苹果枝干轮纹病与抗性物质的相关性研究及轮纹病抗病标记的筛选

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苹果枝干轮纹病与抗性物质的相关性研究及轮纹病抗病标记的筛选摘要苹果作为我国加工、销售的第一大水果，是很多果农的主要经济来源，但是苹果轮纹病严重影响着苹果产业的发展，会造成树木衰弱、烂果，甚至树体死亡。苹果轮纹病已经成为我国苹果的主要病害，为了深入了解抗病性机制，本文从病原物与寄主互作的角度出发，观察试验植株在自然条件下或接种轮纹病菌后，总酚含量及POD（过氧化酶）、PPO（多酚氧化酶）、PAL（苯丙氨酸解氨酶）的差异和变化，根据各抗性物质的变化规律，探寻抗性物质起到抵抗或防御作用的阶段，从而为筛选苹果轮纹病的抗性指标，鉴定、筛选抗轮纹病的苹果砧木；并结合在离体条件下多酚类抗性物质对轮纹病菌的抑制作用研究，为阐述苹果轮纹病抗性物质的抗病机理提供理论依据。本项目亦从分子水平出发，利用AFLP分子标记的方法对抗病品系与感病品系“舞美×M9”的性状分离F1后代群体进行分析，初步筛选与苹果轮纹病基因相关联的分子标记，为早期辅助育种等提供理论依据。1通过对自然条件下不同抗性植株叶片中总酚含量及防御酶（POD、PPO、PAL）活性的测定，结果表明抗病植株的酚含量及各种防御酶活性从4月到7月一直处于升高趋势，在5、6月份期间超过感病植株，在侵染高峰期7月份达到最高值，而感病植株在植株早期（5、6月份）酚含量及酶活性就达到高峰，随后呈现下降趋势；且对于各类抗性物质的最高值抗病植株>中感植株>感病植株。2通过对不同抗性植株接种处理研究，结果显示接种轮纹病菌均可明显激发抗性物质的变化各类抗性物质均值、最高值规律为抗性植株>中感植株>感病植株；且抗性植株的抗性物质比中感和感病植株维持较长的时间。3在整个接种测试周期上总酚含量与感病程度呈显著相关性，抗病植株与中感植株有显著性差异（P<0.05），与感病植株有极显著差异（P<0.01）；在某些阶段和时期，防御酶的活性与抗病性也存在着显著相关性。PAL活性接种后第7天至21天阶段中抗病植株与中感植株呈显著性差异（P<0.05），与感病植株呈极显著性差异（P<0.01）；PPO活性在第14至21天阶段，抗病植株与中感与感病植株均有显著性差异（P<0.05）；POD活性在第21至28天时抗病植株与中感与感病植株均有显著性差异（P<0.05）。从数据可以看出PAL是发生变化最早而且保持I 时间最长的，POD却相对较晚。4通过不同浓度的茶多酚及苹果叶多酚提取物对苹果轮纹病菌的抑制实验，说明多酚类物质对轮纹病菌有显著的抑制作用（P<0.05），其中100mg/mL可达到较好的效果，抑制率达30％以上。5本研究以“舞美×M9”的13年生杂种感抗病分离群体为研究材料，应用AFLP分子标记技术，筛选与苹果枝干抗轮纹病性状基因距离较近的标记。在所筛选的64对AFLP引物组合中，其中E4/M4抗病单株上的交换率最低，为10.7%，在抗病群体中定位到一个与苹果枝干轮纹病抗性相关的标记命名为：R4-4，分子量约为460bp。关键词：苹果轮纹病防御酶酚类物质AFLP--II RELATIONSHIPBETWEENDISEASERESISTIVEMATERIALSWITHAPPLERINGSPOTMORBIDITYANDIDENTIFICATIONOFAFLPMARKERSABSTRACTAppleisthemostimportantfruitwhichpopularinChineseconsumers．Anditisoneofthemostimportantprocessingandmarketingfruitsintheworld.However,Appleringrotdisease,themostseriousandprevalentapplediseaseinchina,whichleadstonumerousrottenfruitsandweakentreevigorous,affectsappleproductioninChina,，generates．itbecomesanoutstandingprobleminappleproduction.WeareplanningtostudyinteractionofHost-Pathogenatbiochemicallevel.Weobservedthevariationregularityofresistivematerialssuchaspolyphenols,phenylanineammonialyase(PAL),peroxidase(POD)andpolyphenoloxidase(PPO)amongappletreeswithdifferentlevelofresistanceundernaturalconditionfromApirltoAugust,andthechangesoftheseresistivematerialafterinoculatedwiththeBotryosphaeriaberengrianaf．piricolca,anddeducedtheeffectiveperiodofeachresistivematerialaccordingtothevariationruleofresistivematerials.therebyscreenedspecificresistivematerialinspecificperiodsasresistanceindexThisresearchincombinationwiththestudyofinhibitiveeffectofpolyphenolsonBotryosphaeriaberengrianainvitrowilllaidthetheoreticalfoundation,toidentifyresistantapplestocks,andtoelucidatethemechanismsofhowresistivematerialconfertheirresistancetoappleringrot.Ontheotherhand,F1hybridssegregationpopulationofseedlingplantsfrom“wumei×M9”wereresearchedsearchingforthemolecularmarkerlinkedtoappleringrotresistancegenelocusbyusingAFLPtobeusedinmarkerassistedbreedingforhighresistantapplevarietiesinthefuture.1Undernaturalcondition,thevariationregularityofdifferentresistivematerials(totalleavespolyphenol,activitiesofprotectiveenzymes)indifferentappletreeswithdifferentrotdiseaseresistanceweredetermined.TheresultsshowedthatfromApriltoJuly,thecontentofpolyphenolsandenzymaticactivitiesfrom1eavesofhighlyresistancetreespresentedagraduallyincreasingtrend,andshowedhigherIII concentrationoractivitiesthanthoseofmoderateresistancetreesandsuspitiblematerialsinaboutMaytoJuneaccordingtothekindsofresistivematerials,thentheseresistivematerialsreachedthemaximuminJuly,whichisthemaininfectionperiod.whilethemaximumresistivematerialsofmoderateresistancematerialsandsuspitiblematerialsoccurredinMayorJune,thenappeardowntrend.Themaximumofeachresistivematerialsshowedthathighlyresistancetrees>moderateresistancetrees>suspitibletrees2ThedifferenttreeswithdifferentlevelofresistancetoappleringrotdiseasewerestudiedbyinoculatingtheBotryosphaeriaberengriana.fsp.piricolaontheirstems.Theresultsshowedtheinoculationcanarousethechangeofeachresistivematerialsobviously.Theaverageandthemaximumofpolyphenolscontentandtheactivitiesofenzymesshowedfollowingrules:highresistanttrees>moderateresistancetrees>suspitibletrees.Andhighresistancetreesmaintainedlongerperiodofhighlevelofresistivematerialsthanthatofotherresistantgradestrees.3Toacertainextent,theresistivematerialswerecorrelatedwithplantsusceptiblelevel.thecorrelateleveloftotalphenolcontentwithsusceptiblelevelisremarkable.Insomestageandperiod,theactivitiesofdefendantenzymeswiththesusceptiblelevelalsohadremarkablecorrelation,forexample,PALactivityofhighresistanttreeshadsignificancelevel（P<0.05）withmoderateresistancetreesinthe7daysto21daysafterinovulationandhadhighsignificancelevel（P<0.01）withsuspitibletrees;PPOactivityofhighresistanttreeshadsignificancelevel（P<0.05）withmoderateresistancetreesandsuspitibletreesinthe14daysto21days;PODactivityofhighresistanttreeshadsignificancelevel（P<0.05）withmoderateresistancetreesandsuspitibletreesinthe21daysto28days.ThedatashowedthatPALwastheearliestactivatedresistivesubstanceandmaintainsforthelongesttime.ThepeakofPODactivityandPhenolscontentappearedlater.4Theinhibitiveeffectsofdifferentconcentrationsoftea-polyphenolandapplepolyphenolonBotryosphaeriaberengriana.fsp.piricolaweretested,Theresultsshowedthattea-polyphenolandapplepolyphenolsinhibitedpathogengrowthsignificantly(p<0.05).Thehighertheconcentrationwas,thehighertheinhibitiveratewas．Amongtheseriesconcentrations，the100and50mg/mLhadthehighestinhibitiverate.5Weconstructedthreedifferentsusceptiblelevelsegregationpopulationsusingthethirteen-yearsoldF1seedlingof“wumei×M9”basedonthenaturalincidenceinthefieldofapplebranches,andscreenedformolecularmarkerscloselylinkedwithresistancegenesusingAFLP.Amongallthe64primerpairweused,primerpairE4/M4generatedbandsshowingthelowestrecombinationrate(10.7%).An460bpband,namedR4-4,amplifiedinE4/M4primercombinationwasfoundtobelinkedtotheresistancepopulation--IV KEYWORDS:appleringrotdiseasedefenseenzymespolyphenolsAFLPV 目录第一章前言----------------------------------------------------------------------11.1苹果枝干轮纹病概述----------------------------------------------11.1.1病原菌.......................................................11.1.2发病规律.....................................................11.1.3轮纹病遗传规律..............................................21.1.4不同品种抗轮纹病的差异.......................................21.1.5防治现状.....................................................21.2病原菌与寄主植株互相作用机理------------------------------------31.2.1病原菌致病机理...............................................31.2.2寄主植物的抗病性.............................................41.2.3抗病生化因子.................................................51.2.4抗病结构因子.................................................81.3苹果多酚类物质研究进展-----------------------------------------91.3.1苹果多酚成分.................................................91.3.2苹果多酚的功能活性...........................................91.3.3提取方法....................................................111.4分子标记------------------------------------------------------111.4.1分子标记种类及其应用........................................111.4.2分子标记在苹果研究中的应用...................................131.5研究背景和研究意义--------------------------------------------14第二章苹果枝干轮纹病与抗性物质的相关性研究---------------------152.1材料与试剂----------------------------------------------------152.1.1植物材料....................................................152.1.2主要试剂.....................................................152.1.3主要仪器.....................................................152.1.4菌种.........................................................162.1.5培养基.......................................................162.2主要方法------------------------------------------------------162.2.1PDA培养基的配制.............................................162.2.2菌种纯化及保存...............................................162.2.3接种处理....................................................162.2.4抗感植株筛选.................................................162.2.5采样方法....................................................172.2.6苹果叶及枝条中总酚物质及酶液的提取..........................172.2.7总酚含量及防御酶活性测定....................................192.2.8抑菌试验.....................................................202.2.9数据分析....................................................20I 