《小胶质细胞的激活途径对神经发生的影响及其在抑郁症病理中的意义》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
电子科技大学UNIVERSITYOFELECTRONICSCIENCEANDTECHNOLOGYOFCHINA博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目小胶质细胞的激活途径对神经发生的影响及其在抑郁症病理中的意义学科专业生物医学工程学号201511090110作者姓名张进强指导教师游自立教授 分类号密级注1UDC学位论文小胶质细胞的激活途径对神经发生的影响及其在抑郁症病理中的意义（题名和副题名）张进强（作者姓名）指导教师游自立教授电子科技大学成都（姓名、职称、单位名称）申请学位级别博士学科专业生物医学工程提交论文日期2018.3.18论文答辩日期2018.6.4学位授予单位和日期电子科技大学2018年6月答辩委员会主席张志珺评阅人杨足君周红顾万君ZJ11146ZJ11030注1：注明《国际十进分类法UDC》的类号。 电子科技大学博士学位论文TheeffectofmicroglialactivationpathwayonneurogenesisanditssignificanceinthepathogenesisofdepressionADoctoralDissertationSubmittedtoUniversityofElectronicScienceandTechnologyofChinaDiscipline:BiomedicalEngineeringAuthor:ZhangJinqiangSupervisor:Prof.YouZiliSchool:SchoolofLifeScienceandTechnology 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方夕卜，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得电子科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表不谢意。：｛月作者签名曰期：州日＾／弥＋论文使用授权本学位论文作者完全了解电子科技大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权电子科技大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后应遵守此规定）／作者签名：导师签名：＿曰期年月曰＾６ｆ 摘要摘要抑郁症是一种基因与环境交互作用所致的系统性疾病，该疾病的病因复杂，而且有着很强的异质性，因此，抑郁症的发病机制尚不清楚。全球科学家分别从神经环路、单胺递质、神经发生、表观遗传等角度对其病理机制进行了深入探索，尽管在抑郁的治疗方面也取得了长足的进步，然而，现有的抗抑郁药物还有很大的改善空间。在开发快速、安全、有效的抗抑郁药物之前，迫切需要弄清抑郁症的分子机制。本研究中，我们以慢性温和应激的小鼠作为抑郁模型，研究小胶质细胞的不同激活途径在抑郁症发生中的作用，并进一步探究其作用机制。首先，我们采用系统的行为学检测，从慢性温和应激的小鼠中筛选出了应激高敏感小鼠和应激低敏感小鼠。并检测了多个脑区中的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的形态学变化。我们发现在应激易感型小鼠的海马中，小胶质细胞表现出明显的激活特征，而且海马中小胶质细胞的激活与抑郁症状呈正相关。这一结果表明小胶质细胞参与了抑郁症的调节。我们进一步确定了海马的CA1和DG这两个亚区的小胶质细胞在应激易感的小鼠中表现出显著的激活状态。结合qPCR、ELISA和免疫组织化学染色等技术，我们揭示了应激易感性与海马区的小胶质细胞的M1型激活呈正相关，与小胶质细胞的M2型激活呈负相关。IL-4是诱导M2型小胶质细胞的最主要的细胞因子之一，我们的研究结果表明IL-4的表达水平在应激易感型的小鼠的海马中显著减少，但在应激抵抗型的小鼠海马中显著增加。通过相关性分析后，我们发现应激的易感性与海马区IL-4信号的减弱有关。为了证实这一发现，我们建立了Cre/LoxP系统，成功在海马区特异性敲低小胶质细胞的IL-4受体，并证明下调海马区小胶质细胞的IL-4受体能够加重应激小鼠海马区的炎症反应，同时能够增加小鼠对应激的易感性。这些发现揭示了海马区的IL-4在抑制M1型小胶质细胞及调节应激易感性中发挥了重要作用。其次，我们构建了AAV-IL-4腺相关病毒载体，采用脑立体定位注射将AAV-IL-4注射到抑郁小鼠的双侧海马，检测结果表明AAV-IL-4在小鼠的海马区能够稳定表达，同时能够改善小鼠的抑郁样行为。我们进一步从分子、细胞及组织学上揭示了海马区的IL-4能够诱导小胶质细胞向M2a表型激活，这种小胶质细胞能够抑制M1型小胶质细胞的活化。如果用Cre/LoxP系统特异性敲低海马区小胶质细胞的IL-4受体，会减少了IL-4诱导的M2a小胶质细胞数量，同时阻断对M1小胶质细胞的抑制作用，最终阻断了IL-4的抗抑郁效果。这些结果表明了IL-4的抗抑郁效果依赖于海马区的M2a型小胶质细胞。I 摘要然后，我们进一步探索了IL-4诱导的M2a型小胶质细胞的抗抑郁机制，通过免疫组织化学染色，我们发现抑郁小鼠的海马神经发生显著减少，同时伴随着海马的萎缩。相关性分析结果表明，抑郁样行为与海马神经发生的减少紧密相关。在抑郁小鼠的海马中上调IL-4的水平能够增加增殖的神经前体细胞数量，同时能够促进神经前体细胞的分化、存活和成熟，最终修复了应激导致的海马萎缩。若采用替莫唑氨抑制海马的神经发生，IL-4的抗抑郁效果会被抑制，表明IL-4的抗抑郁作用是通过促进海马的神经发生。若敲低海马区小胶质细胞的IL-4受体，能够阻断IL-4的促神经发生作用，表明IL-4的促神经发生作用依赖于小胶质细胞。为了进一步证实这一发现，我们从小鼠的海马中分离出小胶质细胞和神经干细胞做体外研究，采用transwell和条件培养研究小胶质细胞激活途径与神经干细胞的相互关系，研究结果表明，从抑郁模型小鼠的海马中分离出的小胶质细胞能够抑制神经干细胞增殖、分化和迁移，然而，从AAV-IL-4注射的抑郁小鼠的海马中分离出的小胶质细胞能促进神经干细胞的增殖、分化和迁移，并且小胶质细胞主要是通过非接触依赖的方式来影响神经干细胞。我们在原代培养的细胞实验中进一步证明了IFN-γ诱导的M1型小胶质细胞会抑制神经干细胞的增殖、分化和迁移，而IL-4诱导的M2a型小胶质细胞能促进神经干细胞的增殖分化和迁移。这些结果表明IL-4的抗抑郁作用主要通过诱导M2a型的小胶质细胞来促进神经发生，从而改善抑郁样行为。最后，我们探究了M2a型小胶质细胞的促神经发生机制。在体内实验中，我们发现，抑郁小鼠的海马中BDNF水平显著降低，借助腺相关病毒上调IL-4的表达能够显著增加海马中BDNF的表达。通过免疫组织化学染色，我们发现IL-4介导的BDNF主要表达在M2a型的小胶质细胞上。敲低海马区小胶质细胞IL-4受体能够减少BDNF阳性的小胶质细胞数量。相关性分析结果表明BDNF阳性的小胶质细胞数量与神经发生呈正相关。这些结果表明了IL-4通过诱导M2a的小胶质细胞来促进BDNF的分泌，从而起到促神经发生和抗抑郁作用的。我们采用体外实验验证了M2a型小胶质细胞分泌的BDNF在促进神经干细胞增殖、分化、存活和迁移中的作用。我们用BDNF的中和抗体或BDNF的受体拮抗剂阻断BDNF信号，发现M2a小胶质细胞的促神经发生作用能够被有效阻断。揭示了IL-4诱导的M2a型小胶质细胞促进神经发生是依赖于BDNF。综上所述，海马区M1型的小胶质细胞激活在抑郁症的发生和发展过程中起了很重要的作用，它通过增加分泌炎症介质，损伤海马的神经发生，导致海马功能异常，从而启动或加重了抑郁症的生理病理；而IL-4诱导的M2a型的小胶质细胞能够保护大脑免受应激的损伤，这种保护机制包括两个部分：一方面，M2a型II 摘要的小胶质细胞分泌抗炎介质，抑制小胶质细胞在应激时向M1型极化，减少了促炎性细胞因子的增加；另一方面，M2a型的小胶质细胞增加神经营养因子的分泌，促进海马的神经发生和组织重构，其中BDNF在这个过程中起到关键性的作用。关键词：抑郁症，小胶质细胞，IL-4，神经发生，BDNFIII ABSTRACTABSTRACTDepressionisacomplexsystemdiseasecausedbytheinteractionbetweengenesandtheenvironment.Theetiologyofthediseaseiscomplexandhighlyheterogeneous,sothepathogenesisofdepressionisunclear.Globalscientistshaveexploredthepathologicalmechanismofdepressionfromtheperspectiveofneuralcircuits,monoaminetransmitters,neurogenesisandepigenetics.Althoughgreatprogresshasbeenmadeinthetreatmentofdepression,thereisstillmuchroomforimprovementintheexistingantidepressantdrugs.Beforedevelopingthefast,safeandeffectiveantidepressantdrugs,itisurgenttounderstandthemolecμLarmechanismsofdepression.Inthisstudy,weusedchronicmildstressmiceasamodelofdepressiontostudytheroleofdifferentactivationpathwaysofmicrogliainthedevelopmentofdepression,andfurtherexploreditsmolecμLarmechanism.First,weusedsystematicbehavioralteststoscreenouthigh-sensitivemiceandlow-sensitivemicefromchronicmildstressmice.Themorphologicalchangesofneurons,astrocytesandmicrogliainseveralbrainregionswereexamined.Wefoundthatmicrogliashowedobviousactivationcharacteristicsinthehippocampusofthestress-susceptiblemice.Andtheactivationofmicrogliainhippocampuswaspositivelycorrelatedwithdepressivesymptoms.TheseresμLtsshowedthatmicrogliawereinvolvedintheregμLationofdepression.WefurtherdeterminedthatthemicrogliaintheCA1andDGofhippocampusshowedsignificantactivationinthestress-sensitivemice.CombiningthetechniquesofqPCR,ELISAandimmunohistochemicalstaining,wehaverevealedthatstresssusceptibilityispositivelycorrelatedwithM1activationofmicrogliainhippocampusandnegativelycorrelatedwithM2activationofmicroglia.IL-4isoneofthemostimportantcytokinesinducingM2-typemicroglia.OurresμLtsshowedthattheexpressionlevelofIL-4wassignificantlyreducedinthehippocampusofthehigh-sensitivemice,butincreasedsignificantlyinthehippocampusofthelow-sensitivemice.Aftercorrelationanalysis,wefoundthatthesusceptibilityofstresswasrelatedtotheweakeningofIL-4signalinhippocampus.Toconfirmthisfinding,wehaveestablishedCre/LoxPsystemtodownregμLatethemicroglialIL-4receptorsinthehippocampus.WedemonstratedthatknockdownofmicroglialIL-4receptorinthehippocampuscoμLdaggravatetheinflammatoryresponseinthestress-treatedmice.IV ABSTRACTItcanalsoincreasethesusceptibilityofmicetostress.ThesefindingsrevealedthattheIL-4inthehippocampusplaysanimportantroleininhibitingM1-typemicrogliaandregμLatingstresssusceptibility.Secondly,weconstructedtheadeno-associatedvirusvectorwhichencodedIL-4expression.TheAAV-IL-4wasinjectedintothebilateralhippocampusofCMS-treatedmicebystereotacticinjectionofbrain.TheresμLtsshowedthatAAV-IL-4coμLdbestablyexpressedinthehippocampusofmiceandcoμLdimprovethedepressive-likebehaviorsinmice.WefurtherrevealedthatIL-4inthehippocampuscoμLdinducetheactivationofmicrogliatoM2aphenotypeinmolecμLar,cellμLarandhistologicalterms.ThesemicrogliacoμLdinhibittheactivationofM1-typemicroglia.IfknockdownthemicroglialIL-4receptorinhippocampususingCre/LoxPsystem,thenumberofM2amicrogliacoμLdbereducedinAAV-IL-4injectedmice,andtheinhibitionofM1microgliaisblocked,aswellastheantidepressanteffectofIL-4isfinallyblocked.TheseresμLtssuggestthattheantidepressanteffectofIL-4dependonM2amicrogliainthehippocampus.ThenwefurtherexploredtheantidepressantmechanismofIL-4-inducedM2a-typemicroglia.Throughimmunohistochemicalstaining,wefoundthathippocampalneurogenesisweredecreasedsignificantlyindepressivemousemodel,accompaniedbyatrophyofthehippocampus.TheresμLtsofcorrelationanalysisshowedthatdepressive-likebehaviorswerecloselycorrelatedwiththedecreaseofhippocampalneurogenesis.UpregμLatingthelevelofIL-4inthehippocampusofCMS-exposedmicecoμLdincreasethenumberofneuralprogenitorcellsthatproliferate.Atthesametime,itcoμLdpromotethedifferentiation,survivalandmaturationofNSCs,andfinallyrepairtheatrophichippocampuscausedbystress.Ifusethetemozolomidetoblockhippocampalneurogenesis,theantidepressanteffectofIL-4coμLdbeinhibited.TheseresμLtssuggestthatIL-4improvedepressive-likebehaviorsbypromotinghippocampalneurogenesis.IfknockdownthemicroglialIL-4receptorinthehippocampus,thepro-neurogenesiseffectofIL-4coμLdbeinterrupted.Thesedataindicatedthatthethepro-neurogenesiseffectofIL-4dependsonM2a-typemicroglia.Tofurtherconfirmthesefindings,weisolatedthemicrogliaandneuralstemcellsfromthehippocampusofmiceandstudiedtherelationshipbetweentheactivationpathwayofmicrogliaandneuralstemcellsbytranswellandconditionedcμLture.AndtheresμLtsshowedthatthemicrogliaisolatedfromthehippocampusofthedepressivemodelmiceV ABSTRACTinhibitedtheproliferation,differentiationandmigrationofNSCs.However,themicrogliaisolatedfromthehippocampusoftheIL-4-injectedmicepromotedtheproliferation,differentiationandmigrationofneuralstemcells.Moreover,themicrogliaaffectneuralstemcellsmainlythroughnon-contactdependence.IntheprimarycμLturedcellexperiment,wefurtherdemonstratedthatIFN-γ-inducedM1microgliainhibitedtheproliferation,differentiationandmigrationofNPCs,whileIL-4-inducedM2amicrogliacoμLdpromotetheproliferation,differentiationandmigrationofneuralstemcells.TheseresμLtssuggestthattheantidepressanteffectofIL-4byinducingM2a-typemicrogliatopromoteneurogenesis.Finally,weexploredthemechanismofM2a-typemicrogliainpromotingneurogenesis.Invivoexperiments,wefoundthatthelevelofBDNFdecreasedsignificantlyinthehippocampusofmousemodelofdepression.TheexpressionofBDNFinthehippocampuscoμLdbesignificantlyincreasedbyIL-4.Throughimmunohistochemicalstaining,wefoundthatIL-4mediated-BDNFwasmainlyexpressedonM2a-typemicroglia.KnockdownofthemicroglialIL-4receptorinlowhippocampusreducedthenumberofBDNF-positivemicroglia.TheresμLtfromcorrelationanalysisshowedthatthenumberofBDNF-positivemicrogliawaspositivelycorrelatedwithhippocampalneurogenesis.TheseresμLtssuggestthatIL-4-inducedM2a-typemicrogliaincreasedthesecretionofBDNF,thuspromotingneurogenesisandimprovingdepressive-likebehaviors.InvitroexperimentsweremadetoverifytheroleofBDNFsecretedbyM2a-typemicrogliainpromotingtheproliferation,differentiation,survivalandmigrationofneuralstemcells.WeusedBDNFneutralizingantibodiesorBDNFreceptorantagoniststoblockBDNFsignals,andfoundthatpro-neurogenesiseffectsofM2a-typemicrogliaiseffectivelyblocked.Itwasrevealedthatthepro-neurogenesiseffectsofIL-4-inducedM2a-typemicrogliaweredependentonBDNFpathway.Insummary,M1-activatedmicrogliaplayanimportantroleintheoccurrenceanddevelopmentofdepression.TheincreasedinflammatorymediatorsofM1-activatedmicrogliadamagedthehippocampalneurogenesis,leadstoabnormalhippocampalfunctionanddepressive-likebehaviors.Incontrast,IL-4-inducedM2amicrogliaprotectthebrainfromstress-induceddamagebyincreasingthesecretionofneurotrophicmediators.Thisprotectivemechanismconsistsoftwoparts.Ononehand,M2a-typemicrogliasecreteanti-inflammatorymediatorstoinhibitmicroglialM1polarizationVI ABSTRACTduringstress.Ontheotherhand,M2amicrogliasecreteneurotrophicfactorstopromotehippocampalneurogenesisandtissueremodeling,inwhich,BDNFplaysakeyroleinthisprocess.Keywords:Depression,Microglia,IL-4,Neurogenesis,BDNFVII 目录目录第一章绪论..................................................................................................................11.1小胶质细胞介导的神经炎症与抑郁症...........................................................11.1.1抑郁症与炎症........................................................................................11.1.2小胶质细胞与中枢神经系统的免疫调节............................................21.1.3抑郁症与小胶质细胞的激活................................................................41.2抑郁症和神经发生...........................................................................................81.3特定表型的小胶质细胞对海马区神经发生的作用.......................................91.3.1静息状态的小胶质细胞对神经发生的作用........................................91.3.2经典激活的小胶质细胞对神经发生的作用......................................101.3.3替代激活的小胶质细胞对神经发生的作用.......................................111.4脑源性神经营养因子与抑郁症.....................................................................121.5本论文研究的目的和意义.............................................................................131.6本论文的研究内容及结构安排.....................................................................141.6.1研究内容..............................................................................................141.6.2论文内容安排......................................................................................15第二章小胶质细胞的表型与应激敏感性的关系探究..............................................162.1引言.................................................................................................................162.2实验材料.........................................................................................................182.2.1实验动物..............................................................................................182.2.2慢性温和应激（CMS）......................................................................182.2.3行为学检测..........................................................................................182.2.4动物筛选..............................................................................................192.2.5免疫组织化学染色..............................................................................192.2.6实时荧光定量PCR..............................................................................202.2.7酶联免疫吸附测试..............................................................................222.2.8蛋白免疫印记......................................................................................222.2.9统计学分析..........................................................................................222.3结果.................................................................................................................232.3.1应激敏感型与应激抵抗型动物的行为学差异..................................232.3.2海马区小胶质细胞与应激易感性相关联..........................................24VIII 目录2.3.3星形胶质细胞在应激敏感型与应激抵抗型动物的海马中无明显差异....................................................................................................................282.3.4小胶质细胞相关的炎症因子在应激敏感型与应激抵抗型动物的海马中的差异表达............................................................................................292.4讨论.................................................................................................................322.5本章小结.........................................................................................................35第三章下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对小鼠应激易感性的影响.................363.1引言.................................................................................................................363.2材料与方法.....................................................................................................373.2.1实验动物..............................................................................................373.2.2慢性温和应激及阈下应激..................................................................383.2.3行为学检测..........................................................................................383.2.4动物筛选..............................................................................................383.2.5小胶质细胞培养..................................................................................383.2.6LV-LoxP-CMV-GFP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα转染.....................393.2.7percoll法分离小胶质细胞.................................................................393.2.8LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα慢病毒注射............................393.2.9免疫组织化学染色..............................................................................393.2.10实时荧光定量PCR.............................................................................393.2.11酶联免疫吸附测试............................................................................393.2.12蛋白免疫印记....................................................................................393.2.13统计学分析........................................................................................403.3结果.................................................................................................................403.3.1海马的IL-4水平与应激敏感的相关性.............................................403.3.2海马的IL-4水平与炎症因子的相关性.............................................413.3.3LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα慢病毒注射对IL-4Rα的影响423.4.4下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对应激敏感性的影响..............443.4.5下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对炎症因子表达的影响..........463.4讨论.................................................................................................................483.5本章小结.........................................................................................................50第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响.............514.1引言.................................................................................................................514.2材料与方法.....................................................................................................53IX 