广东部分猪场回肠炎的流行病学调查和防治效果的观察

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学校代码：10564学号：VM20120037分类号：S855.1密级：硕士学位论文广东部分猪场回肠炎的流行病学调查和防治效果的观察龙星第一指导教师：邓衔柏副教授第二指导教师：樊福好研究员学院名称：兽医学院专业学位类别：兽医领域：无答辩委员会主席：刘为民教授中国·广州2016年6月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：学科带头人签名：日期： 摘要回肠炎也称为增生性肠炎（proliferativeenteritis，PE），是猪感染胞内劳森氏菌（Liawsoniaintracellularis，LI）引发一种具有传染性的肠道疾病，表现为急性、慢性和亚临床等不同症状的症候群，病理上以肠道粘膜增厚、肠壁细胞腺瘤样增生为主的特征性病理病变。目前，诊断猪回肠炎所采用的主要方法有：活体病理诊断，通过PCR、免疫过氧化酶等试验的方法检测粪便样品中的LI或者采用IFA、ELISA等试验方法检测胞内劳森氏菌的抗体。猪回肠炎多发生于猪只生长育肥阶段，且各个农场的疾病控制方案都不相同，导致了猪回肠炎的发病率和时间都有差异，这为生产中回肠炎的防控制造了困难。因此，需要有一种能评估农场回肠炎的感染率和感染时间，且操作简单、数据准确的检测方法，为将来实际生产和疾病防控提供指导。为研究猪回肠炎在广东部分猪场的流行情况，从2009年至2014年间对来自广TM东20个规模化猪场的粪便样品通过使用回肠炎LawsoniaFIRSTtest的诊断试剂盒进行了胞内劳森氏菌的检测，以期掌握猪回肠炎在猪场中的感染率、感染时间和发病规律，为农场控制该病提供制定策略性投药方案的依据或者制定疫苗免疫程序的方法。本次试验共检测样品724个，共检测出阳性样品403个，阳性率55.66%；不同饲养阶段的猪回肠炎的感染比例不一样，在保育前期，感染率在22.93%，而到达保育后期能达到45.06%，在生长舍达到69.15%，育肥舍能达到70.58%。在检测的农场中，很多农场都是没有明显的临床表现，也比较少见到有急性猪回肠炎的感染，现场中很多以慢性型和亚临床型为主，保育后期和生长前期为感染的高峰期，主要原因可能是由于母源抗体的下降和转群应激带来的感染风险。在育肥期、后备母猪和母猪上有着比较高的亚临床感染，他们都有带菌，却没有表现出临床症状，是猪回肠炎感染比例偏高和很难控制的主要原因之一。在制定日常的防控方案前，最好能先了解农场猪回肠炎的发病规律和感染高峰期，在疾病爆发前2周左右采取合理的防控方法，既能减少疾病带来的肠道损伤，又能为整个生产期保驾护航。在制定猪回肠炎的防控方案时，应该更加关注农场的生物安全和精细管理，辅以疫苗预防和药物保健，在选择合适药物的时候，重点关注药物的敏感性、药动学、用药周期和药物干预的时间，以达到有效控制回肠炎的目的。在常规I 的药物防控方案中，以泰妙菌素和泰乐菌素为主的方案所带来的经济效益更为突出，可以为生产带来更大帮助，产生更多的经济效益。TM关键词：猪回肠炎；胞内劳森氏菌；LawsoniaFIRSTtest；流行病学；防治效果II TheepidemiologicalinvestigationandpreventionefficacyofIleitisinlargescalepigfarmsinGuangdongLongXing（CollegeofVeterinary,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China）Abstract:Porcineproliferativeenteritisknownasnecroticileitis,isacontactintestinalinfectiousdiseaseofpigscausedbyLawsoniaintracellularis（LI）,manifestedasacute,chronicandsub-clinicaldifferentsyndromes.Histopathologicalobservedshowsthatthediseasewascharacterizedmicroscopicallybythickeningoftheintestinalmucosa,intestinalwallcellsadenomatoushyperplasia.Mucosalthickeninggenerallytakesplaceattheendofthesmallintestine,wheninfectedseverelyorcontinuesforalongtime,injuryofintestinalhyperplasiawillbeextendedtothecolonorcaecum.Atpresent,themainmethodsareusedindiagnosisofileitis:vivopathologydiagnosis,throughPCR,immuneperoxidasetesttodetectLIinfecalsamplesorusingIFA,ELISAtodetecttheantibodyofLI.It’sdifficulttodevelopeacontrolscheduleforileitisaswhichoftenoccursingrowthfatteningstage,andmedicationscheduleanddiseasecontrolscheduleofeachfarmisnotthesame,thustheincidenceandtimeofileitisisdifferent.So,asimple,accuratemethodforassessingfarmileitisinfectionandthetimeofinfectionisneededtoprovideguidancetoproductionanddiseasepreventionandcontrol.ForstudyingtheprevalenceofileitisinsomepigfarmsinGuangdong,from2009to2014,fecalsamplesof20large-scalepigfarmsinGuangdongweredetectedforLIbyuseTMofileitisLawsoniaFIRSTtestdiagnostickits.Inordertounderstandtheinfectionrate,theinfectiontime,theincidenceofLI,providepropermedicationscheduleorvaccineprogramtothefarmtocontrolthedisease.724samplesweredetected,amongwhich403sampleswerepositive,thepositiveratewas55.66%.Theinfectionratearenotthesameduringdifferentstages.Inearlynurserystage,theinfectionratewas22.93%andupto45.06%inthelatenurserystage,69.15%atgrowthhouse,70.58%finishinghouse.Thereisnoobviousclinicalsymptomandacuteinfectionisrareinmanyofthetestedfarms,mostarechronicandsubclinical.AtthelatestageofNurseryandtheearlyperiodofgrowth,thereIII wasthepeakofLIinfection,themainreasonmaybeduetothedropofmaternalantibodiesandmix-groupstress.Thereismuchhighersubclinicalinfectionsinthefatteningperiod,giltsandsows,withoutshowingclinicalsymptoms,andthat’swhyileitisinfectionratioishighanddifficulttocontrolinpigfarm.It’sbettertounderstandtheincidencerule,peakinfectionofLIbeforesettingupthescheduleofpreventionandcontrol.Takingreasonablemeasures2weeksbeforetheoutbreakofLI,whichnotonlydecreaseintestinaldamagefromdisease,butalsoisgoodandsafefortheentireproductionperiod.Whenmakingpreventionandcontrolprogramofileitis,thefarmshouldpaymoreattentiontobio-safetyandmanagement,supplementedbyvaccineandmedicine.Whenchoosingtherightdrugs,focusingondrugsensitivity,pharmacokineticsanddrugintervention,medicationcycletimeinordertocontrolileitiswell.Intheconventionaldrugpreventionandcontrolprogram,TiamulinandTylosin-orientedprogrambringsmoreprominenteconomicbenefits,canbringmorehelptoproduction,producemoreeconomicbenefits.Keywords:Porcineproliferativeenteritis;Lawsoniaintracellularis;TMLawsoniaFIRSTtest;Epidemiologicalinvestigation;preventionefficacyIV 