牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究

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批分类号:密级:公开噶纟乓午:2013103036单位代码:10759石河子大学珏士营伍呛父牛病毒性腹泻病毒(B`ov)E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究学位申请人黄美玲陈创大教授导教师盛金良副教授申请学位类别理学硕士专业名‘称生物化学与分子生物学研究领域功能基因组与分子免疫学所在学院生命科学学院··中国新疆石河子2016年6月 批分类号：密级：公开学号：2013103036单位代码：10759石河子大学硕士学位论文牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究学位申请人黄美玲陈创夫教授指导教师盛金良副教授申请学位类别理学硕士专业名称生物化学与分子生物学研究领域功能基因组与分子免疫学所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2016年6月 Selectionofsingle-domainantibodiesagainstBovineviraldiarrheavirusE2(BVDV-E2)fromacamelidimmenedlibraryADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofNatureScienceByHuangMeiling(BiochemistryandMolecularBiology)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuShengJinliangJune,2016 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日 课题来源课题名称:国际合作项目（牛病毒性腹泻/粘膜病防治新技术）课题编号:2013DFR309 中文摘要牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD)，主要引起偶蹄类家畜动物感染及并发症，对我国畜牧养殖业造成巨大经济损失。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)在全世界范围内广泛传播，其主要的临床症状表现为腹泻，急、慢性黏膜疾病以及持续性感染和免疫耐受等，主要引发母畜流产、死胎以及畸形胎等。新疆是我国主要的畜牧业生产基地，也是该病流行的主要地区之一。然而目前对于该疾病的防制，尚无有效的治疗方法，因此，该病给畜牧养殖业、食品生产业带来了巨大的安全隐患以及经济损失。美国科学家发现骆驼体内存在天然缺失轻链的重链抗体，为抗体的制备以及研发开启了新篇章，克隆其可变区得到的抗体称为单域抗体，因其体积较小又称为纳米抗体(nanobody)。纳米抗体具有耐高温、易在原核系统中表达、亲和力好、组织穿透性强等诸多优点。[目的]利用噬菌体展示技术从抗BVDV纳米抗体基因文库中进行筛选，可以得到高效高特异性的纳米抗体，为研发防治BVDV的生物制剂奠定基础。[方法]（1）对标准株牛病毒性腹泻病毒BVDV-E2基因全序列进行分析，发现其中包含大量的大肠杆菌稀有密码子以及疏水结构区，将其进行同义突变改造。同时，在此基础上对BVDV-E2基因编码蛋白的抗原表位进行预测分析；（2）利用噬菌体展示技术，将构建的BVDV纳米抗体文库进行辅助噬菌体（M13K07）的重新拯救并大量扩增，经过拯救及扩增13后的文库大约为1.34×10cfu/ml。然后进行三轮的特异性亲和筛选，对筛选得到的单克隆进行序列测定及分析；（3）对分析成功的序列进行设计引物、并利用PCR技术对基因片段进行大量扩增，构建pEGX-4T--VHH原核表达载体，通过SDS-PAGE实验对目的蛋白进行检测并通过Ni柱将表达的蛋白进行纯化，然后进行蛋白的透析、浓缩；（4）利用双夹心ELISA对纳米抗体结合性验证，通过病毒侵染MDBK细胞进行功能的初步验证。[结果]（1）发现在BVDV-E2区中有一段较密集长度为630bp的抗原表位区域，选取该区域片段在大肠杆菌中进行表达、纯化及功能验证，显示获得预期的抗原蛋白；（2）BVDV-E2纳米抗体的筛选得到阳性单克隆。将阳性单克隆进行序列测定分析及比对，确定序列为驼科重链抗体片段；（3）BVDV-E2蛋白纳米抗体在原核系统中成功表达获得大小为49.5KD的蛋白并纯化；（4）纳米抗体中和病毒功能的验证结果显示纳米抗体蛋白可以中和病毒从而保护MDBK细胞不被破坏。[结论]本实验利用原核表达的BVDV-E2抗原表位蛋白成功的从已构建好的抗体文库中筛选得到特异性针对BVDV-E2的纳米抗体，该纳米抗体能够中和BVDV，在一定程度上保护MDBK细胞避免发生病变，为研究BVDV的治疗以及防治奠定了非常重要基础。关键词：BVDV–E2；纳米抗体；文库筛选；MDBKI AbstractBovinevirusdiarrheamucosaldisease(BVD-MD),mainlycausedbyclovenhoofedanimals,complicationsofinfection,causehugeeconomiclossestothelivestockbreedingindustryinChina.Bovineviraldiarrheavirus(BVDV)spreadwidelyintheworld.Themainclinicalsymptomsshoweddiarrhea,acuteandchronicmucosaldiseaseandpersistentinfectionandimmunetolerance,mainlycausedbythedamofabortion,stillbirthandfetalmalformation.XinjiangisthemainproductionbaseofanimalhusbandryinChina,anditisalsooneofthemainareasofthedisease.However,thereisnoeffectivetreatmentforthedisease.Therefore,thediseasehasbroughtgreatsecurityrisksandeconomiclossestothelivestockbreedingindustryandthefoodindustry.ScientistsintheUnitedStatesfoundsingledomainantibodyincamelopenedanewchapterintheclonedantibody;itislackoflightchainoftheantibody,becauseofitssmallvolume,alsoknownasnanobody.Nanobodyhasmanyadvantages,suchashightemperatureresistance,easytobeexpressedintheprokaryoticsystem,goodaffinity,andstrongtissuepenetrationandsoon.Objective:TheuseofphagedisplaytechnologyfromtheantiBVDVnanobodygenelibraryscreening.Gethighefficiencyandhighspecificityofnanobodies,LaythefoundationforresearchanddevelopmentofbiologicalagentstopreventandcontrolBVDV.Methods:(1)ThewholesequenceofBVDV-E2geneofbovineviraldiarrheaviruswasanalyzed,whichwasfoundtocontainalargenumberofrarecordonandhydrophobicregion.Atthesametime,onthebasisofBVDV-E2geneencodingproteinantigentableforanalysisandprediction;(2)Usingphagedisplaytechnology,buildtheBVDVnanobodylibraryofhelperphagem13k07tosaveandenlargeit,afterrescueandamplificationofthelibrary.Takethreeroundsofaffinityselectionandscreeningofspecificitymonoclonal;(3)Thesuccessfulanalysisofsequenceforprimerdesign,andusePCRtechniqueofgenefragmentswereamplifiedandtoconstructtheprokaryoticexpressionvectorofpEGX-4T--VHH.BySDS-PAGEexperimentforthepurposeofproteinweredetectedbyNicolumnwillexpresstheproteinwaspurifiedandproteinofdialysisandconcentration;(4)UsethedoublesandwichELISAvalidationofnanobodybindingandneutralizationtestsforthevirusinfectedMDBKcells,andestablishthenegativecontrolgroupandpositivecontrolgroup.Results:(1)Foundintensive630bpantigenepitoperegionsinBVDV-E2,selectstheregionfragmentinEscherichiacoliforexpression,purificationandfunctionalverification,thedisplaytoobtaintheexpectedantigenprotein;(2)BVDV-E2nanobodyscreeningpositivemonoclonal.Andsequencepositiveclone,analyzethesequenceisbelongtocamelheavychainantibodyfragments;(3)BVDV-E2proteinnanobodiesinprokaryoticsystemsuccessfullyexpressedgainsize49.5KDoftheproteinandpurified;(4)nanobodyvirusneutralizationfunctionverificationresultsshownanobodyproteincanneutralizethevirussoastoprotecttheMDBKcellswillnotbedamaged.III Conclusion:ThisexperimentgetBVDV-E2epitopeproteinfrombyprokaryoticsystemstructurebuiltofantibodylibraryscreeningspecificantibodiesdirectedagainsttheBVDV-E2,thenanobodytoBVDVneutralizing,inacertainextentprotectMDBKcellstoavoidtheoccurrenceoflesionsandlaidaveryimportantfoundationforthedevelopmentandstudyofBVDVtreatmentandprevention.Keywords:E2-BVDV;nanobody;screening;MDBKIV 目录中文摘要...................................................................IABSTRACT.................................................................III目录.......................................................................V英文缩略表................................................................VI引言.....................................................................VII第一章文献综述.............................................................1BVDV-E2抗原蛋白及其纳米抗体的研究.........................................11.牛病毒性腹泻病毒病原学研究............................................12.纳米抗体的研究进展....................................................53.展望................................................................10第二章实验研究............................................................11实验一牛病毒性腹泻病毒E2抗原表位的预测分析、表达及抗原性验证............111.材料与方法..........................................................122.结果与分析..........................................................163.讨论................................................................19实验二牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体文库的扩增及筛选............211.材料与方法..........................................................212.