目录4.2.1实验动物..............................................................................................534.2.2慢性温和应激......................................................................................534.2.3行为学检测..........................................................................................534.2.2AAV-IL-4腺相关病毒制备...............................................................534.2.5AAV-IL-4注射...................................................................................544.2.6LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα慢病毒注射.............................544.2.7免疫组织化学染色..............................................................................544.2.8实时荧光定量PCR..............................................................................554.2.9酶联免疫吸附测试..............................................................................554.2.10蛋白免疫印记....................................................................................554.2.11统计学分析........................................................................................554.3结果.................................................................................................................554.3.1腺相关病毒介导的海马区IL-4的特异性表达及潜在抗抑郁作用.554.3.2上调海马的IL-4水平对应激小鼠的小胶质细胞形态学的影响.....574.3.3上调海马的IL-4水平对应激小鼠的炎症水平的影响.....................614.3.4上调海马的IL-4水平对应激小鼠的抑郁样行为的影响.................644.3.5下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对胶质细胞的影响.................654.3.6下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对IL-4抗抑郁效果的影响....704.4讨论.................................................................................................................714.5本章小结.........................................................................................................74第五章调节海马区的IL-4及IL-4受体表达对神经发生的影响............................765.1引言.................................................................................................................765.2材料与方法.....................................................................................................775.2.1实验动物..............................................................................................775.2.2慢性温和应激......................................................................................775.2.3行为学检测..........................................................................................775.2.4AAV-IL-4注射....................................................................................775.2.5LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα慢病毒注射.............................775.2.6BrdU注射............................................................................................785.2.7免疫组织化学染色..............................................................................785.2.8实时荧光定量PCR..............................................................................785.2.9统计学分析..........................................................................................785.3结果.................................................................................................................78X 目录5.3.1海马的神经发生与抑郁样行为的相关性..........................................785.3.2上调海马的IL-4水平对应激小鼠的海马神经前体细胞增殖和分化的影响............................................................................................................805.3.3上调海马的IL-4水平对应激小鼠的海马神经前体细胞成熟和存活的影响............................................................................................................815.4.4下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对IL-4的促神经发生效果的影响....................................................................................................................825.4.5阻断海马神经发生对IL-4抗抑郁效果的影响.................................835.4讨论.................................................................................................................855.5本章小结..........................................................................................................88第六章调节小胶质细胞的激活状态对神经干细增殖、分化、存活和迁移的影响........................................................................................................................................896.1引言.................................................................................................................896.2材料与方法.....................................................................................................906.2.1体内小胶质细胞分离..........................................................................906.2.2原代小胶质细胞培养..........................................................................906.2.3原代神经干细胞培养..........................................................................906.2.4原代神经元培养..................................................................................916.2.5小胶质细胞条件刺激..........................................................................916.2.6小胶质细胞与神经干细胞共培养......................................................916.2.7神经干细胞的条件培养......................................................................926.2.8免疫组织化学染色..............................................................................926.2.9实时荧光定量PCR..............................................................................926.2.10酶联免疫吸附测试............................................................................926.2.11统计学分析........................................................................................926.3结果.................................................................................................................926.3.1IL-4和IFN-γ对原代培养的小胶质细胞的影响..............................926.3.2IL-4或IFN-γ激活的小胶质细胞对神经干细胞的增殖、分化的影响........................................................................................................................946.3.3海马中分离的小胶质细胞短期内对神经干细胞增殖、分化和迁移的影响................................................................................................................966.3.4海马中分离的小胶质细胞分泌物对神经干细胞增殖、分化和存活的影响................................................................................................................99XI 目录6.3.5海马中分离的小胶质细胞对神经元突触生长的影响....................1006.4讨论...............................................................................................................1016.5本章小结.......................................................................................................102第七章BDNF通路在替代激活的小胶质细胞介导的神经发生中的作用............1037.1引言...............................................................................................................1037.2材料与方法...................................................................................................1037.2.1实验动物............................................................................................1037.2.2慢性温和应激....................................................................................1047.2.3行为学检测........................................................................................1047.2.4动物筛选............................................................................................1047.2.5LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα慢病毒注射...........................1047.2.6AAV-IL-4病毒注射.........................................................................1047.2.7percoll法分离小胶质细胞...............................................................1047.2.8小胶质细胞培养................................................................................1047.2.9神经干细胞培养................................................................................1047.2.10原代神经元培养..............................................................................1047.2.11小胶质细胞条件刺激......................................................................1047.2.12小胶质细胞与神经干细胞共培养..................................................1047.2.13神经干细胞的条件培养..................................................................1057.2.14BDNF中和抗体处理......................................................................1057.2.15K252a药物处理..............................................................................1057.2.16免疫组织化学染色..........................................................................1057.2.17实时荧光定量PCR..........................................................................1057.2.18酶联免疫吸附测试..........................................................................1057.2.19蛋白免疫印记..................................................................................1057.2.20统计学分析......................................................................................1057.3结果...............................................................................................................1057.3.1海马的BDNF水平与海马IL-4水平和应激敏感性相关..............1057.3.2上调海马的IL-4水平显著增加小胶质细胞源性的BDNF水平..1067.3.3阻断BDNF通路显著抑制M2a型小胶质细胞的的促神经发生效果的影响..........................................................................................................1087.4讨论................................................................................................................1127.5本章小结........................................................................................................112XII 目录第八章全文总结与展望.............................................................................................1148.1本论文工作总结............................................................................................1148.2后续工作展望................................................................................................116致谢...........................................................................................................................118参考文献.......................................................................................................................119攻读博士学位期间取得的成果..................................................................................133XIII 第一章绪论第一章绪论1.1小胶质细胞介导的神经炎症与抑郁症1.1.1抑郁症与炎症抑郁症一种情感障碍性疾病，以显著而持久的心境低落为主要特征。临床症状主要表现为：睡眠障碍、情绪低落、快感缺失、认知损伤，严重患者会产生自杀企图或行为,甚至发生精神木僵；部分患者会表现出明显的焦虑和极端行为的症状；重度患者会出现幻觉、妄想等精神病性症状。随着社会竞争的日趋激烈，以及来自学习和工作或家庭的持续不断的压力，抑郁症的发病率呈逐年增加趋势，且发病年龄日渐年轻化。目前，抑郁症已经跻身为世界第四大疾病，初步估计，[1]到2020年抑郁症可能成为第二大疾病。抑郁症给患者及其家属造成了巨大的痛苦，也给社会带来沉重的经济负担。重度抑郁症已经被认为是一个严重的公共卫[2]生问题，据统计，抑郁症影响着全球大约3亿5千万人。此外，每年大约有1百万人因此而自杀，这意味着每天约有3000人死于抑郁症。[3]图1-1应激导致的抑郁与炎症的关系1 电子科技大学博士学位论文[4]近年来，“单胺假说”已经是抑郁症中最被广泛接受的假说。然而，一系列新的研究显示，神经可塑性或细胞内级联信号不能有效地反映情绪调节异常，[5]。这预示着单胺假说并不足以揭示抑郁症的发病机制。研究发现患有自身免疫性和炎症性疾病（如糖尿病和纤维肌痛）的患者会出现抑郁症状，因此有人提出[6]抑郁症可能与炎症有关。同样，从抑郁症患者的血清中检测到了促炎性细胞因子（如IL-1β，IL-6，IL-8，IL-12，IFN-γ，TNF-α）含量升高，抗炎性细胞因子IL-10水平降低的现象。在啮齿动物实验中，注射细菌内毒素脂多糖（LPS）会诱导其炎症反应以及抑郁样行为。因此，应激导致抑郁症的发生已经达成广泛共识。危险信号、生理应激或心理应激都会导致大脑及外周的炎症因子水平增加，[7]而小胶质细胞和巨噬细胞可能在这个过程中起到主要作用（如图1-1所示）。尽管抑郁症的发生与炎症因子相关的潜在的分子机制还不清楚，但有理论认为，[8]抑郁症所导致的炎症过程是由中枢神经系统中的免疫调节改变所引起的。1.1.2小胶质细胞与中枢神经系统的免疫调节免疫系统分为先天性免疫和适应性免疫，它们在免疫应答中各自发挥着独特[9]的作用，促使机体从损伤和感染中康复。先天性免疫是抵御感染时的第一道防线。这一应答的特点是快速但非特异性，主要由骨髓源性的细胞（如巨噬细胞，中性粒细胞，树突细胞）调节。与之相反，适应性免疫主要受到淋巴细胞的调控（如T淋巴细胞，B淋巴细胞），适应性免疫能产生针对特定抗原的免疫应答，这一过程需要较长的反应时间，但能提供长久的免疫效果。在遭受损伤或感染时，先天性免疫和适应性免疫的协同作用保护了外周神经系统，促进其从损伤或感染中复原。然而，大脑不再被认为是免疫豁免区域，中枢神经系统中同样存在着能与外周建立联系的免疫细胞，大脑内原驻免疫细胞与外周的免疫细胞在免疫激活上存在着差异。这一免疫学上的差异很可能与血脑屏障（BBB）的存在有关[10]，BBB将中枢系统和外周神经系统隔离开。它通过限制进出大脑的物质来给机体营造一个特定的环境。这个区分外周和大脑的边界对免疫激活有着直接的影响。虽然外周的免疫细胞和大脑内免疫细胞在招募和执行功能时有着显著的对应性，但也存在着差异。例如，全身性感染发生后，先天性免疫会被激活并启动适[11]应性免疫来清除病原体。而大脑内参与先天性免疫的细胞并不能有效的激活适应性免疫系统。来自外周的细胞能够渗入到中枢神经系统并协助清理病原体，[12]并通过释放炎症介质影响突触功能（如图1-2所示），但这种现象只发生在血脑屏障隔离功能下降的条件下。事实上，血脑屏障的通透性改变不会时常发生。因此，在机体遭受损伤和感染时，保护中枢神经系统的任务落在了一组特定的细2 第一章绪论[13]胞身上，这些细胞分别是小胶质细胞，星形胶质细胞和肥大细胞。肥大细胞[14]是大脑内的原驻细胞，能通过释放促炎症因子来招募和激活其他免疫细胞。星形胶质细胞通过产生促炎和抗炎细胞因子，补体，趋化因子来参与大脑内的免[12]疫应答。尽管有各种各样的细胞参与大脑内炎症的产生，但小胶质细胞是大脑内神经炎症的主要调节者和释放者，因此研究小胶质细胞与神经炎症的关系是[15]目前研究的热点。[16]图1-2外周-中枢免疫系统参与调节突触功能神经免疫是指在大脑组织损伤或感染条件下，小胶质细胞迁移至炎症部位抑[17]制炎症发生的过程。由于小胶质细胞具有多样性和极强可塑性的特征，所以会表现出几种不同的极化状态，发挥不同的功能，这几种极化状态依赖于胞外环境的不同刺激（如图1-3所示）。病原相关分子模式（PAMPS）或损伤相关分子模式（DAMPS）可分别通过Toll样受体（TLRs）或ATP受体刺激静息态的小胶质细胞。在1型辅助性T细胞（Th1）衍生的细胞因子干扰素（IFN）-γ作用下，通[18]过经典激活的途径静息态的小胶质细胞会向M1型转化。M1小胶质细胞可产生促炎细胞因子，如IL-1β，IL-6，肿瘤坏死因子（TNF）-α，趋化因子配体2[19]（CCL2），ROS和NO，发挥防御细菌和病毒感染的作用。另一方面，2型辅助性T细胞（Th2）来源的细胞因子IL-4和IL-13可通过替代激活的途径诱导小胶3 电子科技大学博士学位论文[20]质细胞细胞向M2（特别是M2a）表型转化。M2a小胶质细胞表达精氨酸酶-1（Arg-1），Ym1，CD36，CD163和CD206，抑制M1小胶质细胞细胞介导的炎[21]症。虽然有研究指出三种不同的M2小胶质细胞细胞表型（M2a，M2b和M2c），但这些M2表型的小胶质细胞表现出一系列可塑的功能状态，而不是一组离散的活[22]化状态。[23]图1-3小胶质细胞的激活类型M1和M2小胶质细胞可以在它们特定的微环境中相互转化，这取决于他们激活途径。干扰素调节因子（IRFs），核因子（NF）-κB，激活蛋白1（AP1），过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-γ等多种关键转录因子，和c-AMP反应性元件结合蛋白（CREB）参与小胶质细胞极化，这些因子相互作用，共同调控小胶[24]质细胞表型的转化以及功能的发挥。因此，M1和M2小胶质细胞代表小胶质[25]细胞活化状态的两个末端。小胶质细胞不同表型的转化，在调节炎性疾病的发生、发展和停止中发挥重要作用。基于这些证据，小胶质细胞的M1/M2极化可能[26]在控制中枢神经炎症中神经炎症的产生和消退之间的平衡中起重要作用。1.1.3抑郁症与小胶质细胞的激活小胶质细胞是源自胚胎期卵黄囊的骨髓细胞，在早期发育时期迁移至大脑，并通过增殖在大脑维持特定的数目。成熟大脑中小胶质细胞占细胞总细胞数的10%，中枢神经系统中的小胶质细胞存在一定程度上的异质性。小胶质细胞与外周的巨噬细胞相似，两者都能被诱导成几种激活表型来探测环境病原物质，并清除细胞碎片和病原体，帮助神经再生与组织重构。小胶质细胞的不同表型是为了响应周围环境的信号而形成的。在应答感染或损伤的信号时，小胶质细胞呈炎症反应表型，也就是经典表型。小胶质细胞的经典炎症表型的主要特征包括：细胞4 第一章绪论数量的增加，形态学改变（如细胞体膨大，细胞分枝减少），和释放包括细胞因[27]子，趋化因子，活性氧及一氧化氮在内的多种炎症分子。最近研究表明，心理应激可以增强神经元活动进而激活中枢神经系统的免疫[28]反应。这种激活途径通过神经元和神经胶质细胞之间的相互作用而发生。神经元和小胶质细胞之间的交流是通过一种趋化因子（CX3CL1）实现的，这种跨膜[29]的趋化因子由神经元表达并通过小胶质细胞上的受体（CX3CR1）起作用。中枢神经系统的免疫反应主要是由小胶质细胞和星形胶质细胞所调控。小胶质细胞[30]对来自中枢和外周神经系统的危险信号做出响应。有趣的是，对遭受重度抑郁症的死者的背侧前扣带皮层进行尸检，发现了小胶质细胞激活和巨噬细胞的聚集。并且在抑郁后自杀死亡的的患者的腹侧前额叶白质中发现激活的小胶质细胞[31]数目增加。同样，研究发现在精神分裂症和抑郁症患者的背外侧前额叶皮层，前扣带皮层，海马和中层丘脑区域中，发现小胶质细胞的激活与患者的自杀倾向之间存在相关性。总之，这些研究表明小胶质细胞激活可能被认为是自杀的重要标志。值得注意的是，在患有抑郁症但未具有自杀念头的患者的脑区没有发现任何小胶质细胞激活，但在自杀患者中却发现了小胶质细胞异常激活，暗示小胶质细胞激活可能预示着自杀。动物实验中也发现类似的现象，例如束缚应激的小鼠在其前额叶皮质显示出小胶质细胞活性增加，而米诺环素作为一种具有抗炎以及抗抑郁功能的四环素类抗生素能够降低小胶质细胞活性以及对神经元的影[32,响。这些发现支持了小胶质细胞在调节应激的过程中发挥关键作用的假说33]。此外，在应激敏感性鼠中，小胶质细胞的促炎表型和小胶质细胞活性的增加都与应激引起的快感缺失相关。当神经可塑性发生异常时，胶质细胞在突触水平上的交互作用发生也发生紊乱，因此大脑对应激事件更为敏感。事实上，慢性应激促进前额叶皮质中的小神经胶质分支增加和星形胶质细胞萎缩，并且急性应激的小鼠，其丘脑，下丘脑，海马，黑质，和中央灰质中的小胶质细胞同样也发生[34]形态学上的激活。这说明应激动物可以作为一种探究小胶质细胞与抑郁症之间关系共同模式生物。应激事件促进了抑郁症的发展已成为公认的事实，临床前研究的证据表明小[35]胶质细胞在抑郁和应激中起到关键的作用。并且原驻性小胶质细胞的形态学[36]上的激活，主要是由于暴露于急性应激而引起的。应激导致小胶质细胞的激活可能与炎症小体NLRP3的激活相关，如图1-4所示，应激首先导致IL-1β的转录水平提高，增加IL-1β前体蛋白的水平，与此同时，应激对神经元的微损伤导致胞外ATP释放增加，激活炎症小体，促使NLRP3装配成有功能的炎症小体，5 电子科技大学博士学位论文将IL-1β前体蛋白加工成成熟的IL-1β，并将其释放到胞外启动炎症反应，这些[37-39]信号被更多的细胞接收到实现信号的级联放大，最终导致病理性改变。