英文缩略词或符号表缩写中文名称英文名称AbbreviationChineseNameEnglishNameLI胞内劳森氏菌LawsoniaintracellularisPPE猪回肠炎PorcineproliferativeenteritisPE回肠炎ProliferativeenteritisDNA脱氧核糖核酸DeoxyribonucleicacidIFA间接免疫荧光分析法IndirectimmunofluorescenceIHC免疫组织化学ImmunohistochemistryPCR聚合酶链式反应PolymerasechainreactionmL毫升Milliliterppm百万分之（几）PartspermillionPH酸碱度PotentialofhydrogenELISA酶联免疫吸附实验Enzymelinkedimmunosorbentassayg克GramKg千克KilogramT吨Ton16SrRNA16S核糖体RNA16SribosomalibonucleicacidV 目录1前言...........................................................................................................................................11.1病原学....................................................................................................................................11.2流行病学................................................................................................................................21.3临床症状................................................................................................................................31.3.1急性型回肠炎的临床症状.................................................................................................41.3.2慢性型回肠炎的临床症状.................................................................................................51.3.3亚临床型回肠炎的临床症状.............................................................................................51.4诊断和检测............................................................................................................................61.4.1病理学诊断技术.................................................................................................................61.4.2血清学诊断技术.................................................................................................................61.4.3分子生物学诊断技术.........................................................................................................71.4.4FirstTest检测技术..............................................................................................................81.5常用的防控方法....................................................................................................................91.5.1做好饲养管理，重视清洁和消毒.....................................................................................91.5.2疫苗的预防免疫.................................................................................................................91.5.3药物的合理选择...............................................................................................................101.5.4国外胞内劳森氏菌的净化方案.......................................................................................112.材料和方法...........................................................................................................................122.1FirstTest试剂盒的材料和方法...........................................................................................122.1.1FirstTest试剂盒的材料.....................................................................................................122.1.2FirstTest试剂盒的使用方法.............................................................................................122.1.3样品的采集.......................................................................................................................142.2猪回肠炎防治方案的设计..................................................................................................142.2.1泰妙菌素方案...................................................................................................................142.2.2泰乐菌素方案...................................................................................................................163结果.........................................................................................................................................173.1不同饲养阶段猪回肠炎的感染阳性率..............................................................................203.2不同年份猪回肠炎的感染阳性率......................................................................................21VI 