结果与分析..........................................................253.讨论................................................................28实验三BVDV纳米抗体的表达、纯化及抗病毒的初步观察.......................291.材料与方法..........................................................302.结果与分析..........................................................343.讨论................................................................37参考文献..................................................................40结论......................................................................47创新点....................................................................48致谢......................................................................49作者简介..................................................................50石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表.....................................51V 英文缩略表缩写词英文中文bpBasepair碱基对BVD/MDBovineviraldiarrhea/mucosaldisease牛病毒性腹泻/粘膜病BVDVBovineviraldiarrheavirus牛病毒性腹泻病毒nmNanometer纳米MDBKMadin-Darbybovinekidney牛肾细胞ORFOpenreadingframe开放阅读框RNARibonucleicAcid核糖核酸RLPRibosomallandingpads核糖体结合位点MDMucosaldisease粘膜病HCAbsHeavy-chainantibodies重链抗体NARNewornursesharkantigenreceptor新抗原受体IgGImmunoglobμlinG免疫球蛋白mlMilliliter毫升ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定NbNanobody纳米抗体HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶TCID50Tissuecμltureinfectivedose半数组织培养感染剂量DMEMDμlbecco'sminimumessentialmedium达尔伯克（氏）必需基本培养基CDRComplementaritydeterminingregion抗原互补决定簇AmpAmpicillin氨苄青霉素μlMinuteliter微升DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸PBSPhospatebuffersaline磷酸盐缓冲液kDaKilodalton千道尔顿ODOpticaldensity光密度pHpHvaluepH值PAGEPolyacrylamidegeleleectroporesis聚丙烯酰胺凝胶电泳IPTGIsopropylthiogalactoside异丙基硫代半乳糖苷PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应TrisHydroxymethylaminomethans三羟甲基胺基甲烷SDSSadiumdodecylsμlfate十二烷基磺酸钠hHour小时minMinute分钟VI 引言牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD-MD)是发生在家畜中的一种接触性传染病，该病是由黄病毒科、瘟病毒属的成员之一----牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV)感染引起的。该病主要引起家畜的腹泻、持续性感染、母畜流产甚至畸形胎儿等症状。该病在1946年首次发现于美国，在上世纪八十年代初首次于我国吉林省发现，然而目前该病在我国很多地区仍时有爆发。新疆是我国主要的畜牧业生产地区并且有着五大牧区之一的称号，已有调查研究表明，新疆牛场的阳性感染率不低于25%。因该病的致病机理非常复杂，目前尚无有效手段进行治疗和预防。该病的流行及感染严重地影响着我国畜牧产业的发展。BVDV的全基因组一共可以编码12种蛋白，包括4种结构蛋白和8种非解构蛋白，4种结构蛋白分别为C、E0、E1、E2，其中E2蛋白表明包含有大量的抗原决定簇为主要的抗原性蛋白，因此对E2蛋白的深入研究，将为BVDV疫苗的研发奠定基础。纳米抗体(VHH)是目前发现的仅存在于驼科动物和某些软骨鱼类体内的一种特殊抗体，由于其天然缺失轻链仅由重链部分组成，因此又被称为重链抗体（heavy-chainantibody）或者单域抗体(single-domainantibody)。相比于传统抗体，纳米抗体的体积非常小，仅仅相当于传统抗体的重链可变区部分，因此它可以与病毒缝隙或包埋于隐藏部位的抗原表位相结合，并且其穿透能力特别好，又因其具有亲和能力强、免疫原性低、稳定性好、容易获得、造价便宜等优势，因此，纳米抗体在疾病的治疗与预防领域得到了广泛应用。本研究以BVDV-E2蛋白为诱饵蛋白，利用噬菌体展示技术对已构建的纳米抗体文库进行筛选，得到特异性结合BVDV-E2蛋白的纳米抗体，并对其特异性的纳米抗体进行原核表达以及功能性的验证，为研制特异性强、稳定性高、造价低的BVDV抗体治疗制剂奠定基础，也为该病的防治和治疗提供提供新的思路和研究手段。VII 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究第一章文献综述BVDV-E2抗原蛋白及其纳米抗体的研究牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrhoeavirus,BVDV)，又称牛病毒性腹泻-[1]黏膜病病毒或粘膜病毒。近年来，BVDV病毒疫情呈现再次爆发趋势，该病自然感染多种偶蹄类动物，以持续感染为主，主要临床表现症状为腹泻、发热、流产、急性、慢性黏膜性疾病以及持续性感染和免疫耐受、免疫抑制等，主要引发母畜流产、产死胎等，该类疾病在全世界范围内广泛传播，尤其在养牛产业比较[2,3]发达的国家和地区，因此，该病呈现出世界性的分布。给我国甚至是世界上大多数的国家的畜牧业造成了非常巨大的经济损失，我国西部新疆维吾尔族自治区是一个多民族的地区，是我国五大牧区之一，也是我国主要的畜牧业肉制品、奶类制品主要生产基地，该病的流行给我国畜牧业、养殖业及食品业带来了巨大的安全隐患和经济损失，同时也给世界各地的人类健康、食品安全带来严重的安[4]全隐患。1.牛病毒性腹泻病毒病原学研究[5]截至目前，国内外尚且没有针对BVDV的有效疫苗。发达国家对该病主要采取扑杀和淘汰持续感染病畜的办法，相对于发达国家大量屠杀BVDV感染牛的方法来说，并不适用于仍处于发展中国家的我们，因为这本身对我国畜牧业就造成了巨大经济损失，并且我国国内目前对BVDV疫苗相关的研究相对滞后，[6,7]一些疫苗只是存在于实验阶段并且效果不稳定。通常所采用的疫苗为弱毒苗、灭活苗等，国际上研发的针对BVDV传统疫苗和新型疫苗往往普遍存在安全性低、免疫原性差、诱发免疫抑制、交叉保护性差、目的基因的表达水平不理想等[8]缺点。因此,要研制出一种既安全又高效的BVDV疫苗是当前我国对该病的研究方向。1.1牛病毒性腹泻病毒分类BVDV属于黄病毒科的RNA病毒，该属中的其他代表属有黄病毒属（如登革热病毒(Denguevirus，DV)）和瘟病毒属，如丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，[9]HCV)。BVDV外侧有囊膜包被，病毒直径在45nm到60nm之间，BVDV有两个分型I型和II型（5’UTR序列不同），其中I型中包括11个群，其针对[1]BVDV药物的研发及诊断方面的研究中应用比较广泛。后来科学家们根据BVDV是否能够会引起所感染的细胞产生相应的病变，将BVDV分为致细胞病变型（Cytopathicbiotype，CP）和非致细胞病变型（Non-cytopathicbiotype）两种。其中CP型BVDV在进行感染细胞之后，将会导致细胞的凋亡反应或者细胞在1 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究形态上发生改变，如：细胞出现变亮变圆继而产生脱落、聚集或者培养的细胞间[10,11]隔逐渐变大、细胞皱缩、出现拉丝等现象。1.2牛病毒性腹泻病毒结构蛋白研究概况1.2.1BVDV-E2蛋白研究概况从病毒的结构分析BVDV，BVDV基因组大小为12.2~12.5kb，由5’UTR及3’UTR组成一个可以翻译成大约4000个氨基酸残基的大的开放阅读框（Openreadingframe，ORF），包括4种结构蛋白（C/P14、E0/gp48、E1/gp25、E2/gp53）和8种非结构蛋白（P20/Npro、P7、P125/（NS2-3/NS3)、P10/NS4A、P30/NS4B、P58/NS5A、P75/NS5B)，其中由于BVDV-E2蛋白表面覆盖了较多[12,13]的抗原决定簇成分，因此成为瘟病毒中主要的保护性抗原蛋白之一。BVDV-E2蛋白通常可以诱导机体产生具有特异针对性的抗体，其产生的抗体往往可以中和该病毒，从而在某种程度上避免了同源性毒株的攻毒和对细胞的破坏[14]。此外，已有研究表明，在病毒的结构蛋白中往往其变异性比较大，而BVDV-E2[15]的变异种类最为多。因此，通常会导致BVDV对宿主细胞以及环境的适应能力更好、生存能力更强，同时这也是导致某些疫苗以及药物的功能性丧失的重要原因。由于E2能诱导机体产生中和抗体，所以目前研制的新型疫苗多为针对E2蛋白。BVDV-E2蛋白能够参与并介导免疫中和反应，也是病毒与宿主细胞进行[16,17]识别和吸附的主要部位。BVDV-E2是BVDV的一种囊膜糖蛋白，通常可以在原核的表达系统中进行表达，其表达的产物往往可以做到纯度较高且依旧可保持很好的生物学功能活性，从而在试验中可以通过刺激促使动物机体产生相对应的免疫应答反应，然而在具体操作过程中仍然存在很多不确定的因素，影响某些真核基因在大肠杆菌中的表达,如密码子的偏爱性、基因的二级结构、表达载体的构建、诱导方式以及[18,19]纯化方法等。另外含有疏水跨膜区的E2蛋白全基因表达产物在细胞膜上积聚也可能阻碍蛋白质的合成，从而导致极低水平的表达。在以往的研究中往往忽[20]略以上问题，从而造成抗原蛋白表达量低或者不易表达、抗原性差等问题。1.2.2结构蛋白C又称为P14蛋白，该蛋白是一种非糖基化蛋白，将其全长的基因进行其转录以及翻译后，通常可产生100多个氨基酸的残基，这些氨基酸残基的相对分子质[21-23]量约为14kDa。该种蛋白为BVDV的核衣壳蛋白的重要组成部分。1.2.3E0蛋白E0蛋白又称为gp48，是一种囊膜蛋白，其转录可产生大约200多个氨基酸[24]残基，该蛋白上存在8个可以糖基化的位点，去糖基化分子质量约为27kDa。在病毒感染时，E0蛋白通过其C端与靶细胞表面黏多糖结构紧密的结合，从而可以完成病毒与靶细胞之间的粘附作用过程，因此，BVDV-E0在病毒的入侵过[25]程中发挥着不可替代的重要的作用。此外，它还可以可抑制合成及淋巴细胞2 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究的凋亡，发挥对黄病毒RNA合成的调控作用以及减弱感染初期宿主免疫防御的[26]作用。1.2.4E1蛋白囊膜蛋白E1又称为gp25,将其全长基因通过转录以及最终的翻译后，变成195个氨基酸残基的结构，其相对分子质量往往在20kDa左右，其蛋白是一种包括有2个糖基化位点和2个疏水结构区的结构，该蛋白并非裸露在病毒表面，而是被包埋在病毒囊膜内，因此不能诱导免疫反应发生。E0蛋白对病毒的包装起[27,28]到辅助作用。1.3非结构蛋白概况1.3.1NS2/3和NS3NS2/3也称为P125，通常以NS2和NS3的复合形式存在，其相对分子质量一般约为125kDa。当不同类型的BVDV（CP型-BVDV和NCP型-BVDV）侵染正常的细胞以后，在细胞内检测到的组分是有很大区别的，比如当使用CP–BVDV进行侵染至正常的MDBK细胞中后，在MDBK细胞中可以分别检测到单独形式存在的NS2/3蛋白、NS2蛋白以及NS3蛋白；而当使用NCP-BVDV侵染正常的MDBK细胞后，在MDBK细胞中却只能检测到NS2/3蛋白[6]的形式。NS2基因序列发生改变将会引起NS3的产生，从而使NCP型病毒转变为CP性病毒。因此，通常我们说此种蛋白可以将决定BVDV具体区分为[27]为NCP型BVDV以及CP-BVDV病毒。NS3也称为P80，该蛋白同时具有RNA解旋酶(RNAhelicase)、核苷三磷酸酶(Triphosphatase,NTPase)、以及丝氨酸蛋白酶（Serineprotease）的功能活性。主要负责利用水解NTP获得的能量并催化产生成熟的非结构蛋白NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。此外，在哺乳动物的免疫系统中的一些免疫细胞，其对BVDV的特异性识别主要是针对NS3（或E2）蛋白，由于NS3的存在，往往可以刺激动物机体对病毒产生相对应的抗体，因此，亦可以说，NS3蛋白具[29]有相对较高的免疫原性。1.3.2NS4A和NS4BNS4A属于高度保守的非结构蛋白，转录后可翻译成64个氨基酸残基，其包含的带电残基可参与形成辅助因子的结构域。NS4B转录后可翻译成约由347个氨基酸残基，相对分子质量约为38kDa。突变将引起病毒由CP型转变为NCP[30,31]型。1.3.3NS5ANS5BNS5A转录后可翻译成490多个氨基酸残基，相对分子质量约为55kDa。其为可溶性的、亲水性的非结构BVDV蛋白之一，该蛋白中的丝氨酸以及苏氨酸[32]残基常常伴随有磷酸化的现象出现。NS5B转录后可翻译成700多个氨基酸残基，相对分子质量约为80kDa。[33]NS5A与NS4B蛋白共同组成病毒复制酶。