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《cd38缺失对lps诱导巨噬细胞炎性因子表达和分泌的影响及其分子机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
ADissertationPresentedMaior"PharmacolmPvtic●■■■■■■■■■■■■■●■■■■■■■■■■■■■■■●●■■■■●一Sul：DoctorHong-BoXinSupervisor：Doctor______SubmittedtotheGraduateSchoolofNanchangUniversityfortheDegreeof№～STEROFMEDICINEJune，2013SchoolofMedicine，NanchangUniversity,Nanchang，330088，丛：China 学位论文独创性声明lIflJlIFIlIJllllmllJllllJIJlllflIrlllrlllljiY2427519本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名(手写)：幸尊杪签字日期：Ⅺ，，年，月’日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所和中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名(手写)：褥釉导臌c矧：手燃签字日期：yI≥年6月q日签字日期：M年／月 摘要背景与目的：动脉粥样硬化是许多心血管疾病的重要成因。大量的实验证据和临床资料表明，炎症反应在动脉粥样硬化的发生发展过程中起重要作用，其机制与巨噬细胞等炎性细胞浸润并分泌大量炎性因子，促使泡沫细胞生成等密切相关。CD38是具有ADPR(ADP．ribosyl)环化酶和水解酶活性的双功能酶，它可分别催化NAD+生成cADPR和催化cADPR降解成ADPR，其酶活性位点均定位于胞外结构域。我们的前期实验显示，CD38基因缺失可使高脂饮食诱导的ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化损伤明显加重。本文旨在探讨CD38对巨噬细胞活化的影响及其可能的分子机制，从而为进一步阐明CD38在动脉粥样硬化形成中的作用及其机制提供线索和实验依据。方法：1．巨噬细胞的诱导和培养：给野生型和CD38基因敲除小鼠腹腔注射O．5ml3％巯基乙醇酸钠诱导其巨噬细胞分泌，三天后收集小鼠腹腔的巨噬细胞并进行体外培养，经鉴定后用于后续实验。2．巨噬细胞基因表达及炎性因子分泌：取原代培养的腹腔巨噬细胞并用LPS(199／m1)对其进行刺激，实验分为4组每组3个样本：①野生型(W．T．)未刺激组；②野生型(w．T．)LPS刺激组；③CD38士未刺激组；@CD38士LPS刺激组。利用RT．PCR或实时荧光定量PCR技术对TLR4和相关炎性因子如TNF．0【，IL．1p及巨噬细胞炎症趋化因子MCP．1的mRNA表达量进行检测，同时用WesternBlot技术对NF．r,B蛋白表达量进行分析。结果：1．镜下观察细胞形态，与文献描述相符，确认为巨噬细胞。2．CD38缺失使LPS诱导巨噬细胞炎性因子分泌及相关蛋白表达升高@LPS刺激后W．T．组与CD38小组均出现TLR4表达量升高，炎性因子TNF．0t，IL．1D及炎症趋化因子MCP．1分泌增加；②与LPS刺激W．T．组比较，CD38斗组中TLR4及NF．1cB表达量显著升高；③LPS刺激后CD384组炎性因子TNF．0【，IL．113及炎症趋化因子MCP．1分泌量较W．T．组增加。结论：LPS可明显诱导CD38斗小鼠原代培养巨噬细胞的M1型炎性因子分泌，提示CD38基因缺失可显著促进巨噬细胞介导的炎性反应，其机制可能与 摘要CD38缺失诱导巨噬细胞TLR4-NF．r,B通路活化，进而促进炎性因子的合成与分泌有关。关键词：CD38；动脉粥样硬化；巨噬细胞；炎性反应：TLR4；NF一1cB AbstractABSTRACTBackgroundandObjective：Atherosclerosisisallimportantcauseofmanycardiovasculardiseases．Numerousexperimentalevidenceandclinicalresourcesindicatedthatinflammationreactionplayedanimportantroleinthedevelopmentofatherosclerosis．Themechanismsarecloselyrelatedwiththeinflammatorycellinfiltration，cytokinesecretion，smoothmusclecellmigrationandfoamcellformation．CD38isamultifunctionalectoenzymethatcatalyzesthesynthesisandhydrolysisofcyclicADP-ribose(cADPR)fromNAD+toADP-ribose．OurpreviousstudyshowedthatthedisruptionofCD38inApoEl|‘micecouldresultinmoresevereatheroscleroticlesions．TheaimofthisthesisistoinvestigatetheroleandmolecularmechanismsofCD38inmacrophageactivation．Thefindingswouldhelptodevelopneweffectivestrategiesforpreventionandtreatmentofatherosclerosis．Methods：1．Primarycultureofmacrophages．Thewild—typeandCD38knockoutmicewereintraperitoneailyinjectedwith0．5mlof3％sodiummercaptoe’thanoltoinducethemacrophages．Afterthreedaystheperitonealmacrophageswerecollectedandcultured，andthenidentifiedforfollow．upexperiments．2．Geneexpressionandinflammatorycytokinesecretionofmacrophages：Theprimaryperitonealmacrophagesfrombothwild-typeandCD38一|-micewerestimulatedwithorwithout1“g／rraofLPS．ThemRNAlevelsofTLR4andrelatedinflammatorycytokinessuchasTNF．Q，IL．BandMCP．1wereevaluatedbyreal-timePCR．AtthesametimetheexpressionofNF-r,BwasanalyzedbyWestemBlotting．Results：1．TheidentityofmacrophagesWasconfirmedbythecellmorphologyexaminationunderthemicroscope．2．CD38．deficiencyresultedinincreaseofinflammatorycytokinesandrelatedproteinexpressionafterinducedbyLPS．①TheTLR4expressionandcytokinesecretionsuchasTNF．0【，IL-1DandMCP-1weresignificantlyincreasedafterstimulationbyLPSinbothgroups．②TheexpressionofTLR4andNF．r．BweregreatlyincreasedinCD381|‘macrophagecomparedthatwithwild—typegroup．③．ThesecretionofTNF—Ct，IL一1BandMCP一1weresharplyincreasedinCD38一’macrophagesafterstimulatedbyLPScomparedwiththatofWT． Conclusion：LPSsignificantlyinducedtheM1inflammatorycytokinesecretioninmacrophagesfromCD38．／-mice，suggestingthatCD38deficiencyresultsinincreasedinflammatoryresponseofmacrophages．Moreover，theTLR4-NF·r．