[3]图1-4小胶质细胞的炎症小体激活途径在抑郁症中，小胶细胞激活的来源是广泛存在争议的话题，可能存在机制包括以下几种：（1）小胶细胞通过感染性和非感染性炎症应答激活。外周和中枢炎症刺激能够影响行为从而导致抑郁症的发生，保守的病原体相关分子模式和危险相关分子模式分别负责了传染性的或非传染性的炎症应答，并且引导外周免疫细胞分泌炎症介质，这些炎症介质反过来又通过体液通路和神经通路将机体免疫传6 第一章绪论递给大脑中的小胶质细胞。正常情况下，外周免疫细胞和小胶细胞的交互作用受到脉络丛和血脑屏障的调节。在病理条件下，比如病毒性感染、中风、创伤。血脑屏障功能会被减弱，并且从外周渗透的免疫细胞进入大脑实质，从内部来调节炎症应答。无论哪一种小胶激活的来源，一旦进入病原体相关分子模式和危险相关分子模式，都会引起炎症介质释放和神经传递紊乱。这些损伤信号通过特定的受体，直接刺激小胶细胞，从而使其分泌更多的炎症因子，这样反过来会导致更[40]多小胶细胞的激活，同时加剧抑郁症状。（2）糖皮质激素引起小胶细胞的激活。大多数抑郁患者不会表现出明显的炎症体质。尽管这样，许多患者体内有不明来源的炎症生物标记物水平的升高。下丘脑-垂体-肾上腺轴是主要的内分泌系统，可以调节炎症响应。尽管糖皮质激素通常情况下是抗炎的，但他们会在特定的情况下产生促炎作用，特别是在大脑内稳态被打破时。具体来说，在遭遇应激后，糖皮质激素会引发小胶质细胞激活，[41]以应对损伤、创伤或是感染这一系列免疫挑战。糖皮质激素诱导小胶质细胞的亮氨酸拉链和FK506绑定蛋白51的基因表达，这些基因是糖皮质激素发挥作用[42]的中介体，他们会加重应激反应与抑郁。皮质酮的处理会增加小胶细胞的数量，抑制皮质酮的产生能消除应激引起的小胶细胞增殖和激活。这些结果充分证明，糖皮质激素能够导致小胶质细胞激活。[43]（3）肠-脑轴是另一个涉及到应激引起小胶激活的系统。肠道菌群能够影响免疫细胞的结构、功能和迁徙。同时，肠道菌群在正常生理状态下能够控制小胶细胞的功能，研究表明肠道菌群的紊乱会导致神经、荷尔蒙和行为上的改变[44]。譬如，无菌动物对于对于束缚应激或者其他新奇环境应激均表现出过度的HPA轴反应，在行为上也更容易表现出抑郁样行为。然而，益生菌的处理会减少抑郁样行为。目前，肠道和大脑之间的通路现在仍然没有阐释清楚，但在某些特定情况下，应激会增加肠道的通透性，肠道菌群或是它们的代谢物（比如LPS），能够跨过肠粘膜，刺激免疫-大脑系统，最后导致小胶细胞的激活同时伴随着抑郁样行为的产生。（4）去甲肾上腺素系统也被认为是小胶细胞激活的应激源。所有社会心理压力源都会引起去甲肾上腺素的释放，而这些信号都是通过各种免疫细胞，包括小胶细胞的β肾上腺素受体释放的。在应激引起的小胶细胞改变的过程中，β肾上腺[45]素受体拮抗剂能够阻断应激对于小胶细胞激活的影响。（5）生理应激也能够通过脑内DAMP的释放来直接引起小胶细胞的激活。这些分子能够作用于小胶上TLR4受体，产生危险信号，这些危险信号进一步传递，从而引起小胶质细胞的改变。具体来说，急性应激会引起DAMP高迁移率组蛋白7 电子科技大学博士学位论文1（HGMB1）产生，它使小胶能够为促炎因子的分泌以及小胶基质金属蛋白上调做好准备。在抑郁患者中也发现小胶基质金属蛋白有上调。应激也可以改变HSP70的表达水平，同时影响分子伴侣BAG1，HSP70与TLR4受体相结合，这些[46]变化均与抑郁的发生相关。（6）IL-1激活小胶质细胞。促炎因子IL-1产生于多种急性或慢性应激，它在抑郁的发展过程中起到重要作用，有研究表明，强化IL-1信号通路，会引起小胶质细胞的激活、抑郁或是焦虑。最终，强烈的应激会使得骨髓来源的单核细胞迁移到脑内，这些单核细胞最终会变成小胶样细胞或者是改变已存在的小胶细胞[47]的功能。（7）强烈的神经元活动引起小胶细胞激活。应激通常会引起神经元活动增强，小胶质细胞在监测环境变化的过程中可能会被强烈的神经元信号激活。考虑到小胶细胞表面有许多受体，它们可以与许多应激引起的神经递质结合，包括谷氨酸盐、去甲肾上腺素和5-羟色胺。大脑灰质在对于不可控的应激、威胁、焦虑和疼痛造成的行为响应方面起到关键作用，在这个区域，激活的神经元附近，会[48]有大量的小胶细胞的激活。另外，长期束缚的应激与小胶细胞的激活和神经[49]元活动是密切相关的，药理学上抑制NMDA受体能够抑制小胶细胞的激活。1.2抑郁症和神经发生由于抑郁症的临床和病因存在很大的异质性，因此抑郁症的病理生理学机制以及生物学基础仍然还不清楚。数十年的研究已经清楚地证明，各种神经递质，特别是单胺类神经递质，以及神经营养因子都对抑郁症有着一定的影响。最近研[50]究证明谷氨酸能信号也与抑郁症有关。经过检测发现包括人类在内的哺乳动物的大脑的神经发生，发现神经发生的减少与抑郁症有着密切的联系，因此抑郁[51]症的神经源性假说越来越引起人们的广泛关注。抑郁症的神经源性假说是基于若干相关研究，抑郁症患者的脑成像和死后研究结果表明，成熟神经元细胞的凋亡，以及海马体积减少均反映神经发生的减[52]少。更有趣的是抗抑郁药物滞后的起效时间和神经发生的周期基本一致。另外，应激是抑郁症的常见危险因素，长期的应激条件会抑制非人灵长类动物的神经发生，这种抑制现象可以通过抗抑郁药治疗来恢复。在啮齿类动物中，抑制海马神经发生会导致抑郁样行为，这些行为能被抗抑郁药物或促神经发生药物改[53]善，抗抑郁药影响了神经发生的多个方面。五羟色胺重摄取抑制剂氟西汀，上[54]调了神经前体细胞增殖速率和未成熟神经元存活速率。同时，五羟色胺重摄取抑制剂西太普伦或依他普伦也具有同样的功效。三环类抗抑郁药丙咪嗪虽然很8 第一章绪论少用于神经发生研究，但也已表明增加了神经前体细胞的增殖和存活。另外，还有部分药物虽未被临床批准但对实验室动物显示出抗抑郁作用的药物，如CRF1拮抗剂和V1B拮抗剂，对上调应激诱导的神经前体细胞增殖速率也显示出相似的[55]作用。情绪稳定剂锂和丙戊酸也显示出显著增强神经干细胞增殖和存活。具有改善抑郁样行为的非药物治疗也具有促神经发生的效果。单一的电痉挛刺激（ECS），类似于临床上治疗重度抑郁症的电休克疗法，治疗2个月后会促使新生[56]神经元存活的数量显著增加。运用多重疗法，神经前体细胞增殖的速率也会显著增加。电痉挛刺激也可以一定程度上恢复X射线照射后破坏的神经发生，也可以恢复环境条件性恐惧下的神经损伤。海马的神经发生除了影响空间学习记忆外，同时也与应激诱导的抑郁和焦虑样行为有关。丰富环境能够促进神经前体细[57]胞增殖，同时能缓解抑郁和焦虑样症状。不同类型的抗抑郁治疗手段都能增加神经前体细胞的增殖和存活，表明上调神经发生具有抵抗应激和抗抑郁的作用，这对抑郁症的治疗具有深远的意义。因此，成年海马神经发生减少可能是MDD[58]的病理基础。1.3特定表型的小胶质细胞对海马区神经发生的作用依据小胶质细胞的激活状态不同，它对成年期的神经发生有着支持和损害两种作用。促炎症表型的小胶质细胞通常损害神经发生，而抗炎表型的小胶质细胞[59]呈神经保护性，能促进新生神经元的存活。小胶质细胞所呈现的不同表型对海马区神经发生的影响是一个复杂且缓慢的过程。1.3.1静息状态的小胶质细胞对神经发生的作用在健康的大脑内，大多数小胶质细胞都处于静息状态。静息状态的小胶质细胞呈现多分枝状，有着许多精细的分枝和一个较小的胞体。这些细胞用它们精细的分枝来检测周围环境中的感染和损伤。在海马区，静息态的小胶质细胞可通过[60]吞噬作用积极参与成年神经发生。尽管每天都有成千上万的新生细胞在齿状[61]回的颗粒下层诞生，但并非所有的细胞都能存活和分化成神经元。至少有一半的细胞在其诞生后的几天到几周内死亡，而死亡的方式很可能是通过凋亡。未激活的小胶质细胞对与神经发生有着重要的作用，它能通过吞噬作用来清除凋亡[60]的新生神经元。此外，有研究显示吞噬新生的神经元并不能激活小胶质细胞，这意味着未完全激活的小胶质细胞也具有吞噬功能。这些发现表明小胶质细[62]胞在未激活时对神经发生具有调节作用。9 电子科技大学博士学位论文静息态的小胶质细胞通过调节神经干细胞的功能影响神经发生，体外培养的小胶质细胞能释放因子来挽救成年神经前体细胞并指导神经元的分化。研究表明，小鼠的室管膜下组织的神经干细胞（NSCs）通过分离培养，随着培养时间增[63-65]长，成神经细胞的比例变少。成神经细胞的减少并不是神经干细胞的减少所导致，而是由于非神经元类细胞的增殖减少引起的，特别是小胶质细胞。当小胶质细胞缺失时，与它共培养的神经前体细胞失去了营养支撑，而导致神经元分化[66]数目减少。这些数据表明小胶质细胞能分泌未知的因子来延长培养中的神经源性细胞的潜能。用小胶质数目较多的脑区制成的条件培养基能增强培养的神经[65]干细胞的分化。有趣的是，从老年鼠中提取的小胶质细胞对于神经发生的促进作用没有年轻的小鼠的小胶质细胞显著，这表明小胶质细胞的活性随年龄改变[67]而导致神经发生衰弱。这些证据共同说明了小胶质细胞在未激活时，对于神经发生有着支撑作用，这使我们进一步认识了小胶质细胞在大脑中作用。1.3.2经典激活的小胶质细胞对神经发生的作用大量的证据表明，经典激活的小胶质细胞对于海马区的神经发生有负面作用。在中枢或全身注射细菌内毒素脂多糖（LPS），来模拟脑内的炎症反应，并诱导小胶质细胞的经典激活（M1）。LPS通过与toll样受体4(TLR4)分子结合来诱导小胶质细胞的激活，并诱导其释放多种促炎症因子包括白介素-1β（IL-1β）,肿瘤[68]坏死因子-α（TNF-α），和白介素-6（IL-6）以及一些其他炎症分子。Monje和Ekdahl第一次证明经典激活的小胶质细胞会损害海马区的神经发生[69]。他们发现，小鼠接受四周的LPS腹腔注射能彻底降低皮层新生神经元的存活，而LPS并不会影响新生细胞的增殖。同样Monje等报道，在腹腔内注射LPS[63]能显著降低海马新生细胞的存活，但对于增殖确没有影响。此外，在LPS处理的大鼠里，标记早期神经元的标志双肾上腺皮质激素（DCX）表达显著减少，证[70]明了LPS的应用会减少新生细胞向神经元的分化。在这些报道中，新生神经元的存活与小胶质细胞激活的数量成负相关性。进一步实验中，使用小胶质细胞的抑制剂，米诺环素，能阻断LPS对新生神经元存活减少的影响，这表明M1型小胶质细胞参与损害新生神经元的存活。总的来说，这些报道证明神经炎症对海马[71]区神经发生的抑制作用是通过降低新生神经元的分化和存活来实现的。炎症对神经发生的影响不只是简单的作用于新生细胞的增殖、存活和分化，还会影响到新生神经元整合到先前存在的神经网络中，以及与存活的新生神经元之间的功能连接。炎症能增强新生神经元的抑制信号。海马区注射LPS，会引起小胶质细胞的持续激活，使得颗粒细胞层的细胞处于慢性炎症的环境下，LPS诱10 第一章绪论[72]导的慢性炎症改变了先前存在的和新生的神经元的突触输入。与对照动物的颗粒层相比，LPS处理后的动物出现存在的和新生的神经元自发兴奋性突触后电位（EPSC）的频率升高，这表明驻留在炎症环境中的细胞会获得兴奋性提高的激[73]活。虽然新生神经元和先前存在的神经元都变现为兴奋性输入提高，但只有[74]LPS处理后一周诞生的新生神经元才变现出抑制性输入增强。此外，这些新生的神经元与先前存在的神经元相比在神经末梢有着更高密度的抑制性突触。总的来说这些数据表明在炎症环境中，成熟神经元突触的抑制性输入能力会提高，从[75]而改变了新生神经元的功能。1.3.3替代激活的小胶质细胞对神经发生的作用与经典的炎症表型相反，小胶质细胞能变成替代激活（M2）表型时，主要起到神经保护作用，在组织重构和神经再生过程中发挥核心作用。这种替代表型主要表达组织相容性复合体Ⅱ（MHCⅡ），精氨酸酶1（Arg-1），甘露糖受体（MRC1），过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPAR-γ），几丁质酶-3（Ym1），和抵抗素家族FIZZ1。另外，替代激活的小胶质细胞通常表达抗炎症因子IL-10，转化生长因子β（TGF-β）和生长因子如胰岛素样生长因子（IGF），以及脑源性的神经营养因子（BDNF）。小胶质细胞的替代表型的转变通常跟随在促炎反应之后，使得替代表型作为代偿应答以帮助病理修复。抗炎症细胞因子如IL-4和IL-13能诱导替代表型。意味着IL-4或IL-13可通过调控小胶质细胞表型，来维持海马[76]的神经发生。有证据表明抗炎症因子可能促进神经发生。利用腺病毒载体在SVZ区长期表达抗炎因子TGF-β能提高BrdU阳性的细胞存活。TGF-β在肾上腺切除之后，在增强海马区的神经发生的过程中发挥重要的作用。有观点认为小胶质细胞之所以对与神经发生有着不同的影响是由于它们呈现的表型不同。神经前体细胞（NPCs）与被LPS刺激的小胶质细胞共培养表现为低程度的神经分化，然而NPCs与IL-4刺激的小胶质细胞共培养时，神经元数目的比例会增加。同样，当NPCs与IL-4刺激的小胶质细胞共培养时，与未刺激的小胶质细胞共培养相比，DCX细胞数目显著增加。此外，IL-4刺激小胶质细胞，能增加小胶质细胞表达IGF-1，研究报道IGF-1能够促进神经发生。同样的，最近的文章报道，NPCs与IL-4激活的小胶质细胞共培养会增强神经元的分化。此外，还观察到IL-10刺激的小胶质细胞能增强NPC的增殖，但不影响神经元的分化。分泌IL-10的小胶质细胞在细胞培养时，[77]对神经元的分化和新生细胞的存活起支持作用。这些数据共同表明了替代激活的小胶质细胞促进神经发生的分化。11 电子科技大学博士学位论文小胶质细胞释放促神经源性营养因子在一个缺血损伤模型中也有报道。最初随着损伤发生，小胶质细胞为炎症表型。然而，随着时间推移，一部分小胶质细[76]胞开始呈现替代激活的变型。在纹状体缺血性损伤持续16周后小胶质细胞呈现替代激活表型。此外损伤还引起SVZ区的新生细胞增加，并且许多新生细胞迁移进入纹状体内的损伤位点。小胶质细胞激活形态的转变暗示着新生细胞的产生及迁移进入损伤位点需要替代激活神经保护性表型的支持。中风模型中SVZ中的小胶质细胞表现为IGF-1表达增加，增强神经发生。这些数据共同表明替代激活的小胶质细胞有助于神经元的分化迁移，及损伤后整合进神经网络。在阿兹海默症的动物模型中研究表明神经炎症可能对神经发生的抑制有贡献，而转变小胶质细胞成替代激活表型可能会减轻神经发生的抑制作用。长期使用二甲胺四环素能够增加阿尔兹海默症模型小鼠新生神经元的存活，表明小胶质[78]细胞的激活有助于降低海马区的神经发生。此外，抗炎因子IL-10的过表达能减弱阿兹海默症小鼠模型中的神经发生作用。阿尔兹海默症模型小鼠的海马区过表达IL-10能增加新生细胞，增加IL-10的表达并不能减少海马区总体β淀粉样蛋白沉淀的量，表明β淀粉样蛋白沉淀的减少并不能解释海马区神经发生的增加。这些研究结果表明提高海马区的IL-10水平能减少小胶质细胞向抑制神经发生的炎症表型的极化，或者是促进小胶质细胞向增强神经发生的替代表型的极化。总的来说，这些数据潜在地表明了大脑内促炎及抗炎激活的平衡可能对于患病大脑[79]中的神经可塑性有帮助。1.4脑源性神经营养因子与抑郁症抑郁症患者在服用抗抑郁药之后，临床反应的时间滞后，表明单独改变单胺[80,81]代谢不能解释抗抑郁作用。在这方面，有人提出，抗抑郁药物的作用机制可能与细胞内信号转导途径有关，而信号转导与特定基因的表达有关。神经可塑性假说认为，抑郁症是由于应对应激的反应过程中，大脑不能产生适当的神经营[82]养因子。脑源性神经营养因子（BDNF）是神经营养因子家族的重要成员，是[83]神经可塑性假说的关键组成部分。在抑郁症患者血清中发现BDNF水平显著减少。荷兰抑郁和焦虑研究（NESDA）在6个月时间范围内，对1070例严重抑郁症诊断患者进行系统的检测，分别在独立多元回归分析中测试来自综合国际诊断采访（CIDI）和抑郁症状清单（IDS）的项目，采用血清BDNF水平作为因变量和[83]CIDI或IDS项目作为独立变量。随后，比较季节性情感障碍、忧郁性抑郁症、非典型抑郁症和中度抑郁症的患者的BDNF水平后发现，这些患者的血浆中BDNF12 第一章绪论[84]浓度均降低。这预示着血清中BDNF水平可作为抑郁症早期诊断的分子标记[83]。1.5本论文研究的目的和意义抑郁症是一种常见的情感认知障碍，严重影响着人们的身心健康和生活质量。由于临床以及病因学的异质性，目前关于抑郁症的分子机制还不是很清楚，传统的药物治疗效果不理想。最近提出的神经发生与炎症假说，补充了单胺假说的缺陷，使我们进一步了解抑郁症的发病机制。尸检及动物研究结果表明，小胶质细胞的结构与功能的改变会抑制海马的神经发生，同时会产生抑郁样的行为。然而，小胶质细胞通过什么途径去调控神经再生及抑郁样行为的分子机制还不清[85]楚。由于血脑屏障的存在，将外周免疫系统与大脑免疫系统分开，小胶质细胞被认为是大脑内常驻的主要的免疫细胞，它主要发挥免疫调节和免疫监视的作用，从而维持大脑内环境的稳态。在应激状态下，小胶质细胞能够被诱导成M1型，释放炎症因子，引起神经炎症反应。由此可推断小胶质细胞的促炎性激活可能在应激诱导的抑郁样行为中起着关键作用。在炎症反应消退之后，小胶质细胞的表型通常表现为替代激活的M2表型，这种小胶质细胞能够表现出神经保护性，这可能是因为替代激活的小胶质细胞发挥一种代偿性的修复作用。促炎性细胞因子INF-γ能够直接诱导出M1型的小胶质细胞，用干扰素来治疗其它疾病的时候会通常会导致较强的副作用，这种副作用的主要表现就是抑郁。由此我们可以推断，抑郁症与M1型小胶质细胞介导神经炎症反应紧密相关。临床数据表明用抗炎药物治疗一些顽疟的重度抑郁症有较好的效果，表明抑制小胶质细胞的M1型激活可以作为一个潜在的治疗靶点。另外抗抑郁药物在体外能够诱导M2型的小胶质细[86]胞，这提示了M2型小胶质细胞在治疗抑郁过程中起一定作用。尽管大家普遍认识到小胶质细胞的激活分多种亚型，但在实际的抑郁症研究中，人们往往只将小胶质细胞粗略的分为激活和未激活两种类型，并且一度认为这种激活的小胶质细胞就是具有神经毒性的M1型小胶质细胞，多数针对小胶质细胞的抗抑郁治疗的探索都集中在如何抑制小胶质细胞的激活，并没有对小胶质细胞的激活类型加以细分。实际上从抑郁症的起始到表现出核心症状的过程中，机体已经发生了很多改变，如神经发生减少，功能神经元坏死，突触损伤等，这些改变不是简单抑制小胶质细胞激活或抑制神经炎症就能完全改善的。在抑郁症改善的过程中需要修复型的小胶质细胞参与其中，而具有修复性功能的小胶质细胞是同样需要处于激活态。这种类型的小胶质细胞除了分泌抗炎性细胞因子抑制13 电子科技大学博士学位论文炎症和吞噬碎片外，更重要的是它能够分泌一些营养物质来促进组织修复和突触重构。据此，本研究旨在探索M2a型小胶质细胞对神经发生及抑郁样行为的影响，并确定调控小胶质细胞表型是否可以取到抗抑郁的作用及其作用机理，以期为抗抑郁治疗提供新思路。1.6本论文的研究内容及结构安排1.6.1研究内容本研究以从应激、小胶质细胞表型、神经发生和抑郁样行为作为主要的研究主线，从多个侧面揭示应激所致抑郁的生物学机制，以慢性温和应激建立抑郁动物模型，并以侧脑室注射IL-4作为小胶质细胞表型的干预措施，再分别评价它对神经发生及抑郁样行为的影响。旨在进一步探索小胶质细胞的生物学功能，为深入揭示应激所致抑郁的发生机制提供实验支持，并为建立一种基于小胶质细胞表型途径来抑制抑郁症发生的治疗策略提供理论依据与药物靶点。本研究的科学假说如图1-5所示：应激导致相应脑区的小胶质细胞向M1型激活，从而促进促炎性细胞因子增加，抑制海马神经发生，最终促成抑郁发生。用IL-4干预导致小胶质细胞向M2a表型极化，分泌神经营养因子促进神经发生，从而起到抗抑郁的效果。图1-5本文科学假设14 第一章绪论图1-6本文实验方案本研究的实验方案如图1-6所示，从行为、组织、细胞及分子层面揭示小胶质细胞激活途径与抑郁症之间的关系。主要工作包括三个部分：第一，建立小鼠抑郁动物模型，分析应激诱导的M1型小胶质细胞对神经发生的影响及导致抑郁的可能机制；第二，构建AAV-IL-4表达载体，观察经IL-4诱导M2a型小胶质细胞在体内是否具有促神经发生的作用，及其在抗抑郁行为方面有何意义。第三，以原代培养或体内分离的小胶质细胞与神经前体细胞共培养，检测经IL-4处理的小胶质细胞对神经发生的影响，并探究其可能的信号通路。1.6.2论文内容安排本文章的章节结构安排如下：第一章初步探究了小胶质细胞的表型与应激的敏感性之间的联系；第二章探究了下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对小鼠应激易感性的影响；第三章研究了海马中IL-4水平上调对小胶质细胞及抑郁样行为的影响；第四章探索了海马区的IL-4及IL-4受体表达对神经发生的影响；第五章探究小胶质细胞的激活状态对神经干细增殖、分化、存活和迁移的影响；第六章研究BDNF通路在替代激活的小胶质细胞介导的神经发生中的作用。15 电子科技大学博士学位论文第二章小胶质细胞的表型与应激敏感性的关系探究2.1引言抑郁症的发生主要是因为长期的社会或生活的压力所致，在抑郁症的众多动物模型中，慢性温和应激（CMS）模型更能够模拟抑郁症的发生及发展过程。在慢性温和应激中，抑郁样行为是随着时间的推移逐渐的形成，这是一种自然状态。抑郁症的发生发展不是一蹴而就的，大量的研究表明，抑郁的发作与遗传基因、遭遇消极生活事件、环境因素、人际交往、认知水平、人格特质等等都有着密切的联系。综合来讲，抑郁症的发生是遗传背景与社会环境共同作用的结果。调查结果显示，抑郁症的终身患病率在男性和女性之间是存在很大差异的，女性的终身患病率约为25%，而男性的终身患病率约为12%，相差近一倍，这也充分说明基因在抑郁症发生中的作用。应激通常被看作是导致许多心理和生理问题的原因。一直以来应激反应被认为是一个适应性机制，是机体对真实或潜在的威胁有效的反。应激可以看作是被不良的刺激和情境所唤起，其生理和行为的反应强度由个体对刺激的控制和评估强度所决定。应激事件是诱发抑郁发生的导火索，长期暴露在各种压力中会导致抑郁症状的出现。由于遗传背景、社会经历、人格特质等方面的差异，每个人得抑郁症的风险也各有不同，在遭受同等强度的应激[87]事件时，他们的反应也会有差异。易感性这个概念的提出进一步解释了个体对应激的反应差异性。易感性具有三个重要的特征，首先易感性是一种相对稳定的特质；其次易感性在受别的因素影响时，可能发生变化；最后，易感性具有个人内化的特点，是潜在的，长期的。近几年的研究将易感性包括的内容扩展到更深的层次，包括各种社会心理因素，如认知、人际关系、人格、应对方式等。在早期的研究中，无论是对应激还是对易感性的研究，都比较强调生物学因素的作用，并且应激和易感性也是作为各自独立的因素被研究。随着研究的深入，尤其是心理社会因素在抑郁发生、发展过程中的作用越来越明显，单独用应激或易感性因素都不足以解释抑郁的病理发生过程。研究者们很自然地开始意识到二者相互关联，相互联合可能导致抑郁障碍出现。20世纪60年代，BleμLer和Rosenhal正式提出易感性—应激模型，用于解释精神疾病的病理特征。该模型强调：假定所有的人都存在有发展为精神障碍的潜质，而且每个人存在一个抑郁症的触发点，这个点的位置及触发，依赖于个人遭遇的应激与存在的易感性素质之间的相互作用。个体、易感性和应激都具有独立的意义和概念，但在这个模型16 第二章小胶质细胞的表型与应激敏感性的关系探究中强调的是它们之间相互作用、相互影响的关系，是一种整体、全面的观念。易感性-应激相互作用模式已被广泛运用于抑郁症的发病机制研究。对于应激易感性的筛选，普遍采用小鼠来作为研究对象，根据小鼠在遭受同一强度的应激事件后所表现出来的行为差异，我们可以将其分成应激敏感型和应激抵抗型两个亚群，并进一步研究这两个亚群之间的分子差异，这是研究抑郁症发病机制的常规手段，由于遗传背景和早期生活经历的不同，动物对应激的敏感性也会出现差异，这些差异可能与抑郁症的发生及发展息息相关。最近，大量的证据证实小胶质细胞是一类特化作用后形成的细胞群，这类细胞具有多重作用，其作用主要体现在对于发育过程中神经元连接性的定形和修整，另外这类细胞还参与了完全成熟的CNS中依赖于神经活性的突触可塑性形成、神经生成以及学习等过程。在正常的成熟CNS中，小胶质细胞具有复杂的形态，从其致密的胞体上形成许多分支突起，这些突起持续地对环境中瞬时接触到的突触和突触外区域进行扫描。由于小胶质细胞具有吞噬能力，因此长期以来人们一直认为小胶质细胞在CNS发育过程中的主要作用就是吞噬并清除神经元碎片，这些碎片是细胞程序化死亡后形成的，这种细胞程序化死亡作用会对正常发育过程中产生的多余神经元进行清除。然而在发育过程中小胶质细胞不仅仅是反应性废物的收集器，它们还是具有主动性的神经元杀手，会通过诱导细胞凋亡来杀死神经元。小胶质细胞的主要功能就是在中枢神经系统疾病中作为炎症反应的调节剂。人们发现在处于类似晶格那样相邻而彼此之间没有重叠的区域中的小胶质细胞会在几分钟内对非常有限、甚至小到单个神经进程的区域性损伤做出回应。还有，小胶质细胞会在对更广泛性的损伤、感染或疾病的应答中会形成刺激信号依赖性表型。小胶质细胞的应答类型包括导致细胞形态变化的细胞骨架重排作用、模式化的转录性变化以及细胞的增殖作用。因此，小胶质细胞对于一切对CNS正常状态的破坏作用都保持着警惕性，对特异性威胁以高度模式化的方式进行应答，并在需要时会加强应答作用。在遭受持续的社会应激时，神经元处于过度活跃状态，长期的神经元兴奋会造成大脑局部的微损伤，目前报道较多的病变脑区包括海马、杏仁核和皮层，这些脑区的小胶质细胞检测到大脑损伤后立即做出应答，包括改变细胞形态、分泌[34]炎症介质及招募周边的小胶质细胞参与应答等等。小胶质细胞的一系列变化最终将导致大脑内稳态失去平衡，同时造成持久的低级别的神经炎症反应，这被认为是抑郁症发生的可能机制之一。但从目前的研究结果来看，尽管有部分研究证明抑郁症与小胶质细胞的激活相关，但是并没有足够证据证明小胶质细胞参与17 电子科技大学博士学位论文了抑郁症的发生和发展。因此本章内容比较了在应激易感型小鼠与应激抵抗型小鼠中小胶质细胞以及小胶质细胞分泌的介质之间的差异，初步证明了小胶质细胞的促炎性激活与应激易感性之间的关联。2.2实验材料2.2.1实验动物本研究所用的实验动物为7周龄C57/BL雄性小鼠，购自四川省人民医院。实验动物日常饲养条件均一致，包括：照明时间与黑暗时间均为12h（早上7点开灯，晚上7点关灯），25±1℃室温，75%空气湿度，标准饲料与饮用水，单笼饲养，动物活动自由，适应两周后开始用于实验研究。在整个实验过程中，严格遵守相关法律以及电子科技大学动物伦理委员会的相关规定，符合动物行为规范。2.2.2慢性温和应激（CMS）8周龄C57/BL小鼠被按照公认的慢性温和应激（Chronicmildstress,CMS）造模方式执行，所用实验小鼠均为单笼饲养，每天接受3种应激，持续经历4周。慢性温和应激的内容包括：45度倾斜鼠笼12h，夹尾5min，震荡2min，持续光照24h，持续黑暗24h，束缚2-3h，潮湿垫料24h，空笼子12h，夺水夺食12h。应激周期中，实验动物每周进行一次糖水偏好测试，称体重两次。2.2.3行为学检测糖水偏好测试（SPT）：实验前在隔噪音、安静的房间里训练动物适应喝糖水，实验小鼠均单笼饲养，每笼放置2个水瓶，第一个24h，两瓶均装有1%蔗糖水，随后的24h，一个瓶装有1%蔗糖水，一个瓶装日常饮用水。在24h禁食禁水后，进行动物的糖水/纯水消耗实验，给与小鼠已称好重量的两个瓶子，一瓶1%蔗糖水，一瓶日常饮用水。测试2h后，取走两个瓶子并对其称重，做好数据记录，计算小鼠的糖水消耗量、饮用水消耗量以及糖水偏好程度（糖水偏好程度=糖水消耗量/总液体消耗×100%）。自主活动(LAT)：小鼠自发活动的测试采用泰盟ZZ-6小鼠自主活动测试仪测试，实验室应保持周围环境安静，尽量减少实验误差。在实验中，将实验小鼠置于测试仪的测定室中，使其适应1min，然后记录每只小鼠10min内的运动次数和站立次数。实验仪器每次可检测6只小鼠的活动，且考虑到小鼠对气味的敏感性，18 第二章小胶质细胞的表型与应激敏感性的关系探究所以每一次实验结束，记录完毕后，必须将实验仪器清洗赶紧，避免实验鼠受到前一只小鼠气味影响。强迫游泳测试(FST)：实验进行的前一天需对每只小鼠进行预实验，小鼠放至于水深12cm、水温22±1℃、21×12cm玻璃烧杯中，进行10min游泳实验。第二天正式实验，所有实验小鼠维持游泳6min，通过数码相机录像记录整个实验过程。此后，使用双盲法统计小鼠6min内后4min的绝望不动时间和6min内第一次放弃挣扎的时间。悬尾实验(TST)：将实验小鼠尾巴尖端用胶带固定悬挂在离地30cm高处，每只实验小鼠需间隔一定的距离，每两只鼠中间用黑色纸板间隔，实验持续6min，用数码相机记录6min实验过程，然后通过双盲法统计小鼠6min内一动不动的时间和第一次放弃挣扎的时间。糖水消耗测试(SCT)：每只小鼠每周在固定时间要进行体重检测，计算出每只小鼠的糖水（1%）消耗量与体重的比值，将结果换算为每g小鼠体重对糖水的需求值，最后以对照组为参照（100%）,换算出其它组的相对值。毛色评价试验：在慢性温和应激4周后，对小鼠的头部、前颈、后颈、背部、腹部、前足、后足的毛色进行评分，评分标准为整齐和凌乱，每个部位的毛发整齐各得一分，所有部位毛发整齐共得7分。2.2.4动物筛选慢性温和应激三周后的动物先经过糖水偏好实验进行初步筛选，将高于对照组标准偏差线以上的动物归为应激抵抗型，偏差线以下的归为应激敏感型组。用同样的分类方法进一步在强迫游泳和悬尾实验中进行筛选。三种筛选结果都一致的才被认定为稳定的行为表型。2.2.5免疫组织化学染色应激4周后的小鼠使用1%的戊巴比妥麻醉（50mg/kg.i.p.）麻醉，用4%多聚甲醛（0.1M磷酸盐缓冲液配置，PBS）进行灌注10min，取出小鼠全脑放入4%多聚甲醛中进行后固定48h，再放入30%蔗糖里脱水48h。冰冻切片为30μm，4℃保存。取出4℃保存的脑片室温放置5min，用PBS清洗3次，5min/次，最后一次彻底吸干残留液体，用0.5%TritonX-100通透清洗15min，用10%，再用PBS清洗3次，5min/次。使用PBS配制的10%驴血清，室温封闭脑片2h，加入一抗4℃孵育过夜。次日，脑片放置室温10min，用PBS清洗3次，5min/次，避19 电子科技大学博士学位论文光孵育二抗2h，后用PBS清洗脑片3次，每次5min。最后加入DAPI着色细胞核，镜检观察脑片。2.2.6实时荧光定量PCR分离小鼠不同脑区（皮层、海马、杏仁核、小脑、嗅球和脊髓），放入预冷的1.5mL离心管中，每管加入1mLTrizol，用5mL注射器抽打脑组织，直至无块状物存在，室温放置5min。加入200μL三氯甲烷，剧烈震荡促使组织中的蛋白被完全抽提，室温静置5min，12000g，4℃离心15min，需注意放管方向。吸取上清液转移至新的1.5mL离心管中，上层清液即为RNA，宁缺毋滥，切不可吸到下部沉淀，后加入与上清液等体积的异丙醇，震荡混匀，15-30℃孵育10min，沉淀RNA，12000g，4℃离心10min。用移液枪吸干上清液，可见底部有白色沉淀，加入75%DEPC处理过的乙醇500μL，上下剧烈震荡，混合样品，务必使白色沉淀悬浮于液体中，7500g，4℃离心5min，期间不可使RNA完全干燥，否则会极大降低其可溶性。弃上清，打开管盖，放入4℃冰箱，风干后加入30μLDEPC处理的水，放入-80℃保存，勿保存至冰箱门口。提取的RNA，使用TaKaRa公司提供的反转录试剂盒，严格按照实验说明书步骤进行。首先，200μLDEPC浸泡过的EP管依次加入5×gDNAEraserBuffer（2μL）、gDNAEraser（1μL）、totalRNA（1μg），最后加RNaseFreedH2O至总体积10μL，混合均匀，离心使混合液沉积于EP管底部，42℃加热2min。然后，依次加入ReactionsolutionfromStep1（10μL）、5×PrimeScriptBuffe2(forRealTime)（4μL）、PrimeScriptRTEnzymeMix1（1μL）、RTPrimeMix（1μL）、RNaseFreedH2O（4μL），得到20μL体系混合液，再次混匀离心，30℃孵育15min，85℃加热5S终止反应。从所得cDNA样品中取1μL，加入5μLMasterMix和上下游引物各1μL，加DEPC水至10μL体系。混匀后放入CFX96荧光定量实时PCR仪中，在98℃预变性2s，70℃退火5s，并延伸，该过程重复35个循环，每个样品3个重复。内参基因为β-actin，相关基因的表达按照2-ΔΔct的计算方法。本论文所涉及的基因引物序列如表2-1所示。