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１０１８３分类号：Ｒ３７２单位代码：研究生学号：２０１５７１２００３密级：公开吉林大学硕士学位论文学术学位（）蒲公英总黄酮对香烟烟雾所致慢性阻塞性肺疾病的抗氧化损伤作用及机制研究ＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＥｆｆｅｃｔｓａｎｄＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＴａｒａｘａｃｕｍｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ－ＦｉｒｅｔｔｉｎｒｉｃｓｔｒｕｃｔｉｖｅｌａｖｏｎｏｄｓｏｎＣｉｇａｅＳｍｏｋｅｄｕｃｅｄＣｈｏｎＯｂＰｕｌｍｏｎａｒＤｉｓｅａｓｅｙ作者姓名：陈芳专业：微生物研究方向：感染与免疫指导教师：王放教授培养单位：吉林大学基础医学院２０１８年４月 蒲公英总黄酮对香烟烟雾所致慢性阻塞性肺疾病的抗氧化损伤作用及机制研究ＡｎｔｉｉｏｘｄａｎｔＥｆｆｅｃｔｓａｎｄＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＴａｒａｘａｃｕｍ－ｍｏｎｇｏＵｃｕｍＦｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｎＣｉｇａｒｅｔｔｅＳｍｏｋｅｉｎｄｕｃｅｄＣｈｒｏｎｉｃＯｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅＰｕｌｍｏｎａｒｙＤｉｓｅａｓｅ作者姓名：陈芳专业名称：微生物学指导教师：王放教授学位类别：理学硕士答辩日期：年ｉｒ月砌日 未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行＼出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体。，均己在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：曰期１＃年：２＾：月＾曰 中文摘要蒲公英总黄酮对香烟烟雾所致慢性阻塞性肺疾病的抗氧化损伤作用及机制研究慢性阻塞性肺疾病（Chronicobstructivepulmonarydisease，COPD）是一种以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，气流受限以不完全可逆、进行性加重为特征，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的慢性炎症及氧化应激反应有关，COPD已成为全球第三大致死病因，目前尚无有效的治疗手段，且其发病机制尚仍未明晰。因此，进行防治COPD的药物研发工作势在必行。蒲公英作为一种药食同源的中草药，富含黄酮类、倍半萜类及酚酸类等多种化学成分，相关研究证实蒲公英根与茎叶总黄酮类提取物有明显的抗炎和抗氧化等生物活性，故本课题组旨在通过构建香烟烟雾所致的慢性阻塞性肺疾病小鼠模型和细胞氧化损伤模型，进行蒲公英根与茎叶总黄酮类提取物的抗氧化损伤作用及其机制研究。【方法】首先通过DPPH法、ABTS法自由基清除实验检测蒲公英根部总黄酮和茎叶总黄酮的自由基清除能力；采用CSE刺激建立细胞氧化损伤模型，以MTT法测定CSE对人肺癌上皮细胞系A549的细胞活性的影响：实验分组为正常对照组（CON），香烟提取物组（CSE），蒲公英根总黄酮低剂量组（Root-LD）、蒲公英根总黄酮高剂量组（Root-HD）、蒲公英茎叶总黄酮低剂量组（Leaf-LD）和蒲公英茎叶总黄酮高剂量组（Leaf-HD）；分别检测各给药治疗组对活性氧（ROS）和氧化因子LDH、MDA、GSH和SOD水平的影响，并通过RT-PCR和westernblot检测药物对Nrf2信号通路的激活作用。其次构建香烟烟雾暴露12周诱导COPD小鼠模型，实验分组为正常对照组（CON），香烟烟雾组（CS），蒲公英根总黄酮低剂量组（Root-LD）、蒲公英根总黄酮高剂量组（Root-HD）、蒲公英茎叶总黄酮低剂量组（Leaf-LD）和蒲公英茎叶总黄酮高剂量组（Leaf-HD）；分别检测各组小鼠肺功能相关指标，包括气道阻力(Raw)、动态肺顺应性(Cdyn)和第0.1I 秒用力呼气容积（ForcedExpiratoryVolumein100ms，FEV0.1）等相关参数；同时收集小鼠肺组织，检测肺部氧化因子MDA、GSH和SOD水平，RT-PCR检测Nrf2信号通路的激活作用，并进行HE染色和免疫组化法测定8-OHdG和Nrf2信号通路相关蛋白表达水平。【结果】1.蒲公英根总黄酮和茎叶总黄酮的DPPH自由基清除率EC50值分别为54.88μg/mL和123.50μg/mL，ABTS自由基清除率EC50值分别为229.41μg/mL和559.07μg/mL。2.CSE为10%~30%的浓度对细胞存活率无明显影响。3.蒲公英总黄酮分别下调了A549细胞氧化损伤模型和CS诱导的小鼠COPD模型中的氧化损伤因子ROS、LDH、MDA及8-OHdG，同时增加GSH和SOD抗氧化因子的水平，且以Leaf-LD和Leaf-HD组效果显著。4.肺部HE染色结果显示，蒲公英总黄酮能显著抑制了CS诱导的COPD模型的炎症反应，且以Leaf-LD和Leaf-HD组效果明显。5.蒲公英总黄酮能改善小鼠Cdyn及FEV0.1等肺功能检测指标，同时降低Raw，且以Leaf-LD和Leaf-HD组效果显著。6.在体内外实验中，蒲公英总黄酮上调Nrf2、SOD1和HO1的mRNA水平和蛋白表达，从而发挥抗氧化作用，且以Leaf-LD和Leaf-HD组效果明显。【结论】基于上述结果，本研究揭示了蒲公英根总黄酮与茎叶总黄酮对香烟烟雾所致慢性阻塞性肺疾病中的抗氧化损伤作用及其作用机制，即通过上调Nrf2、SOD1和HO1，增强内源性抗氧化因子的表达量，从而抑制ROS等氧化剂的产生，减弱肺部氧化损伤和炎症反应，改善肺功能。为临床进一步筛选新型有效防治COPD药物提供实验基础。关键词：蒲公英总黄酮；慢性阻塞性肺疾病；氧化损伤；肺功能；Nrf2II AbstractAntioxidantEffectsandMechanismofTaraxacummongolicumFlavonoidsonCigaretteSmoke-inducedChronicObstructivePulmonaryDiseaseChronicobstructivepulmonarydisease(COPD)isthethirdfataldiseaseintheworld,characterizedwithpersistent,incompletereversibleandprogressiveaggravatedairflowlimitation.Cigarettesmokeandharmfulparticleshavebeenconsideredasimportantfactorscausingchronicinflammationandoxidativestressreaction.Sincecurrently,thereisnoeffectivetreatmentforCOPDbecauseofitsunclearpathogenesis,moreattentionshouldbepaidondevelopmentofeffectivenewdrugswithmulti-targetsandmulti-pathways.AsamedicineandfoodhomologousChineseherbalmedicine,taraxacummongolicumisrichinflavonoids,sesquiterpenoids,phenolicacidsandotherchemicalcomponentswithanti-inflammatoryandanti-oxidationbiologicalactivity.Thus,thepurposeofthisstudywastoinvestigatetheantioxidativeeffectsoftotalflavonoidsoftaraxacummongolicumoncigarettesmoke-inducedchronicobstructivepulmonarydiseases.Methods:ThefreeradicalscavengingcapacityoftotalflavonoidsinstemleafandrootoftaraxacummongolicumwasdetectedbyDPPHandABTSfreeradicalscavengingexperiments.Sixgroupsweredividedinthisstudy,normalcontrolgroup(CON),cigaretteextractgroup(CSE),low-dosetotalflavonoidsinrootoftaraxacummongolicumgroup(Root-LD),high-dosetotalflavonoidsinrootoftaraxacummongolicumgroup(Root-HD),low-dosetotalflavonoidsinstemleafoftaraxacummongolicumgroup(Leaf-LD)andhigh-dosetotalflavonoidsinstemleafoftaraxacummongolicumgroup(Leaf-HD).Invitro,COPDmodelwasestablishedbyCSEstimulationonhumanlungcancerepithelialcelllineA549andMTTassaywasinvestigatedforcellviability.OxidativefactorsLDH,MDA,GSH,SODandoxygenfreeradicals(ROS)wereassessedandNrf2signalingpathwaywasdetectedbyRT-PCRIII andwesternblotineachgroup.AndinvivomurineCOPDmodelwasestablishedvia12-weekcigarettesmokeexposure.Lungfunctionwasdetectedandparametersincludingairwayresistance(Raw),dynamiclungcompliance(Cdyn)andForcedExpiratoryVolumein100ms(FEV0.1)weretested.MicelungtissueswerecollectedtodetectthelevelsofoxidativefactorsMDA,GSHandSOD.RT-PCRwasappliedtodetecttheactivationofNrf2signalingpathway.HEstainningandimmunohistochemistrywereusedtodeterminetheexpressionof8-OHdGandotherrelatedproteinsthroughNrf2signalingpathway.Results:1.Intotalflavonoidsinstemleafandrootoftaraxacummongolicum,theEC50valuesofDPPHfreeradicalsscavengingradicalrateswere54.88μg/mLand123.50μg/mL,respectively.EC50valuesofABTSradicalscavengingrateswere229.41μg/mLand559.07μg/mL,respectively.2.TheproperconcentrationofCSEoncellwas10%~30%.3.TotalflavonoidsoftaraxacummongolicumcouldhelptoinhibitthegenerationofROSandLDHinCSEinducedA549cells.4.Invitroandinvivo,totalflavonoidsoftaraxacummongolicumcouldhelptodown-regulateoxidativefactorsROS,LDH,MDAand8-OHdGrespectivelyandup-regulatelevelsofantioxidantfactorsGSHandSOD,especiallyinLeaf-LDandLeaf-HDgroups.5.PulmonaryHEstainningshowedaninhibitionoftotalflavonoidsoftaraxacummongolicumonCSE-inducedinflammatoryresponseintheCOPDmodel,withasignificanteffectinLeaf-LDandLeaf-HDgroups.6.LungfunctiontestexhibitedthattotalflavonoidsoftaraxacummongolicumcouldhelpimproveCdynandFEV0.1inmiceandreducedRaw,especiallyinLeaf-LDandLeaf-HDgroups.7.Totalflavonoidsoftaraxacummongolicumshowedanantioxidativeabilitybothinvitroandinvivo,possiblythroughup-regulatingthemRNAlevelsandproteinexpressionofNrf2,SOD1,andHO1.DatashowedsignificantdifferenceinLeaf-LDandLeaf-HDgroups.IV Conclusions:Aboveall,ourstudyhasinvestigatedtheantioxidativeeffectsoftotalflavonoidsinstemleafandrootoftaraxacummongolicumoncigarettesmoke-inducedchronicobstructivepulmonarydiseases.ThetotalflavonoidscouldupregulateNrf2,SOD1andHO1andenhancetheexpressionofantioxidantfactors,whichtherebyinhibitedtheproductionofROSandotheroxidants,weakenedtheoxidativedamageandinflammationofthelungsandimprovedlungfunction.ThesemighthelptoprovideanexperimentalbasisforthefurtherclinicalscreeningofnewandeffectivedrugsonCOPDpreventionandtreatment.Keywords:Taraxacummongolicumflavonoids;chronicobstructivepulmonarydisease;oxidativedamage;lungfunction;Nrf2V 