3 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究1.4BVDV的感染的形式病毒持续性感染的形式主要有潜伏性感染、急性感染、慢性感染。潜伏性感染（latentinfection）通常在病毒感染机体后，机体可以依靠其自身的免疫反应系统对病毒产生抵抗作用从而将其清除掉，但仍有些病毒隐蔽于组织细胞中，因而逃避免疫防控机制系统，当宿主机体免疫力低下或状态不好时，潜伏的病毒在宿主细胞开始活跃，引起与初次感染症状看似相同但仍有区别的临床症状，并且反[34]复发作。急性感染（chronicinfection）通常在病毒感染机体后，部分病原仍存在于机体内，并且能持续排到体外，但通常并不引发感染机体产生临床症状表现，当宿主机体免疫力低下或者状态不好时，临床症状将表现出来并反复发作、[35]持续有病毒排到体外。慢性感染(slowinfection)通常潜伏期特别长，受感染的动物往往会承受一段漫长的发病折磨后，最终将导致动物因长时间的感染而死亡。导致感染因素一般包括病原的基因组随机的插入到宿主基因中，并复制、通过其基因突变从而适应环境改变，最终逃逸免疫防御体系及缺乏致细胞病变效[36]应、产生免疫抑制因子也是导致持续性感染的分子机制之一。1.5BVDV疫苗的研究1.5.1常规疫苗BVDV常规疫苗是第一批研制出的关于BVDV的疫苗，产生于60年代，目前，已有针对很多突变株种类的商品化的BVDV疫苗（大多数针对NADL株），[37]也存在一些针对其各种突变株的弱毒苗、或者针对灭活的疫苗。常规的疫苗针对其抗原相同的或者差异较小的毒株具有保护作用，反之对抗原差异较大的或[38]者不同种类的BVDV毒株并不能起到有效的保护作用。一般来说,对于两种同源性的毒株或者是抗原性相近的毒株而言，使用同种疫苗是可以起到保护性作用的，但是通常这种疫苗在不同的地区所爆发的、不同的突变株的BVDV的感染[39]中的效果很差。并且弱毒疫苗的缺点是始终存在安全性的问题。因此，对弱毒疫苗还需进行深入性的研究，以提高其安全性及高效性。1.5.2新型疫苗随着生物技术以及基因工程技术的的迅速发展及进步，针对于传统疫苗存在的诸多不足与缺点，新型的BVDV疫苗应运而生，比如新型的BVDV重组-活载[40]体疫苗等。BVDV的亚单位疫苗也是属于新型疫苗研发的中的一种，BVDV的亚单位疫苗通常是采用BVDV中抗原性较好的蛋白（如抗原蛋白E0和E2）的主要编码基因质粒，通过将其注入动物体内诱导动物机体产生抗体，从而在体内产生免[41]疫的中和反应。目前已有E2蛋白的亚单位疫苗研制成功的案例，如Bruschke等学者已经成功的构建出E2多价的亚单位疫苗，并且证明这种E2的亚单位疫[10]苗在某种程度上可以同时针对同源毒株发挥效果；同时，国外学者在研究中利用基因重组技术成功的将BVDV-E2基因插入到禽痘病毒，将其构建的重组序4 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究列的病毒进行动物免疫后，发现其实验动物有着很好的保护且不被感染的效果[42,43]。由于目前对BVDV的具体感染机制尚不明确，并且BVDV自然条件下的变[44]异率较高，因此对BVDV的治疗与防治方面带来很大的挑战。目前国际上已出现的疫苗尚不能很好的针对BVDV进行全面性的控制，且很多疫苗在安全问题上存在很大不足，因此对BVDV疫苗的研发需要考虑运用新技术手段和新思[45,46]路方法来解决，从而减少因为该病导致的重大经济损失。2.纳米抗体的研究进展随着对抗体研究的逐渐深入化，近几年来对纳米抗体生物功能的研究可谓如[47]火如荼，纳米抗体最早是本世纪初在骆驼体内发现的一种新型抗体。纳米的体积非常小，结构非常简单，其结构仅仅相当于传统抗体重链区的可变区，但是它却有着超乎传统抗体的结合能力、耐热性、稳定性等优势，也正因为其体积小、相对分子质量低，所以他往往可以与很多被包埋或者被隐藏的表位结合，不仅如此，纳米抗体的组织渗透性也非常强，当一般药物无法到达靶器官时，纳米抗体[48]也能轻松做到。2.1纳米抗体的结构特征及性质特点传统的抗体主要包括VL、CL、CH1、VH以及恒定区—CH2和CH3，去除传统抗体的轻链部分即为骆驼体内产生的重链抗体，对骆驼体内重链抗体部分克隆其可变区，便是我们所说的纳米抗体。纳米抗体的大小仅仅相当于传统的纳米抗体的0.1倍，分子质量非常小，其晶体直径仅约2nm，晶体长度仅在4.5nm左[49]右，是目前世界上所发现的具有抗体结合功能的最小的的功能片段。在肿瘤的靶向治疗、病毒的中和功能、食品的安全监测等领域已有深入性的研究成果目前，国际上已研究出纳米抗体药物，该种纳米抗体药物通常靶向能力超强、可溶性好、造价低廉，因此纳米抗体药物将继续成为今后靶向药物治疗研究的一个热[50]点。纳米抗体结构主要包括四个框架区部分、三个互补决定区部分相间拼接组合而构成，其中CDR2区最短，CDR3区最长，CDR3区往往形成凸出的环状结构，这非常有利于纳米抗体在行使结合功能时发挥互补结合的作用。对比于传统的抗体的可变区结构，纳米抗体的CDR1区和CDR3区明显要长，尤其是CDR3区，[51]这就决定了其结合能力要远远优越于传统的抗体。此外，框架区部分也有所区别，如纳米抗体在框架2（FR2）区域中的四个氨基酸为亲水性的氨基酸（F37、[52]E44、R45、W47），而传统的抗体中此四种氨基酸则为疏水性的氨基酸。因此，纳米抗体较传统的抗体而言其亲水性要更好，可溶性更好。此外，纳米抗体[53]及易人源化，目前国际上已有将其成功人源化的报道。5 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究2.2纳米抗体的制备传统的抗体往往需要在哺乳动物的细胞系中进行表达以及分泌，因此其往往表达量低、不容易获得、溶解性差、造价高。相对于传统抗体的造价高、不容易[54]获得等局限，纳米抗体则更加容易获得并且造价比较低。大多数实验工作者常常将单一或混合的抗原免疫骆驼或者羊驼，将其外周淋巴血液进行分离并通过巢氏PCR的方法克隆得到基因，从而构建出文库，再利用筛选手段如噬菌体展示技术、酵母双杂交等方法（此两种筛选技术目前已经非常成熟，国内外已有很多报道）从文库中筛选得到亲和力好、针对性强的纳米抗体，此种抗体非常容易在原核系统或真核系统中表达，因此对于纳米抗体的大规模生产也非常容易做到[55,56]。2.3纳米抗体的研究类型随着对纳米抗体研究的不断深入，纳米抗体的类型也在不断的增多。我们将直接利用诱饵抗原在纳米抗体文库中筛选得到的纳米抗体称之为单价纳米抗体，[57]单价纳米抗体获得容易，稳定性强、亲水性好、结合能力强。但是随着对纳米抗体研究的进步，将两个针对相同抗原的纳米抗体连接起来便构成了双价的纳米抗体，双价的纳米抗体针对性强、靶向能力比单价的纳米抗体更好，目前已有很多关于双价纳米抗体的报道，有些纳米抗体的靶向性比单价的纳米抗体的靶向[58]性要高至5千左右。后来，多价纳米抗体也应运而生，多价纳米抗体是将多个单价的纳米抗体串联起来构成的，多价纳米抗体的效率往往要比单价纳米抗体[59]效率高。此外，针对不同的抗原蛋白，还可以将两个特异性不同的纳米抗体串联起来，就构成了双特异性的纳米抗体，根据某些特殊要求在双价的纳米抗体、双特异性的纳米抗体或者多价的纳米抗体上融合不同的功能单位，如荧光类物质等，像这类将纳米抗体与具有不同的功能活性的物质连接组合在一起的复合物就[60]称之为融合的纳米抗体。并且通常在纳米抗体中的一条链的末端，往往出现聚集现象的几率非常大，因此，这种特性使其可有效提高合成药效发挥的效率。总之，对纳米抗体的研究已经不是仅处于基础阶段了，国际上目前已有纳米抗体药物投入生产及应用中。2.4纳米抗体研究的领域2.4.1病毒领域纳米抗体具有特异性识别位于病毒表面、病毒缝隙甚至被包埋的病毒抗原表位的功能，因此，纳米抗体具有优越于传统的抗体的结合能力，从而高效率的并高针对性的靶向目标病毒，从而实现中和病毒的功效。目前针对病毒的纳米抗体的研究已经进入深层次阶段，诸如禽流感病毒（H5N1）、猪圆环病毒PCV、丙型肝炎病毒HCV、呼吸道合胞病毒（RSV）等，对于其研究内容也从最初的单[61]价的纳米抗体深入研究到多价的纳米抗体及其具体的作用机制的研究等。比如H5N1的研究中，利用其神经氨酰酶（H5N1-NA）从已构建的文库中筛选得到特性强、稳定性好的单价纳米抗体后，进行融合及连接，从而得到双价的纳米6 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究抗体，经验证双价的纳米抗体的中和性要高于单价的纳米抗体的4000多倍，最后通过X光晶体射线等技术，得出纳米抗体的蛋白的晶体构造并分析其具体功[62]能位点。2.4.2细菌领域纳米抗体在细菌方面的研究也屡见不鲜，纳米抗体的高特异性及其超强的结合能力可以与位于细菌上的抗原蛋白进行结和并改变其结构，从而达到特异性识别及中和抗原的目的，比如近年来在对布鲁氏杆菌纳米抗体的研究中发现，其通[63]过筛选文库得到一个能特异性结合布鲁氏菌抗原蛋白GroEL的纳米抗体。此外，科学家还发现纳米抗体可以用来区别布鲁氏菌和叶尔森氏鼠疫杆菌，由于其两种抗原性细菌具有非常相似的特征，因此其他方法很难将其进行区别，而纳米[58]抗体却可以轻松进行区分。此项研究对布鲁氏菌疫苗的研发提供新的思路方法和新的研究手段。2.4.3人类重大疾病领域目前科学技术虽然已经非常先进，但是对于许多人类重大疾病如肝癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌等还是令科学家们很棘手，因为在传统的治疗癌症的方法中，无论是化学治疗方法还是物理治疗方法，都会毫无避免的对人类机体本身造成一定程度的损害，由于其靶向性不好，常常会伤害人类机体的正常细胞及组织，[64]并且这种伤害一直以来无法很好的得到控制。鉴于纳米抗体的靶向性好、高度的专一性以及无毒害作用，许多针对癌细胞的纳米抗体的研究已有深入的研究。比如在丙型肝炎的研究中，将成功构建的纳米抗体文库利用噬菌体展示技术将其中靶向丙型肝炎病毒HCV的纳米抗体进行亲和筛选富集、并将靶向性强、结合性好的纳米抗体进行作用机制的研究，从而得到纳米抗体的具体作用位点[65]。2.4.4食品领域随着科学技术的不断发展和生活水平的不断提高，食品健康问题已经变得备受重视，虽然近年来针对食品的卫生问题、安全问题、质量问题等的监控手段和要求在不断提高，但是很多问题仍然此起彼伏、层出不穷，因此，相对应的很多[66]针对食品安全监测的方法也纷至沓来。基于纳米抗体的体积小并且可以携带荧光类物质及其可控制荧光类蛋白效果的增强和猝灭的优势，因此纳米抗体常常作为生物传感器类的探针来使用，并且由于纳米抗体的结合能力强，因此由纳米抗体构建的探针一般都具有准确度好、灵敏度高等优点，在实际应用中，其常作[67]为有害物质（如农药、毒素等）残留的检测、解毒及脱毒的应用。2.5胞内中和性抗体在很多疾病的治疗中，抗体由于本身具有很多其他药物不具有的优势（如靶向专一等），已成为众多科学研究者进行研究利用的热门，但是对于传统的抗体而言往往无法做到在细胞内的表达，因此，传统的抗体一般不具有细胞内活性，所以无法与细胞内的一些蛋白（比如某些酶的活性中心等）进行结合发挥作用7 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究[68]。然而，纳米抗体却能克服这一障碍，其无论在细胞核、细胞质还是内质网上，都可以正常的折叠，从而保证其活性，因此可以说纳米抗体可以在细胞内进行表达，从而与细胞内的某些酶等物质进行靶向结合，从而降低或者中和酶的活[69]性。比如国内对猪圆环病毒的研究中选择该病毒的2型Cap蛋白为诱饵抗原蛋白利用酵母双杂交技术对构建好的文库进行筛选，从而得到针对Cap蛋白的纳米抗体，对该纳米抗体纯化后，利用现代免疫学技术以及分子生物学方法对其进[70,71]行亲和效果以及功能的验证。2.6.噬菌体展示技术概况纳米抗体筛选过程中的影响因素包括两方面，一是筛选抗原诱饵选取，二是筛选方法选择。目前常用的筛选方法主要有噬菌体展示技术以及酵母双杂交筛选[55]技术、杂交瘤技术等。其中酵母双杂交系统的筛选技术通常用于筛选细胞内源性的蛋白，如细胞内的某些酶等生物活性物质。杂交瘤技术是将多克隆纳米抗体通过杂交瘤细胞培养技术从而获得单克隆纳米抗体，但是，这种方法不仅操作[64]比较复杂而且效率也非常低。噬菌体展示技术是研究蛋白质间相互作用的一种方法，其可通过将纳米抗体的基因片段插入到噬菌体的基因中，从而在噬菌体表面（衣壳蛋白）将纳米抗体与噬菌体的外膜蛋白进行融合的表达，再利用抗原蛋白或包含主要抗原决定簇的[72]诱饵蛋白将功能性的纳米抗体筛选出来。因此，该方法常常用于筛选特定的蛋白，噬菌体展示技术通常用于筛选外源性的蛋白，目前利用噬菌体展示技术筛选的方法已经非常普遍，此种方法不仅高效准确，同时其也具有花费较低、操作[56]简单等优点，因此此种方法成为目前最常用的一种方法。2.6.1丝状噬菌体利用噬菌体表面展示技术进行研究时常常用到的是丝状噬菌体，长的丝状噬菌体主要是有核心的DNA部分及其外层包裹的衣壳蛋白组成，长度大约为1μm、半径大约为3nm，其整个核苷酸序列部分包括多种不同功能的蛋白（总计11个），其中的五个分布在噬菌体的外表面称之为衣壳蛋白，其均匀的将整个管形的噬菌体紧紧包裹（包括P3、P6、P7、P8、P9），其中P8以长形的管状形式分布于整[65,73]个噬菌体上，P3、P6与P7、P8分别位于噬菌体的两端。在噬菌体展示过程中P3、P8是纳米抗体进行融合展示的主要部位。P3是由大约40多个氨基酸构[74]成的相对分子质量为40kDa左右的衣壳蛋白。其N端可插入大片段外源蛋白基因序列；P8是由大约50个氨基酸构成的相对分子质量比较小的衣壳蛋白。在P3、P8蛋白的编码基因中存在两个特殊的基因（基因ＩＩＩ和基因ＩＶ），若将外源基因插入到这两个基因中时往往会导致其全部的P3、P8蛋白进行融合表达，因此造成噬菌体的扩增障碍并且影响噬菌体的侵染过程及其在宿主细胞中的[75,76]组装能力。鉴于以上方面，通常采取将基因中保留部分野生基因或者采用辅助噬菌体（或噬菌粒）的办法进行克服。8 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究2.6.2噬菌体表面展示技术的应用现状目前噬菌体展示技术已广泛的受到医学诊断、生物疫苗药物的研制、多肽药物治疗研究、抗肿瘤研究等领域的青睐，并且在自身免疫性疾病方面及肿瘤疾病[77]的研究方面已取得长足的发展。目前，该技术已成为纳米抗体筛选中的常见方法手段，继1985年国外首次报道关于噬菌体展示技术之后，国际上相继出现[78]了利用该技术成功筛选得到针对H5N1、HCV、HIV等的高亲和性纳米抗体。国内目前已成功的将其应用到实践中，比如国内的学者利用噬菌体展示技术成功[79]筛选到文库中针对O型口蹄疫的纳米抗体等。