人骨髓间充质干细胞体外向肝样细胞的诱导分化论文

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　　人骨髓间充质干细胞体外向肝样细胞的诱导分化论文【摘要】目的：研究人骨髓来源的间充质干细胞(humanbonemarroesenchymalstemcells，hBM-MSCs)在肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)、抑瘤素M(OSM)诱导下，体外向肝样细胞的诱导分化。方法：通过密度梯度离心和贴壁培养法获得hBM-MSCs，分离的hBM-MSCs扩增传至第6代，流式细胞仪检测hBM-MSCs表面CD34、CD45、CD105、CD166表达。第6代hBM-MSCs生长达100%融合时采用两步法对hBM-MSCs进行诱导分化。第1～第14天采用IMDM诱导培养基(含2%FCS、20ng/mLHGF、20ng/mLFGF-4)，第15～第21天在上述培养基中加OSM(10ng/mL)，促进诱导细胞的成熟，同时收集第0、第7、第14、第21天培养上清液标本.freelanbonemarroesenchymalstemcellsintohepatocyte-likecellsinducedbyhepatocytegroalstemcells(MSCs)fromhumanbonemarroetryedusingthefolloouseanti-humanantibodies:anti-CD34FITC，anti-CD45FITC，anti-CD105PE，anti-CD166APC.ThesixthgenerationMSCsethed.Differentiationedium，consistingofIMDMsupplementedLHGFand20ng/mLFGF-4for14days，folloentaturationmedium，consistingofIMDMsupplementedLHGF，20ng/mLFGF-4，10ng/mLoncostatinM.MediumchangesedtRNAofALBandCK18erasechainreaction.ProductionofALBandCK18munofluorescenceanalysisandElisa.GlycogendepositshumanboneexpressedCD105andcd166，andorphologyandfunctionofhepatocytes.Cellolarmorphologychangedfromaspindletoaratherpolygonalshapetypically.DifferentiatedhBM-MSCsarkers，suchasCK-18(cytokeratin18)andALB(albumin).Moreover，secretionofALBbydifferentiatedhBM-MSCsincreasedasculturetimeanbonemarroesenchymalstemcellscandifferentiateintohepatocyte-likecellsinresponsetoHGF，FGF-4andOSM，aybeusedasakindofcellresourcestotreatseverehepaticdisease.Keyesenchymalstemcells;humanbonemarroesenchymalstemcells;hepatocyte-like;cytokine肝细胞移植、生物型人工肝是治疗肝衰竭的有效手段，却面临肝细胞来源缺乏的困境，因此寻找新的肝细胞源代替成体肝细胞尤为迫切1-2。骨髓间充质干细胞(humanbonemarroesenchymalstem cells，hBM-MSCs)体外容易分离，免疫原性弱，可大量扩增3，把hBM-MSCs定向分化为肝细胞，将对肝病的治疗带来新的思路和新的前景。当前对骨髓体外向肝样细胞诱导分化没有统一的标准，细胞因子之间组合、诱导分化时细胞生长融合状态也有争议。本实验探讨了生长100%融合时的hBM-MSCs，在肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)、抑瘤素M(OSM)诱导培养下，向肝样细胞的转化，从而为骨髓间充质干细胞对肝衰竭的治疗提供理论依据。