表2-1荧光定量PCR引物序列GenePrimersequencesAcc.Numberβ-actinForward:5’-CCGTGAAAAGATGACCCAGATC-3’NM_003E02Reverse:5’-CACAGCCTGGATGGCTACGT-3’CD11bForward:5’-CACAATGGATGGCTTGATGGA-3’NM_007H06Reverse:5’-CGTCCACGCAGTCCGGTAAAA-3’GFAPForward:5’-TGCTGGAGGGCGAAGAAA-3’NM_007D06Reverse:5’-CGGATCTGGAGGTTGGAGAA-3’20 第二章小胶质细胞的表型与应激敏感性的关系探究CD68Forward:5’-CCACAGGCAGCACAGTGGACA-3’NM_007A04Reverse:5’-TCCACAGCAGAAGCTTTGGCCC-3’CD86Forward:5’-ACGATGGACCCCAGATGCACCA-3’NM_007G03Reverse:5’-GCGTCTCCACGGAAACAGCA-3’INF-γForward:5’-CGGCACAGTCATTGAAAGCCTA-3’NM_007C03Reverse:5’-GTTGCTGATGGCCTGATTGTC-3’IL-1βForward:5’-CCAGCAGGTTATCATCATCATCC-3’NM_007F01Reverse:5’-CTCGCAGCAGCACATCAAC-3’IL-2Forward:5’-CCTGAGCAGGATGGAGAATTACA-3’NM_007D05Reverse:5’-TCCAGAACATGCCGCAGAG-3’IL-6Forward:5-ACCGCTATGAAGTTCCTCTC-3’NM_007H01Reverse:5’-CTCTGTGAAGTCTCCTCTCC-3’IL-12Forward:5’-GCCCTCTCTCTCCTCTTGCT-3’NM_007F03Reverse:5’-GTCTGCCTCTTTTGGTCAGG-3’TNF-αForward:5’-TACTGAACTTCGGGGTGATTGGTCC-3’NM_007H02Reverse:5’-CAGCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC-3’iNOSForward:5’-ACAACAGGAACCTACCAGCTCA-3’NM_007E01Reverse:5’-GATGTTGTAGCGCTGTGTGTCA-3’CCL17Forward:5’-CTCAGTTCATCCACGGCATAC-3’NM_007B04Reverse:5’-GACAAGGCTCACCATCATCG-3’CD163Forward:5’-CGGCACAGTCATTGAAAGCCTA-3’NM_007D02Reverse:5’-GTTGCTGATGGCCTGATTGTC-3’IL-4Forward:5’-TCTCGAATGTACCAGGAGCCATATC-3’NM_007C04Reverse:5’-AGCACCTTGGAAGCCCTACAGA-3’IL-10Forward:5’-TGGCCCAGAAATCAAGGAGC-3’NM_007B03Reverse:5’-CAGCAGACTCAATACACACT-3’TGF-βForward:5’-GACCGCAACAACGCCATCTA-3’NM_007C06Reverse:5’-GGCGTATCAGTGGGGGTCAG-3’Fizz1Forward:5’-TCCCAGTGAATACTGATGAGA-3’NM_007E03Reverse:5’-CCACTCTGGATCTCCCAAGA-3’Arg-1Forward:5’-AGACAGCAGAGGAGGTGAAGAG-3’NM_007A06Reverse:5’-CGAAGCAAGCCAAGGTTAAAGC-3’MMRForward:5’-AGTTGGGTTCTCCTGTAGCCCAA-3’NM_007D03Reverse:5’-ACTACTACCTGAGCCCACACCTGCT-3’YM1Forward:5’-CATTCAGTCAGTTATCAGATTCC-3’NM_007A02Reverse:5’-AGTGAGTAGCAGCCTTGG-3’IL-1raForward:5’-CCAGCTCATTGCTGGGTACT-3’NM_007B07Reverse:5’-TTCTCAGAGCGGATGAAGGT-3’IL-13Forward:5’-CAATTGCAATGCCATCTACAGGAC-3’NM_007F02Reverse:5’-CGAAACAGTTGCTTTGTGTAGCTGA-3’DCXForward:5’-GCGCCGCAGCAAGTCT-3’NM_007F06Reverse:5’-TTGAGAGCTGACTGCTGGAAGTT-3’IGF-1Forward:5’-GGTGGTTTATGAATGGTT-3’NM_007A05Reverse:5’-AGGGTGTGTCTAATGGAG-3’BDNFForward:5’-GAGCTGAGCGTGTGTGACAG-3’NM_007E04Reverse:5’-CGCCAGCCAATTCTCTTTTTGC-3’CXCL10Forward:5’-CATTCAGTCAGTTATCAGATTCC-3’NM_007H02Reverse:5’-AGTGAGTAGCAGCCTTGG-3’VEGFForward:5’-CGAGCTCATTGGTGGGTACT-3’NM_007I07Reverse:5’-TTCTCAGAGAGGATGCAGGT-3’21 电子科技大学博士学位论文2.2.7酶联免疫吸附测试提取海马和皮层，放入1.5mL离心管中，称重，用冷PBS洗涤2-3次，去除血污，10mg组织加入100μL蛋白裂解液（每1mL裂解液加入10μLPMSF），放置在冰上。用5mL注射器抽打组织，直至充分裂解。可以通过适量减少裂解液体积来提高蛋白样品浓度。将裂解后的样品10000-14000g离心3-5min，取上清液至新1.5mL离心管，切勿吸取沉淀，蛋白样品放入-80℃冻存。BCA法测蛋白浓度，按照BCA试剂盒说明进行蛋白浓度测定。根据标准曲线算出总蛋白浓度，对每组样品进行稀释，保证具有基本一致的蛋白浓度。Arg-1、iNOS、TGF-β、IL-4和BDNF浓度测定均严格按照ELISA试剂盒的说明执行。2.2.8蛋白免疫印记SDS-PAGE电泳，清洗玻璃板以及电泳实验仪器，对齐玻璃板用夹子加紧，加入液体多次检测避免漏胶。将TEMED加入配置好的分离胶中，立即摇匀即可灌胶，放入37℃的孵箱，20min后倒去较上面的水层，用吸水纸将剩余的水吸干。剩余空间灌入5%的浓缩胶，将梳子缓慢插入浓缩胶中，放置37℃孵箱使其凝固，小心拔出梳子，将样品加入电泳孔中，电泳。浓缩胶电压75-80V，30min，分离胶电压120V，1.5h。观察到溴酚蓝刚好跑出即可终止电泳，进行转膜，转膜条件为：300mA恒流转膜30min-60min左右，时间可根据蛋白分子量大小进行调整，转好膜应蛋白面向上，在其左上角剪缺口做好标记。转好的膜用丽春红染料染色，观察转染情况，用TBST清洗3次，5min/次，在摇床上晃动清洗。用5%脱脂牛奶（0.5%TBST配制）封闭1h，稀释一抗，4℃孵育过夜，用TBST在室温下驼色摇床上洗3次，每次5min，二抗室温孵育1h，亦用TBST清洗。ECLA和ECLB等体积混匀，将膜的蛋白面向上，与混合液充分接触1-2min，平铺在凝胶成像仪中，根据目的蛋白浓度调节曝光时间拍照。2.2.9统计学分析本论文的所有图表制作及统计学分析均采用Graghpadprism软件，所有数据的表示方法都是Mean±SEM，分析方法为one-wayANOVA中的Bonnferoniposthoc检验，P小于0.05表示有显著性差异。22 第二章小胶质细胞的表型与应激敏感性的关系探究2.3结果2.3.1应激敏感型与应激抵抗型动物的行为学差异为了检测小胶质细胞与抑郁症之间的关系，我们对应激后的小鼠进行筛选。本次筛选随机选择了20只体重相近的同龄小鼠作为对照组，40只小鼠作为应激组，应激组小鼠在应激前体重与对照组相比无差异。遭受了3周的慢性温和应激图2-1应激易感型和应激抵抗型小鼠的筛选和鉴定。Mean±SEM，Ctrl（n=13），LS（n=13-20）,andHS(n=12-20),*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005vsCtrl23 电子科技大学博士学位论文后，我们用糖水偏好(SPT)结果进行初步筛选，我们从中筛选出16只应激抵抗型小鼠和24只应激敏感型小鼠，再从悬尾实验(TST)和强迫游泳实验(FST)的结果中进一步对这些小鼠进行筛选，最终得到12只应激抵抗型小鼠（LS）和13只应激敏感型小鼠（HS），还有15只鼠在筛选过程中三个指标没有一致性结果，因此没有被用到后续试验。筛选模式和层层筛选结果如图2-1（a）和2-1(b)所示。为了确保筛选结果的可靠性，我们对筛选出来的小鼠做了更多的行为学分析。在自主活动测试(LAT)中，如图2-(c)所示，应激敏感型小鼠与应激抵抗型小鼠与对照组相比，运动和站立次数都没有显著性差异。这表明小鼠在悬尾和强迫游泳中的不动时间是由于心理因素，与身体运动性能无关，同时也反应了筛选结果的可靠性。紧接着，我们测试了小鼠的糖水消耗量，结果如图2-1(d)所示，应激敏感型小鼠表现出比对照组更低的糖水消耗，而应激抵抗型小鼠与对照组相比没有显著性差异。从毛色评分的结果来看，结果如图2-1(e)所示，应激敏感型小鼠表现出比对照组更低的毛色评分，而应激抵抗型小鼠与对照组相比没有显著性差异。从体重变化来看，结果如图2-1(f)所示，应激敏感型小鼠表现出比应激抵抗型小鼠更多的体重减轻。2.3.2海马区小胶质细胞与应激易感性相关联在确保筛选结果的前提下，我们从各组中随机挑选出6只小鼠做免疫组织化学染色，分别检测神经元和星形胶质细胞的变化，结果如2-2所示，各个组中的星形胶质细胞和神经元在皮层(PFC)、海马(Hip)、杏仁核（Amy）、小脑（Cb）和嗅球（OB）中均无显著性差异。我们又对小胶质细胞进行检测，检测结果如图2-3所示，小胶质细胞用Iba1抗体标记，吞噬溶酶体用CD68抗体标记，细胞核用DAPI标记，CD68阳性的小胶质细胞被认为是被激活的小胶质细胞。我们分别检测皮层(PFC)、海马(Hip)、杏仁核（Amy）、小脑（Cb）和嗅球（OB）中的CD68阳性的小胶质细胞的数量，结果如图2-3（b）所示，与对照组相比，应激敏感小鼠与应激抵抗小鼠中CD68阳性的小胶质细胞的数量在小脑、杏仁核和嗅球中没有显著差异，而在皮层中都有显著性提高。值得注意的是，CD68阳性的小胶质细胞的数量在应激敏感型小鼠的海马中显著提高，但是在应激抵抗小鼠的海马中没有显著变化。为了进一步确认这一结果，我们检测了Iba1阳性细胞的面积，结果如图2-3（c）所示，与对照组相比，应激敏感小鼠与应激抵抗小鼠中Iba1阳性细胞的数量在小脑、杏仁核和嗅球中没有显著差异，而在皮层中都有显著性提高。同样，Iba1阳性细胞的数量在应激敏感型小鼠的海马中显著提高，但是在应激抵抗小鼠的海马中没有显著变化。CD11b作为小胶质细胞激活的标志基因，我24 第二章小胶质细胞的表型与应激敏感性的关系探究们对CD11b的基因表达水平的检测结果如图2-3（d）所示，检测结果与免疫组织化学的结果相同。最后，我们分析了Iba1阳性细胞的面积与抑郁样行为的相关性，分析结果如图2-3（e）所示，海马区小胶质细胞的面积与悬尾实验中的不动时间呈正相关。小胶质细胞面积增大是激活的一个重要表征，因此，这些结果表明海马区小胶质细胞的激活与抑郁显著相关。图2-2应激易感型和应激抵抗型小鼠的神经元和星型胶质细胞变化差异。Mean±SEM，Ctrl（n=6），LS（n=6）,andHS(n=6)；Scalebar=20μm25 电子科技大学博士学位论文图2-3应激易感型和应激抵抗型小鼠的小胶质细胞变化差异。Mean±SEM，Ctrl（n=6），LS（n=6）,andHS(n=6),*P<0.05，**P<0.01vsCtrl；Scalebar=50μm26 第二章小胶质细胞的表型与应激敏感性的关系探究图2-4应激易感型和应激抵抗型小鼠的海马区小胶质细胞形态学差异。Mean±SEM，Ctrl（n=6），LS（n=6）,andHS(n=6),*P<0.05，**P<0.01vsCtrl；Scalebar=100μm接下来，我们对海马区亚结构中的小胶质细胞做进一步的检测，Iba1抗体标记小胶质细胞，DAPI标记细胞核，海马区的CA1区、CA3区和齿状回（DG）区的染色结果如图2-4（a）所示，正常海马中的小胶质细胞呈多分枝状，而且分枝精细，有着一个较小的胞体。应激抵抗型小鼠海马中的小胶质细胞与对照组相27 电子科技大学博士学位论文似，但是应激敏感型小鼠海马中的小胶质细胞表现出膨大的胞体，缩短变粗的分枝，呈现出阿米巴样的形态。我们对不同胞体的直径的小胶质细胞数量进行统计，统计结果如图2-4（b）所示，在海马CA3区和CA3区，直径小于125像素的小胶质细胞数量在三组之间没有显著性差异。然而在应激敏感型小鼠中，直径大于125像素的小胶质细胞数量显著增加；在海马DG区，直径小于75像素的小胶质细胞数量在三组之间没有显著性差异。然而在应激敏感型小鼠中，直径大于75像素的小胶质细胞数量都显著增加，直径在75像素-100像素的小胶质细胞数量在应激抵抗型小鼠中有少量减少。除此之外，我们统计了海马各亚区的小胶质细胞的数量，统计结果如图2-4（c）所示，与对照组相比，应激敏感型小鼠的DG区和CA1区的小胶质细胞的数目都显著增多。如图2-4（d）所示，应激敏感型小鼠CA1区、DG区和颗粒细胞层的小胶质细胞的分枝与对照组相比显著减少，而应激抵抗型小鼠的海马各区域的单个小胶质细胞分枝与对照组无明显差异。小质细胞的过度增殖也是小胶质细胞激活的一个重要表征。考虑到Iba1阳性着色的总面积的变化可能与小胶质细胞的增殖有关，因此，我们换算出了平均每个小胶质细胞的面积变化，换算结果如图2-4（e）所示，应激敏感型小鼠CA1区、DG区和颗粒细胞层的单个小胶质细胞的面积依然比对照组高，而应激抵抗型小鼠的海马各区域的单个小胶质细胞面积与对照组无明显差异。2.3.3星形胶质细胞在应激敏感型与应激抵抗型动物的海马中无明显差异除了小胶质细胞以外，星形胶质细胞也有可能参与应激的敏感性，因此本实验中，我们同时也检测了星形胶质细胞的变化。我们用GFAP来标记星形胶质细胞，用DAPI来标记细胞核，海马各亚区的染色结果如图2-5（a）所示，从星形胶质细胞的形态学上看，应激敏感型小鼠与应激抵抗型小鼠以及对照小鼠之间没有明显的差异。为了进一步确认这一结果，我们统计了星形胶质细胞所占的面积比，统计结果如图2-5（b）所示，在海马的CA1区、CA3区和DG区，三组的GFAP阳性着色面积没有显著性差异。接着我们分别统计了海马各亚区星形胶质细胞的数目，统计结果如图2-5（c）所示，应激敏感型小鼠与应激抵抗型小鼠海马的CA1区、CA3区和DG区的星形胶质细胞数量与对照组相比无显著性差异。我们在基因水平检测和海马区GFAP的表达情况，检测结果如图2-5（c）所示，海马区GFAP的表达在各组间没有显著性差异。28 第二章小胶质细胞的表型与应激敏感性的关系探究图2-5应激易感型和应激抵抗型小鼠的海马区星形胶质细胞的差异。Mean±SEM，Ctrl（n=6），LS（n=6）,andHS(n=6)；Scalebar=100μm2.3.4小胶质细胞相关的炎症因子在应激敏感型与应激抵抗型动物的海马中的差异表达小胶质细胞的激活常常会伴随着炎症水平的变化，紧接着，我们检测了海马区的多种炎症相关的基因变化，其中与促炎相关的基因包括CXCL10、MCP-1、CCL17、CD68、TNF-α、iNOS、IFN-γ、IL-1β和IL-6，与抗炎和神经营养相关的基因包括IL-4、Arg-1、CD163、IL-1ra、IL-10、Ym-1、CD206、Fizz1、TGF-β和IGF-1，并对成对的促炎/抗炎标志基因做比值分析。检测和分析结果如图2-6（a）所示，与对照组相比，应激敏感型小鼠的海马中的促炎性基因（CD68、TNF-α、iNOS、IL-1β和IL-6）显著升高，而抗炎性基因（IL-4、Arg-1、CD163、Ym-1、IL-10、和TGF-β）显著降低。应激抵抗型小鼠的海马中的促炎性基因均没有显著变化，而抗炎性基因IL-4、Arg-1显著升高。成对的促炎/抗炎基因做比29 电子科技大学博士学位论文值分析结果显示，TNF-α与IL-10的比值、iNOS与Arg-1的比值和IL-1β与IL-1ra的比值在应激敏感型小鼠的海马中显著增加，而在应激抵抗型小鼠海马内无显著变化，这意味着在应激敏感型小鼠的海马内的炎症因子失去平衡，炎症因子动态平衡的内稳态已被打破。与此同时，我们在蛋白质水平进一步确定TNF-α、iNOS和Arg-1的变化，检测结果如图2-6（b）所示，TNF-α、iNOS和Arg-1蛋白质水平的变化规律与基因的变化保持一致，表明我们基因筛选结果是可靠的。接下来，我们通过免疫组织化学双染色来确定这些炎症水平的变化是否与小胶质细胞激活相关。我们用诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的抗体标记iNOS，用Iba1抗体来标记小胶质细胞，用DAPI标记细胞核，检测海马区iNOS的细胞来源。染色结果如图2-6（c）所示，iNOS主要表达在Iba1阳性标记的细胞上，表明诱导型一氧化氮合酶主要由小胶质细胞产生。我们进一步统计了应激敏感型小鼠和应激抵抗型小鼠海马中的iNOS阳性小胶质细胞的数量，统计结果如图2-6（d）所示，与对照组相比，应激敏感型小鼠的海马中iNOS阳性小胶质细胞的数量显著增多，而应激抵抗型小鼠的海马中iNOS阳性小胶质细胞的数量没有显著变化。这种iNOS阳性的小胶质细胞我们认为是经典激活的小胶质细胞，即M1型。此外我们做了相关性分析确定小胶质细胞的促炎性激活是否与抑郁样行为相关。分析结果如图2-6（e）所示，悬尾实验的不动时间与iNOS阳性小胶质细胞的数量呈正相关。表明抑郁样行为与小胶质细胞的促炎性激活正相关。精氨酸酶1（Arg-1）是与iNOS作用正好相反的酶，他们催化共同底物向相反的方向代谢。我们用Arg-1的抗体标记Arg-1，用Iba1抗体来标记小胶质细胞，用DAPI标记细胞核，检测海马区Arg-1的细胞来源。染色结果如图2-6（f）所示，Arg-1主要表达在Iba1阳性标记的细胞上，表明Arg-1主要由小胶质细胞产生。我们进一步统计了应激敏感型小鼠和应激抵抗型小鼠海马中的Arg-1阳性小胶质细胞的数量，统计结果如图2-6（g）所示，与对照组相比，应激敏感型小鼠的海马中Arg-1阳性小胶质细胞的数量有所下降，但没有显著性差异，而应激抵抗型小鼠的海马中Arg-1阳性小胶质细胞的数量显著增加。这种Arg-1阳性的小胶质细胞我们认为是替代激活的小胶质细胞，即M2a型。此外我们做了相关性分析确定小胶质细胞的抗炎性激活是否与应激敏感性相关。分析结果如图2-6（h）所示，悬尾实验的不动时间与Arg-1阳性小胶质细胞的数量负正相关。表明抑郁样行为与小胶质细胞的抗炎性激活负相关。30 第二章小胶质细胞的表型与应激敏感性的关系探究图2-6小胶质细胞介导的的炎症性细胞因子在应激敏感型与应激抵抗型动物的海马中的差异表达。Mean±SEM，Ctrl（n=6），LS（n=6）,andHS(n=6),图（a）、图（d）和图（g）：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005vsCtrl；图（b）:*P<0.05，**P<0.01;Scalebar=20μm31 电子科技大学博士学位论文2.4讨论本章节通过免疫组织化学染色，行为学观察及分子水平检测研究了小胶质细胞与应激易感性之间的关系。我们从慢性温和应激的小组中成功筛选出了应激敏感型及应激抵抗型的两个亚群，并采用系统的行为学评价确定了这两个亚群的行为表型。比较了应激抵抗型小鼠与应激敏感型小鼠的多个脑区的小胶质细胞的差异，并明确海马区是小胶质两者存在差异的重要脑区之一。进一步比较了应激抵抗型小鼠与应激敏感型小鼠的海马亚结构中的小胶质细胞的差异，确定了CA1区和DG区为显著变化的海马亚区。系统地分析了小胶质细胞的形态变化，揭示了海马区的小胶质细胞激活与应激易感性相关。同时证明了海马区的星形胶质细胞在应激抵抗型小鼠与应激敏感型小鼠之间没有显著性差异。而且我们用免疫染色共定位揭示了炎症因子的改变与小胶质细胞的变化有直接的关系。关于精神障碍的发作，个体、易感性与应激之间存在几种可能机制：（1）易感性和应激可能是以与某种方式叠加而导致抑郁症状的出现；（2）只有一种因素起主要作用，而另一种只是一种补充、中介；（3）只有应激和易感性同等增强时，在它们的双重作用下就更容易导致障碍出现，相反只有其中一个因素得到增强时也难以增加抑郁的风险；（4）应激和易感性的相互作用可能是连续不断的，甚至可以累积，小的应激逐渐累积，最终可能导致障碍出现。易感性也可能因为累加而更加敏感；（5）应激和易感性的相互作用可能存在一个阈值。每个人都具有发生某种障碍的可能。应激与易感性相互作用，超过这个阈值障碍就会出现。[88]不同的人具有不一样的阈值。阈值的高低依赖于易感性的敏感程度和遭遇生活应激的强度。例如，强烈的应激与低易感性的作用，其阈值可能会很高。但如果阈值很低，极便很少很小的应激对高易感性的人也可能导致障碍。这些可能性目前都停留在逻辑推理与大胆假设的基础上，同时应激和易感性，是相对稳定的，但也不是固定不变。随着时间的变化，应激或易感性可能改变，从弱到强或者相反。因此在研究易感性的时候需要控制变量，最好能保持单一变量。本研究中，研究应激易感性时所采用的鼠均为同一品系的雄性小鼠，排除了品系和性别对应激易感性的影响，同时实验鼠的来源是固定的，消除了同一品系鼠之间在饲养过程中可能存在差异，这些小鼠都被单只单笼饲养，这样可以控制稳定的社会环境，也可以排除动物之间的安抚及交流行为给结果造成的偏差，最后这些动物几乎在同时遭受同等强度的生活应激而没有分批筛选，这样就排除了天气、季[33]节、应激手段之间的差异。经过3周慢性温和应激后，可用于应激敏感型和应激抵抗型动物的筛选，对于应激时间的选择，根据我们长期的研究发现，小鼠在遭受4周的慢性温和应激32 第二章小胶质细胞的表型与应激敏感性的关系探究后，超过三分之二的小鼠会表现出抑郁样行为，这将很难筛选到应激抵抗型小鼠，因此3周的应激是一个比较适用于筛选应激抵抗型和应激敏感型小鼠。从筛选结果来看大约有三分之一的小鼠表现出稳定的应激易感表型，还约有三分之一的小鼠表现出应激抵抗表型，另外三分之一在筛选过程中结果出现不均一的现象，这部分小鼠没有被运用到后续的的检测，同时我们采用了多重行为学检测进一步确定筛选结果可靠。以前的大部分研究都以单一的行为学结果作为筛选的指标，最终可能导致检测结果出现不均一现象。本实验中这种层层筛选的方法在当前的研究领域当属首创，在后续的检测中也证实这样的筛选方式是可靠的。性别对于抑郁模型的筛选是有很大影响的，雌性激素及生理周期均会对行为及分泌的因子造成影响，导致检测结果偏差较大，不能充分反应所研究的问题。我们在抑郁模型构建过程中用到的所有小鼠均为雄性小鼠，这样可减小个体差异，使结果更均一。我们以前的研究证明了应激导致的抑郁会伴随着海马和皮层区域的小胶质细胞激活，本研究对应激抵抗型小鼠和应激敏感型小鼠的大脑主要脑区的小胶质细胞做了检测，主要采用了一个吞噬溶酶体的标记蛋白CD68，与小胶质细胞的标记蛋白Iba1共染，这种CD68标记的小胶质细胞被成为反应性小胶质细胞，它预示着小胶质细胞被激活。我们发现小鼠在遭受应激之后，反应性小胶质细胞的数量在小脑、杏仁核和嗅球中都没有显著变化，这表明这三个脑区的小胶质细胞可能没有参与应答应激事件。反应性小胶质细胞在应激易感型小鼠和应激抵抗型小鼠的皮层都有显著提高，这表明应激皮层的小胶质细胞参与了对应激事件的响应，两种类型的小鼠之间并没有显著性差异，表明皮层的小胶质细胞仅仅与应激事件相关，与应激的易感性可能没有直接联系。然而，海马区的反应性小胶质细胞数目显著高于对照组和应激抵抗组，这表明应激的敏感性可能与海马区小胶质细胞的激活相关。进一步分析海马亚结构中的小胶质细胞形态发现小胶质细胞的胞体直径、分枝数量及胞体面积在应激敏感型小鼠的CA1区和DG区发生了显著的变化，表现出了明显的激活形态，这些变化与应激抵抗型小鼠是截然不同的，这表明CA1区和DG区的小胶质细胞激活与应激敏感性相关。也有观点认为星形胶质细胞也参与了抑郁的发生和发展，有研究者观察到星形胶质细胞在抑郁小鼠的大脑中出现数量减少的现象，因此本研究也比较了应激敏感型小鼠与应激抵抗型小鼠海马中的星形胶质细胞的形态和数量，结果发现与对照组相比，星形胶质细胞的形态和数量都没有发生改变，这表明星形胶质细胞可能没有直接参与应激的敏感性，可能抑郁发展到一定程度才会对星形胶质细胞造成影响。最后，我们检测了海马区33 电子科技大学博士学位论文炎症水平的变化，结果表明应激敏感型小鼠的海马中小胶质细胞呈M1型激活，这预示着M1型小胶质细胞与应激敏感性相关。另一个重要的发现是IL-4和Arg-1在应激抵抗型小鼠的海马内的表达与对照组相比是显著提高的，这预示这这两个细胞因子与应激抵抗型相关。Arg-1主要由小胶质表达，而IL-4的细胞来源还无法确定。在人类和实验动物中，应激通常与抑郁的发展相关。大量的证据揭示，暴露在应激环境能够引起小胶质细胞激活。急性应激源引起多个脑区小胶细胞的激活。米诺环素处理能够完全阻断足底电击对于下丘脑IL-1β的产生。2-6天的重复束缚或者是不可预知的刺激也会引起海马中小胶细胞的增生显著增加，同时伴随着一些小胶质细胞激活标志物mRNA表达水平的增加。对于进行重复社交挫败或是足底电击应激的小鼠也会表现出小胶细胞的激活外周巨噬细胞聚集到大脑以及焦虑样的行为。慢性应激能给实验啮齿动物制造一个抑郁样条件，同时也会造成[41]小胶细胞数量、形态和功能的改变。对于大鼠，每日对其进行束缚，持续2-3周，会造成抑郁样的症状，同时在应激应答的脑区伴随着小胶细胞数量的增加，分支数量增多，以及小胶激活标志物Iba-1（离子钙结合配体分子1）表达增多。最近的研究揭示，对大鼠进行慢性不可预知应激处理会导致小胶细胞的激活，刺[89]激小胶细胞NLRP炎症小体，以及背侧前额叶皮层IL-1表达的增加。在神经炎症等环境下，慢性不可预知应激处理会加重由腹腔注射的LPS引起的小胶细胞的激活。更重要的是，慢性应激对于小胶细胞激活的影响是多相性的，它取决于不同的指标，比如动物的年龄，例如，有研究就揭示了在青年鼠中应激引起的小胶细胞激活范围大于老年鼠中小胶激活范围，并且还取决于应激的本质，例如，[40]有研究揭示束缚能够激活小胶细胞而慢性不可预知应激不可以。早期应激，创伤，以及逆境是抑郁产生的主要危险因素。早期应激会改变免疫系统的功能，也会改变在后期对于免疫、内分泌、神经、行为方面对于各种挑[90]战的应对能力，并可能促成多种精神病理学的产生。考虑到在大脑和行为发展方面扮演的重要角色，早期应激引起的小胶细胞的改变可能对于授予抑郁的易损性十分重要。事实上，我们已经知道产前应激能够引起后代一系列的抑郁样症状，并且能够长时程地激活海马区小胶细胞，导致小胶细胞对于外周LPS处理的响应加剧。除此之外，经历母婴分离的成年鼠表现出小胶数量与分支运动能力的增加，对于那些在青年时期进行过长期食物剥夺应激的鼠来说，它们前额叶皮层[33]的小胶细胞活性也有所增加。对于未来的研究，应该着力于早期应激引起的小胶细胞结构和功能永久性的改变与抑郁易感性之间的研究。34 第二章小胶质细胞的表型与应激敏感性的关系探究除了传统的对于神经传递方面的影响外，抗抑郁药也能够抑制促炎因子的产生以及抑制小胶细胞的活性。具体来说，研究发现选择性5-羟色胺能够抑制体外培养或是大鼠体内小胶细胞产生肿瘤坏死因子和自由基氧化氮的的能力。而其他种类的抗抑郁药（包括三环类抗抑郁药、血清素/去甲肾上腺素重吸收抑制剂以及单胺类氧化物抑制剂）对小胶细胞的抑制效果也被发现在体外培养的小胶细胞中。我们也发现抗抑郁药能够减弱小胶细胞的激活，以及促进体内神经炎症环境下受损神经元的回复。最终，通过丙咪嗪或是氟西汀进行的长时程抗抑郁治疗能够阻止体内小胶细胞改变的发生，以及由慢性不可预知应激引起的抑郁样行为的[91]改变。2.5本章小结1.从慢性温和应激的小组中成功筛选出了应激敏感型及应激抵抗型的两个亚群，并采用系统的行为学评价确定了这两个亚群的行为表型。2.比较了应激抵抗型小鼠与应激敏感型小鼠的多个脑区的小胶质细胞的差异，并确海马区是小胶质两者存在差异的重要脑区之一。3.进一步比较了应激抵抗型小鼠与应激敏感型小鼠的海马亚结构中的小胶质细胞的差异，确定了CA1区和DG区为显著变化的海马亚区。4.系统地分析了小胶质细胞的形态变化，揭示了海马区的小胶质细胞激活与应激易感性相关。5.海马区的星形胶质细胞在应激抵抗型小鼠与应激敏感型小鼠之间没有显著性差异。6.在应激抵抗型小鼠和应激敏感型小鼠海马区系统地检测了炎症水平的变化，并发现IL-1β，iNOS等促炎性细胞因子在应激敏感型小鼠海马中显著上升，而在应激抵抗型小鼠的海马中无显著变化，IL-4，Arg-1等抗炎性细胞因子在在应激敏感型小鼠海马中显著下降，而在应激抵抗型小鼠的海马中呈上升趋势。7.iNOS和Arg-1在海马中的细胞来源是小胶质细胞，并且应激易感性与海马中促炎的小胶质细胞数量呈正相关，与抗炎的小胶质细胞数量呈负相关。35 电子科技大学博士学位论文第三章下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对小鼠应激易感性的影响3.1引言lL-4是1982年Howard于T细胞培养上清液中发现的具有多种生物学功能的细胞因子，Howard发现这种细胞因子能促进B细胞增殖，起初命名为B细胞生长因子1(BCGF-1)。有的人称之为B细胞刺激因子1、T细胞生长因子2(TCGF-2)。1986年基因克隆成功，国际统一命名为lL-4。IL-4是一活化的Th2淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞分泌的多效的细胞因子，单核细胞和骨髓中的多种细胞也都可以产生，是许多造血祖细胞来源的骨祖细胞的生成、分化因子[92]。小鼠IL-4基因长约6kb，成熟IL-4分子由120氨基酸残基组成，裸肽分子量为14kDa，有3个糖基化点，经糖基化后IL-4分子量为30kDa。人IL-4基因定位于第5号染色体，由4个外显子和3个内含子组成，约10kb，是现知淋巴因子基因中较大的一个。成熟人IL-4分子由129氨基酸残基组成，15kDa，有2个糖基化点，含有6个半胱氨酸，参与分子内二硫键的组成。IL-4前体蛋白从N端到91位氨基酸以及C端到128位氨基酸，人小鼠之间在氨基酸水平上有70%同源性。IL-4是Th2的特征细胞因子，有多效的免疫功能，是一种抗炎因子，具有强大而广泛的生物学活性，在Th2细胞为特征的免疫应答过程中发挥重要作用，能够调节T、B淋巴细胞的分化、活化。临床前不同阶段和临床研究表明其对白血病、肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病有治疗作用，IL-4还具有抗辐射和促进成肌细胞的融合、生长的作用，在老年痴呆的治疗中可抑制神经细胞损伤，并且IL-4[93]作为免疫佐剂在疫苗构建中也有一定的用途。IL-4受体(IL-4R)由802氨基酸残基组成，分子量为140kDa，胞膜外区209氨基酸，跨膜区24氨基酸，胞浆区569氨基酸。在小鼠的T细胞、B细胞、胸腺细胞、骨髓细胞、巨噬细胞和肥大细胞表面都有IL-4R，每个细胞受体数目在100到[94]2000左右，具有较高的亲和力。IL-4与IL-4R结合后会启动下游的信号通路[95]。目前研究表明IL-4信号在中枢神经系统中也起到非常重要的作用，IL-4基因敲除的小鼠会加重脑缺血的症状，同时会加重神经炎症水平，更有趣的是IL-4基[96]因敲除的小鼠会表现出抑郁样行为，同时会增加应激易损性。由此可见，抑郁和应激的敏感性可能与IL-4信号的减弱相关联。这种作用是否通过调节小胶质细胞表型实现的，还有待证实。36 第三章下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对小鼠应激易感性的影响小胶质细胞是一大类异质细胞，表型可变性和功能多样性是它们的重要特征，在局部微环境因素的影响下，分化成为不同的细胞亚型。最近几年的研究逐渐形成共识，作为巨噬细胞在中枢神经系统的对应物，小胶质细胞也存在M1和M2两种激活途径，两者具有不同的基因表达谱，并执行不同的功能。当被炎症激活后，小胶质细胞表现为M1型，可以产生大量的促炎症物质，被称为经典激[97]活途径（classicalactivation）。对应地，一类能够抑制调节炎症信号通路的细胞亚型，被称为M2型，它所介导的细胞激活途径则称为替代途径（altenative[98]activation）。促炎症配体如细菌脂多糖（LPS）或IFN-γ促进小胶质细胞向M1转化，产生TNFα、IL-6、IL-1β以及活性氧分子（ROS）等促炎症因子，通常具有促进中枢炎症反应的作用，并致局部组织损伤。而经IL-4、IL-13作用，小胶质细胞则向M2型转换，分泌IL-4、IL-10、TGF-β等抗炎症因子，可减少炎症反应强[99]度、促进神经组织的修复与重建。几种转录调节因子涉及细胞表型的转换，如IFN-γ通过转录因子STAT1增加M1表型，IL-13与IL-4通过STAT6、IL-10通过STAT3增加M2表型，另一种转录因子PPARγ有促进M2型小胶质细胞的作[94]用。IL-4是一种典型的Th2类细胞因子，主要参与体液免疫的调节。它可通过诱导巨噬细胞的替代激活而促进组织修复，现有证据表明它亦具有神经保护作用，与认知和行为等高级脑功能相关。前面的研究中我们发现IL-4在海马的基因表达水平在应激敏感型小鼠的海马中显著减少，而在应激抵抗型小鼠的海马中显著增高，这表明海马中IL-4水平的下调可能与应激易感性相关。在中枢神经系统中，IL-4通常与M2a型小胶质细胞联系在一起。研究表明IL-4在体外能够诱导出M2a表型的小胶质细胞，同时IL-4信号在体内，对于M2a小胶质细胞或巨噬细胞来说是不可或缺的。由此可见，IL-4对小胶质细胞的重要性。本研究中所观察到的一系列小胶质细胞的变化是否与IL-4信号的变化相关还不清楚。因此本章节的内容将着重探讨IL-4信号在小胶质细胞表型调节及应激抗性方面的作用。3.2材料与方法3.2.1实验动物本章内容用到两种类型的小鼠，用于常规研究的实验动物为7周龄C57/BL雄CreER/+性小鼠，购自四川省人民医院。另一种小鼠CX3CR1C57/BL6雄性鼠，实验动物日常饲养条件均与2.2.1相同，购于杰克逊实验室。37 电子科技大学博士学位论文3.2.2慢性温和应激及阈下应激慢性温和应激的方法与2.2.2相同，阈下应激手段与慢性温和应激相同，唯一的区别阈下应激时间缩短为10天。3.2.3行为学检测糖水偏好测试，自主活动，强迫游泳测试，糖水消耗测试和悬尾实验的检测方法与2.2.3相同。新奇环境摄食抑制（NSF）：在矿场中央放置一个糖球，然后将小鼠放在矿场中，用一套矿场检测系统OFT100记录小鼠从进入矿场到前足托起糖球的这潜伏期。矿场实验：将小鼠放入矿场中，用OFT100记录分析软件统计小鼠呆在矿场中央区域的时间。3.2.4动物筛选应激敏感型小鼠与应激抵抗型小鼠的筛选与2.2.4相同。3.2.5小胶质细胞培养0-3天C57/BL6乳鼠，脊椎脱臼法处死，浸入75%酒精3-5S，对乳鼠进行消毒，从颈部上方插入剪刀，剪至眼部，两边均剪开。取出全脑放入无菌PBS中，移除小脑和嗅球，用尖镊子剥离脑膜。用移液枪吹打组织块，使其尽可能小块，后转入50mL离心管800g离心5min，离心完毕保留沉淀，遗弃上清，操作尽量小心避免摇晃沉淀。然后加入5mL胰蛋白酶，放入37℃恒温水浴锅消化3-5min，期间应一直震荡，直至有胶状物开始出现，此时加入与等体积内含10%胎牛血清的DMEM-F12完全培养基，以此终止消化，加入后吹打多次。将70μm细胞筛放置在新的50mL离心管管口，用移液枪将终止消化之后的细胞悬液移至滤膜上，过滤液体后1200g离心10min。弃上清，可以清楚观察到的底部沉淀即为细胞，加入一定量的无菌PBS洗涤，用移液枪吹打沉淀，至其溶解，再次1200g离心10min。弃上清液，加入小胶质细胞培养基（45mLDMEM、5mLFBS、100μL双抗）10-15mL，吹成单个细胞。最后用电动枪将细胞加入细胞培养的方瓶中，注意方瓶的放置方向，切勿将大肚移液管放置太过深入，以防止污染细胞。24h后，更换小胶质细胞培养基，培养两周后用于后续实验。混合培养的胶质细胞14天后用震荡分离法分离纯化小胶质细胞。38 第三章下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对小鼠应激易感性的影响3.2.6LV-LoxP-CMV-GFP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα转染11分离纯化后的小胶质细胞转移到24孔板里培养，每孔加入1×10TU/mL浓度的LV-LoxP-CMV-GFP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα病毒，分别在12h、24h、48h和72h检测转染效率。3.2.7percoll法分离小胶质细胞取出小鼠的大脑，并从大脑出分离出海马组织，将海马组织剪碎，并在DMEM中轻轻吹打成细胞悬液，将细胞分离液（percoll）配制成100%、70%、50%和35%几梯度，将细胞悬液缓慢加入到底部，3000g离心30min，将50%与70%之间的细胞层抽提出来用于蛋白检测或细胞研究。