3.3两种猪回肠炎防治方案的效果比较..................................................................................223.3.1泰妙菌素方案...................................................................................................................223.3.2泰乐菌素方案...................................................................................................................234讨论.........................................................................................................................................254.1关于猪回肠炎检测方法的讨论..........................................................................................254.2关于猪回肠炎流行情况的讨论..........................................................................................254.3关于猪回肠炎防治效果的讨论..........................................................................................27全文总结....................................................................................................................................30致谢............................................................................................................................................31参考文献....................................................................................................................................32VII 1前言20世纪30年代，Biester等在美国衣阿华州首次报道了猪感染PE的病变（BiesterandSchwarte,1931），随后在全球其他的养猪地区也发现了该病。然而，在接下来的多年里，人们试图弄清楚引起PE的病原，却一直都没有成功。在40多年之后，据Rowland等报道，通过对苏格兰病猪异常增生的肠道进行研究，使用电镜技术和结合银染色技术，首次观察到病原菌，这是一种弯曲状、弧状、寄生于细胞内的细菌（Rowlandetal.,1973）。这种细菌存活在被感染的肠壁上皮细胞的胞浆里，在感染的关键阶段不结合细胞膜。因此，在发现胞内劳森氏菌的前期，一直被认为是一种弯曲杆菌样的生物体、回肠的共生胞内菌或者是肠杆菌样的胞内菌（McOristetal.,1995）。这种胞内细菌在体外特殊气体环境中的成功分离和鉴定（McOristetal.,1993），终于揭开了困扰人们60多年找不到病原菌的难题。根据16SrRNA序列的分析，该病原菌跟脱硫弧杆菌有91%的相似性（Gebhartetal.,1993），与厌氧的人类华德嗜胆菌有92%的相似（Sapicoetal.,1994）。通过使用最新微生物学分类方法，McOrist等建议把这种新发现的细菌归类于脱硫弧菌科，最后，命名为胞内劳森氏菌（McOristetal.,1993），以此来表彰LawsonGHK博士，对发现PE致病原这一具有里程碑式意义的研究所作出的贡献（McOristetal.,1995）。1.1病原学胞内劳森氏菌（Liawsoniaintracellularis，LI）是一种专性的胞内寄生菌，长约1.25-1.75μm，宽约0.25-0.43μm，呈弯曲状或者弧状，末端渐细或者钝圆形，是一种典型的三层外膜作为外壁的革兰氏阴性菌，没有发现纤毛和孢子。通过观察细胞系上共培养的分离物，发现有一根长的极性鞭毛，并能够快速的运动，但是这只发生于细菌位于细胞外的时候。该菌能使用Warthin-Starry键银染色法染色，通过ModifiedZiehlNeelsen染色法，细菌可以被染成红色（McOristetal.,2000）。劳森氏菌的培养需要移植在猪肠道上皮细胞的细胞系中培养，常用的适合其生长的细胞系有IEC-18、IGPC-1651、Henle407、McCoy和IPEC-12等。并在82.2%氮气、8.8%的二氧化碳和8%的氧气的微厌氧环境中，37℃培养（Stills,1991）。有研究报道，使用LI的纯培养物，通过口服的方法感染普通的猪或者预接种小剂量非致病性病菌的猪，结果在猪肠壁上都发现了PE的特征性病变。一些早期的攻毒研究中，把病变的粘膜匀浆简单过滤，用来感染猪，也可以观察到PE的特征性病变1 （Robertsetal.,1977）。把这些猪只肠道组织做成切片，可以观察到大量胞内细菌（McOristetal.,1994），但是，在使用非感染细胞培养物接种的对照组的猪中却找不到这种病变。后来，这种利用病变肠道粘膜匀浆液攻毒的方法成为了复制PE的攻毒模型（Wilsonetal.,2002）。虽然通过分离出病原菌或者对易感猪只口服接种含有胞内劳森氏菌的病变粘膜都可以顺利的复制出PE的典型病例，而且各个年龄段未用过药的猪（新生仔猪到出栏）对口服攻毒都非常敏感，但是目前对于LI感染猪只的致病机理却还没有完全弄清楚。有些实验研究证实通过在体外条件下分离和纯培养胞内劳森氏菌，阐述了早期的细菌与细胞之间相互作用的机理。细菌进入细胞内开始时，就会在胞质内大量的增殖，在第6天时会达到感染的峰值，随后就会被释放到细胞外（McOristetal.,1995b）。然而，这些被LI感染的上皮细胞却没有了正常肠道上皮细胞的吸收功能，同时也不能发育成熟，这样，被感染的肠壁上皮细胞就会一直处于有丝分裂状态，却不能正常长成成熟的肠壁上皮细胞发挥作用，这样就导致了组织的高度增生，病程进展太久或者太快，就会导致增生组织的坏死脱落，于是容易观察到腹泻或者血便。一般在慢性感染病例中，如果同时没有伴随其他并发症的感染，肠腔内糖类和氨基酸等营养物质就会出现不能被感染的未分化成熟的肠黏膜细胞吸收的情况，这些营养物质就会随未被消化的食物一起排出体外，严重影响营养物质的吸收效率，这可能就是导致被感染猪增重缓慢和饲料转化率下降的原因之一（Gogolewskietal.,1991;RowanandLawrence,1982）。有研究表明，猪只感染3周其数量能达到峰值，50%的被感染猪只通过肉眼可以观察到腹泻，采集腹泻猪的肠道组织进行病理学观察，几乎都可以在显微镜下看到病理变化。通过口服攻毒的方法，一般小肠感染后的1-2周时间，可在大肠段发现相应的病理变化，说明随着感染时间的推移，病灶会从小肠延伸到大肠，而以增生为主的特征病变一般在感染3周后发生，且主要发生在回肠段，较少会延伸至结肠或者空肠，含有病菌的被感染的猪只的排泄物和肠道特征的增生性病变可持续4到6周（McOristetal.,1992），也有报道有可能可以持续10周。1.2流行病学回肠炎在全世界流行范围很广，潜伏期2－3周，粪便带菌可达10周，主要经口感染，病猪和带菌猪是主要的感染源，带菌的粪便，污染环境、饲料和饮水等，经消化道感染，野生动物在在该病的传播过程中起重要作用比如有：鸟类、鼠类等，另外，2 人员、车辆和设备在农场的流动也可以成为该病流行的媒介。常见的饲养管理发生改变，比如：断奶、转栏、换料、疫苗接种等，以及天气变化、环境温度变化等也可成为本病流行的诱因。目前为止，美国、阿根廷、澳大利亚、荷兰、丹麦、日本、加拿大、巴西、韩国和我国台湾地区等都有一系列的相关病例报道。据权威统计，在美国，PPE每年造成的损失高达2000万美元（MacIntyreetal.,2003），英国每年的损失约为400万英镑。有研究发现：每头猪的成本增加2英镑（欧洲），感染猪与未感染猪日增重有100克左右的差异，料肉比增加0.4，出栏期延长14天，死亡率提高1－6%，临床上持续6－8周，淘汰率高达15%。在国内，LI在猪场中的流行也非常普遍，首先由林绍荣等1999年报道了该病，并提出了相对应的诊断方法和防治方案，刘佩红等（刘佩红etal.,2007）对上海地区的10个规模化猪场通过血清学检查的方法调查了该病的流行情况。结果发现，各个猪场的感染情况都不一样，猪场间的差异也非常大，抗体阳性率从4%到34%不等。黄忠等（2006）对华南五省区的22个猪场采集了1100份血清样品，通过ELISA的方法检测，发现22个猪场均为阳性场，其中18-24周龄猪只的感染阳性率最高达到了90%。总体上，可以看出阳性率是随着猪只年龄增长而升高，但是个体之间的表现差异较大（黄忠etal.,2006）。李凯年等对吉林地区检测，所有被检验的猪场均有阳性病例，被测猪群中阳性率在23.6-64.7%，后备母猪和母猪的血清学阳性率最高，分别为83％和85％，保育早期和保育结束时，阳性率最低，在保育结束时，33%的猪被感染，发生了血清学的阳性转化。有研究表明，仔猪大部分的劳森氏菌感染发生在5-7周龄，即仔猪获得的母源抗体消失之后，而血清学转化发生在猪的8-16周龄阶段。己经被证实的传播方式是猪群之间粪口途径，因此，含有细菌的粪便是该病在猪群间传播的重要原因，但是，人们对细菌通过粪便排泄之后对猪群的二次感染动态还了解很少。一些研究也曾经报道，猪只感染后的1-3周就有细菌随粪便排出，，并且带菌猪通过粪便持续排毒时间达到10-12周（Guedesetal.,2002）。但是，人们对于猪感染后从粪便排出细菌的数量以及细菌的排泄高峰期却知之甚少。之前研究细菌排泄量是通过对连续稀释的粪便样品进行免疫突光试验来进行评估的，绿色、弯曲、有光亮的突光信号将在突光显微镜下进行计数。但是，这种方法的局限性在于结果判断的主观性太强，费时费力且检测特异性较低。此外，在世界上只有位数不多的实验室能够对样品中细菌量进行定量检测，3 因为这项试验依赖于特异性的抗体。总体来说，PE的流行病学特征包括：劳森氏菌在5-15℃条件下可以在粪便中存活2周，细菌感染剂量相对较低以及感染猪的粪便排泄物中的含菌量很高（Huertaetal.,2003）。目前还没有完全可靠的卫生消毒措施。1.3临床症状猪回肠炎的临床症状主要有三种类型：急性型、慢性型和亚临床型。其中急性型也称出血性肠炎（PHE），常好发于3-12月龄的育肥猪或者后备猪，表现为发病突然，初期粪便为暗褐色，随即变成红色，容易导致急性死亡。