黑斑狗鱼的各项性状进行了测量并分析，表明黑斑狗鱼的体长对体重的决定系数最大，其它性状主要通过体长影响体重。耿绪云等[93]分析研究了不同年龄组梭鱼外部形态性状对体重的影响效果，表明各年龄组梭鱼的体长、体高对体重均有影响效果。佟雪红等[94]结果表明20日龄至40日龄时牙鲆体高对体重的直接作用远大于体长的直接作用，说明在牙鲆体高是影响牙鲆体重的主要性状。本实验探究牙鲆的全长、体宽、体重与抗病力的相关性，从而利于选育出抗病力高、、生长性状较好的牙鲆优良品种。1材料与方法1.1实验用鱼本实验的研究材料为2016年本实验培育的牙鲆F4代家系，共28个。F4代牙22 上海海洋大学硕士学位论文鲆家系的建立、培育、感染实验参考第二章。1.2实验方法本实验于2016年10月5日至10月30日进行了牙鲆F4代家系迟缓爱德华氏菌人工注射感染实验，实验过程中，记录每条鱼的体重、全长（从吻端到尾鳍末端的距离）、体宽（鱼体左右侧的最大距离）。详细实验方法参照第二章。1.3数据分析用SPSS19.0软件计算各家系的平均全长、体宽和体重，统计死亡与存活数量，计算各个家系的存活率。计算各性状与抗病力的皮尔森相关系数。2结果与分析2.1牙鲆F4代家系感染后各项表型值表3-1为经人工注射感染迟缓爱德华氏菌后牙鲆F4代家系的各项数据。23 上海海洋大学硕士学位论文表3-1牙鲆F4代家系的全长、全长日增长率、体重、感染存活率Tab.3-1Bodylength,dailylengthgainrate,weightandsurvivalrateofFlounderfamilies家系全长/cm全长日增长率/cm·d-1体重/g存活率/%FamilyBodylengthDailylengthgainrateBodyweightSurvivalrate160113.150.143818.7174.23160312.300.147116.3718.81160614.580.164826.9467.47161412.290.142914.6051.09161513.790.156522.4339.22161612.670.146417.0725.51162115.070.173330.1252.08162511.960.140515.6826.80162712.210.142317.2823.96162911.720.138113.7418.63163113.130.151019.0266.67163313.480.150922.6573.81163413.430.152820.9654.00163512.720.152017.3870.71163612.270.144115.3421.95163812.790.154917.2552.22163914.000.174023.4677.23164012.940.148818.0744.00164511.910.139113.9815.24164613.830.156724.7241.89164712.840.157217.9627.62164813.310.162919.3936.17165012.630.147517.2726.00165212.980.145318.2553.33165513.240.154519.5539.18165712.620.141717.0169.39166113.920.165522.9624.51166713.260.141920.3553.61平均值Mean13.04±0.800.1513±0.009819.23±3.9044.48±19.722.2牙鲆F4代家系中各项表型间相关性分析使用SPSS19.0软件对牙鲆F4代家系中生长性状与抗病性状进行皮尔森相关性分析（表3-2），存活率与全长、体重、全长日增长率呈现正相关，其中全长与存24 上海海洋大学硕士学位论文活率的相关系数为0.496，全长日增长率与存活率的相关系数为0.301，体重与存活率的相关系数为0.432，说明存活率与全长、全长日增长率、体重之间呈现中等相关性。表3-2牙鲆F4代家系中各项表型间相关性分析Tab.3-2CorrelationanalysisofphenotypesinF4flounderfamilies全长全长日增长率体重存活率BodylengthDailylengthgainrateBodyweightSurvivalrate全长1.0000.850**0.974**0.496**Bodylength全长日增长率1.0000.811**0.301Dailylengthgainrate体重1.0000.432*Bodyweight存活率1.000Survivalrate*在0.05水平上显著相关；**在0.01水平上显著相关（双尾检验）。