2.6.3噬菌体表面展示技术基本方法噬菌体表面展示技术的筛选是利用目标分子与相应的配体之间的相互亲和吸附力进行的，当目标分子固相化以后加入其文库，靶分子与文库中的蛋白进行相互作用，使具有亲和吸附能力，经过洗脱后，去除非特异性结合的部分，再使用酸性的缓冲液洗脱下结合的噬菌体克隆，使其对大肠杆菌进行侵染操作，使其在菌体细胞内得到大量的复制以及扩增，经过3轮的淘选程序：吸附、洗脱以及扩增，对其进行循环式的重复筛选操作，将最终得到的特异性较强的单克隆并进[78,80,81]行测序分析。2.6.4影响噬菌体表面展示技术筛选时的因素为了得到具有高质量、高亲和性的筛选产物，在筛选过程中往往要注意建库材料的选择、重组系统的构建以及筛选方法的要素。首先文库的质量决定筛选的质量的高低，其B细胞因其自身免疫耐受或由于接触抗原限制因素，从而多样[82]性受限，因此其文库的库容多样性是决定文库质量的重要指标。同时，在构建天然噬菌体抗体文库时，实际操作时由于失误导致阴性的克隆繁殖扩增过度，[83]或者抗性的丢失也会造成筛选的失败。2.6.5噬菌体表面展示技术在分子间相互作用中的优势传统的分析抗原表位的手段一般是通过生物学方法或化学处理方法对抗原分子进行处理从而得到较多的短肽碎片，再通过使用单克隆抗体对其进行筛选实验，得到能与之发生相互作用的片段，这种方法操作复杂，稳定性较低，而且对天然蛋白质进行化学或生物学方法处理后，不利于其保持天然性，因此可能会对[84,85]其生物学功能的深入研究造成影响。天然的蛋白质一般包括很多个抗原位点，也称作抗原表位，其上分布很多抗[86]原决定簇，这些抗原决定簇能够与特异性的抗体进行高效率的结合。它们通常是可溶性较好的的蛋白，其表面通常是带电荷的具有极性的氨基酸，这种蛋白[3,87]一般是可溶性蛋白，其外表面广泛的分布着亲水性的氨基酸残基。相反，疏水性的氨基酸残基往往隐藏在内部，在抗原蛋白的表面，一般电荷极性相对较大[88]的区域往往也是其抗原决定簇的聚集部位。此外抗原决定簇的分布还与其二级结构有关，一般α螺旋以及β折叠往往处于蛋白质内部，利用氢键的连接从而9 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究保证蛋白质的稳定性，而β转角结构和无规则卷曲则往往是凸出于蛋白表面的结[24]构，成为抗原决定簇的几率相对较大。通过噬菌体表面展示技术筛选蛋白的抗原表位，对抗原与抗体作用位点的定位很有帮助，此外，这种方法往往也非常有利于酶-底物或者受体-配体相互作用[89]时的具体位点的准确定位。噬菌体表面展示筛选方法以其简单的筛选流程，反复淘汰非特异性结合的办法，可以得到较其他方法更为天然的抗原功能性基团，从而有利于对这些接近天然基团的生物学功能的深入化研究。2.6.6噬菌体表面展示技术在疾病诊断及防治的应用为了提高安全性、稳定性，很多医学研究采用噬菌体展示技术，目前已有成功在构建好的肽库中筛选出高效针对双呋喃氧杂萘邻酮衍生物的模拟肽（黄曲霉毒素，该毒素可导致癌变、畸形和突变），应用模拟肽可以达到降低对周围环境[90-93]的影响、检测花费低、提高安全性等优点。在功能基因组学中，噬菌体表面展示技术同样发挥了不可替代的作用，利用该技术可以将指定的具有活性的生物活性片段进行筛选，此外，使用两个噬菌体[94,95]表面展示文库可以筛选得到成对的具有特异结合性的片段。3.展望鉴于国际上目前尚无商品化的BVDV疫苗以及目前对BVDV所采取的应对措施无法从根源上控制疫情的发生和发展，采用新技术和新思路研发BVDV疫苗以及药物显得尤为重要，BVDV-E2是BVDV的主要抗原性的蛋白，其上分布很多亲水性的抗原决定簇氨基酸残基，因此对BVDV-E2蛋白的深入研究有利于对BVDV药物的研发提供前提；纳米抗体是产生于驼科动物及某些软骨鱼类机体内的天然小型功能性抗体，以其天然无毒副作用、靶向稳定性强、小型亲和性好等自然优势，目前已成为很多靶向药物的开发研究材料；利用噬菌体展示技术，通过构建针对BVDV多抗原表位的纳米抗体噬菌体文库并利用诱饵抗原表位蛋白对其进行高亲和力的筛选，从而可以得到天然的、亲和性较高的纳米抗体。这为BVDV的靶向药物以及疫情的控制提供新的方法平台。10 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究第二章实验研究实验一牛病毒性腹泻病毒E2抗原表位的预测分析、表达及抗原性验证摘要：[目的]获得高效表达的重组牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrhoeavirus,BVDV)E2免疫抗原蛋白。[方法]应用软件分析BVDV-E2蛋白抗原表位，将富含抗原表位基因片段连接表达载体pGEX-4T-1，并将构建成功的载体转化至大肠杆菌的感受态细胞中进行大量的扩增，通过IPTG对包含有目标基因载体的菌体进行诱导，使目的基因在菌体中进行大量的表达，最后，通过SDS-PAGE实验，以及Western-blot验证对蛋白的功能进行检测，并通过经镍柱亲和层析的方法将蛋白进行分离和纯化；以纯化蛋白为包被抗原，用间接ELISA检测抗原对免疫血清的反应性。[结果]成功克隆出经过优化后的BVDV-E2抗原表位基因片段，并且在大肠杆菌中进行了高效率的蛋白表达，通过Western-blot实验、ELISA检测，证实此次表达的重组表位蛋白对BVDV的阳性血清具有较很灵敏的反应原性。[结论]获得大小为49.5kDa的BVDV-E2抗原表位蛋白，并且该抗原稀释度在1:40，抗体稀释度在1:80时结合效果最佳。可用于后续的纳米抗体筛选的研究。关键词：抗原表位，E2蛋白，Western-blot，间接ELISA牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrhoeavirus,BVDV)，属于黄病毒科，本病毒在自然条件下，常常引发多种动物的感染，比如牛、羊、鹿、猪等，并且，该病通常以持续性感染为主，主要临床症状为腹泻、发热、流产、胎儿畸形等，该病不仅给环境造成危害还给我国畜牧业带来严重的经济损失。近几年来，[4]BVDV病毒疫情时常出现再次爆发趋势，给畜牧业和人类健康带来严重危害。国际上对于BVDV的处理办法少之又少，由于没有疗效可观的针对BVDV的药物，因此，通常采取直接屠杀的方式，这不仅无法消除该病毒带来的污染，[32]并且此种方式并不能从源头上消灭病毒，从而无法使该病得到根本性的解决。目前国际上研发出的针对BVDV的传统疫苗和新型疫苗存在安全性低、免疫原[96]性差、诱发免疫抑制、交叉保护性差、目的基因的表达水平不理想等缺点。BVDV的结构蛋白有很多，其中之一的BVDV-E2蛋白，因其可以诱导使机体产生有效的抗体，从而对病毒在某种程度上对病毒产生抵抗，因此可以说具有很好的抗原性。但是该病毒结构蛋白的变异较大，其代表为BVDV-E2糖蛋白，其变异出现的最多、变化也最大。这常常导致疫苗免疫的失败，从而造成病毒的11 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究持续感染无法解决，给BVDV的药物研发带来了很大挑战。BVDV-E2蛋白能够[36]参与并介导免疫中和反应，也是病毒与宿主细胞进行识别和吸附的主要部位。本次实验首先通过对BVDV-E2全序列进行抗原表位预测及分析，再将优化[13-14]好的序列在大肠杆菌中进行原核表达，得到高效表达并且抗原性较好的蛋白，因此本实验为新型BVDV疫苗的研究及制备奠定了良好基础。1.材料与方法1.1材料1.1.1实验材料大肠杆菌克隆菌株（E.coliDH5α）、大肠杆菌表达菌株(DE3)、pMD19-T(simple)克隆载体，原核表达载体pGEX-4T-1、骆驼血清、羊抗骆驼二抗均由石河子大学人畜共患病实验室保存；pACNR/NADL质粒由美国洛克菲勒大学CharlesM.Rice教授惠赠。1.1.2试剂限制性内切酶BamHⅠ、限制性内切酶XholⅠ、T4DNA连接酶、DNAMarker购自TaKaRa公司；PCRMix购自北京康为世纪生物有限公司；蛋白Marker购自北京康为世纪生物有限公司；质粒DNA小量快速提取试剂盒和DNA凝胶小量快速回收试剂盒均购自北京康为世纪生物有限公司；其余试剂均为国产或进口分析纯。1.1.3仪器PCR仪(TC-512)、超速离心机(GS-21R)、微波炉(HR-7751MS)、超净工作台(BMCC-1000A/B3)、凝胶成像仪（伯乐Bio-Rad)、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪，电泳槽(北京六一仪器)、恒温培养箱(HIQ-X100)、恒温摇床(HWY-100B)、电热恒温水槽（DK-8D）、智能蛋白质多维纯化系统(AKTAPRIFIER100)、分光光度计（Nano2000）。1.1.4培养基LB液体培养基：1g/100mlNaCl,1g/100ml蛋白胨，0.5g/100ml酵母提取物。LB固体培养基：1.5%琼脂粉，1g/100mlNaCl,1g/100ml蛋白胨，0.5g/100ml酵母提取物。1.2方法1.2.1BVDV复合多表位抗原基因片段的选择、优化将BVDVNADL株E2基因序列通过在线软件epitop进行抗原表位分析，再将该序列与大肠杆菌的稀有密码子序列进行比对并将其进行同义突变优化，去除疏水跨膜区后的序列即为最终优化的基因序列。1.2.2引物设计根据优化好的E2抗原表位目的基因序列以及pMD-19-T克隆载体的基因序列、pGEX-4T-1表达载体的多克隆位点（MCS）的序列，运用Primer5.0等软件12 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究设计其上游及下游引物（E2-F/E2-R）。其上游的引物的酶切位点设置为BamHⅠ，其下游的酶切位点设置为XhoⅠ。具体引物序列如下：E2-F：5'ggatccCCAATAGGATGGACAGGGA3'(BamHⅠ)E2-R：5'ctcgagGGACTCAGCGAAGTAATCCC3'(XhoⅠ)引物合成及测序服务由上海生工完成。1.2.3BVDV-E2基因的扩增、克隆及鉴定以BVDVNADL质粒为模板，PCR扩增，目的基因得到扩增。将BVDV-E2的扩增抗原表位基因片段与pMD-19-T载体连接，16℃中水浴过夜。隔日，取出连接产物，与感受态细胞相互作用，使之转化入DH5α感受态细胞，并将DH5α涂于含氨苄霉素抗性的LB固体培养基上，恒温培养箱中倒置、37℃过夜培养。隔日，利用PCR的方法对单克隆菌落鉴定，从而筛选出阳性单克隆，并对阳性单克隆大量的扩增然后提取质粒，将质粒双酶切（BamHⅠ/XhoⅠ）鉴定。将鉴定正确的重组表达载体pMD-19-T-E2测序（均送至上海生工）。1.2.3.1BVDV-E2基因PCR扩增BVDV-E2PCR扩增采用20μl反应体系，加入各组分后充分混匀。组分体积Mix10μlddH2O7μl模板2μl上游引物0.5μl下游引物0.5μl按PCR以下条件设置程序：步骤条件预变性95℃4min变性94℃30s退火64℃30s上延伸72℃1min下总延伸：72℃10min保存4℃1.2.3.2BVDV-E2基因片段的回收PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化，步骤如下：根据说明加入胶块的3倍体积的BufferPG使其完全浸没置于50℃水浴5-8min，注意观察直至其充分溶解；将混合液转移到吸附柱中（加三分之一倍体积的异丙醇，用以增加DNA片段的回收浓度）。向其中加750μl加乙醇的BufferPW，13000rpm离心60-70s，弃去混合液，再离心60-70s，弃去管中的混合液体。将晾干后的吸附13 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究柱放到经过高压灭菌的Ep管中，向其中滴加50μl的BufferEB，经过2-3min后再离心1min，收集富含DNA的溶液即可。1.2.3.3感受态细胞的制作方法涂布E.coliDH5α于无抗性LB培养板上，隔日，挑取单克隆菌落，于液体LB培养基内进行大量的扩增，使之达到对数生长期（OD600≈0.4-0.6）时将其取出，6000r/min、4℃离心6-8min，收集菌体富集物，并使用40ml已预冷的CaCl2溶液将沉淀的菌体富集物进行重悬，6000r/min、4℃离心6-8min（此步骤重复进行两次），使用4-7ml已预冷的甘油-CaCl2溶液重悬细胞沉淀富集物。（注意全程冰上无菌操作）1.2.3.4提取质粒方法将转入pMD-19-T-E2质粒的菌体进行大量扩增，次日，取3-5ml扩增后的菌液于离心管中12000r/min离心3min弃上清液。用250μlBufferP1将收集的菌体剧烈吹打使其充分混匀。再向其中加250μlBufferP2并使其混匀直到混合液变得清亮粘稠（动作温和、缓慢）。然后继续加350μlBufferN3（有白色絮状物出现）。离心7-10min，使用移液器将上清转移至无菌的吸附柱中、离心60s，使用750μlBufferPW清洗吸附柱，离心120s并弃去上清，晾干吸附柱，用50μlBufferEB清洗吸附柱，收集到的混合液即为高纯度质粒液体。1.2.4构建及鉴定pGEX-4T-E2重组表达载体将表达载体pGEX-4T-1和重组质粒pMD-19-T-E2分别使用BamHⅠ以及XhoⅠ双酶切，酶切后对产物电泳检测，并将酶切成功的片段回收、纯化。获得两端具有粘性末端的E2DNA片段和pGEX-4T-1基因片段连接，16℃水浴过夜。次日，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中使其进行扩增复制，并将扩增的菌体均匀的涂于含氨苄霉素抗性的LB培养基皿上，倒置37℃过夜培养。次日，生长良好的菌落通过PCR的方法筛选鉴定，并将筛选得到的阳性菌提取质粒，将质粒转化入表达菌BL21（DE3）感受态细胞内，涂于氨苄霉素抗性的固体LB培养基，置于37℃过夜培养。次日，酶切鉴定后的重组表达载体即为pGEX-4T-E2。1.2.5诱导大肠杆菌中BVDV-E2基因的表达将20μlpGEX-4T-E2表达载体接种到20ml含有氨苄抗性的液体LB的培养基中，37℃230r/min震荡恒温过夜培养。次日，取2ml菌液转接种200ml含氨苄抗性的液体LB中，37℃恒温230r/min震荡培养，菌体生长至对数生长期（约为0.4-0.6OD）时加入IPTG（终浓度为1.0mmol/L），继续震荡扩增培养至8h时收集菌液。1.2.6SDS-PAGE和Weternblot实验1.2.6.1SDS-PAGE电泳（1）制备SDS-PAGE凝胶，配制2%的封底胶，待封底胶彻底凝固后（大约20min）开始配制12%的分离胶，将各组分混依次加到烧杯中并通过磁力搅14 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究拌器进行充分混匀，缓慢的注入两层玻璃板之间，要求剩余约5cm左右的高度，向其中加入无水乙醇以压平分离胶。