慢性型也叫腺瘤样增生性肠炎（PIA），一般好发于6-20周龄，临床症状主要包括粪便稀软、不成形、增重下降、料肉比变差或者猪群均匀度变差，严重时候残次猪的比例大量提高。亚临床型回肠炎多发生于6-20周龄，一般在母源抗体消失后，保育阶段开始感染，一直到肥育的晚期。主要表现生长缓慢，但并不表现腹泻症状，主要引起生长缓慢，料肉比变差等。1.3.1急性型回肠炎的临床症状急性型回肠炎也被称为“增生性出血性肠炎”，常好发于3-12月龄的育肥猪或者后备母猪，特别是好发于后备母猪，表现为突然发病，粪便为暗褐色，随即变成红色，猪只苍白，疾病进程较快，容易导致急性死亡，治疗效果不好，也常好发生于应激状态之后，常见的有饲养管理的应激比如：转栏、混群、更换饲料等，天气变化之后或者环境温度变化等。农场如果不注意一些饲养管理应激，比如将猪群赶到产房、猪群的引种、运猪车的猪只转运等过程中不注意控制应激，如果是易感猪突然发生急性感染，死亡率通常会达到12%到50%之间，造成非常大的经济损失。该病的急性型多发于成年猪，一般如果这些猪先前没有接触过胞内劳森氏菌，而且这些阴性猪一次性突然接触到大剂量的胞内劳森菌，导致健康的肠壁上皮细胞在短时间内坏死脱落，毛细血管裸露出来，造成肠道大出血，发病速度快，紧急治疗效果不明显，因此，非常容易造成猪群的大批死亡，损失惨重。在引种的过程中，后备猪如果从洁净的种猪场突然到有大量胞内劳森氏菌存在的商品场，这时发生急性回肠炎的机会就会非常高，造成的经济损失将是非常大的。如果青年猪接触较低剂量的病菌的感染的时候，一般不会发生急性型回肠炎，而会随着病程的缓慢进行而发生慢性型回肠炎或者亚临床型回肠炎。如果农场早期对猪群采取大量长时间的敏感抗生素的预防和治疗，可以减少猪群接触胞内劳森氏菌的机会，这些猪则有可能在一定的时间内保持阴性，有报道称，4 如果猪群持续口服抗生素至18周龄，停用抗生素后再对猪群进行攻毒，在这些易感猪中，大部分的猪可能发生严重的急性出血性回肠炎。1.3.2慢性型回肠炎临床症状慢性型回肠炎一般好发于6-20周龄，临床症状主要包括粪便稀软、不成形、增重下降、料肉比变差或者猪群均匀度变差，严重时候残次猪的比例大幅提高。观察到的临床症状以粪便状况不良为主，排出的粪不成形，松散有粘性，泥泞状，比较像牛粪，在严重的病例中，可能会出现液态或水样的粪便。在猪群中，一般只有10%到15%的猪只会出现临床症状，表现为同一猪栏内不间断的出现几头腹泻的猪或者一栋舍内有几栏猪会有间歇性的腹泻，可以观察到肛门附近有粘粪，粪便松软或不成形，有时会发现有未消化完全的饲料。一般发病较轻的猪只的采食量正常，而生长速度却受到严重的影响，而且因为猪只之间的个体差异，影响的程度不一样，所以导致栏舍内猪只之间的体重差异很大。部分发病严重的猪只食欲下降，采食量变小，精神状况较差，如果肠壁病变严重的猪会发生严重的持续性腹泻。一般，大部分慢性感染猪只会在感染4-10周后开始慢慢恢复正常，表现出正常的食欲，生长速率也能恢复到正常水平，少数病变严重的猪只会变成僵猪，最后淘汰。与正常猪相比，发生慢性回肠炎的猪只会推迟上市时间，造成饲料的浪费，影响栏舍的周转，严重影响经济效益。1.3.3亚临床型回肠炎的临床症状亚临床型回肠炎多发生于6-20周龄，一般在母源抗体消失后，保育阶段开始感染，一直到肥育的晚期。回肠炎的大部分病例以亚临床症状的为主，比率高达70%，一般不表现出明显的临床症状，少部分猪只会有轻微的腹泻症状或者没有，但在肥育阶段结束后，可以发现日增重减少，尾猪数量增加，整齐度变差，出栏时间变长，出栏时间总有部分猪出栏体重不够等。轻微的病例不表现出临床症状，很难被发现，一般要在上市时候才发现，但经济损失已经造成，这种情况在猪群中却是最为常见。因此猪场要想发现亚临床的病例，要做好猪场的数据统计和分析，及时更新生产数据，仔细检查外观消瘦但生长良好的猪的数量。记录各个阶段的平均日增重和饲料转化率的变化。猪只肠道发生轻微的病变时，一般局限在回肠，由于有一定的补偿作用，不会发生严重腹泻，所以不容易发现，但是实际上，轻微的损伤会引起回肠的消化和吸收机能下降，造成生长缓慢，但是轻微病变不会扩散至结肠，因此粪便中的水分吸收正常，粪便也会比较正常，这也是不容易观察到临床症状的主要原因。部分亚临床感染猪由于自身的抵抗力较弱，有一部分会发展成慢性型回肠炎，长期排出含有病菌的粪便，5 成为猪群中的隐性带毒猪而造成猪群的重复感染，因此这也是导致猪群中胞内劳森氏菌长期存在的一个主要原因。亚临床型是最容易忽视的，在养猪生产中，不太容易看见临床症状，特别是一些在数据统计不太严谨的猪场中，几乎不会被生产者发现，很多都是要等到猪群上市后发现料比变差，淘汰猪数量增多才开始去寻找原因，但经济的损失已经发生。1.4诊断和检测由于胞内劳森氏菌的人工培养非常困难，因此只能采用另外的方法进行诊断，目前比较常用的方法有病理学诊断、血清学技术、分子生物学技术和FirstTest检测。1.4.1病理学诊断技术通过对临床症状的观察，结合剖检采样，观察肠道特征性的病理变化，同时对样品采用萋-尼氏染色或者姬姆萨染色，接着对粘膜图片进行检查，通过观察病原菌，可以证实有胞内劳森氏菌的存在，这也是最为简便的技术，在一般实验室都可以操作，而且不需要复杂的设备。对感染的病变组织进行组织学检查的同时，也可以对增生性病变在形态上进行鉴别诊断。如果对病灶中的劳森氏菌进行鉴定，则可以采用固定包埋的组织进行免疫组化染色。如果没有特异性的免疫学试剂时，可以采用银染技术能够清楚的显示细胞中的劳森菌。常规方法是采用改进的Warthin-Starry银染技术一般可得到满意的结果，由于胞内劳森氏菌很小，需要在高倍镜下对感染的腺窝组织进行检查。如果采用电镜技术，是可以证实胞内劳森氏菌的存在。1.4.2血清学诊断技术血清学诊断方法对实验室和设备的要求不高，使用广泛，相比PCR的方法比较经济和便捷，适合一般基层实验室或者规模猪场的大规模筛查。常用的血清学方法有：酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）和间接免疫荧光抗体试验（IFAT）。酶联免疫吸附试验（ELISA）通常用于检测猪群中LI感染或疫苗免疫后，血清中的抗体水平，是一种非常实用的技术，以人工合成的抗原、单克隆抗原或者特殊处理过的LI菌为包被抗原，通过抗原来检测抗体水平，建立直接ELISA或间接ELISA的试验方法。在日常的使用中，该方法具有高度灵敏性和特异性，在猪只感染病菌的早期，可采用该方法检测，同时结果也容易受到不同菌株（疫苗株或野毒株）造成的影响。Holyoake等（Holyoakeetal.,1994）报道，使用发病猪的肠道粘膜匀浆，然后离6 心沉淀，通过把沉淀分离出的细菌作为抗原，成功的建立了ELISA试验方法。结果显示，通过剖检时能观察有典型病变的猪群中有75%以上的样品为阳性，但是，无典型症状的猪群中的样品也有4%阳性率，这意味着，ELISA的检测结果只能感染早期一定程度上反应猪群的感染状况，如果感染时间较长后，不能准确的表现出猪群的发病比例。但是，ELISA具有操作简便、灵敏准确、经济适用等特点，在国内外被广泛用于LI的诊断和猪场流行病学调查。间接免疫荧光抗体试验是通过标记的抗原来检测抗体，或者是通过荧光标记的抗体检测未知抗原。目前，已有很多通过IFAT方法检测LI的报道。Huerta等（Huertaetal.,2003）等报道，该报道设计了一系列双盲试验，比较通过剖检与PCR、IFAT、HE染色后组织病理学检测和warthin一Starry银染4种方法，在PPE诊断中的效果，以寻找最佳的诊断方法和各种诊断方法之间的优劣。结果发现IFAT的灵敏度为89%、特异性为97%（阳性似然率为30），与PCR检测结果相符的比例为82%，而组织病理学检测在猪屠宰后，可以当成诊断PE的一种替代方法。免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）是一种血清学免疫酶测定试验，可用于病毒感染的诊断。1PMA不需要荧光显微镜，并且着色后的微孔板非常稳定，一般可以保存数月之久，这样就能够为诊断提供更为直观的证据。免疫过氧化物酶试验主要是使用血清学免疫酶测定试验，可用来检测病毒的感染，其敏感性和特异性都较好，由于LI可感染细胞单层，因此也可采用此方法对PPE进行诊断。1.4.3分子生物学诊断技术PCR技术已广泛应用于分子生物学各个领域。目前PCR方法作为诊断方法在各种病原的检测中使用，因为其灵敏度高、特异性好、操作方便、耗时短，成为了使用频率最高的检测方法之一。PCR技术采用的是LI菌染色体DNA或16srRNA部分基因片段进行引物设计（Dittmaretal.,2003），并提取动物粪便样品中LI的DNA作为模板，通过PCR或套式PCR（nest一PCR）扩增相应基因片段，通过电泳的方法来得出结果。通过PCR方法，可以非常直观并且灵敏地观察到动物粪便中是否存在LI菌，其灵敏度远远高于病理剖检、免疫组化、组织染色、细胞接种培养等方法，这也是PCR非常流行的原因之一。伴随着PCR技术的不断革新和迅猛发展，其优点更加明显，比如检测样本需要量小、特异性高、操作简便方便、耗时短等，目前已经被各个实验室广泛接受，成为最常用LI的确诊方法之一。PCR方法检测具有高度的特异性和灵敏度，但由于其可7 能受到样品处理的回收率和粪便样本中PCR抑制因子等一些原因的影响，检测结果有可能出现假阴性。荧光定量PCR不仅检测灵敏度比普通PCR方法高，而且特异性好，并能减少污染的机会，其检测灵敏度可达到每管1个细菌。Pusterla等（Pusterlaetal.,2008）对马场的粪便进行荧光定量检测，根据LI天冬氨酸解氨酶的序列设计了可扩增大小为104bp的引物并进行了定量分析，其灵敏度为95%。1.4.4FirstTest检测技术TMLawsoniaFIRSTtest又叫回肠炎现场诊断试剂盒（免疫磁珠法，美国礼来公司拥有专利权）是德国Microcoat公司开发的，具有专利的诊断方法，也是用于现场诊断粪便中的胞内劳森氏菌的最实用的方法之一。其原理与夹心Elisa（抗体－抗原[待检病原菌]－抗体－过氧化物酶－显色物或底物）原理相似。