2.3结果-----------------------------------------------------------202.3.1总酚提取条件.................................................202.3.2总酚测定（FC法）标准曲线....................................212.3.3自然条件下抗性物质的变化规律.................................222.3.4接种处理后苹果枝条酚类物质与抵抗轮纹病菌的关系...............252.3.5接种处理后苹果枝条POD酶活性与抵抗轮纹病菌的关系.............292.3.6接种处理后苹果枝条PPO酶活性与抵抗轮纹病菌的关系.............332.3.7接种处理后苹果枝条PAL酶活性与抵抗轮纹病菌的关系.............362.3.8在离体条件下多酚类抗性物质对轮纹病菌的抑菌作用...............392.4讨论-----------------------------------------------------------41第三章利用AFLP分子标记技术筛选苹果轮纹病抗病标记----------433.1材料与试剂-----------------------------------------------------433.1.1供试材料.....................................................433.1.2主要试剂.....................................................433.1.3仪器.........................................................443.2方法---------------------------------------------------------443.2.1分离群体构建.................................................443.2.2BSA法建池...................................................443.2.3DNA的提取与浓度测定.........................................443.2.4酶切连接.....................................................453.2.5预扩增.......................................................463.2.6选择性扩增...................................................463.2.7变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.......................................473.3结果-----------------------------------------------------------503.3.1引物筛选.....................................................503.3.2与轮纹病抗性相关AFLP分子标记的初步筛选......................513.4讨论-----------------------------------------------------------55结论--------------------------------------------------------------------------------56问题与展望-----------------------------------------------------------------------58参考文献--------------------------------------------------------------------------59附录------------------------------------------------------------------------------67致谢------------------------------------------------------------------------------70攻读学位期间发表的学术论文目录-----------------------------------------71--II 第一章前言1.1苹果枝干轮纹病概述苹果(MaluspumilaMill.)是世界上最主要的鲜食和加工水果之一，是主产区果农重要的经济来源。在种植生产过程中，病虫害严重影响着苹果的品质及产量，给果农带来巨大的经济损失。其中果树病害中，90％以上为真菌病害，如苹果轮纹病、干腐病、腐烂病等。苹果轮纹病常危害枝干与果实，苹果枝干轮纹病危害着苹果树的各级枝干，以皮孔为中心形成直径3-20cm扁圆形病斑,一般为红褐色。中心突起呈瘤状,边缘向周围裂开。随着树龄的增长边缘裂缝增深，以病斑为中心向外扩展,逐渐形成同心轮纹状斑。严重的可以造成烂果，甚至树[1]体死亡，在中国部分产区发生普遍，使苹果产业遭受巨大的经济损失，严重影响了苹果产业的健康发展，已引起国内外的广泛关注。1.1.1病原菌苹果轮纹病菌（Botryosphaeriaberengriana.fsp.piricola）为真菌，子囊菌亚门核菌纲球壳菌目梨生囊孢壳菌，无性态为半知菌亚门球壳孢目轮纹大茎点菌(MacrophomakawatsukaiHara)，有性态是梨生囊壳孢（PhysalosporapiricolaNose）。分生孢子器扁圆形或椭圆型，孔口乳突状，分生孢子为无色，纺锤形。[2]研究表明，苹果轮纹病是由枝干轮纹病菌和干腐病菌引起的，有研究对苹果枝干轮纹病与干腐病进行RAPD分析，证明关系很近，然而两种菌株在发病率、[3]潜伏期和病斑大小上都存在着一定的差异性。引起的粗皮病症状虽然相似，但也可以区分，轮纹病一般病瘤在皮孔部位，而粗皮病一般发病部位却不确定[4]。防治苹果轮纹病两种病菌一起防治效果较好。1.1.2发病规律苹果轮纹病病原菌在枝干病部上以菌丝体、分生孢子器及子囊壳的形式越冬，在适宜条件下产下分生孢子，在枝干皮孔上进行侵染而发病，成为初次侵[5]染和连续侵染的主要菌源。枝干病组织中的菌丝体可存活4～5年，病菌当年不产生分生孢子，前3年会形成大量的孢子。然后病菌孢子从皮孔、气孔和伤口侵入果实或枝干，随着皮孔的木栓化，病菌的侵入也逐渐减弱。侵染期一般为6月中下旬至8月中旬，随后侵染数量会明显减少。有研究表明，病原菌从1 [6]侵染到显示出病态达三个月之久，分生孢子会潜伏在在皮孔腔内，果实近成熟期会显出症状，至采后贮藏近一个月后会达到发病高峰期。分生孢子主要借风雨飞溅传播，每年5-7月间降雨高发期传播率最高，传播距离在10m左右。[1,2]空气中分生孢子的密度与降雨量呈正相关，降雨量加大，孢子散发量也渐多，[7]在无降雨期未能检测到孢子。不同种质的苹果抗轮纹病性能不同。田间调查表明富士、元帅、国光等品种易发病，人工接种果实病菌显示不同品种的发病情况也有差异。1.1.3轮纹病遗传规律[8]果树病害的遗传规律对于苹果枝干轮纹病的研究一直是难题。阎振立等通过枝条接种法对不同抗性植株间杂交组合，研究表明轮纹病的抗病性可以通过亲本遗传给后代，枝干轮纹病的抗性随着不同组合杂交，从而后代也存在显著的差异，而且抗性存在母性遗传的趋势。研究证明抗病性好、遗传能力强的品种对于抗病育种的选择效果最好。1.1.4不同品种抗轮纹病的差异选择并栽培抗病品种或者将抗病植株作为中间砧进行嫁接来提高苹果果树[9]整体的抗病性是防治苹果病害的一个有效的方法。阎振立等对多个品种进行室内与田间接种实验，发现不同苹果品种的枝条间皮孔的密度与大小均有显著[8][10]差异。不同的品种资源抗性也有所不同。沈永波等人的研究发现在感病品种富士上病斑突起较大，经过长期的发展逐渐变成褐色大瘤；中感品种国光，纹病斑的突起较小，很快扩展成褐圆斑。果树嫁接优良砧木是改善果树本质的重要基础，筛选出的优良砧木可以延长结果年限、调节果实品质、甚至提高果[11]实及果树的抗病性等实践意义。选用抗生砧木可提高果树对病虫害的抵御能力，增强果树对不良环境的适应性。采用具有轮纹病抗性的砧木可提高苹果树对轮纹病的抵御能力。砧木种类不同，树体抗枝干轮纹病的能力也不同。有报道显示日本用抗性砧木圆叶海棠，嫁接到感病品种红富士上，有效地较低了枝[12]干轮纹病发病情况。U8是一个抗苹果枝干轮纹病较强的矮化砧木。研究者从鸡冠自然杂交实生苗中选育出了具有高抗轮纹病特性的砧木“YG”，繁育出了优良苹果苗木，多个地区实验园试栽观察发现，各地均反应“YG”作中间砧后抗病性强，而且对果实品质及其果园产量没有显著的影响。1.1.5防治现状防治轮纹病一般采用喷药和套袋措施。药剂一般采用波尔多液、代森锰锌、--2 [13][14]多菌灵等，抗轮纹病药剂的开发备受瞩目，周增强等通过田间药效试验发现内吸性低毒杀菌剂戊唑醇对苹果轮纹病具有良好的防治效果。随着人们对环[14]境污染、生态平衡及菌种产生耐药性认识的加深，越来越多的研究者开始致[15]力于微生物源农药及植物源农药的开发，如枯草芽孢杆菌B-903是从苹果树皮上分离出来的一种广谱拮抗菌株，经过田间和水果贮存试验研究，表明该菌株对轮纹病菌有明显的抑制作用。一些菌株产生的多肽、脂蛋白、糖蛋白等也[16]可抑制轮纹病菌的生长。康斌斌等对苦参碱提取物对苹果轮纹病菌的防治效果进行了室内及田间试验，证明苦参碱对轮纹病防治效果优良。苦参碱对苹果[17]树的腐烂病防治效果也比较显著。但植物源农药均为天然成分，在很多条件下易分解、不稳定，如何提高植物源农药的稳定性成为植物源农药研究亟待解决的问题。1.2病原菌与寄主植株互相作用机理病原菌侵染寄主，影响着寄主的结构和生理代谢的同时也激发了寄主植株潜在的抗病物质，导致了病原菌与植株的相互作用，共同进化。1.2.1病原菌致病机理寄生性的强弱与致病性的强弱相关性不大。病原物致病性会随着寄生性的增强而减弱，寄生性的减弱而增强。这是因为病原物的生存严格于依赖寄主，例如植物病原菌侵染植物时，不会立即把植株杀死。一般来讲，没有了活寄主也就没有病毒存在的可能，病原菌-寄主的长期协同进化导致了寄主与病毒共存[21][18]在共灭亡的可能性。[19]病原物的致病性大致有以下几种方式：（1）分泌各种酶类当病原菌侵染植物时必须突破植物表面细胞壁的障碍。病原菌可以自身合成并向外分泌各种能够降解植物细胞壁的酶，包括蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、淀粉酶等类型。以此来消解和破坏植物组织和细胞，侵入植物并进行繁殖、破坏。例如果胶酶(Pectinase)可分解消化植物细胞间的果胶物质，分离植物组织细胞，最深入破坏植物细胞的中胶层。角质酶(Cutinase)可破坏植物体表面的角质层，从而顺利进入植物体内。病原菌分泌的蛋白酶可降解细胞膜和细胞结构主要成分蛋白质，从而严重破坏寄主的结构和功能。研究表明，轮纹病菌在侵染苹果果实后致使果实内产生降解果实胞壁的多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果胶3 [20]甲基醋酶(PMG)等多种酶类，这也为论证了轮纹病菌的致病性。（2）分泌毒素[21]病原菌可以在植物组织细胞内分泌毒素，影响寄主植物的一些生理代谢，破坏寄主植物的细胞膜、线粒体、叶绿体等结构，导致植物坏死、能够引起寄主植物水分代谢发生变化，导致萎蔫等不同情况。毒素在致病中发生起决定作用，能加重病害的发生。许多毒素引起植物发生坏死或褐变，但是很多反应并不是直接来自毒素，抑制光合作用；对酚代谢的影响，而是一种次级效应；毒[19]素对植物生长调节过程也有显著的作用力。（3）病原菌可分泌某种或几种激素类的致病物质，干扰植物的正常代谢，[19]造成植株的生长畸形。不同的病原物或者在不同的阶段往往致病方式也不同，导致寄主内激素水平明显超过正常水平，从而造成病害。产生特殊物质，破坏植物激素平衡，引起植物非正常生长；有些侵染物可以利用植物酸和蛋白质等增殖自己如病毒类；农杆菌则可以遗传繁殖，许多细菌的胞外多糖，脂多糖会阻塞导管；一些马铃薯以及豆科植物病原物有修饰植保素的功能。另外病原菌侵染后会引起植物自身激素如脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)水杨酸(sA)激素水平异[22][23]常，打乱植物本身的正常代谢。（4）改变寄主植物基因组功能侵入寄主植物后某些病原菌为了得到自己需求的营养物质会把自己一段[24]DNA插入寄主基因组中。病原菌基因组有编码转运蛋白的功能，编码致病蛋白的基因在侵染寄主后得到快速复制，在致病过程中这些致病蛋白可以复制毒[25][26]素并且能忍耐植物防卫反应所释放出来的植保素或抗毒素的物质。1.2.2寄主植物的抗病性1.2.2.1抗病性的定义及类型寄主植物抗病性是指具有可以抑制或延缓病原菌侵害的能力，是寄主植物自身的属性。这种能力取决于寄主植物的遗传特性，不同植物对不同的病原菌表现出的抗病能力也有所不同。抗病性被划分为免疫、抗病、耐病、感病避病[19]等几种不同能力程度的类型。（1）免疫（immune）：病原物侵染时，寄主植物的反应表现为观察不到可见的症状或者是完全不发病。（2）抗病（resistant）：病原物侵染时，寄主植物的反应表现为发病较轻。发病很轻的称为高抗。（3）耐病（tolerant）：病原物侵染时，寄主植物的反应表现为发病较重，但植株的忍耐性较好，即外观上发病程度类似感病，但对植株的经济损失较小。--4 （4）感病（susceptible）：病原物侵染时，寄主植物的反应表现为发病较严重，并且对经济及产量造成很大的损失。（5）避病（escape）：指寄主植物本身是感病的，但该植株可在在特殊情况下避免发病或者能避免被侵染。如寄主在感病盛期可以避开病原物的高侵染期。1.2.2.2抗病性机制植物的防御体系是国内外研究的热点。植物的防御系统包括预存的防御体系和病原菌诱导的防御体系，预存的防御体系主要包括细胞壁的角质和蜡质等、木质素、特殊的气孔结构、小分子抗病物质、种子固有的抗真菌蛋白和能与真菌几丁质结合的凝集素、破坏真菌细胞透性的蛋白质和核糖体失活蛋白等。其[27]中小分子抗病化学物质研究较多，如毒性脂肪酸、酚类化合物、类萜与类黄[28]酮类植保素等；及有关的多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨[29]酸解氨酶（PAL）等。植物防御体系的作用主要是抵抗病原微生物（特别是真菌）。植物保卫自身免受病原物的侵染，有一种是生化抗病，在受到侵染时植物的组织或细胞中发生一系列变化，产生对病原物有害的物质，来抑制或抵抗病原物的侵染。另一种是机械的阻碍作用，比如利用组织和结构的屏障作用阻止[30]病原物的接触、侵染，从而也避免了病原菌在植物体内的扩展与危害。[31]植物依靠原有的组织结构的特点，抵御或阻止病原物与之接触或侵入，发挥其抗侵入的作用，是先天性的防御结构。如植物表面的蜡质层、茸毛或防水的或防虫的隔离屏障，使病原菌难以接触、侵入表皮细胞。还有一种后天性的防御结构，如病原物接触或侵染可诱导的植物组织结构的变化，比如在侵染部位形成木栓层等组织结构，来抵制病原物的侵入和扩增。[22]不同的种或品种对于植株的抗病性也有一定的差异，这可能与组织结构的抗性有关。抗病性可分为先天的固有生化抗性和后天的诱导产生的生化抗性物质。葱蒜类、松柏类植物向外分泌大量的抑菌物质具有杀菌或抑菌活性的挥发性物质；许多微生物都被分泌的酚、萜、萘类等生化物质所钝化或失活。后天诱导的植物保卫素等是在病菌侵入寄主植物时在细胞内沉积的抑菌物质。