目录第1章绪论..........................................11.1香烟与COPD.......................................11.2氧化应激损伤与COPD...............................31.3Keap1-Nrf2-ARE信号通路与氧化损伤..................51.4蒲公英的药效学研究进展.............................7第2章实验材料与方法..................................102.1实验材料..........................................102.1.1实验细胞株、实验动物和蒲公英提取物...............102.1.2主要试剂及耗材...................................112.1.3主要仪器.........................................132.2实验方法..........................................142.2.1体外实验.........................................142.2.1.1蒲公英总黄酮抗氧化活性的测定..........................................142.2.1.2细胞培养........................................................................................142.2.1.3香烟烟雾提取物（CSE）细胞培养液的制备...................152.2.1.4MTT法检测CSE的细胞毒性.................................................162.2.1.5蒲公英总黄酮对细胞增殖活性的影响................................162.2.1.6ROS荧光检测...............................................................................172.2.1.7氧化因子检测................................................................................172.2.1.8RT-PCR检测细胞中Nrf2、SOD1、HO1mRNA相对表达量.....................................................................................................................18VI 2.2.1.9WesternBlot检测细胞中Nrf2、SOD1、HO1蛋白表达量..........................................................................................................................212.2.2体内实验.........................................232.2.2.1蒲公英总黄酮提取物混悬液的制备.....................................232.2.2.2小鼠香烟烟雾所致慢性阻塞性肺疾病模型的制备.........232.2.2.3分组及处理....................................................................................232.2.2.4一般情况观察...............................................................................242.2.2.5肺功能检测....................................................................................242.2.2.6样本收集........................................................................................242.2.2.7小鼠肺组织中氧化因子检测...................................................242.2.2.8RT-PCR检测肺组织中Nrf2、SOD1、HO1mRNA表达量.....................................................................................................................252.2.2.9小鼠肺组织HE染色..................................................................252.2.2.10小鼠肺组织免疫组化................................................................252.2.3统计学分析.......................................26第3章实验结果及分析.................................273.1体外实验结果......................................273.1.1蒲公英总黄酮的抗氧化活性.........................273.1.2CSE的细胞毒性...................................283.1.3蒲公英总黄酮对细胞增殖活性的影响.................293.1.4蒲公英总黄酮对CSE诱导的A549细胞ROS水平的影响293.1.5蒲公英总黄酮对CSE诱导的A549细胞氧化因子水平的影VII 响....................................................303.1.6RT-PCR检测A549细胞中Nrf2、SOD1、HO1mRNA相对表达量................................................323.1.7WesternBlotting检测细胞中Nrf2、SOD1、HO1蛋白表达量......................................................333.2体内实验结果......................................353.2.1COPD小鼠模型一般情况观察及体重变化.............353.2.2小鼠肺功能检测...................................363.2.3小鼠肺组织氧化因子水平检测.......................373.2.4RT-PCR检测肺组织中Nrf2、SOD1、HO1mRNA表达量.383.2.5小鼠肺组织HE染色...............................393.2.6免疫组化检测小鼠肺组织中8-OHdG、Nrf2、SOD1和HO1蛋白的表达............................................42第4章讨论.........................................48第5章结论.........................................51参考文献...........................................52作者简介及在学期间所取得的科研成果.....................58致谢..................................................59VIII 