*indicatescorrelationissignificantatthe0.05level,**indicatescorrelationissignificantatthe0.01level(2-tailed).3讨论通过对F4代牙鲆家系中生长性状与抗病性状的相关性分析，可以看出牙鲆鱼的全长、体重等生长性状与抗病力呈现极显著正相关，可以初步认为生长性状优良的牙鲆鱼具有更好的抗病力。在实际的生产应用中，可以保留生长性状较为优良的亲本，进行进一步的品种选育，从而得到抗病力高的后代。徐田军等[95]于2009年对牙鲆进行鳗弧菌感染，其研究表明各家系存活率与65d和85d的体长及体重不存在显著的相关性；与230d的生长数据存在显著的相关关系，存活率与体长和体重的相关系数分别为0.282和0.237。对于这种相异的结果，初步认为是细菌种类及来源对牙鲆的致病机理存在差异，或与鱼体的养殖过程、实验环境等因素相关。25 上海海洋大学硕士学位论文第四章牙鲆世代家系抗病力分析及“鲆优2号”抗病性能验证家系选育的亲本系谱清晰、利于减缓近交衰退、缩短育种年限、具有良好的选育效果，从而成为近年来广泛应用的选择育种手段。家系选育实际上是通过对优良的性状进行富集选择，择优汰劣后，确定亲本交配方案，建立家系，累计优良性状，使隐性基因控制的优良性状在后代中进行纯合，并且淘汰不良基因，最终获得良好的经济性状。Friars等[96]研究结果表明大西洋鲑二倍体家系的平均体质量显著高于三倍体。于飞等[97]以不同批次进口的大菱鲆构建杂交组合家系，结果表明丹麦与法国进口群体的杂交组合子一代生长优于其它杂交组合。韦信键等[98]利用不平衡巢式设计方法构建大黄鱼家系，比较不同家系的生长性能，成功筛选出快速生长家系。王新安等[98]以不同地理群体的大菱鲆作亲本构建全同胞和半同胞家系，结果表明来自英国和法国的群体比丹麦和挪威群体的家系系的生长性能更为优良。户国等[100]以虹鳟优良品系G1世代为基础群体，建立了子代全同胞家系，进行了快速生长家系的筛选工作，成功筛选出体质量和体长性能优良的家系。唐章生等[101]为吉富品系尼罗罗非鱼构建了全同胞家系和半同胞家系，选育出生长速度相对保持稳定的家系。本实验室自2003年起开始对牙鲆进行新品种选育，于2010年经过全国水产原种和良种审定委员会组织专家现场验收和专家审定，“鲆优1号”被认定为适宜推广的杂交新品种。现再经过多年的选育工作，成功选育出生长快速、养殖存活率高、抗迟缓爱德华氏菌病的牙鲆新品种“鲆优2号”。1材料与方法1.1实验用鱼2016年建立了牙鲆抗迟缓爱德华氏菌F4代家系。2014年建立了牙鲆抗迟缓爱26 上海海洋大学硕士学位论文德华氏菌F3代家系。2009年建立了抗鳗弧菌F2代家系。2007年建立了抗鳗弧菌F1代家系。家系建立、苗种培育等详见第二章。鲆优2号的培育过程见陈松林等（2017）的文献[102]。1.2实验方法通过对F1-F4代的牙鲆家系进行人工注射细菌感染实验，确定每代中各家系的抗病力情况，优先以抗病力高的家系为亲本，进行后代家系建立。选取“鲆优2号”家系与对照组家系中100尾大小相近的个体，采用腹腔注射法注射半致死浓度的菌液，注射剂量与预实验相同，并用1×PBS缓冲液注射作对照组。实验时水温控制在(22±1)℃，注射后每隔6h察看并取样，及时清理死鱼，记录每条鱼的死亡时间，家系号，统计每个家系的死亡鱼苗数量。感染后12d，各家系发病死亡情况基本消失，终止实验，统计每个家系的存活鱼苗数量。1.3数据分析用SPSS19.0软件计算各世代的平均全长、体重，统计死亡与存活数量，计算各个家系的存活率，并对不同世代间数据的进行方差分析。2结果与分析2.1牙鲆“鲆优2号”验证2个“鲆优2号”鱼苗的平均成活率为75.52%，而4个对照组鱼苗的平均存活率为35.23%（图4-1）。因此，“鲆优2号”牙鲆鱼苗比对照牙鲆的感染后存活率高40.29%。证明牙鲆“鲆优2号”的抗迟缓爱德华氏菌病能力较普通牙鲆强，适合在迟缓爱德华氏菌病引起的腹水病高发区进行推广养殖。27 上海海洋大学硕士学位论文表4-1“鲆优2号”牙鲆新品种鱼苗对比抗感染性状统计表Tab.4-1ComparisonofinfectioustraitsofJapaneseflounder死亡数量总数量死亡率存活率鲆优2号-1114226.19%73.81%鲆优2号-22310122.78%77.23%对照-17710275.49%24.51%对照-28210181.19%18.81%对照-35610056.00%44.00%对照-4459746.39%53.61%图4-1牙鲆“鲆优2号”对比感染性状统计图Fig.4-1ComparisonofinfectioustraitsofJapaneseflounder2.2牙鲆F4代家系抗病速生家系系谱图2016年共建立了28个牙鲆家系，包括F3代家系4个、F4代家系23个和对照家系1个。