通过包被在磁珠上的多克隆抗体来捕捉粪便中的胞内劳森氏菌，然后通过连接在多克隆抗体上的过氧化物酶（POD）催化TMB显色，通过颜色与阳性和阴性对照的比对，可以对粪便中的胞内劳森氏菌进行定性检测，得出结论，其原理如下：图1FirstTest检测原理图8 1.5常用的防控方法1.5.1做好饲养管理，重视清洁与消毒工作实行全进全出，批次管理，完善的生产记录。进一步的完善生产记录，科学计算猪只的生长速度及饲料效率有助于合理评估该病对猪群经济效益的影响。在饲养管理中，减少转群和并栏时的次数，及时调整对策应对不良环境因素的影响，比如：加强畜舍的通风，保持畜舍的合适温度，减低畜舍内氨气的浓度，合理的饲养密度，提供足够的采食空间与洁净的饮水供给等。做好农场的生物安全工作，特别注意鸟类、鼠类、害虫和工作人员携带含菌的粪便到处而传播病原菌。在引进新的种群的时候，要注意做好隔离驯化工作，及时掌握猪群中胞内劳森氏菌的感染情况，确认没有回肠炎感染压力时或者制定合适的药物干预方案，才可混群，以尽量避免急性型回肠炎的爆发。重视农场的卫生，加强农场的清洁和消毒工作，特别是在转群前后的栋舍的清扫，消毒与干燥等工作，注意要清洗干净后再喷洒消毒药。选用合适的敏感的消毒剂是控制环境中LI的最有效的防控措施之一。然而，在自然环境的条件下，一直都还没有一个科学的评估报告来评估消毒剂对LI的效果。当然，在一些体外环境中，有些消毒剂的效果也是得到了试验的验证。有一个体外实验中，研究者通过采用常规的方法来培养细菌，以检验LI的耐受能力，结果发现LI对1%碘类和3.3%季铵盐类化合物比较敏感，而对0.33%酚类混合物和0.0005%的过氧化氢或过氧乙酸有一定的耐受能力。另外，LI对1%过硫酸钾和0.001%次氯酸钠的影响也有一定的耐受力（CollinsAM,2000）。因此，在生产管理的过程中，要选择合适的消毒剂，对生产用具及时的进行清洁消毒，尤其是靴子和交叉使用的一些工具，防止细菌在栏舍和栋舍之间循环流动，并制定好完整的清洁消毒程序。1.5.2疫苗的预防免疫目前已经有商品化的回肠炎疫苗，通过口服的方式，给青年猪免疫接种一次低剂量的弱毒活疫苗可以够获得比较好的免疫水平，并能够抵抗不同毒力的劳森氏菌的攻毒感染（Krolletal.,2004）。值得注意的是该疫苗为活菌疫苗，经口服给药，因此需要关注影响疫苗活性的几个方面：在免疫前后一周内应避免使用抗生素、注意水中消毒剂的影响和饮水量的控制等。9 1.5.3药物合理的选择利用敏感药物对该病进行防控已得到全球用户的认同。但胞内劳森氏菌是专一的细胞内病原菌，寄生在肠道上皮细胞内，因此，所选药物除了对LI有高度的敏外，必须还要能够进入到肠壁上皮细胞内，且能在细胞内聚集，然后进入细胞后仍能可保持较高的药物活性。另外，由于该病主要危害在于对生长育肥猪生产成绩的影响，病程发展较慢，用药周期（最好持续两周以上时间）对药物的效果影响也比较显著，故回肠炎防控的关键是适宜药物的选择与科学的给药策略。有研究证明，通过对10种抗生素的最小杀菌浓度MBC和20种抗生素的最小抑菌浓度MIC进行一项测定，结果证明，胞内劳森氏菌对许多抗生素有耐受作用（McOristetal.,1995）。然而，通过研究试验感染猪和对商业化猪群的治疗和预防的方法，结果表明，林可霉素类、大环内脂类和截短侧耳类药物在按体重给予合适药量时最有效（Marstelleretal.,2001）。据McOrist等在1996年进行了一项试验，首先，连续给猪饲喂浓度为50ppm的泰妙菌素2天，然后把猪群暴露在LI的污染区21天，以150ppm的泰妙菌素通过口服给药，连续饲喂为7天，最后，通过观察临床症状和肠道组织的病例变化，未见相关临床症状及特征性病变。即使通过饲喂给药，较低浓度35ppm和50ppm的泰妙菌素时，也能够获得了与前面相似的结果。与药物治疗组相比时，非药物治疗的动物则有严重的特征病变、并发现带菌排泄物和血清学转化（BaumannandBilkei,2002）。有研究显示，对感染动物中，表现PE症状的猪通过饲喂使用35ppm泰妙菌素和通过饮水的给药方式，使用60ppm的泰妙菌素进行治疗时，发现两种方法均能有效减少临床症状和肠壁上的特征性病变，减低临床症状的严重程度和降低粪便中LI的数量等（Szyfteretal.,2007）。据McOrist等的研究报告，通过饲喂添加了l00ppm泰乐菌素的饲料，感染PE的猪在7天后，能观察到肠道内的病变明显被抑制了。据报道，在自然爆发PE的猪群中，通过在饲料中添加110ppm的泰乐菌素，治疗21天后，对比非药物治疗组，药物组的临床症状得到迅速的改善，腹泻明显得到了控制。Marstdlar等在2000年的报TM告中证实，通过肌肉注射泰乐菌素200（注射单位）治疗被感染猪，有效减少了临床腹泻病例的数量和肠壁的组织病变。据Bradford等（Bradfordetal.,2004）的研究，通过饮水给药的方式，给予感染10天后猪群浓度为83.3ppm泰乐菌素进行治疗，连续该方案7天后观察结果，对照组与治疗组相比，其粪便、组织PCR阳性率都较高，10 其中治疗组的生长性能也较快恢复。因此，通过注射和饮水途径，泰乐菌素控制和治疗PE的疗效得到了验证，另外，有研究证明泰乐菌素能在肠道细胞内大量聚集，这对于治疗和控制LI的感染有非常大的帮助。据McOrist等2000年进行的一个实验报道（McOristetal.,2000b），可溶于水的林可霉素-壮观霉素对欧洲猪场中LI的疗效也得到了证实。通过PCR的方法检测，证实了参与试验的猪只都有感染PE，将被感染的猪随机分成2组，分别给予7天和14天的林可霉素（21ppm）和壮观霉素（42ppm）的进行治疗，在实验进行到第3天到7天后，LI导致的腹泻就恢复了。治疗组整体的生长性能优于未治疗组，而用药7天或者是14天对猪群产生的效果几乎一样。据报道（Yenetal.,1985,Winkelmanetal.,2002），通过饲料中添加林可霉素治疗LI的感染的效果也得到证实，实验结果显示，在饲料中添加44ppm和110ppm的林可霉素连续饲喂21天能显著降低腹泻猪的数量，并显著改善猪群的平均日增重（ADG），林可霉素在控制LI的感染中可以减少临床症状的发生。然而，两种浓度的林可霉素均不能有效抑制PE的微观病变，但110ppm的林可霉素能显著降低感染猪的死亡率。目前，针对PE临床病例的治疗，青霉素，杆菌肽，氨基糖苷类如新霉素，维吉尼霉素和离子载体类药物是无效的。非抗生素如铜-锌化合物或者饲料酸味剂等也已经证明也没有治疗作用。1.5.4国外胞内劳森氏菌的净化方案在丹麦，HansBundgaard博士发现了一个清除Li的方法，当引入一个新的母猪群或全部清群，重新补栏时，该清除程序时很容易做到。就投入产出来说，成本和整个工作负荷也是可以接受的，经过几个农场的评估，被证实可行。清除后的生产数据和该场之前的数据相比较，从7－100千克日增重改善100克/天，料肉比改善0.1，有些农场甚至表现出更好的结果。所用的方法是HansBundgaard博士的缩群方法（HansBundgaardetal.,2000），所有的猪栏完全清空，清扫并用VirconS消毒。走廊和通道用氢氧化钙消毒，以杀死劳森氏菌和苍蝇的幼虫。并空栏8天，使其完全干燥。新进的SPF小母猪在隔离栏内加药14天，之后移入干净的栏舍。然后再连续用药14天。所添加药物为泰乐菌素（礼来的泰农），添加剂量为每公斤体重5mg。在开始冲洗程序之前12－24小时，不喂给饲料，以减少粪便。在转入空栏之前1小时，给母猪洗澡：高压枪冲洗，冲洗液为2%的VirconS溶液。11 做好日常的监测工作，在根除程序结束之后，每月拜访一次农场，以观察劳森氏菌的临床症状（下痢之后剖检）。当这些母猪所产仔猪达到30－40公斤体重时，对粪便采样做PCR检测；采血进行ELISA检测。在2003年到2004年期间对11个农场做清除程序，9个获得成功，成功的标准是没有临床症状，PCR和ELISA检测均为阴性。2材料和方法2.1FirstTest试剂盒材料和方法：2.1.1FirstTest试剂盒材料：（1）用于收集粪便样品的试管（收集管）20只；（2）用于收集粪便样品的的刮片20片；（3）分析试管：内含被多克隆抗体包被的磁性离子（每管2微克的劳森氏菌抗体），防腐剂：0.09%叠氮化纳24只（20只含样品的，2只阳性对照，2只阴性对照）；（4）劳森氏菌多克隆抗体过氧化物酶共轭物，冻干粉。稀释为7mL后的浓度为20.34mu/mL，冻干粉的防腐剂为：0.01%的N-甲基－Isothiazolone和0.02%的4-二甲基-氨基-安替比林2瓶冻干粉；（5）用于吸取粪便上清液的移液管（转移管）20根；（6）吸取冲洗液的移液管；吸取共轭物和显色剂的缓冲液6根；（7）粪便稀释缓冲液（含有牛血清蛋白和兔IgG的磷酸缓冲液）防腐剂：0.01%的N-甲基－Isothiazolone和0.1%的2-氯乙酰胺。1瓶，125mL；（8）冲洗液（磷酸缓冲液）；防腐剂：防腐剂：0.01%的N-甲基－Isothiazolone和0.1%的2-氯乙酰胺。1瓶，110mL；（9）共轭物溶解液（含有牛血清蛋白的磷酸缓冲液）。防腐剂：防腐剂：0.01%的N-甲基－Isothiazolone和0.1%的2-氯乙酰胺。2瓶，7mL；（10）显色缓冲液（四甲基对二氨基联苯）1瓶，15mL；（11）阳性对照（灭活的劳森氏菌抗原，含有牛血清蛋白和Tween的磷酸缓冲液）；6每管含2×10。2.1.2FirsTest试剂盒使用方法：（1）样品收集：用刮片刮取大约1g的粪便样品放进收集管中，大约在1mL线处，一定不会超过该线；12 （2）样品稀释吸取5mL的稀释缓冲液到收集管中，直到6mL线处。在添加完所有的收集管后，充分摇匀，放置在试管架上；（3）样品沉淀：在试管架上静止5分钟，让收集管中的样品发生分级沉淀；（4）样品转移：使用吸液管（2mL）吸取0.5mL的收集管上清液到分析试管中。每个样品使用不同的移液管。摇动阳性对照，将阳性对照物添加到没有使用过的分析管中。一旦上述操作完成，马上逐个地摇动每个试管，使其完全接触，然后放在试管架上；（5）培养1：在试管架上静止30分钟。在此期间要逐一轻轻摇动2－3次；（6）磁头分离：把分析管从试管架上移到磁铁试管架上，进行磁头分离，时间为3分钟；（7）冲洗1/1：慢慢倒置磁铁试管架，小心弃掉上清液。然后将试管轻轻倒置在吸水纸上，以拭去多余的水分。用吸液管吸取约0.8mL的冲洗液到每个试管中，逐一摇动试管直至所有的磁头凝集物完全溶解，然后重新放回磁铁试管架。