3.2.8LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα慢病毒注射LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα慢病毒委托武汉枢密科技有限公司包装。1211公司提供病毒的滴度为3.8×10TU/mL，注射时稀释成1×10TU/mL。用1%戊巴比妥麻醉小鼠，立体定向仪固定小鼠，对小鼠海马立体定向定位（bromega2.3mm,L:1.8mm,V:2.0mm），在钻孔后双侧海马注射1μLLV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα慢病毒，速度0.2μL/15s，注射完毕后留针2min，然后每min退针1mm，整个注射过程接近10min，注射好后用碘酒做消毒处理，并缝合伤口。注射完的小鼠最好在放在28℃暖箱中有助于小鼠快速从麻醉中恢复。3.2.9免疫组织化学染色免疫组织化学染色与2.2.5相同。3.2.10实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR步骤与2.2.6相同。3.2.11酶联免疫吸附测试酶联免疫吸附测试方法与2.2.7相同。3.2.12蛋白免疫印记Westernblot步骤与2.2.8相同。39 电子科技大学博士学位论文3.2.13统计学分析本论文的所有图表制作及统计学分析均采用Graghpadprism软件，所有数据的表示方法都是Mean±SEM，分析方法为one-wayANOVA和two-wayANOVA中的Bonnferoniposthoc检验，P小于0.05表示有显著性差异。3.3结果3.3.1海马的IL-4水平与应激敏感的相关性尽管我们已经检测到IL-4水平在应激抵抗型小鼠的海马中显著上调，而在应激敏感型小鼠的海马中显著下调，但是这一现象是否具有脑区特异性性，以及是否与小胶质细胞的变化相对应都还不清楚。因此，我们在应激抵抗型小鼠和应激敏感型小鼠中检测IL-4在各个脑区的表达差异。我们首先用荧光定量实时PCR检测IL-4基因在脾脏、皮层、小脑、海马、脊髓、杏仁核和嗅球的表达。结果如图3-1（a）所示，与对照组相比，应激敏感型小鼠和应激抵抗型小鼠的皮层中的IL-4基因水平显著降低，而在脾脏、小脑、脊髓、杏仁核和嗅球中的IL-4基因水平没有受显著影响。IL-4的mRNA水平在应激敏感型小鼠的海马中显著减少，而在应激抵抗型小鼠的海马中显著提高。我们进一步从蛋白质水平确认这一发现，结果如图3-1（b）所示，IL-4蛋白在脾脏、皮层、小脑、海马、脊髓、杏仁核和嗅球的表达水平变化与基因水平的变化一致，表明的检测结果是可靠的。除了检测IL-4的变化外，我们用Westernblot检测了IL-4下游的信号通路的变化，检测结果如图3-1（c）所示，不仅IL-4在应激敏感型小鼠的海马中下调，IL-4下游的IL-4受体以及核转录因子STAT6磷酸化水平也显著下调。与之相反，在应激敏感型小鼠的海马中不仅IL-4上调，IL-4下游的IL-4受体以及核转录因子STAT6磷酸化水平也显著升高。这些结果预示着IL-4可能参与抑郁样行为及应激敏感性调节。因此，我们做了海马IL-4水平与抑郁样行为的相关性分析，分析结果如图3-1（d）所示，糖水消耗量与海马IL-4水平呈正相关，而悬尾的不动时间与海马IL-4水平呈负相关。表明海马的IL-4水平与抑郁样行为呈负相关。40 第三章下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对小鼠应激易感性的影响图3-1抑郁样行为与海马中减弱的IL-4信号相关联。Mean±SEM，Ctrl（n=6），LS（n=6）,andHS(n=6),*P<0.05，**P<0.01vsCtrl3.3.2海马的IL-4水平与炎症因子的相关性IL-4作为多功能的免疫调节因子，具有抗炎作用，因此我们推测他可能会对炎症因子的表达发挥免疫调节作用。接下来我们在正常鼠，应激抵抗型鼠和应激敏感型鼠中，对海马中促炎性细胞因子iNOS和抗炎性细胞因子Arg-1与IL-4的表达水平做相关性分析，分析结果如图3-2所示，海马中的iNOS蛋白水平与IL-4水平呈负相关，而海马中的Arg-1蛋白水平与IL-4水平呈正相关。41 电子科技大学博士学位论文图3-2海马中的IL-4水平与炎症因子表达相关联。Mean±SEM，Ctrl（n=6），LS（n=6）,andHS(n=6)3.3.3LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα慢病毒注射对IL-4Rα的影响尽管我们观察到海马中IL-4水平与炎症因子调节紧密相关，同时我们也发现小胶质细胞在海马中发生的一系列变化，但是IL-4对海马炎症的调控作用是否需要小胶质细胞参与，以及IL-4的减少与小胶质细胞的M1型激活之间的关系还不清楚。因此，我们想通过特异性地下调海马中小胶质细胞的IL-4受体来研究IL-4与小胶质细胞的关联。为了特异性地下调小胶质细胞中IL-4受体，我们引入了CreER/+CX3CR1C57/BL6小鼠，这种小鼠携带着小胶质细胞的特异性启动子CX3CR1,同时有Cre酶表达的基因，Cre酶能够特异性识别和剪切LoxP位点，更大的优势是Cre酶的表达是可药物诱导，而不是持续表达。在需要的时候给小鼠注射他莫西芬（tamoxifen）就能诱导Cre酶的表达。此外我们构建了带有LoxP位点的IL-4受体干扰病毒LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα，该病毒结合CreER/+CX3CR1C57/BL6小鼠就可以实现特异性的小胶质细胞的IL-4受体的干扰。简单介绍其工作原理，LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα病毒注射入CreER/+CX3CR1C57/BL6小鼠的海马后，病毒会转染海马区的多种细胞，小胶质细胞，星形胶质细胞及神经元，在该病毒成功转染后会表达LoxP基因，但由于LoxP后的终止基因（stop）会阻止后面的shRNA-IL-4Rα基因表达，因此，此时不能达干扰效果。但是我们在病毒注射两周后给小鼠它莫西芬处理，它能诱导小胶质细胞的Cre酶的表达，Cre酶将特异性识别LoxP位点，并将LoxP位点之间的终止基因（stop）特异性切除，后面的shRNA-IL-4Rα开始表达，此时就能实现特异性干扰小胶质细胞表面的IL-4受体。42 第三章下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对小鼠应激易感性的影响图3-3LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα慢病毒注射下调小胶质细胞中IL-4Rα的表达。Mean±SEM，ControlshRNA（n=5），LoxPshIL-4Rα（n=6）,**P<0.01，***P<0.005vsControlshRNA；Scalebar=20μm从上面的介绍我们不难看出，我们所需的慢病毒应具备较高的转染效率，特别是对小胶质细胞的转染。因此我们首先在体外培养了小胶质细胞中检测该病毒43 电子科技大学博士学位论文的转染效率，转染结果如图3-3（a）所示，LV-LoxP-CMV-GFP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα病毒对小胶质细胞的转染率接近80%。为了便于后续对小胶质细胞做染色分析，我们切除了病毒的荧光基团（CMV-GFP）。由于小胶质细胞在脑内只有10%左右，只下调小胶质细胞的IL-4受体可能对海马内IL-4受体的总量不会造成显著变化，如何检测检测该病毒的干扰效果成了我们面临的巨大挑战。为此，我们从小鼠的大脑海马中用密度梯度离心法分离出小胶质细胞，分离程序及结果如图3-3（b）所示，经统计，小胶质细胞的比例高达86.1%，表明我们的分离CreER/+步骤是可靠的。克服了上述的技术壁垒后，我们向CX3CR1C57/BL6小鼠的海马立体定位注射LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα病毒和对照病毒LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA，待小鼠恢复两周后腹腔注射它莫西芬诱导Cre酶表达，十天后从海马中分离出小胶质细胞检测IL-4受体及下游STAT6的磷酸化水平，检测结果如图3-3（c）所示，LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射尽管下调了海马内总的IL-4受体水平，但是与对照组相比并没有显著性差异。但从分离出的小胶质细胞中的检测结果发现，LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射显著降低了IL-4受体的水平，同时降低了下游的STAT6的磷酸化水平。3.3.4下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对应激敏感性的影响为了研究下调海马区小胶质细胞IL-4受体对应激敏感性和抑郁样行为的影响，我们给LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射的CX3CR1CreERC57/BL6小鼠一个阈下的社会应激（sCUS）,这个应激包括每天三个不可预知的应激源，持续应激十天，程序如图3-4（a）所示，这种轻度的应激对于多数小鼠不会造成显著影响，但可能对应激敏感的小鼠造成影响。经过十天的应激，我们分别检测了LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射和LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的CreER/+CX3CR1C57/BL6小鼠的抑郁样行为。糖水偏好实验(SPT)的检测结果如图CreER/+3-4（b）所示，LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的CX3CR1C57/BL6小鼠在遭受阈下应激后，糖水偏好率与对照组相比没有显著性差异。但是CreER/+LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射的CX3CR1C57/BL6小鼠的糖水偏好与对照小鼠相比显著降低。悬尾实验(FST)的检测结果如图3-4（c）所示，CreER/+LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的CX3CR1C57/BL6小鼠在遭受阈下应激后，悬尾不动时间与对照组相比没有显著性差异。但是CreER/+LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射的CX3CR1C57/BL6小鼠的悬尾不动时间与对照小鼠相比显著增多。强迫游泳实验(FST)的检测结果如图3-4（d）所示，44 第三章下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对小鼠应激易感性的影响CreER/+LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的CX3CR1C57/BL6小鼠在遭受阈下应激后，放弃挣扎的时间与对照组相比没有显著性差异。图3-4对下调小胶质细胞中IL-4Rα的小鼠做阈下应激助理对抑郁样行为的影响。Mean±SEM，Ctrl-shRNA（n=8），Ctrl-shIL-4Rα（n=8）,sCUS-shRNA（n=8），sCUS-shIL-4Rα（n=8）*P<0.05，**P<0.0145 电子科技大学博士学位论文CreER/+但是LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射的CX3CR1C57/BL6小鼠的放弃挣扎的时间与对照小鼠相比显著增多。新奇环境摄食抑制实验(NSF)的检测CreER/+结果如图3-4（e）所示，LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的CX3CR1C57/BL6小鼠在遭受阈下应激后，摄食潜伏期与对照组相比没有显著性差异。但是CreER/+LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射的CX3CR1C57/BL6小鼠的摄食潜伏期与对照小鼠相比显著增多。矿场实验(OFT)的检测结果如图3-4（f）所示，CreER/+LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的CX3CR1C57/BL6小鼠在遭受阈下应激后，在矿场中央的时间百分比与对照组相比没有显著性差异。但是CreER/+LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射的CX3CR1C57/BL6小鼠的在矿场中央的时间百分比与对照小鼠相比显著减少。在这些行为检测中LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA与LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射的CreER/+CX3CR1C57/BL6未应激组之间都没有显著性差异。3.3.5下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对炎症因子表达的影响除了行为学外，我们还分别检测了LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射和CreER/+LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的CX3CR1C57/BL6小鼠的海马小胶质细胞的变化。我们首先用免疫组织化学染色检测了M1型小胶质细胞的变化，M1小胶质细胞的免疫标记为iNOS阳性。染色结果如图3-5（a）所示，我们进一步对iNOS阳性的小胶质细胞进行统计分析，统计分析结果如图3-5（b）所示，CreER/+LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的CX3CR1C57/BL6小鼠在遭受阈下应激后，iNOS-Iba1双阳性细胞的数量与对照组相比没有显著性差异，CreER/+LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射的CX3CR1C57/BL6小鼠在遭受阈下应激后，iNOS-Iba1双阳性细胞的数量与LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的小鼠相比显著增多。同时我们检测了M2a型小胶质细胞的变化，M2a小胶质细胞的免疫标记为Arg-1阳性。染色结果如图3-5（c）所示，我们进一步对Arg-1阳性的小胶质细胞进行统计分析，统计分析结果如图3-5（d）所示，CreER/+LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的CX3CR1C57/BL6小鼠在遭受阈下应激后，Arg-1-Iba1双阳性细胞的数量与对照组相比没有显著性差异，CreER/+LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射的CX3CR1C57/BL6小鼠在遭受阈下应激后，Arg-1-Iba1双阳性细胞的数量与LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的小鼠相比显著减少。46 第三章下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对小鼠应激易感性的影响图3-5对下调小胶质细胞中IL-4Rα的小鼠做阈下应激处理对小胶质细胞的影响。Mean±SEM，Ctrl-shRNA（n=5），Ctrl-shIL-4Rα（n=5）,sCUS-shRNA（n=5），sCUS-shIL-4Rα（n=5）;图（b）、图（d）和图（f）：*P<0.05，#**P<0.01；图（g）：P<0.01vssCUS-shRNA；Scalebar=20μm47 电子科技大学博士学位论文另外我们检测了反应性小胶质细胞的变化，反应性小胶质细胞的免疫标记为CD68阳性。染色结果如图3-5（e）所示，我们进一步对CD68阳性的小胶质细胞进行统计分析，统计分析结果如图3-5（d）所示，LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的CreER/+CX3CR1C57/BL6小鼠在遭受阈下应激后，CD68-Iba1双阳性细胞的数量与对照组相比没有显著性差异，LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射的CX3CR1CreERC57/BL6小鼠在遭受阈下应激后，CD68-Iba1双阳性细胞的数量与LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的小鼠相比显著增多。在这些检测中LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA与LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα注射的CX3CR1CreERC57/BL6未应激组之间都没有显著性差异。此外，我们通过qPCR了其它炎症因子在海马中的变化，结果如图3-5（g）所示，CreER/+LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的CX3CR1C57/BL6小鼠在遭受阈下应激后，促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-6）及抗炎性细胞因子（CD163、IL-1ra和TGF-β）与对照组相比没有显著性差异，LV-LoxP-stop-CreER/+LoxP-shRNA-IL-4Rα注射的CX3CR1C57/BL6小鼠在遭受阈下应激后，TNF-α，IL-1β的表达水平与LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA注射的小鼠相比显著上调。3.4讨论在这一章的研究中，我们研究了海马区的IL-4与应激敏感性及小胶质细胞的关系。首先我们比较了应激抵抗型小鼠与应激敏感型小鼠的多个脑区的IL-4水平的变化，发现了IL-4在应激敏感型小鼠的海马区显著下调，而在应激抵抗型小鼠的海马中显著升高。通过相关性分析结果表明海马区的IL-4水平与绝望行为和快[100]感缺乏负相关，这意味着IL-4与应激敏感性相关。同时我们检测了IL-4下游的信号通路发现IL-4下游的信号通路在应激敏感型小鼠的海马中被减弱，而在应激抵抗型小鼠的海马中得到增强，并且应激的敏感性与海马区IL-4信号的减弱有关。因此，我们建立了Cre/LoxP系统，在海马区特异性下调了小胶质细胞的IL-4受体。让小胶质细胞感受不到IL-4信号，我们发现下调海马区小胶质细胞的IL-4受体能够加重应激小鼠海马区的炎症反应。同时能够增加小鼠对应激的易感性。关于小胶质细胞激活参与抑郁发生，近年国内外学者取得一些进展，在人类抑郁患者中，通过对患者PET扫描显示，在抑郁症患者脑内，小胶质细胞激活的特异性标志物的密度明显增加，对自杀患者尸检标本免疫组化检测提示，重症抑郁伴有明显的小胶质细胞增生，同时发现小胶质细胞的形态学发生变化；在抑郁48 第三章下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对小鼠应激易感性的影响动物模型中，应激可诱导小胶质细胞激活，小胶质细胞数量增加，海马IL-1β等细胞因子水平上升，并引起抑郁样行为；通过基因敲除的方法改变小胶质细胞激活状态，可影响动物的抑郁样行为，P2X7敲除小鼠不易引起抑郁行为并对抗抑郁药物敏感，而CX3CR1敲除小鼠则致抑郁行为更为显著并持久；心理或生理应激对于中枢神经系统的影响，一个显著持续便是应激相关脑区小胶质细胞的形态学改变和神经免疫系统处于预激活状态，同时出现认知行为的改变；抗抑郁药物在体内、外抑制小胶质细胞的激活。除传统强调的神经内分泌途径外，应激导致抑郁的一条重要途径是启动了小胶质细胞介导的中枢炎症反应过程。长期应激，除致外周细胞因子水平改变外，还可引起明显的中枢炎症表现，在与情感认知密切相关区域包括皮层、伏核、纹状体、尾核、杏仁核和海马等区域小胶质细胞的激活，伴有细胞因子水平增加，以促炎症因子增加为其显著特征。抑制小胶质细胞过度活性是治疗抑郁的一种新机制，学术界和制药企业都在进行积极的探索，某些抗炎或小胶质细胞抑制剂用于抑郁症的施治已经FDA批准进入临床试验阶段，尽管还没有得到一致性的结论，初步结果显示它们能够减轻患者的痛苦而无明显的毒副作用，人们对此寄极高的期待。IL-4作为抗炎性细胞因子之一，能够抑制静息态小胶质细胞向M1型极化，它对促炎性小胶质细胞的抑制主要表现在以下几个方面，首先从形态学上，应激抵抗型的小鼠由于有较高的IL-4水平，因此在遭受应激事件时，小胶质细胞的形态不容易发生改变，而应激敏感型小鼠海马内IL-4水平偏低，因此在遭受应激时，对小胶质细胞的促炎性激活失去了抑制，因此表现出了小胶质细胞的促炎性[101]激活状态。从我们的免疫组织化学染色结果来看，事实上单个小胶质细胞的形态并不是完全一致，而且胞体的大小也不均一，同时iNOS或Arg-1标记的小胶质细胞在正常小鼠海马中也普遍存在，只是数目相对较少，这表明应激导致小胶质细胞的激活是一个总体的概念，它只能说明小胶质细胞总体的激活水平升高，而不是所有的细胞都激活，而正常脑内的小胶质细胞也非绝对不激活或无激活细胞。IL-4在这个过程中的作用可能是抑制小胶质细胞的激活程度。但是总所周知，IL-4本身就能够激活小胶质细胞，那IL-4水平升高的应激抵抗小鼠为何没有表现出激活态的小胶质细胞形态。这里首先应该考虑IL-4的浓度问题，在先前的体外研究中，我们发现用低剂量的IL-4刺激小胶质细胞是无效的，无法导致形态学改变，这正好回答了这个问题。在应激抵抗型小鼠中升高的IL-4不足以诱导小[102]胶质细胞的形态学变化，但它可以抑制小胶质细胞向促炎状态激活。49 电子科技大学博士学位论文IL-4对M1型小胶质细胞的抑制还表现在对促炎性细胞因子的抑制，IL-4下游的信号通常会激活Arg-1的转录，同时也会增加IL-10这类抗炎性较强的细胞因子的表达，Arg-1的上调本身就会抑制促炎性因子iNOS的活性，从而抑制NO的产生，主要是Arg-1和iNOS有共同催化底物，它们此消彼长。这样就可以减少NO对周边细胞的损伤，没有损伤信号小胶质细胞自然也不会激活。本研究中采用了Cre/LoxP系统特异性下调小胶质细胞的的IL-4受体，对于研究IL-4信号在小胶质细胞中作用意义深远。当然IL-13与IL-4的作用相类似，大部分研究中将IL-4和IL-13的功能和下游途径放在一起研究。它们的功能以及通路都非常相近，IL-4和IL-13单独刺激或联合刺激小胶质细胞都能诱导出M2a表型的小胶质细胞，其作用途径主要也是STAT6途径。更重要的是IL-4或IL-13发挥作用时需要IL-4R与IL-13R耦合后才能高效激活下游通路，也就是说，阻断IL-4R会同时抑制IL-13的作用，本研究中阻断IL-4R是为了减少M2a型小胶质细胞的数量，若存在其它因素（IL-13）促进M2a型小胶质细胞生成，将会影响我们的阻断效率。因此，阻断IL-4受体同时减弱了IL-13的信号，这可以大大提高M2a型小胶质细胞的阻断效率。IL-4对M1型小胶质细胞的抑制作用可能涉及对神经元功能的完整性，IL-4信号对于BDNF水平的维持是至关重要的，而BDNF对于神经元功能的完整性又是必不可少的。神经元有一个重要的功能就是与小胶质细胞交互作用，通过CX3CL1-CX3CR1这条途径抑制小胶质细胞的激活。在应激条件下，IL-4通过增加BDNF来保护神经元的功能，进而实现对促炎性小胶质细胞的抑制作用。当然IL-4抑制M1型小胶质细胞的途径可能是上述几种的一种，也有可能几种机制同时存在，这还需要我们做进一步的探究。3.5本章小结1.比较了应激抵抗型小鼠与应激敏感型小鼠的多个脑区的IL-4水平的变化，发现了IL-4在应激敏感型小鼠的海马区显著下调，而在应激抵抗型小鼠的海马中显著升高。2.IL-4下游的信号通路在应激敏感型小鼠的海马中被减弱，而在应激抵抗型小鼠的海马中得到增强，并且应激的敏感性与海马区IL-4信号的减弱有关。3.海马区IL-4水平与促炎性细胞因子的表达呈负相关，与抗炎性细胞因子的表达呈正相关。4.建立了Cre/LoxP系统，成功下调了海马区小胶质细胞的IL-4受体。5.下调海马区小胶质细胞的IL-4受体能够加重应激小鼠海马区的炎症反应。6.下调海马区小胶质细胞的IL-4受体能够增加小鼠对应激的易感性。50 第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响4.1引言IL-4是一种多功能细胞因子，主要由肥大细胞，Th2细胞，嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞分泌，IL-4作为免疫力的有效调节剂。最初由Howard和Paul鉴定为B细胞的共同促分裂原，随后证实在生理和病理条件下IL-4都是白细胞存活的重要参与者，例如Th2细胞介导的免疫，B细胞中IgE类别转换细胞，以及“替代激活”巨噬细胞的组织修复和体内平衡。虽然粒细胞和2型先天淋巴细胞（ILC2）能够产生Th2细胞因子，但目前大多数文献都集中在Th2T细胞上。IL-4信号传导的作用是通过IL-4受体α链（IL-4Rα）介导的。当与其配体结合时，IL-4Rα与γ链二聚产生1型信号复合物，在造血细胞用IL-13受体α1（IL-13Rα1）[103,104]产生2型复合物，这种复合物很快也会表达在非造血细胞上。1型信号复合物对T细胞的Th2极化和替代激活的巨噬细胞（M2）的发展至关重要，而2型复合物在对IL-4和IL-13的非造血反应中起作用，例如高反应性和粘液产生等[105]。IL-4在变态反应和其他免疫疾病的病理学中具有确定的作用，其中T细胞分泌IL-4以诱导B细胞活化和IgE类转换。IL-4Rα被激活后，1型复合物通过Janus家族激酶（JAK1和JAK3）发出信号，该激酶磷酸化并产生转录因子STAT6的对接位点，STAT6二聚化并转位至细胞核。在其他作用中，STAT6促进GATA3（Th2细胞诱导物）和MHCII（骨髓和B细胞）的转录并诱导B细胞中的IgE类别转换。JAK1还磷酸化胰岛素受体底物，[106]它们通过PI3/AKT，PKB/mTOR和其他途径激活并促进存活和生长。2型受体也通过JAK家族激酶（JAK1和Tyk2）发出信号，但不是由T细胞表达，而是由非造血细胞例如内皮细胞和成纤维细胞响应IL-4。与1型一样，2型受体的大部分信息由STAT6传递，STAT6被磷酸化并在配体结合后转位至细胞核。2型受体也可作为IL-13的受体，IL-13是一种与IL-4相似的细胞因子，它首先与IL-13Rα1[107]结合，然后与IL-4Rα发生二聚化以产生熟悉的信号级联反应（如图4-1）。有研究表明，外周长期注射IL-4或IL-4/IL-10能够显著降低大脑中的炎症水平，同时能够改善应激诱导的抑郁样行为。由于血脑屏障的存在，传统的观点一直认为大脑是独立在外周免疫之外的，因而对于大脑的研究通常与免疫系统相分离。15Kd以上的分子都无法透过血脑屏障从外周进入中枢神经系统，在正常生51 电子科技大学博士学位论文[107]图4-1IL-4的信号转导途径理条件下，血脑屏障功能通常不会受到影响，但是人们发现IL-4在大脑中也能广泛表达。目前并没有证据显示IL-4的在大脑中的表达是否具有细胞选择性，研究表明星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元都能够表达IL-4和IL-4受体。脑源性的IL-4与外周的IL-4功能上可能有差异。这种差异可能来自于IL-4复杂的功能属性，IL-4对外周的作用是复杂的，外周的IL-4可能会诱导更多的细胞因子或介质，当IL-4通过血脑屏障进入大脑时，其它介质同样也有机会进入大脑并发挥作[96]用。因此，外周的IL-4处理无法说明IL-4对大脑的直接作用。从侧脑室注射IL-4，发现能够改善阿尔兹海默症模型鼠的认知功能，同时能够促进小胶质细胞对淀粉样蛋白的吞噬。通过慢病毒介导IL-4在脑内过表达也同样能够改善小鼠的认知障碍，表明IL-4在改善认知方面有一定的作用。也有研究显示在遭受应激时，成熟神经元会分泌大量IL-4来调控小胶质细胞的功能，从而让机体去适应应激环境。IL-4敲除的小鼠对应激表现较强的易感性，本研究也发现应激敏感型小鼠的海马中IL-4水平是降低的，下调小胶质细胞的IL-4受体能够增加小鼠对应激的易感性，这预示着IL-4具有潜在的抗抑郁作用。本章内容将研究脑源性的IL-4对抑郁样行为和小胶质细胞的影响。52 第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响4.2材料与方法4.2.1实验动物CreER/+本章内容用到的C57/BL雄性小鼠，和CX3CR1C57/BL6雄性鼠与3.2.1相同。4.2.2慢性温和应激方法与2.2.2相同。4.2.3行为学检测方法与2.2.3相同。4.2.4AAV-IL-4腺相关病毒制备基因的克隆：（1）无菌条件下取出C57BL/6小鼠脾脏，用Trizol法提取总RNA。（2）参照反转录试剂盒说明书的程序将提取的总RNA反转录合成第一链cDNA模板。（3）根据小鼠IL-4基因序列和的BamHI和XhoI双酶切克隆位点，设计IL-4的PCR的引物：上游引物：CGCGGATCCATGGGTCTCAACCCCCAG，下游引物：CCGCTCGAGCTACGAGTAATCCATTTGCAT（4）在200μL的EP管中分别加入2μL的cDNA模板，2μL的上游引物，2μL的下游引物，15μL的2xTransTaqHiFiPCRSuperMix和9μL的ddH2O，按照以下循环条件进行PCR反应扩增IL-4基因：95℃酶激活3min；95℃变性10s；72℃延伸10s，39个循环。（5）上一步所得的PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶分析系统上分析结果是否可靠。（6）在紫外灯下切出含有目的的琼脂糖凝胶，参照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书分离纯化出目的DNA。IL-4基因与载体pAAV质粒连接与转化扩增：（1）将分离纯化出的IL-4基因与Ef1α-EYFP-WPRE-pA质粒载体同时进行双酶切反应，通过连接体系在PCR仪上16℃过夜，将IL-4基因连接到质粒载体上。（2）将连接好的质粒载体与大肠杆菌在感受态大肠杆菌以10:1的比例混合，53 电子科技大学博士学位论文37℃水浴20min，再42℃水浴热激30s，加入250μL的SOC培养基，摇床200rpm、37℃培养1h。（3）取200μL的菌液涂布在培养大肠杆菌的培养板上，在37℃的培养箱中培养12h后进行蓝白斑筛选，重复上一步骤再次扩增，并用试剂盒提取质粒。（4）将上一步骤所得的质粒进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶分析系统上分析结果是否可靠。在紫外灯下切出含有目的质粒的琼脂糖凝胶，参照琼脂糖凝胶质粒回收试剂盒说明书回收目的质粒。（5）以重组质粒DNA为模板进行双向测序，最后通过BLAST工具进行同源性搜素和分析。AAV病毒的包装：（1）将冻存好的HEK293细胞进行复苏，并传代培养，待细胞生长旺盛时，选择细胞形态较均一，细胞边界清晰的细胞用于AAV病毒包装。（2）上一步得到的细胞以70%的比例种植到培养板中，待细胞生长良好后更换成Opti-MEM培养基进行培养，1h后，将纯化好的质粒用转染试剂稀释成1μg/μL的浓度，充分混匀，室温放置20min，将质粒-转染试剂混合液加入到培养的细胞中。37℃培养6h进行第一次换液，往后每24h换一次培养基。培养10天后，出现病毒空斑即可用于病毒纯化。（3）将上一步所得的细胞用经典的氯化铯梯度离心法进行病毒纯化。（4）将纯化的病毒转入透析袋中，在4℃条件下，用600倍体积的10mMTris-HCl，PH8.0透析36h。透析后的病毒保存于-80℃冰箱。4.2.5AAV-IL-4注射11将AAV-IL-4稀释成1×10TU/mL备用，用1%戊巴比妥麻醉小鼠，立体定位仪固定小鼠，对小鼠海马立体定位（bromega2.3mm,L:1.8mm,V:2.0mm），钻孔，双侧海马注射LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα慢病毒，每侧注射0.5μL，注射速度0.2μL/15s，注射完毕后留针2min，然后每min退针0.2mm，整个注射过程接近10min，注射好后用碘酒做消毒处理，并缝合伤口。注射完的小鼠最好在放在28℃暖箱中有助于小鼠快速从麻醉中恢复。4.2.6LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα慢病毒注射注射方法与3.2.8相同。4.2.7免疫组织化学染色54 第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响免疫组织化学染色与2.2.5相同。4.2.8实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR步骤与2.2.6相同。4.2.9酶联免疫吸附测试酶联免疫吸附测试方法与2.2.7相同。4.2.10蛋白免疫印记Westernblot步骤与2.2.8相同。4.2.11统计学分析本论文的所有图表制作及统计学分析均采用Graghpadprism软件，所有数据的表示方法都是Mean±SEM，分析方法为one-wayANOVA或two-wayANOVA中的Bonnferoniposthoc检验，P小于0.05表示有显著性差异。4.3结果4.3.1腺相关病毒介导的海马区IL-4的特异性表达及潜在抗抑郁作用为了检测脑源性的IL-4对抑郁样行为的影响，我们构建了IL-4的腺相关病毒载体（AAV-Ef1α-IL-4-eYFP-WPRE-PA），AAV-Ef1α-IL-4-eYFP-WPRE-PA通过双侧的海马注射，两周后我们检测该病毒在海马的表达情况，检测结果如图4-1所示，绿色荧光蛋白均匀地分布在海马区内，并没有扩散到周边区域，这表该病毒能够成功介导IL-4的过表达，同时也说明病毒注射浓度及海马定位是准确的。