骨髓间充质干细胞体外向胰岛样细胞诱导分化的实验研究

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1、四川大学临床医学博士学位论文中英文缩略词英文缩写英文全称中文全称BMSCsboneHIalTOWmesenchymalsterncells骨髓间充质干细胞bpbasepair碱基对BSAbovinese九IInalbumin牛血清白蛋白BTCbetacellulin口细胞调节素DABdiaminobenzidine二氨基联苯胺DEPCdiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯DMSOdimethylsulfoxidc二甲亚砜EPeppendoff微量离心管FBSfetalbovinesertlln胎牛血清FIT

2、Cfluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素GLP-1glucagon-likepeptide-1胰高血糖素样肽一lHEPES4-(2一Hydroxyethyl)-I·piperazincethancsulfonicacid羟乙基哌唪乙磺酸WCsinsulin-producingcells胰岛素分泌细胞mRNAmessengerribonucleicacid信使核糖核酸PBSphosphatebuffcredsolution磷酸盐缓冲溶液PCRpolymcrascchainreaction聚合酶联反

3、应PDX一1pancreaticduodenalhome．box—l胰岛／十二指肠同源框一1PEphycoerythrin藻红蛋白RNAribonucleicacid核糖核酸rpmrevolutionperminute每分钟转速RT-PCRl∞vcTsetranacription-polymerasechainreaction逆转录聚合酶联反应ThEIris-aceticacideleOrophoresisbufferTris一乙酸电泳缓冲液声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据

4、我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四JII；t：学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。申请人：爱海点指导教师：圆敞四川大学临床医学博士学位论文论文摘要第一部分大鼠骨髓间充质千细胞的体外分离、培养及鉴定摘要背景与目的骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓中的一种具有自我更新和多

5、向分化潜能的细胞。研究表明骨髓间充质干细胞可以向内胚层、中胚层和外胚层组织细胞分化，如肝细胞、心肌细胞、肌细胞、神经细胞、脂肪细胞和胰岛素分泌细胞等。本研究旨在体外分离培养大鼠BMSCs，观察BMSCs的生物学特性，并采用流式细胞检测技术鉴定BMSCs。为进一步观察体外BMSCs向胰岛素分泌细胞分化奠定基础。材料与方法Wister大鼠麻醉致死后，无菌条件下取出胫骨和股骨用L-DMEM培养基从骨腔一端冲洗骨髓腔，冲出骨髓，轻柔充分吹打成单细胞悬液，离心洗涤后，所得细胞按lXi08／mE密度接种于25cm2塑料培养瓶中，37

6、℃，5％CO。，饱和湿度下培养48小时，首次更换培养液，弃去未贴壁细胞，此后每2-3天换液1次，观察细胞形态变化。待细胞生长良好，80％融合后，传代培养。取第3或4代细胞做流式细胞检测，检测获得的贴壁细胞表面标记抗原CD29、CD90和CD45表达情况。结果在最初培养的48h内，可见大量圆形细胞，悬浮生长。48h后可见部分细胞呈贴壁生长。至第5天时，随着换液次数的增加，圆形悬浮细胞逐渐减少，贴壁细胞明显增多，呈聚集样生长，细胞形态呈梭形和多角形。约10-14天后细胞铺满瓶底，呈鱼丛状或漩涡状聚集，细胞形态呈梭形。流式细胞

7、方法检测大鼠BMSCs的表面标记抗原。结果显示：2四川大学临床医学博士学位论文第三代大鼠BMSCs的特异性表面标志物：CD29阳性，阳性率为91．9％；CD45阴性，阳性率为6．996；CD29／CD45阳性率为7．4％；CD90阳性，阳性率为51．3％；CD90／CD45阳性率为3．6％。结论本实验通过贴壁筛选法和全骨髓培养法成功分离培养了大鼠骨髓间充质干细胞。关键词骨髓，间充质干细胞，大鼠四川大学临床医学博士学位论文第二部分人骨髓间充质干细胞体外向胰岛样细胞诱导分化实验研究摘要目的探讨联合应用高糖和GLP．1、活化素

8、A、尼克酰胺和B细胞调节素刺激体外能否诱导人骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化。材料与方法体外培养人骨髓问充质干细胞，待细胞80％融合时，用0．1％胰蛋白酶消化传代，按2×105／ml接种于96孔板。观察细胞生长情况。采用以下诱导刺激方案：先给予23n肋ol／L高葡萄糖刺激约20天，接着再将刺激后细胞分为7组，分别给予