根据F4代家系的人工注射感染实验与生长性状测定实验，成功筛选出F1639为F4代中抗病力高、生长快速家系。F1639家系系谱图如图4-2所示。28 上海海洋大学硕士学位论文图4-2抗病家系系谱Fig.4-2Thefamilytreesofdiseaseresistancefamily虚线外框家系为抗病家系,箭头上端为亲本,←为杂交,KS为韩国群体,RS为抗病群体,JS为日本群体,LS为鲈鱼精子Thefamiliesinframewithadottedlinearetheresistantfamilies,theupperendsofthearrowsaretheparentsoffamiliesarrowed,←representhybridization,KS:Koreanstocks,RS:Disease-resistantstocks,JS:Japanesestocks,LS:Lateolabraxjaponicussperm2.3牙鲆世代抗病力分析F1639家系早期生长最快，抗病力也最强，为F4代中的速生高抗病力家系。F1639的母本来自F1421家系，父本来自F1430家系。F1430家系为F3代中筛选出的生长快速家系，其母本来自F0917家系，父本来自F0915家系，均为抗病速生家系；F1421家系为F3代选育出的抗病速生家系，其母本来自F0927家系，父本来自F0915家系。F0927家系为F2代筛选出的抗病力高家系，是F0750家系个体雌核发育后代。F0750为F1代选育出的抗病力高家系，亲本为选育出的中国牙鲆抗病选育群体(RS)与日本引进后选育的牙鲆群体(JS)。表4-2、表4-3为牙鲆世代家系部分亲本信息及感染存活率。其中F1代为2007年徐田军等[78]所建立，F2代家系为2009年王磊等[79]所建立，F3代家系为2014年孙何军等[81]所建立。29 上海海洋大学硕士学位论文表4-2牙鲆世代家系亲本信息及感染存活率Tab.4-2Parentalinformationandsurvivalrateofgenerationflounderfamilies家系号Family母本Female父本Male存活率SurvivalrateF4代F1639F1430F142177.23%F1601日本F140674.23%F1633F1263F142173.81%F1635F1432F142170.71%F1657F1432F142169.39%F1606F1342F142267.47%F3代F1406F1005F100551.19%F1421F0927F091547.06%F1401F09104F091544.44%F1422F0915F091543.68%F1411F0719F100540.79%F1446F09104F0911936.25%F1417F1005F0910432.00%F1424F0917F091729.33%F2代F0905F0750F075078.27%F0915KS-79JS-1272.82%F0927F0750雌核发育64.97%F0917KS-50RS-3661.83%F09104F0719F076855.57%F0990F0750F075052.69%F0999F0719F076838.63%F1代F0761JS-21RS-1265.76%F0750JS-15RS-4664.05%F0768RS-7JS-2862.08%F0751RS-31JS-2954.13%F0770RS-65JS-1849.90%F0766RS-82JS-2949.39%F0749JS-4RS-4648.46%F0752YS-1RS-3247.23%F0757JS-11RS-5246.26%F0764JS-21RS-1345.80%F0753YS-2RS-3244.78%F0779JS-21JS-744.50%30 