在病毒注射两周后，这些小鼠将遭受4周的慢性温和应激，最后进行行为学检测。在行为学检测时，我们采用FST100统计软件分析小鼠在强迫游泳实验和悬尾实验中的不动时间。其统计样本如图4-1（b）所示，它能将小鼠每min的状态分别作统计分析，这样可以避免人为统计造成的误差。强迫游泳实验统计分析结果如图4-1（c）所示，与对AAV-Ctrl组，AAV-IL-4-Ctrl组的不动时间没有显著性差异，AAV-CMS组表现出更多的不动时间，而AAV-IL-4-CMS组与AAV-CMS组相比则表现出更少的不动时间。悬尾实验统计分析结果如图4-1（d）所示，与对AAV-Ctrl组，AAV-IL-4-Ctrl组的不动时间没有显著性差异，AAV-CMS组表现出更多的不动时间，而AAV-IL-4-CMS组与AAV-CMS组相比则表现出更少的不动时间。这些结果表明IL-4过表达具有潜在的抗抑郁效果。55 电子科技大学博士学位论文图4-1AAV-IL-4在海马的特异性表达及潜在抗抑郁作用。Mean±SEM，AAV-Ctrl（n=8），AAV-IL-4-Ctrl（n=8）,AAV-CMS（n=9），AAV-IL-4-CMS（n=10）*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005;Scalebar=100μm为了便于在后续试验中做免疫组织化学染色，我们切除了AAV-Ef1α-IL-4-eYFP-WPRE-PA病毒的荧光基团，得到AAV-Ef1α-IL-4-WPRE-PA，由于缺乏标记，我们再次对该病毒的表达效果做进一步的鉴定。在病毒注射两周后，我们检测IL-4基因在脾脏、皮层、小脑、海马、脊髓和嗅球的表达，检测结果如图4-2（a）所示，IL-4特异性在海马高表达，说明注射定位是准确的。同时我们检测海56 第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响马的蛋白质水平，检测结果如图4-2（b）所示，在AAV-IL-4注射后，IL-4的蛋白质水平在海马也显著提高。此外，我们用Westernblot检测了IL-4下游的信号通路，检测结果如图4-2（c）所示，AAV-IL-4注射后不仅提高了海马的IL-4的蛋白质水平，同时能够激活下游的IL-4受体和核转录因子的磷酸化。表明在海马过表达的IL-4是能够正常发挥功能的。图4-2AAV-IL-4在海马的表达效果。Mean±SEM，Vehicle（n=5），IL-4（n=5）*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005vsVehicle4.3.2上调海马的IL-4水平对应激小鼠的小胶质细胞形态学的影响在AAV-IL-4注射两周后，小鼠被用于小胶质细胞形态学研究，操作流程如图4-3（a）所示，在CMS应激四周后，我们检测了小胶质细胞的形态学变化，用Iba1抗体标记小胶质细胞，用DAPI标记细胞核，染色结果如图4-3（b）所示，我们进一步对海马各亚区小胶质细胞的数量进行统计分析，统计分析结果如图4-3（c）所示，对照病毒注射的小鼠在遭受慢性温后，Iba1阳性细胞的数量与对照组相比显著增多。AAV-IL-4注射的小鼠在遭受慢性温和应激或非应激条件下，Iba1阳性细胞的数量与对照组相比显著增多。同时，对海马各亚区小胶质细胞的57 电子科技大学博士学位论文面积进行统计分析，统计分析结果如图4-3（d）所示，对照病毒注射的小鼠在遭受慢性温后，Iba1阳性细胞的面积与对照组相比显著增大。AAV-IL-4注射的小鼠在遭受慢性温和应激或非应激条件下，Iba1阳性细胞的面积与对照组或应激组相比都显著增大。另外，我们对单个小胶质细胞的形态做了进一步分析，各组的小胶质细胞形态如图4-3（e）所示，对海马各亚区单个小胶质细胞的面积进行统计分析，统计分析结果如图4-3（f）所示，对照病毒注射的小鼠在遭受慢性温后，单个Iba1阳性细胞的面积与对照组相比显著增大。AAV-IL-4注射的小鼠在遭受慢性温和应激或非应激条件下，单个Iba1阳性细胞的面积与对照组或应激组相比都显著增大。同时对海马小胶质细胞的分枝进行统计分析，统计分析结果如图4-3（g）所示，对照病毒注射的小鼠在遭受慢性温后，小胶质细胞的分枝与对照组相比显著减少。AV-IL-4注射的小鼠在遭受慢性温和应激或非应激条件下，单个小胶质细胞的分枝与对照组或应激组相比都显著减少。与此同时，我们检测了海马各亚区星形胶质细胞的形态学变化，用GFAP抗体标记星形胶质细胞，用DAPI标记细胞核，染色结果如图4-4（a）所示。实时PCR用于检测GFAP的基因表达，检测结果如图4-4（b）所示，AAV-IL-4注射不影响非应激小鼠海马中的GFAP表达，在CMS应激后，AAV-IL-4注射提高了GFAP的表达，这可能与应激导致星形胶质丢失有关。我们进一步对海马各亚区星形胶质细胞的数量进行统计分析，统计分析结果如图4-4（c）所示，对照病毒注射的小鼠在遭受慢性温后，GFAP阳性细胞的数量与对照组相比各亚区都没有显著性差异。AAV-IL-4注射的小鼠在遭受慢性温和应激后，DG区GFAP阳性细胞的数量与CMS组相比显著增多。同时，我们对海马各亚区星形胶质细胞的面积进行统计分析，统计分析结果如图4-4（d）所示，对照病毒注射的小鼠在遭受慢性温后，GFAP阳性细胞的面积与对照组相比各亚区都没有显著性差异。AAV-IL-4注射的小鼠在遭受慢性温和应激后，DG区GFAP阳性细胞的面积与CMS组相比显著增多。对单个星形胶质细胞的面积分析结果如图4-4（f）所示，各个组的单个星形胶质细胞的面积都没有显著差异。58 第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响图4-3AAV-IL-4在海马的特异性表达对小胶质细胞形态学的影响。Mean±SEM，AAV-Ctrl（n=6），AAV-IL-4-Ctrl（n=5）,AAV-CMS（n=6），AAV-IL-4-CMS###（n=6）；图（c）：*P<0.05，**P<0.01vsAAV-Ctrl；P<0.05，P<0.01vsAAV-CMS；图（d）、图（f）和图（g）：*P<0.05，**P<0.01，**P<0.00559 电子科技大学博士学位论文图4-4AAV-IL-4在海马的特异性表达对星形胶质细胞形态学的影响。Mean±SEM，AAV-Ctrl（n=6），AAV-IL-4-Ctrl（n=5）,AAV-CMS（n=6），AAV-IL-4-CMS（n=6）*P<0.05；Scalebar=100μm60 第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响4.3.3上调海马的IL-4水平对应激小鼠的炎症水平的影响小胶质细胞的激活常常会伴随着炎症水平的变化，紧接着，我们检测了海马区的小胶质细胞相关基因和多种炎症相关的细胞因子及趋化因子的基因变化，其中与小胶质细胞激活相关的基因包括Iba1、CX3CR1、CD11b和CSF1，与促炎相关的细胞因子包括CD68、TNF-α、iNOS、IFN-γ和IL-1β，与抗炎和神经营养相图4-5AAV-IL-4在海马的特异性表达对炎症水平的影响。Mean±SEM，AAV-Ctrl（n=6），AAV-IL-4-Ctrl（n=5）,AAV-CMS（n=6），AAV-IL-4-CMS（n=6）；###图（a）：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005vsControl，P<0.05P<0.01，###P<0.005vsCMS；图（b）和图（c)：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005；Scalebar=20μm61 电子科技大学博士学位论文关的细胞因子包括Arg-1、IL-10、CD206、Fizz1和TGF-β，并对成对的促炎/抗炎细胞因子做比值分析。检测和分析结果如图4-5（a）所示，与对照组相比，AAV-IL-4注射小鼠在非应激状态下，海马中的小胶质细胞激活相关的基因Iba1、CD11b和CSF1显著升高，而炎症相关的细胞因子CD68、Arg-1、IL-1β和Fizz1显著增加。在应激状态下，AAV-IL-4注射小鼠与AAV-对照相比，海马中的小胶质细胞激活相关的基因Iba1、CD11b和CX3CR1显著升高，而促炎性的细胞因子iNOS和IFN-γ得到显著的抑制，抗炎性细胞因子Arg-1、IL-10、CD206、Fizz1和TGF-β显著提高，成对的促炎/抗炎细胞因子做比值分析结果显示，iNOS与Arg-1的比值在AV-IL-4注射小鼠的海马中显著增加，而在CMS应激小鼠海马内显著降低。与此同时，我们在蛋白质水平进一步确定TGF-β、iNOS和Arg-1的变化，检测结果如图4-5（b）所示，TGF-β、iNOS和Arg-1蛋白质水平的变化规律与基因的变化保持一致，表明我们基因筛选结果是可靠的。接下来，我们通过免疫组织化学双染色来确定这些细胞因子的变化是否与小胶质细胞激活相关。我们用诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的抗体标记iNOS，用Iba1抗体来标记小胶质细胞，用DAPI标记细胞核，检测海马区iNOS的细胞来源。染色结果如图5-5（c）所示，iNOS主要表达在Iba1阳性标记的细胞上，表明诱导型一氧化氮合酶主要由小胶质细胞产生。我们进一步统计了各组小鼠海马中的iNOS阳性小胶质细胞的数量，统计结果表明，在AAV对照病毒注射小鼠中，CMS应激导致海马中iNOS阳性小胶质细胞的数量显著增多，AAV-IL-4注射显著抑制了应激导致的iNOS阳性小胶质细胞增多。而AAV-IL-4注射的小鼠的海马中iNOS阳性小胶质细胞的数量与正常对照组相比没有显著变化。精氨酸酶1（Arg-1）是与iNOS作用正好相反的酶，他们催化共同底物向相反的方向代谢。我们用Arg-1的抗体标记Arg-1，用Iba1抗体来标记小胶质细胞，用DAPI标记细胞核，检测海马区Arg-1的细胞来源。染色结果如图4-6（a）所示，Arg-1主要表达在Iba1阳性标记的细胞上，表明Arg-1主要由小胶质细胞产生。我们进一步统计了各组小鼠海马中的Arg-1阳性小胶质细胞的数量，统计结果如图4-6（b）所示，在AAV对照病毒注射小鼠中，CMS应激导致海马中Arg-1阳性小胶质细胞的数量显著减少，在应激或非应激条件下，AAV-IL-4注射显著增加海马区Arg-1阳性小胶质细胞。我们进一步在海马各亚区对Arg-1阳性的细胞进行分析，分析结果如4-6（c）所示，AAV-IL-4注射显著增加海马区CA3区和DG区的Arg-1阳性小胶质细胞占总的Arg-1阳性细胞的比值，CMS应激减少CA1区和DG区Arg-1阳性小胶质细胞占总的小胶质细胞的比值，AAV-IL-4注射显著增加海马区CA1、CA3区和DG区的Arg-1阳性小胶质细胞占总的Arg-1阳性细胞的比值。Weternblot分析总的62 第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响图4-6AAV-IL-4在海马的特异性表达对M2a小胶质细胞的影响。Mean±SEM，AAV-Ctrl（n=6），AAV-IL-4-Ctrl（n=5）,AAV-CMS（n=6），AAV-IL-4-CMS###（n=6）；图（b）：***P<0.005vsControl，P<0.005vsCMS；图（b）-图（d）：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.00563 电子科技大学博士学位论文Arg-1和小胶质细胞内的Arg-1的表达变化，检测结果如图4-6（d）所示，总的Arg-1的变化趋势与在小胶质细胞中的变化趋势一致。4.3.4上调海马的IL-4水平对应激小鼠的抑郁样行为的影响除了细胞学检测外，我们对AAV-IL-4注射的应激小鼠做了行为学分析，强迫游泳实验的检测结果如图4-7（a）所示，AAV对照病毒注射的小鼠在遭受慢性温和应激后，放弃挣扎的时间与对照组相比显著增多，潜伏期显著减少。但是AAV-IL-4注射的应激小鼠的放弃挣扎时间与AAV对照病毒注射的应激小鼠相比显著减少，潜伏期显著增加。悬尾实验的检测结果如图4-7（b）所示，AAV对照病毒注射的小鼠在遭受慢性温和应激后，放弃挣扎的时间与对照组相比显著增多。但是AAV-IL-4注射的应激小鼠的放弃挣扎时间与AAV对照病毒注射的应激小鼠相比显著减少。矿场实验的检测结果如图4-7（c）和4-7（d）所示，AAV对照病毒注射的小鼠在遭受慢性温和应激后，在矿场中央的时间百分比与对照组相比显著减少。但是AAV-IL-4注射的应激小鼠的在矿场中央的时间百分比与AAV对照病毒注射的应激小鼠相比显著增加，但所有组的移动总距离没有显著变化。新奇环境摄食抑制实验的检测结果如图4-7（e）所示，AAV对照病毒注射的小鼠在遭受慢性温和应激后，摄食潜伏期与对照组相比显著增多。但是AAV-IL-4注射的应激小鼠的摄食潜伏期与AAV对照病毒注射的应激小鼠相比显著减少。糖水偏好实验的检测结果如图4-7（f）所示，AAV对照病毒注射的小鼠在遭受慢性温和应激后，糖水偏好率与对照组相比显著减少。但是AAV-IL-4注射的应激小鼠的糖水偏好率与AAV对照病毒注射的应激小鼠相比显著增加。毛色评分的检测结果如图4-7（g）所示，AAV对照病毒注射的小鼠在遭受慢性温和应激后，毛色评分与对照组相比显著减少。但是AAV-IL-4注射的应激小鼠的毛色评分与AAV对照病毒注射的应激小鼠相比显著增加。体重测试结果如图4-7（h）所示，AAV对照病毒注射的小鼠在遭受慢性温和应激后，体重与对照组相比显著减少。但是AAV-IL-4注射的应激小鼠的体重与AAV对照病毒注射的应激小鼠相比有所增加。自主活动测试结果如图4-7(i)所示，在各个组之间，小鼠的站立次数和移动次数都没有显著性差异。64 第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响图4-7AAV-IL-4在海马的特异性表达对抑郁样行为的影响。Mean±SEM，AAV-Ctrl（n=8），AAV-IL-4-Ctrl（n=8）,AAV-CMS（n=8），AAV-IL-4-CMS（n=8）*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0054.3.5下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对胶质细胞的影响前面实验已经证明了IL-4的抗抑郁作用，而且能够导致小胶质细胞的一系列改变，但是IL-4的抗抑郁作用是否依赖于小胶质细胞目前还不清楚，因此在这部分内容中，我们特异性地下调海马区小胶质细胞的IL-4受体，具体操作流程如图CreER/+4-8（a）所示，我们先在CX3CR1C57/BL6小鼠的海马种注射LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA或LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα病毒，待小鼠恢65 电子科技大学博士学位论文图4-8下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对小胶质细胞的影响。Mean±SEM，CreER/+CreER/+Ctrl-CX3CR1：IL-4Rα-Vehicle（n=6），Ctrl-CX3CR1：IL-4Rα-IL-4CreER/+CreER/+（n=6）,Ctrl-CX3CR1：LoxP-IL-4Rα-IL-4（n=6），CMS-CX3CR1：CreER/+IL-4Rα-Vehicle（n=6），CMS-CX3CR1：IL-4Rα-IL-4（n=6）,CMS-CreER/+CX3CR1：LoxP-IL-4α-IL-4（n=6），*P<0.05，**P<0.01；Scalebar=50μm复两周后，在小鼠腹腔连续注射7天tamoxifen，然后再次向小鼠海马内注射AAV-IL-4病毒，待恢复两周后做4周的CMS应激，最后检测小胶质细胞的变化和行为学的变化。我们首先检测了小胶质细胞的变化，有Iba1抗体标记小胶质细66 第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响胞，DPI标记细胞核，染色结果如图4-8（b）所示，CMS或AAV-IL-4处理的小胶质细胞呈激活的阿米巴状，但是，在下调IL-4受体的小鼠海马中，小胶质细胞呈多分枝的静息态，这表明下调小胶质细胞的IL-4受体能够抑制IL-4对小胶质细胞的激活。我们进一步统计了小胶质细胞的面积，统计结果如图4-8（c）所示，在非应激状态下，下调小胶质细胞IL-4受体能够显著减少AAV-IL-4诱导的小胶质细胞面积的增大。正常对照鼠和IL-4受体下调鼠中，CMS应激能够增加海马中的小胶质细胞面积。对小胶质细胞的分枝统计结果如图4-8（d）所示，在非应激状态下，下调小胶质细胞IL-4受体能够显著增加AAV-IL-4诱导的小胶质细胞分枝减少。正常对照鼠和IL-4受体下调鼠中，CMS应激能够减少海马中的小胶质细胞的分枝。对小胶质细胞的数量统计结果如图4-8（e）所示，在非应激状态下，下调小胶质细胞IL-4受体能够显著减少AAV-IL-4诱导的小胶质细胞数目增多。正常对照鼠和IL-4受体下调鼠中，CMS应激能够增加海马中的小胶质细胞的数量。我们同时也检测了下调小胶质细胞对海马区星形胶质细胞的影响，用GFAP标记星形胶质细胞，染色结果如图4-9（a）所示，我们进一步统计了GFAP阳性染色的面积比，统计结果如图4-9（b）所示，在非应激的小鼠中，AAV-IL-4过表达或小胶质细胞的IL-4受体敲低都没有显著影响GFAP阳性染色的面积比。在CMS应激的小鼠中，AAV-IL-4注射轻微增加了GFAP阳性染色的面积比，下调小胶质细胞的IL-4受体不影响GFAP阳性染色的面积比。对单个星形胶质细胞面积计算结果如图4-9（c）所示，单个GFAP阳性细胞的面积在各个组之间没有显著差异。与此同时，我们做了小胶质细胞的表型分析，通过免疫组织化学染色对M2a表型的小胶质细胞进行标记，我们用Arg-1-Iba1双阳性的小胶质细胞代表M2a表型的小胶质细胞，染色及统计分析结果如图4-10（a）所示，在应激或非应激状态下，下调小胶质细胞IL-4受体能够显著减少AAV-IL-4诱导的M2a小胶质细胞面积的数量。CMS应激能够减少海马中的M2a小胶质细胞数量。我们用iNOS-Iba1双阳性的小胶质细胞代表M1表型的小胶质细胞，染色及统计分析结果如图4-10（b）所示，CMS能够显著增加海马中的M1小胶质细胞的数量，AAV-IL-4处理减少M1型小胶质细胞的数量。在应激状态下，下调小胶质细胞IL-4受体能够显著减少AAV-IL-4诱导的M1小胶质细胞的减少。67 电子科技大学博士学位论文图4-9下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对星形胶质细胞的影响。Mean±SEM，CreER/+CreER/+Ctrl-CX3CR1：IL-4Rα-Vehicle（n=6），Ctrl-CX3CR1：IL-4Rα-IL-4CreER/+CreER/+（n=6）,Ctrl-CX3CR1：LoxP-IL-4Rα-IL-4（n=6），CMS-CX3CR1：CreER/+IL-4Rα-Vehicle（n=6），CMS-CX3CR1：IL-4Rα-IL-4（n=6）,CMS-CreER/+CX3CR1：LoxP-IL-4α-IL-4（n=6），*P<0.05；Scalebar=50μm对反应性小胶质细胞的分析结果如图4-10（c）所示，CMS应激和IL-4处理都能增加海马区CD68阳性的小胶质细胞的数量，以及CD68阳性的面积占比，小胶质细胞的IL-4受体干扰能够阻断IL-4对CD68阳性的小胶质细胞的数量和CD68阳性的面积占比的影响。68 第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响图4-10下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对小胶质细胞表型变化的影响。Mean±CreER/+CreER/+SEM，Ctrl-CX3CR1：IL-4Rα-Vehicle（n=6），Ctrl-CX3CR1：CreER/+IL-4Rα-IL-4（n=6）,Ctrl-CX3CR1：LoxP-IL-4Rα-IL-4（n=6），CMS-CreER/+CreER/+CX3CR1：IL-4Rα-Vehicle（n=6），CMS-CX3CR1：IL-4Rα-IL-4CreER/+（n=6）,CMS-CX3CR1：LoxP-IL-4α-IL-4（n=6），*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005；图（a）和图（b）：Scalebar=20μm，图（c）Scalebar=5μm69 电子科技大学博士学位论文4.3.6下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对IL-4抗抑郁效果的影响尽管我们已经发现，下调海马区小胶质细胞的IL-4受体能够减少AAV-IL-4注射诱导的M2a的细胞数目，但是IL-4的抗抑郁作用是否与之相关还不清楚。因此图4-11下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对抑郁样行为的影响。Mean±SEM，Ctrl-CreER/+CreER/+CX3CR1：IL-4Rα-Vehicle（n=9），Ctrl-CX3CR1：IL-4Rα-IL-4CreER/+CreER/+（n=8）,CX3CR1：LoxP-IL-4Rα-IL-4（n=10），CMS-CX3CR1：CreER/+IL-4Rα-Vehicle（n=9），CMS-CX3CR1：IL-4Rα-IL-4（n=8）,CMS-CreER/+CX3CR1：LoxP-IL-4α-IL-4（n=8），*P<0.05，**P<0.01，***P<0.00570 第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响我们在干扰小胶质细胞IL-4受体的情况下又系统分析了多项行为学指标。悬尾实验分析结果如图4-11（a）所示，CMS应激能够增加正常小鼠在悬尾实验中的不动时间，但是在IL-4过表达小鼠中，CMS应激并不影响悬尾实验中的不动时间。但在小胶质细胞的IL-4受体受干扰后再过表达IL-4的小鼠中，CMS应激能够增加悬尾实验中的不动时间。类似的结果在强迫游泳实验（如图4-11b所示）、糖水偏好实验（如图4-11c所示）、矿场实验（如图4-11d所示）、糖水消耗实验（如图4-11e所示）、新奇环境抑制摄食实验（如图4-11f所示）、毛色评分测试（如图4-11g所示）和体重测试（如图4-11h所示）都被证实。在自主活动中各个组之间没有显著性差异。这些结果都表明IL-4诱导的M2a小胶质细胞在缓解抑郁症状的过程中发挥重要作用。4.4讨论本章内容我们成功构建了AAV-IL-4腺相关病毒载体，并在小鼠的海马区稳定表达。证明了在慢性温和应激的小鼠海马中上调IL-4的表达，能够改善小鼠的抑郁样行为，但在正常小鼠海马中上调IL-4的表达对行为并没有显著影响。通过从分子、细胞及组织学的检测，我们发现上调海马区的IL-4表达水平能够大量增加M2a型的小胶质细胞激活，这些小胶质细胞表现出数目的增加，胞体面积的增大和分枝的减少，最重要的是增加了M2a标志物（Arg-1）的表达，这种Arg-1阳性的小胶质细胞在海马的CA1区，CA3区和DG区都有大量分布。同时在海马中上调IL-4的表达能够抑制促炎性细胞因子的表达，并提高抗炎性细胞因子的表达。在慢性温和应激的小鼠海马中上调IL-4的表达虽然轻微增加了星形胶质细胞的数量，但是并不影响单个星形胶质细胞的胞体面积。下调海马区小胶质细胞的IL-4受体阻断了IL-4对小胶质细胞形态学的影响，同时减少了IL-4诱导的M2a小胶质细胞数量。在AAV-IL-4注射的应激小鼠中下调海马区小胶质细胞的IL-4受体阻断了IL-4的抗抑郁效果。这些数据表明IL-4的体内作用是复杂的，同时需要受到良好调节，而且取决于局部环境，并且它们可能在不同组织中同时介导不同的过程。在大脑中IL-4的作用机制就更为复杂，这种细胞因子进入大脑实质后，对神经细胞的作用方式或其对靶细胞的作用性质目前还知之甚少。已经也有研究证明了CNS中的小胶质细胞和星形胶质细胞与IL-4有关，但是IL-4在直接刺激神经元和少突胶质细胞方面的可能作用尚不清楚。小胶质细胞被认为是大脑组织中定居的巨噬细胞的等价物。尽管它们在发育早期阶段植入，并在生物体的整个生命期维持自我更新的群体，但它们的谱系与巨噬细胞相似。然而，当某些条件得到满足（通常涉及损伤）71 电子科技大学博士学位论文时，来自单核细胞谱系的新型小胶质细胞样细胞可以植入成年动物的大脑。尽管巨噬细胞和小胶质细胞之间的确切关系需要进一步研究，但了解相关细胞类型有助于理解小胶质细胞对IL-4和免疫刺激的反应。IL-4在许多细胞事件中起重要作用，使得难以在任何一个系统上研究其效[108]应，特别是在体内。虽然本论文重点介绍IL-4的神经功能，但大部分关于IL4[96]的知识都来自外周的研究免疫细胞，如巨噬细胞和淋巴细胞。因此，在讨论这种细胞因子的细胞靶点时，我们将在适当的时候从这些细胞类型推断。最早在巨噬细胞中对IL-4的研究结果表明，它在炎症刺激时同时或短时间内，可作为抗炎剂起作用，并且能够下调炎性细胞因子如TNF的产生。然而，IL-4不纯粹是抗[109]炎剂，因为用IL-4刺激巨噬细后，再进行促炎性刺激可导致炎症反应增强。本研究中也出现了类似情况，当IL-4过表达时会增加促炎性细胞因子IL-1β的表达，体内研究表明慢性高剂量IL-4刺激或转基因使IL-4过量产生都会导致巨噬细胞积累，增加IFN-γ表达，减少促炎细胞因子产生，组织细胞增多症，红细胞增[93]多症，髓外造血增多和体重减轻。本研究选择AAV-IL-4而不选择IL-4蛋白有其必要性，其必要性主要表现在以下几个方面：（1）对于抑郁症这种慢性疾病，其治疗过程缓慢，直接立体定位注射IL-4蛋白只能起到短暂的效果，因此需要借助AAV-IL-4使IL-4在大脑中长期稳定表达，AAV与其它载体相比，表达周期最长，转染效率也较高，用于研究慢性疾病较为合适。（2）若选择IL-4蛋白长期注射，其方案可行性不高。目前可供选择的IL-4蛋白长期注射方案有两种：一种是长期腹腔内注射，另一种方法则是采用定点微注射泵。但是IL-4蛋白分子量超过15KDa，若选择腹腔内长期注射，IL-4蛋白无法直接穿过血脑屏障，导致我们检测到的行为或神经细胞的变化都是IL-4对外周的间接作用，而不是对大脑的直接作用，更无法具体锁定到大脑的特定区域。若采用定点微注射泵注射，需要给小鼠在大脑上安装一个微注射装置，每天定量往大脑的海马区注射IL-4蛋白，该方法尽管可以实现特定脑区定量注射，但是，注射泵需要长期留在小鼠体内，定位注射针也需长期保留在海马中，一方面损伤部位无法愈合，这对于小鼠海马功能的影响极大，会影响到后期行为学的检测结果；另一方面小鼠会在饲养过程中抓挠注射泵，导致脑区定位在后期出现偏差，最终影响实验结果。而AAV-IL-4，只需要一次脑定位注射，注射后让其恢复两周，使注射伤口愈合。待伤口愈合后再做进一步的检测便可以避免上述的诸多弊端。（3）脑源性的IL-4与人工合成的IL-4在功能或作用效率上可能存在显著差异，我们用AAV-IL-4诱导神经细胞表达IL-4，这与大脑启动自我保护功能时的情况相似，此时分泌的IL-4更接近与大脑的生理功能。特别地，大脑内不同细胞72 第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响分泌的IL-4在功能上也可能出现差异，本论文的AAV-IL-4过表达结果显示，这种过表达的IL-4主要也是神经元分泌，大量研究表明神经元分泌的IL-4对小胶质细胞的调节最为普遍。外源的IL-4蛋白在功能上，可能无法替代脑源性的IL-4的功能。基于以上三方面的原因，本论文中选择AAV-IL-4有其不可替代性。小胶质细胞在M1和M2表型极化的研究主要参照中巨噬细胞的范例。典型的IL-4处理的巨噬细胞会表达相应的maker，这些基因表达变化，如Ym1和Arg1。和巨噬细胞一样，小胶质细胞通过诱导iNOS上调NO产生来响应IFN-γ的受刺激[96]。IL-4预处理能够减少IFN-γ或TNF诱导NO产生量增多。在胶质细胞中，IL-4在对iNOS的调节过程中可能会涉及多个信号通路，如图4-12所示，核转录因子[110]NF-κB和PPARγ便是两个主要的参与者。促炎性细胞因子通过激活PI3K-Akt来激活NF-κB，从而增加iNOS的表达；而IL-4通过激活PPARγ来抑制iNOS的表达。[111]图4-12IL-4抑制iNOS表达的信号途径也有研究表明IL-4通过减少TNF和增加IGF-1发挥神经保护作用。CD200在神经元上表达，其受体CD200R在小胶质细胞上表达，IL-4介导的小胶质细胞激73 电子科技大学博士学位论文活可以保护神经元损伤。IL-4基因敲除小鼠在减轻炎症反应方面比野生型小鼠的效果差，这与IL-4缺陷的神经元上较低的CD200表达有关。另一个有趣的研究发[97]现是IL-4激活的小胶质细胞可能会使成人神经祖细胞向少突胶质细胞分化。总而言之，小胶质细胞和巨噬细胞对IL-4信号的转导和激活途径是相似的。上述研究共同说明了IL-4在调节脑免疫中的关键作用，一种“替代激活的小胶质细胞被IL-4驱动，从而激活大脑免疫系统来支持脑功能。尽管炎性细胞因子已经牵涉到疾病行为，如抑郁、衰老和自身免疫，但为了达到最佳的大脑表现，外周和大脑免疫力的适当平衡可能是必需的。事实上，与经典炎症相关的某些细胞因子对于重要CNS功能的许多方面是必需的，例如通过胶质源性的TNF-α调节[92]突触缩放，IL-6维持海马中功能性LTP等等。在应激和疾病时期，大脑免疫力的微妙内稳态平衡被打破，伴随着潜在威胁，这时促炎分子产量很高。因此，通过脑膜T细胞和其他细胞类型产生IL-4可以通过恢复平衡的CNS进而使大脑适应外来刺激，恢复脑功能。因此，更好地了解免疫系统对中枢神经系统功能的影响，这为与免疫相关的神经系统疾病开辟新的治疗途径。4.5本章小结1.成功构建了AAV-IL-4腺相关病毒载体，并能在小鼠的海马区稳定表达，同时能够激活IL-4下游的信号通路。2.慢性温和应激导致海马区小胶质细胞呈激活状态，上调海马区的IL-4表达水平进一步增加小胶质细胞的数目和胞体面积，同时能够减少小胶质细胞的分枝。3.在慢性温和应激的小鼠海马中上调IL-4的表达虽然轻微增加了星形胶质细胞的数量，但是并不影响单个星形胶质细胞的胞体面积。4.在慢性温和应激的小鼠海马中上调IL-4的表达能够抑制促炎性细胞因子的表达，并提高抗炎性细胞因子的表达。5.在小鼠的海马区注射AAV-IL-4能诱导出大量的Arg-1阳性的小胶质细胞，这些细胞在海马的CA1区，CA3区和DG区都有分布。6.在慢性温和应激的小鼠海马中上调IL-4的表达，能够改善小鼠的抑郁样行为，但在正常小鼠海马中上调IL-4的表达对行为并没有显著影响。7.下调海马区小胶质细胞的IL-4受体阻断了IL-4对小胶质细胞形态学的影响。8.在AAV-IL-4注射的小鼠中下调海马区小胶质细胞的IL-4受体减少了Arg-1阳性小胶质细胞，同时增加了iNOS阳性的小胶质细胞。74 第四章上调海马中的IL-4表达水平对小胶质细胞及抑郁样行为的影响9.在AAV-IL-4注射的小鼠中下调海马区小胶质细胞的IL-4受体减少了小胶质细胞的激活程度。10.在AAV-IL-4注射的小鼠中下调海马区小胶质细胞的IL-4受体不影响星形胶质细胞的形态。11.在AAV-IL-4注射的应激小鼠中下调海马区小胶质细胞的IL-4受体阻断了IL-4的抗抑郁效果。75 电子科技大学博士学位论文第五章调节海马区的IL-4及IL-4受体表达对神经发生的影响5.1引言在20世纪九十年代之前，成年人类脑内的神经元被广泛地认为是不能再生的。因此，如果神经元在成年后因为任何原因（例如氧化应激，中风，神经变性疾病，头部损伤，正常衰老）死亡时，他们是不能被替换的。然而在20世纪六十年代，Altman和同事改变了这一看法，他们报告在成年大鼠的大脑内新生神经元至少在两个区域内自发不断的生成：海马区颗粒下层迁移到齿状回下层的细胞和室管膜下层迁移到嗅球的细胞。由于长期存在的教条思想认为哺乳动物中不存在[112]出生后的神经发生，因而在至少30年后Altman和Das的发现才被广泛接受。大多数分化能力强的干细胞分布在齿状回的颗粒下层和室管膜下区。这些干细胞进行不对称分裂，产生一个子代祖细胞和一个干细胞。该祖细胞能随后进行不对称分裂产生一个能分化成星形胶质细胞或神经元的子细胞和一个保留多次分裂能力的祖细胞。研究这些新生细胞的增长，存活和分化通常涉及分裂细胞的标[53]签胸苷和溴脱氧鸟苷（BrdU）的外因管理。这些新细胞（比如BrdU阳性的细胞）随后被用与荧光标签共轭的抗体检测出，通常还与其他标签共轭以区分这些[113]新生细胞的命运。例如，一个与神经元核蛋白（NeuN）共标签的的BrdU阳性蛋白表明该细胞是一个成熟的神经元。然而，一个BrdU阳性与S100β共标记的[114]细胞表明是星形胶质细胞。与使用总体形态学在鉴定新生细胞是否分化成神经元相比，使用双标记有着不需要依赖对细胞形态进行主观判断的优点。更多的免疫组织化学技术（例如，检测有丝分裂标记Ki67，和未成熟神经元标记双肾上腺皮质激素（DCX）与双重标记技术联合有助于确定新生神经元在大多数哺乳动[115]物的成年期持续不断的补充进齿状回和嗅球区。在海马中，成体神经发生涉及以下五个步骤：（1）在齿状回（DG）的颗粒下区（SGZ）中的神经干细胞/祖细胞（NSCs/NPCs）的增殖;（2）神经干细胞/祖细胞的分化，即命运决定（神经元与星形胶质细胞）;（3）祖细胞的大量丧失;（4）神经元分化和成熟;（5）与DG区的已有神经元的最终整合。每一步都受到生理刺激和病理生理条件的调节，细胞自主因素和神经生态位是两个重要的决定因素，它们在成人神经发生中起着关键作用。细胞自主因素决定NSC/NPC的内在遗传特征，而神经原生态位通过定义的局部微环境，决定NSCs/NPCs相互作[116]用的各种参数，并影响他们最终的命运。76 第五章调节海马区的IL-4及IL-4受体表达对神经发生的影响神经发生微环境可以调控神经发生的进程，即增殖，存活，分化，网络整合，这是一个极其复杂的过程，涉及到血管系统，生长因子，营养因子的增多，[56,57,117]电化学环境,和神经胶质细胞的改变。免疫系统作用于神经发生通过大脑内免疫细胞(如小胶质细胞)的活化和来自外周的炎症信号因子进入大脑。因此，[118-120]神经系统的激活对于新生神经元的增殖和存活有着潜在的影响。