沙地云杉ISSR-PCR反应体系的初步优化.pdf

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1、-——48·-——江苏农业科学2014年第42卷第8期郑舒文，田有亮，白玉娥，等．沙地云杉ISSR—PCR反应体系的初步优化[J]．江苏农业科学，2014，42(8)：48—50沙地云杉ISSR—PCR反应体系的初步优化郑舒文，田有亮，白玉娥，何炎红(内蒙古农业大学林学院，呼和浩特010019)摘要：以沙地云杉叶基因组DNA为材料，采用单因素试验方法对ISSR—PCR体系中的主要成分Mg“、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物浓度、退火温度进行筛选，建立并优化沙地ISSR—PCR反应体系。结果表明，UBC835是最适引物，适宜退火温度为50℃。沙地云杉ISSR—PCR分析的最适反应体系(2

2、0PCR反应体系)为：2．0mmol／LMg“、1．0U／Tat／DNA聚合酶、0．25mmol／LdNTPs、0．25p,mol／L引物、50rig／；xL模板DNA。PCR扩增程序：94℃预变性4rain；94℃变性45S，50℃退火45s，72℃延伸2rain，40个循环；72oC延伸7rain，4℃保存。关键词：沙地云杉；叶基因组DNA；ISSR—PCR；优化中图分类号：s791．180．1文献标志码：A文章编号：1002—1302(2014)08—0048—03沙地云杉(Piceamongolwa)是中国稀有珍贵树种，集中1994年发展起来的一种微卫星的分子标记。ISSR标记呈成

3、片地分布在生态环境恶劣的内蒙古自治区以克什克腾旗的孟德尔式遗传，大部分ISSR标记为显性标记。它结合了SSR白音敖包自然保护区，形成了罕见的沙地森林。沙地云杉具和RAPD的优点，具有模板DNA用量少、质量要求低，扩增有耐旱抗寒、防风阻沙、调节气候等特点，并且生存年代久远，产物特异性强，重复性高，试验操作简便，费用较低等特点，又所以被称为沙漠上的“绿宝石”和“生物活化石”⋯。自引种比RFLP、RAPD、SSR能更多地提供遗传信息，已被广泛应用到辽宁、北京、呼和浩特成功之后J，沙地云杉不再是内蒙古于品种鉴定、遗传多样性、系统进化关系、遗传作图、基因定草原的特有树种。目前，沙地云杉的研究仍停滞在

4、生态学水位、标记辅助选择等研究，通过遗传多样性手段对沙地云平，对其遗传多样性的研究尚未见报道。杉作进一步研究。本试验以沙地云杉叶基因组为模板DNA，简单重复序列间区标记技术(inter—simplesequence分析引物、dNTPs、Mg“、TaqDNA聚合酶浓度、退火温度对repeat，ISSR)是由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewiez等于ISSR—PCR扩增的影响，建立适合沙地云杉ISSR—PCR的反应体系，为研究沙地云杉的系统进化、物种鉴定和种间杂交育收稿13期：2013—11—26种提供理论依据。基金项目：国家自然科学基金(编号：31160166)；内蒙古农业大学创新团队项

5、目。1材料与方法作者简介：郑舒文(1990一)，女，辽宁本溪人，硕士研究生，主要从事森林培育理论与技术的研究。1．1材料与试剂通信作者：何炎红。E—mail：hyh20012008@imau．edu．el。1．1．1材料试验材料来自内蒙古浑善达克沙地，种子于[12]谷祝平，徐涛．树兰原球茎增殖中体细胞胚发生的研究[J]．艺学报，2006，33(4)：915—920．兰州大学学报，1990，28(1)：76—79．[19]曾宋君，陈之林，吴坤林，等．兜兰无菌播种和组织培养研究进[13]PereiraOL，SilvaM．Twonewhosts，Ep~ndrum$ecundumandEp—展[J

6、]．园艺学报，2007，34(3)：793—796．idendmmxanthinum，fortheorchidrestSphenosporakevorkianii[20]顾德峰，赵春莉，宋彦君，等．蝴蝶兰无性快繁规模化生产的研(Raveneliaceae)inBrazil[J]．AustralasianPlantDiseaseNotes，究[J]．园艺学报，2007，34(1)：193—196．2009，4(1)：62—63．[21]范成明，李枝林，何月秋．兰花组织培养及分子生物学研究进展[14]HossainMM．Asymbiotieseedgerminationandinvitrose

7、edling[J]．园艺学报，2003，30(4)：487—491．developmentofEp／dendrum6meKunth．(Orchidaeeae)[J]．[22]张志胜，欧秀娟．墨兰的组织培养[J]．园艺学报，1995，22(3)：AfricanJoumalofBiotechnology，2008，7(20)：3614—3619．303—304．[15]LawrenceWZ．PoulterSB。Mcdonal