BpathwaymaybeinvolvedinCD38··mediatedcytokineproductioninmacrophages·Keywords：CD38；Atherosclerosis；Macrophage；Inflammatoryresponse；TLR4；NF一1cBV 目录第1章绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1CD38与动脉粥样硬化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1．1CD38简述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．2动脉粥样硬化的产生及通路⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．1．3巨噬细胞(Maerophage)与动脉粥样硬化(AS)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．1．4．NF．r,B与动脉粥样硬化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．1．5TLR／NF．KB信号通路⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5第2章CD38基因敲除小鼠原代巨噬细胞的分离和培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一62．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62．2材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62．2．1CD38基因敲除鼠的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．62．2．2巨噬细胞(Macrophage)的原代培养及基因型鉴定⋯⋯⋯⋯⋯．．72．3结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．102．3．1CD38基因敲除小鼠基因型鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．102．3．2巨噬细胞(Macrophage)原代培养及基因型鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．4讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．4．1基因敲除小鼠的分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．4．2巨噬细胞的分型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13第3章CD38缺失在LPS诱导巨噬细胞炎性反应中的作用及其机制⋯⋯⋯⋯143．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．143．2材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．143．2．1TLR4表达水平检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．143．2．2NF．1出表达量检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯153．2．3荧光定量PCR检测巨噬细胞炎性因子分泌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16Vf 目录3．3实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．183．3．1LPS促进CD38．／．与WT小鼠腹腔巨噬细胞TLR4的表达⋯⋯．．183．3．2LPS促进CD38．／．与WT小鼠腹腔巨噬细胞NF．r．B的表达⋯⋯．193．3．3LPS促进CD38．／．与WT小鼠腹腔巨噬细胞炎性因子的表达⋯．．203．4讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223．4．1LPS与TLR4作用方式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223．4．2LPS与NF．1(B作用方式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22第4章结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一23致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．24参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．28综j苤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一30VlI 符号说明 第1章绪论1．1CD38与动脉粥样硬化1．1．1CD38简述20世纪80年代由Reinnerz等用单克隆抗体的方法分离鉴定得到CD38蛋白，它是一种单链II型跨膜糖蛋白，胞浆内有一短尾，羧基端位于细胞外，具有4个糖基化位点、透明质酸结合区和疏水伸展区，其中两个伸展区有亮氨酸拉链样结构【l’2】。在小鼠B细胞表面，CD38以非共价键相连的同型二聚体形式表达，用于稳定CD38的分子结构【1．3】。近期的研究表明，CD38的表达与分布相当广泛，无组织及细胞系的限制性，与细胞的分化和活化状态有关，主要表达于不成熟的造血细胞和活化的淋巴样细胞，在心肌、气道平滑肌、骨骼肌、纤维组织和子宫平滑肌均有表达【1。3】。CD38分子是具有ADPR(ADP．ribosyl)环化酶和脱氢酶活性的双功能酶，发挥这两种功能的酶活性位点均定位于胞外结构域，其ADPR环化酶活性可催化NAD+生成cADPR，并以同源二聚体的方式将胞外产生的cADPR转运进胞内。cADPR在胞内的信号级联反应中可充当第二信使，以不依赖三磷酸肌醇(IP3)的方式介导胞浆内Ca2+的释放，故CD38的酶活性可能与cADPR的信号传导功能有关【4】。另外，CD38的水解酶活性可催化cADPR的降解成ADPR。细胞膜表面的CD38分子具有受体的特点，与其它膜蛋白分子可以形成共帽(Co．capping)现象，介导多个信号传导途径之间的交流。CD38与其竞争性单克隆抗体结合，可使其内吞化或脱落，同时亦伴有其它表面分子如T细胞的TCR／CD3、B细胞的smIg／CDl9、NK细胞的CDl6等表达的下降或消失，表明CD38可能是一个共受体，参与细胞(特别是淋巴细胞)的增殖和分化的调控f51。此外，CD38分子还具有信号传导功能，目前推测可能与其借助其它具有跨膜信号传导能力的分子侧面的相互作用来完成。Co．capping实验提示CD38与具有特异性信号传导功能的分子如TCR、BCR及NK细胞的CDl6相关联。最近的相关研究表明，CD38也可以通过其胞浆域尾部直接传递信号。 第1章绪论1．1．2动脉粥样硬化的产生及通路动脉粥样硬化是动脉壁发生炎性应答反应引起的进行性增生病变，以动脉血管壁增厚变硬失去弹性，同时管腔缩小为特征。心血管疾病是全球发病率最高的疾病，动脉粥样硬化则是引发多种心血管疾病的重要诱因【6】。一般认为，引起动脉粥样硬化的因素主要是内皮细胞损伤引起的慢性炎性纤维增生反应的结果。多种危险因素造成的血管内皮细胞反复损伤和功能紊乱是动脉粥样硬化发生的始动环节，在此基础上血小板粘附聚集，单核细胞移入内膜吞噬大量脂质转化为泡沫细胞。泡沫细胞、T淋巴细胞和浸入的脂质，构成了早期的脂质条纹斑块17J。随着内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞的激活，释放出多种生物活性分子，调控平滑肌细胞移入斑块并发生表型转变而活化、增殖，同时伴有内皮细胞增殖、间质增生，在脂质和坏死物质所构成的斑块外被覆盖一层纤维帽，形成纤维脂质斑块。近期有文献报道，巨噬细胞或泡沫细胞均可以增加胆固醇的外流，加速动脉粥样硬化斑块形成【引。动脉粥样硬化多发生在大中型动脉中。人体血液中的脂类包括胆固醇、三酰甘油、磷脂和游离脂肪酸，当其表达异常时，尤其胆固醇和三酰甘油的比例升高，这和动脉粥样硬化的发生发展存在显著相关性。一般情况下，动脉内膜可将大部分血脂渗入动脉壁，然后经由动脉外膜所连接的淋巴管将血脂排出，在这种情况下，血脂不会沉积在动脉内壁。当人体患有高脂血症，其在血脂的调节方面产生障碍，将致使胆固醇和三酰甘油在血脂中的浓度增高，同时由于各种各因素，例如高血压、过度吸烟、情绪波动或病毒感染等引起动脉内膜损伤，可导致动脉内膜处血脂的渗透与沉积。