中英文对照表英文缩写英文全称中文全称COPDChronicObstructivePulmonaryDisease慢性阻塞性肺疾病CS（E）Cigarettesmoke（extract）香烟烟雾（提取物）FEV1Forcedexpiratoryvolumeinonesecond1秒用力呼气容积FEV0.1ForcedExpiratoryVolumein100ms0.1秒用力呼气容积DCFH-DADichlorofluorescindiacetate3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-MTT四甲基偶氮唑盐diphenyltetrazoliumbromideHO1Hemeoxygenase1血红素氧合酶18-OHdG8-hydroxy-2-deoxyguanosine8-羟基脱氧鸟苷GSHGlutathione还原型谷胱甘肽SODSuperoxidedismutase超氧化物歧化酶MDAMalondialdehyde丙二醛实时定量多聚酶链合反RT-PCRReal-timepolymerasechainreaction应DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜Nuclearfactorerythroid2-relatedfactor核转录因子E2相关因Nrf22子2PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液NACN-Acetyl-L-cysteineN-乙酰半胱氨酸ROSReactiveoxygenspecies活性氧CdynDynamicLungCompliance动态肺顺应性RawAirwayResistance气道阻力IX 第1章绪论第1章绪论慢性阻塞性肺疾病（Chronicobstructivepulmonarydisease，COPD）是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和（或）肺气肿，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病，它是一种以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，其气流受限以不完全可逆、进行性加重为特征，与肺部对香烟烟雾等有害气体或[1]有害颗粒的慢性炎症和氧化应激损伤反应有关，COPD已成为全球第三大致死[2]病因，预计到2030年将成为全世界第七大负担的疾病。肺功能检测是确诊COPD的主要手段，超过70％的COPD患者为COPD指南（GOLD）定义的1期（轻度）或2期（中度），即症状轻微，没有明显的呼吸受限和呼吸困难等症状。由于大多COPD1期和2期人群就诊时间晚，从而失去了最佳治疗时间，致[3]使症状进展为更严重阶段，目前发现，COPD的发病机制主要为气道炎症反应、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化-抗氧化功能失衡和机体免疫功能紊乱等原因。因此，研发有效防治COPD的多靶点、多环节、多途径的新型药物成了至关重要的任务。蒲公英作为一种药食同源的中草药，富含黄酮类、倍半萜类及酚酸类等多种化学成分，现代药理学研究证实其有显著的抗炎、抗氧化、抗过敏和抗肿瘤等生[4][5][6]物活性。但关于蒲公英能否通过抗氧化损伤从而发挥治疗COPD的研究尚未见报道。鉴于市场上蒲公英入药部位的不统一性，本研究将比较蒲公英地上茎叶部分和地下根部黄酮类提取物的药效作用，为蒲公英不同部位的选择性开发提供实验数据，也为临床治疗入药部位的选择提出参考依据。1.1香烟与COPDCOPD是一种以呼吸道气流阻塞为特点的呼吸道疾病，病情常呈进行性发展，而这种持续性的气流阻塞主要是由小气道病变和（或）肺实质病变综合所致。患者通常表现出慢性咳嗽，痰液增多，呼吸困难等病理特征[3]。流行病学研究表明，吸烟者或有吸烟史的人比不吸烟者更容易患COPD[8]。1 第1章绪论吸烟对健康有害，其已被认为是非传染性疾病的主要风险因素之一，每年全[7]世界约有600万人死于吸烟引起的各种疾病。我国吸烟人群数量巨大，肺癌和COPD的发病率均呈不断上升趋势，流行病学资料显示我国40岁以上COPD患[8]病率为8.2%，且其随年龄的增长患病率随之增加，超过70岁COPD患病率高[9]达20%。我国在2010年颁布了禁止在公共场所吸烟的相关法律，从而可减少[10]吸烟和被动吸烟对人类造成的伤害。[11]烟草烟雾微粒中包含有4500多种化合物，其中尼古丁是使其成瘾的主要物质，也是CSE（CigaretteSmokingExtract，CSE）中最主要的致癌物质。我国制造的不同品牌的香烟尼古丁含量约10mg/包，可通过口腔粘膜和皮肤吸收，其[12][13]中1~1.5mg在肺中被吸收，在人体内形成烟草特有的亚硝胺，进而对人体心血管系统和呼吸系统都有直接的毒性，可导致高血压，心跳加速和呼吸急促。另外，尼古丁在机体有多种损害自身免疫系统的机制，如通过改变巨噬细胞活化[14]和抑制其吞噬作用，从而损害机体的免疫机制。尼古丁还会引起诸如细胞增殖、血管生成、肿瘤恶化和炎症浸润等影响，这无疑对人类健康构成重大威胁。烟草内还含有大量的细菌脂多糖（LPS）（每支香烟高达20μg），香烟烟雾[15]（CigaretteSmoking，CS）中也可检测到较高浓度的LPS，存在于主流和侧流[16]烟雾中。LPS也称为内毒素(endotoxin)，是革兰氏阴性细菌细胞壁上的一种物质，可诱导强烈的炎症反应。正常人吸入LPS后，出现胸闷，咳嗽，呼吸困难，多痰和FEV1明显下降。COPD的发病原因也包括烟草中的LPS刺激，相关研究表明长时间LPS暴露后，大量炎症细胞可浸润到小鼠的气道和血管周围，气道粘液分泌过多，气管壁增厚，肺泡腔增大等形态学改变，细胞因子如IL-18、TNF[17]-α等表达量显著上调。另外，CS对机体来说是外源性物质，接触后身体产生异常免疫反应。慢性长期或大面积暴露时，机体可能因免疫调节失衡而受损，这是CS对机体造成伤害的主要机制之一。CS中的有毒物质和刺激物，通过病原相关模式分子2 第1章绪论(Pathogen-associatedmoleculepatterns,PAMP)可激活气道上皮细胞、巨噬细胞和树突细胞上的模式识别受体（patternrecognitionreceptors，PRRs），同时PRRs可通过细胞损伤后释放胞内特定内源性分子即损伤相关分子模式（damage-[18]associatedmolecularpatterns，DAMPs），PRRs介导的PAMP和DAMP识别模式对于由感染或局部损伤引起的炎症反应非常重要，其在患有稳定的慢性炎症[19]的患者中放大了其炎症反应。此外，CS还可激活肺组织的凋亡相关通路，导[20]致气道内发生细胞凋亡。以上这些物质均会对肺部产生严重的氧化应激损伤与炎症反应，直接损伤肺组织，长期的CS暴露可以导致支气管上皮纤毛和上皮细胞产生功能障碍，增加呼吸道病原体感染的可能性，进一步发展成慢性支气管炎、慢性阻塞性肺气肿及慢性心源性心脏病等肺部相关疾病，同时CS也会增加机体的患癌风险，如肺癌、[21]肝癌、食管癌和胃癌（图1.1）。研究报导，肺癌死亡和CS的相对风险度是3.03。故现对其发病机制的深入研究和有效防治药物的开发将有着重要的临床意义。