此外，已知一些生活方式的因素也会对新生神经元的增值殖，存活，分化，和整合进通路有着调节作用，这些因素包括应激，饮食和运动。而这些因素可能通过作用于大脑内的免疫系统和免疫细胞来发挥作用。小胶质细胞作为大脑内主要的免疫细胞，我们前面的研究已经证明了小胶质细胞在抑郁模型小鼠中发生了一系列变化，这些变化包括形态学变化和所表达的细胞因子的变化，特别是在海马DG区[121,122]的变化，而DG区是海马神经发生的主要区域。目前也有研究表明抑郁样行为与海马中减少的神经发生相关，这些证据预示这IL-4的抗抑郁作用可能通过调节小胶质细胞来影响神经发生。因此本章节主要研究了IL-4与海马神经发生之间的关系。5.2材料与方法5.2.1实验动物CreER/+本章内容用到的C57/BL雄性小鼠，和CX3CR1C57/BL6雄性鼠与3.2.1相同。5.2.2慢性温和应激方法与2.2.2相同。5.2.3行为学检测4.2.3行为学检测。5.2.4AAV-IL-4注射应激敏感型小鼠与应激抵抗型小鼠的筛选与2.2.4相同。5.2.5LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα慢病毒注射注射方法与3.2.8相同。77 电子科技大学博士学位论文5.2.6BrdU注射在检测神经前体细胞增殖和分化实验中，BrdU在应激3周后腹腔注射，注射剂量为50mg/kg/d，连续注射3天，注射后7天开始检测神经前体细胞的增殖和分化。而在神经前体细胞的成熟和存活实验中，BrdU在应激前注射，注射剂量也为50mg/kg/d，连续注射3天，注射后的小鼠在CMS应激完成后检测神经前体细胞的存活和成熟。5.2.7免疫组织化学染色免疫组织化学染色与2.2.5相同。5.2.8实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR步骤与2.2.6相同。5.2.9统计学分析本论文的所有图表制作及统计学分析均采用Graghpadprism软件，所有数据的表示方法都是Mean±SEM，分析方法为one-wayANOVA或two-wayANOVA中的Bonnferoniposthoc检验，P小于0.05表示有显著性差异。5.3结果5.3.1海马的神经发生与抑郁样行为的相关性在应激敏感小鼠与应激抵抗小鼠海马的齿状回区域检测海马的神经发生情况，结果如图5-1所示，应激敏感型小鼠海马区的DCX阳性细胞显著减少,如5-1（a）所示，DCX的基因表达量与对照组相比显著减少，如5-1（b）所示。另外我们检测了海马区神经前体细胞的增殖和分化，结果显示，应激敏感小鼠的海马齿状回SGZ区BrdU阳性细胞与对照相比没有显著性差异，DCX阳性细胞的分枝没有显著性差异。BrdU-DCX阳性细胞的数量及百分比在应激敏感小鼠海马中显著减少，结果如图5-1（c）-(e)所示。我们分析了抑郁样行为与海马神经发生的关系，结果如图5-1（f）所示，悬尾实验中的不动时间与海马中的增殖时间前体细胞数量呈负相关。海马体积估测的结果如图5-1（g）和（h）所示，应激敏感型小鼠的海马体积、齿状回体积和颗粒细胞层体积与对照组相比都显著减少。海马体积与抑郁样行为的相关性分析如图5-1（i）所示，一动不动时间与颗粒细胞层体积呈负相关，糖水消耗量与颗粒细胞层体积呈正相关。78 第五章调节海马区的IL-4及IL-4受体表达对神经发生的影响图5-1应激易感型和应激抵抗型小鼠的海马神经发生的差异。Mean±SEM，Ctrl（n=6），LS（n=6）,andHS(n=6),*P<0.05，**P<0.01vsCtrl79 电子科技大学博士学位论文5.3.2上调海马的IL-4水平对应激小鼠的海马神经前体细胞增殖和分化的影响我们在IL-4过表达的小鼠海马中检测了神经发生，检测结果如图5-2所示，在注BrdU注射一周后，我们用BrdU标记增殖的神经元，用DCX标记新生神经元，用DAPI标记细胞核。在慢性温和应激后，海马区BrdU-DCX阳性细胞的数量及百分比显著减少，IL-4处理的小鼠与CMS组相比，海马区BrdU-DCX阳性细胞的数量，BrdU阳性细胞的数量及BrdU-DCX阳性细胞占BrdU阳性细胞的百分比显著增高。图5-2AAV-IL-4在海马的特异性表达对海马神经前体细胞增殖分化的影响。Mean±SEM，AAV-Ctrl（n=6），AAV-IL-4-Ctrl（n=6）,AAV-CMS（n=6），AAV-IL-4-CMS（n=6）*P<0.05，**P<0.01，***P<0.00580 第五章调节海马区的IL-4及IL-4受体表达对神经发生的影响5.3.3上调海马的IL-4水平对应激小鼠的海马神经前体细胞成熟和存活的影响神经元成熟和存活的检测结果如图5-3所示，CMS应激导致DCX阳性的细胞减少，而IL-4处理能够增加海马区的DCX阳性细胞数量。CMS应激小鼠海马中图5-3AAV-IL-4在海马的特异性表达对海马神经前体细胞成熟和存活的影响。Mean±SEM，AAV-Ctrl（n=6），AAV-IL-4-Ctrl（n=6）,AAV-CMS（n=6），AAV-IL-4-CMS（n=6）*P<0.05，**P<0.0181 电子科技大学博士学位论文DCX-NeuN的细胞数量与对照组相比显著减少，在IL-4处理后，应激小鼠海马中的DCX-NeuN的细胞数量显著增加。在BrdU注射四周后对神经元存活和成熟的检测结果显示，成熟的神经前体细胞（BrdU-NeuN双阳性）和存活的神经前体细胞（BrdU阳性）的数量经CMS应激后显著减少，而IL-4处理的CMS小鼠与CMS小鼠相比，海马区BrdU-NeuN双阳性的数量显著增加。5.3.4下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对IL-4的促神经发生效果的影响CreER/+我们在CX3CR1小鼠中检测下调小胶质细胞的IL-4受体对海马神经图5-4下调海马区小胶质细胞的IL-4受体对IL-4促神经发生作用的影响。Mean±CreER/+CreER/+SEM，Ctrl-CX3CR1：IL-4Rα-Vehicle（n=6），Ctrl-CX3CR1：CreER/+IL-4Rα-IL-4（n=6）,Ctrl-CX3CR1：LoxP-IL-4Rα-IL-4（n=6），CMS-CreER/+CreER/+CX3CR1：IL-4Rα-Vehicle（n=6），CMS-CX3CR1：IL-4Rα-IL-4CreER/+（n=6）,CMS-CX3CR1：LoxP-IL-4α-IL-4（n=6）；*P<0.05，**P<0.0182 第五章调节海马区的IL-4及IL-4受体表达对神经发生的影响发生的影响，检测结果如图5-4所示，BrdU标增殖的细胞，DCX标记未成熟神经CreER/+元。IL-4能够在CMS应激的CX3CR1小鼠海马中增加BrdU阳性细胞的数CreER/+量，CMS应激显著减少了海马区CX3CR1小鼠海马中的BrdU-DCX阳性细胞的数量及分化比，IL-4处理的CMS小鼠与CMS组相比，海马区BrdU-DCX阳性细胞的数量，BrdU阳性细胞的数量及BrdU-DCX阳性细胞占BrdU阳性细胞的百分比显著增高。下调海马区小胶质细胞的IL-4受体，能够在CMS应激的ER/+CX3CR1Cre小鼠中阻断IL-4的促神经发生作用。5.3.5阻断海马神经发生对IL-4抗抑郁效果的影响尽管我们已经证明了IL-4在应激小鼠中具有促进海马神经发生的作用，但是这种作用是否是IL-4发挥抗抑郁作用的主要途径还不清楚，我们试图用替莫唑胺图5-5替莫唑胺对神经前体细胞增殖分化的影响。Mean±SEM，DMSO（n=5），TMZ,（n=5），*P<0.05，**P<0.01vsDMSO；Scalebar=20μm83 电子科技大学博士学位论文（TMZ）抑制海马的神经发生，进而评估IL-4的抗抑郁作用。TMZ处理后对神经发生的影响如图5-5所示，经过4周的TMZ处理，IL-4过表达的应激小鼠海马中的增殖的神经前体细胞数量显著减少，但没有显著影响神经前体细胞的分化，由此可见，TMZ阻断了细胞增殖，对神经发生起了抑制作用。图5-6替莫唑胺对小胶质细胞及抑郁样行为的影响。Mean±SEM，DMSO（n=5），TMZ,（n=5），*P<0.05，**P<0.01vsDMSO；Scalebar=50μm84 第五章调节海马区的IL-4及IL-4受体表达对神经发生的影响接下来我们检测了TMZ处理对小胶质细胞的影响，结果如图5-6（a）-（e）所示，TMZ处理并不影响小胶质细胞分枝及胞体面积，同时也不影响小胶质细胞的M1/M2激活表型。说明TMZ在不影响炎症水平的前提下特异性抑制了神经发生。进一步我们检测了IL-4过表达的CMS小鼠在阻断了神经发生后的行为学后果，结果如图5-6（f）-（m）所示，通过毛色评分、悬尾实验、糖水偏好、自主活动、强迫游泳实验、矿场试验和新奇环境摄食抑制实验检测了小鼠抑郁样行为，我们发现阻断了神经发生后能够阻断IL-4的抗抑郁效果。这些结果表明IL-4的抗抑郁作用主要是依赖于小胶质细胞介导的神经发生。5.4讨论在本研究中，我们证明了增殖的神经前体细胞在应激敏感型小鼠的SGZ区显著减少，而在应激抵抗型小鼠的SGZ区无显著变化，同时神经前体细胞的分化比在应激敏感型小鼠的SGZ区显著降低。海马及海马亚结构的体积在应激敏感型小鼠中显著减少，而在应激抵抗型小鼠的SGZ区无显著变化。抑郁样行为与减少的神经发生和减少的海马亚结构体积紧密相关。在慢性温和应激的小鼠海马中上调IL-4的表达能够增加增殖的神经前体细胞数量，同时能够促进神经前体细胞的分化、存活和成熟。下调海马区小胶质细胞的IL-4受体能够阻断IL-4的促神经发生效果。在AAV-IL-4注射的应激小鼠中阻断海马的神经发生会影响了IL-4的抗抑郁效果。我们的结果表明了慢性温和应激能够减少海马神经发生导致抑郁样行为，IL-4可以促进海马的神经发生并改善抑郁样行为，而且这种作用依赖于海马的小胶质细胞，同时阻断神经发生会导致抑郁样行为。但是神经发生如何影响行为目前还不清楚，有观点认为还没有完全整合到神经通路的新生神经元，能通过调整[82]它们之间的连接，他们的功能比已经整合进神经通路的老神经元有更广范。很明显旧神经元能调整自己的突触以响应相应的应激，但新生神经元可能演变出[123,124]更大程度上的延展性和可塑性。电生理学的证据表明年轻的神经元具有很高可塑性的单元。例如，海马区和嗅球区的新生神经元在长时程增强效应中有着更低的阈值，并且，在齿状回的年轻非成熟颗粒神经元中GABA是作为兴奋性的[125]神经递质。大约在6~8周的齿状回新生颗粒神经元与更老的神经元相比更可[126]能表达立早基因以响应行为上的应激。新生神经元是一个具有高度可塑性的单元，这个假说意味着在神经元发展的过程中存在着一个临界期，它能在这个临界期以内表现出成熟后就丧失的高度可[127]塑性。然而，这个假定的临界期确切的时期并不知道，并且在不同物种之间85 电子科技大学博士学位论文可能有着很大的差别。例如，在小鼠中齿状回的颗粒层新生神经元只需要花费几天到一周的时间就会表达成熟神经元的标记，并功能性的整合到海马区的回路[128]中，然而在猕猴中这个过程需要花费6个月。由于伦理道德的约束，同样的分析不可能用于人类，但从猕猴数据意味着如果临界期真的存在，那么人类的临界期可能比小鼠的长得多。在我们看来，齿状回的颗粒层的新生神经元可能对于齿状回所有功能都有贡献，而不是只是对于特殊认知功能。正如前文所说的新生神经元和就成熟神经元相比有着一些独有的特征，但新生神经元最后将会整合到已经存在的海马区回路中，因此新生神经元很可能有助于齿状回的日常维护和功[129]能。神经发生被多种因子调节，T细胞与小胶质细胞的交互作用参与环境增强所诱导的神经发生增强。重症联合免疫缺陷（SCID）的小鼠即缺乏功能性的T，B细胞的小鼠，并不能由环境丰富而引起神经发生增加。然而，如果将能针对某一个神经抗原的T细胞转入，那么神经发生的增强就会被修复。随着环境丰富，T细胞可能够诱导小胶质细胞倾向于替代的M2型，这时小胶质细胞表现出MHCⅡ[130]的表达增加，并且大多小胶质细胞似乎能与神经保护性分子IGF-1共标记。此外，在T细胞被转入的SCID小鼠中的环境丰富的积极作用可被二甲胺四环素使[131]用时会被阻碍，表明小胶质细胞参与到这一应答。尽管存在着差异，但这些研究都提供了小胶质细胞会应答环境或机体激活的证据。总的来说，这些数据表明了小胶质细胞能对环境因素如参与运动产生应答，并且这些偏差与神经发生的水平有对应关系。不管怎样，未来的工作需要确定这一关系是否有着因果关系，[132]也就是小胶质细胞能直接作用于神经发生的改变。海马区神经发生的损伤被认为是一个潜在的抑郁症发生机制并且作为一个抗抑郁治疗的靶点。一些研究表明，在炎症或应激环境下，小胶细胞的激活作为[133]一种神经发生抑制的重要机制。具体来说，LPS处理或是光照处理会导致海[134]马区神经发生的抑制，而使用米罗环素则会抵消这种影响。这种对于神经发生的消极影响主要是源于对于新生神经元的数量维持的一个影响，而不是对于其分生的限制。小胶细胞在神经发生被抑制这一过程中的特殊角色是由在炎症环境下新生神经元数量与激活小胶数量之间的负相关联系来揭示的。除此之外，体外实验表明，在条件培养基中，LPS处理的小胶会引起海马区神经干细胞的凋亡，这种凋亡受到小胶细胞分泌到培养基中的IL-6和TNF-α的介导，与之对应的是，在这种非激活小胶的培养基中，神经干细胞存货数量增加。小胶对于神经发生的影响可能受到IL-1分泌的影响，因为不管是急性的还是慢性的IL-1β的处理，都会损伤海马区的神经发生，但是我们通过药理学、基因或是手术治疗手段来阻抑86 第五章调节海马区的IL-4及IL-4受体表达对神经发生的影响IL-1β的产生，则会阻止神经发生的抑制以及由急性或慢性应激引起的抑郁样行为[118]。小胶质细胞来源的IL-1能够通过对于HPA轴的刺激以及影响糖皮质激素的分泌来对神经发生施加有害影响，通过肾上腺切除术，抵消CUS模型鼠中IL-1介导的神经发生抑制效果。IL-1还可以直接激活表达在海马神经前体细胞上的IL-1R，结果就会导致NF-κB信号通路介导的细胞增殖减少。除了在神经发生方面的作用外，小胶细胞也调控着其他神经可塑性的机制。因此，可以预期的是，[135]在炎症和应激环境下，小胶细胞的激活会干扰它们的调控。事实上，CMS模型的处理会通过GluR1磷酸化的抑制来损伤神经行为可塑性，比如空间记忆和海马长时程增强，而GluR1磷酸化对于突触可塑性以及空间记忆学习能力的维持是十分重要的。更重要的是，在整个CMS模型应激过程中，米罗环素的处理会阻止GluR1磷酸化和神经行为学的改变，这揭示了在啮齿动物中，小胶细胞激活相关的抑郁症可能会与谷氨酸能神经递质改变相关。炎症减弱海马区神经发生的机制一直还没有完全理解，但是证据显示激活的小胶质细胞及其随后分泌的炎症分子形成一个不适合新生细胞存活的环境。有证据表明经典的促炎症因子IL-1β，IL-6，和TNF-α对于炎症相关的神经发生的减少有贡献。在体外的研究发现说明了IL-6是由小胶质细胞释放的减弱神经元存活的关键因子。在脑内进一步过表达IL-6会减弱新生细胞的增殖，存活和神经性分化。IL-4在大脑中过表达后，抑制了这些促炎性细胞因子的表达，从而消除了促炎性细胞因子对海马神经发生的影响，除此之外，在非应激的小鼠中过表达IL-4，我们发现它能够促进神经前体细胞的增殖，这表明除了抗炎外，IL-4可能还有其他途径促进海马的神经发生，比如促进神经营养物质的分泌等，然而，在正常机体内额外增加神经前体细胞的数目，这对小鼠的大脑的正常功能可能会造成影响，但是我们的行为学检测结果表明，IL-4过表达的小鼠在抑郁样行为上与正常鼠没有差异，当然对其他行为是否有差异还有待进一步研究。为了揭示IL-4在正常鼠内影响了神经前体细胞的数量，为何没有影响抑郁样行为。我们做了神经元的存活和成熟，结果显示，IL-4尽管在正常鼠里增加了神经前体细胞的增殖，但不影响最终存活和成熟的神经前体细胞，这说明机体内可能存在一套限制神经发生的自我调节机制，能够以诱导凋亡或直接吞噬的方式将多余的神经前体细胞清理掉，所以最终保持了一定数量的神经前体细胞存活，最终变成成熟神经[80,136-138]元。87 电子科技大学博士学位论文5.5本章小结1.增殖的神经前体细胞在应激敏感型小鼠的SGZ区显著减少，而在应激抵抗型小鼠的SGZ区无显著变化，同时神经前体细胞的分化比在应激敏感型小鼠的SGZ区显著降低。2.海马及海马亚结构的体积在应激敏感型小鼠中显著减少，而在应激抵抗型小鼠的SGZ区无显著变化。3.抑郁样行为与减少的神经发生和海马亚结构体积紧密相关。4.在慢性温和应激的小鼠海马中上调IL-4的表达能够增加增殖的神经前体细胞数量，同时能够促进神经前体细胞的分化。5.在慢性温和应激的小鼠海马中上调IL-4的表达能够促进神经前体细胞的存活和成熟。5.下调海马区小胶质细胞的IL-4受体能够阻断IL-4的促神经发生效果。6.替莫唑胺注射能够阻断神经前体细胞的增殖，但不影响神经前体细胞的分化。7.在AAV-IL-4注射的小鼠中，替莫唑胺处理不影响小胶质的形态和表达产物。8.在AAV-IL-4注射的应激小鼠中阻断海马的神经发生会影响了IL-4的抗抑郁效果。88 第六章调节小胶质细胞的激活状态对神经干细增殖、分化、存活和迁移的影响第六章调节小胶质细胞的激活状态对神经干细增殖、分化、存活和迁移的影响6.1引言大家普遍接受小胶质细胞能够影响神经发生，据报道TNF-α有着类似的抗神经源性作用。例如，使用TNF-α后发现会削减颗粒层的细胞增殖。而且，在体外海马区神经分化模型中，额外的TNF-α会导致海马区干细胞或祖细胞的凋亡增加。海马区的神经细胞在TNF-α刺激的条件下会出现神经元细胞数目的减少，星形胶质细胞的数目增多。将正在分化的细胞与TNF-α接后发现抗神经源性基因Hes1表[139]达增强，这是一种通过抑制促神经系统基因表达来减弱神经性分化的基因。而且小鼠缺失TNF-α受体1会显示颗粒下层细胞增殖水平的下降，这表明TNF-α通过其受体1对细胞增殖起负调节作用。总的来说这些数据表明TNF-α水平上升会[140,141]降低细胞增殖并通过增加分化成星形胶质细胞来影响新生细胞的分化。IL-1β水平增加通过影响细胞增殖和分化来改变神经发生。神经前体细胞（NPC）已被揭示表达IL-1R1（IL-1受体1），说明IL-1β可能直接作用于NPC。在IL-1β存在的环境下培养胚胎大鼠的海马区NPC会显著减少NPC的增殖和神经球的生长。此外，IL-1β存在时的显示能增加干细胞成为星形胶质细胞细胞的比例，[142,143]减少新生神经元的百分比。为了证实慢性神经炎症在神经发生中的作用，利用Cre-LoxP条件转基因大鼠模型使成年海马区的IL-1β过表达。在IL-1β过表达后1到3个月里，使得颗粒层的DCX阳性细胞数量减少。新生神经元（例如，DCX阳性细胞）的减少是通过IL-1R1的激活来调节的，因为在IL-1R1敲除小鼠[144]的海马区DCX阳性细胞不会受到IL-1β过表达的影响。而且，IL-1β的长期表达削减了新生细胞分化成新生神经元的比例，增加了成为星形胶质细胞的比例，[145]说明了IL-1β促使新生细胞倾向于星形胶质细胞。IL-1β还与有应激引起的海马区神经发生的削减的调节有关。急性或慢性应激能减少细胞增殖，而这种削减能因IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)的使用而被阻碍,同样的缺乏IL-R1的小鼠也表现为[142]应激对于细胞增殖没有影响。此外，有研究报道了通过测量BrdU阳性的细胞DCX的表达发现长期应激削减了新生神经元数量，而这种削减能被IL-1Ra抑制剂所抑制。总的来说，这些数据揭示了IL-1β能通过减缓细胞周期来抑制祖细胞增殖，[146]并提高新生细胞分化成星形胶质细胞的概率来改变细胞的命运。小胶质细胞根据激活的形态不同分别发挥着增强和损害神经发生的作用。LPS(脂多糖)或IFN-γ的刺激能诱导小胶质细胞发生经典激活表现为促炎表型，也89 电子科技大学博士学位论文叫M1型，这一表型的小胶质细胞通常被认为损害海马区的神经发生。同时有证据表明小胶质细胞的经典激活后所分泌的促炎症因子IL-1β，IL-6，TNF-α损伤神经[147]发生，体外实验表明IL-6是抑制新生神经元存活的关键因子。当IL-4，IL-13等抗炎性因子刺激小胶质细胞时，小胶质细胞呈现出名为替代激活的表型，也叫M2型。这种表型的小胶质细胞的特征是高表达MHCⅡ（主要组织相容性复合体[148]Ⅱ），AG1（精氨酸酶1），MRC1（甘露糖受体1）等表面标记物。同时M2型小胶质细胞中抗炎症因子IL-10，TGF-β，生长因子如IGF-1（胰岛素样生长因[149]子），BDNF（脑源性神经营养因子），NGF（神经生长因子）的分泌也提高。大量实验证明替代激活的小胶质细胞有助于大脑损伤后新神经元的增殖，迁移，和整合。但是当诱导小胶质细胞的因子不同时，M2型小胶质细胞对神经前体细胞产生不同的影响。如IL-4刺激所得到的M2型小胶在与NPCs（神经前体细胞）培养时能增强神经元方向的分化，而IL-10刺激后的产生M2型小胶质细胞只能促进NPCs的增殖并不能促进分化。这一系列的实验现象足以证明替代激活的小胶质细胞对于神经发生有着重要的促进作用。当然IL-4影响神经发生也可能是通过调控小胶质细胞的表型来实现的。体内研究总是会伴随着诸多因素的干扰，如神经元与小胶质细胞的交互作用，或者是星形胶质细胞参与调控神经发生等，为了排除这些干扰，我们在本章节设计了体外实验，从体外诱导或从体内分离不同激活态的小胶质细胞，将他们与神经干细胞共培养或条件培养，检测他们对神经干细胞的增殖、分化和存活的影响。6.2材料与方法6.2.1体内小胶质细胞分离体内的小胶质细胞分离方法如3.2.7所示。6.2.2原代小胶质细胞培养原代小胶质细胞的培养方法如3.2.5所示。6.2.3原代神经干细胞培养出生0-3天的C57/BL6乳鼠，购自四川省人民医院。将乳鼠处死，浸入75%酒精浸泡3-5S。用镊子夹住乳鼠嘴部，沿眼睛方向剪开颅骨，取出全部脑组织放入装有无菌PBS培养皿，移除小脑和嗅球，后用镊子剥离剩余脑组织表面脑膜。另取一个培养皿，加入5mL无菌PBS，将表面剥离干净的脑组织转入，剪碎脑组90 第六章调节小胶质细胞的激活状态对神经干细增殖、分化、存活和迁移的影响织，将其移入50mL离心管，800g离心5min。弃上清液，留下组织碎块，加入A酶（木瓜蛋白酶）消化10min，之后加入等体积的DMEM/F12GlutaMax培养基终止消化，1200g离心10min。缓慢倾倒上清液，留下底部沉淀，加入3mLDMEM/F12GlutaMax培养基，用移液枪吹散组织块，再次1200g离心10min。离心完毕，加入6mL4×的神经干细胞增殖培养基（9mLDMEM/F12GlutaMax、400μLN2、800μLB27、80μLEGF、80μLFGF、80μL；双抗），将其培养在直径60cm培养皿中。6.2.4原代神经元培养在无菌条件下切取C57/BL6鼠头并以75%酒精浸泡1min，解剖出完整鼠脑；预冷解剖液中分离去除软膜、血管、取大脑皮质漂洗，用眼科剪将皮质反复剪切成碎块；移入培养皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2mL，37℃培养箱中消化30min；将皮层组织碎块移入离心管，弃去剩余消化液，用接种液洗3次，每次洗涤后使组织块充分沉降到试管底，弃去上清液；最后再用接种液1mL混悬，反复吹打（巴氏吸管）混悬液中组织块，力度适中，至浑浊后将上清液移入培养瓶待用；加入1mL接种液后再次吹打，如此反复3-4次，组织块逐渐消化后，弃去最终残块；收集含单细胞悬液的上清液约4-5mL于培养瓶中，以接种液重新悬浮细胞，细胞记数；接种1x107个细胞于6孔培养板中；培养24h至细胞贴壁后，换全培养液（DMEM/F12+2%B27，engreen）培养3天，观察神经元生长状况；换用阿糖胞苷培养液(终浓度2.5ug/mL，换半液)培养3天以抑制神经胶质细胞及杂细胞生长，获得单纯培养的原代神经细胞；每隔3天换全培养液1次，每次换半液。6.2.5小胶质细胞条件刺激首先，观察已成熟的小胶质细胞形态，拧紧方瓶瓶盖，用手掌用力拍打瓶子侧面，用显微镜观察，小胶质细胞悬浮在培养基中，用移液器将细胞转移至50mL离心管中。然后，将小胶质细胞接种到6孔板中，待细胞完全贴壁后，用[97]50ng/mL的IFN-γ或20ng/mL的IL-4分别处理小胶质细胞。最后处理24h后用来提取总蛋白和RNA，或用于免疫组织化学染色。6.2.6小胶质细胞与神经干细胞共培养小胶质细胞培养在transwell培养板的上层，用IL-4或IFN-γ刺激小胶质细91 电子科技大学博士学位论文胞，24h后，将神经干细胞培养在transwell培养板的下层，同时加入增殖或分化培养基，并将刺激好的小胶质细胞转移至神经干细胞上方，他们只有分泌物质的交流，并没有直接接触。6.2.7神经干细胞的条件培养用IL-4或IFN-γ刺激小胶质细胞，24h后，将培养基替换成新鲜的神经干培养基，让小胶质细胞持续分泌炎症介质24h后，搜集小胶质细胞的培养基，2000r离心，取上清液配制神经干细胞的增殖或分化培养基区培养神经干细胞，观察神经干细胞的增殖分化。6.2.8免疫组织化学染色免疫组织化学染色与2.2.5相同。6.2.9实时荧光定量PCR免实时荧光定量PCR步骤与2.2.6相同。6.2.10酶联免疫吸附测试酶联免疫吸附测试方法与2.2.7相同。6.2.11统计学分析本论文的所有图表制作及统计学分析均采用Graghpadprism软件，所有数据的表示方法都是Mean±SEM，分析方法为one-wayANOVA或two-wayANOVA中的Bonnferoniposthoc检验，P小于0.05表示有显著性差异。6.3结果6.3.1IL-4和IFN-γ对原代培养的小胶质细胞的影响首先，我们在体外培养了原代小胶质细胞，分别用IFN-γ或IL-4刺激小胶质细胞，检测小胶质细胞的表型变化，检测结果如图6-1（a）-（f）所示，IFN-γ刺激能够诱导促炎性细胞因子iNOS和TNF-α的显著上调，而IL-4刺激小胶质细胞后能够显著上调抗炎性细胞因子Arg-1和MMR。蛋白质检测结果也说明IFN-γ刺激能够诱导M1型小胶质细胞的标志物iNOS的增加，而IL-4刺激小胶质细胞后能够显著上调M2型的标志无Arg-1。92 第六章调节小胶质细胞的激活状态对神经干细增殖、分化、存活和迁移的影响图6-1IL-4或IFN-γ的条件刺激对小胶质细胞表型的影响。Mean±SEM，Ctrl（n=6），IL-4（n=6）,IFN-γ（n=6），*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005vsCtrl，Scalebar=10μm免疫组织化学检测结果也显示IFN-γ或IL-4刺激的小胶质细胞表现出阿米巴样的激活状态，通过免疫荧光强度的测试结果显示，相应的M1或M2标志物表达量会显著上升。我们检测了M1/M2小胶质细胞的表型维护持续时间，如6-1(g)所93 电子科技大学博士学位论文示，小胶质细胞在刺激24h后，将培养基更换成新鲜培养基，24h后检测iNOS和Arg-1的表达情况，结果显示IFN-γ刺激的M1型小胶质细胞可以持续24h表达iNOS，同样IL-4诱导的M2型小胶质细胞也可以维持24h表达Arg-1,。这些结果说明小胶质细胞的M1/M2表型能够被成功诱导出来，并且该表型可以在无刺激源的条件下维持24h。6.3.2IL-4或IFN-γ激活的小胶质细胞对神经干细胞的增殖、分化的影响在确定完小胶质表型后，我们将小胶质细胞与神经干细胞进行条件培养，检测在不同表型的小胶质细胞培养基中，神经干细胞的增殖、分化发生会发生哪些变化。结果如图6-2所示，我们制备了M1/M2小胶质细胞的条件培养基来培养神图6-2IL-4或IFN-γ激活的小胶质细胞对神经干细胞的分化迁移的影响。Mean±SEM，PBS-Ctrl（n=5），IFN-γ-Ctrl（n=5）,IL-4-Ctrl（n=5）,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005vsPBS-Ctrl（n=5）；PBS-M-CM（n=5），IFN-γ-M-CM（n=5）,IL-4-M-CM（n=5）*P<0.05；Scalebar=50μm94 第六章调节小胶质细胞的激活状态对神经干细增殖、分化、存活和迁移的影响图6-3IL-4或IFN-γ激活的小胶质细胞对神经干细胞的分化和增殖的影响。Mean±SEM，PBS-Ctrl（n=5），IFN-γ-Ctrl（n=5）,IL-4-Ctrl（n=5）,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005vsPBS-Ctrl（n=5）；PBS-M-CM（n=5），IFN-γ-M-CM（n=5）,IL-4-M-CM（n=5）*P<0.05；Scalebar=50μm经球，用GFAP标记星形胶质细胞，用DCX标记神经前体细胞，用DAPI标记细胞核，我们发现IFN-γ诱导的M1型小胶质细胞能够抑制神经球的分化迁移，而95 电子科技大学博士学位论文IL-4处理的M2型小胶质细胞能够促进神经球的分化迁移。考虑到神经球的迁移对神经干细胞分化造成一定的影响，我们将神经球消化成单个细胞，检测不同表型的小胶质细胞对单个的神经干细胞的增殖分化的影响。如图6-3所示，在分化3天的研究中，M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞对星形胶质细胞的分化没有影响，而IL-4处理的小胶质细胞能够增加神经前体细胞的分化。在7天的分化研究中，IFN-γ诱导的M1小胶质细胞能够减少DCX阳性细胞（神经前体细胞）的分化，而IL-4激活的M2小胶质细胞促进神经前体细胞的分化。在增殖研究中，发现M1型小胶质细胞减少了BrdU阳性的细胞，表明抑制了神经干细胞增殖，而IL-4处理的小胶质细胞增加了增殖的神经前体细胞数量。6.3.3海马中分离的小胶质细胞短期内对神经干细胞增殖、分化和迁移的影响考虑到体外原代培养的细胞在细胞属性上与体内细胞的差异性，我们从各个处理组的小鼠海马内分离出了小胶质细胞，用transwell将小胶质细胞与神经球共培养，分化迁移用GFAP标记星形胶质细胞，DCX标记神经元，DAPI标记细胞核，星形胶质细胞分化率用GFAP阳性染色的面积来估测，而神经元的分化率则用DCX阳性染色面积来估测。迁移率的统计是测量平均每个DAPI染色的细胞与未分化神经球的边缘之间的距离来表示，最终结果用对照组来做归一化。结果如图6-4所示，从CMS应激小鼠海马中分离的小胶质细胞显著抑制了神经球的分化迁移，而从IL-4过表达的小鼠海马中分离的小胶质细胞促进神经球的分化迁移。除了检测神经干细胞的迁移分化，我们检测了神经干细胞的增殖能力，增殖的细胞用BrdU标记，细胞核用DAPI表示，增值率则用BrdU阳性的细胞占总细胞的百分比来统计。在神经干细胞增殖研究中发现，从CMS应激小鼠海马中分离的小胶质细胞显著抑制了神经干细胞的增殖，而从IL-4过表达的小鼠海马中分离的小胶质细胞促进神经干细胞的增殖。我们也检测可不同处理的小鼠海马中分离的小胶质细胞对单个神经干细胞分化的影响，结果如图6-5所示，从CMS应激小鼠海马中分离的小胶质细胞显著抑制了神经干细胞向神经前体细胞和NG2细胞分化，而从IL-4过表达的小鼠海马中分离的小胶质细胞促进神经干细胞向神经前体细胞和NG2细胞分化。96 第六章调节小胶质细胞的激活状态对神经干细增殖、分化、存活和迁移的影响图6-4海马中分离的小胶质细胞短期内对神经干细胞增殖、分化迁移的影响。Mean±SEM，Vehicle-Ctrl（n=6），IL-4-Ctrl（n=6）,Vehicle-CMS（n=6），IL-4-CMS（n=6）*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005；Scalebar=50μm97 电子科技大学博士学位论文图6-5海马中分离的小胶质细胞对单个神经干细胞分化的影响。Mean±SEM，Vehicle-Ctrl（n=6），IL-4-Ctrl（n=6）,Vehicle-CMS（n=6），IL-4-CMS（n=6）*P<0.05，***P<0.005；Scalebar=20μm98 第六章调节小胶质细胞的激活状态对神经干细增殖、分化、存活和迁移的影响6.3.4海马中分离的小胶质细胞分泌物对神经干细胞增殖、分化和存活的影响由于小胶质细胞的体外易受环境的影响，在共培养时可能会导致其表型的变化，因此transwell难以用于长期的研究，为了克服这个困难，我们搜集体内分离图6-6海马中分离的小胶质细胞分泌介质对神经干细胞增殖、分化和存活的影响。Mean±SEM，Vehicle-Ctrl（n=6），IL-4-Ctrl（n=6）,Vehicle-CMS（n=6），IL-4-CMS（n=6）*P<0.05，**P<0.01；Scalebar=100μm（图a），20μm（图b，c）99 电子科技大学博士学位论文的小胶质细胞的培养基上清，制备成条件培养基，来研究小胶质细胞对神经干细胞增殖分化和存活的长期影响。检测结果如图6-6所示，从CMS应激小鼠海马中分离的小胶质细胞的培养基上清显著抑制了神经干细胞的分化和存活，而从IL-4过表达的小鼠海马中分离的小胶质细胞的培养基上清促进神经干细胞的增殖、分化和存活。6.3.5海马中分离的小胶质细胞对神经元突触生长的影响我们接着检测了小胶质细胞的分泌物对神经元突触生长的影响，我们在体外图6-7海马中分离的小胶质细胞对神经元突触生长的影响。Mean±SEM，Vehicle-Ctrl（n=6），IL-4-Ctrl（n=6）,Vehicle-CMS（n=6），IL-4-CMS（n=6）*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005；Scalebar=5μm100 第六章调节小胶质细胞的激活状态对神经干细增殖、分化、存活和迁移的影响培养了原代神经元，然后用小胶质细胞的培养基上清去处理神经元，结果如图6-7所示，MAP2表示神经元的突触，CMS处理的小胶质细胞的分泌物能够显著抑制神经元的突出生长，而IL-4处理过的小鼠海马中的小胶质细胞的分泌物能够保护神经元突出损伤。我们用同样的方法从小胶质细胞的IL-4受体敲低的小鼠中分离出小胶质细胞，并将它与神经干细胞条件培养，结果显示，下调小胶质细胞的IL-4受体可以阻断IL-4处理的小胶质细胞的促神经发生功能。6.4讨论在本研究中，我们发现IFN-γ在体外能够诱导出M1表型的小胶质细胞，IL-4能够诱导出M2a表型的小胶质细胞，这两种表型都能维持到24h。并且证明了IFN-γ诱导的M1型小胶质细胞抑制神经干细胞的增殖、分化和迁移，IL-4诱导的M2a型小胶质细胞促进神经干细胞的增殖分化和迁移。本研究中，在刺激小胶质细胞时IFN-γ和IL-4选择了不同的剂量，主要是考虑到不同的细胞因子对于小胶质细胞的诱导能力是有差异的，LPS和IL-4是强诱导剂，只需要较小的剂量便可以诱导出明显的小胶质细胞表型。但IFN-γ是弱诱导剂，需要较高的剂量才可以诱导出明显的小胶质细胞表型。