1材料和方法1.1实验材料骨髓由浙江大学医学院附属第一医院骨髓室提供。L-DMEM培养基、胎牛血清(FCS)、PAS染色液、0.25%胰蛋白酶购于GIBCO公司，Ficoll分离液购于StemCell公司，鼠抗人FITC-CD34，FITC-CD45，PE-CD105，APC-CD166抗体购于美国BD公司，HGF，FGF-4，OSM购于Peprotec公司，RNA提取试剂盒购于Invitrogen公司，逆转录试剂盒购于Promega公司，PCR试剂盒购于大连宝诚公司，ALB测定试剂盒购于Bethyl公司。鼠抗人ALB，CK18抗体、兔抗鼠IgG-FITC购于美国BD公司。1.2方法1.2.1骨髓间充质干细胞的分离培养：抽取肝素抗凝的健康成人骨髓5mL，加等量体积的PBS稀释，加于5mLFicoll分离液中，1500r/min离心30min。提取单个核细胞，PBS洗两遍，用L-DMEM培养基(含10%胎牛血清)配成浓度为2×109/L细胞悬液接种于六孔培养板中，每3天换液1次。当细胞生长至80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。1.2.2第6代hBM-MSCs的鉴定：消化第6代hBM-MSCs，配成细胞浓度为1×106/mL的细胞悬液。取100μL细胞悬液，加鼠抗人FITC-CD34，FITC-CD45，PE-CD105，APC-CD166荧光抗体，同时加各荧光抗体的同型对照抗体，4℃避光孵育30min，流式细胞仪检测hBM-MSCs的纯度。1.2.3MSCs诱导分化：当第6代MSCs生长100%融合时，按下述培养基诱导分化。第1～第14天IMDM诱导培养基(含20ng/mLHGF，20ng/mLFGF-4，2%FCS)，第15～第21天IMDM成熟培养基(含20ng/mLHGF，20ng/mLFGF-4，2%FCS，10ng/mLOSM)。1.2.4RT-PCR检测诱导后ALB、CK-18的表达：诱导后的细胞提取RNA，采用RT-PCR检测ALB、CK18表达。ALB上游引物：5’-GATGTCTTCCTGGGCA-3’，ALB下游引物：5’-CTTGGGCTTGTGTTTCAC-3’，PCR产物长度645bp，退火温度52℃;CK18上游引物：5’-GAAGGAGACCATGCAAAGCCTG-3’，下游引物：5’-CATGAAGAGCAGCTCCTCCTTG-3’，PCR产物长度400bp，退火温度62℃ 。内参采用GAPDH，GAPDH上游引物：5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3，下游引物：5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’，PCR产物长度195bp4。1.2.5PAS染色测定诱导后的糖原表达：细胞爬片后，诱导培养21d取玻片，4%的多聚甲醛固定后按说明书PAS染色。出现红色、紫红色颗粒说明糖原存在。1.2.6免疫荧光测定诱导后MSCs细胞内ALB，CK18表达：第6代hBM-MSCs做细胞爬片，诱导培养21d后，用PBS缓冲液洗细胞两遍，4%的多聚甲醛固定15min，3%的甲醛H2O2液浸泡5min，PBS缓冲液冲洗两遍，TritonX-100打孔，PBS洗两遍，加封闭血清20min，滴加一抗(鼠抗人ALB、CK18抗体)，4℃过夜，滴加二抗(兔抗鼠IgG-FITC)，37℃孵育90min，PBS洗两遍，荧光显微镜观察。暗视野下绿色荧光为阳性。1.2.7诱导培养上清液ALB测定：收集培养第0、第7、第14、第21天上清培养液，ELISA法测定上清中的ALB。2结果2.1hBM-MSCs体外培养骨髓分离的PBMC细胞接种于六孔板中，3d后可见到梭形、纺锤形、多角形细胞克隆生长，起初生长较慢，20d左右可生长到80%～90%融合，胰酶消化传代，传代后的细胞两个小时大部分贴壁，生长较快，一般来说3～5d可增殖一倍，细胞形态变大，长梭形变成短梭形。图1和图2分别是原代和第6代细胞形态。2.2第6代hBM-MSCs的鉴定流式细胞仪测定显示第6代hBM-MSCsCD105，CD166阳性，CD34，CD45阴性，MSCs纯度较高。结果见图3、图4。2.3刺激21d后hBM-MSCs形态变化诱导组hBM-MSCs出现明显的细胞形态、体积变化，可见细胞由梭形变为三角形、多角形或类圆形。