[22]图1.1氧化应激和炎症反应参与肺癌和慢性阻塞性肺疾病的共同机制1.2氧化应激损伤与COPD氧化应激主要是由活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）的产生和抗氧化3 第1章绪论[23]酶降解ROS的能力之间的不平衡引起的，在正常情况下，人体内的ROS产生与保护细胞的抗氧化防御系统之间存在着平衡，当内环境稳态平衡被打破，机体则产生氧化应激损伤。在气道疾病的发病机理中，除了常见的炎症反应之外，氧化应激同样也发挥着其重要作用。[24]研究表明，CS中含有高浓度的活性氧自由基(ROS)。COPD发生时，ROS等相关氧化应激指标均增加，这与支气管炎症状、空气滞留、肺功能丧失有关[25][26]。同时，由CS引起的巨噬细胞和嗜中性粒细胞也释放内源性ROS，最终导致高浓度的ROS在气道和肺中蓄积，从而破坏氧化-抗氧化平衡，致肺部严重[27][28][29]的氧化应激损伤，气道高反应和细胞调亡。其中，氧化应激和炎症反应相互作用并相互促进，氧化应激可以增强促炎症细胞因子的表达，NF-kBp65的[30]活化、中性粒细胞等炎症细胞趋化、炎症反应延长、增强，同时，抑制性T细胞功能下降，B淋巴细胞异常增生、分化，在机体产生多种自身抗体，引起自身[31]免疫反应紊乱，图1.2为氧化应激在COPD发病中的作用。图1.2氧化应激在COPD发病中的作用[31]一般情况下，肺组织通过大量的酶系统（GPx、CAT、SOD）和非酶系统（铁蛋白、抗坏血酸、血浆铜蓝蛋白、尿酸和胡萝卜素）保护机体免受氧化应激损伤。其中，经典的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱4 第1章绪论甘肽过氧化物酶（GSH-Px），这些酶可以直接灭活机体内ROS从而抑制ROS诱导的氧化应激反应。SOD可将活性极强的ROS转化为水和过氧化氢，然后通过CAT、GSH-Px和谷胱甘肽还原酶（GR）再将过氧化氢转化为水。同时，在氧化应激损伤中，也可引起脂质过氧化作用，形成丙二醛(MDA)，MDA是机体脂质[32]过氧化的主要产物之一。细胞中SOD的减少可同时伴随ROS和MDA的增加，导致细胞产生氧化应激损伤。综上所述，COPD是气道氧化应激和炎症相互作用、相互诱导的结果。而且机体内生性抗氧化系统在抑制炎症和氧化应激方面发挥了重要作用。由此可见，如果能够通过上调机体内的抗氧化酶以清除外界刺激诱生的这些氧化剂小分子物质，这将对防治COPD的病程进展有重大意义。1.3Keap1-Nrf2-ARE信号通路与氧化损伤Keap1-Nrf2-ARE信号通路，迄今为止被认为是细胞防御和细胞存活最重要[33]的内源性抗氧化应激通路。其核心包括核转录因子NF-E2相关因子2（nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2，Nrf2）、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-likeECH-associatedprotein1，Keap1）以及抗氧化反应元件（antioxidantresponseelement，ARE），Keap1-Nrf2-ARE信号通路可调控多种抗氧化酶和II相解毒酶（如NQO1、HO-1、GPX）基因的表达，这些酶在各种亚型中表达并分布于各种亚细胞群体和细胞器中，一起参与代谢反应，并在其分泌部位消除反应性物质。其中ARE的活化将启动这些酶的表达，其激活在于Nrf2与之结合，Nrf2通过在Keap1上泛素化而缓慢降解，当机体受到氧化应激或被Nrf2激活剂激活时，Keap1从Nrf2解离，Nrf2转入核并与ARE基因结合，启动下游抗氧化酶和II相[34]解毒酶基因，起到抗氧化保护作用（图1.3）。5 第1章绪论图1.3Keap1-Nrf2-ARE抗氧化防御系统[34]基于众多研究发现，Keap1-Nrf2-ARE通路在抗炎、抗氧化、抗应激、抗凋[35]亡和神经保护等方面发挥着广泛的细胞保护功能。Wu等研究发现，Nrf2过表达的小鼠体内，抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）合成增加，血清中谷丙转氨酶（ALT）与乳酸脱氢酶（LDH）的活性明显降低，这表明Nrf2是通过诱导抗氧化防御相关基因表达，起到抗氧化应激作用。通过对支气管上皮细胞进行微阵列分析，发现CS诱导的大鼠急性和亚急性损伤模型中，Nrf2和一些编码HO-1和NQO1等[36]的解毒酶基因参与了发病过程。同时体外给予丙烯醛刺激，能够激活II型肺细胞Nrf2和NQO1表达。在长期的CS暴露中（CS暴露4个月或6个月）可引起Nrf2−/−小鼠出现更为严重的肺气肿症状[37][38]。并且有趣的是，将野生型骨髓细胞移植到Nrf2缺陷小鼠中会延迟早期肺炎症状和随后的肺气肿的发展进程，这种改善与巨噬细胞表达的Nrf2相关的抗蛋白酶和抗氧化剂基因有关，证明了Nrf2具有通过肺泡巨噬细胞对蛋白酶和抗氧化剂的转录激活来抑制COPD发展的作用。除此之外，随着研究的不断深入，现已发现一些天然小分子如类黄酮代谢物激活剂能激活细胞中的Nrf2，诱导NQO1和GST表达。因此，筛选出对Keap1-Nrf2-ARE信号通路有活性的化合物可能对抗氧化损伤的药物研发工作具有指导作用。6 第1章绪论1.4蒲公英的药效学研究进展蒲公英（拉丁学名：TaraxacummongolicumHand.-Mazz.）又称婆婆丁、黄花地丁和蒲公草等，为菊科蒲公英属，多年生草本植物。关于蒲公英的记载始于《唐本草》。2015年《中国药典》中收载的蒲公英为蒲公英（T.mongolicumHand.Mazz.）、碱地蒲公英（T.borealisinenseKitam.），以及同一属数种的植物的干燥全草，其性味苦、甘，其主要功能为清热解毒、通淋利尿、散结消肿。蒲公英的药理作用在明代《本草纲目》、《唐本草》以及现代《中药大辞典》中均有详细的记载，古方有载蒲公英为“解热凉血之要药”、“至践有大功”。可用于乳痈、肺痈、疔疮、[39]咽痛、目赤、瘰疬和热淋涩痛。蒲公英作为一种药食兼用的植物，临床上主要用于治疗炎症、肺部化脓性感染[40]、便秘、胃溃疡、高血脂和肿瘤等多种疾病[41]。现代药理学研究表明，蒲公英有多种化学活性成分，主要化合物包括：黄酮类、酚酸类、三萜类、倍半萜内[42]酯类、香豆素类、植物甾醇类和胡萝卜素类等，其中功效成分研究较多的是以木犀草素为代表的黄酮类化合物、以绿原酸为代表的有机酸类和以蒲公英甾醇为代表的三萜类化合物。近年来蒲公英的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌、利尿和免疫功能改善等药理作用得到验证，同时应用于肺部疾病的研究也越来越多，可用于肺部化脓性感染[40]、急性肺损伤[43]及肺部肿瘤[44]等，展现出该药物具有广阔[45]的应用前景。蒲公英主要药效学作用如下：（1）抑菌作用：蒲公英具有广谱抑菌作用，目前发现其主要抗菌成分是黄[46]酮类化合物、甾醇、有机酸和多糖，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、螺旋体、真菌和病毒均有效且无耐药性。对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球[47]菌有很强的杀菌作用。蒲公英提取物可杀死钩端螺旋体，抑制结核分枝杆菌，并对某些真菌和抗性菌株有抑制作用。其抑菌作用机制为抑制细菌DNA和蛋白质的合成，以及抑制细菌细胞壁的生成。综上，蒲公英被认为是中药界抗感染的“八大金刚”之一，蒲公英可以在一定程度上替代抗生素。（2）抗炎作用：炎症是机体对致炎因子的损伤所发生的一种防御反应为主、7 第1章绪论[48]损伤和抗损伤并存的基本病理过程，严重的炎症反应可危及生命。使用化学抗炎药虽效果好，但不良反应大；而中药具有不良反应少，疗效持久和双向调整等[49][50]优点，能开发出适合的抗炎药物。