1.2.3抗病生化因子1.2.3.1酚类化合物酚类化合物是植物体内重要的次生代谢产物，很多研究表明酚类化合物中的简单酚、黄酮及醌类等化合物在植物体外对植物病原真菌菌丝生长与孢子萌[31]发均具有抑制作用，说明酚类物质在抗病方面起着重要的作用。在一些病害5 中己经把寄主内酚类物质含量同抗病性联系起来,酚类物质可能在侵染后期起作用。果实中酚类物质的含量和成分种类由生长环境和遗传因素决定的，除此之外采后加工和贮藏过程也起到一定的作用。酚类物质的含量高低与抗病性关系较大，这些物质的合成代谢愈强,品种的抗病性也就越高。研究表明果树叶片及枝条中多酚类物质含量变化都与植株整体的抗病性有着密切的关系，在接种病菌后抗病品种健康叶片及枝条中酚类物质含量高于对[32]照，而感病品种的叶片及枝条发病后其酚类物质含量均有提高。研究显示苹果果实的总酚含量在幼果期、膨大期、成熟期3个生育期都与苹果轮纹病的发生程度呈显著负相关，认为果实中酚类物质对抵抗轮纹病病菌[33]侵入有显著的作用，可以抑制轮纹病病菌的扩展。研究表明，含酚类物质较高的‘红玉’可以抑制果皮表面菌丝的繁殖并且能抵抗菌丝的入侵而抗病；含[34][35]酚类物质较少的‘金冠’抑制作用不明显而抗病差。吴永华等对龙血竭、樟子松、落叶松树体内的多酚提取物抑制病原真菌进行了研究，结果表明，同一种植物多酚浓度较高的植株抑菌能力也相对较强。但也有少数文献质疑了酚[36]类物质的抑菌作用，并且认为由酚类物质氧化而成的醌类物质才是潜在的抗病因子，酚类物质只是抗菌底物。有研究表明，酚类物质除了和病原菌有一定的抵抗性，也与植物的其他抗性关系密切。比如在低温胁迫下，植物细胞内自由基的产生与清除平衡遭到破坏，植物酚类物质具有较强的抗氧化活性，能够清除过量的自由基，保护生物膜的稳定性，因而在植物的抗逆生理中具有重要[37-40]作用，可作为判断植物抗寒性的生理指标。1.2.3.2糖酸类在苹果果实内含物中，糖类物质和酸类物质是重要的代谢物质，也影响着病原菌的侵染。很多研究显示，糖类物质的含量与苹果果实轮纹病的发生有一定的关系，糖含量高的果实有利于病菌的生长，果实未成熟时期糖类物质含量[10]低而抑菌物质含量较高，果实采后糖含量提高，病原菌从潜伏态逐渐到发病[41]态。苹果酸、柠檬酸和草酸是苹果中的主要有机酸，不同的品种含量有所不同。酸性物质有利于组织细胞木质化从而达到抑制病菌的作用。对鸭梨中有机酸抗病性研究显示，奎宁酸可以抑制病原菌的生长，但较低浓度的奎宁酸反而[20]促进病原菌的生长。接种损伤苹果果实后并用苹果酸经过处理，导致果实中代谢产物如总酚、类黄酮的含量和PPO、POD和PAL的活性都明显提高，说[42]明在经过处理后诱导了果实体内的抗病性。1.2.3.3防御酶类近年来，研究人员对多种植物感病后某些酶活性的变化规律进行了深入研--6 究植物在抵御病原菌的侵染时，抗病相关酶也发挥了重要作用，这主要包括酚[43][44]类代谢系统中的一些酶和病原相关蛋白(PR蛋白)家族，发现酶活性与植物[45][46]抗病有关。1.2.3.3.1过氧化酶(POD)POD参与了广泛的生理过程，木质化细胞壁的合成，多糖的交联，病虫害防御，植物激素代谢和酚的氧化等。POD可以催化酚类物质的氧化、生产木质[46]素从而抵抗病原菌的入侵。陈子文等指出枣疯树体内POD活性的强度与生长素的含量呈显著的负相关。Folke等发现在IAA过量的转基因烟草中，从而增加了木质素的沉积，POD活性亦提高了。这些结果表明POD在木质素的聚合作用中起主导作用。POD普遍存在于植物细胞,可以有效地清除细胞内过量的活性氧，催化许多酚类等物质的氧化。有研究表明，POD是寄主植物细胞内抵御活性氧伤害的主要保护酶类，可以清除活性氧并阻止活性氧的形成，对植物抗病起着关键的作用，其活性间接地反映着植物体内活性氧的代谢变化，与植物的抗病性有着密[47]切的相关性。高抗品种鸡冠POD酶活性变化差异显著高于中感品种国光和高[48]感品种富士。多数学者认为，植物中的POD是一种种类较多、功能较复杂的[49]酶，它的功能与木质素的合成有关，并与细胞的抗病性相联系。另外，刘海[33]英等也分析研究表明，随着接种时间的延长，POD的活性均出现先增加后降低的变化趋势，抗病性苹果品种POD酶活性变化的峰值和均值都高于感病品种，且峰值的出现比感病品种相对较晚。另外也有研究表明苹果品种POD活性[50]与果实发生苹果轮纹病有显著的相关性。1.2.3.3.2多酚氧化酶(PPO)PPO作为植物体内普遍存在的一种酶可促进褐变、合成色素，参与酚类代谢，将酚类物质氧化成高毒性的醌类物质，并参与木质素的合成从而抑制病原[51][52]菌，醌类化合物能钝化病原物的呼吸酶，可阻止病原物孢子的扩展，抑制病原物的生长，而且PPO还参与合成木质素，导致植株细胞壁的木质化，以[20]此在初步侵染时来抵抗病原菌的侵染。1.2.3.3.3苯丙氨酸解氨酶(PAL)PAL在植物生长过程中影响着苯丙烷类代谢和催化，是一种典型的胞内诱导酶，通过苯丙烷类代谢途径可转化为黄酮、香豆素、绿原酸等代谢物，并且[52-54]可以在植株中合成植保素和木质素等抗菌物质，WICHERS等对火炬松木质部的PAL进行了纯化，然后又从木质素cDNA文库中得到了含有PAL基因的cDNA，说明PAL与木质素的合成有一定的关系，很多研究都证实PAL与[55-56]植物的抗病性的关系密切，在植物抗病中有着屏障病原菌侵染的作用。植7 物感染病原菌后PAL活性显著升高，都表现出有规律的动态变化，感染的初期上升缓慢，随后急剧上升并且达到高峰，消退期PAL活性急剧下降。病原菌感染诱导抗病植株所产生的PAL活性远比感病植株高，侵染部位的酶活性高于离感染较远的部位，说明致病菌对PAL活性升高的刺激作用大于非致病菌，病原[57-59]菌接种感染可以激发PAL活性升高和增强毒素的作用。1.2.4抗病结构因子1.2.4.1木质素[60]木质素的抗病性已被广泛证实，木质素在植物体内沉积在细胞壁上，从而加强了细胞壁的木质化，既可以阻止病原菌扩散，也可切断病原菌扩散需要的营养物质，钝化真菌生长点，抑制其生长和繁殖。木质素的沉积可降低具有[30]抗真菌作用的细胞壁降解酶与多糖接触，从而减少细胞壁降解，增强抗病性。Hijwegen最早通过对黄瓜疮痂病抗病品种与感病品种的木质素活性测定确定了木质素的含量及木质化作用影响植物抗病性。毛爱军等通过水杨酸诱导辣椒使[61]其木质素含量增高，也证明了木质素与抗病性有着密切的联系。赵玲玲等对‘烟砧一号’抗病机理研究显示该品种作为中间砧加快了富士品种的木质素合[12]成，增加了木质部的厚度，从而使富士品种对轮纹病的抗性加强，说明了木质素在苹果轮纹病菌侵染后起着重要的作用。1.2.4.2皮孔组织结构皮孔是病原菌入侵及传播的主要通道，也是重要的潜伏部位。有研究报道，皮孔的密度及大小影响着苹果轮纹病的发病情况，可用皮孔密度或用皮孔密度[62][63]与其直径的积作为指标来鉴定对轮纹病的抗性。于秋香等通过对几种苹果砧木杂交后代及其父母本的皮孔性状的调查和抗轮纹病菌侵染能力的鉴定后证明皮孔密度与面积之积与侵染率之间存在极显著正相关，其积值越大侵染率及侵染指数越高，试材抗侵染能力越差。对‘鸡冠’等及其后代的皮孔组织及不同的皮孔组织的抗轮纹病侵染研究表明，皮孔组织结构不同的抗病性也存在差[64]异。孙月丽等研究证明不同抗性的苹果枝条间的皮孔组织结构有明显不同，抗性品种皮孔开裂时间较晚，分层明显，组织补充的较多，栓内层细胞排列较紧密，从而可以有效的阻碍轮纹病菌孢子的入侵。感病品种的皮孔组织结构则差异不明显。抗病品种侵染初期不开口，皮孔下木栓组织丰富，随后中后期逐渐开口。而感病或中感品种中侵染初期皮孔先开口，其下没有明显的木栓组织，[62]随后的皮孔开口加大。虽然很多研究表明皮孔是轮纹病菌侵染的最主要部位，[12]但赵玲玲等通过‘烟砧一号’作为中间砧嫁接后提高了富士的抗病能力，暗示了病菌入侵途径与皮孔之间没有显著的关联。--8 1.2.4.3植保素植物受到病原菌侵染后刺激所产生、积累的一类低分子量抗菌性次生代谢[22]产化合物，称为植物保卫素。植物受诱导后多数能产生植保素，它的产量及产生速度反映着植株抗病的强弱。它平时在植物体内含量很小，一旦受到某种诱导后则大量产生并积累，具有亲脂性。对病原菌具有很高毒性，但并不具有[65]专一性。很多菌丝及培养液等都可以诱导刺激植保素的产生和积累。1.3苹果多酚类物质研究进展1.3.1苹果多酚成分苹果多酚是苹果中所含多元酚类物质的总称，主要包括黄烷-3-醇类、羟基[66]苯甲酸类、二氢楂尔酮类、花色素类、黄酮醇类。其中羟基苯甲酸类中的绿[67-69]原酸是大多数种类苹果果肉中含量最高的，黄酮醇类在表皮中含量最高。成熟度不同的苹果中多酚类物质的含量也有所不同，成熟苹果中主要含原花青素、绿原酸、儿茶素，对于未成熟苹果中除了上述成分外还有二氢楂尔酮类、[70]槲皮酮等化合物。不同的苹果品种，不同部位，多酚类化合物含量及种类也有所不同，研究者利用不同品种苹果实验表明苹果皮中总酚及类黄酮含量高于苹果果肉，尤其是苹果皮中的根皮苷与芦丁分别占其苹果总含量的50％和66％，而槲皮苷几乎[71-73]完全存在于果皮中，因此重视苹果果皮的利用是至关重要的。然而苹果多酚含量会随着储藏期的延长而降低，所以从采摘到贮藏条件的选择也相当重要。1.3.2苹果多酚的功能活性1.3.2.1抗氧化作用苹果多酚的抗氧化活性比茶多酚高100倍以上，使得苹果多酚的开发与应[74][75]用倍受关注。金莹等利用国光苹果提取的苹果多酚进行体外抗氧化实验，对性质较为稳定的DPPH自由基清除能力表明在一定浓度范围内苹果多酚抗氧[76]化能力远远高于茶多酚，可与葡萄籽多酚媲美。金莹等利用国光苹果提取的苹果多酚进行体外抗氧化实验，对性质较为稳定的DPPH自由基清除能力表明在一定浓度范围内苹果多酚抗氧化能力远远高于茶多酚，可与葡萄籽多酚媲美。[77]郭娇娇等利用红苹果多酚提取物进行抗氧化实验，表明对DPPH自由基的清[78]除率达94.6％。彭雪萍等利用苹果渣中提取的多酚类物质作为腊肉涂膜液成[79]分，使腊肉保鲜期延长了1个月。廖春丽等通过在花生油、玉米胚芽油、大9 豆油等中加入苹果多酚、BHT（丁基羟基甲苯）、TBHQ（特丁基对苯二酚）、VC四种抗氧化剂进行对比，结果显示苹果多酚抑制油脂氧化能力是最强的，证明了苹果多酚是一种天然、高效的抗氧化剂，并且可以与VC等抗氧化剂之间产生协同作用。不同的苹果多酚提取物具有不同的抗氧化作用，不同的苹果品种抗氧化关[80]系也有差异。目前，对苹果多酚体外清除自由基能力的研究较多，而多酚类[81]物质在人体中抗氧化活性能力研究较少，文献表明，虽然苹果多酚在体外有较强的抗氧化活性，但是通过人体内实验发现，苹果多酚类物质在人体内并未发现有很强的抗氧化能力，所以，他们不支持在膳食中添加苹果多酚就可增加[82]抗氧化能力的观点。1.3.2.2抑菌作用[83][84]多酚类物质的抑菌作用已经得到了广泛的认可。如茶多酚，葡萄多酚，[85]玫瑰色蒜(rosygarlic)多酚提取物等，但对苹果多酚的抑菌作用研究还相对较[86-87]少。孙爱东等用苹果多酚对细菌、酵母菌、霉菌生长进行了研究，表明对6种细菌有明显的抑制作用，然而对酵母菌和霉菌的抑制作用不是很明显，对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌均具有十分显著的抑制[88]作用，并且与茶多酚、皂苷等抑制剂相比，抑菌能力高出几十倍。郝少莉等也利用苹果渣中提取的多酚类物质对细菌、霉菌、酵母菌进行抑菌实验，实验[79]结果与孙爱东等的相符。廖春丽等对苹果多酚的实验也证明其对金黄色葡萄[89]球菌、大肠杆菌以及枯草芽孢杆菌有明显的抑制作用。Petti等研究显示:苹果多酚通过抑制牙周致病菌的活性，增加口腔液的抗氧化活性和抑制变性链球[90]菌的致病性，从而有效的抑制牙龈疾病的发生，起到预防口腔癌的功效。1.3.2.3抗癌作用多酚类物质中黄酮和异黄酮类在人体生理代谢中起着重要的作用，有大量产生抗癌作用的生物活性，包括对酪氨酸激酶的抑制、抗扩散、抗氧化、免疫[91-92]功能等。体内外环境中的理化致癌因子使体内产生自由基，并以自由基的形式富集于脂质细胞膜的周围，从而引起脂质过氧化，导致破坏细胞的DNA的目的，从而导致致癌，其中类黄酮是自由基的猝灭剂和抗氧化剂，它能有效[93-94]地阻止脂质过氧化引起的细胞破坏，起到抗癌、防癌的作用。[95]Daiki等对大鼠肝癌细胞的体外抑制实验，证明苹果多酚具有一定的抗肝癌的作用。1.3.2.4其他功能[96]PChaudhary等研究证明苹果多酚可抑制由辐照引起的DNA死亡和细胞损伤；研究者喂养小白鼠苹果多酚显示食用过苹果多酚的小鼠胆固醇明显降--10 ［97］低。苹果多酚也对龋齿菌转葡萄糖基酶有抑制作用，其效果比儿茶素还要[97-99]高，对预防龋齿有一定的效果。1.3.3提取方法苹果多酚的常规提取方法为乙醇热回流浸提法。随着现代提取技术的发展，[77]超声波、大孔树脂等辅助工艺也相继被利用。郭娇娇等在采用乙醇回流法的基础上应用Folin-ciocalteu法对多酚的含量进行检测，得出苹果中多酚的最佳提取条件为：乙醇体积分数30%、提取温度70℃、料液比1:6、提取时间45min，并证明乙醇体积分数对多酚提取的影响显著，提取温度和料液比对其影响不显[100]著。张耀光等采用甲醇为提取剂，中极性吸附树脂ADS-8树脂吸附，吸附率达到49%，高于其他类型的树脂量，并研究了温度对吸附率的影响，温度升[101]高未吸附率也会增加，20℃为最适吸附温度。吕春茂等利用超声波技术辅助提取苹果渣中的多酚类物质，认为影响提取率的因素大小依次为超声波功率＞乙醇浓度＞超声波时间＞料液比。1.4分子标记1.4.1分子标记种类及其应用随着PCR方法的建立，分子生物学快速发展，发展史上的一场革命，DNA指纹技术也随之加快了步伐，成为了基因组的分析的有力工具。分子标记直接的反映了DNA水平遗传多态性。与形态学标记、细胞学标记等相比，大多数分子标记为共显性，也可对隐性的性状有选择性；分子标记的数量几乎是无限的，这些分子标记可以丰富地表达基因组；分子标记辅助选择不同于其他遗传标记，通过遗传标记对目标性状进行特异性选择；利用与目的基因紧密连锁的DNA标记，不只是可以改善某一品种的某一性状，还可以对品种或植株直接进[102]行选择。1.4.1.1RFLP标记（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）[102]RFLP是应用最广泛的分子标记技术，也是最早发展起来的。它是把特定生物类型的基因组DNA经限制性内切酶，酶切消化后，会产生数万条DNA片段，通过琼脂糖电泳将酶切DNA片段按大小顺序分离开，转移到尼龙支持膜上；然后与放射性同位素或非放射性物质标记后的DNA探针进行杂交，通过放射性自显影或酶学检测，可以显示出不同材料含有与探针含同源序列的酶切片段在长度上的差异，即多态性。该技术广泛应用在分析性群体遗传变异度、11 亲缘关系等方面。其优点是具有共显性的特点；种族特异性，对于分析一个分离群体的不同来源的染色体片段的分析具有重要价值；RFLP标记遍及整个基因组；而且稳定性好，重复率高。但其不足是主要表现在所需DNA量大，周期长；操作较复杂，需要的仪器、设备较多、成本高；并且实验中需要用到放射性的同位素，易污染环境。1.4.1.2RAPD标记(RadomAmplifiedPolymorphicDNA)RAPD技术是随机扩增多态性DNA，是利用PCR(PolymeraseChainReaction)扩增，对整个未知序列的基因组扩增，而得到多态性DNA的分子技术[103]。RAPD是以基因组DNA为模板，加入单个人工合成的随机引物（这些引物一般大小为10个核苷酸），在热稳定的TaqDNA聚合酶作用下，进行PCR扩增。扩增产物经电泳分离、溴化乙锭（EB）染色后，观察其多态性。扩增产[104]物的多态性反映了基因组的多态性。其优点为可以检测未知序列的基因组DNA，显性标记，引物无种族特异性，技术简单，多态性高，应用较为广泛。该分子标记技术缺点是稳定性较差，再[105]现性差。RAPD技术现已广泛的应用于动物及植株的品种鉴定、系谱分析及[106]寻求进化的关系。1.4.1.3SSR(SimpleSequenceRepeats)SSR分子标记是基本序列单位串联重复多次构成的短片段，一般1-6个碱基，长度一般在200bp以下。SSR是一种通过直接分析物质的多态性来鉴别生[107]物内在的核苷酸排布及其外在状态表现规律的技术。根据两端序列特征设计引物；进行PCR，在聚丙烯酰胺电泳下进行分离，染色显带以检测序列多态性；从而来得到样本DNA序列以及在遗传性状上的调控和差异，并确定基因排布[108]序列及表型，最终达到成功鉴定的目的。优点是：稳定性好、多态性高、分辨率好、引物特异性强，比较适合于苹果属种质资源亲缘演化关系和遗传多样性的研究。但是不足之处是SSR引物开发比较困难，代价比较高。而且虽然苹果引物已经开发出来很多，但是目前仍然缺乏对不同的种质资源类型具有针对性的引物。1.4.1.4AFLP（AmplifiedFragmentsLengthPolymorphism）AFLP即扩增片段长度多态性，通过限制性内切酶片断的不同长度检测DNA多态性，是由Zabeau和Vos（1993）发明的一种利用PCR技术检测DNA[109]多态性的方法。通过PCR反应先扩增酶切片断，然后再进行高分辨率电泳，然后通过扩增片段的长度来判断多态性。AFLP具有丰富的多态性，可以检测到的扩增产物多达100－150个，因而非常适合进行分类研究甚至是绘制出品种--12 的指纹图谱。