上海海洋大学硕士学位论文KS为韩国群体,RS为抗病群体,JS为日本群体,雌核发育KS:Koreanstocks,RS:Disease-resistantstocks,JS:Japanesestocks,Gynogenesis表4-3牙鲆F4代家系亲本信息及感染存活率Tab.4-3ParentalinformationandsurvivalrateofF4generationflounderfamilies家系号母本父本存活率家系号母本父本存活率FamilyFemaleMaleSurvivalrateFamilyFemaleMaleSurvivalrateF1601JSF140674.23%F1636F1432F142121.95%F1603F1325F141118.81%F1638F1413F144652.22%F1606F1342F142267.47%F1639F1430F142177.23%F1614F1444F141151.09%F1640F1423F140144.00%F1615F1419F142139.22%F1645F1002F144615.24%F1616F1446F144625.51%F1646F1002F144641.89%F1621JSF131752.08%F1647F1260F141727.62%F1625F0927F131726.80%F1648F1260F144636.17%F1627F1013F131723.96%F1650F1260F144626.00%F1629F1432F143718.63%F1652F1421F144653.33%F1631F1263F142166.67%F1655F1432F142139.18%F1633F1263F142173.81%F1657F1432F142169.39%F1634F1413F142154.00%F1661F1430F141324.51%F1635F1432F142170.71%F166753.61%JS为日本群体，F1667为对照组JS:Japanesestocks,F1667iscontrolgroupF1639家系的感染存活率为77.23%，比2016年构建的28个家系的平均存活率44.48%高32.75%。F1421家系为F3代选育出的抗病力高家系，存活率为47.06%，比F3代平均存活率20.29%高26.77%。F0927家系为F2代筛选出的抗病力高家系，感染存活率为64.97%，比F2代平均存活率28.24%高36.73%。F0750为F1代选育出的抗病力高家系，感染存活率为64.05%，比F1代平均存活率32.60%高31.45%。31 上海海洋大学硕士学位论文图4-3牙鲆F1-F4家系存活率分布图Fig.4-3DistributionofsurvivalrateofF1-F4flounderfamilies图4-3为牙鲆F1至F4代家系中不同存活率家系的比例分布图，表4-4为各世代中不同抗病力家系的数量。表4-4牙鲆各世代不同抗病力家系数量分布Tab.4-4ThequantitativedistributionofdifferentresistancetodiseaseinJapaneseflounder数量世代GenerationQuantityF1F2F3F4高抗病力家系Diseaseresistancehighfamily4677抗病力一般家系Diseaseresistancegeneralfamily28192211低抗病力家系Diseaseresistancelowfamily2781010合计Total59333928根据人工感染实验后各家系的存活率情况可分为高抗病力、抗病力一般、低抗病力家系。F1代与F2代进行的是抗鳗弧菌选育，F2代家系对鳗弧菌攻击的抗病力显著增强，高抗病力家系的攻毒感染存活率由F1代的61.51%提高至F2代的64.36%。F3代与F4代进行的是抗迟缓爱德华氏菌选育，高抗病力家系的攻毒感染存活率由F3代的42.20%提高至F4代的71.36%。（图4-4）32 上海海洋大学硕士学位论文图4-4F1至F4代不同抗病力家系感染存活率Fig.4-4SurvivalrateofdifferentdiseaseresistancefamiliesfromF1toF43讨论本实验室于2007年建立F1代家系，2009年建立F2代家系，2014年建立F3代家系，2016年建立F4代家系。其中，F1代、F2代为抗鳗弧菌病家系，F3、F4代为抗迟缓爱德华氏菌病家系。经过4代的家系选育，牙鲆世代家系抗病性能逐代提高，F1至F4代中抗病力高家系的存活率为61.51%、64.36%、42.20%、71.36%，存活率逐年提升。由于其中F3代由于气温骤变，预实验与正式感染实验温度相差较大，导致鱼体免疫能力减弱，整体存活率下降。经过F1代、F2代选育出的牙鲆家系具有生长迅速、养殖成活率较高、抗鳗弧菌感染的优点。本研究通过家系选育，建立了牙鲆抗迟缓爱德华氏菌病家系，成功筛选到抗病力强、生长快速的F4代家系(F1639)，为进一步培育抗病高产优质的牙鲆优良品种奠定了重要基础。本研究表明，经过多代的家系选育和攻毒感染实33 上海海洋大学硕士学位论文验，牙鲆的抗病力得到逐代提升，实现了抗病力性状向后代的稳定遗传。本研究结果对于其它鱼类抗病良种培育，具有重大的应用价值和广阔的推广前景。