Hye-JinJeon等通过建立了不同的炎症模型，发现蒲公英70%乙醇提取液具有很好的抗炎作用，且作用机制为抑制NO的[51]产生和降低iNOS和COX-2的表达。Yoon-JeoungKoh等发现三氯甲烷和醋酸乙酯提取的蒲公英提取物抗炎作用最强。蒲公英属植物的粗提物或水煎剂也具有一系列抗炎活性，且其抗炎活性的研究集中于植物中的黄酮类、酚酸类、三萜类、[52]有机酸类以及甾醇类等成分中。NanYang等发现了蒲公英全草中的有机酸类成分可通过TLR4/IKK/NF-kB信号通路减轻LPS诱导的呼吸道炎症及其他炎症。[53]ChungMuPark等研究发现，木犀草素与菊苣酸两者通过NF-κB和Akt信号转导通路协同抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中的炎症介质，从而改善多级炎症反应，其中咖啡酸可能增强了木犀草素的抗炎活性，且HuanzhangXiong等[54]研究结果发现，蒲公英总多糖及其各洗脱部位均能够在一定程度上抑制炎症因子TNF-α、COX-2、IL-6和IL-1βmRNA的表达，具有较好的抗炎活性。（3）抗氧化作用：黄酮类化合物是天然的强抗氧化剂，其抗氧化作用主要是清除ROS和氧自由基。黄酮类化合物还能够通过螯合金属离子防止氧化反应的发生。赵华[55]等发现，吸烟造成SOD含量降低，蒲公英通过升高被动吸烟小鼠SOD活性，降低吸烟对肺组织的氧化作用，提示了蒲公英是一种良好的肺部自由基清除剂，可通过SOD的活性，发挥预防吸烟造成支气管炎等损伤作用有[56]一定程度的修复及缓解作用。HuC等首次发现蒲公英花70%醇提取液无论在化学模型还是生物模型中都具有显著的抗氧化活性。还有研究发现蒲公英叶提取物中的酚类成分含量大约是其根部提取物中的3倍，是有效的还原剂、供氢体、[57]过氧化氢清除剂，植物的地上部分（花和叶）中的多酚含量（每100克蒲公英提取物含9.9±0.28克多酚）多于根中（每克蒲公英提取物含0.086±0.003克多[58][59]酚）的含量。同时还发现类黄酮糖苷如木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-芸香糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷和芹菜素-7-O-葡萄糖苷只存在于地上部分8 第1章绪论[60][61][62]。另外，TubaEsatbeyoglu等在蒲公英叶提取物中分离鉴定出的蒲公英[63]酸-β-D-吡喃葡萄糖酯可增加Nrf2转录，且呈剂量依赖性。杨锐杰等发现，蒲公英花各萃取物对DPPH、OH、O2-均有一定的清除活性，但不同萃取物对3种自由基的清除能力各不相同，其清除能力与黄酮的含量成正比，说明蒲公英花的抗氧化性与花中所含黄酮类成分有关。综上所述，蒲公英具有抑菌、抗炎和抗氧化等多种药效学作用，以蒲公英为基源研发出的一系列药物已用于治疗急性乳腺炎、支气管炎及尿路感染等疾病[64]，但蒲公英总黄酮提取物在COPD的防治领域研究尚鲜见报道。因此，本研究选用蒲公英总黄酮进行抗COPD的药效学研究，通过CS诱导的COPD模型和A549氧化损伤模型，分别从大体、细胞水平和分子水平探讨蒲公英总黄酮的抗COPD作用和机理，从而为蒲公英黄酮类药物的开发及应用提供实验依据。9 第2章实验材料与方法第2章实验材料与方法2.1实验材料2.1.1实验细胞株、实验动物和蒲公英提取物10 第2章实验材料与方法A:B：图2.1蒲公英叶（A）和根（B）基峰离子流（BPI）图2.1.2主要试剂及耗材11 第2章实验材料与方法12 第2章实验材料与方法2.1.3主要仪器13 第2章实验材料与方法2.2实验方法2.2.1体外实验2.2.1.1蒲公英总黄酮抗氧化活性的测定（1）DPPH法自由基清除实验：[65]①实验方法参考TurkmenN等，精密称取DPPH粉末0.00798g溶于无水乙醇，定容至100mL容量瓶中，得到浓度为200μM的DPPH储备液。②分别精密称取蒲公英茎叶提取物和蒲公英根部提取物适量，用甲醇稀释成不同浓度。取2mL上述不同浓度的药物，加入2mLDPPH溶液，充分混匀，室温避光反应30min,随即酶标仪测定515nm处吸光值A，n=3。阳性对照组为NAC，对照组以等体积的甲醇代替样品溶液，空白组以等体积无水乙醇代替DPPH溶液。DPPH•清除率(%)=[1-(A样品-A空白)/A对照]×100%（2）ABTS法自由基清除实验：[66]①参考Deng.etal.方法，将ABTS溶液和Trolox溶液以1：1的体积比制备成ABTS+工作母液，室温下避光反应16小时并在2天内使用，使用时用乙醇适当稀释成ABTS+工作液。②将10μL乙醇稀释的样品与200μLABTS+工作溶液混匀，室温孵育6分钟后在734nm处测取吸光度A，n=3。阳性对照组为NAC，对照组以等体积的乙醇代替样品溶液，空白组以等体积乙醇代替ABTS+工作液。ABTS•的清除率(%)=[1-(A样品-A空白)/A对照]×100%2.2.1.2细胞培养（1）细胞复苏①将细胞从液氮中取出，置于37℃水浴锅中，轻轻晃动使冻存管中培养液完全溶解后，离心1000rpm，5min，弃除上清。②加1mL37℃预热的完全培养基（10%FBS＋90%DMEM），轻轻吹打混匀细14 第2章实验材料与方法2.2.1.3香烟烟雾提取物（CSE）细胞培养液的制备本研究中，我们均使用同一批生产的雄狮牌香烟制作香烟烟雾提取物（CSE），用橡胶管依次连接香烟、玻璃瓶、蠕动泵，连接香烟侧管深入培养液面下，剪去香烟滤嘴，点燃香烟（每支含有烟碱量0.7mg，焦油量8mg，一氧化碳量10mg），蠕动泵使用恒定抽吸速度，使瓶中产生负压，烟雾随即进入瓶中，待香烟燃尽，15 第2章实验材料与方法停止蠕动泵，静置15min待香烟充分溶解进入培养液中，并调整溶液PH值至7.3~7.4，随即将CSE培养液经0.22μm滤器过滤除菌并于30min内用于细胞实验刺激，为确保每次实验刺激效果稳定，检测CSE培养液在320nm处吸光度，定义其吸光值为0.38±0.02为100%浓度的CSE细胞培养液。2.2.1.4MTT法检测CSE的细胞毒性2.2.1.5蒲公英总黄酮对细胞增殖活性的影响（1）药物准备精确称量蒲公英提取物粉末溶于细胞完全培养基中，充分搅拌，超声混匀，4度过夜，所有药物均经0.22um滤器过滤除菌，制备成贮备液于4℃冰箱保存备用。（2）MTT法检测蒲公英总黄酮的细胞增殖活性①取对数生长期的A549细胞，消化离心，弃去上清液，按5×103个/孔的细胞密度接种于96孔板中，CO2孵箱培养过夜。②第二天弃去细胞上清，加入适量37℃预热的PBS冲洗细胞2~3次，移除16 第2章实验材料与方法PBS，随后加入不同稀释倍数药物，使其终浓度为300μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL，每孔200μL，对照孔为完全培养基。③培养一定时间后，防止药物与MTT可能发生反应，可弃去培养基后，用PBS冲洗一遍，再加入MTT，避光继续培养4h。④取出96孔板，弃去上清液，使用多道移液器往每孔加入200μLDMSO，摇床避光摇晃10min。⑤570nm处测定吸光值，计算细胞增殖率=OD实验组/OD对照组×100%。2.2.1.6ROS荧光检测2.2.1.7氧化因子检测根据南京建成氧化因子检测试剂盒说明书，检测药物对CSE刺激引起的氧化因子释放的影响作用。①实验分为空白对照组、CSE模型组、蒲公英根总黄酮低剂量组（Root-LD）、蒲公英根总黄酮高剂量组（Root-HD）、蒲公英茎叶总黄酮低剂量组（Leaf-17 第2章实验材料与方法LD）和蒲公英茎叶总黄酮高剂量组（Leaf-HD）。每组各为三个平行复孔。②取对数生长期的A549细胞，消化离心，弃去上清液，按5×105/孔的密度接种于6孔培养板中，CO2孵箱培养过夜。③向药物处理组加入不同浓度的药物，其余组加入等体积的细胞培养液，培养24h。