由于动脉内膜处的损伤，致使和凝血有关的血小板在损伤处大量聚集，使大量细胞聚集在动脉的内膜和中层，并连续吸收渗入的血脂。由于细胞的大量堆积及对脂质的吸收，动脉中层和内膜逐渐从管腔内突出，加之其动脉壁的病理改变，即在血管壁上形成了粥样斑块。随着粥样斑块的不断变大血管腔随之变得狭小，血液的流速也会变缓慢。若斑块发生在主动脉主要血管上，因为其内径较大，斑块所致狭窄对血流速度影响不大；若动脉粥样硬化斑块出现冠状动脉或脑动脉上，特别是出现在血管的开口或分叉处，便会因为狭窄引起血液的供给不足加重，甚至斑块破裂，而引起心肌梗塞，心绞痛或脑血栓的形成。近百年来随着对AS研究的不断深入，先后形成了脂质侵润、血栓形成、平滑肌细胞克隆、损伤反应和慢性炎症等几个有代表性的学说。2 第1章绪论单核细胞和巨噬细胞是临床动脉粥样硬化及其并发症发生的重要组成部分，是先天免疫和获得性免疫中必不可缺的一员。巨噬细胞是由单核细胞分化而来，在炎症反应中，通过吞噬作用，杀死侵入机体的抗原，清除细胞碎片等。在动脉粥样硬化及相关的疾病中，巨噬细胞通过摄取作用将修饰的低密度脂蛋白(Lowdensitylipoprotein，LDL)转变成泡沫细胞。蛋白聚糖在血管内膜捕获LDLt91，LDL的氧化修饰使血液循环中的单核细胞激活，使之产生包括MCP-1在内的细胞因子【lo】。巨噬细胞通过对细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)的降解，使其迁移到发生炎症的组织处，通过摄取LDL转变成泡沫细胞。巨噬细胞M1型在炎症反应中产生TNF．0【，IFN．Y等炎症因子，同时M2型巨噬细胞也可以产生IL．10等对抗炎症或抑制炎症的细胞因子【ll】。巨噬细胞同时能参与组织修复过程，在动脉粥样硬化的发生发展过程中，巨噬细胞促使平滑肌细胞增生，并使其从中膜迁移到内膜下形成纤维帽。巨噬细胞和成纤维细胞则直接参与到细胞外基质的合成【12】，同时，泡沫细胞分泌的细胞因子能够促进斑块处的血管新生，促进肉芽肿的形成。1．1．3巨噬细胞(Macrophage)与动脉粥样硬化(AS)1914年，Antischkow首次证实胆固醇及富含胆固醇的泡沫细胞与动脉粥样硬化的发生有关。文献表明，动脉粥样硬化过程是巨噬细胞对入侵动脉壁的致病型脂蛋白产生的免疫性炎症反应【l31。研究发现，巨噬细胞缺陷小鼠具有明显抵御高胆固醇诱导动脉粥样硬化的能力，提示巨噬细胞出可促进动脉粥样硬化的发生发展。在动脉粥样硬化病变处，渗入的脂蛋白刺激巨噬细胞产生并释放IL．21和TNF．0【等多种炎症细胞因子，从而激活血液中的单核细胞，诱导其迁移入动脉内膜【141。动脉粥样硬化中还产生许多单核细胞趋化因子，其巨噬细胞集落刺激因子(M2CSF)作为主要的刺激因子来使单核细胞向巨噬细胞分化。巨噬细胞通过不同的胞吞方式摄取各种脂蛋白(包括oxLDL)和脂蛋白残粒后，大部分脂蛋白都将进入溶酶体最终被消化和降解成为游离的胆固醇和氨基酸。在负反馈的调节机制下，SRs参与于巨噬细胞的吞噬作用来摄取过量的oxLDL，使之在溶酶体中降解成为胆固醇，在缺乏胞外受体时，胆固醇极易酯化导致胞内胆固醇酯累积成为脂滴，加速巨噬细胞变为泡沫细胞。3 第1章绪论1．1．4．NF-KB与动脉粥样硬化NF．rd3是一个转录因子家族的总称，它包括五个成员：Rel(cRel)、p65(RelA，NF·r,B3)、RelB和p50(NF．心1)、p52(NF．1出2)，在静息状态下，NF．r．B转录区被隐藏，使之处于无活性状态。当细胞受到某些炎性细胞因子、缺氧复氧变化、紫外线照射、LPS刺激、细菌、病毒、某些变应原等多方面刺激时，引起一系列的连锁酶促反应。NF．r．B诱导激酶(NF．rd3．inducingkinase，NIK)首先被激活，然后激活NF．r,B，并转移进入细胞内。入核的NF．rd3与靶基因上的1cB位点发生特异性结合，促进相关基因的转录、表达。在动脉粥样硬化中NF．r．B控制着许多在其中起重要作用的基因转录，在动脉粥样硬化不同时期，NF．rd3的活化可能通过许多不同种类应激原诱导的复杂方式实现。人们已经对NF．r,B与动脉粥样硬化的关系做了大量研究，Wang等研究发现，在外膜成纤维细胞中，LPS可通过TLR4的下游基因NF．r．B上调ADRP的表达提高脂质的积累。增加LPS激活的外膜成纤维细胞释放MCP．1的量和脂质的积累可能加剧单核细胞的募集，并加剧充满脂质的巨噬泡沫细胞形成，最终促进动脉粥样硬化形成【lo】。而未成熟的Rubuscoreanus果实水提取物可以通过抑制阶段II基因表达中的NF．rd3基因的激活，改善血脂，缓解动脉粥样硬化【15】。高胆固醇饲养野生型小鼠慢性间歇性缺氧后可激活NF．rd3并导致小鼠动脉粥样硬化形成，而NF．1cB亚单位p50缺失的小鼠不会发生动脉粥样硬化【l61。此外，CobanD等发现，姜黄素可能通过NF．rd3通路，影响白细胞的粘附和跨内皮迁移达到抗动脉粥样硬化的作用【1‘71。越来越多的研究表明，当RAGE与它的受体如AGE结合后，可以引发NADPH氧化酶、MAPK以及NF．rd3的激活，其结果是ROS产生过度并上调动脉粥样硬化易发部位炎症浸润细胞的主要因子VCAM．1、ICAM．1和MCP．1的表达。氧化应激可以从多种途径直接激活氧化还原敏感转录因子NF．rB，导致炎性细胞因子和粘附分子表达增加，促进炎症反应【l引。以上研究表明，增加NF．rd3的表达可促进动脉粥样硬化的形成，而抑制NF．r．B的表达则可产生抗动脉粥样硬化的作用。4 第1章绪论1．1．5TLR／NF-KB信号通路TLRfToll．1ikereceptor)属于I型跨膜蛋白受体，主要由胞外区、跨膜区、胞内区构成。胞外区含有不同长度的亮氨酸重复序列，参与配体的识别。胞内区与IL．1受体胞内区结构相似，Toll／IL．1R同源结构域，依赖TIR结构域的嗜同性作用与下游接头蛋白的TIR结构域结合转导信号。TIR主要表达于免疫细胞如树突状细胞、巨噬细胞等。TLR4是人类最早发现的TLR相关蛋白，与多种慢性疾病相关，有辨别源于动脉粥样斑块中的坏死细胞释放的尿酸、高迁移率蛋白B1和热休克蛋白的能力。TLR4与配体特异性结合形成同源或异源二聚体，TLRs的TIR区域接受信号转导后，与不同的接头蛋白连接，从而激活多种信号通路。转录因子NF．r．B激活即是TLR4．MD．20．CDl4介导的，主要通过以下两个途径：1)TLRs信号的MyD88依赖机制：MyD88与TIRAP／MAL通过结合IL-1受体相关激酶启动TRAK6／IKK复合物的活化，从而导致NF．KB的早期迅速激活。2)TLP,s信号转导的非MyD88依赖机制：由TRIF／TIR、TICAMl与TRAM／TICAM2诱导的晚期NF．1(B激活。本实验室前期结果发现在高脂食物喂养下ApoE与CD38双基因缺失的小鼠模型中其动脉粥样硬化症状较ApoE单基因缺失小鼠加重，提示CD38在动脉粥样硬化的发生发展过程中可能起重要作用。本实验从动脉粥样硬化的主要因素之一巨噬细胞炎性反应入手，通过其经典TLR4-NF．r,B通路，对其机制进行初步探讨。 第2章CD38基因敲除小鼠原代巨噬细胞的分离和培养2．1引言巨噬细胞来源于骨髓中的前体细胞．单核细胞，后者进入血液可存留数小时至数日，然后移行到全身组织器官，继而分化成巨噬细胞。血循环中的单核细胞和组织中定居的巨噬细胞可以趋化至感染部位。因为单核细胞和巨噬细胞能表达多种受体包括补体受体，清道夫受体、模式识别受体等，以及表达和分泌多种酶类和生物活性产物，其吞噬和清除病原微生物能力很强，在机体的免疫防御中发挥重要作用。单核细胞和巨噬细胞能在病原体组分和趋化因子的作用下，趋化到炎症部位，通过分泌多种炎性细胞因子和小分子炎症介质，参与炎症反应过程。当机体受到损伤后，募集至感染部位的巨噬细胞被活化，通过分泌MIP．1、MCP-1和IL．8等趋化因子，募集活化更多的巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞，发挥抗感染作用；同时巨噬细胞分泌多种促进炎症的细胞因子IL．1、IL．6、TNF．0【和其他炎症介质，参与促进炎症反应。2．2材料和方法2．2．1CD38基因敲除鼠的鉴定CD38基因敲除鼠由Dr．FrancesE．Lund赠送，其制备原理见图2．1【191。2Ida广———1SHHS。SH钿一儿一_嗍T+—+呻竹3]卜—寸—彤1lIZ●’■tBIlI：Tar删呻V嘲。r}镯圈I_——————_{“cTlrg咖dL∞嘴-{】彩4——+．———“卫量——卜———小——-7纷14旯6图2．1CD38基冈敲除小鼠的制备6 第2章CD38基因敲除小鼠原代巨噬细胞的分离和培养从上图可以看出，同源重组导致一个1．6kb的CD38基因组区域(第二和第三外显子)被更换，其中包括被公认的NAD水解酶位点。CD38基因敲除鼠的基因表型鉴定：提取小鼠尾巴组织DNA：(1)剪取1厘米小鼠尾巴置于冰上保存，向其中加入4001．tl裂解液和20p,1蛋白酶K(10．20mg／m1)，60。C水浴过夜。