放置120min左右，待分离胶完全凝固后倾倒出无水乙醇并用滤纸将残余无水乙醇吸干。开始配制5%的浓缩胶，并插入合适的梳子，室温静置90min左右，待浓缩胶完全凝固后轻轻拔掉梳子，将其入电泳槽中并加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。（2）SDS-PAGE电泳，按照顺序依次将样品点到样品孔中，（样品预处理：20μl溴酚蓝+80μl水+蛋白样品进行金属浴10min）开始通电，直至溴酚蓝到达分离胶底端时停止电泳。（3）SDS-PAGE凝胶染色与脱色电泳结束后，用蒸馏水将凝胶轻轻冲洗3-4次，加入考马斯亮蓝R-250染色液，使凝胶被完全浸没，染色30-40min。洗去残留的染色液，加入脱色液，待脱色完毕后，利用凝胶成像系统进行拍照分析。1.2.6.2Wetern-blot将表达的菌液进行离心，收集菌体，加入去离子水80μl和上样缓冲液20μl去离子水，混匀并金属浴或水浴锅加热煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳检测菌液是否表达蛋白然后以骆驼血清做为一抗，HRP羊抗骆驼为二抗，将其和表达的蛋白一起，进行Wetern-blot分析。1.2.7纯化并浓缩BVDV-E2抗原表位蛋白取3ml的菌液加入至600ml的含有氨苄霉素抗性的LB液体培养基中37度摇床培养1.5h左右，直至菌液达到对数生长期为止（OD600≈0.4-0.6），加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达8h后以5000rpm进行4℃离心15min收集菌体后，加15ml的LysisBuffer4℃过夜裂解。次日，液氮和42摄氏度中进行反复冻融三次、超声裂解五个循环（每次3s，90次/周期、间歇3s，功率180瓦），至菌体透明清亮时进行5000rpm、4℃离心15min，保留上清液并将其以5000rpm、4℃离心25min,0.45um滤膜过滤后，将其结合到Ni柱中（1ml镍柱加入4ml菌液）于摇床上冰浴结合2h，取出Ni柱以800rpm离心2min，加4mlWashBuffer将柱子清洗三遍后再以800rpm离心2min，最后加入1ml的ElutionBuffer清洗四遍并收集含有目的蛋白的上清液，将最终的上清液放入透析袋中，利用蔗糖对蛋白进行浓缩。1.2.8ELISA验证反应原性经分光光度计测定纯化的蛋白浓度为1.36mg/ml，首先将纯化的重组蛋白从左向右依次做1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280稀释，将其进行过夜包被；次日，弃去抗原及包被液，用含0.1%吐温的PBS（PBST）洗涤3次，每次洗涤3-5min，然后每孔加入200μl含0.4%脱脂奶粉的PBS进行封闭2h，37℃恒温箱孵育后弃去封闭液，用PBST洗涤3次，每次洗涤3-5min，将骆驼血清(BVDV阳性血清、BVDV阴性血清)按同样的稀释倍数1:10、1:20、l:40、1:80稀释后,自上而下加入各孔，每孔100μl,37℃温箱作用lh后弃去血清，用PBST洗涤3次后,每孔加入100μl稀释倍数为1:40的羊抗骆驼酶标二抗，37℃15 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究恒温孵育1h，弃去羊抗骆驼酶标二抗的混合液，用PBST洗涤3次，加入TMB底物缓冲液，条件为37℃恒温避光作用20min，最后在每孔加入100μl浓硫酸使反应终止，用酶标仪测定OD450值后比较阳性（P）与阴性（N）血清的OD比值，其阳性OD值与阴性OD值比值最大时的包被稀释度即为抗原/抗体最佳包被浓度。2.结果与分析2.1抗原表位分析利用在线软件epitop对BVDV-E2全基因序列进行抗原表位的预测及分析，结果如下：表2.1抗原表位分析Table2.1AntigenicepitopesanalysisNO.STARTENDPEPITIDELENTH177E121621ERIGQL632338AEGLTTTWKEYSPGMK1648694GRKQEDVVE95109111KPI36137137T17157165RRSKPFPHR98167167G19169169I110173175NLG311188190TCV312201202SI213212221FKESEGLPHY1014223223I115228231LENE416235235R117241244SCNR418249250IV219273279LGPMPCR720283292IISSEGPVEK1021308314FEPRDSY722335335H123372373AL216 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究2.2BVDV-E2基因的扩增E2-F/E2-R引物扩增E2基因，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测得到约630bp，与预期结果相符，结果如图1，说明E2基因扩增成功。1234567891011M图2.1E2基因PCR鉴定Fig2.1IdentificationofE2genebyrestriction1-10：E2基因PCR结果；11：阴性对照；M：DL10001-10：ResultofE2genebyPCR;11:nagtivecontrol;M：DL10002.3重组表达载体pGEX-4T-E2的鉴定采用酶切法鉴定重组质粒pGEX-4T-E2用BamHI/XhoI酶切片段，经琼脂糖凝胶电泳检测的到约630p片段和约4900bp质粒片段，与预期结果一致，结果如图2，说明重组表达载体pGEX-4T-E2构建成功。12M图2.2pGEX-4T-E2重组质粒双酶切鉴定Fig.2.2IdentificationofpGEX-4T-E2byrestriction1：BamHI/XhoI双酶切产物；2：pGEX-4T-E2质粒对照M：DL100001:ProductsofpGEX-4T-E2withBamHI/XhoIdigestion;2:pGEX-4T-E2Plasmidcontrol;M:DL10000M：DL10002.4E2蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测17 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究重组菌经IPTG诱导，SDS-PAGE分析表明，目的蛋白成功表达，重组蛋白pGEX-4T-E2相对分子质量约为49.5KD（图3），与预期结果相符。1234M图2.3pGEX-4T-E2重组质粒的蛋白表达鉴定Fig.2.3ProteinexpressionofpGEX-4T-E2recombinantplasmid1：对照,2-4：pGEX-4T-E2蛋白,M：蛋白Marker1:control2-4:pGEX-4T-E2recombinantprotein,M:ProteinMarker,2.5E2表达产物Western-Blot鉴定重组菌表达产物通过Western-Blot进行分析。结果显示，在49.5KD处有明显条带，与理论分析值相符（图），Western-Blot分析结果表明，表达的重组E2蛋白可以与抗BVDV-E2抗体发生特异性免疫学反应，证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性。M1图2.4重组菌Western-Blot结果Fig2.4Western-BlotofrecombinantbacteriaM.蛋白Marker;1.E2蛋白M.Marker;1.E2protein2.6间接ELISA方法测定抗原蛋白的灵敏性经分光光度计测定，纯化蛋白浓度为1.36mg/ml方阵实验表明(见图5)，最佳结合浓度为抗原稀释度1:40，抗体稀释度1:80。18 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究血清最佳0D450稀释度抗原蛋白稀释倍数Dilutionofantigen图2.5抗原最佳稀释浓度和血清最佳稀释度Fig2.5Bestdilutionconcentrationofantigenandserumdilution3.讨论牛病毒性腹泻病毒(BVDV)呈世界性分布，临床表现为腹泻，急、慢性黏膜病以及持续性感染和免疫耐受、免疫抑制等，主要引发母畜流产、产死胎和畸形胎[4]等。该病在全世界广泛流传尤其在养牛业发达的国家和地区都有该病的流行。我国新疆是一个多民族地区，是我国五大牧区之一，是我国主要的畜牧业主要生产[8]基地，该病的流行给畜牧业养殖业及食品业带来了巨大的安全隐患和经济损失。[71]国外对该病主要扑杀和淘汰持续感染病畜的办法。国内对BVDV疫苗的研究也相对滞后,目前国内还没有正式的国产BVDV疫苗。而目前所采用的疫苗一般为弱毒苗、灭活苗、联合疫苗、亚单位疫苗等，但是这些疫苗始终存在着一定的危险性或效果差等缺陷，因此,研制一种安全高效的BVDV疫苗是当前防治该病的主要方向。E2蛋白是瘟病毒主要保护性抗原蛋白，含有病毒的主要抗原决定簇，它存在较高的变异性，这种变异使BVDV对宿主有更强的适应性，这也是导致疫苗[22]保护失效和牛持续性感染的重要原因。由于E2能诱导机体产生中和抗体，所以目前研制的新型疫苗多为针对E2蛋白。E2是BVDV的一种囊膜糖蛋白，可以在原核表达系统中进行表达，其可以使机体产生免疫应答，然而影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素很多,如密码子的偏爱性、基因的二级结构、表达载体的构建、诱导方式以及纯化方法及过程等。另外含有疏水跨膜区的E2蛋白全基因表达产物在细胞膜上积聚也可能阻碍[97]了蛋白质的合成,从而导致了极低水平的表达。本次研究首先对标准株BVDV-E2基因全序列进行分析，发现全序列中包含大量的大肠杆菌稀有密码子19 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究和疏水结构区，这些因素都是之前影响其在大肠杆菌中高效表达的主要因素，因此将其进行同义突变进行改造。同时，为了得到既高效表达有具有很好抗原性的E2蛋白，对BVDV-E2基因编码蛋白的抗原表位进行了预测分析，结果发现在BVDV-E2区中有一段较密集长度为630bp的抗原表位区域，选取该区域片段在大肠杆菌中进行了表达、纯化及功能验证，获得预期的抗原蛋白，为BVDV纳米抗体的筛选及制备奠定了良好的基础。酶联免疫吸附（ELISA）反应通常有两种方式—间接ELISA和双夹心ELISA。这两种方法中其结合在固相载体表面的无论是抗原还是抗体都具有免疫学活性，用于酶标记的抗原/抗体不仅具有免疫学活性，又具有酶的活性。一般首先将被检测物结合到固相载体表面，并使之在其表面进行抗原与抗体的的相互作用，用洗涤的方法分离出抗原-抗体复合物。再加入酶标记物，使其结合于固相载体表面。当加入酶反应底物时，底物被酶催化，从而产生有色物质，这时可通过显色[18]的深浅度进行定性、定量的分析。该方法通过酶的高效催化的特点，从而将相互作用的结果进行间接地放大。本次研究对BVDV-E2的全基因进行分析优化后设计引物并构建原核表达载体，经诱导后在大肠杆菌中表达，蛋白大小为49.5kDa，经Western-Blot验证其具有很好的抗原性，通过间接ELISA对其检测结果说明，抗原与抗体最佳稀释度为1:40/1:80时，其结合效果最佳。20 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究实验二牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体文库的扩增及筛选【摘要】[目的]获得特异性针对牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白的纳米抗体。[方法]对抗BVDV纳米抗体初始文库复苏，将复苏的纳米抗体文库进行辅助噬菌体（M13K07）拯救并扩增。以BVDV-E2作为诱饵蛋白，对拯救后扩增的纳米抗体文库进行三轮―吸附-洗脱-扩增‖亲和筛选，将筛选得到的纳米抗体进行ELISA鉴定并对阳性单克隆进行测序和分析。[结果]经过辅助噬菌体拯救后的文14库滴度约1.6×10cfu/ml，经过三轮―吸附-洗脱-扩增‖的筛选后，得到9个与BVDV-E2特异性结合的阳性单克隆，将测序后的结果进行比对后发现该基因序列与驼源序列有较高的同源性。[结论]通过三轮的亲和淘选实验，得到特异性针对BVDV-E2的单克隆纳米抗体，为研究BVDV的治疗和诊断药物提供了新的技术和方法。【关键词】BVDV-E2；纳米抗体文库；筛选；阳性单克隆纳米抗体(VHH)是一种结构非常简单的抗体，是仅存在于驼科动物和某些软骨鱼类体内的一种特殊的小抗体，又称为重链抗体(heavy-chainantibodies,[55]HCAbs)。由于纳米抗体具有很多优点，比如其体积超级微小以至于可以结合于病毒的包埋表位或者缝隙表位上面。其卓越的穿透力使之可以轻松的穿透组织，此外其容易获得、成本低等优点均是纳米抗体成为近年来热门研究的主要因[47][60]素。纳米抗体的研究为新药物的研制提供了新的技术手段和新的方法思路。本次研究是利用噬菌体展示技术使用诱饵蛋白BVDV-E2抗原表位蛋白对已构建好的纳米抗体文库进行三轮的亲和筛选实验，并将筛选得到的阳性单克隆进行序列测定以及序列的分析，为研制高效特异的抗BVDV的纳米抗体药物提供新思路和新技术平台。1.材料与方法1.1材料1.1.1菌株、抗体本研究所用到的BVDV-E2蛋白、抗BVDV纳米抗体初始文库、抗BVDV骆驼血清均为石河子大学人畜共患病实验室所制备、保存；EcoliTG1、Ecoli2267、辅助性噬菌体M13K07由石河子大学人畜共患病实验室所保存；羊抗驼IgG-HRP、抗E-tag抗体(HRP标记)、抗-M13抗体(HRP标记)均购于abcam公司。21 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究1.1.2试剂低熔点琼脂糖、脱脂奶粉均为进口试剂，葡萄糖、TRIS-HCl、碳酸钠、甘氨酸-盐酸、碳酸氢钠、氨苄霉素、蛋白胨、浓硫酸、NaCl、卡那霉素、丙三醇、20%PEG-NaCl、酵母提取物质、50×TAEBuffer、pH=9.0的PBS、异丙醇、核酸上样液、琼脂粉等试剂均为国产分析纯。