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灵芝三萜类化合物对AD模型大鼠脑组织中CAT,ACHE,SOD,MDA的影响【摘要】 目的：探讨灵芝三萜类化合物（GLT）对阿尔茨海默病(AD)的防治作用，为临床新药的开发和应用提供理论依据。方法:将经Morris水迷宫筛选合格的SD大鼠80只分为8组，正常对照组、假手术组,模型组、GLT低、中、高（GLT0.25、0.5、1.0g/kg)剂量组、阳性药组（健脑胶囊组0.54g/kg）和溶媒组（食用油10ml/kg）,除正常对照组和假手术组外，其余各组大鼠经侧脑室注射Aβ25-352μl制备AD大鼠模型，正常对照组侧脑室注射等量生理盐水，术后次日开始灌胃给药。每天1次，连续给药20d后，处死动物取脑组织制备匀浆。采用光化学法检测脑匀浆中过氧化氢酶（CAT）、乙酰胆碱酯酶（ACHE）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量。结果:与正常对照组比较，模型组脑组织中CAT活性降低，ACHE活性升高，SOD活性降低，MDA含量升高。与模型组比较，三个GLT给药组脑组织中，CAT活力均升高，ACHE活力均下降，SOD活性均升高，MDA含量均降低。结论:灵芝三萜类化合物对AD模型大鼠具有增强清除自由基的能力，抗脂质过氧化及促进胆碱能神经系统功能的恢复。【关键词】阿尔茨海默病；灵芝属；脑； 过氧化氢酶；乙酰胆碱脂酶； ［Abstract］Objective:Toinvestigatethepreventiveeffectsofganodermolucidumtriterpenoids(GLT)toAlzheimerdisease（AD）inmodelrats.soastoprovidetheorybasisforneazetestlydividedinto8groups:normalcontrolgroup(groupNC,received10ml/kgofdistilledoperationgroup(groupSO,received10ml/kgofdistilledodelgroup(groupM,received10ml/kgofdistilledasculinedruggroup(groupMD,received0.54g/kgofJiannaocapsules)，andsolutemediatedgroup(groupSM,received10ml/kgofedibleoil).AlloftheSDratsexceptthoseingroupNCandgroupSOicroinjectedyloidpeptidesegment25-35(Aβ25-35)intolateralventricletoproduceADmodel,andinstead,ratsingroupNCentbeganonthenextday,onceadayintragastricallyfor20days.Then,theanimalsutase(SOD),andthecontentofmalondialdehyde(MDA)istrydetectingkits.Results:TheactivitiesofCAT,SODotetherestoreofcholinenervoussystemfunction. ［Keyerdisease；Ganoderma;brain;catalase; acetylcholinesterase;superoxidedismutase;malondialdehyde;rat,sprague-daer’sdisease，AD)是以进行性痴呆为主要症状，以认知能力迅速减退和记忆功能丧失为特征的大脑变性疾病，其病理特征主要有老年斑(SP)、神经纤维缠结(NFT)和神经元丢失等病理改变[1]。随着人类平均寿命的延长,世界人口趋于老龄化，AD的发病率也逐渐提高，现已成为威胁人类健康的社会问题之一,预防和治疗AD已成为一个重要的医学课题。目前，AD的病因不明确，从根本上治愈尚缺乏理想的方法和药物。2007年10月采用大鼠侧脑室注射Aβ25-35制备AD大鼠模型，研究不同剂量灵芝三萜类化合物[2]对AD大鼠脑组织CAT、ACHE、SOD、MDA的影响，以探讨药物对AD模型鼠的作用机制。 1材料及方法 1.1材料 1.1.1动物 雄性健康成年SD大鼠（280±20）g，由贵阳医学院实验动物中心提供。动物合格证（SCXK(黔)2002-0001）。 1.1.2药品与主要试剂 GLT（中国科学院地球化学研究所超临界流体技术研究中心提供)，健脑胶囊(青岛国风药业股份有限公司)，Aβ25-35(Sigma,USALot 114k4773)，CAT、ACHE、SOD及MDA试剂（南京建成生物工程研究所）。 1.1.3主要仪器 DYT2E型脑立体定位仪(中国天津医疗器械研究所),XH-B型漩涡混匀器(江堰市康健医疗器具有限公司),80-2型离心沉淀机(上海手术器械厂),-80℃超低温冰箱(FormaScientic,Germany),721分光光度计(北京光学仪器厂),37℃及100℃水浴箱(北京长源实验设备厂),550nm紫外分光光度计(北京光学仪器厂)，5810R型台式低温离心机(eppendorfGermany)。 1.2实验方法 1.2.1分组、造模及给药 大鼠80只随机分为8组，正常对照组(NS10ml/kg)、假手术组(NS10ml/kg)、模型组(NS10ml/kg)、GLT低、中、高（GLT0.25、0.5及1.0g/kg)剂量组，阳性药组（健脑胶囊0.38g/kg）、溶媒组（食用油10ml/kg），参考Sharma等[3]的方法，所有大鼠经10％水合氯醛(0.3g/kg)腹腔注射麻醉后固定于大鼠脑立体定位仪上，常规消毒皮肤，正中矢状切口，分离骨膜，锥颅器钻开颅骨，暴露硬脑膜。