另外AFLP最大的优点在于这种分子标记适合所有生物的基因组的检测，因此被认为是迄今为止最有效最理想的一种DNA分子标记技术，已广泛应用于动植物及微生物的遗传多样性研究、高密度遗传图谱的构建、抗性[110-111]育种、疾病诊断、生态分析等方面。AFLP也有一定的缺点，比如说模板DNA纯度要求高，否则会造成酶切不充分，出现过多的扩增片断，影响实验结果，而且技术流程较为复杂。AFLP技术除可以用于被广泛应用于动植物遗传多样性分析、功能基因筛[112-113]选及种质鉴定等领域。AFLP技术在微生物学领域的应用也相当广泛，在微生物分类、基因标定、鉴定和品系分析研究都有很好的效果。AFLP标记在[114]检测肿瘤等病原体中也有理想的效果。Terakami等利用SSR、AFLP和RAPD等标记技术将日本梨品种‘Kinchaku’中所含的抗黑星病Vnk基因定位在梨遗传图谱中LG1的中间区域，并鉴定出多个与黑星病抗性基因紧密连锁的分子标记[115][116]。YamamotoF应用甲基化敏感-AFLP技术检测了乳腺癌的基因变化。这[117]些都会对以后研究肿瘤发病机制发挥重要作用。1.4.2分子标记在苹果研究中的应用苹果基因组高度杂合，且多自交不亲合加上童期长等特点很难获得近等基因系(NIL)。现在主要运用分离群体分群法(BSA)快速定位基因标记，其原理是根据F1代个体中按抗感病发病状态，分离构建DNA抗感病池。每一组群体由等量的DNA混合，形成两个池。找出同目标抗病、感病基因相连锁的DNA多态性标记，找到抗感池之间的差异，从而对目标基因进行定位。利用DNA分子标记技术鉴定染色体上DNA片段的特异性，找到同目标基因连锁的分子标记，然后进一步找到其在染色体上的确切位置，植物抗病育种中具有很大的应用潜力，备受研究人员的广泛关注。这种遗传背景复杂的植物来说，分子育种是个有效、理想的手段。选配杂交亲本、检测目的基因、筛选抗病标记、杂种实生苗的早期选择等都是分子辅助育种的主要方向。查找分子标记与判断目的基因是主要方法，其中遗传距离越小，假阳性就越小，可靠性越大。2003年以FiestaxDiscovery群体构建了苹果遗传连锁图谱，该图谱为目前最完整、最新的，图谱包含840个标记其中475个AFLPs，利用建立的分子遗传图谱，选择目的基因分子标记可以缩小遗传距离。分子标记辅助育种可以使准确性提高，为分离抗性、品质、早期选择以及定向改变苹果性状等打下基础。到目前为止，在苹果上已有大量的质量性状被定位，包括抗黑星病的基因[118-120][121][122][123]Yf；抗霜霉病基因Pl1、果皮颜色基因Rf、根蘖发生基因Rs13 [124]和柱形性状基因Co等。其中一些标记已成功地转化为SCAR标记。尤其是关于抗黑星病基因的分子标记，它是一个以孟德尔特性遗传的主效显性基因，受到一些修饰其活性的微效基因的影响，该研究是最具有代表性。1.5研究背景和研究意义随着公众对化学药剂污染环境的关注，迫切要求通过非化学药剂的手段控制苹果轮纹病病害。套袋增加了生产成本，但套袋后主要应该加强对叶片、枝干病害的防治，而大部分果农将果实套袋后，就减少了药剂的用量甚至不喷药，导致枝干发病越来越严重，最终导致树势衰弱、果实产量和品质都下降，基于以上原因，迫切需要抗轮纹病品种。苹果轮纹病发病部位主要是主干和枝条，主干的发病情况最为严重，因此选育高抗苹果轮纹病的砧木或中间砧砧木极为重要。苹果植株遗传背景复杂、童期长、杂合度较高、自交亲合性差，杂交繁殖模式复杂，这都给遗传育种研究带来了很大的障碍。而且对于苹果轮纹病植株来说，在早期树龄较小时很难与普通植株区分开来，因此给早期选择带来一定的难度。本文从病原物与寄主互作的角度出发，以“舞美×M9”的13年生杂种实生树为试材，研究不同抗性植株在自然条件下不同时期总酚含量及POD、PPO、PAL活性的差异以及接种病原菌后各抗性物质的变化来进一步了解抗性植株抗病性的机理，从而可以把这些抗性物质作为抗病指标，进行不同时期检测，来间接地鉴定品种或植株的抗病性,从而可以选育好的中间砧来提高整体抗性。或者也可以通过有诱导剂诱导抗性物质的升高来提高果树抗性。结合离体抑菌试验，来验证抗性物质酚类对于苹果轮纹病的抑制作用，也为酚类植物源农药的开发提供理论依据。另外DNA分子标记技术也是一个理想的途径，可以通过寻找与苹果抗轮纹病基因紧密连锁的分子标记，直接通过早期的分子标记辅助，能大大提高选择效率，缩短育种周期，降低成本。在研究抗感病、抗病菌防御系统差异的同时，筛选抗性基因、选育抗病品种，控制病害，减少化学药剂的使用，达到经济环保的目标，结合轮纹病的发病机制，防御体系与抗性机制间的相关性早期鉴定植株的抗病性，并设计合理的用药措施及抗病方法。--14 第二章苹果枝干轮纹病与抗性物质的相关性研究2.1材料与试剂2.1.1植物材料来自青岛市农业科学研究院苹果砧木资源圃，高抗品种舞美为抗病亲本，感病品种M9为感病亲本，二者杂交的植株F1代为试验材料，前一年8月下旬开始观察74株13年生苹果实生植株的自然发病情况。2.1.2主要试剂无水乙醇溶液、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼砂、硼酸、钨酸钠、磷钼酸、愈创木酚、30%H2O2等购自青岛市化学试剂经营部。茶多酚为市售，含量为50％。用无菌水配成5mg/mL、10mg/mL、50mg/mL、100mg/mL茶多酚母液各50mL。2.1.3主要仪器表2-1实验用的主要仪器Table2-1Theapparatususedintheexperiment仪器及设备名称生产单位培养皿直径直径9cmSW-CJ-1Cµ双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司LDZX-50KB自动电热压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂DHP-9162电热恒温培养箱上海一恒科技有限公司生化恒温培养箱宁波莱福科技有限公司DHG-9140电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司KQ-500B超声仪郑州欧卡实验设备AL204-1C电子天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司15 2.1.4菌种轮纹病菌编号为LXS030101，来自青岛农业大学病毒流行学实验室，采集自山东省莱阳市水沐头村商用果园。2.1.5培养基PDA培养基：马铃薯200g葡萄糖20g琼脂20g补充纯水至1000mL无需调PH值2.2主要方法2.2.1PDA培养基的配制先把马铃薯洗净去皮，称取200g，切成小块，加水煮沸约30min至能被玻璃棒戳破即可，纱布过滤，过滤液中加入葡萄糖和琼脂各10g，边加热边搅拌混匀，稍冷却后加水分至1000mL，分装至锥形瓶，用脱脂棉塞紧瓶口，并扎紧，灭菌锅（121℃）灭菌20分钟左右后取出，冷却后贮存备用。2.2.2菌种纯化及保存琼胶平板稀释纯化法：用灭菌水清洗下菌种上产生的孢子，大致稀释至平均每个培养皿中30个左右的孢子，取一定量的孢子悬浮液与熔化后冷却到45℃左右的琼胶培养基中，充分混合，倒在与稀释分离相同的培养皿中，在25℃温度下培养，单个分散的菌落形成后，挑取，移植菌丝体培养。2.2.3接种处理取1年生新生枝条，抗病植株、中感植株、感病植株三种类型各处理5株，用70％的酒精对将接种的枝条部位进行擦洗，然后用无菌水再擦洗干净，在粗细均匀处用针扎三个孔，用打孔器取菌块，并将菌块覆盖在针孔处，用保鲜膜包裹住枝条，以便保湿，2-4天后可去除保鲜膜，做好标记。以接种无菌水作为空白对照。2.2.4抗感植株筛选以实生树枝干轮纹病自然发病表现作为抗病性评价指标。--16 表2-2苹果枝干轮纹病的分级标准Table2-2Dieasegradingstandardofringspotinapplebranch反应型症状表现抗病枝干光滑没有病斑中感主树干有病斑，但上部较少感病主干上下均匀病斑，而且病斑较多2.2.5采样方法从4月20号开始第一次采样，采取一年生枝条上的叶片，最好是同一向阳方向。抗病植株、中感植株、感病植株每个类型随机采取3株，间隔一个月采一次样，后期分别为5月21号、6月18号、7月19号、8月23号。采取叶片后，加入液氮，-70℃保存备用。接种实验中选取抗性不同的植株进行接种处理，采集接种处理后7、14、21、28天后的枝条，剥下接种部位表皮，表皮自然干燥至恒重后研磨成的粉末。2.2.6苹果叶及枝条中总酚物质及酶液的提取2.2.6.1总酚的提取表2-3供试因素和水平Table2-3Testfactorsandtheirlevels因子水平A溶剂B溶剂量（mL）C水浴温度（℃）D提取时间/min1水55020250％乙醇106530370％乙醇15804017 表2-4正交试验设计Table2-4Designoforthogonalexperiment编号组合A溶剂B溶剂量（mL）C水浴温度（℃）D提取时间/min1A1B1C1D1水550202A1B2C2D2水1065303A1B3C3D3水1580404A2B1C2D350％乙醇565405A2B2C3D150％乙醇1080206A2B3C1D250％乙醇1550307A3B1C3D270％乙醇580308A3B2C1D370％乙醇1050409A3B3C2D170％乙醇156520取0.5g苹果叶，用沸水烫5s，烘干水分，研磨成粉末。按照表2-4中的预设条件分别进行200W超声波水浴提取。4℃12000r/min离心20min。取上清用于测定，计算多酚提取率。然后按照优化的条件进行试验材料叶片或枝条的总[47-48]酚提取。2.2.6.2POD酶液提取称0.5g叶片或枝条粉末，加1mL磷酸缓冲液(0.2moL/L，pH7.8)，冰浴研磨后再加1.5mL缓冲液，倒人离心管中，再用2.5mL缓冲液清洗研钵，倒入离心管中，平衡，低温(0～4℃)离心20min(12000r/min)，离心后冷藏保存，上清液用于测定POD活性。2.2.6.3PPO酶液提取取0.5g叶片或枝条粉末，加1.5mL0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0，内含5mmol/L巯基乙醇，加2％的PVP溶解)，冰浴中匀浆，4℃12000r/min离心20min，上清液用于测定PPO的活性。多酚氧化酶酶活测定的最适pH值为6.0，其最适温度为25℃。2.2.6.4PAL酶液提取取0.5g叶片或枝条粉末，加1.5mL0.2moL/L硼酸缓冲液（pH8.8，内含5mol/L巯基乙醇，加2％或0.1g的PVP溶解），冰浴中匀浆，4℃12000r/min离心20min，上清液用于测定PAL的活性，或4℃下静置2h，取上清液在12000r/min条件下离心2min(4℃)，上清液用于酶活性测定。--18 2.2.7总酚含量及防御酶活性测定2.2.7.1总酚含量采用福林酚法测定2.2.7.1.1标准曲线的制作用10mL乙醇溶解0.04g没食子酸，定容至100mL，分别移取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL到25mL容量瓶中定容。从上述不同浓度的标准溶液中，移取5.0mL到100mL容量瓶中，分别加入50mL蒸馏水，加入4mL福林试剂摇匀，静置4～5min，加入8mL10%Na2CO3，用蒸馏水定容，置于25℃的恒温水浴锅中120min，显色后于760nm波长下测定吸光度，可得浓度与吸光度的曲线。2.2.7.1.2总酚含量测定准确吸取2mL样品于50mL的容量瓶中定溶，从中吸取5mL于100mL容量瓶中，加入50mL蒸馏水，再加入4mL福林试剂摇匀，静置4～5min，加入8mL10%Na2CO3，用蒸馏水定容，置于25℃的恒温水浴锅中120min，显色后于765nm波长下测定吸光度。由标准曲线查得相对应的浓度，并按下列公式[48][77]计算出多酚的含量。C×V×Vnω=——————（2.1）M式中，ω为多酚含量(mg/g)；C为没食子酸质量浓度(µg/mL)；V为提取液体积(mL)；Vn为稀释体积；M为取样量(mL)。2.2.7.2POD活性测定[55][59]采用愈创木酚法，0.2mol/L磷酸缓冲溶液（PH7.8）50mL，加入愈创木酚28µl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解、待溶液冷却后，加入（待溶液冷却后再加入，否则引起分解）40mmol/L30%H2O219uL，混合均匀，加入酶液后开始测定吸光度值，酶活性的大小用每克鲜重叶片1min内470nm处吸光值的变化来表示一个酶活性单位（U）。-1-1POD活性（U·g·min）=△A470×VT/(V1×W×t)（2.2）式中△A470为反应时间内吸光度的变化；VT为酶液总体积；V1为测定时吸取的体积；W为样品鲜重（g）；t为反应时间（min）。2.2.7.3PPO活性测定取磷酸盐缓冲溶液lmL1cm比色皿中，加人0.1mol/L邻苯二酚溶液lmL。[55][59]混匀后在420nm处比色，酶液加人后开始记时，每15s记录1次OD随时间的变化值，在测定条件下，每分钟引起吸光度改变0.1所需的酶量。酶活19 -1-1性以△A400nm·g·min表示，重复3次，以不加底物邻苯二酚的反应液为-1-1对照，单位为U·g·min。-1-1PPO活性（U·g·min）=△A400×VT/(0.1×V1×W×t)（2.3）式中△A420为反应时间内吸光度的变化；VT为酶液总体积；V1为测定时吸取的体积；W为样品鲜重（g）；t为反应时间（min）。2.2.7.4PAL活性测定1mL0.2moL/L硼酸缓冲液加1mL0.02mol/LL-苯丙氨酸和4mL蒸馏水，反应体系于35℃恒温水浴40min。加入10µl酶提取液，摇匀，然后在紫外可见分光光度计上290nm处测OD值，为初反应值，35℃水浴1h后再次测OD值，[55][59]两者的差值为酶液在1h内反应的酶活性。-1-1PAL活性（U·g·min）=△A290×VT/(0.01×V1×W×t)（2.4）式中△A290为反应时间内吸光度的变化；VT为酶液总体积；V1为测定时吸取的体积；W为样品鲜重（g）；t为反应时间（min）。2.2.8抑菌试验[86-88]浓度梯度实验方法，分别加入1mL浓度为5mg/mL、10mg/mL、50mg/mL、100mg/mL茶多酚母液及苹果叶多酚提取物至灭菌培养皿中，并将冷却至45℃左右的培养基倒人各培养皿中，摇匀使其达到规定浓度。用打孔器分别打取三种供试菌菌落边缘生长旺盛的菌饼，移到对应平板中间，以培养基内加入1mL无菌水为对照，每处理重复3次，置25℃恒温箱中培养，分别在24h和48h观察测量各处理菌落直径。对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径抑菌率(％)=×100（2.5）显著性不同浓度处理的多酚与对照比较差异达显著水平（P<0.05）2.2.9数据分析数据经SPSS软件处理，采用ANOVA进行各处理间进行差异性分析。2.3结果2.3.1总酚提取条件--20 表2-5正交试验结果Table2-5Resultoforthogonalexperiment编号组合提取率％（mg/g）1A1B1C1D114.022A1B2C2D218.13A1B3C3D317.54A2B1C2D321.65A2B2C3D125.36A2B3C1D218.897A3B1C3D224.628A3B2C1D329.189A3B3C2D131.22由表2-5可以得出最佳提取方案为0.5g样品加入15mL70％乙醇为提取剂，65℃200W超声波水浴20min，提取率达到31.22％。从表中可以看出溶剂的选择对提取率的影响最大，溶剂量为10mL时影响不明显，所以采用加入10mL提取剂的方案。2.3.2总酚测定（FC法）标准曲线以浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算回归方程为：y=0.1489x+0.0579，R2=0.9993，说明没食子酸对照品浓度在0.8mg/mL-2.4mg/mL范围内与吸光度呈现良好的线性关系。0.450.4y=0.1489x+0.05790.352R=0.99930.3(OD)0.25度0.2吸光0.150.10.05000.511.522.53没食子酸浓度（mg/ml)theconcetrationofgallicacid图2-1没食子酸标准曲线Fig.2-1Standardcurveofgallicacidconcentration21 2.3.3自然条件下抗性物质的变化规律2.3.3.1不同时期苹果叶中酚类物质含量与枝干轮纹病的关系抗病植株中感植株感病植株i3025201510总酚含量（mg/g)Contentsoftotalphenol504月5月6月7月8月采样时间(月）Monthsofsample图2-2不同时期总酚含量的变化Fig2-2.ChangesofcontentsoftotalPhenolicsindifferentperiods抗病植株一直呈缓慢上升趋势，6月份到7月份期间呈现大幅度升高，并达到最高峰值，随后8月份有所回落。