等待重新分离（<1分钟）后，同样的方法弃掉上清液，并用吸水纸去管口水分；（8）冲洗1/2：重复上述步骤；（9）磁铁试管架上等待重新凝集分离，时间1分钟。并重复7和8；（10）溶解过氧化物酶共轭物：将溶解液导入含有冻干共轭物的的瓶子中，充分摇动后，以备使用；（11）添加共轭物溶解：用吸液管吸取0.5mL的共轭物溶解液到分析试管内，逐一从磁铁试管架上移走分析管，充分摇匀后，放在试管架上；（12）培养2：在试管架上培养20分钟，在此期间轻轻摇动2－3次；（13）磁头分离和冲洗2:从试管架上拿出分析管，放在磁铁试管架上1分钟，用于分离磁头，按照步骤7连续冲洗2遍；（14）加入显色剂：用吸液管吸取大约0.5mL的显色剂到每个分析管中，充分摇动后放在试管架上。阴性对照，将0.5mL的显色剂直接添加到没有使用过的分析管中，充分摇匀后，放在试管架上；（15）培养3：将分析管放置在试管架上7分钟；（16）读结果：将分析管放在磁铁试管架上，立即观察颜色变化：阳性的为蓝色；阴性的为透明色。13 图2检测标准透明的轻微蓝色中度蓝色深度蓝色阴性轻微阳性阳性强烈阳性2.1.3样品采集在广东省20个规模化猪场随机采集特定周龄的新鲜松软或水泥样的粪便样品，每份样品3克。粪便主要来自猪群的不同阶段：4-6周龄、8-10周龄、12-16周龄、育肥期、后备母猪与经产母猪，每阶段样品作2份重复，样品采集后立即进行现场检测。2.2猪回肠炎防治方案的设计2.2.1泰妙菌素方案试验背景：该农场在中猪阶段猪群健康度较差，均匀度不好，残次比例较高，有10%左右猪只出现顽固性下痢，治疗好了容易复发，主要表现有：咳嗽、喘气等呼吸道症状，拉稀粪、粪便不成形等消化道症状等。通过Firsttest检测，该猪场存在回肠炎的病例，且生长舍感染比例较高，同时部分猪只伴有呼吸道症状。其中有发生腹泻的猪粪便状况如下图显示：14 图3泰妙菌素试验农场发生回肠炎的猪粪便1图4泰妙菌素试验农场发生回肠炎的猪粪便2试验分组：选择同一品种，日龄、体重相近，饲养于同一栏舍的猪，随机抽签分组。共分为三组：对照组1：阿莫西林350g/T；对照组2：15%金霉素2000g/T；泰妙组：80%枝原净125g/T。试验时间：13周龄开始共30天。15 2.2.2泰乐菌素方案试验背景：该猪场猪群在保育中后期有一定比例的腹泻，发生腹泻的猪只生长速度下降，残次比例升高，导致出保育时候猪群均匀度变差。经Firsttest检测，保育中后期开始有猪只感染胞内劳森氏细菌，怀疑有发生回肠炎。其中有发生腹泻的猪粪便状况如下图显示：图5泰乐菌素试验农场发生回肠炎的猪粪便试验分组：从断奶仔猪中随机挑选，以断奶时间相近为原则（品种、胎次保持一致），分为两组进行保育舍试验。针对仔猪保健加药组合的不同，分为泰乐组和对照组，具体保健计划如下：泰乐组：8.8%泰农110ppm+200ppm阿莫西林；对照组：外买预混料。试验时间：保育期32天。饲养管理：本试验针对仔猪的饲养管理（包括防疫计划、基础饲料配方、其他常规用药等）完全一样，均按照本场原来的程序进行。数据的记录和观察：体重：试验开始时仔猪窝重，结束时窝重；成活率：保育舍成活率；详细记录各组的腹泻情况和呼吸道情况。16 3结果本调查从2009年至2014年间利用德国Microcoat公司开发的胞内劳森氏菌快速TM检测试剂盒（LawsoniaFirsttest）对广东20个规模化猪场的724份粪便样品进行胞内劳森氏菌检测。检测结果表明：所检测的20个规模化猪场95%的农场存在回肠炎感染，不同农场的感染比例也表现出不同，而且感染率随着猪只日龄增长而逐渐升高。通过如下例子叙述详细的调查过程：该农场母猪存栏1500头，分为两个分场，其中1分场母猪存栏700头，2分场母猪存栏800头，两个分场相隔5km，分开管理，药物保健程序和疫苗免疫程序相同。现场采集新鲜的粪便样品，两个分场各10个样品，其中母猪4个，保育猪2个，育肥猪4个，按照FirstTest试剂盒操作流程进行操作,检测结果如下：图61分场检测结果图中序号依次为母猪1-4号、保育5-6号、育肥猪7-10号，阳性，阴性对照17 图72分场检测结果图中序号依次为母猪1-4号、保育5-6号、育肥猪7-10号，阳性，阴性对照表1单农场2个分场猪回肠炎检测结果母猪1母猪2母猪3母猪4保育1保育2育肥1育肥2育肥3育肥41分场+++-+---++++++++++++++2分场-+----++++++++++其中母猪1号为怀孕母猪，其他3个为哺乳母猪，育肥1号为育肥前期，2号为育肥中期，3,、4号为育肥后期的猪，其中1场1号母猪样品为强阳性，保育猪样品均为阴性，4个育肥猪样品都是阳性，2场只有一个母猪样品为弱阳性，保育猪样品均为阴性，4个育肥猪样品中有2个为强阳性。按照以上的调查流程，本试验进一步调查了其中10个典型的规模化农场，其各阶段的感染阳性率如下：18 表210个典型农场不同饲养阶段猪回肠炎感染阳性率农4-6周8-10周12-16周育肥期母猪合计场阳性/阳性/阳性/阳性/阳性/阳性/总阳性编阳性率阳性率阳性率阳性率阳性率合计合计合计合计合计合计率号19/3030.00%45/9746.39%50/7566.67%12/1580.00%116/21753.45%20/60.00%3/1618.75%13/1681.25%4/666.67%9/1464.29%29/5850.00%32/633.33%5/955.56%5/683.33%3/3100.00%15/2462.50%42/366.67%4/666.67%1/250.00%5/683.33%12/1770.58%51/425.00%3/650.00%6/6100.00%4/4100.00%14/2070.00%60/40.00%2/825.00%3/475.00%2/450.00%7/2035.00%70/30.00%4/850.00%3/650.00%3/560.00%10/2245.45%80/40.00%5/862.50%8/8100.00%6/966.67%19/2965.51%92/633.33%8/1172.73%8/1266.67%5/771.43%1/333.33%24/3961.53%104/2020.00%17/2568.00%18/2378.26%5/955.56%19/2286.36%63/9963.63%合20/8623.26%96/19449.48%115/15872.78%37/5567.27%41/5278.85%309/54556.69%计从表2来看，不同农场之间的感染情况差异比较大，阳性率最高的是4号农场达到70.58%，阳性率最低的是6号农场达到35%。其中2号、6号、7号、8号农场在4-6周是阴性，没有检测到阳性样品，不同农场生长育肥猪阳性率高峰期也有所不同，其中1号和7号育肥期阳性率最高，2号、3号、5号、6号、8号和10号阳性率高峰期发生在12-16周龄，而4号和9号阳性率高峰期则出现在保育期的4-10周。这可能跟不同农场的管理水平和农场药物干预的水平有关系。通过以上的调查过程，从2009年到2014年，本试验一共调了查了20个农场，部分农场调查了多次，综合整体的检测数据，得出以下结果：19 3.1不同饲养阶段猪回肠炎的感染阳性率表320个农场不同饲养阶段猪回肠炎感染阳性率合计4-6周8-10周12-16周育肥期母猪后备母猪合计724109233201855343阳性40325105139604133阳性率55.66%22.93%45.06%69.15%70.58%77.35%76.74%90.00%80.00%70.00%60.00%50.00%40.00%阳性率30.00%20.00%10.00%0.00%合计4-6周8-10周12-16周育肥期母猪后备母猪图8不同饲养阶段猪回肠炎感染阳性的率变化表3数据显示可知，20个猪场共检测724份样品，其中总体阳性率为55.66%（403/724），其中不同阶段的猪感染比例有较大的差别，4-6周龄，22.93%；8-10周龄，45.06%；12-16周龄，69.15%；育肥期，70.58%；母猪，77.35%和后备母猪，76.74%。说明广东地区大部分猪场从8周龄～10周龄开始感染回肠炎，12周龄～16周龄达到感染高峰期，在育肥期则表现为持续感染，维持了较高的感染比例。感染率的规律则是随周龄的增加而升高，呈现一种持续性感染状态（如:后备母猪与经产母猪）。20 3.2不同年份猪回肠炎的感染阳性率表42009-2014年猪回肠炎总体感染阳性率年份（农场数）样品数阳性阳性率2009（13）18813169.68%2010（5）24113254.77%2011（5）803746.25%2012（4）682942.64%2013（5）814859.25%2014（4）662639.39%80.00%70.00%60.00%50.00%40.00%阳性率30.00%20.00%10.00%0.00%200920102011201220132014图92009-2014年猪回肠炎感染阳性率的变化本次检测的时间从2009年到2014年间，表4中可以看出不同的年份猪场回肠炎感染阳性率也表现出不同，其中有些猪场是不同年份重复检测，2009年，69.68%；2010年，54.77%；2011年，46.25%；2012年，59.25%；2013年，59.26%；2014年，39.39%。21 从结果来看，2009-2012年呈现一个逐年下降的趋势，2013年有所反弹，2014年有所下降，这可能跟猪场对于回肠炎的重视程度和当年疾病的流行情况有关系。3.3两种猪回肠炎防治方案的效果比较目前，国内常用的控制回肠炎的药物方案有泰妙菌素方案和泰乐菌素方案，根据本人在工作中收集的一些动物实验的结果可以看出，在控制回肠炎造成的临床症状和改善日增重等方面都有较好的表现。3.3.1泰妙菌素方案的结果表5泰妙菌素方案试验结果初始结束发病总增日增用料料总重淘汰成活组别头总重均重头均重死亡治疗重重量肉量率%数量kg/kg数/kg/头/kg/kgkg比kg2（共对照1头43156036.284022405687.5k98000.6223202.995.35组150kgg）2（共对照3头724.43158036.7438211555.6580.5k80.5621202.9395.35组2109kg5g）泰妙43152035.3543240055.810028800.6822802.59100组（1）生产成绩：泰妙组与对照组1和对照组2相比，在日增重，发病率和成活率三个指标上改善最好。