(2)160009，lOmin离心，转移上清到新的EP管中。(3)上清中加入200p15MNaCI溶液，震荡混匀：之后加入异丙醇450pl，颠倒混匀。(4)160009离心10min弃上清，沉淀中加入lml70％乙醇溶液清洗DNA，160009离心5min，该步骤重复2．3次以达到清洗目的，清洗结束后弃上清，晾干，加入8081无核酶水溶解DNA，4"C过夜溶解。CD384小鼠基因型鉴定引物见表2．1：表2．1引物名称及序列引物名称序列(5’一3’)CD38上游引物Neo上游引物CD38&Neo共用下游引物CAATGTCCCAATCTCCCAAGGCTGCGAATCGGGAGCGGCGAI’ACAAAGGGGAGAACAGGAAGGA2．2．2巨噬细胞(Macrophage)的原代培养及基因型鉴定2．2．2．1巨噬细胞的原代培养取6．8周的CD38壬与野生型C57小鼠：(1)实验前三天向小鼠腹腔注射lml3％巯基乙醇酸钠(PBS溶解)，缓慢注射，注射过快则容易导致小鼠易死亡。(2)实验当天，将小鼠断颈处死，浸泡在75％酒精中3min进行皮肤消毒，向腹腔注射8mlD．Hank’S缓冲液，手指按压腹部20．30次，用10ml注射器抽取腹水，收集后离心100095min弃去上清，用RPMll640+15％FBS+1％双抗的培养基重悬细胞，37。C，5％二氧化碳培养4h，吸去上清，用PBS冲洗细胞两次，加培养基RPMll640+15％FBS+1％双抗，37℃，5％-氧化碳培养。7 第2章CD38基因敲除小鼠原代巨噬细胞的分离和培养(3)次日，细胞即可用于实验。2．2．2．2巨噬细胞基因型鉴定1、提取小鼠巨噬细胞RNA(1)取6孔板中的巨噬细胞，将细胞用冷PBS液冲洗两遍。向各孔细胞中分别加入lmlTrizol试剂，吹打并轻轻颠倒混匀，室温静置5min。(2)向Trizol的细胞悬液中加入2009l氯仿，剧烈震荡15s，充分混匀，室温静置15min，4。C，120009离心20min。(3)轻轻吸取上层水相，勿触及中间蛋白层。在取出的上层水相中加入5009l异丙醇，颠倒混匀后．20。C放置2h，4。C离心12000920min。(4)弃上清，加入预冷的DEPC处理的75％乙醇lml，颠倒混匀，4。C，120009离心5min。该步骤重复两次。(5)弃乙醇上清，并短暂离心，用移液器吸取残余乙醇，将EP管置于滤纸上室温放置3min。向每管加入DEPC处理的无核酶水309l，混匀，将其在55．60℃温育10min，放置于4。C，待测量浓度。2、使用超微量分光光度计测量RNA浓度。吸取29l无核酶水清洗点样孔，用吸水纸擦干后，再次使用29l无核酶水调零。吸取同样量的样本依次进行浓度测量。3、反转录PCR检测CD38表达量将RNA反转录成为cDNA。RNA浓度测定后处理数据，准备反转录。根据实验需求用不同的RNA总量除以RNA浓度以计算反转录模板所需量，一般为O．1．599不等(以499为例)，计算方法如下：模板体积(¨1)=4000ng／所测RNA浓度(ng／91)8 第2章CD38基因敲除小鼠原代巨噬细胞的分离和培养22uI24uI65。C5rain2uI40uI8uI；。20c。061。0mmiinn厶成终止c反D应NA2uI16uI4uI2uI图2．2RNA反转录体系4、PCR扩增将引物从-20度冰箱取出混悬，使得壁上的粉末掉落，之后进行短暂离心，使得粉末集中在EP管底部，按照引物的说明加入相应体积的水，使其达到10011M的储存浓度。取出一部分，将其稀释五倍体积，使其达到20pM的工作浓度。储存浓度包括粉末长期保存于．20*(2，工作液保存于4"C，避免反复冻融。表2．2PCR扩增体系达型堡丝笪咝签墼盟!塑型PCRMix12．5p,lddH209．5ttlForwardprimer1mReverseprimerl山cDNAloaTotalVolume25山9 第2章CD38基因敲除小鼠原代巨噬细胞的分离和培养扩增程序：一／jj?一／一?一j．．二：i。／二一／30cycles图2．3PCR扩增程序5、电泳琼脂糖凝胶浓度为1．2％，Marker上样量为6tdPCR产物上样量为7td100V电压30min。6、凝胶成像系统分析。表2．3引物名称及序列引物名称序列(5’司’)CD38mRNA上游引物CD38mRNA下游引物GGACGCT(}CCTCATCTACACTCCTCAGGrI’GGATTCTCAGCC2．3结果2．3．1∞38基因敲除小■基因型鉴定利用CD38基因敲除的原理我们对特殊片段进行引物设计并扩增其基因片段，对CD38基因进行检测的同时也检测新霉素(Ne0)片段是否存在，若Neo片段存在，CD38基因片段不存在则为CD38小敲除小鼠，若CD38片段存在且Neo片段亦存在，则说明该小鼠为CD38+／-：b鼠，反之，若CD38片段存在且高亮，Neo未出现片段则证明为野生型(W．T．)小鼠(图1)。通过PCR方法鉴定，我们所用的CD38基因敲除小鼠为纯合子敲除鼠，其Neo条带可以扩增得出，而CD38无扩增条带。10 第2章CD38基因敲除小鼠原代巨噬细胞的分离和培养NeOCD38图1．PCR方法鉴定小鼠基因型。2．3．2巨噬细胞(Ihcrophage)原代培养及基因型鉴定2．3．2．1巨噬细胞原代培养原代培养巨噬细胞4h后，换新鲜培养基，显微镜观察可见细胞已贴壁，呈球形或扁圆鹅卵石形状，6．8h伸出伪足，铺开生长后为梭形三角形或多角形(图2)。巨噬细胞的原代培养结果显示我们培养的巨噬细胞从形态以及特征方面均与国内外文献一致，可满足进一步的实验需求。dY'ox图2．显微镜下不同倍数原代培养腹腔巨噬细胞图片。图片分别在目镜倍数为4倍(左上)；10倍(右上)；20倍(左下)；40倍(右下)中拍摄。11 第2章CD38基因敲除小鼠原代巨噬细胞的分离和培养2．3．2．2巨噬细胞的基因型及蛋白检测为探明从CD38小小鼠中提取的巨噬细胞基因型是否与小鼠DNA鉴定结果一致，并确定小鼠为全基因敲除鼠我们提取巨噬细胞的RNA和蛋白，将总RNA反转录为eDNA后进行巨噬细胞基因型鉴定，并通过WesternBlot检测巨噬细胞内CD38蛋白的表达情况(图3)。实验结果显示CD38士小鼠中提取的巨噬细胞在mRNA及蛋白水平均未表达CD38，证实实验可靠且准确，为后续实验奠定了良好的基础。ACD38BCD38W．T’’■^B’(●0●E■·}，图3小鼠腹腔巨噬细胞基因型及蛋白鉴定结果。A．逆转录PCR结果，其中GAPDH为25循环数，CD38为30循环数；B．WesternBlot蛋白表达量检测结果；C．在B图中发现W．T．组中CD38蛋白条带较暗，故用eDNA进行荧光定量PCR检测后发现CD38基因在巨噬细胞中表达丰度偏低。12一心一～一，一、、、、惑日¨㈣～ 第2章CD38基因敲除小鼠原代巨噬细胞的分离和培养2．4讨论2．4．1基因敲除小鼠的分类基因敲除小鼠是研究基因功能的重要工具。基因敲除小鼠可分为全基因敲除和条件性基因敲除。在全基因敲除(ConventionalKnockout)小鼠中，重要基因的敲除会对胚胎发育有严重的影响，甚至导致死亡，这就意味着含突变基因的胚胎小鼠不能顺利成长为成年鼠。因此，在这种情况下，人们可使用条件基因敲除(ConditionalKnockout)小鼠来克服这些问题。2．4．2巨噬细胞的分型根据巨噬细胞的激活状态可将巨噬细胞分为M1和M2两种类型【21|。M1型巨噬细胞又叫做经典激活巨噬细胞，是抵抗细菌入侵并且对坏死细胞进行吞噬并且消化的免疫效应细胞，并且在此过程中产生许多淋巴因子，M1型巨噬细胞通常是被LPS和IFN．b激活，激活后产生大量的IL．12和少量的IL．10。随着越来越多的方法对巨噬细胞的激活进行鉴定，M2型成为除M1型激活状态后的统称，并且具有一定的抗炎作用，它的功能主要是伤口的愈合以及组织修复，并且通过产生IL．10这类抗炎性反应的细胞因子，使免疫系统从激活状态恢复，M2型巨噬细胞一般是由IL．4激活，并且可以产生大量的IL．10及少量的IL．12。在动脉粥样硬化斑块形成的过程中M1型巨噬细胞参与泡沫细胞的形成，在肿瘤相关的巨噬细胞通常被认为是M2型巨噬细胞【2引。13 第3章CD38缺失在LPS诱导巨噬细胞炎性反应中的作用及其机制第3章CD38缺失在LPS诱导巨噬细胞炎性反应中的作用及其机制3．1引言本实验前期结果发现，在CD38基因缺失小鼠中，动脉粥样硬化症状加重，巨噬细胞浸润增多，提示CD38缺失可促进巨噬细胞参与动脉粥样硬化的形成。考虑到在不同基因型小鼠提取的原代巨噬细胞中存在的炎性反应会有部分差异，故从中选择最具有代表性的TLR40NF．rd3信号传导通路进行探讨，本研究旨在研究CD38对LPS诱导巨噬细胞炎性因子表达和分泌的影响，并对其可能的分子机制进行探讨。3．2材料和方法3．2．1TLR4表达水平检测LPS是绝大多数革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，有很强的免疫原性，可以增强免疫反应。在巨噬细胞中LPS主要通过TLR4(Toll．1ikeReceptor4)发挥作用。