34 上海海洋大学硕士学位论文参考文献[1]杨大川,高峰.浅谈鱼类选择育种的基本原理[J].黑龙江水产,2000,(02):33.[2]张岩.海产动物选择育种的研究进展[J].黄渤海海洋,1992,(02):65-72.[3]程汉良,潘黔生,马国文,等.鲤鱼育种研究[J].内蒙古民族大学学报(自然科学版),2001,(01):46-50.[4]吴清江,柯鸿文,陈荣德.鲤鱼的遗传分离规律及选种分析[J].遗传,1980,(02):15-16.[5]方宗熙,欧毓麟,崔竞进.海带杂种优势的研究和利用—“单杂10号”的培育[J].山东海洋学院学报,1985,(01):64-72.[6]李梦军,杨品红.三角帆蚌选择育种技术研究[J].内陆水产,2006,(03):38-40.[7]DonaldsonLR.SelectiveBreedingofSalmonidFishes[J].JournaloftheWorldAquacultureSociety,1971,2(1‐4):75-83.[8]BrzeskiVJ,DoyleRW.Atestofanon-farmselectionprocedurefortilapiagrowthinIndonesia[J].Aquaculture,1995,137(1–4):219-230.[9]BolivarRB,NewkirkGF.ResponsetowithinfamilyselectionforbodyweightinNiletilapia(Oreochromisniloticus)usingasingle-traitanimalmodel[J].Aquaculture,2002,204(3–4):371-381.[10]ScottAG,PenmanDJ,BeardmoreJA,etal.The‘YY’supermaleinOreochromisniloticus,(L.)anditspotentialinaquaculture[J].Aquaculture,1989,78(3–4):237-251.[11]MairGC,AbucayJS,BeardmoreJA,etal.Growthperformancetrialsofgeneticallymaletilapia(GMT)derivedfromYY-malesinOreochromisniloticus,L.:Onstationcomparisonswithmixedsexandsexreversedmalepopulations[J].Aquaculture,1995,137(1–4):313-323.[12]吴仲贤.猪的杂交育种理论[J].畜牧兽医简讯,1979,(Z1):26-32.[13]李健,刘萍,何玉英,等.中国对虾快速生长新品种“黄海1号”的人工选育[J].水产学报,2005,(01):1-5.[14]李太光,李瑞伟.罗非鱼群体选育及奥尼杂交种生产技术[J].湛江海洋大学学报,2004,(03):8-13.35 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上海海洋大学硕士学位论文致谢时光荏苒，岁月如梭，三年的研究生生活转瞬即逝。回首望去，有付出，有回报，有困惑，也有执着，生活与学习中的点点滴滴，见证了我的成长，也为我将来的生活和工作打下了坚实的基础。三年的学习和生活中，家人、老师、同学给与了我无私的帮助的鼓励，在此，我要向他们表达我最诚挚的谢意。首先感谢我的导师陈松林研究员。本研究是在陈老师的悉心指导下完成的，论文的选题、设计和撰写无不倾注了老师的心血，感谢老师对我的信任和支持。陈老师渊博的学识，执着忘我的工作精神，深邃的洞察力和敏锐的创新意识使我受益匪浅。感谢陈老师引导并营造的积极向上、奋勇拼搏的良好的科研氛围，在这个集体中成长经历，是值得我永远珍惜的财富。感谢黄海水产研究所基因组于细胞工程实验室的田永胜老师、王娜老师、邵长伟老师、徐文腾老师、李希红老师、李仰真老师对我工作学习及实验等方面给予的关心和帮助。特别感谢在实验基地与我同甘共苦的邓寒老师、李仰真老师、杨英明老师、同门郭华、张念伟、马慧鑫。特别感谢王磊师姐、王倩师姐在实验过程中给予的帮助。感谢上海海洋大学水产与生命学院的老师们在这三年中给予的指导和帮助。特别感谢我的父亲母亲，二十多年来，呕心沥血，不求回报，感谢你们在我多年求学路上的支持和鼓励，你们的付出是我前进的动力。养育之恩，无以为报，你们永远健康平安是我最大的心愿。感谢我的女朋友谭青在学业、科研、生活和感情上无微不至的关心和照顾，感谢她在我实验过程中的支持与帮助。受恩于大家，我得以完成这篇论文，再次感谢各位师长、同学、朋友和家人！李泽宇2017年5月于青岛43