（2）料肉比：对照组1为2.9，对照组2为2.93，泰妙组为2.59。（3）经济效益：泰妙组总增重880公斤，对照组1总增重为800公斤，对照组2为724.5公斤。泰妙组比对照组1料肉比降低0.31，比对照组2降低0.34，泰妙组总增重880公斤，按节约饲料来算，饲料按3.4元/公斤算。比对照组1节约0.31×880×3.4元/公斤＝927.5元，比对照组2节约0.34×880×3.4元/公斤＝1017元。（4）死淘率：对照组1死亡2头，淘汰1头；对照组2死亡2头，淘汰3头，泰妙组没有死亡，没有淘汰。（5）发病率：对照组1：9头，对照组2：8头，泰妙组：2头发病。可以观察到有拉稀粪、血便等消化道症状，咳嗽、喘气、呼吸困难等呼吸道症状，通过对症治疗，22 部分猪得到好转（6）泰妙组的表现：试验前7天有部分猪出现咳嗽、喘气、拉稀粪等症状，试验7天后开始好转，试验20天到结束时，猪群健康状况得到好转，可以观察到猪群皮毛光亮，没有出现咳嗽、喘气、拉稀粪、血便等症状得到明显改善。3.3.2泰乐菌素方案的结果：表6泰乐菌素方案试验结果小结腹咳初始初始结束结束总用猪束死亡日增料肉泻嗽组别体重均重总重均重料量头头率%重g比情情kgkgkgkgkg数数况况泰乐907528.36900%192621.440819901.69511组对照807198.99800%170021.338317401.77484组23 表7泰乐菌素方案现场观察表日期泰乐组对照组日期泰乐组对照组11.1812.411.1912.51头腹泻（治愈）11.205头腹泻（治愈）12.61头腹泻（治愈）11.2112.711.221头腹泻（治愈）12.811.2312.911.241头喘气12.1011.251头腹泻（治愈）12.1111.2612.122头喘气（治愈）11.2712.1311.282头喘气发烧12.14（治愈）11.2912.1511.3012.1612.112.1712.212.1812.312.19（1）泰乐组日增重为408g，对照组为383g，泰乐组料比为1.695，对照组为1.774。（2）在试验的过程中，观察到泰乐组的猪只皮肤红润，有光泽，精神状况良好，喜欢四处活动，试验开始时的平均体重偏小，到实验结束时，平均体重赶上了对照组。（3）在试验过程中，对照组有8只小猪在不同时期发生了腹泻，经过治疗均得到了好转，而试验过程中,泰乐组只有1只小猪发生腹泻，治疗后也得到好转，粪便状况好转，猪群整体均匀度得到改善。（4）在呼吸道方面，对照组有4头有发生呼吸道症状表现为咳嗽、流鼻水等，经过治疗得到好转，而泰乐组有一头发生呼吸道症状表现为咳嗽症状，经过治疗后，得到了好转。24 4讨论猪回肠炎虽然只是一个细菌病，但其在全球养猪生产中所带来经济损失确实巨大的，因为其不容易被发现，有着很高的感染比例，而且很难清除，因此，成为了每届世界猪病大会的主要话题之一。4.1关于猪回肠炎检测方法的讨论目前回肠炎活体诊断的主要方法是利用PCR、免疫过氧化酶试验检测粪便样品中的劳森氏菌或采用ELISA、IFA等检测胞内劳森菌抗体（杨小燕etal.,2010）。本文采用了最新的FirstTest检测方法，相对于传统的剖检、血清学和PCR技术检测，有着非常大的不同，剖检要有比较清晰的临床症状和特征性的病例变化才能比较容易发现，而血清学检测是一个非常实用的方法，由于回肠炎的感染在猪上就是一个动态平衡的过程，因此检出了代表有感染，没有检出不能代表没有感染。PCR技术是非常成熟的技术，特异性很高，敏感性稍差一点，对实验室的操作要求比较高。而FirstTest技术主要检查粪便中的细菌，操作方便，现场检测，现场出结果，是一个非常实用有效的方法，通过简单实用的方法，让广大农场主能够认识和了解本场回肠炎的感染和发病状况，更好的及时的采取措施，提高生产效益，同时也提高了对于回肠炎的重视程度。目前，针对猪回肠炎的检测没有统一标准，本研究采用了最新的FirstTest检测方法，为临床生产提供了一种评估农场回肠炎感染状况且操作简单，数据确切的检测方法，并为实际生产和疾病防控提供指导。4.2关于猪回肠炎流行情况的讨论表1中，可以看出感染规律：猪群在保育舍内感染压力比较小，主要还是在育肥阶段开始感染胞内劳森氏菌，生长猪的感染压力比较大，从检测中可以看到少量弱阳性的，可能跟投药有关。猪场中母猪和生长猪体内带有劳森氏菌，是主要的传染源。一方面，母猪感染后劳森氏菌自身可产生抗体，通过母乳传递给仔猪，使其获得部分被动免疫；另一方面，感染的母猪群又不断的向外界排菌，仔猪又经口感染，因此仔猪在出生后不久即可带菌。断奶后，由于母源抗体降低，加上断乳、转群、环境转变等的应激，仔猪体内劳森氏菌开始增殖，从而表现出感染率随天龄的增大而上升。回肠炎在临床上多以慢性型回肠炎出现，好发于在10－15周龄之间，出现饲料便、软便、粪便不成形，均匀度差的状况，大大影响猪场经济效益。急性出血性的病例多出现在新引进的后备猪及临出栏的肥猪（20周龄以后），造成急性的出血，甚至急性25 死亡，但发病率较低。劳森氏菌在肠壁增殖会严重破坏回肠粘膜（特别是在生长育肥期），严重影响饲料的报酬率与猪群的整体整齐度，应引起经营管理者的足够重视，避免因饲料浪费所造成的巨大经济损失。在同一个农场的两个不同分场，虽然2个分场的感染阳性率有所不同，但规律性是比较接近，保育舍保持了阴性，感染高峰期推迟到了育肥前期。据Guedes等人（Guedesetal.,2003）发现抗体阳性的母猪所产仔猪的母源抗体可持续至5周龄，可保护哺乳仔猪与保育前期猪免受劳森氏菌感染。随着母源抗体的衰减，加上保育转群应激与卫生消毒等生物安全措施不到位等，回肠炎易感性增加。但因为2个不同的分场采取了相同的药物干预方案，在保育后期添加了泰乐作为药物干预方案。因此推测，保育舍能保持阴性主要跟有较好的母源抗体保护和在母源抗体消失后的合理的药物干预方案有关系。表2中，有10个比较典型农场的检测结果，10个农场都检出了阳性，但在各个阶段的阳性比例都不太一样，其中，5号和10号农场在6周前的阳性率是20%左右，1号、3号和5号农场在6周前的感染比例达到30%左右，4号甚至达到了66.67%，而2号、6号、7号和8号农场在6周前都是阴性的，阳性高峰期出现的时间也不太一样，4号和9号农场的阳性高峰期出现在10周龄前后，而其他几个农场的阳性高峰期则都出现在12-16周龄，每个农场的实际情况和感染情况都有着比较大的区别，因此，如果通过药物进行控制，则最好需要通过检测和临床诊断来判断出农场的实际感染情况，再针对性的制定防控方案，才能取得比较好的效果。Guedes等人（Guedesetal.,2002）报道：猪在7周龄左右开始排菌，在13周龄～16周龄达到排菌高峰期。在本次调查中，除部分猪场从4周龄或6周龄开始排菌外，大多数猪场从8～10周龄开始排菌，12周龄～14周龄达到排菌高峰期，也就是说，在没有药物干预的状况下，猪群一旦感染，会持续性排菌。本调查与Guedes等人的报告基本吻合，由于各个农场的药物计划不一样，所以也导致了感染高峰期出现的时间有推迟或者延后或者弱阳性的出现，但总体上呈现一出一个规律性的变化。表3中，2009-2014年，对20个农场采集粪便，使用Firsttest试剂盒进行检测，共检测样品724个，共检测出阳性样品403个，阳性率55.66%，不同阶段的感染比例不一样，在保育前期，感染率在22.93%，而到达保育后期能达到45.06%，在生长舍达到69.15%和育肥舍能达到70.58%。在检测的农场中，很多农场都是没有发生严重的临床表现，也比较少见到有急性回肠炎的感染，现场中还是很多以慢性和亚临床为主。而保育后26 期和生长前期为开始感染的高峰期，主要原因可能是由于母源抗体的下降和转群应激带来的风险，而在育肥期、后备母猪和母猪上有着比较高的亚临床感染，他们都有带菌，却没有表现出临床症状，是猪场回肠炎感染比例偏高和很难控制的主要原因之一。表4中，在不同年份，不同农场，平均的感染比例也有所不同，其中，2009年阳性率为69.68%，2010年为54.77%，2011年为46.25%，2012年为42.64%，2013年为59.25%，2014年为39.39%，这可能跟农场对于回肠炎的关注和重视程度有很大的关系。其中，从2009年开始，很多动保公司在中国上市了很多关于回肠炎控制的产品，包括疫苗、药品等，也给国内的很多农场做了很多检测和回肠炎知识的普及，因此，很多农场主和技术人员在这个方面也有了很多的认识，从检测结果来看，从2009年到2012年综合阳性率是有一个下降的过程。然而，很多农场的最大风险还是在死亡率和淘汰率，很多农场的数据统计和计算方法也非常不完善，不能及时有效的关注回肠炎，也是重视程度不够的一个原因。根据本研究调查的结果，建议农场在制定防控方案时要考虑以下几个方面的因素：第一：重点关注母猪的感染状况，因为母猪是带菌的源头，同时产房的环境卫生管理也关系到猪场的整体感染水平；第二：考虑母源抗体的水平，母猪群健康程度高，同时有感染病菌，其传给仔猪的母源抗体就能保护较长的时间，在保育舍的感染时间可能会较晚；第三：猪群的用药方案：药物的干预会影响回肠炎的发病规律，也可能导致急性感染病例的发病率增加，造成更大的损失。4.3关于猪回肠炎防治效果的讨论泰妙菌素方案中，对照组1相对于对照组2中，在猪群的成活率，料肉比，发病率和腹泻等指标方面改善不明显，而泰妙组在试验进行到7天时，整个猪群的发病率得到有效控制，在发病率和死亡率方面与对照组相比得到改善。在整个试验结束后，泰妙组在料肉比和经济效益两个指标上，与对照组1和对照组2相比，有明显改善。泰乐菌素方案中，在30天的试验过程中，泰乐组与对照组的相比，可以观察到泰乐组在腹泻，咳嗽，成活率和料肉比四个指标方面改善明显，在试验开始时，泰农组同对照组比较在平均体重上有劣势，但是在试验结束时，两组平均体重达到一致。通过对回肠炎的两个防控方案的观察，泰妙菌素和泰乐菌素在猪群的疾病控制方面都有比较好的效果，对于回肠炎造成的腹泻有明显改善，但是用药时机要把握准确，另外，这两个药物对于猪群的呼吸道疾病控制方面也有很大作用。猪群健康水平提高，27 在料比和增重方面可以看到明显改善，在经济效益方面有较大的帮助。