LPS可以和脂多糖结合蛋白(LipopolysaccharideBindingProtein，LBP)结合，随后和CDl4结合，并与TLR4和MD2形成复合物。该复合物形成后，可以通过MyD88途径诱导炎性细胞因子的产生。但有文献报道LPS的信号途径也可以是不依赖于MyD88的，LPS也可以直接和TLR4相结合‘241。本实验将以CD38斗与W．T．小鼠原代培养腹腔巨噬细胞为主要模型，在对照组与LPS刺激组中，对CD38基因敲除后TLR4表达量是否改变进行探讨。3．2．1．1TLR4mRNA表达水平检测将原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞培养至稳定状态后，使用无血清培养基培养12h，加入LPS使其终浓度达到l¨g／mL，LPS刺激12h后，收集细胞，提取RNA并反转录，RT-PCR检测TLR4表达量。逆转录及PCR体系同2．2．2．2中巨噬细胞基因型鉴定。14 第3章CD38缺失在LPS诱导巨噬细胞炎性反应中的作用及其机制3．2．1．2TLR4蛋白表达水平检测通过前期实验发现，巨噬细胞在无血清培养12h后用LPS刺激12h即可达到应激状态。(1)将原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞用LPS刺激12h后，用预冷的PBS清洗细胞两次，6孔板每孔加入1501al裂解液(RIPA+PMSF(100：1))，摇床冰浴30min，收集液体至1．5mlEP管中。(2)13000rpm，4℃离心25min，取上清，即为蛋白样品，．80℃保存。(3)测定蛋白浓度，根据浓度计算所需蛋白体积，加入1／5体积的5XloadingBuffer，沸水水浴10min，使蛋白变性。(4)配制12％分离胶和5％浓缩胶，表3．2和表3．3．表3．25ml12％分离胶的配制方法试剂(Reagent)体积(Volume)Protogel(30％)2MTris(pH8．8)ddH2020％SDS10％APSTEMED2ml1ml2m125pl16．5“110“l表3．32．5ml5％浓缩胶的配制方法试剂(Reagem)体积(Volume)protogel(30％)0．4ml2MTris(pH8．8、0．6mlddH201．5ml20％SDS12．5肛l10％APS12．5“lTEMED7gl15 第3章CD38缺失在LPS诱导巨噬细胞炎性反应中的作用及其机制(5)上样。在浓缩胶中40V电压将样品压缩为一条直线后，加电压至70V，待Marker分开后，停止电泳。(6)转膜。将胶卸下，切除多余的胶，右上切角标记，在转移液中稍稍浸泡一下，将与胶同样大小的PVDF膜提前在甲醇中浸泡一分钟。按顺序放滤纸，胶，PVDF膜，滤纸，用玻璃棒逐出气泡，两边放海绵，靠近胶的一面放负极，PVDF膜的一面放正极，转移槽中盛满转膜缓冲液，恒流300mA转移60min。(7)封闭。将PVDF膜浸没于5％牛奶封闭液中摇床缓慢封闭1h。封闭完后，TBST漂洗3次，每次10min。(8)孵育一抗，4"C摇床过夜。孵育完后TBST漂洗3次，每次10min。(9)孵育二抗，室温摇床1h。孵育完后TBST漂洗3次，每次10rain。(10)用吸水纸尽量吸干PVDF膜上的水分后，将其平放在采集化学发光信号凝胶成像仪里。配制显色液，显色。3．2．2NF-KB表达量检测LPS与TLR4结合可以激活两条主要的信号转导通路，这两条通路分别为MyD88依赖型与MyD88非依赖型通路，这两条通路最终都会激活NF．r．B这一转录因子，它在许多细胞中都参与细胞因子的分泌以及免疫应答，其中一种主要的细胞系即为巨噬细胞。因为在前期的结果中显示在CD38斗小鼠巨噬细胞中TLR4表达量升高，从而让我们进入下游通路的探索，检测NF．rd3的表达量是否存在变化【24J。通过前期实验发现，巨噬细胞在无血清培养12h后用LPS刺激12h即可达到应激状态。实验步骤同3．2．1．2中TLR4蛋白水平检测。3．2．3荧光定量PCR检测巨噬细胞炎性因子分泌NF．rd3作为一个重要的细胞内免疫转录因子，也以非激活状态存在于正常细胞中，但是当细胞受到刺激后，NF．rd3则为最快对刺激做出反应的因子，通常可以激活NF．r．B通路的因子为活性氧自由基(ROS)，肿瘤坏死因子(It(TNF．0【)，白介素1(IL．1)以及LPS。但当NF．r．B激活后，又可以调控炎性因子的分泌与释放。所以本文对CD38基因缺失小鼠及野生型小鼠的腹腔巨噬细胞进行LPS刺激后，对其炎性因子的分泌量进行了相关检测。16 第3章CD38缺失在LPS诱导巨噬细胞炎性反应中的作用及其机制待细胞培养至第3天时，用无血清培养基培养细胞12h，然后用加入LPS(199／mL)刺激，在12h收集细胞样品。提取RNA方法及反转录方法同2．2．2．2中巨噬细胞基因型鉴定。检测mRNA水平上的细胞因子表达量变化，利用Real．Time方法检测细胞因子表达量变化IL．1细、MCP．1以及TNF．1的表达水平。按照Takara的SYBR@PremixExTaqlMII(DRR081A)的方法合成进行荧光定量PCR，引物如表3．4，反应体系和条件如表3．5．表3．4引物名称及序列引物名称序列(5'--,3’)TNF．aMCPIL．11上游下游上游下游上游下游GTGGAACTGGCAGAAGAGGCAAGAGGGAGGCCATTTGGGAACGGTGTCCCAAAGAAGCTGTAACGG(汀CAACTTCACATTCAGTGTClTTCCCGTGGACCTTCTCATCTCGGAGCCTGTAGTGC表3．5实时荧光定量PCR反应体系试剂(Reagent)体积(Volume)cDNANuclease．FreewaterSYBR@PremixExTaqXMIIROXReferenceDyeIIUni-miRqPCRPrimer(10山田Primer(10小)TotalVolume2td6ttl10m0．4td0．8山0．81xl20m17 第3章CD38缺失在LPS诱导巨噬细胞炎性反应中的作用及其机制按照下图设置反应程序Stage1Stage2Stage3Rep弓口Repg圈Reps口3．3实验结果3．3．1LPS促进01)38．／-与盯小■腹腔巨毫细胞TLR4的表达Toll．1ikereceptor4(TLR4)是TLR家族中的一员，与LPS密切相关，在先天的免疫系统中具有重要作用。在LPS的刺激下，TLR4和LY96、CDl4所形成的复合物一起参与免疫反应过程。在对TLR4的基因表达量进行检测，发现在CD38基因敲除后，TLR4表达量有明显升高(图4)。18器 第3章CD38缺失在LPS诱导巨噬细胞炎性反应中的作用及其机制ATLR4GAPDHW．T．1W．T．2CD38一／一1cD38一／一2哥一m1固卅2日C038—1口：038一-2图4TLR4基因表达情况A．TLR4的PCR扩增产物表达情况；B．使用imageJ软件对其进行灰度分析，定量得出柱状图，从B图可知CD38基因敲除后TLR4表达量较W．T．有显著升高。AWT*WTCD38-／．+CD38．／-TLR4一一●——VGAPDH●-●一●，·——，B≤梦≤梦’图5TLR4蛋白表达水平(·为刺激组)A．TLR4的蛋白表达情况；B．使用imageJ软件对其进行灰度分析，定量得出柱状图，从B图可知CD38基因敲除后TLR4表达量较W．T．有显著升高。3．3．2LPS促进liD38-／_与盯小曩腹腔巨t细胞肛xB的表达NF．KB为一个控制转录的蛋白复合物，在控制感染的免疫应答中扮演着重要的角色，NF-r,B与炎症反应、自身免疫疾病以及细菌感染密切相关，简言之，NF-r．B可以理解成一种与细胞因子的产生及细胞的生存密切相关的关键蛋白。在CD38小小鼠巨噬细胞中，n旺．仅和MCP．1的mRNA表达量均比较高，故我们接着检测了NF．KB的表达。结果表明在CD38基因敲除后，NF．v,B的表达量也相应升高(图6)，在LPS刺激前后分别对WT．组及CD38乒组巨噬细胞检19 第3章CD38缺失在LPS诱导巨噬细胞炎性反应中的作用及其机制测发现，在LPS未刺激状态下CD38乒组NF．r,B表达量较W．T．高，在LPS刺激后两组则均有升高，但CD38乒组升高更为显著。WTWT木K01K02K03K01宰K02*KG3木／t梦／矿。毒≤扩梦图6在LPS刺激前后CD38小与w．T．组NV-r。B表达量差异A．WesternBlot化学发光结果，其中CD38敲除组中刺激与未刺激各重复三次；B．使用imageJ软件对化学发光结果进行分析定量，得出柱状图。3．3．3LPS促进C038-／一与耵小■腹腔巨t细胞炎性因子的表达在细胞形态上可以发现，在LPS刺激后，显微结构显示典型的成熟巨噬细胞特征如吞饮小泡增多，胞浆出现晶体包涵体和次级溶酶体等。在含LPS介质中分化的细胞具有相似的形态学和超微结构改变，但体积较在不含LPS介质中分化的巨噬细胞略小。本实验中LPS刺激前后W．T．与CD38斗巨噬细胞差别明显(图7)，LPS刺激前两组细胞之间差别不大，但在LPS刺激后可观察到CD38小小鼠腹腔巨噬细胞中胞浆内晶体包涵体增多，且伪足生长较W．