黑海参酸性粘多糖的分离纯化

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1、维普资讯http://www.cqvip.com≯5一黑海参酸性粘多糖的分离纯化7中山医科大学(510089)唐孝礼邱鹏新明涛苏兴文颜光美／五摘要采用酶法和碱法消化、醋酸钾和乙醇分级沉淀，从新鲜黑悔参体壁中分离得到酸性粘多糖．分子母为10253Da．经琼脂糖电泳证实为纯一成分，多糖组成中彝基半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻黑海参Holotho~aa[raJaeger叉名黑怪海海参去内脏、洗净、称重、剪碎，加2倍重量参、黑狗参、黑怪参，在我国南海海域的潮间的双蒸水，加0．4％海参重量的木瓜蛋白酶，带和珊瑚

2、礁的砂底常成群出现，其口中流出的60oc水解2h，加氢氧化钠溶液使NaOH终浓白色线状粘液可用于治外伤出血、止痛，去内度为0．5mol／L，4oc冰箱中过夜。用冰醋酸中脏后的全体可作滋补品用于妇女补奶⋯，但其和，加乙醇使终浓度为4o％，4℃冰箱中过体壁薄，且品质远不如刺参，是最次的食用海夜。7000rpm离心10min(所有离心均在4oc参。近年来的许多研究表明，海参酸’}生粘多糖进行，下同)，弃上清液，沉淀分别用95％乙具有抗凝血、增强免疫功能等药理作用L2']：。醇、100％乙醇、丙酮洗涤，

3、真空干燥。将干从食用价值不高而资源丰富的海参品种中提取燥粉末溶于50倍体积的双蒸水中，3600rpm酸·性粘多糖，进行药理作用及其机理研究，对离心15min去除不溶·性沉淀．上清液中加醋于充分利用丰富的生物资源，开发研制新型海酸钾(KAc)使KAc终浓度为2mol／L，4oc冰洋药物．具有重要的理论和应用价值。箱中过夜。7000rpm离心15min，弃上清液，1材料和仪器沉淀用双蒸水溶解，3600rpm离心15min，弃1．1材料海参采集于广东省惠州市大辣椒沉淀，上清液用NaOH调PH9，加02

4、使其岛水域，经中国科学院南海海洋研究所鉴定为终浓度为4．5％，60oc脱色2h，冷却后加KAc黑海参Holothuriaa[raJaeger。使其终浓度为2mol／L，7000rpm离心15min，1．2试剂葡葡糖醛酸(美国Sigma公司)；弃上清液，沉淀依次用舳％、95％、100％乙地衣酚(美国Aldrich公司)；盐酸氨基葡萄糖醇及丙酮洗涤，真空干燥，得白色无定形粉(浙江玉环红星生化制品厂)；甲苯胺蓝(上海末，此即为纯化的黑海参酸性粘多糖，提得率化学试剂站分装厂)；D一岩藻糖(瑞典Fluka

5、为0．12％。公司)；肝素(上海化学试剂公司)；对二甲氨2．2琼脂糖电泳测定纯度参照Dietrich基苯甲醛(上海试剂三厂)。法_4J，以0．8％琼脂糖溶液制成8x4em胶板，1．3仪器高速冷冻离心机(德国Heraeus公采用0．5mot／L硼砂缓冲液(pH9．0)，IO0V电司)；LKB电泳仪(Bromma公司)；5DX傅利泳20min，0．1％十六烷基三甲基溴化铵叶变换光谱仪(美国Nicolet公司)；REFLEXTM()中固定30min，胶板用预先经0．1％Ⅲ基体辅助激光懈吸飞行时间质谱仪

6、(德国CTAB湿润的Whatman滤纸覆盖，电吹风暖风Bruker公司)；7550紫外一可见光分光光度计吹干(不可用热风)，0．1％甲苯胺蓝溶液(用(惠普上海仪器有限公司)。醋酸：乙醇：水：0．1：5：5配制)染色15min，2方法和结果用脱色液(醋酸：乙醇：水：0．1：5：5，v／v)冲2．1黑海参酸性粘多糖的分离纯化新鲜黑洗3—5次脱色，拍照。从电泳图可以看出，中药材第22卷第5期1999年5月’223。维普资讯http://www.cqvip.com黑海参酸性粘多糖集中于比较狭窄的一条带，

7、表明分离得到的多糖为均一成分。2．3分子量测定采用基体辅助激光解吸飞一行时间质谱仪测定黑海参酸性粘多糖的分子量为10253Da(图2)。2．4红外光谱鉴定将黑海参酸性粘多糖与123溴化钾压片，用傅利叶变换红外光谱仪进行圄1黑海参酸性粘多糖的琼脂糖电泳图谱扫描，得红外光谱圈(图3)。该图谱表明黑海I黑海参酸性粘多糖5／Lg2．黑海参酸性粘多糖10参酸性粘多糖具有典型硫酸粘多糖红外吸收特征。3444cm～、1053era(强)，表明样品中含较多羟基；1657cm～、1567cm(强)，表示样品中含较

8、多的硫酸基或羧基，如果羧基多则表明蛋白质含量可能比较高；1650～1610cm(强)，1405era(中)，1250cm(强)，表明本品是一种粘多糖的硫酸酯。2．5蛋白质含量测定样品中蛋白质含量测参性粘；糖莩-的’定采用考马斯亮蓝法J。结果未测出蛋白质，激光飞行时同质谱圄表明样品中几乎不含蛋白质。2．6硫酸基含量测定将黑海参酸性粘多糖用浓盐酸在100℃水解I4h，取多糖水解液，厂一、I滴加5％眈c12溶液，产生白色沉淀，表明有SO42一存在。SO4一含量测定采用重量法【。测l．；lJl定结果表明