其中泰妙菌素方案对于宏观的临床症状的控制和生产成绩的改善有较明显的效果，这和Szyfter等的研究相吻合（Szyfteretal.,2007）。泰乐菌素方案中，试验组猪只试验开始时的体重小于对照组，但试验结束时，试验组平均体重与对照组相当，而且试验组腹泻的猪只头数比对照组要少，这与Bradford等（Bradfordetal.,2004）的研究相吻合，通过泰乐菌素的控制，临床症状能够得到明显改善，生产速度快速恢复。因此，由于不同农场回肠炎感染的情况差异比较大，需要不同的防控方案。农场间感染率的差异主要与饲养管理和药物保健方案不同有关，比如：常见的在保育期和育肥前期采用相关药物（如泰乐菌素、泰妙菌素、替米考星等）对支原体等呼吸道疾病进行干预，会同时干扰了猪群回肠炎的发生，对哺乳母猪的产前产后药物方案也会对母猪回肠炎发展规律有影响，但由于采取的药物方案主要是针对呼吸道，所达到的防治回肠炎的效果往往不理想。较少农场会针对性的对回肠炎采取药物干预措施，所以导致的结果是停药后疾病的反复。胞内劳森氏菌属于专一性的细胞内病原菌，所选药物除敏感性高外，必须能够进入到肠道细胞内且可在细胞内聚集，在进入细胞后仍可保持药物活性，在农场常规的药物使用方案中，泰乐菌素方案和泰妙菌素方案是最常用的两个方案，从两个不同农场根据实际不同的情况采取控制方案来看，两个药物在控制猪群由于回肠炎导致的下痢方面均达到的预期效果，在猪群的料肉比和疾病控制方面也起到了一定的作用，由于两个农场发病的时间和感染的情况不一样，所以采取药物干预的时间也有所不同，因此，在制定药物防控方案的时候，如果农场主能够准确掌握回肠炎的发病高峰和感染状况，对于回肠炎的控制则能达到事半功倍的效果。目前，在回肠炎的防控上，大部分农场还是采用的救火式防控，主要是等观察到急性血痢，或者较高比例的腹泻时，才会关注到猪场的损失，而采取药物治疗的措施，这种方法的后遗症是，停药后很容易复发，不容易根除。因此，在防控方法上，还是应该以预防为主，多管齐下，做好猪场的生物安全，定期的药物保健，如果条件成熟，可以考虑使用疫苗进行预防接种，定期做回肠炎的检测，掌握感染规律和感染压力，及时调整控制方案。同时，在兽医临床上，需要能够区其他疾病，特别是以下几种疾病：猪痢疾、猪沙门氏菌性肠炎、出血性肠病综合征、猪密螺旋体病感染等，并及时做好试验室检测而采取对因治疗，才能取得较好的预防和治疗效果。28 通过本调查研究，农场在制定药物防控方案的时候应注意以下几点：第一：关注药物的敏感性及其药物动力学。建议优先选择能够在肠道上皮细胞内聚集较高浓度的药物,如：泰妙菌素（100ppm）、泰乐菌素（110ppm）。第二：药物使用周期最好达到21天；第三：建议农场使用猪回肠炎FirstTest检测方法来确定药物的使用时机。29 全文总结1．本研究采用了FirstTest检测方法，为临床生产提供了一种评估农场回肠炎感染状况且操作简单，数据确切的检测方法。2．通过本研究对广东部分猪场回肠炎的流行病学调查，发现猪回肠炎广泛存在于各个猪场中，一般发病高峰期为猪群保育后期和育肥前期，猪场应加强对回肠炎的重视程度。3．通过本研究可以观察到在使用药物防控猪回肠炎时，泰妙菌素和泰乐菌素方案均能达到预期效果，建议农场在制定猪回肠炎药物防控方案时，可以优先选择泰乐菌素和泰妙菌素。4．在制定猪回肠炎的综合防控方案时，本研究建议农场先通过FirstTest检测方法及时了解回肠炎在农场中的发病和感染状况，然后再针对性的制定防控方案。30 致谢本论文是在我的导师邓衔柏老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。邓老师多次指导我的论文构思，从实验的设计思路到结果的分析和讨论，他都十分耐心的为我指导，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。邓老师一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，而且教我做人，使我终身受益。感谢我的第二指导老师樊福好研究员，从课题的选择到论文的最终完成，樊老师提出了许多宝贵意见，始终给予我细心的指导和不懈的支持。同时，还要特别感谢解剖教研室的范小龙老师对论文内容和写作的悉心指导和帮助，范老师平易近人的性格让我学习了很多。另外，还要感谢工作单位的领导和同事们对实验的安排和指导提出了很多宝贵意见，对论文的写作提供了很多帮助。此外，还要特别感谢实验室的同学：邓超、秦伟森、江映云、唐双林、曹喜峰、谭文盛等同学对我的关心和帮助。在此，谨对以上老师、同学、同事和朋友给予我的关心和帮助表示最诚挚、最衷心的感谢。最后，还要特别感谢我家人和朋友在我的求学生涯中给予我的关心和支持，他们无私的关怀和鼓励使我始终充满信心和希望，谢谢大家。龙星2016.05.3031 参考文献杨小燕,郑新添,陈杰等.闽西地区猪增生性肠炎的调查[J].动物医学进展.2010,31（10）:126-128.刘佩红，王建，沈莉萍等.上海地区猪增生性肠炎的血清流行病学调查[J].动物医学进展.2007,28（9）;108-109.黄忠，宋长绪，等.华南五省区猪增生性肠炎的血清学调查[J].中国兽医科学.2006,36（09）:748-751.BiesterHE，SchwarteLH.Intestinaladenomainswine[J].AmJPathol.1931（7）:175-185.Bradford,J.R.,N.L.Winkelman,F.P.Moreira,andG.D.Elfring,2004,EvaluationoflincomycinindrinkingwaterfortreatmentofinducedporcineproliferativeenteropathyusingaSwinechallengemodel[J].VetTher.2004,5:239-50.Baumann,D.,andG.Bilkei,2002,Effectofhighlyfermentabledietaryfiberonthedevelopmentofswinedysenteryandonpigperformanceina"Pure--CultureChallengeModel[J].BerlMunchTierarztlWochenschr.2002,115:37-42.DittmarM,HoelaleK,etal.Diagnosisofporcineproliferativeenteropathy:DetectionofLawsoniaintraeellularisbyPathologiealexaminations,PolymerasechainReactionandcellcultureinoculation[J].VetMedBInfectDisVetPublieHeath.2003,50（7）:332一338.GebhartCJ，BamsSM，McOristS，LinGF，LawsonGH.Ilealsymbiontintracellularis，anobligateintracellularbacteriumofporcineintestinesshowingarelationshiptoDesulfovibriospecies[J].Int.J.Syst-Bacteriol.1993（43）:533-538.GogolewskiRP，CookRW，BatterhamES.Suboptimalgrowthassociatedwithporcineintestinaladenomatosisinpigsinnutritionalstudies[J].AustVetJ.1991（68）:406-408.GuedesRM,GebhartCJ.ComparisonofintestinalmucosahomogenateandpurecultureofthehomologousLawsoniaintracellularisisolateinreproducingproliferativeenteropathyinswine[J].VetMicrobiol.2003（93）:159-166.GuedesRM,GebhartCJ,ArmbrusterGA,etal.Serologicfollow-upofarepopulatedswineherdafteranoutbreakofproliferativehemorrhagicenteropathy[J].VetRes.2002,66（4）:258-263.HolyoakePK,CutlerS,CapleIW,etal.Enzyme-LinkedImmunosorbertAssayforMeasuringIlealSymbiontIntracellularSpecificImmunologlobinGResponseinSeraofpigs[J].ClinMicrobiol.1994（32）:1980-1985.HuertaBA,Arenas,etal.Comparisonofdiagnostictechniquesforporcineproliferativeenteropathy（Lawsoniaintracellularisinfection）[J].JournalofComparativePathology.2003,129（2-3）:179-185.H.Bundgaard.AttempttoeliminateLawsoniaIntracellularisinanewhighheathsowherd.IPVS,2000.KrollJ,RoofMB,McOristS.Evaluationofpro-tectiveimmunityinpigsfollowingoraladministrationofanavirulentlivevaccineofLawsoniaintracellularis[J].VetRes.2004,65:559-565.McOristS，MaclntyreN，StokesCR，LawsonGHK.Immunocytologicalresponsesintheporcine32 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