T．组有明显增加。刺激后图7在LPS刺激前后，W．T．与CD38乒细胞差别比较放大倍数20X20 第3章CD38缺失在LPS诱导巨噬细胞炎性反应中的作用及其机制巨噬细胞在受到LPS刺激后，炎症反应开始并加剧，激活相关通路，增加相应炎性因子的分泌，本文主要从单核细胞趋化蛋白-1(1Vlonocytechemotacticprotdn1，MCP．1)和肿瘤坏死因子a(Tumornecrosisfacta,n吓-吣方面对巨噬细胞的炎性因子分泌进行分析，同时检测巨噬细胞中白介素1p(儿．1p)的表达情况(图8图9)。ABMCP．1TNF．aGAPDHWTN、VTSCD38-／-NCD38一／一Sc2．F羹爹图8PCR扩增MCP．1及TNF-o．在不同基因型小鼠中的表达差异。A．MCP．1与TNF-_0t琼脂糖凝胶电泳结果；B．ImageJ对琼脂糖凝胶电泳结果分析，在CD384-dx鼠腹腔巨噬细胞中MCP-1的表达量升高。A窨5-1产垂L血《31⋯⋯⋯jIE2_E刍川⋯⋯JI呈l目⋯⋯⋯|I列图固目叫灿l1a1《Z叱E2卫芷B》8暑罟6o《丕4E兰2罢叱0LI-8f，●一肌_≯f◇，图9实时荧光定量PCR对MCP．1，n师．a及IL．13表达水平分析。A．小鼠腹腔巨噬细胞中MCP-1在LPS刺激后CD38基因敲除组较W．T．gt有显著升高(n_3幸··p<0．0001)；B．小鼠腹腔巨噬细胞中TNF-Q在LPS刺激后CD38基因敲除组较W．T．组有显著升高(n=3)··p：0．0088)；C．小鼠腹腔巨噬细胞中IL-1p在LPS刺激后CD38基因敲除组较WT．组有显著升高(n=3··p=0．0022)。2l妒广c矿妒 第3章CD38缺失在LPS诱导巨噬细胞炎性反应中的作用及其机制3．4讨论3．4．1Ip$与TL阱作用方式LPS源自于革兰氏阴性菌，被认为是研究免疫的最佳细菌组分之一，它可以诱导一系列的炎症反应以及信号传导。LPS刺激哺乳动物细胞通过一些相互反应的蛋白，其中也包括了LPS结合蛋白(LBP)。通过对LPS／TLR4信号传递的认识发现，脂多糖结合蛋白(LBP)和白细胞分化抗原(CDl4)是识别LPS的主要蛋白，并且是通过TLR4／MD．2受体复合物对该信号进行调控作用。LPS／TLR4信号可以被划分为两种模式，一种为MyD88依赖模式，另一种为MyD88非依赖模式。MyD88依赖模式可以激活促炎症因子的释放，MyD88非依赖模式则对I型干扰素基因进行调控。显然，LPS／TLR4信号通路的阐明将有利于研究TLR家族其他成员的信号转导通路。因为LPS／TLR4信号的非正常调控对于诱导炎症反应有着潜在的作用，这条通路将成为研究炎症反应以及控制其反应的一个重要的靶点。3．4．2LPS与NF-ItB作用方式经典通路认为，LPS促进NT．r,B的表达和分泌是通过TLR4的MyD88依赖途径，因为MyD88的下游通路主要是MAPK通路以及NF．1出通路。但最近有研究表明，LPS可部分激活MyD88基因敲除鼠巨噬细胞中的NF．r,B通路【23】，同时有理论证明在骨髓源与非骨髓源的细胞中，LPS诱导NF．r,B活化并且产生一系列细胞因子时可能同时存在预期之外的机制。在人脐静脉内皮细胞中，LPS的信号是通过MyD88或Mal／TIRAP以及IKK2来诱导NF．r,B活化以及细胞因子分泌的，这些现象的发生及发展均不需TLR4的参与。反之，在原代培养的巨噬细胞中，LPS信号传导致NF．r,B激活以及细胞因子的产生则需要通过TLR4而非MyD88、Mal／TIRAP或IKK2。这些证据说明在以特异性分子MyD88和Mal／TIRAP参与的LPS刺激信号传导过程中有重要的位点可以用于抑制LPS在体内的活性。同时也有理论认为在MyD88的下游通路中可能还存在其他的通路，也可以加速炎性因子的分泌【25J。 第4章结论4．1结论1．与WT鼠比较，LPS可明显诱导CD38基因敲除小鼠原代巨噬细胞M1型炎性因子分泌，提示CD38基因缺失具有促进炎性反应的作用。2．CD38对巨噬细胞炎性反应的影响可能与其调节TLR4-NF．r,B通路有关。 致谢昌医的五月，丝丝炎热中充盈着熟悉的香樟花味，夏天的到来意味着我硕士生活将告一段落。不禁让我再次感叹时光的飞逝，三年的时光太过匆忙，还没来及品味便已成为回忆，转化医学研究院将被书写进入我的人生，三年时光里它带给我太多酸甜苦辣但现在回味都成了怡人的甘甜。毕业论文便是对我这三年时光的部分总结，这篇论文是在我的导师辛洪波教授指导下完成的，老师无私的指导和不厌其烦的帮助让我深深感动。论文的字里行间都倾注着老师的心血，老师渊博的学识、严谨求实的科研态度、兢兢业业的工作作风、孜孜不倦的探索精神和谦虚谨慎的做人态度使我在学习和工作中得到教益和启迪。通过这次论文的修改，老师让我懂得不论做任何事情都要踏实认真与负责。在此谨向辛老师表示崇高的敬意和衷心的感谢!衷心感谢转化医学研究院所有老师和同学在生活、学习和研究上的帮助。让我在我们这个大家庭中开心充实的度过了三年的时光。衷心感谢本实验室的黄璇老师，管小卉，唐琳，赵宁，苗连杰等同学的帮助。他们使我感受到良好的团结协作、共同奋进的学习、工作气氛。最后，我深深地感谢我的家人和朋友!一直以来，他们对我的学习及实验工作给予了深切的理解和支持，并在精神上和生活上给了我莫大的关心和爱护。24蒋凯2013年5月 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附录S表2实验主要仪器和设备9700PCR仪Veriti梯度PCR仪实时定量PCR仪SW-CJ．2FD型超净化工作台二氧化碳培养箱超低温箱(．80℃)超纯水仪倒置显微镜酶标仪FSH．2A可调高速匀浆机BT300-2JLongerPump磁力搅拌器电热恒温水浴锅凝胶成像分析系统电泳系统MiIli离心机LEGENDMicr021R微量台式离心机BiofugeStratos台式高速冷冻离心机涡旋振荡器美国ABI公司苏州净化设备有限公司美国Thermo公司美国Millipore公司日本Olympus公司美国Thermo公司杭州华普达教学仪器有限公司美国Thermo公司德国IKA公司天津泰斯特仪器有限公司美国Bio．Rad公司北京六一仪器厂美国VWR公司美国Thermo公司江苏海门麒麟医用仪器厂29 综述CD38，Sirtuins，与炎症之间的关系蒋凯综述辛洪波审校摘要：CD38作为一个多功能的酶，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为底物制造二级信使cADPR，在哺乳动物的组织中发现CD38同时拥有细胞NAD酶作用，并且在许多组织和细胞中表现出调控细胞中NAD水平。而NAD在许多信号传导通路中起到重要作用，最近研究发现NAD参与了许多生理学变化，包括胰岛素分泌，能量代谢，气管收缩，衰老和长寿等等。而SIRTl作为Sirtuins家族中研究最多的成员，也以NAD为底物进行脱乙酰作用，从而调控许多重要的转录因子，如p53，FOX01和NF．r．B等，从而调节包括代谢、炎症、细胞衰老、细胞增殖、细胞凋亡以及DNA损伤反应。本综述以CD38为主要内容，研究其所影响的Sirtl及其下游信号通路，以及Sirtl对NF．r．B的调控作用对炎症反应的影响。从而揭示出CD38可能在许多疾病中具有药理学研究价值。关键词：CD38；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)；SirtlCD38在细胞内作为NAD酶，用于调节NAD的降解和控制其表达水平，CD38作为一个多功能的酶，在哺乳动物体内组织中分布广泛，Sirtl作为Sirtuins家族中研究最多的成员，也以NAD为底物进行脱乙酰作用，从而调控许多重要的转录因子，如p53，FOX01和NF．r．B等，从而调节包括代谢、炎症、细胞衰老、细胞增殖、细胞凋亡以及DNA损伤反应。本篇综述从CD38的结构开始，对CD38的结构，功能，代谢，以及对Sirtl的影响，从而导致一系有关炎症的信号传导通路变化进行阐述，更加深入了解CD38在机体中的作用。1．CD38的结构CD38基因包括了8个外显子，5'UTR无TATA盒或CAAT盒llJ。一段高GC含量区可能是CD38的启动子区，调节CD38的表达。CD38蛋白大小为45kDa，整体结构分为N末端短的胞质尾，单次跨膜域和C端长的胞外区。其开放阅读框含有300个氨基酸残基，5'UTR比较短小仅69bp，不包括PolyA尾，30 其3'UTR含有260bp。其编码的多肽链分子量为34，288道尔顿。天然的CD38抗原的分子量为46，000道尔顿。预测的氨基酸序列没有N．末端的引导肽序列，但在从翻译起始位点起21个氨基酸残基处含有一段长23个氨基酸残基的内部疏水序列。CD38原始序列的亲水性提示CD38分子仅跨膜一次，也就是说多肽链的长C．末端指向胞外，N．末端有19aa的短胞质尾【2J。CD38除了锚钉在细胞膜上外(45kD钆mCD38)，还以可溶性的形式存在(39kDa,sCD38)，可能为细胞膜蛋白被剪切的结果。因此，在体外培养的T淋巴细胞异常激活及CD38+的肿瘤细胞系的培养液中可以检测到CD38。