1.1.3主要仪器设备PCR仪(TC-512)、制冰机(SIM-F140Y65)、超速离心机(GS-21R)、超低温冰箱(美国Thermo公司)、微波炉(HR-7751MS)、超净工作台(BHC-1300A/B3)、恒温培养箱(SLI-700)、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(北京六一仪器)、恒温摇床(HWY-100B)、凝胶成像仪(Bio-Rad)、电热恒温水槽（DK-8D）、低温冷却液循环泵(DLSB-5L/5)、智能蛋白质多维纯化系统(AKTA-PRIFIER100)、分光光度计（Nano2000）、去离子水生成仪(Bio-Rad)、低温离心机(SICMA2-16K)、电子天平(德国赛多利斯公司)。1.2方法1.2.1扩增与收集辅助噬菌体M13K07，并进行其滴度测定+取大肠杆菌2267于冻存盒中，进行复苏扩增培养（于含有K的高温灭菌过的LB液体的培养基中，过夜），次日，将大量扩增培养液进行转接，观察，当菌液处于生长活力最佳的对数生长期时停止培养。取100μlM13K07保存液侵染1ml对数生长期的2267菌液，37℃恒温温育15min后置于37℃、200rpm摇床中震荡培养30min，将已扩增的菌转接至200ml含葡萄糖和卡那霉素的2xYT培养基中继续37℃、200rpm恒温振荡过夜培养。次日，将过夜扩增复制培养的大量菌液于4℃条件下，进行6500-8000rpm离心大约半个小时，收集上清液；并向上清液中加入其总体积的1/5-2/5的PEG/NaCI溶液，摇匀，冰上放置1.6-2h，用于沉降反应。取出后,将混合液进行4℃条件下的，6500-8000rpm离心大概85-90min，保留沉淀的大量菌体；使用3.5-4mlPBS（PH7.4）将沉淀进行重悬，再将混合物液体进行常温9000-13000rpm离心4.5-5min，最后，将高速离心所分离收集得到的上清液即辅助噬菌体（M13KO7）的大量扩增液，于4℃冻存盒中保存备用。1.2.2抗BVDV纳米抗初始文库的扩增抗BVDV纳米抗初始文库的扩增，主要步骤为：（1）复苏（2）离心（3）沉降（4）离心（5）回收。具体操作如下：首先，将保存的纳米抗体初始文库扩增至对数生长期（OD值约0.4-0.6），向其中加入辅助噬菌体其比例常常控制为20:1，条件为：37℃恒温箱中，静止培养25-35min然后转移至剧烈震荡培养35-45min从而使菌体进行大量复制扩增。然后在4℃条件下，进行离心15-25min，5000rpm，弃掉上清液体。将沉淀吹打起来，转接到同时含有氨苄霉素、卡那霉素和葡萄糖的2×YT液体培养基中，37℃、200rpm过夜恒温震荡培养。次日，4℃离心25min（6000rpm），收集上清液并加入1/5体积的PEG/NaCI混合均匀，22 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究冰上放置2h后4℃离心1.5h（8000rpm），留下菌体沉淀。最后，加入3.5-4ml的PBS(pH7.4)溶液进行重悬沉淀，再将其混合物以9000-12000rpm进行常温离心，大约4.5-5min，收集得到的上清即为纳米抗体文库扩增液，4℃保存用于对扩增的纳米抗体文库进行滴度测定。1.2.3辅助噬菌体M13K07的扩增液以及纳米抗体文库扩增液的滴度测定+首先将冻存的大肠杆菌2267进行复苏，接种到含K和葡萄糖的高压灭菌过的2×YT的液体的培养基中，于37℃恒温中，进行剧烈的振荡扩增培养，大约进行2.5-4.5h，直到对数生长期时停止培养。然后，配制含低熔点琼脂糖的2×YT固体培养基，高压后置于37℃烘干箱内备用。最后用PBS液体将M13K07扩增-1-9液按10-10倍稀释。取一支高压灭菌过的15ml离心管，50μl的M13K07的稀释液，依次加入150μl处于对数生长期的大肠杆菌2267、2ml含低熔点琼脂糖的YT培养基混合均匀后，直接将混合物倒入事先制好的无抗性2×TY下层固体培养基中，待混合液缓缓平铺均匀后，进行封口，并将其培养皿于37℃恒温培养箱中，进行倒置隔夜筛选培养，时间大约为7h。隔日，观察每个稀释倍数下M13K07的培养皿中噬菌斑的生长情况以及记录其噬菌斑的数量。（注意：设置对照组以便对比）文库的滴度测定方法和步骤与之雷同。1.2.4针对BVDV-E2的纳米抗体的筛选筛选过程主要包括以下几部分(1)包被(2)封闭（3)结合文库(4)侵染TG1(5)滴度测定(6)培养（7）第二轮筛选物的收集。具体操作如下：首先用包被液（pH9.6的碳酸盐缓冲液）将BVDV-E2蛋白稀释40倍后进行包被，每孔加入量为200µL，条件为4℃过夜（对照组仅为包被液包被）。第二天，将孔内包被液弃去尽量弃干净，使用洗脱液(1%PBST)对包被孔进行三次的洗涤操作，每孔加入量控制在300µL左右时间控制在3.5-4min，然后使用洁净的吸水纸将洗脱液尽量拍干。加入封闭液(2%PBST与BSA交替封闭)，每孔加如量大约控制在200µL左右，条件为37℃2h。洗涤三次。准备结合文库（注意：文库使用前要经过预处理—100μl文库扩增液与300μl的2%的PBST稀释液，进行混和均匀后，于37℃放置1h），每孔加入已经预处理好的文库大约为200µL左右，150rmp摇床震荡30min，条件为37℃静止温育2h。然后分别使用洗脱液以及10×PBS进行洗涤，次数分别为3-4次，8-10次，每次洗完都用干净的纸巾拍干。为减少第二轮和第三轮筛选时的非特异性结合，应该适当的增加洗涤次数。然后加入200μl对数生长期的EcoliTG1，37℃温育15min后于转移到1.5mlEP管中保存。向其中加入100μl0.2M甘氨酸(pH2.7)进行洗脱，37℃温育10min后再用移液器反复吹打混匀数次。将孔中的液体转移至已加入20μl的1MTris(pH9.1)的1.5mlEP管中进行中和，并用移液器吹打混匀并与前面的菌液进行混合后侵染对数生长期的EcoliTG1。37℃恒温静置-1-430min。从其中取出100μl进行10倍比梯度稀释(10~10)，并将每个梯度液涂23 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究布于含有氨苄霉素和葡萄糖的2×YT固体培养皿上，于37℃的培养箱进行恒温,倒置过夜培养。隔日进行观察，记录菌落个数，进行滴度的测定和筛选输出量计算。将剩余的混合液使用超速离心机进行7000-8000rpm的离心，8-10min，弃上+清留下菌体沉淀，重悬后，涂布于K抗性和葡萄糖、经过高压灭菌的2×YT的固体培养基上，封口，置于37℃恒温箱，隔夜筛选培养。第二日，将培养皿上经过筛选培养的菌落收集起来，将混合液取出适量，接种于同时含有葡萄糖和+K的无菌的2×YT的液体培养基中，置于恒温37℃培养箱振荡培养直至对数生长期。制备下一轮筛选所用的纳米抗体文库扩增液并进行滴度测定，并计算其筛选富集率。（以上为一轮筛选的完整步骤，随着筛选轮数的递增应注意其洗脱强度也应逐轮有所增强，以便于减少非特异型结合的几率。）1.2.5制备筛选后的噬菌体VHH单克隆+将第三轮筛选后长势良好的单克隆菌落挑取96个，接种于同时含有K和葡萄糖的2xYT液体培养基的96深孔板中，恒温的37℃振荡培养。隔日，将大量扩增的菌液转接至新鲜培养基中直至菌液处于对数生长期时停止培养。用M13K07辅助噬菌体侵染该对数生长期的菌液（侵染的M13K07的体积大约为菌液的二十分之一），将混合液首先置于37℃恒温温育30min后，再以200rpm恒温震荡培养。经过26-30min的扩增复制培养后，取出扩增的菌液离心5000-6000rpm，18-20min，弃上清液，重悬沉淀后，置于37℃摇床振荡培养。第二日，6000rpm、4℃离心4min-5min，收集的上清液即VHH-噬菌体的单克隆。1.2.6PhageELISA初步验证经过3轮的特异性亲和筛选实验，将随机挑取的96个单菌落经过M13K07辅助噬菌体拯救并制备噬菌体纳米抗体单克隆后，以其作为一抗（设置M13K07为阳性对照租、PBS阴性对照组），用BVDV-E2为抗原包被蛋白，选用酶标抗M13抗体为二抗（通常都为带有HRP的标记），最终测得的OD492值。1.2.7间接ELISA检测特异针对BVDV-E2阳性纳米抗体具体操作如下：首先用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)将BVDV-E2蛋白进行1:20倍稀释，每孔加入200µL，条件为4℃包被过夜，空白对照为仅含包被液包被。次日，弃去包被液，洗涤三次，每次洗脱时间为3min-5min，每孔加入洗脱液1%PBST约300µL，尽量使用吸水纸将包被孔内液体拍干。向包被孔中加入封闭液（每孔的加入量控制在200-250µL），其条件为37℃的恒温稳定环境中作用大约1.5-2h。然后进行10×PBS的三次洗涤。将可溶性重组单克隆抗体加入封闭过的ELISA板中（预处理：160μl单克隆抗体与40μlPBST混和均匀，进行恒温37℃稳定反应35-40min）大约作用1.5-2h停止。洗涤三次。再用PBS将HRP标记的酶标E-tag抗体浓度稀释为1:5000，每孔加入200μl，37℃作用1h。进行三次的洗涤操作。然后开始进行TMB的显色：向每个孔中加入大约100μl体积的TMB底物显色的溶液，进行恒温37℃稳定显色反应，时间控制在4-15min24 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究此过程严格注意要避光；最后每孔中加入约50μl体积的2M硫酸(H2SO4)溶液，用以对显色反应的终止进行。可以利用酶标仪上测出OD492处的吸光值。1.2.8ELISA阳性VHH抗体噬菌体单克隆的序列测定将阳性单克隆的菌液接种于新鲜的含有葡萄糖和氨苄霉素的2ml2×YT液体培养基中37℃恒温过夜震荡培养。隔日，送生工生物工程股份有限公司对其基因的序列进行测定分析，并对测序的反馈结果使用DNAMAN软件进行拼接处理以及使用NCBI对其进行Blast比对等分析。2.结果与分析2.2扩增后的M13K07以及经拯救后文库的滴度测定13将M13K07进行大量扩增并使用滴度大约为4.2×10cfu/ml的噬菌体保存液-9-10将纳米抗体文库进行复苏及拯救，将拯救后的文库稀释为10、10然后分别测13其滴度。结果M13K07的纳米抗体文库的滴度为：2.3×10cfu/ml123图2.1VHH噬菌体抗体文库的滴度-101：空白对照2：VHH文库扩增液稀释10滴定-93：VHH文库扩增液稀释10滴定；Fig2.1VHHtiterofphageantibodylibrary-101:Control2:DilutedVHHphage10titration-93:DilutedVHHphage10titration;2.3抗BVDV特异性VHH纳米抗体的筛选用BVDV-E2蛋白作为诱饵蛋白，经过三轮―吸附-洗脱-扩增‖的特异性亲和筛选实验，通过观察每轮纳米抗体文库的输入量及产出量从而计算出其回收率与富集度。结果说明其阳性克隆富集度逐轮增加(表2-2)，这是特异性针对BVDV-E2的纳米抗体随着筛选次数的增加得到了有效的富集：回收率=噬菌体输出量(CFU)/噬菌体输入量(CFU)，富集度=后轮的回收率/前轮的回收率。25 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究表2.2筛选过程中噬菌体的回收率Table.2.2Selectiveenrichmentofnanobodiesfromthelibrariesduringpanning筛选轮数噬菌体投入量噬菌体输出量回收率富集度（cfu）（cfu）128-413.31×105.16×101.56×10--105-522.11×106.49×103.08×1019.792-731.73×105.78×103.34×10108.42.4PhageELISA初步验证将3轮筛选得到的纳米抗体进行特异性亲和筛选实验：随机挑取的96个单菌落经过M13K07辅助噬菌体拯救并制备噬菌体纳米抗体单克隆，以其作为一抗（设置M13K07为阳性对照租、PBS阴性对照组），以BVDV-E2为抗原包被蛋白、酶标抗M13抗体为二抗（通常都为带有HRP的标记），最终测得的OD492值以实验组值高于空白对照组值的1.5倍时认为是阳性。因此，我们得到9个可以特异性结合BVDV-E2的纳米抗体（图2-2）。OD492Phageclones图2.3phage-ELISA检测噬菌体单克隆PC：阳性对照；BC：空白对照VHH1-9：第三轮挑取的单克隆Fig.2.3phage-ELISAforphageclonesrandomlypickedfromthethirdroundofpanningPC:PositiveControl;BC:BlankVHH1-9:phageclonespickedfromthethirdroundofpanning2.5间接ELISA检测特异针对BVDV-E2阳性纳米抗体将此9个阳性单克隆，通过IPTG进行诱导、制备出可溶性的重组VHH抗体并以其作为一抗（设置PBS为阴性对照组），用BVDV-E2的抗原表位蛋白做为包被抗原，选用酶标的E-tag抗体作为其相互作用的二抗，再次进行间接ELISA26 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究检测结果表明：9个单克隆抗体中有5个可以特异性的与BVDV-E2蛋白进行结合（图2-3）。OD492Phageclones图2.4phage-ELISA检测噬菌体单克隆BC：空白对照VHH1-9:第三轮挑取的单克隆Fig2.4phage-ELISAforphageclonesrandomlypickedfromthethirdroundofpanningBC：ControlVHH1-9:phageclonespickedfromthethirdround2.6ELISA阳性VHH抗体噬菌体单克隆的序列测定将ELISA检测为得到5个阳性的单克隆，对其进行测序结果显示5个阳性克隆为不同序列的单克隆，对测序结果进行序列比对分析表明筛选的到的单克隆均与驼源性VHH序列有着较高的同源性。CDR1CDR2CDR3图2.5纳米抗体氨基酸序列比对Fig2.5comparingofthesequencesofnanobodies27 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究3.讨论本实验选取BVDV中主要抗原BVDV-E2表面的主要抗原决定簇蛋白为诱饵[53]抗原，利用ELISA反应中可灵敏检测抗原-抗体间相互作用的原理，将构建的文库中的特异性功能性抗体筛选出来，在筛选过程中，我们利用噬菌体展示技术，将文库中的蛋白进行噬菌体表面的表达展示，利用噬菌体表面展示技术时为了提高其效率，在筛选过程中要注意减少非特异性的结合，作为靶分子的血清需要被纯化为高纯度的IgG或IgM等，并且其纯度应该大于90%为好，若抗体的校价[60]较高，则可以适当的降低其要求。同时靶分子的结果在筛选过程中也决定其效果，对于某些结构相对简单、惰性的生物活性物质的筛选的难度一般比较大，因此在筛选中常常采用脱脂奶粉与BSA交叉封闭。