这可能是由于4-6月份是轮纹病菌孢子的生成时期，而后7-8月份孢子开始散发，逐渐达到高峰；抗病植株受孢子侵染后酚逐渐积累，达到最高值，随后8月份随着侵染势力的减弱，总酚含量酚也逐渐减弱；中感型植株4-5月份期间有小幅上升，随后没有明显的变化，在7月份缓慢增幅后，在8月份也回落。中感型植株的趋势与抗病植株相似，但增幅不如抗病植株大，尤其是5-6份期间。4月嫩叶时期感病植株中叶片总酚高于抗病植株与中感植株，在5月达到最高峰，随后6月份有一段时间的回落，7月份又略有回升，其后又呈现下降趋势。这可能是由于感病植株中受侵染的较早，或者是因为感病植株皮孔中潜伏的孢子较多，4-5月期间就已经开始侵染植株了，诱导酚类含量急剧加强，6-7月再次受侵染高峰期的影响，酚类再一次的增加；随后随着侵染势力的减弱也逐渐回落。到达8月底的时候，受侵染严重的感病植株叶子病斑也增多，很多都造成了早期落叶。2.3.3.2不同时期苹果叶中POD酶活性变化--22 抗病植株中感植株感病植株600500)1﹣400·min300活性1﹣200PODU·gPODactivity（10004月5月6月7月8月采样时间（月）Monthsofsample图2-3不同时期POD活性的变化Fig2-3.ChangesofPODactivityindifferentperiods4月份抗病植株的POD酶活性低于感病植株和中感植株。抗病植株4-7月份一直处于积累阶段，7月份达到最高值，8月份有缓慢回落。由趋势可以看出抗病植株的POD酶到7月份一直呈现上升的阶段，6-7月期间侵染高发期，POD酶活性也快速上升，与病原菌的侵染强弱一致。中感植株在4月嫩叶时期POD酶活性比抗病植株要高，5月份变化不大，6月份又有下降趋势，这可能是由于病原菌侵染中感植株较早，随后7月份又有大幅上升趋势，也是受病原菌侵染有关。感病植株整体趋势与中感植株相似，两者没有明显变化，而与抗病植株有着一定的差异性，说明POD在抗病植株中起着关键的作用。2.3.3.3不同时期苹果叶中PPO酶活性变化抗病植株中感植株感病植株80.0070.00)60.00﹣⒈50.00活性·min40.00PP0﹣⒈30.00PPOacticity20.00(U·g10.000.004月5月6月7月8月采样时间(月)Monthsofsample图2-4不同时期PPO活性的变化Fig2-4.ChangesofPPOactivityindifferentperiods在4月初次采样时，抗病植株嫩叶中PPO酶活性相对较低,随着温度升高，23 到6月期间一直处于缓慢上升阶段，到7月份样品中PPO酶活性有大幅度的增加,并到达最高峰值，随后8月有所回落，酶活性与6月份相差不大。这可能是由于在轮纹病菌侵染高峰期够氧化多酚类化合物形成醌类化合物，对病原菌进行抑制，另外PPO酶也可参与酚类物质(如香豆酸，绿原酸等)的氧化作用从而促进木质素的合成。中感植株从4月份开始也同抗病植株呈现上升趋势，并在6月份急速上升达到最高值，7月份就有明显的下降梯度，虽然8月份有小幅回升，但差异性不大。感病植株4-5月期间感病植株的酶活性变化不明显，5-6期间与中感植株的变化趋势相似，可能是感病植株与中感植株受病原菌侵染的较早或早期侵染自身反应较快，比抗病植株早达到峰值。2.3.3.4不同时期苹果叶中PAL酶活性变化抗病植株中感植株感病植株300250)﹣⒈200·min活性150﹣⒈PALU·gPALactivity100（5004月5月6月7月8月采样时间(月）Monthsofsample图2-5不同时期PAL活性的变化Fig2-5.ChangesofPALactivityindifferentperiods4月份嫩叶时期抗病植株叶片的PAL酶活性较中感植株与感病植株三者中最低，随后一直呈现上升趋势，一直到7月到达最高峰，但8月份又有所回落，PAL对于酚类物质的合成有一定的推动作用，4-5月份病原菌侵染逐渐增强，PAL活性也逐渐增强，促使酚类物质的逐渐积累。中感植株在4-5月份期间没有明显变化，6月份由短暂的升高，随后小幅度下降，趋势缓慢。中感植株PAL酶活性整体变幅不大，呈平稳状态，这也可能导致病菌侵染初期可以达到一定的抵御作用，达到侵染高峰期反而达不到完全抵御的作用。感病植株整体变幅也不大，5月份侵染初期反而积累比较多，随后下降。2.3.3.5总酚及防御酶变化规律对于总酚含量与三种防御酶活性，抗病植株的趋势相似，都是4-7月份逐--24 渐上升，随后8月份有所回落。并都在7月份达到最高值，说明在抗病植株中抗性物质在7月份积累达到顶点。4月酚总酚含量及酶活性三者相差不大，而且感病植株与中感植株比抗病植株相对要高，可能是由于感病植株枝干存留的轮纹病菌经过越冬之后，开始复苏，引起感病植株一些生理反应。5月到7月是侵染盛期，然而5-6月期间感病植株与中感植株的酚含量及酶活性都比抗病植株持平或者是高于抗病植株。说明在侵染初期，病原菌入侵的时间，抗病植株要慢于其他两者，这可能和自身的皮孔组织或其他外在防御强的抵抗力有关。当7月份继续侵染高峰时，抗病植株总酚含量及各种酶活性都已经达到高峰，这对于抵抗轮纹病病原菌的侵袭起到了重要的作用。2.3.4接种处理后苹果枝条酚类物质与抵抗轮纹病菌的关系抗病植株空白对照6050403020总酚含量（mg/g)10Contentsoftotalphenolic007天14天21天28天接菌后时间（天)Hoursafterinoculation(d)图2-6接种轮纹病后抗病植株中酚类物质总含量的变化Fig2-6.ThechangesofPhenolicscontentinresistantplantafterinfectionwithB.berengriana抗病植株枝条在接种初期，一周内变化不大，随后迅速上升达40mg/g，并在一周内保持含量，随后又大幅上升，接种28天时浓度已超过50mg/g。空白对照植株7天时有上升趋势，可能是由于枝条受刺伤后内部组织的自然防御反应。最高值为39.7mg/g。枝条在接种两周期间总酚含量与空白对照差异并不明显（P>0.05），21天时对照组有下降趋势，而接种枝条总酚含量持续增高，两者呈显著性差异（P<0.05），接种28天后空白对照已经相对平稳，没有太大的变化，接种处理植株则继续上升，可能是由于枝条侵染反应从21天时开始增强，并在28天时刺激诱导总酚积累达到较高的峰值51.9mg/g，两者呈现极显著差异25 （P<0.01）。中感植株空白对照45c4035mg/g)30（252015总酚含量10Contentsoftotalphenoli5007天14天21天28天接种后时间（天）Hoursafterinoculation(d)图2-7接种轮纹病后中感植株中酚类物质总含量的变化Fig2-7.ThechangesofPhenolicscontentinModerateSusceptibleplantafterinfectionwithB.berengriana接种处理的中感植株接种后两周的时间变化不明显，处于平稳状态，说明菌丝对枝条的侵染还没有对树干内部的抗性物质产生刺激作用，随后14天到21天的过程中总酚含量开始迅速增加，并在第四周又重新回落，可能由于在轮纹病菌侵染枝干时促使了总酚含量的积累，但没有积累的足够的抗性物质，或产生其他抑制酚类物质的物质，总酚含量回落到接种时平稳状态。相对于接种处理的植株，空白对照植株的总酚含量整体都在处于下降趋势，尤其是在受刺伤后一周有下降幅度后有小幅上升，后两周处于平稳趋势。随后的的唯一一次上升趋势，可能是受刺激后总酚的小幅积累。从上图可以看出对于中感植株受病原菌侵染的反应是从第14天开始的。在21天时达到最高峰，并且接种处理植株与对照组二者差异极显著（P<0.01）。--26 感病植株空白对照40c3530(mg/g)252015总酚含量105Contentsoftotalphenoli007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursafterinoculation(d)图2-8接种轮纹病后感病植株中酚类物质总含量的变化Fig2-8.ThechangesofPhenolicscontentinSusceptibleplantafterinfectionwithB.berengriana感病植株的总酚含量整体较低，在25-35mg/g之间，接种处理的植株从接种处理一直到第21天一直处于缓慢上升趋势，第一周就增加了约5mg/g，感病植株受到病原菌侵染后反应较快较灵敏，说明感病植株枝条中其他的抗性物质在侵染初期没有能抵抗住病原菌的侵染，一周内就刺激总酚的积累，并在第21天积累量达到顶峰，但随后又下降至未接种水平。空白对照组在受针刺初期一周内有所上升，随后缓慢下降，整体变化幅度不大。抗病植株中感植株感病植株6050mg/g)40（3020总酚含量10Contentsoftotalphenolic007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursafterinoculation(d)A接种植株(Thetestedplants)27 抗病植株中感植株感病植株c6050mg/g)40（3020总酚含量10Contentsoftotalphenoli007天14天21天28天接菌后时间（天）HoursafterinoculationB空白对照（CK)图2-9不同抗性植株接种轮纹病后总酚含量的差异A为接种植株B为空白对照Fig2-9.ThedifferenceofPhenolicscontentindifferentresistantplantafterinfectionwithB.berengrianaA:ThetestedplantsB:CK由以上两张整体图可看出对于接种处理的总酚含量约在20-50mg/g范围内，抗病植株整体高于中感植株与感病植株。抗病植株与中感植株有显著性差异（P<0.05），与感病植株存在极显著性差异（P<0.01），而中感植株与感病之间却差异不显著（P>0.05）。空白对照中总酚含量约在20-40mg/g范围内，与感病植株存在极显著性差异（P<0.01），而抗病植株与中感植株、中感植株与感病植株之间没有显著性差异（P>0.05）。总酚含量在整体接种实验中，抗病植株与中感植株呈显著性差异（P<0.05），与感病植株呈极显著性差异（P<0.01），说明接种后多酚类物质就起到了重要的作用。果树体内含有丰富的酚类物质，并且很多研究都已经表明，酚类物质与植物抵抗病原菌有着密切的关系，本实验通过接种处理，研究了酚类物质在受接种轮纹病菌后抗病植株、中感植株、感病植株的自身含量的变化及三者之间含量差异。抗病植株在枝条侵染后反应从21天时开始增强，并在28天时总酚积累达到较高的峰值，中感植株受病原菌侵染的反应是从第14天开始的，并在21天时达到最高峰，感病植株，第21天积累量达到顶峰，但随后又下降至未接种水平。6月中旬到8月中旬是轮纹病菌侵染盛期，抗病植株在接种初期的总酚含量就高于其他两种植株，说明在没接种以前抗病植株的总酚就在不断地积累，接种后菌丝侵染的速度较慢与其他两种植株，可能是由于抗病植株自身的其他抗性物质或前期积累酚类物质的影响，在侵染初期及时做出了防御，总酚含量--28 只是稍有下降。但后期随着轮纹病菌侵染的继续，总酚含量有了大幅度的增加，并一直保持高含量。中感植株在受侵染初期变化不明显，三周后开始急速增加，这反应了中感植株自身结构或其他抗性物质初期的防御作用起到了作用。感病植株接种初期总酚含量就开始积累，可能是由于本身积累的抗性物质较少，不能做初期防御，但后期总酚物质也没有增加，说明感病植株受病菌侵染严重，抗性物质也随着生理机能的衰退逐渐地下降，最后导致染病，枝条受到伤害。2.3.5接种处理后苹果枝条POD酶活性与抵抗轮纹病菌的关系抗病植株空白对照7060)50﹣⒈·min40﹣⒈30POD活性U·gPODactivity20（10007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursafterinoculation(d)图2-10接种轮纹病后抗病植株中POD活性变化Fig2-10.ThechangesofPODactivityinresistantplantafterinfectionwithB.berengriana由图表趋势可以看出抗病植株枝条接种后POD活性一直处于上升趋势，7-1-1天内缓慢上升，而后迅速升高，至21天时达到最高值（56U·g·min）,然后略有下降。空白对照组整体趋势变化不大，尤其是前两周，基本处于平稳状态，第三周开始有所升高，但幅度不大，随后又回落。在21天至28天时期，接种处理植株的POD活性均极显著高于对照（P<0.01）。说明在此期间接种处的POD活性受病原菌的侵染变化最大。29 中感植株空白对照6050)﹣⒈40活性·min30﹣⒈PODU·gPODactivity20（10007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursafterinoculation(d)图2-11接种轮纹病后中感植株中POD活性变化Fig2-11.ThechangesofPODactivityinModerateSusceptibleplantafterinfectionwithB.berengriana由上图可看出中感植株前期POD活性变化一直是上升趋势，并于14天时-1-1达到峰值，随后迅速下降，28天测定时只有（25U·g·min），未接种对照组，POD活性变化幅度不明显，只在7天内有小幅升高，随后一直处于平稳下降趋势。接种植株与对照组在14天时有显著差异（P<0.05），其他时期差异不明显（P>0.05）。感病植株空白对照6050)﹣⒈40活性·min30﹣⒈PODPODactivity20(U·g10007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursafterinoculation(d)图2-12接种轮纹病后感病植株中POD活性变化Fig2-12.ThechangesofPODactivityinsusceptibleplantafterinfectionwithB.berengriana--30 感病植株在7天内变化幅度不大，随后迅速升高，至14天到达最高峰，然后有又迅速下降，此后处于平稳。空白对照组在未接种时比接种植株略高，随后一直缓慢下降，21天后有小幅上升，并与接种植株持平。两者整体差异不明显，虽然14天时，有显著差异。可由于感病植株受侵染后，POD活性短暂升高，但没有能抵御病原菌侵染，随后便下降回至原水平，这可能是导致感病的原因之一。抗病植株中感植株感病植株60504030POD活性20（U·g﹣⒈·min﹣⒈)10007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursofinoculation(d)A接菌植株（Thetestedplants)抗病植株中感植株感病植株6050)﹣⒈40活性·min30﹣⒈PODU·gPODactivity20（10007天14天21天28天接菌后时间（天)Hoursafterinoculation(d)B空白对照（CK)图2-13不同抗性植株接种轮纹病后POD活性差异A为接种植株B为空白对照Fig2-13.ThedifferenceofPODactivityindifferentresistantplantafterinfectionwithB.berengrianaA:ThetestedplantsB:CK31 -1-1由上图可以看出接种处理后抗病植株变化幅度比较大（32U·g·min-56-1-1U·g·min），整体POD活性高于其他两种植株。14天内三者差异不显著（P>0.05），随后中感植株与感病植株都是下降趋势而抗病植株却继续上升，而且上升幅度很大，抗病植株与其他两者呈极显著差异（P<0.01）。接种后中感植株与感病植株整体趋势大致相同，只是侵染前期中感植株酶活性较高，这可能是由于中感植株在受侵染后POD比较早地被激发出来，虽然后期作用不大，但也一定程度的保护了植株。空白对照组三者变化幅度均不明显（26-1-1-1-1U·g·min-41U·g·min），三者14天内基本处于同一趋势，抗病植株在第三周有小幅上升，但第四周三者又回到了同一水平，可能是由于在第三周（8月初至中旬）病原菌侵染高峰时，抗病植株受到刺激产生自身抵抗反应。本实验显示抗感植株POD活性在接种侵染早期与对照组差异不显著，接种后14天抗病植株开始高于中感与感病植株，后期与中感植株、感病品种有极显著性差异（P<0.01）。在整体实验周期中POD活性与轮纹病菌的侵染无显著相关性，21-28天阶段中抗病植株与中感及感病植株均呈显著性差异（P<0.05），说明在此阶段时期接种后，POD活性起到了重要防御或抵抗的作用。POD是一种参与防御活性氧伤害的保护酶，可以清除超氧自由基、H2O2和过氧化物以及降低或阻止自由基形成，在受到病原菌侵染时还可催化木质素[48][59]单体聚合成木质素，提高组织木质化程度，从而阻止病原菌的入侵。本实验中接种后三种植株POD酶活性在两周内都有上升趋势，差异不明显，但14天后抗病植株迅速上升，而另外两种是下降趋势，这说明三者的差异是从刺激两周后开始的，侵染初期三者酶活性都迅速升高，但是中感植株与感病植株两周后就没有再继续升高反而下降，可能POD活性的降低，导致两者的抗病性减弱。