在正常的羊水中及多发性黑色素瘤患者的血清和腹水中也可检测到sCD38t31。CD38定位于膜上的糖蛋白，催化环腺苷二磷酸核糖(cADPR,cyclicADP．ribose)的合成和降解。cADPR是核苷酸的代谢产物，通过作用于ryanodine受体(RyRs)参与细胞内钙库的钙动员。CD38在NAD+和p巯基乙醇存在的条件下会形成稳定的寡聚化，伴随着ADP核糖环化酶和NADase活性的下降4|。许多研究发现CD38／cADPR介导的Ca2+信号传递和通过RyRs通道的Ca2+释放在Ca2+内平衡的调控中发挥了重要的作用。CD38／cADPR／RyRs介导的Ca2+信号传递也参与了许多病理和生理过程。NAD作为一个重要的细胞代谢产物，参与细胞动力学的多种反应，NAD在细胞信号传导通路上也有着很重要的作用和细胞的许多生理活动都有密不可分的关系，cADPR作为NAD的次级信使，在细胞许多生理状态下都非常重要，包括从受精卵开始直到细胞的生长，老化和死亡的发生机理。而CD38作为NAD的调节因子，在调控NAD降解以及控制NAD在细胞内的表达水平有着至关重要的作用。CD38可以分别催化NAD和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)生成两种具有钙动员活性的第二信使核苷酸小分子cADPR和烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)。基因敲除实验结果表明：CD38是维持cADPR水平的重要调节器【51。cADPR在胞内的信号级联反应中可充当第二信使，以不依赖三磷酸肌醇(IP3)受体系统的方式将Ca：+从内质网释放，进而影响细胞的功能与生命活动的进行。cADPR从CD38解离过程的模拟，有助于人们获得CD38在配体结合、解离过程中的构象变化、重要氨基酸残基等信息，为抑制剂的设计提供指导。2．CD38与NAD代谢CD38在细胞内作为NAD酶，用于调节NAD的降解和控制其表达水平，31 CD38作为一个多功能的酶，在哺乳动物体内组织中分布广泛，例如前面提到的，它的主要酶活性是水解NADt6‘¨】。事实上，如上所示，CD38会生产一个cADPR对NAD分子进行水解【6J。直到现在，CD38对NAD水平的表达调控机制还没有清楚。最近有报道，假设CD38为哺乳动物细胞内主要的NAD酶，并且调控着细胞内NAD的水平。在野生型和CD38基因敲除小鼠的许多组织中检测了NAD酶的活性和NAD水平111|。和假设一致的是，发现CD38基因敲除小鼠组织内的NAD表达水平比野生型的高出10．20倍，这个结果同样也得到了其他研究组的证型121。在CD38基因敲除小鼠中NAD酶在许多组织中是失活的【11，13，141。这些数据证明CD38是细胞内NAD的主要调节因子。CD38在动物体内各个组织和细胞区间分布调节细胞内NAD的水平。CD38不仅调节细胞内NAD的表达水平，还可能调节细胞外NAD的水平。CD38出现在不同的细胞区间可能具有调节特殊器官中NAD的作用。NAD，又称细胞辅酶，是细胞能量代谢所必需的辅酶，在生物氧化过程中能进行电子传递，并释放细胞生理活动所需的能量。NADH在维持细胞生长、分化和能量代谢中起着十分重要的作用，同时能作为一种生化药物发挥细胞保护作用。研究发现NADH可以抵抗和修复化学毒性、DNA损伤及缺血缺氧引起的细胞损伤，上调抗凋亡基因、下调促凋亡基因表达，减少细胞内氧自由基，增加谷胱甘肽含量，抑制细胞色素C从线粒体释放，并修复相关PARP蛋白剪切，发挥细胞保护作用。近期发现细胞核中存在CD38，它在核膜上调节着第二信使cADPR和核存储钙离子的释放【l引。同样发现细胞核的CD38调节去乙酰化核酶【l5l。特别是，发现了CD38降解NAD和减少从NAD到NAD依赖性乙酰基转移酶Sirtl的生成【13，14J。由CD38生成的烟酰碱可能调节Sirtl的活性【l31。从侧面证明烟酰胺可能是Sirtl酶的内源性抑制剂。作为NAD水平和Sirtl活性的潜在调节因子，CD38可能也是许多Sirtl功能的调节因子，包括能量平衡，肥胖衰老和长寿。3．NAD与Sirtl活性调控Sirtuins家族包括一系列依赖于NAD的去乙酰蛋白酶和ADP核糖转移酶，其首先发现于酵母称为Sir2。哺乳类动物表达的Sirtl是sirtuins家族的一个重要成员，是Sir2的一个重要异构体，参与一系列的生理过程，如细胞代谢，分化，应激及肿瘤的发生等。32 综述Sir2与Sirtl在细胞的功能主要取决于其去乙酰化活性，而这个过程需要辅酶NAD参于。另外，NAD合成酶的前体、sirtuins与多聚ADP核糖合成酶所介导的依赖于NAD的蛋白修饰所产生的附产物乙酰胞壁酸(NAM)可抑制Sir2与Sirtl的活性【l酬。NAD对Sir2与Sirtl活性的调节首先是在酵母【l7’18J的卡路里限制(CR)所诱导的长寿中提出的，并逐步扩展到哺乳动物中【l9I。在酵母中的研究表明，卡路里限制所诱导的长寿需要NAD补偿途径的作用，过表达NAD合成补偿途径中的合成酶可以延长酵母的寿命【l7，18J。因为在长寿酵母菌中未能发现显著的NAD浓度升耐20J，一些其它的受NAD补偿合成途径调节的代谢参数被认为是实际调节CR中Sir2活性的信号：NAD／NADH蚪2l'22J和NAM水平【2引。而哺乳动物细胞研究则主要侧重于NAD补偿合成途径中的两个重要的酶——-NAMPT和NMNAT．1对核内Sirtl活性的影响。在NAD合成的补偿途径中，NAM作为NAD核内合成的前体影响Sirtl的活性与NAD的合成。鬣■jM^卜哪嘲眦Ac■tI之3■k■誓—■蝴●●a晡●·____-◆州■●N’Hk日柚n_nI-瑚b啊●‘h‘嘲瞰Il^胴Ⅸ彳-2V—_抛^再Hk—h—-l●-，t乏3_kH嘲啊■瞳翻州d●-———-——≯II憎NI图l：哺乳类细胞中NAD的生物合成途径。在哺乳类细胞中，NAD的合成源于两条途径：起始合成途径与补偿合成途径。在起始合成中，L一色氨酸是多步合成途径中的起始材料。而在补偿合成中，NAD合成以尼克酰胺或烟酸为起始。3．1磷酸核糖转移酶(NAMPT)磷酸核糖转移酶(NAMPT)即存在于胞浆也存在于胞核，它可以催化NAM到NMNt241的转变。而且，其细胞外的存在形式被称为NAD的生物合成酶【25】，也作为一种细胞因子称为B祖细胞克隆促进因子(PBEF)[261，或是有胰岛素类似33群卜器筹卜器 综述功能的脂肪细胞因子阳。生物化学分析显示NAMPT是NAD补偿合成途径的一个限速酶【28】。与此同时体内分析表明NAMPT的表达水平与胞内的NAD产生密切相关【28，291。NAMPT的酶学活性同样直接减少细胞的NAM水平【301。以上NAMPT这些的反应均有可能影响Sirtl的活性。在多种不同的细胞如骨骼肌细胞、血管平滑肌细胞及软骨细胞中，NAMPT对Sirtl的活性调控均有研究。骨骼肌细胞的营养限制可以刺激NAMPT的表达，导致胞内NAD／NADH比及NAM水平的改变【301。这些改变均可以激活Sirtl的活性，并促进依赖于Sirtl的心肌细胞分化的修复【301。同样的，在人类的血管平滑肌细胞中，随着细胞的成熟NAMPT表达上调【311，随着细胞的衰老而下调。这些NAMPT表达的改变都伴随着相应的胞内NAD水平的改变，同时以一种依赖于Sirtl的方式调节平滑肌细胞的功能。有趣的是，NAMPT的异位表达可以减少平滑肌细胞对依赖于Sirtl的激活的敏感性。在人类的软骨细胞，通过与SOX9相互作用，Sirtl被招募到软骨特异性基因的启动子区。在这个基因中NAMPT通过NAD的产生刺激Sirtl的活性和靶基因的表达。这些研究表明细胞NAD的产生是如何调控基因所影响的Sirtl的活性。最近关于NAMPT对Sirtl的活性的调节也出现在生物节律、生物钟等领域。综上所述，依赖于NAMPT的Sirtl的活性调控在肌细胞的分化成熟和敏感性上起着重要作用，增加的依赖于NAMPT的NAD产生可刺激Sirtl的活性，Sirtl的激活反过来通过与CLOCK：BMALl复合物结合作用于NAMPT的启动子区而抑制NAMPT的转录[31-33]o3．2烟酰胺单核苷酸磷酸转移酶1(NMNAT．1)由烟酰胺单核苷酸磷酸转移酶(NAMPT)所产生的NMN会进一步由NMNAT转变为NAD。在哺乳动物细胞中已发现三种NMNAT的异构体(NMNAT．1，．2，．3)。在这些异构体中，NMNAT．1仅存在于核中【34J，并且是NANAT家庭中调控Sirtl的活性的关键成员分子。使用Wld5小鼠模型【35，36J(它包含一个N端有泛素化因子与全长的NMNAT．1连接的融合蛋白)的研究揭示NMNAT．1的神经保护功能可能是Sirtl依赖性的。但在于Wld5小鼠模型神经退化的机制上仍存在争论。在部分研究中，NMNAT．1的酶学活性需要依赖于Sirtl通路的神经保护‘37，381，而对于另一些研究，结果则不尽相刚39，401。一个运用原代背根结神经原细胞移植的研究中，过表达NMNAT．1或外源性加入NAD可以34 综述产生对神经原保护作用，同时也发现NAD的保护作用也需要Sirtl的酶学活性[371。