在筛选过程中，每个步骤过后的清洗过程也在很大程度上影响着最终效果，传统的清洗试剂一般为PBST，在实际筛选过程中可以将第一轮筛选时的PBST的浓度调至0.05%，然后以后每轮浓度在逐渐进行增加，但是若发现富集率比较低，那么浓度增加不能太多。此外，使用酸性物质对结合的复合物进行洗脱的时候要注意其温和性以及时间的格[52]控制，尤其要注意在使用酸性溶液洗脱后要进行中和，使其最终为中性。在筛选过程过后，噬菌体的克隆得到了大量的富集，这时常常需要进行其单克隆的特异性功能的验证，一般采用竞争性ELISA来进行，通过抗原蛋白与噬菌体富集产物在固相板表面相互作用后，利用酶标记的M13抗体进行其显色后，进行检测，这样只需将检测的阳性单克隆进行测序分析即可，从而大大减少测序中的数目及增大测序的成功率。28 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究实验三针对BVDV-E2的纳米抗体原核表达、纯化及抗病毒的初步观察摘要：[目的]获得特异针对BVDV-E2蛋白的高效表达且可溶性好的纳米抗体VHH蛋白。[方法]应用引物设计软件Primer5.0设计VHH引物，利用PCR技术克隆该基因，构建原核表达载体pGEX-4T-VHH，并转化至大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测诱导表达蛋白，经镍柱分离纯化；将纯化的纳米抗体蛋白VHH分别进行结合能力检测和细胞内的中和病毒能力检测。[结果]成功克隆VHH基因，得到一个原核表达载体pGEX-4T-VHH，并在大肠杆菌中高效表达，ELISA证实该VHH蛋白能与BVDV-E2蛋白特异性结合，细胞实验说明VHH可中和BVDV。[结论]获得大小为44kDa的VHH蛋白，该蛋白对病毒复制有一定的抑制效果。关键词：VHH，表达，间接ELISA近年来随着对抗体的研究的不断深入，纳米抗体正在不断的发展，并且已经越来越受到学者们的亲睐。我们利用诱饵抗原在纳米抗体文库中筛选得到的纳米抗体称之为单价纳米抗体，单价纳米抗体获得容易，稳定性强、亲水性好、结合[69]能力强。酶联免疫吸附（ELISA）反应中有一种类型为双抗体夹心ELISA。通过这种方法将其具有免疫学活性的抗原以及抗体进行结合在固相载体表面上，这种方法检测灵敏度高、精确度好，通常将被抗体先固定于固相载体表面，将其与目标活性抗原进行结合后在与抗体进行第二次结合的相互作用，通过用洗涤将抗原-抗体的复合物进行分离后，加入酶标抗体物质，显色后，通过测量的数据进行定性、[68]定量的分析。从而可以判断抗原与抗体是否发生了特异性的结合。BVDV分为致细胞病变的与非致细胞病变类型的两种，当致细胞病变型的BVDV侵染MDBK细胞时细胞便会发生一系列的细病变，但如果纳米抗体与BVDV结合并使其被中和，则细胞形态将保持不变，因此通过细胞的形态变化情[11]况可以判断出纳米抗体是否对BVDV有中和效果。通过Prmer5.0根据筛选得到的纳米抗体的基因片段进行设计引物，再根据PCR技术扩增基因片段、构建原核表达载体并表达，最终得到高效表达的纳米抗体蛋白，将得到的高纯度的纳米抗体蛋白进行双抗体夹心方法进行与特定抗原的特异性结合实验，并通过与BVDV相互作用后侵染细胞得出纳米抗体是否有中和BVDV的效果。本次实验为针对BVDV-E2蛋白的纳米抗体功能的验证及研究提供材料准备。29 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究1.材料与方法1.1材料1.1.1实验材料大肠杆菌克隆菌株E.coliDH5α、大肠杆菌表达菌株E.coliBL21(DE3)均由石河子大学人畜共患病实验室保存；pMD19-T(simple)载体，原核表达载体pGEX-4T-1均购自TAKARA公司。1.1.2试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNAMarker均购自TaKaRa公司；PCRMix、蛋白Marker、质粒DNA小量提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自北京康为世纪生物有限公司；其余试剂均为国产或进口分析纯。1.1.3仪器PCR仪(TC-512)、超净工作台(BHC-1300A/B3)、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(北京六一仪器)、恒温摇床(HWY-100B)、恒温培养箱(HIQ-X100)、凝胶成像仪(Bio-Rad)、电热恒温水槽（DK-8D）、智能蛋白质多维纯化系统(AKTAPRIFIER100)、分光光度计（Nano2000）。1.1.4培养基LB液体培养基：1g/100ml蛋白胨，1g/100mlNaCl,0.5g/100ml酵母提取物。LB固体培养基：1g/100mlNaCl,1g/100ml蛋白胨，0.5g/100ml酵母提取物，1.5%琼脂粉。1.2方法1.2.2引物设计根据纳米抗体VHH目的基因序列以及pMD-19-T克隆载体的基因序列、pGEX-4T-1表达载体的多克隆位点（MCS）的序列，运用Primer5.0等软件设计其上游及下游引物（VHH-F/VHH-R）。上游引物的酶切位点为EcoRI，下游的酶切位点为HindIII。引物序列如下：VHH-F：GAATTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGG(EcoRI)VHH-R：AAGCTTTGCGGCACGCGGTTCCA(HindIII)引物合成及测序服务由上海祥音生物完成。1.2.3BVDV-E2基因的扩增、克隆及鉴定以菌液质粒为模板，进行PCR反应。采用20μl反应体系，充分混匀。组分体积Mix10μlddH2O7μl模板2μl上游引物0.5μl下游引物0.5μl30 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究按PCR以下条件设置程序：步骤条件预变性95℃4min变性94℃30s退火64℃30s上延伸72℃1min下总延伸：72℃10min保存4℃扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将产物进行回收纯化。将VHH基因的PCR扩增产物与pMD-19-T载体进行连接，条件为16℃水浴过夜。第二天下午，将连接产物转化至活性好的DH5α感受态细胞中，摇菌1h，之后离心并将其涂于含氨苄霉素抗性的LB培养基平皿上，于恒温培养箱中倒置、37℃过夜培养。次日，进行菌液PCR鉴定，筛选出阳性单克隆，进行质粒小提和双酶切（EcoRI/HindIII）鉴定。将鉴定正确的重组载体pMD-19-T-VHH序列测定（均送至上海生工）。1.2.4构建及鉴定pGEX-4T-VHH重组表达载体将重组质粒pMD-19-T-VHH和表达载体pGEX-4T-1分别进行双酶切（EcoRI/XhoI），质粒双酶切。并对酶切成功的片段进行回收及纯化。将获得的两端具有粘性末端的VHH的DNA片段和pGEX-4T-1基因片段进行连接。次日，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，并均匀的涂于含氨苄霉素抗性的LB培养基皿上，进行倒置37℃过夜培养。次日挑取生长良好的转化菌落进行菌液PCR筛选鉴定，并将筛选得到的阳性菌进行质粒小提，将质粒转化入表达菌BL21（DE3）感受态细胞内，涂于含氨苄霉素抗性的LB培养基平皿上，37℃恒温过夜培养，次日进行筛选。酶切鉴定后的重组表达载体即为pGEX-4T-VHH。1.2.4.1pGEX-4T-VHH重组表达载体双酶切双酶切反应10μl体系：组分体积EcoRI1μl、HandIII1μlBuffer1μl目的质粒3.5μl载体质粒3.5μl质粒。按照10μl酶切体系加入并混匀各组分后进行短暂离心，并将于37℃水浴酶切3h-4h，将酶切产物与2μl10×核酸上样液充分混和均匀后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。31 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究1.2.4.2构建重组表达载体将回收的酶切片段与表达载体PGEX-4T-1连接，采用20μl反应体系：组分体积目的片段12μl、PGEX-4T-1片段5μlT4DNABuffer2μlT4DNA连接酶1μl依次加入各组分及充分混和均匀后于16℃水浴中过夜进行连接。1.2.4.3转化重组表达载体至感受态细胞将感受态细胞置于冰上，待其融化后，加入连接产物并充分混和均匀;于冰上放置半小时后热击90s，温度为42摄氏度，取出后于冰上静置5min，再向其加入800μl-900μl无抗性的液体LBB培养基，置于37℃恒温培养箱中震荡60-90min左右，取出后以12000r/min离心120s，弃上清，将菌体涂于含氨苄霉素的培养皿上于37摄氏度恒温箱中过夜倒置培养；1.2.5诱导大肠杆菌中VHH蛋白的表达将20μlpGEX-4T-VHH表达载体接种到20ml含有氨苄抗性的液体LB的培养基中，37℃230r/min震荡恒温过夜培养。次日，吸取200μl菌液接种20ml含氨苄抗性的液体LB中，37℃恒温230r/min震荡培养，菌体生长至对数生长期（约为0.4-0.6OD）时加入IPTG（终浓度为1.0mmol/L），继续震荡扩增培养至8h时收集菌液。1.2.6SDS-PAGE实验将菌液进行8000rpm离心15min，收集菌体并与80μl去离子水、20μl上样缓冲液混匀后金属浴或水浴锅水浴10min，然后SDS-PAGE过夜电泳实验，检测菌液是否表达。1.2.7纯化并浓缩VHH蛋白取3ml的菌液加入至600ml的含有氨苄霉素的LB液体培养基中，37度摇床培养1.5h左右，直至菌液达到对数生长期为止（OD600≈0.4-0.8），加入终浓度为1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对菌体进行诱导表达。诱导时间为6.5-8h，然后以8000rpm进行4℃离心15min，收集大量菌体后，加15ml的LysisBuffer4℃过夜进行菌体的裂解。次日，将已裂解的菌体于液氮中和42水浴锅中进行反复冻融三次，然后超声裂解两个循环（90次/周期每次10s，间歇10s），直至菌体变得透明清亮为止，然后进行6000rpm、4℃离心15min，保留上清液并将其以9000rpm、4℃离心25min。通过0.45μm滤膜过滤处理，将其吸入到清洗的Ni柱中（1ml镍柱加入4ml菌液），放置在摇床上冰浴结合1.5h，然后取出Ni柱以800rpm离心2min并收集上清留作SDS，加入4mlWashBuffer将柱子清洗三遍后再以800rpm离心2min，同时收集上清留作SDS，最后加入1ml32 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究的ElutionBuffer清洗四遍并收集上清液（目的蛋白存在于ElutionBuffer中），将最终的上清液放入透析袋中，利用蔗糖对蛋白进行浓缩。1.2.8双抗体夹心间接ELISA实验使用碳酸盐包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)将纳米抗体蛋白进行稀释，每孔加入200µL，条件为4℃包被过夜，空白对照为仅含包被液包被。次日，弃去包被液，洗涤三次，每次洗脱时间为3min-5min，每孔加入洗脱液1%PBST约300µL，并用吸水纸拍干。加入封闭液，每孔加入200µL，条件为37℃2h。然后用PBS洗涤三次。将稀释过的BVDV-E2蛋白加入封闭过的ELISA板中恒温37℃2h。洗涤三次。将稀释过的纳米抗体蛋白再次进行结合37℃1.5h，再用PBS洗3次，将HRP标记的酶标E-tag抗体浓度稀释为1:5000，每孔加入200μl，37℃作用1h。洗涤三次。进行TMB显色：每孔加入100μlTMB底物显色溶液，37℃15min避光显色。最后每孔中加入50μl2M硫酸(H2SO4)，以终止显色反应。可以利用酶标仪上测出OD492处的吸光值。1.2.9细胞水平验证其中和病毒的实验1.2.9.1MDBK细胞的培养（1）细胞的复苏：取出冻存于液氮内的MDBK细胞，置于盛37℃温水中不停晃动，使冻结的细胞化开，然后将已经化好的细胞转移至含有4ml的DMEM细胞培养液（含10%FBS）的15ml离心管中，进行800r/min离心5min。弃上清，将剩余的细胞沉淀用1mlDMEM培养液吹打重悬并转移细胞液至60mm细胞培养板中，补充3ml细胞培养液使之有充足的营养供应，最后将培养皿置于含5%CO2、37℃的饱和湿度培养箱中行细胞培养。（2）细胞的传代：待细胞接近95%铺满细胞培养板并且仍呈单层状态生长时，培养液用移液器弃去，用PBS清洗细胞培养板3-4次，加入含0.02%EDTA-Na2的胰酶约90s，消化细胞，当通过显微镜可观察到细胞间隙增大并且细胞形态变圆变亮时，加入1mlDMEM培养液进行终止消化过程，将细胞板上的细胞吹打下来并于15ml离心管中进行800r/min离心5min后弃上清，加入约3mlDMEM培养液重悬并混匀细胞，进行分装传代培养。1.2.9.2病毒的收集及其浓缩首先，生长状态良好的MDBK细胞，待其生长密度接近70%-80%时，弃去DMEM培养液，用PBS清洗细胞板4次并接种病毒（DMEM：BVDV=10:1），封板后置于含5%CO2、37℃的饱和湿度培养箱中使病毒吸附细胞大约2h后，弃去培养液并加入含有2%胎牛血清的DMEM，封板，继续进行细胞培养，观察，待细胞病变达到80%以上时将细胞于-80摄氏度反复冻融3次，使病毒得到完全的释放，收集病毒并以1000r/min离心5min，通过0.45μm滤膜过滤后，于-80℃保存，浓缩时通常使用Millipore超滤管进行，将0.45μm滤膜过滤后的病毒于超滤管中进行4℃、5000r/min离心1h，当浓缩液体积达1ml时将浓缩液混匀即可。33 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究1.2.9.3纳米抗体中和病毒的实验（1）将纯化的纳米抗体蛋白使用PSB进行稀释，再将稀释液与BVDV和PBS的稀释液按照2:1的比例于15ml离心管中充分混合，将其封闭后置于37℃恒温培养箱中温育60min，作为实验组备用。（2）将骆驼阳性血清使用PSB进行稀释，再将其稀释液与BVDV和PBS的稀释液同样按照2:1的比例于15ml离心管中充分混合，将其封闭后置于37℃恒温培养箱中温育60min，作为阳性对照组备用。（3）将BVDV浓缩液使用PSB进行稀释，再将其稀释液与和PBS液同充分混合，将其封闭后置于37℃恒温培养箱中温育60min，作为阴性对照组备用。