LPS在诱导小胶质细胞表型的作用方式与IL-4不属于同一类，而且LPS除了导致小胶质细胞的促炎性细胞因子上调外，还会导致抗炎性细胞因子表达上调，因此本论文没有选择LPS作为M1型小胶质细胞的诱导剂，而选择了IFN-γ作为M1型小胶质细胞的诱导剂，但需要增加IFN-γ剂量，所以最终会在剂量选择上与IL-4有所区别。从另一个独立实验结果发现，抑郁小鼠海马中分离出的小胶质细胞抑制神经干细胞增殖、分化和迁移。AAV-IL-4注射的正常小鼠或应激小鼠海马中分离出的的小胶质细胞促进神经干细胞的增殖、分化和迁移。我们进一步证明了抑郁小鼠海马中的小胶质细胞通过分泌炎症介质来抑制神经球的增殖，神经干细胞的分化、存活和成熟，神经元的突触生长。同样来自AAV-IL-4注射的正常小鼠或应激小鼠海马中小胶质细胞的分泌介质促进神经球的增殖，神经干细胞的分化、存活和成熟，神经元的突触生长。IL-4作为一个经典的免疫调节因子对于机体的免疫调控有着不可替代的作用。而新的研究发现又将它的作用延伸到神经领域，进而被认为是外周免疫系统中T淋巴细胞调节中枢神经系统的桥梁。这一延伸不只是白细胞介素4自身功能的拓展，表明随着人类对于神经免疫系统的了解不断加深，就会发现神经与免疫[150]系统的联系比之前认为的要密切的多。从最初的认为中枢神经系统独立于免疫系统之外，到发现免疫细胞能侵润到大脑，再到免疫系统会调节神经发生的发101 电子科技大学博士学位论文[151]生影响认知，这都是人类对于神经免疫系统的了解的不断深入的证明。发现外周T细胞分泌的IL-4能穿过血脑屏障进入大脑对认知产生影响后，已有不少对于IL-4调节认知影响神经发生的研究。这些研究发现IL-4在大脑内也有表达，且IL-4能与大脑内多种细胞发生作用，如星形胶质细胞，小胶质细胞。这就意味着[107]IL-4在大脑内存在着多条影响神经发生的通路。这也是研究IL-4促神经发生的难点所在。另一难点在于大脑内细胞对于IL-4刺激的应答并不固定，如星形胶质细胞会根据刺激的IL-4的剂量及所处炎症环境选择倾向于促炎症表型或抑炎症[107]表型。相比较而言小胶质细胞作为大脑内主要的免疫细胞，其对于IL-4的刺激的应答敏感且相对确定。通常在接受到IL-4刺激后发生替代激活极化成M2型，且其所表达的抗炎症细胞因子也研究的较为透彻。M2型小胶质细胞主要分泌抗炎症因子及神经营养因子，有助于减缓神经炎症，修复神经损伤，促进神经分化。而M1型的小胶质细胞主要分泌促炎症因子，如IL-1β，是对神经发生有损[152]害作用。本实验中就证明了Il-4刺激的小胶质细胞高表达神经营养因子BDNF，而促炎症因子IL-1β表达量极低。同时众多研究表明环境强化，运动等增强神经发生的因素是通过使小胶质细胞倾向于M2型来实现作用的。但小胶质细胞作用于神经前体细胞的具体机制还有待进一步研究。6.5本章小结1．IFN-γ在体外能够诱导出M1表型的小胶质细胞，IL-4能够诱导出M2a表型的小胶质细胞，这两种表型都能维持到撤除刺激源后的24h。2.IFN-γ诱导的M1型小胶质细胞抑制神经干细胞的增殖、分化和迁移，IL-4诱导的M2a型小胶质细胞促进神经干细胞的增殖分化和迁移。3.抑郁小鼠海马中分离出的小胶质细胞抑制神经干细胞增殖、分化和迁移。4.AAV-IL-4注射的正常小鼠或应激小鼠海马中分离出的的小胶质细胞促进神经干细胞的增殖、分化和迁移。5.抑郁小鼠海马中的小胶质细胞的分泌物显著抑制了神经球的增殖，神经干细胞的分化、存活和成熟。6.AAV-IL-4注射的正常小鼠或应激小鼠海马中小胶质细胞的分泌介质促进神经球的增殖，神经干细胞的分化、存活和成熟。7.抑郁小鼠海马中的小胶质细胞抑制神经元的突触生长，AAV-IL-4注射的正常小鼠或应激小鼠海马中小胶质细胞增加了神经元的分枝数量和分枝长度。11.在AAV-IL-4注射的应激小鼠中下调海马区小胶质细胞的IL-4受体阻断了IL-4的抗抑郁效果。102 第七章BDNF通路在替代激活的小胶质细胞介导的神经发生中的作用第七章BDNF通路在替代激活的小胶质细胞介导的神经发生中的作用7.1引言成年神经发生是一个动态，并且精细的过程，会受到多种因素的影响而改变自身的状态，包括神经炎症，神经营养因子，年龄，环境等。当中枢系统存在损伤或感染时，中枢神经系统的小胶质细胞作为主要的防御承担者，在接受到不同炎症因子的刺激时会由静息状态经过两种途径，经典激活或替代激活转换成不同的表型，而这两种表型对神经发生有着或抑制或促进的作用。其中替代激活型的小胶质细胞能分泌神经营养因子例如IGF-1，BDNF等促进神经分化存活。研究表明，抑郁样行为与BDNF水平相关，脑源性神经营养因子（BDNF）是[153]神经营养因子家族的重要成员，是神经可塑性假说的关键组成部分。最早在[154]1982年脑源性神经营养因子在猪脑提取液中发现。自被发现，就一直作为一[155]个促进神经元存活和分化的神经保护性因子进行研究。后续研究发现BDNF能增强突触间递质的释放，加强突触联系，刺激成年神经元的轴突生长，调节合成代谢，增加神经元胞体大小，影响神经元的可塑性。酪氨酸激酶受体(tyrosinekinasereceptor,TrK)家族是神经营养因子受体。编码原癌基因-TrK家族有3个受体，即TrKA、TrKB、TrKC。其中成熟的BDNF[156,157]的高亲和力受体是TrkB。当成熟的BDNF结合到靶组织上的受体时，诱导[158]TrKB形成同源二聚体，进而自磷酸化TrK受体的特异位点。随后，活化的受[159]体可依次激活多种蛋白。当BDNF信号信息传至胞核，启动多种基因的表达或[160]者是直接参与到多种生理反应。有研究表明促炎因子抑制神经发生的作用机制之一是抑制BDNF的表达，表明BDNF是炎症环境对神经发生起作用的桥梁。M2[153,161]型的小胶质细胞分泌BDNF量增加。同时，已有实验证明在用抗体抑制M2型小胶质细胞分泌IGF-1，对NPCs向神经元的分化却没有影响，这表明M2型小胶质细胞的促神经发生作用需要其他因子的参与。所以我们推测BDNF很可能是该过程中的一个关键因子。7.2材料与方法7.2.1实验动物实验动物与3.2.1相同。103 电子科技大学博士学位论文7.2.2慢性温和应激慢性温和应激的方法与2.2.2相同。7.2.3行为学检测行为检测与2.2.3相同。7.2.4动物筛选应激敏感型小鼠与应激抵抗型小鼠的筛选与2.2.4相同。7.2.5LV-LoxP-stop-LoxP-shRNA-IL-4Rα慢病毒注射慢病毒注射与3.2.8相同。7.2.6AAV-IL-4病毒注射AAV-IL-4病毒注射方法与4.2.5相同。7.2.7percoll法分离小胶质细胞小胶质细胞分离与3.2.7相同。7.2.8小胶质细胞培养小胶质细胞培养与3.2.5相同。7.2.9神经干细胞培养神经干细胞培养与6.2.3相同。7.2.10原代神经元培养神经元培养与6.2.4相同。7.2.11小胶质细胞条件刺激小胶质细胞条件刺激与6.2.5相同。7.2.12小胶质细胞与神经干细胞共培养小胶质细胞与神经干细胞共培养方法与6.2.6相同。104 第七章BDNF通路在替代激活的小胶质细胞介导的神经发生中的作用7.2.13神经干细胞的条件培养神经干细胞的条件培养与6.2.7相同。7.2.14BDNF中和抗体处理在神经干细胞与小胶质细胞共培养或条件培养时，在神经干细胞的培养基中加入100μmol的anti-BDNF，而对照组中加入等浓度生物IgG对照抗体。7.2.15K252a药物处理神经干细胞与小胶质细胞共培养或条件培养时，在神经干细胞的培养基中加入10μmol的K252a，而对照组中加入等量的DMSO。7.2.16免疫组织化学染色免疫组织化学染色与2.2.5相同。7.2.17实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR步骤与2.2.6相同。7.2.18酶联免疫吸附测试酶联免疫吸附测试方法与2.2.7相同。7.2.19蛋白免疫印记Westernblot步骤与2.2.8相同。7.2.20统计学分析本论文的所有图表制作及统计学分析均采用Graghpadprism软件，所有数据的表示方法都是Mean±SEM，分析方法为one-wayANOVA和two-wayANOVA中的Bonnferoniposthoc检验，P小于0.05表示有显著性差异。7.3结果7.3.1海马的BDNF水平与海马IL-4水平和应激敏感性相关我们首先在应激敏感型小鼠与应激抵抗型小鼠中检测了BDNF的表达，检测结果如图7.1所示，BDNF的基因表达水平在应激抵抗型小鼠的海马中显著增加，在应激敏感型小鼠的海马中显著降低，这个发现在蛋白质水平得到了确认。通过105 电子科技大学博士学位论文相关性分析结果显示悬尾实验中的一动不动时间与海马中的BDNF水平负相关。同时我们也发现海马的IL-4水平与海马中的BDNF水平呈正相关。这表明IL-4的抗抑郁作用与BDNF水平相关。图7-1应激易感型和应激抵抗型小鼠的海马BDNF表达水平的差异。Mean±SEM，Ctrl（n=6），LS（n=6）,andHS(n=6),*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005vsCtrl7.3.2上调海马的IL-4水平显著增加小胶质细胞源性的BDNF水平我们进一步在AAV-IL-4注射的应激小鼠中检测BDNF的变化，检测结果如图7-3所示，不论在CMS应激或不应激的小鼠中，IL-4在海马的过表达，都能够引起BDNF的显著上调，这种上调不仅表现在基因水平，而且表现在蛋白质水平。我们进一步检测BDNF的来源，结果发现BDNF主要表现在Iba1阳性细胞上，这些细胞都是小胶质细胞，我们统计了BDNF阳性的小胶质细胞的数量，结果发现IL-4过表达增加了海马区BDNF阳性细胞的数量。我们进一步确认了BDNF阳性的小胶质细胞为Arg-1阳性的小胶质细胞，表明M2a表型的小胶质细胞增加表达了BDNF。为了进一步检测IL-4与BDNF小胶质细胞之间的关系，我们特异性地下调了海马区小胶质细胞的IL-4受体，检测AAV-IL-4注射的小鼠海马中的BDNF阳性小胶质106 第七章BDNF通路在替代激活的小胶质细胞介导的神经发生中的作用图7-2IL-4诱导海马区的小胶质细胞表达BDNF。Mean±SEM，（a）（-e）：AAV-Ctrl（n=6），AAV-IL-4-Ctrl（n=6）,AAV-CMS（n=6），AAV-IL-4-CMS（n=6）CreER/+*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005；（f）-（g）：Ctrl-CX3CR1：CreER/+IL-4Rα-Vehicle（n=5），Ctrl-CX3CR1：IL-4Rα-IL-4(n=5）,Ctrl-CreER/+CreER/+CX3CR1：LoxP-IL-4Rα-IL-4（n=5），CMS-CX3CR1：CreER/+IL-4Rα-Vehicle（n=5），CMS-CX3CR1：IL-4Rα-IL-4（n=5）,CMS-CreER/+CX3CR1：LoxP-IL-4Rα-IL-4（n=5），*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005；Scalebar=50μm107 电子科技大学博士学位论文细胞的变化，检测结果表明下调小胶质细胞的IL-4受体能够显著抑制IL-4诱导的BDNF阳性小胶质细胞的数量。通过相关性分析结果显示，海马的神经发生与海马中的BDNF阳性小胶质细胞的数量成正比。这预示这IL-4的抗抑郁作用主要是通过诱导M2a的小胶质细胞来增加分泌BDNF，进而促进海马神经发生。7.3.3阻断BDNF通路显著抑制M2a型小胶质细胞的的促神经发生效果的影响接下来我们探究BDNF信号对于M2a小胶质细胞介导的促神经发生作用是否是必须的。在体外研究中，我们采用了BDNF的中和抗体（anti-BDNF）使BDNF功能性失活，来探究IL-4处理的小胶质细胞对神经干细胞的影响。我们首先研究了BDNF在神经干细胞分化迁移中的作用，如图7-3所示，anti-BDNF处理的神经球表现出显著的分化迁移障碍，即使在M2a小胶质细胞的处理下也表现出对神经干细胞分化迁移的抑制。表明M2a小胶质细胞的促神经迁移的作用是通过BDNF发挥作用的。图7-3BDNF的中和抗体对神经干细胞增殖、分化迁移的影响。Mean±SEM，Vehicle-Ctrl（n=6），IL-4-Ctrl（n=6）,Vehicle-CMS（n=6），IL-4-CMS（n=6）*P<0.05，**P<0.01；Scalebar=50μm108 第七章BDNF通路在替代激活的小胶质细胞介导的神经发生中的作用图7-4阻断BDNF通路对体内分离的M2a小胶质细胞的促神经分化作用的影响。Mean±SEM，图（b）、图（e）和图（h）：Control-IgG（n=5），Anti-BDNF（n=5），*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005vsControl-IgG；图（c）、图（f）和图（i）：DMSO（n=5），K252a（n=5），*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005vsDMSO;Scalebar=20μm109 电子科技大学博士学位论文图7-5阻断BDNF通路对体内分离的M2a小胶质细胞的促神经突触生长作用的影响。Mean±SEM，图（b）：Control-IgG（n=5），Anti-BDNF（n=5），*P<0.05vsControl-IgG；图（c）：DMSO（n=5），K252a（n=5），*P<0.05，**P<0.01vsDMSO;Scalebar=10μm我们进一步研究了在BDNF信号阻断的情况下，体内分离的M2a小胶质细胞对单个神经前体细胞的增殖和分化的影响。结果如图7-4所示，加入BDNF的中和抗体或BDNF受体阻断剂（K252a）都可以阻断IL-4的促神经干细胞分化作用。另外，我们也研究了在BDNF信号阻断的情况下，体内分离的M2a小胶质细胞对神经元突触生长的影响。结果如图7-5所示，BDNF抗体或K252a处理都能够阻断体内分离的M2a小胶质细胞对神经元突触生长的促进作用。考虑到体内分离的小胶质细胞的数量有限，作为补充，我们也研究了体外培养的原代小胶质细胞中BDNF的作用。110 第七章BDNF通路在替代激活的小胶质细胞介导的神经发生中的作用图7-6阻断BDNF通路对原代培养的M2a小胶质细胞的促神经突触生长作用的影响。Mean±SEM，图（c）、图（f）、图（i）、图（k）和图（n）：Control-IgG（n=5），Anti-BDNF（n=5），*P<0.05vsControl-IgG；图（d）、图（g）、图（j）和图（o）：DMSO（n=5），K252a（n=5），*P<0.05vsDMSO;图（b）：Scalebar=50μm,图（e）和图（h）：Scalebar=20μm,图（m）：Scalebar=10μm111 电子科技大学博士学位论文我们采用同样的方法阻断BDNF通路，检测IL-4诱导的M2a型小胶质细胞对神经发生的影响。检测结果如图7-6所示，经过BDNF抗体或K252a处理后，IL-4诱导的小胶质细胞的促神球增殖效果被阻断，同时还阻断了M2a小胶质细胞的促神经分化和促突出生长的效果。7.4讨论在本章研究中，我们发现了脑源性的神经营养因子（BDNF）在应激抵抗型小鼠的海马中高表达，而在应激敏感型的小鼠的海马中低表达。而且海马中的脑源性神经营养因子的水平与抑郁样行为呈负相关。表明了海马中的BDNF的量的减少与应激易感性相关。另外我们发现海马中BDNF的表达水平与海马中IL-4的表达水平呈正相关，这表明IL-4与BDNF有紧密的关联。这个猜想在接下来的实验中被证实，在抑郁小鼠海马内上调IL-4的表达能够显著增加脑源性神经营养因子的表达。而且IL-4介导的脑源性神经营养因子主要表达在小胶质细胞上，并且集中表达在Arg-1阳性的小胶质细胞上。这表明IL-4诱导的M2a小胶质细胞促进BDNF的分泌来调节抑郁样行为。我们在小胶质细胞IL-4受体敲低的小鼠中发现BDNF分泌量以及BDNF阳性的小胶质细胞数量都显著减少，这进一步证明了我们前面的发现。相关性分析发现海马的神经发生与海马区BDNF阳性的小胶质细胞数量呈正相关。这表明M2a的小胶质细胞可能是通过调节BDNF来影响神经发生的。因此在体外，我们发现用BDNF的中和抗体使BDNF功能性失活，或用BDNF的受体拮抗剂都能够有效阻断M2a小胶质细胞的促神经发生作用。这充分说明IL-4处理的小胶质细胞是依赖于BDNF来发挥促神经发生作用的。7.5本章小结1.脑源性的神经营养因子在应激抵抗型小鼠的海马中高表达，而在应激敏感型的小鼠的海马中低表达。2.海马中的脑源性神经营养因子的水平与抑郁样行为呈负相关。3.在抑郁小鼠海马内上调IL-4的表达能够显著增加脑源性神经营养因子的表达。4.IL-4介导的脑源性神经营养因子主要表达在小胶质细胞上，并且集中表达在Arg-1阳性的小胶质细胞上。5.海马的神经发生与海马区BDNF阳性的小胶质细胞数量呈正相关。112 第七章BDNF通路在替代激活的小胶质细胞介导的神经发生中的作用6.在条件培养的神经干细胞中，用BDNF的中和抗体使BDNF功能性失活，能够有效阻断M2a小胶质细胞的促神经发生作用。用BDNF的受体拮抗剂阻断BDNF下游信号通路也能够阻断M2a小胶质细胞的促神经发生作用。113 电子科技大学博士学位论文第八章全文总结与展望8.1本论文工作总结本研究中，我们以慢性温和应激的小鼠作为抑郁模型，研究小胶质细胞的不同激活途径在抑郁症发生中的作用，并研究其作用机制。其作用机制如图8-1所示，M1型激活的小胶质细胞在抑郁症的发生和发展过程中起了很重要的作用，它通过增加分泌炎症介质，损伤海马的神经发生，导致海马功能异常，从而推进了抑郁症的病理进程；而IL-4的作用，能够促进小胶质细胞向M2a型极化，M2a型的小胶质细胞通过增加分泌神经营养介质，保护大脑免受应激的损伤，这种保护机制包括两个部分，一方面，M2a型的小胶质细胞分泌抗炎介质来抑制小胶质细胞在应激时向M1型极化，另一方面，M2a型的小胶质细胞分泌神经营养因子来促进海马神经发生和组织重构，在M2a型小胶质细胞促进神经发生的过程中，BDNF起到关键性的作用。图7-6调节小胶质细胞激活途径来影响神经发生和抑郁行为的作用机理。114 第八章全文总结与展望本论文的主要工作如下：1.从慢性温和应激的小组中成功筛选出了应激敏感型及应激抵抗型的两个亚群，并采用系统的行为学评价确定了这两个亚群的行为表型。比较了应激抵抗型小鼠与应激敏感型小鼠的多个脑区的小胶质细胞的差异，并确海马区是小胶质两者存在差异的重要脑区之一。进一步比较了应激抵抗型小鼠与应激敏感型小鼠的海马亚结构中的小胶质细胞的差异，确定了CA1区和DG区为显著变化的海马亚区。并系统地分析了小胶质细胞的形态变化，揭示了海马区的小胶质细胞激活与应激易感性相关。同时排除了海马区的星形胶质细胞在应激敏感性中的贡献。而且我们用免疫染色共定位揭示了炎症因子的改变与小胶质细胞的变化有直接的关系。2.比较了应激抵抗型小鼠与应激敏感型小鼠的多个脑区的IL-4水平的变化，揭示了应激的敏感性与海马区IL-4信号的减弱有关。建立了Cre/LoxP系统，成功在海马区特异性敲低小胶质细胞的IL-4受体，发现下调海马区小胶质细胞的IL-4受体能够加重应激小鼠海马区的炎症反应。同时能够增加小鼠对应激的易感性。揭示了海马区的IL-4在抑制M1型小胶质细胞中的作用。3.成功构建了AAV-IL-4腺相关病毒载体，并在小鼠的海马区稳定表达。证明了在海马中上调IL-4的表达，能够改善小鼠的抑郁样行为。从分子、细胞及组织学上揭示了海马区的IL-4能够诱导小胶质细胞向M2a表型激活，这种小胶质细胞在能够抑制M1型小胶质细胞的活化。用Cre/LoxP系统特异性下调海马区小胶质细胞的IL-4受体，会减少了IL-4诱导的M2a小胶质细胞数量，同时解除对M1小胶质细胞的抑制作用，最终阻断了IL-4的抗抑郁效果。揭示了IL-4的抗抑郁效果依赖与M2a的小胶质细胞发挥作用。4.在应激敏感型小鼠与应激抵抗型小鼠中证明了应激的易感性与神经发生的减少紧密相关。在海马中上调IL-4的水平能够增加增殖的神经前体细胞数量，同时能够促进神经前体细胞的分化、存活和成熟。下调海马区小胶质细胞的IL-4受体能够阻断IL-4的促神经发生效果。5.在体外培养的细胞实验中证明了IFN-γ诱导的M1型小胶质细胞抑制神经干细胞的增殖、分化和迁移，IL-4诱导的M2a型小胶质细胞促进神经干细胞的增殖分化和迁移。在海马分离的小胶质细胞中，证明了从抑郁小鼠海马中分离出的小胶质细胞能够抑制神经干细胞增殖、分化和迁移。AAV-IL-4注射的正常小鼠或应激小鼠海马中分离出的的小胶质细胞促进神经干细胞的增殖、分化和迁移。我们进一步证明了小鼠海马中分离的小胶质细胞通过分泌炎症介质来影响神经球的增殖，神经干细胞的分化、存活和成熟，神经元的突触生长的。115 电子科技大学博士学位论文6.在应激敏感型小鼠与应激抵抗型小鼠中证明了海马中的BDNF的降低与应激易感性相关，且海马中BDNF的表达水平与海马中IL-4的表达水平呈正相关。借助腺相关病毒上调IL-4的表达能够显著增加海马中脑源性神经营养因子的表达，而且IL-4介导的BDNF子主要表达在小胶质细胞上，并且集中表达在Arg-1阳性的小胶质细胞上。在小胶质细胞IL-4受体敲低的小鼠中发现BDNF分泌量以及BDNF阳性的小胶质细胞数量都显著减少，证明了IL-4通过诱导M2a的小胶质细胞来促进BDNF的分泌，从而起到促神经发生和抗抑郁作用的。用BDNF的中和抗体使BDNF功能性失活，或用BDNF的受体拮抗剂都能够有效阻断M2a小胶质细胞的促神经发生作用。揭示了IL-4诱导的M2a型小胶质细胞是依赖于BDNF来发挥促神经发生作用的。本研究从神经免疫调节的角度揭示了抑郁症的分子机制，针对该机制可能存在的药物靶点主要包括三方面：首先，可以靶向调节小胶质细胞的表型及功能，使小胶质细胞从促炎表型向神经保护表型转变，本研究所用的IL-4是一种可参考的手段，但IL-4相对分子质量超过15kDa，很难穿过血脑屏障，从外周进入到大脑，因此需要找到合适于抑郁症患者的给药方法。当然也可以开发一些能够调节小胶质细胞功能，同时分子量也较小的药物。其次，可以靶向调节海马神经发生来作为抑郁症治疗手段，本研究中IL-4诱导的M2a型小胶质细胞就是通过调节海马神经发生来改善抑郁的，今后也可以开发一些能够直接影响神经发生的药物来作为潜在抗抑郁药物。最后，靶向调节BDNF的药物也可作为潜在的抗抑郁药物。本研究中M2a型小胶质细胞是通过分泌BDNF来调节神经发生和抑郁样行为的，因此BDNF的调节也可作为今后药物筛选的靶标。8.2后续工作展望尽管本研对小胶质细胞的激活途径与神经发生和抑郁症之前的联系做了系统的的研究，但还有很多方面有待进一步的探索。主要体现在：1.抑郁症是系统性疾病，单一从某种细胞或某个分子来揭示抑郁症的发病机制可能具有一定的局限性，本研究主要采用传统的分子生物学实验方法来研究小胶质细胞的不同激活途径在抑郁症发生中的作用，在后续的研究中我们将考虑用一些高通量的检测技术获取小胶质细胞在不同激活路径的状态下的基因组或蛋白质组学数据，为后续相关研究提供一些新的研究对象和思路，同时在今后研究中可结合神经网络和脑功能成像来弥补实验操作中的局限性。2.在特异性敲低海马区小胶质细胞的IL-4受体过程中，我们用的是慢病毒介导的方式，存在转染效率的问题，同时用脑注射的方式执行，对小鼠本身造成的116 第八章全文总结与展望影响不可避免，如果条件允许，今后可以引进带LoxP-IL-4Rα-LoxP的转基因小Cre/ER鼠，与CX3CR1小鼠杂交直接敲除小胶质细胞上的IL-4受体，这样操作简单，而且结果将更加可靠。3.由于小胶质细胞在激活过程中分泌的细胞因子种类复杂，牵连的信号通路甚广，导致本文对信号通路研究方面涉及较少，实际上，在IL-4如何驱动小胶质细胞向M2a表型激活，以及M2a小胶质细胞通过何种途径增加BDNF的释放等问题上还有很多值得深入研究的空间。4.神经发生如何影响抑郁症是热点话题，但在本文中只在前人的研究成果上做了一些讨论，由于研究的疾病模型和药物处理方式的不同，都有可能出现不同的结果，本论文中M2a增加的神经发生如何改善抑郁样行为还有待进一步研究，具体可以从海马脑电信号变化和神经网络信息整合方面去解释这种抗抑郁机制。117 电子科技大学博士学位论文致谢在本论文即将完成之际，首先要感谢游自立导师的悉心引导和关爱，五年时间，他将一个对科研充满愿景的懵懂青年培养成合格的科研工作者，其间付出了很多的心血和汗水，游教授对科研的满腔热血，严谨的治学态度，都深深的影响着我，游老师就像一座灯塔，指引着我前进的方向，再一次向游老师表达我最真挚的感谢。本项研究的得以顺利进行，还要感谢杨足君老师和李光蓉老师无偿为我提供荧光显微镜，并教会我一些成像技巧，论文中大部分荧光图片都是用杨老师实验室的荧光显微镜捕获的。感谢我的师姐赵秋影，你总是在我最需要的时候出现，帮助我解决科研上遇到的各种困难，并让我科研路上一步一步成长起来。感谢谢雷师兄，您这五年时间里给我提供了太多太多的帮助，感激之情无以言表。感谢张立娟师妹，在你的帮助下，腺相关病毒的合成才得以顺利完成，让我向真理又迈近了一步。感谢贺慧师妹，感谢你帮我分担了很多实验压力，你的细心和耐心助我顺利完成了我的实验。感谢毛欢欢师姐给我提供社会历练的机会。感谢我的小伙伴时明阳同学三年来一直陪我体育锻炼，让我有坚实的体魄去面对繁重的科研压力。在此，要感谢陈于波、樊永华、李雅西、姜伟、武晓辉、鄢硕、唐敏敏、韩岳、张静、颜弯、王美丹、黄书贵、莫荔、王九太、凌晗祎、宋锐，感谢你们在学习和生活中对我无偿的帮助，科研路上有你们的陪伴和照顾，让我倍感温暖。此外，对电子科技大学生命学院的所有老师表示衷心的感谢。最后要特别感谢我的家人，感谢你们多年来默默的付出以及对我无私的爱，感谢女友何海丽小朋友多年来对我工作的支持，在最困难的时候对我不离不弃，感谢你一路的陪伴，理解和鼓励。118 参考文献参考文献[1]S.C.Dilsaver.AnestimateoftheminimumeconomicburdenofbipolarIandIIdisordersintheUnitedStates:2009[J].JAffectDisord,2011,129(1-3):79-83[2]C.L.Raison,A.H.Miller.Isdepressionaninflammatorydisorder[J]?CurrPsychiatryRep,2011,13(6):467-75[3]M.Iwata,K.T.Ota,R.S.Duman.Theinflammasome:pathwayslinkingpsychologicalstress,depression,andsystemicillnesses[J].BrainBehavImmun,2013,31:105-14[4]N.Muller,A.M.Myint,M.J.Schwarz.Inflammatorybiomarkersanddepression[J].NeurotoxRes,2011,19(2):308-18[5]M.Maes,P.Ruckoanich,Y.S.Chang,etal.Multipleaberrationsinsharedinflammatoryandoxidative&nitrosativestress(IO&NS)pathwaysexplaintheco-associationofdepressionandcardiovasculardisorder(CVD),andtheincreasedriskforCVDandduemortalityindepressedpatients[J].ProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry,2011,35(3):769-83[6]F.Lotrich.Depressionsymptoms,low-gradeinflammatoryactivity,andnewtargetsforclinicalintervention[J].BiolPsychiatry,2011,70(2):111-2[7]M.Li,J.K.Soczynska,S.H.Kennedy.Inflammatorybiomarkersindepression:anopportunityfornoveltherapeuticinterventions[J].CurrPsychiatryRep,2011,13(5):316-20[8]J.G.Zarruk,A.D.Greenhalgh,S.David.Microgliaandmacrophagesdifferintheirinflammatoryprofileafterpermanentbrainischemia[J].ExpNeurol,2018,301(PtB):120-132[9]P.Forti,E.Rietti,N.Pisacane,etal.Bloodinflammatoryproteinsandriskofincidentdepressionintheelderly[J].DementGeriatrCognDisord,2010,29(1):11-20[10]Y.Kuang,S.N.Lackay,L.Zhao,etal.RoleofchemokinesintheenhancementofBBBpermeabilityandinflammatoryinfiltrationafterrabiesvirusinfection[J].VirusRes,2009,144(1-2):18-26[11]T.A.Kato,A.Monji,Y.Mizoguchi,etal.Anti-Inflammatorypropertiesofantipsychoticsviamicrogliamodulations:areantipsychoticsa'fireextinguisher'inthebrainofschizophrenia[J]?MiniRevMedChem,2011,11(7):565-74[12]C.L.Willis,T.A.Brooks,T.P.Davis.Chronicinflammatorypainandtheneurovascularunit:acentralroleforgliainmaintainingBBBintegrity[J]?CurrPharmDes,2008,14(16):1625-43119 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攻读博士学位期间取得的成果攻读博士学位期间取得的成果[1]J.Q.Zhang,X.F.Xie,M.M.Tang,etal.SalvianolicacidBpromotesmicroglialM2-polarizationandrescuesneurogenesisinstress-exposedmice[J].BrainBehaviorandImmunity.2017,66:111-124[2]J.Q.Zhang,X.F.Wu,Y.Feng,etal.SalvianolicacidBamelioratesdepressive-likebehaviorsinchronicmildstress-treatedmice:involvementoftheneuroinflammatorypathway[J].ActaPharmacolSin.2016,37(9):1141-53[3]Q.Y.Zhao,X.H.Wu,S.Yanetal.Theantidepressant-likeeffectsofpioglitazoneinachronicmildstressmousemodelareassociatedwithPPARγ-mediatedalterationofmicroglialactivationphenotypes[J].TheJournalofNeuroinflammation.2016,13(1):259[4]Q.Y.Zhao,X.F.Xie,Y.H.Fan,etal.PhenotypicdysregμLationofmicroglialactivationinyoungoffspringratswithmaternalsleepdeprivation-inducedcognitiveimpairment[J].ScientificReports.2015,5:9513[5]J.Q.Zhang,H.Hui,L.Mo,etal.Astrocytefacilitatedramificationremodelingofmicrogliaandsuppressedpathologicactivationofmicroglia[C].The4thInternationalConferenceonBiomedicineandPharmaceutics(ICBP),Zhuhai,2016133 附录附录中英文缩略图缩略词英文全称中文全称MDDMajorDepressiveDisorder重度抑郁症CMSChromicMildStress慢性温和应激sCUSSubliminalChronicUnpredictabilityStress阈下慢性不可预知应激LSLow-susceptible低敏感性HSHigh-susceptible高敏感性SPTSucrosePreferenceTest糖水偏好测试FSTForcedSwimmingTest强迫游泳测试TSTTailSuspensionTest悬尾测试LATLocomotorActivityTest自主活动测试NFSNovelEnvironmentalFeedingInhibition新奇环境摄食抑制OFTOpenFieldTest旷场测试CbCerebellum小脑PFCPrefrontalCortex前额叶皮层HipHippocampus海马AmyAmygdala杏仁核OBOlfactoryBulb嗅球DGDentateGyrus齿状回GCLGranuleCellLayer颗粒细胞层iNOSInducibleNitricOxideSynthase诱导型一氧化氮合酶Arg-1Arginase1精氨酸酶1IL-4Interleukin-4白介素-4GFAPGlialFibrillaryAcidicProtein胶质纤维酸性蛋白BrdU5-Bromo-2’-deoxyUridine5-溴-2’-脱氧尿嘧啶核苷DCXDoublecortin双皮质素PBSPhosphateBufferedSolution磷酸盐缓冲液DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜BDNFbrainderivedneurotrophicfactor脑源性神经营养因子M1Classicalactivationmicroglia经典激活型小胶质细胞M2Alternativeactivationmicroglia替代激活型小胶质134
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