--32 2.3.6接种处理后苹果枝条PPO酶活性与抵抗轮纹病菌的关系抗病植株空白对照120100)﹣⒈80活性·min60﹣⒈PPOU·gPPOactivity40（20007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursafterinoculation(d)图2-14接种轮纹病后抗病植株中PPO活性变化Fig2-14.ThechangesofPPOactivityinresis6tantplantafterinfectionwithB.berengriana由图可以看出抗病植株接种后两周时间内PPO活性快速上升，由原来60-1-1-1-1U·g·min上升为最高峰104U·g·min，PPO可以氧化本身积累的酚类物质并且可以参与木质素的合成，以此来抵制病原菌的入侵。随后开始下降，后恢复至接种前活性后开始保持平稳。抗病植株的空白对照组7天内稍有下降，又有小幅上升，随后第三周下降至与接种植株持平，并保持平缓下降。接种处理后抗病植株在7天、14天均与对照组有极显著差异（P<0.01）。中感植株空白对照120100)﹣⒈80活性·min60﹣⒈PPOU·gPPOactivity40（20007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursafterinoculation(d)图2-15接种轮纹病后中感植株中PPO活性变化Fig2-15.ThechangesofPPOactivityinModerateSusceptibleplantafterinfectionwithB.berengriana中感植株接种处理后7天内就快速上升，并达到最高峰，随后两周内一直33 处于下降趋势，28天时有所回升，空白对照组在7天内也有小幅上升，两者有显著性差异（P<0.05），这种7天内的快速反应可能是侵染早期的一种生理反应，随后的迅速下降，并且在21天时已经低于对照组，说明中感植株在早期受刺激产生了一定量的防御酶但中后期还在侵染的同时却下降没有足够的酶活性来抵御病原菌。感病植株空白对照120100)80﹣⒈活性·min60﹣⒈PPOU·gPPOactivity40（20007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursafterinoculation(d)图2-16接种轮纹病后感病植株中PPO活性变化Fig2-16.ThechangesofPPOactivityinsusceptibleplantafterinfectionwithB.berengriana感病植株接种处理后7天内也有迅速的上升趋势，第二周又快速下降，随后保持平稳至接种前活性。未接种的感病植株基本没有变化，保持在-1-140-50U·g·min左右，在第7天时两者有极显著差异（P<0.01），而且接种处理处的PPO活性是对照组的2倍。--34 抗病植株中感植株感病植株120100)﹣⒈80·min60PPO活性﹣⒈PPOactivity40(U·g20007天14天21天28天接菌后时间(天）Hoursafterinoculation(d)A:接种植株（Thetestedplants)抗病植株中感植株感病植株120100)80﹣⒈60活性·minPPO﹣⒈40PPOactivity(U·g20007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursafterinoculation(d)B:空白对照（CK)图2-17不同抗性植株接种轮纹病后PPO活性差异A为接种植株B为空白对照Fig2-17.ThedifferenceofPPOactivityindifferentresistantplantafterinfectionwithB.berengrianaA:ThetestedplantsB:CK-1-1由上图可以看出接种后PPO活性整体比空白对照高，在37U·g·min-104-1-1-1-1-1-1U·g·min范围内，而对照组38.6U·g·min-65U·g·min范围内。接种后7天三者都显著升高并且活性相近，而后一周抗病植株继续上升，中感植株与感病植株有不同幅度的下降，在第14天时三者之间均呈现极显著性差异（P<0.01），说明可能这个时期是抗感病最重要的时期。随后21天时抗病植株也下降，而且28后三者又回到与接种处理前相近的活性。本实验显示抗感植株PPO活性在接种侵染早期差异不显著，接种后21天35 抗病植株PPO活性有极显著性差异高于中感植株、感病品种。三者空白对照组差异不显著。说明14到21天期间PPO对于植物体内的防御或抵抗起着重要作用。在整体实验周期中PPO活性与轮纹病菌的侵染无显著相关性，14-21天阶段中抗病植株与中感及感病植株均呈显著性差异，说明在此阶段时期接种后，PPO活性起到了重要的作用。很多研究表明PPO活性能有效催化多酚类化合物氧化形成相应的醌类物质，具有很强的毒性，能杀死病原菌与植物抗病性密切相关。PPO可增加植物对病原体的抗性，还可促进伤口的愈合。如烟草对炭疽病、黄瓜对黑星病、棉苗对枯萎病菌、水稻对白叶枯病菌和细菌性条斑病以及番茄对小昆虫的抗性等活性与抗病性表现呈显著相关性。2.3.7接种处理后苹果枝条PAL酶活性与抵抗轮纹病菌的关系抗病植株空白对照400350300)250﹣⒈200活性·min150﹣⒈PAL100PALactivity(U·g50007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursafterinoculation(d)图2-18接种轮纹病后抗病植株中PAL活性变化Fig2-18.ThechangesofPALactivityinresistantplantafterinfectionwithB.berengriana抗病植株在接种处理后7天内一直处于大幅度上升的趋势，7-14天缓慢上升，随后开始下降。空白对照虽然在前两周内也有缓慢的上升趋势，但上升幅度较小，在这段时期，二者差异极显著（P<0.01）。接种前及21天以后，接种植株与对照植株基本持平。接种后抗病植株受到病原菌侵染后迅速大幅上升，说明PAL在轮纹病菌侵染枝条过程中起到防御作用，21天后又回到原有活性，可能是由于PAL只是在特定时期发挥它的防御作用。--36 中感植株空白对照400350300)250﹣⒈200·min活性150﹣⒈PAL100U·gPALactivity（50007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursafterinoculation(d)图2-19接种轮纹病后中感植株中PAL活性变化Fig2-19.ThechangesofPALactivityinModerateSusceptibleplantafterinfectionwithB.berengriana接种处理后7天内中感植株也快速上升随后缓慢下降，28天时与对照持平。对照组整体变化不大，只在14天时有小幅上升，一直处于平稳状态。第7天时二者具有极显著性差异（P<0.01）。感病植株空白对照400350300)﹣⒈250活性·min200﹣⒈150PALU·gPALactivity100（50007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursafterinoculation(d)图2-20接种轮纹病后感病植株中PAL活性变化Fig2-20.ThechangesofPALactivityinsusceptibleplantafterinfectionwithB.berengriana感病植株接种后两周内也持续上升，14天达到最高峰，随后开始缓慢下降。37 对照组中趋势与接种植株相似，14天内也是缓慢上升趋势，随后变化不大，28天后与接种植株酶活性相近。二者在14天时呈极显著差异（P<0.01）。抗病植株中感植株感病植株400350300)250﹣⒈200·min150PAL活性﹣⒈100PALactivity(U·g50007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursafterinoculation（d）A:接种植株（Thetestedplants)抗病植株中感植株感病植株400350300250)﹣⒈200活性·min150PAL﹣⒈100PALactivity(U·g50007天14天21天28天接菌后时间（天）Hoursafterinoculation(d)B:空白对照（CK)图2-21不同抗性植株接种轮纹病后PAL活性差异A为接种植株B为空白对照Fig2-21.ThedifferenceofPALactivityindifferentresistantplantafterinfectionwithB.berengrianaA:ThetestedplantsB:CK-1-1由上图可看出接种处理后在53-350(U·g·min)，而空白处理上下浮动-1-1只在71-256(U·g·min)，说明接种后整体酶活性都有大幅升高，尤其是抗病植株。图1中可以看出7天内中感植株与抗病植株相似都快速上升，此时二者与感病植株呈极显著差异（P<0.01）。7-14天感病植株与抗病植株相似，都是升高的趋势，此时中感植株却开始下降，14天时与感病植株持平，抗病植株与感病植株呈极显著差异（P<0.01），与中感植株呈显著性差异（P<0.05）。随后两周三者都下落，说明在14天内PAL对于抵抗苹果枝干轮纹病菌的侵染起着重要的作用。抗病植株在7到14天与对照组均具有极显著性差异，中感植株在7天时与--38 对照组有极显著性差异，而感病植株在14天时极显著差异于对照组，说明PAL在14天以内都起着关键的作用，而7-14天这段时间相比于7天内PAL活性增高要弱。整体实验周期来看，接种后三者差异性不显著，7-21天阶段中，抗病植株与感病植株呈极显著差异（P<0.01），与中感植株呈显著性差异（P<0.05），说明在此阶段中，PAL活性与苹果枝干轮纹病有着一定的相关性。PAL可形成抗性物质，可形成包括植保素、木质素和酚类化合物等抗病次生物质，而且是苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶，许多研究提出，植物受病原菌侵染后，PAL活性有所提高，同时促使木质素、绿原酸合成的增加，说明了PAL在植物抗病性中的重要性。但对这一生理指标并不代表侵染的全部过程，因为植物抗病品种在病原物的侵染过程中PAL活性不一定高于感病品种，故应指明病原菌侵染后的哪一时期或哪一阶段才可以作为抗性的生理指标。2.3.8在离体条件下多酚类抗性物质对轮纹病菌的抑菌作用2.3.8.1不同浓度茶多酚对轮纹病病原真菌生长的抑制作用表2-6茶多酚抑菌结果Table2-6Resultsofinhibition24h48h浓度菌落直径抑制率菌落直径抑制率（mg/mL）(cm)(％)(cm)(％)1003.2042.86a5.2039.53a503.7533.04b6.4525.00b104.8513.39c7.6011.63c55.256.25d8.501.16dCK5.600.00e8.600.00d注：a，b，c，d表示处理问差异显著(P<0.05)，同一列相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著Note：a,b,e,dmeanremarkabledifferenceamongtreatment(P<0.05).Thesameletterswithinacolumnindieatenosignifieantdifferenee,whiledifferentletterswithinacolumnmeanssignifieantdifferenee.39 图2-22茶多酚对轮纹病菌的抑菌效果Fig2-22inhibitioneffectoftea-polyphenolonB.berengriana.表2-3中可以看出，稀释的五种浓度茶多酚分别对轮纹病菌都有一定程度的抑制作用，经过对处理间的多重比较，各处理之间都有显著差异（P<0.05）。从抑制率可以看出随着浓度的增加，对轮纹病菌的抑制效果最好，浓度为100mg/mL时抑制率已经达到三分之一以上，但是浓度为5mg/mL时抑菌效果不太好，无明显抑菌效果如图（2-30）。2.3.8.2苹果叶提取酚类物质的抑菌效果表2-7苹果多酚的抑菌结果Table2-7Resultsofinhibition24h48h浓度菌落直径抑制率菌落直径抑制率（mg/mL）(cm)(％)(cm)(％)1003.735.65a5.7534.66a504.2526.08b6.822.73b104.3524.35b6.4526.70b54.7018.26c7.5014.77cCK5.750.00d8.800.00d注：a，b，c，d表示处理间差异显著(P<0.05)，同一列相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著Note：a，b，e，dmeanremarkabledifferenceamongtreatment(P<0.05).Thesameletterswithinacolumnindieatenosignifieantdifferenee,whiledifferentIetterswithinacolumnmeanssignifieantdifferenee.--40 图2-23苹果多酚对轮纹病菌的抑菌效果Fig2-23inhibitioneffectofapplepolyphenolsonB.berengriana.由表2-4可以看出随着提取物浓度的增大，苹果叶提取的多酚类物质抑菌效果也在不断增加，除浓度为10mg/mL与50mg/mL时没有明显差异，其他各处理间均有显著差异（P<0.05）。与茶多酚相似，浓度为100mg/mL时抑制率也已经达到三分之一以上，苹果叶多酚的抑制率最好，但不同于茶多酚，苹果多酚在5mg/mL时已明显抑菌作用如图（2-31）。酚类物质作为一种被广泛认可的抑菌物质，很多研究都已经得到证实，本实验通过应用不同浓度的茶多酚作、苹果多酚总提取物做抑菌物质，对轮纹病体外抑制，显示出随着浓度的增加，抑菌效果也随之增大。在100mg/mL浓度下抑菌效果最好。实验表明多酚类物质对轮纹病病原真菌有一定的抑制作用，可以作为抗病物质的一种，也为开发植物源农药提供了理论依据。2.4讨论1．总酚提取苹果叶总酚提取时溶剂的选择很重要，选择70％的乙醇作为提取剂，在提取时可以一定程度地抑制酶活性，减少PPO酶氧化酚类物质。另外将提取的苹果叶中的总酚物质，真空干燥，蒸发乙醇，防止乙醇的杀菌效果影响实验。待完全干燥完毕后，加入等量体积的灭菌水溶解，离心，上清作为抑菌溶液。41 2．植株选择对于植株的选择，不同于其他研究中多选用不同品种的植株进行接种调查，本实验选用的是同一个F1群体，可以避免不同品种间遗传上的差异导致的病态差异。而且自然条件下所调查的植株均为重复发病的多年生植株，高发病率是其必然，能较好反应出该种质资源对苹果轮纹病的综合抗性。3．接种处理根据以上对接种处理与对照之间的对比、接种处理间、空白对照间总酚含量及三种酶活性的分析，可以看出接种前后均在不同时期有着不同程度的差异。抗病植株的总酚含量从接种开始一直上升，而且一直高于其他两种植株，总酚含量与轮纹病的发病程度呈显著的相关性。三种酶活性与轮纹病发病程度相关性都不是很显著，PAL>POD>PPO，这种现象是因为三者虽然与轮纹病的抗性有一定的关系，但并在病原菌侵染的整个过程起到作用，抗病植株PAL活性在14天内分别与其他二者有不同程度的差异，而POD活性在21天时有了极显著[49]差异，PPO活性也在14天时就高于中感及感病植株，此研究不同于李广旭等对不同品种侵染轮纹病的研究。不同抗性物质在不同抗性植株中的差异说明接种后对抗感病程度不同的植株的影响不同。4．体外抑菌从抑菌效果图中可以看出苹果多酚中菌丝直径虽与茶多酚相似，甚至不如茶多酚抑菌圈小，但对于孢子的抑制效果相比茶多酚要好，可能苹果多酚对孢子的产生有更好的抑制效果，还有待进一步研究。酚类物质对轮纹病菌的抑菌作用可以确定，但具体酚类物质中的哪种成分，在什么阶段有着什么样的抑制机理，还有待进一步确认。另外，通过苹果叶提取液抑菌作用可以看出，在浓度较低时不但没有作用反而比空白中直径更大些，这可能是由于纯度不好，杂质中含有有益于菌丝生长的成分。抑菌实验期间只是加入了不同浓度的酚类物质，但只属于单一因素，在植物体内可能酚类起到抵抗作用的同时还会受到酶类、酚酸类等物质的相互影响，而且植物体还会受到外在因素的影响，所以体外抑菌试验的抑菌程度只能作为一种理论参考，只能说明酚类物质对于轮纹病菌有一定的抑制作用，但具体作用大小还有待进一步研究。--42 第三章利用AFLP分子标记技术筛选苹果轮纹病抗病标记3.1材料与试剂3.1.1供试材料采自青岛市农业科学研究院苹果砧木资源圃，高抗品种舞美为抗病亲本，感病品种M9为感病亲本，“舞美×M9”的13年生杂种感抗病分离群体，经过多年自然染病情况，总植株数为74株，12株为抗病植株，27株中感植株，35株感病植株，于春天采取幼嫩叶片，-70℃保存备用。3.1.2主要试剂本试验所用的MseI、EcoRI以及所用的引物购自上海生工生物技术有限公司，TaqDNApolymerase和themasterMix购自天根生化科技有限公司，其它试剂均购自青岛市化学试剂经营部。