④向CSE模型组、药物处理组加入CSE给予刺激，空白对照组加入等体积细胞培养液，置于37℃CO2培养箱继续培养12h。⑤收集细胞上清，用于检测细胞LDH水平。⑥收集细胞，冰水浴超声破碎细胞，低温高速离心，收集上清液，一部分用于蛋白浓度检测，剩余部分用于MDA、SOD、GSH活性检测。2.2.1.8RT-PCR检测细胞中Nrf2、SOD1、HO1mRNA相对表达量18 第2章实验材料与方法19 第2章实验材料与方法表2.6反应程序2步骤温度时间125℃5min242℃60min370℃15min44℃保存备用（-20℃长期保存）（4）Real-timePCR检测①引物设计由吉林库美生物科技有限公司合成，见下表2.7表2.7基因名称引物序列Nrf2F:5’-TGCATGATGCCCAATGTGAG-3’(Human)R:5’-CCAAGCGGCTTGAATGTTTA-3’SOD1F:5’-TTGGAGACTTGGGCAATGTG-3’(Human)R:5’-TACACCACAAGCCAAACGAC-3’HO1F:5’-ACGTCCGCAACAAGCTTAAC-3’(Human)R:5’-GCCAACAGTGTTAAGTCAGGTG-3’β-actinF:5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3’(Human)R:5’-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3’②将所有试剂置于冰上融化备用。③Real-timePCR反应体系：*cDNA加入的量每体系不超过50ng混匀体系，离心，避光暂存。20 第2章实验材料与方法2.2.1.9WesternBlot检测细胞中Nrf2、SOD1、HO1蛋白表达量21 第2章实验材料与方法22 第2章实验材料与方法2.2.2体内实验2.2.2.1蒲公英总黄酮提取物混悬液的制备分别精确称取蒲公英根部提取物和茎叶提取物，溶于0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）胶浆中，轻微超声、振荡混匀，制备成贮备液保存于4℃冰箱中。2.2.2.2小鼠香烟烟雾所致慢性阻塞性肺疾病模型的制备参考MarwickJ等[67]及课题组以往实验方法，制备小鼠COPD模型。BALB/c小鼠适应环境1周。高温灭菌饲料喂养，自由饮水，每3d更换一次垫料，保持环境安静。采用被动吸烟法，对小鼠进行全身暴露建立COPD模型于自制烟雾暴露箱（长：50cm宽：40cm高：18cm），箱体上部钻有4个直径8mm通气口，边侧钻有1个进烟孔，通过橡胶管连接雾暴露箱、蠕动泵和香烟三者。当蠕动泵通入香烟烟雾时，封闭所以通气口，待香烟燃尽，关闭蠕动泵同时开启通气孔，开始计时。每次4根香烟，烟熏持续10分钟，过后打开烟雾暴露箱顶盖，待烟雾散去同时使小鼠歇息10分钟，而后重复上述烟熏步骤，结束后将小鼠放回饲养笼中。每天累积烟熏时长为1h，上、下午烟熏各30min，持续造模12周，空白对照组不予烟熏处理。2.2.2.3分组及处理参照文献[68]，将小鼠按数字随机分为空白对照组、烟雾模型组、烟雾-蒲公英根总黄酮低剂量组（Root-LD）、烟雾-蒲公英根总黄酮高剂量组（Root-HD）、烟雾-蒲公英茎叶总黄酮低剂量组（Leaf-LD）和烟雾-蒲公英茎叶总黄酮高剂量组（Leaf-HD），每组10只。烟雾模型组及治疗组小鼠每天吸烟1h，共进行12周。治疗组小鼠在每天烟熏前2h予以灌胃给药治疗。根据《中国药典》中蒲公英用量，换算成小鼠给药剂量，即Root-LD为2.25g生药/kg体重，Root-HD为4.5g生药/kg体重，Leaf-LD为2.25g生药/kg体重，Leaf-HD为4.5g生药/kg体重，正常空白对照组呼吸空气，不作烟熏及灌胃处理。小鼠造模期间，于每周称取各组小鼠的体重。23 第2章实验材料与方法2.2.2.4一般情况观察每天定时观察小鼠整体状况，如精神状况、肢体活动、皮毛色泽、饮食饮水和二便等情况，并且每周给予禁食后称量体重。2.2.2.5肺功能检测①对Buxco小动物肺功能仪进行调零校准。②小鼠称重后，腹腔注射1%戊巴比妥钠注射液40mg/kg体重麻醉小鼠，随后进行气管插管并用手术线固定。③插管另一端与Buxco小动物肺功能仪呼吸机相连，先描记一段平静呼吸，待其呼吸稳定后，记录数据，而后于呼吸末开始通气使小鼠被动深吸气，通过气流及压力传感器和放大器将气流变化转换为电信号，经过计算机处理后，检测气道阻力(Raw)、动态肺顺应性(Cdyn)及第0.1秒用力呼气容积（ForcedExpiratoryVolumein100ms，FEV0.1）等相关参数。2.2.2.6样本收集小鼠肺功能检测完成后，迅速剪开小鼠胸腔，暴露心脏，用预冷的PBS，20mmHg压力，经右心室到左心耳灌流肺循环，同时夹闭腹主动脉，提高肺循环灌流效率。迅速游离出肺组织，左上肺置于预冷的PBS匀浆检测氧化因子，左下肺冻于液氮用于PCR，全右肺浸入甲醛固定用于病理切片。2.2.2.7小鼠肺组织中氧化因子检测取肺组织4℃下匀浆，而后，以1,000g，离心15分钟，收集上清液，根据南京建成氧化因子检测试剂盒说明书，检测分析肺组织中MDA、SOD、GSH的水平（方法同体外实验2.2.1.7）。24 第2章实验材料与方法2.2.2.8RT-PCR检测肺组织中Nrf2、SOD1、HO1mRNA表达量方法同“2.2.1.8”，其中引物序列为下表2.11：表2.11基因名称引物序列Nrf2F:5’-AAGCTTTCAACCCGAAGCAC-3’(mouse)R:5’-AAGCTTTCAACCCGAAGCAC-3’SOD1F:5’-CAAGCGGTGAACCAGTTGTG-3’(mouse)R:5’-CAGTCACATTGCCCAGGTCT-3’HO1F:5’-AAGGGAGAATCTTGCCTGGC-3’(mouse)R:5’-GGTGAGGGAACTGTGTCAGG-3’β-actinF:5’-GATCAAGATCATTGCTCCTCCTG-3’(mouse)R:5’-AGGGTGTAAAACGCAGCTCA-3’2.2.2.9小鼠肺组织HE染色2.2.2.10小鼠肺组织免疫组化①小鼠肺组织切片脱蜡水化，将载玻片依次放入二甲苯I、二甲苯II、100%乙25 第2章实验材料与方法醇I、100%乙醇II、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、PBS。每个溶液中放置约3~5min。②抗原修复，将载玻片放入0.01M（PH=6.0）柠檬酸缓冲盐，高压锅中加热至120℃，10min，拿出后缓慢冷却至室温，流动水冲洗。③吸水纸擦干组织周围，防水笔圈出一定范围，滴入阻断剂（A液），室温约30min。PBS冲洗3次，每次5min。再滴入10%羊血清室温封闭2h，PBS冲洗3次，每次5min。④吸水纸擦干载玻片，加入稀释好的一抗，4℃冰箱过夜。PBS冲洗3次，每次5min。⑤吸水纸擦干载玻片，加入稀释好的二抗（B液），室温孵育10min，PBS冲洗3次，每次5min。⑥滴加抗体放大液（C液），室温10min，PBS冲洗3次，每次5min。⑦滴加HRP聚合物（D液），室温避光孵育10min，PBS冲洗3次，每次5min。⑧吸水纸擦干载玻片，滴加DAB显色剂（E液），室温孵育数分钟，PBS冲洗3次，每次5min。⑨苏木素染液染色数秒，流水冲去多余染液。⑩1%盐酸-乙醇溶液分化数秒，流水冲去多余酸液。⑪依次将载玻片浸入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇I、100%乙醇II、二甲苯I、二甲苯II。每个溶液中放置约3~5min。⑫擦除多余的二甲苯，中性树脂封片。通风橱晾干。