但有趣的是，NMNAT．1过表达并不改变胞内的NAD水平。暗示调控Sirtl功能的NAD应在核中而不依赖于整个胞浆NAD水平。最近研究报道，在基因调控中一种全新的依赖于NMNAT．1的Sirtl功能调节⋯。W．LeeKraus等利用全基因组分析发现，有一些基因可以由NMNAT．1和Sirtl调控，且Sirtl可以直接与其启动区结合。在这个系统中降低NMNAT．1的表达可以减少整体细胞NAD水平，并且抑制Sirtl对H4K16的去乙酰化能力。以上结果表明，NMNAT．1通过NAD的产生调控依赖于Sirtl的转录，而且NAD的生物合成酶可以被募集到靶基因的启动子区而作为转录调节的一个共调节因子。对NMNAT．1和Sirtl于靶基因的启动子区共定位可以从多方面来调节Sirtl的活性1421。例如，空间位置的临近，可以使得Sirtl更容易有效的利用NAD。另外，NMNAT．1与Sirtl在靶基因启动子区的相互作用同样可以促进变构调节而促进其中一个或是两个酶的活性【431。总之，在转录调控中，NMNAT．1与Sirtl在靶基因启动子区的共定位提示NMNAT．1在调节Sirtl活性中扮演了重要作用。4．Sirtl与炎症相关基因调控作为一个NAD依赖酶，Sirtl依据细胞的代谢状态调控基因的表达，从而适应整个机体的代谢。依赖于Sirtl的转录调控存在于多种重要的机制。首先，Sirtl可以通过改变组蛋白的去已酰化状态而调节染色质的功能，而引起转录抑制。它还可以通过招募一些其它的核酶而引起染色质、组蛋白及DNACpG岛的甲基化，而表现出广泛的表观遗传学调控的功能。其次，Sirtl可与许多转录因子相互作用或使之去乙酰化，从而参与对靶基因的调节。细胞的能量状态，特异性的NAD代谢，在Sirtl的活性调节中也起到了重要作用。Sirtl作为Sirtuins家族中被研究最多的蛋白分子，其需要NAD+作为底物进行脱乙酰作用。Sirtl是一个三型的组蛋白脱乙酰酶，调控许多信号传导通路，可以使FOX03，NF．1出，p53，Klotho，PAI心．1和组胺等去乙酰化，从而调节包括代谢、炎症、细胞衰老、细胞增殖、细胞凋亡以及DNA损伤反应(DDR)[4446J。从而阐明Sirtl在II型糖尿病，肿瘤，心血管疾病等方面的发病机理。并且在人群研究中发现Sirtl具有五个单核苷酸多肽性，证明其在人群中具有可变性[47,48】。在本节内容中我们主要讨论Sirtl在炎性反应中的药理活性。35 综述前面提到SRITl被认为是用于调控细早熟和衰老的经典抗衰老蛋白，在衰老的小鼠胚胎成纤维细胞，暴露在氧化环境下的肺上皮细胞、人内皮细胞以及巨噬细胞中Sirtl的表达量均有明显下降[49-54J。在啮齿类动物中，Sirtl也随动物的衰老而表达降低【55。571，当小鼠的Sirtl基因敲除后它们表现出体型减小以及寿命缩短的现象【5引。在机体中，衰老的细胞更容易分泌促炎症的调节因子，例如IL．6，IL．8以及基质金属蛋白酶(MMPs)，这些因子都是依赖于NF．1cB的活化而产生的。这种现象提示出衰老的细胞与细胞分泌有着密切的关系【59'60】。例如在吸烟人群中，肺部衰老的细胞中p16的高表达增加了RelA／p65磷酸化【61】，RelA／p65为NF．1(B的亚基，Sirtl与RelA／p65相互作用使得lys310残基去乙酰化，而lys310是NF．r,B转录活性的重要位剧62，6引。有研究证明在小鼠肺部，吸烟引起肺气肿患者以及单核细胞中，Sirtl可以通过RelA／p65的去乙酰化而减轻因为烟草而引起的促炎症因子的释放【52‘53,64]。当在基因水平高表达Sirtl或使用Sirtl激动剂的时候可明显减轻因为吸烟引起的NF．r,B激活以及肺部的炎症反应【5引。在小鼠肺气肿模型中使用NF．r,B抑制剂后没有出现肺部细胞的衰老【551。这些实验数据证明Sirtl通过减少肺部细胞的衰老从而减轻肺气肿症状，与NF．r,B依赖性的炎症没有依赖关系。有研究表明Sirtl是NF．1出转录的强效抑制物【631。在Sirtl和NF．心信号联系之间存在人们最感兴趣的衰老方面的问题【63，65J。仿佛说明Sirtl在通过抑制NF．r,B信号通路从而达到延长寿命的作用。而在炎症方面，最近也有了新的研究和发现mJ。作者使用HIV．1Tat蛋白结合Sirtl的去乙酰酶位点从而抑制Sirtl对NF．r．B中的组分P65的脱乙酰作用，由于Sirtl的活性收到了限制，NF．r．B的活性得到了非常大的提高，从而唤起T细胞的免疫活化作用。Tat蛋白是一个病毒性的反式激活因子，可以通过转录后调控激活HIV．1的复制和转录【6¨。较早有文献表明HIV．1Tat蛋白可以通过NF．r,B的乙酰化增加NF．1(B的反式激活效掣68】。NF．r,B作为HIV．1转录的激活剂并且增加Tat蛋白的表达，可以损伤被感染的免疫细胞【69】。同时也有文献指出，Sirtl是NF．rd3信号传导通路的有效的抑制剂，它通过对乙酰化的P65作用，从而影响NF．1cB的信号传导，这也证明了长寿基因Sirtl还是NF．1(B信号传导通路中的关键因子，主要调控炎症反应，同时也对组织的萎缩及癌症的发生发展起到调节作用。早些有报道指出Sirtl可以通过NF．r,B通路抑制炎症的发生【70J。同时Sirtl与NF．r,B互相作用可能需要36 综述Sirtl相互作用因子转变为作用样增强子1(Transducin．1ikeEnhancerofSplit．1，TLEl)。在NF．rB系统中的炎症和超活化以及HIV．1Tat蛋白诱导的加速免疫衰老中都说明了年龄相关的NF．1出系统中主要淋巴组织和细胞的活化，如小鼠的脾脏，骨髓，肠系膜和外周淋巴结。从老年小鼠脾脏中分离出T和B淋巴细胞及巨噬细胞较成年小鼠呈现出明显的NF．r,B系统活性。年龄相关的人类免疫衰老同样在T和B淋巴细胞中表现出来，并且出现免疫下降【71,72】。我们发现CD38作为NAD酶在许多有机体中发挥重要作用，CD38调控的Sirtl及其下游通路在对抗衰老，炎症以及脂质代谢等方面具有重要的药理学研究价值，未来这个领域将会出现更多令人振奋的消息。参考文献：[1]NataK，TakamuraT，KarasawaT，KumagaiT，HashiokaWjTohgoA，eta1．HumangeneencodingCD38(ADP-ribosylcyclase／cyclicADP—ribosehydrolase)：organization，nucleotidesequenceandalternativesplicing．Gene．1997；186(2)：285-92．Epub1997／02／28．[2】JacksonDGBellJI．IsolationofacDNAencodingthehumanCD38(TIO)molecule，acellsurfaceglycoproteinwithanunusualdiscontinuouspatternofexpressionduringlymphocytedifferentiation．Journalofimmunology(Baltimore，Md：1950)．1990；144(7)：2811—5．Epub1990／04／01．[3]FunaroAH，MalavasiF．，HumanCD38：aversatileleukocytemarkerwithemergingclinicalprospectives．FundamentalClin．Immun01．1995，3，101-113．【4]ZocchiE，FrancoL，GuidaL，CalderL，DeFloraA．Self-aggregationofpurifiedandmembrane··bounderythrocyteCD38inducesextensivedecreaseofitsADP·-ribosylcyclaseactivity．FEBSletters．1995；359(1)：35-40．Epub1995／02／06．[5]LeeHC．MechanismsofcalciumsignalingbycyclicADP·riboseandNAADEPhysiologicalreviews．1997；77(4)：1133-64．Epub1997／11／14．[6】deToledoFGChengJ，LiangM，ChiniEN，DousaTEADP·Ribosylcyclaseinratvascularsmoothmusclecells：propertiesandregulation．CircRes．2000；86(11)：1153-9．Epub2000／06／13．[7]HigashidaH，EgorovaA，HigashidaC，ZhongZGYokoyamaS，NodaM，eta1．SympatheticpotentiationofcyclicADP-riboseformationinratcardiacmyocytes．37 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