事先合成选择性引物（SAPrimer)：表3-1供试引物及其序列Table3-1Testedprimerpairsandtheirsequence引物编号EcoRI选择性引物（Eco-primer)E1E-AAC:GACTGCGTACCAATTCAACE2E-AAG:GACTGCGTACCAATTCAAGE3E-ACA:GACTGCGTACCAATTCACAE4E-ACT:GACTGCGTACCAATTCACCE5E-ACC:GACTGCGTACCAATTCACCE6E-ACG:GACTGCGTACCAATTCACGE7E-AGC:GACTGCGTACCAATTCAGCE8E-AGG:GACTGCGTAXXAATTCAGCMseI选择性引物（Mse-primer)M1M-CAA:GATGAGTCCTGAGTAACAAM2M-CAC:GATGAGTCCTGAGTAACACM3M-CAG:GATGAGTCCTGAGTAACAGM4M-CAT:GATGAGTCCTGAGTAACATM5M-CTA:GATGAGTCCTGAGTAACTAM6M-CTC:GATGAGTCCTGAGTAACTCM7M-CTG:GATGAGTCCTGAGTAACTGM8M-CTT:GATGAGTCCTGAGTAACTT43 事先已合成预扩增引物（PAPrimer)：序列：EcoRIA:5’GACTGCGTACCAATTCA3’MseIC:5’GATGAGTCCTGAGTAAC3’3.1.3仪器表3-2实验用的主要仪器Table3-2Theapparatususedintheexperiment仪器及设备名称生产厂家HH-S4数显恒温水浴锅国华电器有限公司Sigma3k15超纯水机台湾艾科科技有限公司721可见分光光度计上海菁华科技仪器制造商TG-16W台式高速离心机长沙市湘智离心机仪器公司DYY-Ⅲ电泳仪北京六一仪器厂GH型隔水培养箱天津市泰斯特仪器有限公司JY-CX2C序列分析电泳槽北京君意东方电泳设备有限公司JJ500电子天平常热市双杰测试仪器厂超净工作台苏净集团安泰公司PCR仪BiomedizinischeAnalytikGmbhNichipetEx微量移液枪日本NichipetEx公司3.2方法3.2.1分离群体构建以“舞美×M9”的13年生杂种实生树为试材，依据苹果枝干轮纹病田间自然发病抗病性分离情况构建分离群体，选取高抗、高感病植株各12株，组成抗池、感池。3.2.2BSA法建池根据BSA法的原理，随机采10株抗病单株和10株感病单株的DNA，等量混合组成抗病池和感病池。3.2.3DNA的提取与浓度测定[125][126]苹果属品种幼嫩叶采用CTAB法提取DNA，参考刘卫国等和余英--44 的方法并加以优化。提取到的DNA用ND-1000紫外分光光度计测定其浓度，稀释DNA至200ng/μl，保存于-20℃备用。3.2.3.1DNA提取方法A．用镊子夹取新鲜嫩叶约0.5g，迅速放入1mLEp管中，立即置于液氮罐中。B．将装有叶片的EP管从液氮罐中取出，放入预冷的研钵中。在研钵中不断倒入液氮将叶片磨成细粉。C．迅速将研磨好的细粉装入1mLEp管中，加入500uL，65℃预热的CTAB提取缓冲液，混匀。D．将Ep管置于65℃水浴中，保温30min，每10min颠倒混匀一次。E．待冷至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒混匀，至溶液呈乳浊状，12000rpm离心10min，至溶液分层。F．小心地将上层液转移至干净的Ep管中，约400uL。G．加入等体积的氯仿/异丙醇，颠倒混匀，12000rpm离心10min，至溶液分层。H．再次小心地将上层液转移至干净的Ep管中，约350uLI．加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀至有白色絮状沉淀出现。J．12000rpm离心20min沉淀DNA．去上清。用75%乙醇，洗涤沉淀两次。K．沉淀干燥后溶于加有3uLRNaseA的50uLTE中，4℃过夜或直接置于-20℃。L．通过紫外分光光度计将DNA浓度调至1ug/L，备用。3.2.3.2DNA浓度检测基因组DNA浓度的检测使用紫外分光光度法，方法为：取DNA原液3mL稀释至300mL用DU800Spectrophotometer型紫外分光光度计测定260nm和280nm的吸光值，根据OD260与OD280的比值判断DNA大致纯度。3.2.4酶切连接[127]AFLP分析参照刘淑君等的方法，选用六碱基内切酶EcoRI和四碱基内切酶MseI对基因组DNA进行切割，用T4DNA连接酶连接,酶切和连接一步完成，PCR仪上37℃4h。45 反应体系：DNA1μL10*NEBuffer22.5μLATP(10mM)0.5μLEA(5pMol/μL)0.5μLMA(50pMol/μL)0.5μLBSA(10mg/mL)0.125μLEcoRI(20U/μL)0.125μLMseI(10U/μL)0.25μLT4DNA连接酶（5U/μL）0.5μLH2O19.5μLTotal25μL3.2.5预扩增酶切连接完成的DNA样品稀释10倍后．用MseI-C和EcoRI-A引物对其进行预扩增；反应体系：DNA0.5μL2×TaqPCRMasterMix6μLPrimer1EcoRIA(10µM)1μLPrimer2MseIC(10µM)1μLH2O12.5μLTotal20μL扩增条件:①94℃预变性5min②94℃变性30s③56℃退火30s④72℃延伸1min⑤重复步骤②③④35次⑥72℃后延伸5min预扩增产物完成后保存于-20℃。3.2.6选择性扩增将预扩增产物稀释10倍后，用EcoRI-primer和MseI-primer进行选择性扩--46 增。反应体系：DNA0.5μL2×TaqPCRMasterMix6μLPrimerE(10µM)1μLPrimerM(10µM)1μLH2O12.5μLTotal20μL选择性扩增程序：①94℃预变性5min②94℃变性30s③65℃(每次循环降低0.7℃)30s④72℃延伸1min⑤重复步骤②③④12个循环⑥94℃变性30s⑦56℃退火30s⑧72℃延伸lmin⑨重复步骤⑥⑦⑧24个循环⑩72℃延伸1min完成后-20℃保存。3.2.7变性聚丙烯酰胺凝胶电泳3.2.7.1电泳3.2.7.1.1凝胶板的制作(1)涂板取一套平板，70%乙醇淋洗2次。用镜头纸檫遍。干燥5min。戴手套操作，取擦镜纸或脱脂棉球，蘸取适量的亲和硅烷工作液（3mL无水酒精，加入10uL冰醋酸、10uL亲和硅烷混匀）先横在竖均匀地涂在玻板上。若有残留的亲和硅烷污染另一板，可导致剥胶时撕裂。温室放置20min以上。以类似的方法将剥离硅烷工作液（3mL氯仿，加入300uL剥离硅烷混匀）均匀涂在短板上，室温放置20min以上；在涂板过程中，应避免两种溶液相互污染。(2)灌胶将长板和短板装配好，底部无须密封。上部可略垫高，置于水平（建议用水泡调节水平，水平时气泡位于正中央）的桌面上，下面铺有塑料布、胶盒底47 部垫一块报纸，防止漏胶。预插入梳子检查梳子是否合适，以及梳子插入的最佳位置，可以在梳子和胶盒长板上划一条线为准。6％聚丙烯酰胺凝胶成份：6％聚丙烯酰胺50mL10％APS500μLTEMED50μLTotal55.5mL按照成分表格，配制凝胶，缓缓移动轻轻混匀，避免产生起泡，使鸭嘴瓶于玻板呈60度左右夹角，离开短板一定距离，沿上口左右移动，将胶液迅速挤压入两板之间，液流尽量保持连续，防止出现气泡。(3)插入梳子灌完后，将板调至水平。迅速将梳子平齐端插入胶液深约0.5cm处（插入前用一些胶液覆盖梳子），插入时小心勿出现气泡。(4)清洗及时处理洗涤鸭嘴瓶，防止胶凝于瓶内，不易清洗。停30min，胶即可凝固老化1h以上（建议2h）。3.2.7.1.2高压电泳(1)拔梳子将梳子小心拔出，梳子下方长板上附着的胶片必须用硬塑料片清洗干净，连同插梳子处用洗瓶冲洗干净，避免点样时样品很难进入，即使进入电泳带型液不整齐。(2)安装凝胶板将板装到电泳槽中，加入足量电泳缓冲液，用移液器或吸管将梳子处的气泡赶出（如有丙烯酰胺会使带弯曲），将梳齿插入胶顶端，使齿恰好与胶面相贴或稍微进入胶面。插入太深，易形成弯面，胶裂侧漏。每隔一加样孔加少许加样缓冲液，观察加样孔是否侧漏。(3)预电泳上槽连负极，下槽连正极，恒功率（若恒电流，胶温度高会使带发散）40-50W。除去胶中杂质，提高胶的温度，防止DNA单链内或单链间形成二级结构。一般预电泳的时间为20-60min。胶板温度上升为40℃左右停止。(4)样品变性、点样用吸管吹打加样孔，以清洗加样孔內析出的尿素(尿素析出会使带发虚、模糊。冲洗不彻底，胶加样处有若干毛毛，显色后呈纤细的纵向条纹)，并将点样孔中的气泡逐个赶出。--48 电泳前DNA样品按每20μL体系加5μLLoadingBuffer后变性（95℃5mim），尽可能迅速加样，变性不充分会使加样槽有很深的带。(5)电压1700V，恒功率50W一般电泳1.5h。直至二甲苯青染料达胶长2/3处。电泳结束，切断电源，进行取胶操作。将衬条抽出，拔出梳子，小心分开两块平板，胶会紧贴于涂有BindSaline的玻板上。将玻板连同胶没入固定/终止液。3.2.7.2银染方法染色3.2.7.2.1固定将玻璃板从电泳槽取下，拔出梳子，并轻轻将长板取下，放入2L新配制的10%的醋酸溶液中（固定/终止液）（塑料盒中），轻轻摇动20-30min，至前沿染料全部脱色进行下一步，亦可浸泡过夜（不须振荡）。固定液扔盛放原塑料盒中，用于下面终止.取出长板，放置在另一个塑料盒中，用蒸馏水中漂洗2次，每次3min。最后一次课竖起胶板，倾于水中10-20s。3.2.7.2.2染色在2L蒸馏水中加入2g硝酸银，3mL甲醛，染色30min。注意硝酸银应该充溶解；如多次使用，则需避光保存。3.2.7.2.3显影染色完毕后的凝胶浸入盛有DDW的盒迅速漂洗（轻轻一蘸），不超过10s。竖起倾干水流。此步时间极其重要，从凝胶浸入水中到转入水中到转入显影液的时间总共不可超过5-10s，在水中时间太长会导致DNA条带着色太浅，若浸水时间太长，可将凝胶在染色液中重复浸泡。将胶板迅速转移到2L预冷（用以避免产生暗色背景，最好-20℃预冷，用前呈冰水混合物状，但用时不可有冰块以免划伤胶面）的碳酸钠溶液中，在摇床上显影至棕色条带清晰为止（一般5-6min后出现）。显影过度则背景呈褐色，对比度降低，而不是正常的铅笔灰色和锐带。当条带清晰时，将玻璃板取出放入醋酸溶液中，轻摇，终止2min左右（气泡消失）。中和时间太长，会导致褪色。3.2.7.2.4漂洗将板放入蒸馏水中漂洗10min，需要照相或保存的板漂洗低价不能太短，否则胶面容易变黄。染色废液处理：每2L废液中可入0.1NaCl，使AgNO3沉淀，通过自然沉淀法或过滤回收。上清直接丢弃于下水道即可。3.2.7.2.5照相及数据分析将胶板置室温干燥，拍照，读取条带。抗病植株中含有此条带标为“1”，49 不含有此条带标为“0”，感病植株中含有此条带标为“2”。最后统计个数：如果“0”个数为A，“2”的个数为B，那么A+B的个数为交换的总和，交换率r=(A+B)/74。（3.1）然后采用Kosambi函数：（3.2）来计算遗传距离。3.3结果3.3.1引物筛选用64对引物在抗病和感病基因池之间进行多态性筛选如图（3-1）。有6对引物能产生多态性（表3-3）。在这些多态性条带中，有的来白抗病池,也有的来白感病池。采用上述引物组合进行选择性扩增，快速银染法进行染色，每个泳道中可得到20-100条清晰的条带,说明以上酶切连接、预扩和选择性扩增组合对于苹果基因组是比较合适的。通过结合BSA分析的方法首先筛选出与苹果抗轮纹病基因相关的AFLP引物，再在分离群体上进行验证，其中交换率最小的是E4/M4交换率为10.7%图（3-2）。引物E3/M5扩增出两条特异性条带，其中一条与抗病标记连锁，另一条与感病标记连锁。表3-36个引物组合的交换率Table3-3Exchangeof6primerrate引物组合交换率E2/M6R2-6:25.5%E3/M5R3-5:24.3%S3-5:22.9%E3/M8R3-8:26.9%E4/M4R4-4:10.7%E7/M3R7-3:21.3%E8/M1R8-1:18.5%--50 SRSRSR图3-1部分AFLP引物组合的BSA分析结果.E4/M4、E3/M5、E3/M8的抗病池和感病池；R：抗病池；S：感病池箭头所指为特异性片段。M:pBR322DNA/MspIFig.3-1ParitialresultsofAFLP一BSAanalysisingusingdifferentAFLPPrimercombinationResistantbulkandSusceptiblebulkofE4/M4.R：Resistantbulk；S：Susceptiblebulk；Thespecificfragmentwasindicatedbythearrow3.3.2与轮纹病抗性相关AFLP分子标记的初步筛选应用引物E4/M4对整个群体74株植株进行扩增，在抗病群体中筛选出一条特异性条带，约在500bp左右，抗病植株中全部有抗病标记，8株感病植株中出现抗病标记特征，交换率为10.7％，转化成遗传距离为10.8cm。如图3-2为E4/M4对12株抗病群体与12株部分感病群体进行扩增。51 622bp527bp←R4-4500bp图3-2AFLP引物E4/M4在两亲本、近等基因池及部分F1单株中的电泳图谱X：舞美(抗病亲本)；Y：M9（感病亲本）；R：抗病池；S：感病池；1~12：感病植株；13~24：抗病植株；箭头所指为抗病特异性片段R4-4，分子量为500bp左右。M:pBR322DNA/MspIFig.3-2ElectrophoresispatternsamplifiedbyAFLPprimerE4/M4inparents，twoDNAbulksandpartialF1individualsX：“wumei”（）Resistantparent;Y:“M9”（）Susceptibleparent；R：Resistantbulk；S：Susceptiblebulk；1–12：Resistantplants；13–24：Susceptibleplants；Thespecificfragmentwasindicatedbythearrow.Resistantlinkedmarker:R4-4(500bp)应用引物E3/M5对整个群体进行扩增，在抗病群体中筛选出两条特异性条带，抗病标记R3-5，约在265bp左右，在12株抗病植株中有三株没表现出抗病标记，感病植株中15株中出现抗病标记特征，交换率为24.3％，转化成遗传距离为26.5cm。另一条为感病标记，抗病植株中全部没有此标记，感病植株中有17中不含有此标记，交换率为22.9％，转化成遗传距离为24.7cm。如图3-3为E3/M5对12株抗病群体与12株部分感病群体进行扩增。--52 622bp527bp309bpR3-5265bpS3-5260bp242bp图3-2AFLP引物E3/M5在两亲本、近等基因池及部分F1单株中的电泳图谱X：舞美(抗病亲本)；Y：M9（感病亲本）；R：抗病池；S：感病池；1-12：感病植株；13-24：抗病植株；箭头所指分别为抗病、感病特异性片段，抗病连锁标记R3-5，分子量约为265bp左右，感病连锁标记S3-5，分子量约为265bp左右。M:pBR322DNA/MspIFig.3-2ElectrophoresispatternsamplifiedbyAFLPprimerE3/M5inparents，twoDNAbulksandpartialF1individualsX：“wumei”（）Resistantparent；Y：“M9”（）Susceptibleparent；R：Resistantbulk：S：Susceptiblebulk；1–12：Resistantplants；13–24：Susceptibleplants；Thespecificfragmentwasindicatedbythearrow，Resistantlinkedmarker:R3-5(265bp);Susceptiblelinkedmarker:S3-5(260bp)应用引物E3/M8对整个群体进行扩增，在抗病群体中筛选出一条特异性条带，抗病标记R3-8，约在245bp左右，在12株抗病植株中有三株没表现出抗病标记，感病植株中17株中出现抗病标记特征，交换率为26.9％，转化成遗传距离为30.06cm。如图3-4为E3/M8对12株抗病群体与12株部分感病群体进行扩增。53 622bp309bp←R3-8245bp242bp图3-3AFLP引物E3/M8在两亲本、近等基因池及部分F1单株中的电泳图谱X：舞美(抗病亲本)；Y：M9（感病亲本）；R：抗病池；S：感病池；1-12：感病植株；13-24：抗病植株；箭头所指为特异性片段,为抗病特异性片段R3-8，分子量为245bp左右。M:pBR322DNA/MspIFig.3-3ElectrophoresispatternsamplifiedbyAFLPprimerE3/M8inparents,twoDNAbulksandpartialF1individualsX;“wumei”（Resistantparent）;Y:“M9”（Susceptibleparent）;R:Resistantbulk;S:Susceptiblebulk;1–12:Resistantplants;13–24:Susceptibleplants;Thespecificfragmentwasindicatedbythearrow.Resistantlinkedmarker:R3-8(245bp)本研究在进行标记筛选的过程中，有多个相关标记被筛选出来，但是缺乏一定的稳定性。