侧脑室注射进针坐标为：前囟后3.5mm，中线左侧2mm，自颅骨表面向下深度3mm。除假手术组和正常对照组外，其余各组动物均微量注射器垂直进针3mm，将2μlAβ25-35缓慢注入，留针5 min，缝合伤口；正常对照组注入等体积无菌生理盐水，假手术组钻开颅骨后即缝合伤口。各组动物术后常规注射阿奇霉素50mg/d连续3d。术后次日按上述剂量灌胃给药，1次/d,连续20d。实验结束后，大鼠断头剥取脑组织并称重，按1∶9（每克脑组织加9ml冰生理盐水）的比例制成10%脑组织匀浆（匀浆过程始终处于冰水中）。将组织匀浆分成数份，置于低温离心机离心10min（4℃，3500r/min），取上清液，-80℃冰箱保存备用[4]。 1.2.2测定指标 测定脑组织中CAT、ACHE、SOD活性及MDA含量，按试剂盒说明书操作。 1.3统计学处理实验数据以（x±s）表示，采用SPSS12.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA）。 2.2SOD活力和MDA含量见表2。AD模型组大鼠脑组织中SOD活力降低，MDA含量增高，与正常对照组比较有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）；GLT低、中、高剂量组大鼠脑组织中SOD活性均升高，MDA含量均降低，与AD模型组大鼠相比有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。表2GLT对Aβ25-35模型大鼠脑组织SOD、MDA的影响（略）注：与正常对照组比较，(1)P＜0.05，(2)P ＜0.01；与模型组组比较，(3)P＜0.05，(4)P＜0.01。 3讨论 实验结果表明，GLT能明显提高AD模型大鼠SOD活性、降低MDA含量，提示GLT有提高机体清除自由基及（或）抑制自由基对脑的损害作用，这可能是该药有效防治AD的作用机理之一。同时检测结果显示，模型组大鼠脑组织CAT活性升高，ACHE活性升高；与正常对照组比较，模型组大鼠脑组织中SOD活性下降，MDA含量升高。 AD发病机制不明，目前国内外学者认为与脑内胆碱神经功能紊乱、自由基损伤、Aβ沉积、基因突变等因素有关。Ach由胆碱乙酰化酶合成，通过Ach受体发挥生物效应。ACHE是胆碱能神经系统的重要功能酶，其主要作用是将Ach水解为胆碱和乙酸，从而维持神经系统功能的稳定。ACHE是Ach的降解酶，测定脑组织中ACHE的活性，可间接判断脑内Ach含量的变化[5]，目前许多研究均以ACHE活性作为反映中枢胆碱能神经系统功能状态的重要指标[6，7]。本实验中，模型组ACHE增高，而给GLT后，ACHE活性降低。结果表明，GLT可以对抗Aβ25-35侧脑室注射所致中枢胆碱能神经系统损伤所引起的ACHE活性的升高，恢复胆碱能神经系统的功能。 脑组织是自由基连锁反应和脂质过氧化作用的靶组织，因其对氧的高度依赖性及含有丰富的不饱和脂肪酸，是最容易受氧化损伤的部位。自由基连锁反应主要攻击脑内灰质富含脂质的神经元，导致细胞膜的磷脂破坏、变性，细胞膜的通透性增加，引发神经元中毒性水肿，细胞内酶活性改变，神经递质释放，神经细胞死亡。在探讨自由基损伤实验中，最常见的检测指标为MDA含量及SOD活性。MDA是脂质过氧化物的分解产物，是一种重要的大分子交联剂，其含量在一定程度上反映组织细胞损伤的程度，它能交联大分子物质，使蛋白质变性，DNA发生突变，影响细胞的功能。SOD是自由基清除的关键酶，SOD的升高可减轻缺血缺氧引起的脑损伤。GLT低、中、高剂量连续灌胃给药20d后,脑组织损伤明显减轻，上述生化指标不同均程度改善。表明GLT连续灌胃给药对Aβ25-35侧脑室内注射所致AD模型大鼠的脑组织有保护作用，能增强大鼠脑组织SOD活性，降低脑组织内MDA含量，从而对抗侧脑室内注射Aβ25-35诱发的氧化应激损伤。【参考文献】 [1]CrispinoM,BagattiniM.Molecularepidemiologyofseq-uentialoutbreaksofaciobacterbaumanniiinanintensivecareunitshoergenceofcarbapenemresistance[J].JClinMicrobiol,2004(3):946-953. [2]曾祥丽,包海鹰.灵芝三萜类成分与药理学研究进展[J].菌物研究,2004(1):68-77. [3]SharmaM,GuptaYK.Chronictreatmentlpreventsintracerebmventricularstreptozotocininducedcognitiveimpairmentandoxidativestressinrats[J].LifeSciences,2002(71):2489-2498. [4]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2005:1464-1477. [5]徐斌,陈俊抛,周光斗,等.去松果体对大鼠学习记忆及大脑皮质胆碱能纤维的影响[J].中华神经科杂志,2000(3):153-155. [6]刘涛,卞慧敏,刘学风.改良三甲散对东莨菪碱诱导学习记忆障碍的影响[J].中国中医基础医学杂志,1999(2):18. [7]张均田,刘云,屈志炜,等.人参皂甙Rb1和Rg1对小鼠中枢神经递质受体和脑内蛋白质合成的影响[J].药学学报,1998(1):12.