见图5、图6。2.4RT-PCR检测ALB，CK-18表达RT-PCR可以检测到明显的ALB，CK18条带，ALB的PCR产物为645bp，CK18的PCR产物为400bp，与目的条带相符。见图7、图8。2.5PAS染色结果21d诱导后的MSCs细胞内可见红色、紫红色颗粒，说明糖原有表达。见图9、图10。2.6免疫荧光测定细胞内ALB，CK18MSCs诱导培养21d可以检测到细胞内ALB，CK18表达。显微镜下呈绿色荧光，图11、图12是诱导后MSCs细胞内ALB，CK18测定结果。2.7上清液ALB测定分别取诱导培养液第0、第7、第14、第21天上清培养液测定ALB的浓度。依据标准曲线和样品浓度计算公式，得出上清中ALB的浓度，结果如表1。 3讨论肝细胞的来源是肝细胞移植、生物型人工肝首先要解决的问题。hBM-MSCs作为组织工程和基因工程的种子细胞有比较明显的优势——它贴壁生长，容易获得，体外增殖能力强;通过反复换液，可以除去悬浮生长的造血干细胞，因此容易纯化;更重要的是在体外不同环境中，它能够分化为不同的细胞系，包括软骨细胞、神经细胞、肝细胞等5。本研究采用密度梯度离心法分离单个核细胞，利用hBM-MSCs贴壁生长的特性，使hBM-MSCs传代后纯化，传至第6代的hBM-MSCs采用MSC常用的鉴定标准进行表型鉴定(MSC细胞不表达CD34、CD45，CD166、CD105表达阳性)6。表型鉴定表明，本研究分离的间充质干细胞符合MSC鉴定标准，而且纯度较高，没有受到造血系细胞的污染(造血系干细胞表达CD34、CD45，不表达CD166、CD1057)。细胞因子在个体发育、细胞分化过程中具有重要作用。HGF是一种多效应细胞因子，80年代从肝细胞中识别、提纯和克隆，HGF基因的异常可以导致胚肝的异常和胚胎的死亡，而通过宫内注射HGF可以纠正胚肝异常和挽救胚胎8，这表明HGF在肝细胞再生中起着重要作用。FGF是MSCs向肝样细胞转化的始动细胞因子，目前采用的细胞因子有FGF-1、FGF-2、FGF-4，FGFR-1和FGFR-4抗体能强烈抑制白蛋白mRNA表达9，这间接说明了FGF分子在MSCs向肝细胞转化中的作用。OSM最初是1986年Zarling等从U937组织型淋巴瘤细胞(histiocyticlymphomacells)培养上清液中分离的一种对A375黑色素瘤细胞有生长抑制作用的因子10。OSM可以诱导胎肝的分化，使胎肝逐渐失去造血功能，开始具备成人肝脏的代谢功能11，因此OSM在肝脏的成熟过程中发挥重要作用。依据上面细胞因子的相互作用，本研究采用两步法对hBM-MSCs进行进行诱导。第1～第14天，采用2%FCS、20ng/mLHGF、20ng/mLFGF-4IMDM诱导培养基对hBM-MSCs诱导和分化，第15～第21天在上述培养基中加OSM(10ng/mL)，促进类肝细胞的成熟。由于CK18是肝细胞最重要的表面标志，分泌ALB是肝细胞最重要和最基本的功能，因此本研究采用CK18、ALB来评价MSCs向肝样细胞转化的能力。经过21d培养后的肝样细胞，RT-PCR检测到肝细胞特异的表面标志CK-18、ALB表达。诱导后的类肝细胞具有肝细胞一些最重要而且最基本的功能，如合成糖原、分泌蛋白。本研究发现，在21d培养时间内，ALB随培养时间逐渐增加，这表明本研究采用的两步培养法是可行的。 在MSCs体外分化过程中的影响因素很多，除了细胞因子以外，细胞接种密度、细胞生长融合状态也起着很大的作用。Aubin12在把MSCs向成骨细胞转化中发现，骨节结的形成有赖于细胞接种密度，只有达到一定的密度，细胞才能融合，才能向成骨细胞分化。本研究也发现，细胞密度最大的地方糖原染色最强，这表明hB-MSC细胞之间的相互作用也影响着向类肝细胞的转化，hBM-MSC之间可能通过相应的受体或配体相互作用，传递生物信息，或者只有较高的接种密度，细胞分泌的细胞因子才能达到有效浓度，发挥特定的生物学特性13。因此我们认为MSCs向类肝细胞转化时应选择一定的时机，当细胞生长刚完全融合时应马上诱导，时间过早，MSCs向类肝细胞的转化过低，时间过晚MSCs会因为没有生存空间而死亡。总之，人骨髓来源的间充质干细胞具有向肝细胞分化的潜能，在特定细胞因子作用下，可以分化为具有肝功能的类肝细胞，尽管分化后的类肝细胞功能还需要检测。本研究为解决肝细胞移植、人工肝支持系统细胞源缺乏问题提供了可能【