同时寻找连锁更加紧密的标记。如图3-2中引物E4/M4中选取的12株抗病群体中全部都有抗病连锁标记R4-4，而12株感病群体中没有一株有此标记，此标记在此小群体中较好，但在整个群体中也具有一定的交换率，交换率为10.7％，遗传距离为10.8cm，所以要验证这个标记与真正标记的距离还需进一步扩大群体，所以只能初步定位的E4/M4标记则是稳定性较好的一个标记；下一步将扩大群体进行遗传距离的精确定位。也有同一组引物筛选出抗感病两个标记，如E3/M5，但交换率较高。--54 3.4讨论1DNA提取DNA提取中如果在F步骤后溶液颜色过深或明显混浊应重复E步骤，进行二次抽提；如果所用材料过老，抽提液应换成酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)。如发现DNA沉淀呈黄揭色，应加入PVP。PVP对抑制多酚氧化酶和细胞色素氧化酶的活性有很好的效果。在CTAB提取液中加入巯基乙醇，是为了防止试验材料中多酚类物质的氧化影响实验。2电泳测序胶平板应格外清洁，否则残留的去污剂会导致银染时产生褐色背景，还会在灌胶时产生气泡。梳子齿和平板易碎，清洗时应小心操作。洗板时长板和短板应分开，避免相互污染。倒胶时，气泡的存在导致样品不能按照预定泳道前进，绕开气泡出现偏斜。脱色液、染色液和显影液均可重复使用，以节省药品。染色时为了避免银被氧化使胶板颜色过深，影响条带读取，从染色液银溶液中取出时要快速漂洗，然后放到显影液中；但也注意漂洗时间不能过久，避免附在DNA上的银离子被漂洗掉，导致颜色过浅。3分离群体及鉴定现在研究中主要的鉴定方法有田间自然鉴定、田间人工接种鉴定、室内人工接种鉴定等，本实验采用的田间自然诱发鉴定。分离群体的大小严重影响着分子标记的准确性，群体越多，分子标记的精确性就越高，但是对于果树的分离群体的扩增较为困难，童期长，果树基因杂合度较高，纯度不大。所以为了更准确更科学地获得抗病标记，就要在长期育种中扩大群体，筛选纯度较高的植株。4AFLP优点AFLP标记对于苹果这种基因组较为复杂的植株来说是比较适用的，因为相对于其他分子标记技术，AFLP的信息量较为丰富，多位点多，可以检出的多态性较高，而且重复性强稳定性也较好。通过与BSA方法结合分析，对于目的基因连锁标记的快速查找提供了可靠的方法。55 结论本文系统的研究了不同轮纹病抗病程度的植株在自然条件下苹果叶中酚类及酶类的差异、接种后苹果枝条酚类及酶类的变化，揭示了不同时期抗性物质的作用与苹果枝干轮纹病菌互作机理，通过研究病原菌侵入后枝条抗性物质的生化变化,揭示抗病物质的抗病机理；在离体条件下，研究了多酚类物质对轮纹病菌的抑制作用；初步筛选了轮纹病抗病标记，研究的主要结果如下：1自然条件下不同抗性植株抗性物质在不同时期的差异表明不同抗性的植株总酚含量及各种酶活性的高峰期有所不同，总酚含量及酶活性中感植株与感病植株二者在4、5月份处于高峰期，而抗病植株总酚含量及酶活性在7月份达到最高峰，而5月下旬到7月下旬都是轮纹病侵染的高峰期，有研究表明7月份前侵染发病率最高。说明感病的植株在感病初期有较强的抵抗能力，但随后随着病原菌继续的侵袭，而抗性物质含量较低，所以导致发病率增高。这可能由于在4、5月份期间病原菌侵染时抗病植株的外在的结构因子防御能力较强，没有能很严重的刺激植株，从而也没促进足够的抗性物质的增加。说明不同时期，不同气候下，不同抗性植株受侵染的程度有着一定的差异。2接种后不同植株总酚含量与各种酶活性都在不同的阶段有不同的差异。接种后的植株总酚含量与酶活性都有变化，接种植株与对照植株之间差异最显著的时期也有差异，抗病植株接种后显著或极显著变化的时期，与中感及感病植株有所不同，而且与对照组有明显差异的时间长于中感植株和感病植株，可能由于抗病植株在接种后有一定的抗性物质积累并保持的阶段。从而也说明总酚及酶类在抗病植株中起着一定的作用。从分析中可以看出总酚含量与抗感病程度呈显著的相关性，抗病植株与中感植株呈显著性差异（P<0.05），抗病植株与中感植株呈极显著性差异（P<0.01），说明酚类在植株的整体的抗病性中起着至关重要的作用。然而酶类的活性整体与抗感病程度相关性却不强，而在某些阶段时期差异性显著，PAL活性接种后第7天至21天阶段中抗病植株与中感植株呈显著性差异（P<0.05），与感病植株呈极显著性差异（P<0.01）；PPO活性在第14至21天阶段，抗病植株与中感与感病植株均有显著性差异（P<0.05）；POD活性在第21至28天时抗病植株与中感与感病植株均有显著性差异（P<0.05），说明植株中的不同的酶只在不同的时期与轮纹病菌的侵染有着一定的相关性，在一定的阶段起到关键的作用。这些都表明抗病植株的自身结构或防御体系与感病植株存在一定的差异，说明接种处理后对不同的抗性--56 物质在不同的时期都有受到不同程度的影响，可以根据这些生理指标在不同的时期来间接的鉴定品种或某些植株的抗病性。抗性物质及酶活性高的植株可以作为抗性砧木来提高感病植株中总酚及防御酶的活性来提高抗病性，3离体实验显示，多酚类对苹果轮纹病菌有一定的抑制作用，100mg/g为最好抑制浓度，说明酚类物质在苹果果树在轮纹病菌侵染时有一定的抵抗能力，从而可以把酚类物质作为一种植物源农药或者诱导酚类物质的增加来抵抗轮纹病。苹果叶、枝条中含有丰富的酚类物质，可以作为酚类提取的资源，为苹果酚类植物源农药的开发提供理论依据。4AFLP标记能够提供的信息量更大，多态检出率更高，不论所研究的基因组有多么复杂，该分子标记技术都可展现出足够多位点的多态性,而且稳定性好。与传统的分子标记相比,标记更加丰富性，与BSA分析相结合可以很快得到与目标基因连锁的AFLP标记，因此是寻找与目标基因紧密连锁的分子标记的有效手段，随着AFLP技术的不断发展和完善，大大促进了果树学分平上的理论研究。在F1代群体中有大量介于抗感之间的中间类型，所以选择性基因型分析结果更加可靠研究在进行标记筛选的过程中。本实验通过64对AFLP引物进行抗感池筛选苹果轮纹病抗病标记，有多个相关标记被筛选出来，但是缺乏一定的稳定性。而定位的E4/M4标记则是稳定性较好的一个标记，交换率为10.7％，遗传距离为10.8cm，下一步将扩大群体进行遗传距离的精确定位，同时寻找连锁更加紧密的标记。57 问题与展望对苹果轮纹病病菌的侵染过程及防御体系抗性机制都有了一定的研究，但对病菌侵入寄主体内至发病期间的活动情况尚不清楚，需进一步研究；不同时期不同抗性叶片中总酚含量及防御酶活性的测定结果表明抗病植株在4、5月份侵染初期，不容易被侵染，说明自身防御能力更强，但具体初期抵抗病原菌的结构因子或生化因子是什么还有待进一步研究。对于田间接种处理有一定的弊端，受环境影响较大，下一步可以进行室内盆栽接种处理，进行测定。本文研究了酚类物质对苹果轮纹病有一定的抑制作用，但酚类物质中起到抗病作用的具体成分，还需进一步确认；另外酶类物质在体外是否对轮纹病菌有一定的抑制作用也是下一步需要探讨的。除了酚类物质、糖酸类物质、酶类及木质素等外，还有很多植物代谢物质及生化物质具有抗菌性，如植保素、活性氧等，高温处理或紫外线照射能引起植保素的积累，在植物受侵染的细胞周围，植保素积累后期化学屏障作用，Kubo[128]等就通过高温处理诱导增强了黄瓜的抗病能力。活性氧被认为是一种过敏反[129]应，植物的过敏反应是诱导抗病性产生的主要原因，但至于活性氧的抗病机理还没有定论。很多研究者应用诱导剂促使抗性物质增长，从而达到提高植株[130][131]抗性的效果。贾广成等应用紫外线、电磁波、水杨酸等诱导因素探讨了苹果轮纹病菌的生长规律及抗药性，从而确定了诱导因子对苹果轮纹病菌的诱导作用，实验显示连续使用戊唑醇可导致苹果轮纹病菌的抗药性加强，从而导致药剂使用量的加大，对环境造成污染，使用水杨酸诱导剂可以改变轮纹病菌对戊唑醇的敏感性。需研究病原菌如何突破寄主本身的防御体系发病，有针对[132]性地开发低毒、环保、安全的预防性药剂替代杀菌剂。对于分子标记的研究，分离群体的大小很重要，群体越大，精度就越高；抗感池中植株数量越多，假阳性越低，筛选出的引物准确率越高，从而该分子标记就越可靠，但不同于蔬菜，果树的分离群体数量上有一定的弊端，而且果树基因组高度杂合，很难获得纯系，也为果树抗病标记的筛选增加了难度，所以尽量增加果树植株的实验数量是至关重要的。--58 参考文献[1]SharmaJN,PankAJSharma．StudiedonMarssoninacoronaria(Ell.andJ.J.Davis)causingMarssinablotchofappleinHimachPradesh[J].Phytomorphology,2006,56:61-64.[2]赵忠仁,苹果轮纹烂果病的发生规律及防治关键技术[J].落叶果树,2002,(4):51-52.[3]张玉经,王昆,王忆,等.苹果种质资源果实轮纹病抗性的评价[J].园艺学艺学报,2010,37(4):539-546.[4]黄春燕,刘开启.苹果轮纹病及相关病害病原菌的RAPD分析[J].植物病理学报,2001,31(2):164-169.[5]范巧红,周向军,吴洪忠,等.果树枝干病害及防治方法综述[J].宁夏农林科技,2007,(2):113.[6]康玲,郝红梅,杨振英,等.苹果轮纹病研究进展[J].中国农学通报,2009,25(09):188-191.[7]王培松,刘保友,栾炳辉,等.苹果轮纹病菌孢子田间释放规律[J].湖北农业科学,2011,50(19):3975-3977.[8]阎振立,张全军,张顺妮等.苹果品种对轮纹病抗性的鉴定[J].果树学报,2005.226:654-657[9]姜中武,李元军,于青,等.苹果抗轮纹病新砧木.烟砧一号的选育[J].果树学报,2011,28(2)：363-364.[10]沈永波,李广旭,高艳敏,等.苹果果实内含物与轮纹病抗性的关系[J].北方果树.2003,(15):9-10.[11]张丽丽,师校欣,杜国强植物抗病机制及果树抗病育种研究进展2006,21(增刊):175-179[12]赵玲玲,宋来庆,李元军,等抗轮纹病苹果砧木‘烟砧一号’抗病机理初探园艺学报2010,37（2）：297–302[13]周增强,冯桂馨,孟秀灵,等.戊唑醇及其复配剂防治苹果轮纹病的田间药效试验[J].中国农学通报,2003,19(1):114-116.[14]苏平,周增强,朱建兰,等.河南省苹果轮纹病菌对戊唑醇的敏感性检测[J].中国农学通报,2010,26(13):312-318.[15]赵白鸽,孔建,王文夕,等.枯草芽孢杆菌B-903对苹果轮纹病的抑制作用及其对病害的控制效果[J].植物病理学报,1997,27(3):2l3-2l4.[16]康斌斌,李林,张存瑞.植物源农药防治苹果树轮纹病的研究与应用[J].杭州化工,2012,43(2):24-26.[17]孟晶岩,高忠东,王贤苹,等.0.5％苦参碱水剂对苹果树腐烂病菌的室内毒力测定和田间药效试验[J].山西农业科学,2009,37(2):47-49.[18]AppelHM.Phenolicsinecologicalinteractions:theimportanceofoxidation[J].ChemicalEcology,1993,19:1521-1552.59 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附录1总酚测定（1）Folin－酚试剂：称取钨酸钠25g和磷钼酸5g，放入回流瓶中，加12.5mL磷酸和188mL蒸馏水，一起回流煮沸2h，冷却后用蒸馏水定容至1000mL。（2）10％Na2CO3：称取10gNa2CO3溶于100mL蒸馏水中。2酶活性提取及测定（1）磷酸缓冲液（0.2M）(25℃)0.2M磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO4·2H2O（分子量178.05）35.61g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL。0.2M磷酸二氢钠：称取NaH2PO4·2H2O（分子量156.03）31.21g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL。XmL0.2M磷酸氢二钠+YmL0.2M磷酸二氢钠pHXmLYmLpHXmLYmL5.88.092.07.061.039.06.012.387.77.272.028.06.218.581.57.481.019.06.426.573.57.687.013.06.637.562.57.891.58.56.849.051.08.094.75.3（2）硼酸—硼砂缓冲液（0.2M硼酸根）0.05M硼砂溶液：称取Na2B4O7·10H2O（分子量381.43）19.07g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL。硼砂易失去结晶水，必须在带塞的瓶中保存。0.2M硼酸溶液：称取H3BO3（分子量61.84）12.37g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL。XmL0.05M硼砂+YmL0.2M硼酸67 pHXmLYmLpHmLXmLYmL7.41.09.08.23.56.57.61.58.58.44.55.57.82.08.08.76.04.08.03.07.09.08.02.0（3）40mmol/LH2O2吸取0.318mL30％H2O2（比重1.438g/mL），加水定容至100mL。（4）20mmol·L-1愈创木酚：吸取0.2mL愈创木酚，加水定容至100mL，贮于棕色瓶中。3DNA提取(1)0.5MEDTA称取186.1gNa2EDTA溶于800mL水中，用NaOH调pH为8.0，用蒸馏水定容至lL，分装，高压灭菌后备用。(2)l×TE(pH8.0)l0mMTris(pH8.0)，lmMEDTA，定容调pH至8.0，高压灭菌后备用。(3)DNA提取液100mmol/LTris-HCl，pH8.00.5MEDTA；1.4mol/LNaCI；2％CTAB；1％PVP-40、10mmol/LNa2S2和2％β-巯基乙醇(用前加入)，用纯水配制，调pH至8.0。(4)RNaseA的制备将10uMTris0.605g，15uMNaCl0.438g，溶于50mL双蒸水中，用盐酸调pH值至7.5，灭菌30min，取10mg的RNaseA溶于lmL上述Tris-HCI-NaCI缓冲液中，配成10mg/mL的终浓度，用沸水煮15min，缓慢冷却到室温，分装备用。20℃保存。4电泳(1)10×TBE配制称取Trisl0.8g、硼酸55g、1MEDTA(pH8.0)20mL，加ddH20定容到1000mL。(2)LoadingBuffer的配制称取溴酚蓝0.125g、二甲苯青0.125g、甲酰胺49mL和0.5M的EDTA(pH8.0)1mL，混匀后，20℃保存。(3)10％过硫酸铵(APS)的配制--68 将1gAPS与9mLddH20混匀，-20℃保存。’(4)6％聚丙烯酰胺变性凝胶母液配置称取60g聚丙烯酰胺(Acr)、3.1575g甲叉双丙烯酰胺(Bis)、420.42g尿素和100mL10×TBE，充分溶解后，ddH20定容至1000mL，两层滤纸过滤，4"C保存待用。69 致谢本论文是在导师石琰璟老师无微不至的关怀和精心指导下完成的。从论文的选题到课题的具体实施，石老师对我无微不至的关怀与帮助给予了很多帮助和指导。老师渊博的科学知识，睿智的科学思路，知难而进的科研追求，平易近人的高尚风格都使我受益匪浅，并将时刻激励我不断进步。在此谨向导师致以最诚挚的感谢和最崇高的敬意！本研究主要是在青岛市农业科学研究院生物所实验室完成的。在课题研究实验过程中，得到了沙广利老师、黄粤老师、马荣群老师对我实验的指导及对我极大的支持与帮助。在此也向各位老师致以最诚挚的感谢和最崇高的敬意！感谢我的同事宫兆丽、师兄师姐、师弟和师妹们！他们在我的实验、学习、和生活上提供了极大的关心和帮助，感谢他们在我研究生三年给我留下了极其难忘而美好的回忆。同时在实验进程中，对我的实验提供了许多宝贵建议，在此致以衷心的感谢！感谢化工学院的领导和老师给我提供了如此宝贵的深造机会！感谢我的家人和朋友，感谢他们对我的支持与鼓励、关爱与奉献。特别是我的父母，他们用辛勤的汗水和永不枯竭的爱心培养了我，是他们无私的奉献使我得以顺利完成论文，我由衷地对他们表感谢！再次向多年来所有关心、支持、帮助过我的人表示最衷心的感谢和最诚挚的敬意！！在本文结束之际，向所有为我的论文提出宝贵意见的评阅专家们表示最诚挚的感谢！--70 攻读学位期间发表的学术论文目录[1]马荣群,黄粤,沙广利,石琰璟,李佳,宫象晖,李梅.无融合生殖苹果砧木F1代实生苗的流式细胞术倍性分析及SSR鉴定[J].果树学报，2012[2]马荣群,李佳,沙广利,黄粤,李梅,王芝云.SSR鉴定无融合生殖苹果砧木杂种实生苗[J].中国果树，2013[3]李佳,石琰璟.苹果轮纹病抗性机制研究进展[J].落叶果树,2013[4]李佳,石琰璟,沙广利,黄粤,马荣群,41份苹果属植物亲缘关系的AFLP分析[J].果树学报，2013[5]李佳,石琰璟,沙广利,黄粤,马荣群基于AFLP和SSR分子标记苹果属植物亲缘关系研究[J].中国农学通报，2013[6]李佳,石琰璟.苹果多酚的研究现状[J].落叶果树,201471