（4）取出温育后的每组混合液，将每组混合液分别侵染生长状态良好的MDBK细胞（处于70%铺满细胞板的数量），并设置阴性对照组（仅BVDV）阳性对照组（骆驼阳性血清与BVDV温育混合物）同时侵染MDBK细胞。次日，观察细胞的病变情况。2.结果与分析2.1VHH基因扩增及双酶切鉴定结果PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测得到约480bp，与预期结果相符，结果如图2.1，说明VHH基因扩增成功。BamHI/XhoI双酶切pMD19-T-VHH载体，得到480bp的片段，与预期结果相符，如图2.2。图2.1VHH基因PCR鉴定Fig2.1IdentificationofVHHgenebyrestriction1-3：E2基因PCR结果；-：阴性对照；M：DL10001-3：ResultofE2genebyPCR;-:nagtivecontrol;M：DL100034 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究图2.2pMD19-T-VHH重组质粒双酶切鉴定1：BamHI/XhoI双酶切产物；2：pMD19-T-VHH质粒对照M：DL2000Fig.2.2IdentificationofpMD19-T-VHHbyrestriction1:ProductsofpMD19-T-VHHwithBamHI/XhoIdigestion;2:pMD19-T-VHHPlasmidcontrol;M:DL20002.2SDS-PAGE结果：将VHH表达菌进行SDS-PAGE电泳后可以看到44KD的蛋白，说明目的蛋白已经表达。123M44KD图2.3pGEX-4T-VHH重组质粒的蛋白表达鉴定Fig2.3ProteinexpressionofpGEX-4T-VHHrecombinantplasmidM：蛋白Marker,1-2：pGEX-4T-VHH菌体表达蛋白,3：pGEX-4T-VHH纯化蛋白；,1-2:pGEX-4T-VHHrecombinantprotein,3:Puriedprotein35 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究2.3双抗体夹心间接ELISA鉴定结果经过双抗体夹心验证得出：VHH可以很好的与BVDV-E2结合。图2.4纳米抗体与抗原蛋白结合能力的验证Fig2.4Verificationofthebindingabilityofnanobodyandantigenprotein2.4细胞水平验证其中和病毒的能力检测通过实验组：VHH与BVDV作用后侵染MDBK细胞、阳性对照组：将骆驼阳性抗体与BVDVNADL作用后侵染MDBK细胞、阴性对照组：PBS与BVDV作用后侵染细胞的实验结果图（图2.4），可以看出：阴性对照组出现明显的病毒噬斑，阳性对照与实验组病毒噬斑不明显，显微镜下五个视野中噬菌斑的数量（图2.5），进一步说明：VHH能够中和BVDV从而达到对细胞的保护作用。ABC图2.5纳米抗体中和病毒能力的初步验证A：阴性对照组;B：阳性对照组;C：BVDV实验组Fig2.5VerificationofthebindingabilityofnanobodyandBVDV;A:NegtiveControl;B:PositiveControl;C:BVDVexperimentgroup36 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究表2.1五个视野中的噬斑数量Table2.1Plaquenumberinthefieldoffivevisions噬斑数量视野噬斑数量视野噬斑数量视野噬斑数量视野噬斑数量视野平均值12345阴性对照563529532639.8阳性对照101619131811.2BVDV实验15.41616171216组454035噬斑30平25均20数15量1050阴性对照阳性对照BVDV实验组图2.6视野中噬菌斑的数量Fig2.6Plaquenumberinthefieldoffivevisions2.5RT-PCR验证VHH-A6纳米抗体对病毒复制的抑制效果将VHH进行梯度稀释，并将纳米抗体与BVDV孵育1.5-2h后，转接至MDBK细胞，分别在培养48h、72h后，收集细胞，提取病毒总RNA，利用相同浓度的总RNA进行cDNA反转录，使用荧光染料法进行实时定量PCR，即采用绝对定量的方法测定BVDVNADL病毒拷贝数，从而确定不同剂量的VHH纳米抗体对BVDV复制的阻断效果。如图2-6所示，为BVDV-NADL病毒液E0基因的扩增曲线与熔解曲线。通过E0基因标准曲线及拷贝数公式计算不同含量VHH纳米抗体组的病毒拷贝数(表2.2)，利用SPSS软件对数据进行处理分析，结果显示100μg/mL的VHH对MDBK细胞内BVDV的复制有一定的阻断效果，具有中和部分病毒的能力(图2.6)。37 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究图2.7BVDVE0基因的扩增曲线与熔解曲线Fig.2.7AmplificationcurvesandmeltingcurvesofE0geneofBVDV表2.2不同剂量纳米抗体对病毒复制拷贝数的影响Table2.2theeffectonBDVDreplicationcopynumberbydifferentdosesofVHHNanobodies11病毒拷贝数（10copies/mL）组别NCPC5μg/μL25μg/μL50μg/μL100μg/μLaccb48h7.74±0.147.39±0.197.73±0.097.67±0.097.39±0.077.43±0.55ac72h7.74±0.047.39±0.017.40±0.087.38±0.087.39±0.087.37±0.02注：同行数据肩表相同小写字母表示差异不显著（P﹥0.05）；肩表相邻小写字母表示差异显著（P﹤0.05）。Thesamepeerdateshouldermarkedthesamelowercaselettersdifferencewasnotsignificant（P﹥0.05）；ShouldermarkedadjacentlowercaseletterssignificantdifferencethesamelowercaselettersdifferenceP﹤0.05）.10病100100毒#######5050拷8**************贝2525数655（1011PCNCcopies/mL4NCPC20）48h72h图2.8不同剂量纳米抗体对病毒复制拷贝数的影响Fig.2.8theeffectonBDVDreplicationcopynumberbydifferentdosesofVHHNanobodies38 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究3.讨论利用噬菌体展示技术将文库中特异性的纳米抗体进行亲和性筛选得到的纳米抗体往往具有较高特异性，可识别位于病毒表面、病毒缝隙甚至被包埋的病毒抗原表位的功能，也可以说纳米抗体具有比传统抗体更加优越的结合能力和优势，从而高效率的高靶向性的结合于目标病毒，从而达到中和病毒或者抵抗病毒[72]侵染的功效。目前在很多疾病的治疗中，纳米抗体扮演着重要的角色，对于传统的抗体而言其无法在细胞内进行表达、无法与细胞内的一些蛋白进行结合发挥作用。但是[64]纳米抗体不仅可以在细胞核、细胞质还是内质网上进行发挥作用。通过酶联免疫吸附（ELISA）反应中的双抗体夹心ELISA。利用其检测高灵敏度、高精确度的特点，通常将具有活性的纳米抗体与靶蛋白进行两次结合后通过加入酶标抗体物质，进行显色反应后，通过测量判断其抗原与抗体是否发生了[48]特异性的结合。利用这种方法时，其抗体的浓度和抗原的浓度一定要进行梯度式的设定，并且二者必须是纯度较高的蛋白，否则将造成结合效率低等后果。另外，温育的时间和洗涤强度也会影响该实验的结果。利用致细胞病变型的BVDV侵染MDBK细胞对纳米抗体的功能性进行检测时，为保证纳米抗体始终具有酶的活性，因此在纳米抗体与BVDV作用时要掌控时间以及作用浓度，以保证纳米抗体对BVDV彻底中和，通过对病变细胞和正常细胞之间的形态、噬菌斑数量以及实时定量PCR检测病毒拷贝数变化等方法，从而判断出纳米抗体的功能。纳米抗体以其稳定性好、靶向性强、天然、无毒副作用、体积小、亲和性好[85]等优势，成为很多靶向药物的开发研究材料；通过针对BVDV多抗原表位的纳米抗体噬菌体文库的构建、并利用高亲和力的筛选办法筛选得到天然的、亲和[98]性较高的纳米抗体。为靶向BVDV的药物的研发以及疫情的控制防治办法提供新方法。39 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牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究结论、1.对BVDV-E2的全基因进行分析优化后设计引物并构建原核表达载体，经诱导后在大肠杆菌中表达，蛋白大小为49.5kDa，经Western-Blot及ELISA验证其具有很好的抗原性且抗原与抗体佳稀释度为1:40/1:80时结合效果最佳。2.以BVDV-E2抗原表位蛋白作为诱饵抗原蛋白，利用噬菌体展示技术对抗BVDV噬菌体纳米抗体文库进行淘选，经过三轮的亲和筛选使文库中特异性针对BVDV-E2的单克隆得到了较高程度的富集，通过间接ELISA检测出5个特异性结合BVDV-E2的阳性单克隆，通过对其基因序列进行比对分析说明该5个序列均与驼源重链抗体序列有着非常高的同源性。3.根据测序分析得到的纳米抗体序列进行引物设计，通过PCR技术将基因片段扩增，并成功构建原核表达载体pGEX-4T-VHH，通过纯化和浓缩得到高纯度的纳米抗体蛋白，大小约44KDa。通过对该纳米抗体蛋白的双抗体夹心ELISA检测，说明其能与BVDV-E2抗原表位蛋白很好的结合，通过细胞实验说明该纳米抗体蛋白能在一定程度上中和病毒从而保护细胞。47 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究创新点1.克隆牛病毒性腹泻病毒（BVDV）囊膜蛋白优化的E2抗原表位基因序列，构建原核表达载体，并且获得了纯化的蛋白。2.通过噬菌体展示技术筛选到特异性针对BVDV-E2的纳米抗体，并且成功构建原核表达载体，并获得了纯化的纳米抗体蛋白。48 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究致谢本文是在导师陈创夫教授、盛金良副教授的悉心指导下完成的，从论文的选题、试验方案的设计、资料的收集和整理、论文的撰写与修改都倾注了两位导师辛勤的汗水和心血。导师严谨的治学态度，渊博的专业知识、执着的科研精神，严谨求真的学术风范是我学习的楷模，将成为我以后工作的潜动力，受益终身。三年来，两位导师在学业上给予的谆谆教诲，在生活中的热情关怀，令我难以忘怀。至此论文完成之际，谨向两位辛勤的恩师致以最诚挚的谢意；感谢张辉老师对我的科研上的帮助，为我顺利完成本论文提供有力的保障和指导、建议；感谢李天森博士、张国奇硕士、李尤简硕士在实验过程中给予的帮助和指导；感谢所有科技楼2013级硕士们实验上的帮助，感谢你们给予生活上的鼓励，我会一如既往的努力奋斗下去；感谢人畜共患病重点实验室中所有的师弟师妹，你们的帮助和鼓励，使我度过了三年难以忘怀的研究生生活；感谢生命科学学院、动物科技学院的领导和老师在三年研究生学习期间给予的学习和生活上的帮助和关心；感谢父母和朋友对我的支持和鼓励，因为有他们无私的帮助，才使我能够集中精力投入到课题研究中；再次感谢所有关心、帮助我得老师、同学和朋友。黄美玲2016年6月49 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究作者简介黄美玲，女，汉，生于1990年2月，中共党员，籍贯吉林通化。2013年7月毕业于通化师范学院，获得学士学位；同年9月考入石河子大学生命科学学院攻读硕士学位，专业为生物化学与分子生物学，研究方向为动物基因工程。硕士研究生期间发表的主要论文：黄美玲，陈创夫等.牛病毒性腹泻病毒E2抗原表位表达及验[J].生物技术.2016,26(2):152-157.张国奇,黄美玲,陈创夫,盛金良,牛病毒性腹泻病毒纳米抗体文库的构建与鉴定[J].西北农业学报.2015,4(3):20-25.硕士研究生期间参加的主要课题研究：课题名称:国际合作项目（牛病毒性腹泻/粘膜病防治新技术），课题编号:2013DFR309。50 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白纳米抗体筛选及其功能的初步研究石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表研究生姓名黄美玲学制3年生物化学与分专业研究方向动物基因工程子生物学学术评语:本研究对标准株牛病毒性腹泻病毒BVDV-E2基因全序列进行分析，发现其中包含大量的大肠杆菌稀有密码子以及疏水结构区，将其进行同义突变改造。同时，在此基础上对BVDV-E2基因编码蛋白的抗原表位进行预测分析。发现在BVDV-E2区中有一段较密集长度为630bp的抗原表位区域，选取该区域片段在大肠杆菌中进行表达、纯化及功能验证，显示获得预期的抗原蛋白；利用噬菌体展示技术，将构建的BVDV纳米抗体文库进行辅助13噬菌体（M13K07）的重新拯救并大量扩增，经过拯救及扩增后的文库大约为1.34×10cfu/ml。然后进行三轮的特异性亲和筛选，对筛选得到的单克隆进行序列测定及分析。BVDV-E2纳米抗体的筛选得到阳性单克隆。将阳性单克隆进行序列测定分析及比对，确定序列为驼科重链抗体片段；对分析成功的序列进行设计引物、并利用PCR技术对基因片段进行大量扩增，构建pEGX-4T--VHH原核表达载体，通过SDS-PAGE实验对目的蛋白进行检测并通过Ni柱将表达的蛋白进行纯化，然后进行蛋白的透析、浓缩。结果BVDV-E2蛋白纳米抗体在原核系统中成功表达获得大小为49.5KD的蛋白并纯化；利用双夹心ELISA对纳米抗体结合性验证，通过病毒侵染MDBK细胞进行功能的初步验证。结果表明纳米抗体中和病毒功能的验证结果显示纳米抗体蛋白可以中和病毒从而保护MDBK细胞不被破坏。本实验利用原核表达的BVDV-E2抗原表位蛋白，成功的从已构建好的抗体文库中筛选得到特异性针对BVDV-E2的纳米抗体，该纳米抗体能够中和BVDV，在一定程度上保护MDBK细胞避免发生病变，为研究BVDV的治疗以及防治奠定了非常重要基础。综上表明，该生理论基础知识扎实，动手能力较强，熟悉本研究的国内外动态，具有一定独立从事科研工作的能力。达到了硕士学位论文水平，同意通过学位论文答辩，建议授予硕士学位。指导教师签字:年月日51