2.2.3统计学分析26 第3章实验结果及分析第3章实验结果及分析3.1体外实验结果3.1.1蒲公英总黄酮的抗氧化活性27 第3章实验结果及分析图2.1A不同浓度的蒲公英茎叶总黄酮和根总黄酮DPPH自由基清除率B不同浓度的蒲公英茎叶总黄酮和根总黄酮ABTS自由基清除率注：实验结果以Mean±SD表示。3.1.2CSE的细胞毒性CS可引起呼吸道上皮损伤，本实验采用香烟提取物作用于人肺癌上皮细胞，MTT法检测细胞存活率，确定CSE干预的浓度。使用不同浓度（50%、40%、30%、20%、10%）的CSE处理细胞12h后，如图2.2显示，细胞存活率均呈现下降趋势，浓度越大，细胞存活率越低，即细胞存活率下降与CSE的浓度呈剂量依赖性。40%和50%的CSE对细胞存活率有显著抑制作用（P<0.0001），10%~30%浓度的CSE对细胞存活率无明显影响，故实验中选取30%浓度的CSE为实验浓度。图2.2不同浓度CSE作用后细胞的存活率注：实验结果以Mean±SD表示。与空白对照组比，*P<0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。28 第3章实验结果及分析3.1.3蒲公英总黄酮对细胞增殖活性的影响如图2.3所示，予以蒲公英根、茎叶总黄酮培养A549细胞24h后，蒲公英茎叶总黄酮在0-50μg/mL范围内，对A549细胞活性无显著影响，在浓度为100-300μg/mL时，与对照组相比均具有显著性差异；蒲公英根总黄酮在0-25μg/mL范围内，对A549细胞活性无显著影响，在浓度为50-300μg/mL时，与对照组相比均具有显著性差异，故选取0-25μg/mL范围内药物浓度用于研究蒲公英茎叶、根总黄酮对CSE刺激的A549细胞的药效作用及机制研究。图2.3不同浓度蒲公英根部、茎叶总黄酮对细胞24h存活率的影响注：实验结果以Mean±SD表示。与空白对照组比，*P<0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。3.1.4蒲公英总黄酮对CSE诱导的A549细胞ROS水平的影响活性氧是诱导氧化应激和炎症反应的重要物质，CSE中含有大量氧化剂和自由基，是诱导氧化应激的重要物质。如图2.4所示，本实验中，CSE刺激12h可显著上调A549细胞中ROS水平，然而蒲公英总黄酮预处理24h后均有抑制细胞ROS的产生，其中浓度为12.5μg/mL、25μg/mL的根部总黄酮和茎叶总黄酮能显著抑制ROS产生，说明此浓度能显著抑制细胞氧化损伤，故后续实验选用此浓度（12.5μg/mL、25μg/mL）作为低、高剂量；并且可见茎叶总黄酮抑制ROS产生的能力强于根总黄酮。29 第3章实验结果及分析图2.4蒲公英根、茎叶总黄酮对CSE诱导的A549细胞ROS水平的影响。空白对照组细胞培养于细胞培养液中，药物治疗组予以预处理24h后，与CSE模型组同时给予CSE刺激12h，随后装载探针，使用全功能酶标仪检测荧光强度，所有组别在相同的环境条件下培养。实验结果以Mean±SD表示。与空白对照组比，#P<0.05；与CSE组相比，*P<0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。3.1.5蒲公英总黄酮对CSE诱导的A549细胞氧化因子水平的影响当细胞ROS水平超过自身的抗氧化能力时，细胞将遭受氧化应激损伤，引起脂质过氧化作用，产生乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)，如图2.5A、B，CSE刺激细胞12h可显著上调LDH和MDA水平（###p＜，同时蒲公英根总黄酮、茎叶总黄酮预处理组，可下调细胞LDH和MDA水平，从而减轻细胞脂质过氧化损伤。在氧化应激损伤时，SOD在清除ROS的过程中，可将活性极强的超氧化自由基转化为过氧化氢和水,过氧化氢再通过过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶转变为水。GSH作为内源性抗氧化剂，可直接清除ROS等氧化剂。SOD和GSH活力的高低可反映机体清除氧自由基的能力。如图2.5C、D所示，CSE刺激下调了SOD和GSH水平，药物预处理组可显著改善CSE刺激导致的细胞内SOD和GSH的降低，提高机体清除氧自由基的能力，同时，蒲公英茎叶总黄酮的能力强于根部总黄酮，与ROS清除实验结果基本一致。30 第3章实验结果及分析A：B：C：D：图2.5蒲公英总黄酮对CSE诱导的A549细胞氧化因子水平的影响。空白对照组细胞培养31 第3章实验结果及分析于细胞培养液中，药物治疗组预给药孵育24h后，与CSE组同时培养于CSE细胞培养液中12h，收集细胞上清检测LDH释放水平（A），收集细胞检测胞内MDA、GSH、SOD水平（B、C、D），所有组别在相同的环境条件下培养。实验结果以Mean±SD表示。与对照组相比#P﹤0.05，##p＜0.01，###p＜0.001，####p＜0.0001；与CSE组相比，*P<0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。3.1.6RT-PCR检测A549细胞中Nrf2、SOD1、HO1mRNA相对表达量荧光定量PCR法测定A549细胞中Nrf2、SOD1、HO1mRNA的相对表达-△△Ct量，采用2法对结果进行相对定量分析，如图2.6所示，相比空白对照组，CSE组Nrf2、SOD1、HO1mRNA表达量无显著变化，蒲公英总黄酮治疗组Nrf2、SOD1、HO1mRNA表达量与CSE组相比均显著提高，且以Leaf-LD和Leaf-HD组尤为明显。CSE没有明显激活Nrf2、SOD1、HO1mRNA的表达，蒲公英总黄酮明显增加细胞内抗氧化相关基因Nrf2、SOD1、HO1的表达量，起到抗氧化保护作用，并且蒲公英茎叶总黄酮作用效果强于根总黄酮。A:B:32 第3章实验结果及分析C:图2.6A549细胞中Nrf2、SOD1、HO1mRNA相对表达量。空白对照组细胞培养于细胞培养液中，药物治疗组预给药孵育24h后，与CSE组同时培养于CSE细胞培养液中12h，收集细胞检测Nrf2、SOD1、HO1mRNA相对表达量，所有组别在相同的环境条件下培养。实验结果以Mean±SD表示。与对照组相比#P﹤0.05，##p＜0.01，###p＜0.001，####p＜0.0001；与CS组相比，*P<0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。3.1.7WesternBlotting检测细胞中Nrf2、SOD1、HO1蛋白表达量采用WesternBlotting法检测蛋白表达量，观察蒲公英总黄酮对CS诱导的A549细胞抗氧化相关蛋白Nrf2、SOD1和HO1的影响，如图2.7所示，结果表明A549细胞经CSE作用12h后，Nrf2和HO1蛋白表达水平升高，但无统计学差异，SOD1水平显著下降（(#P<0.05)，而蒲公英总黄酮治疗后，可明显提高细胞中抗氧化蛋白Nrf2、SOD1的表达量，且蒲公英茎叶总黄酮效果优于根部总黄酮，其中HO1的表达量并无显著性改变，可能跟激活了其他相关通路有关。A:33 第3章实验结果及分析B:C:D:图2.7A549细胞中Nrf2、SOD1、HO1蛋白条带(A)及相对表达量分析统计（B、C、D）。空白对照组细胞培养于细胞培养液中，药物治疗组预给药孵育24h后，与CSE组同时培养于CSE细胞培养液中12h，收集细胞检测Nrf2、SOD1、HO1蛋白相对表达量，所有组别在相同的环境条件下培养。实验结果以Mean±SD表示。与对照组相比#P﹤0.05，##p＜0.01；与CS组相比，*P<0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。34 第3章实验结果及分析3.2体内实验结果3.2.1COPD小鼠模型一般情况观察及体重变化A:B:图2.8小鼠每周体重变化曲线及各组实验后体重统计分析。各组实验动物在实验期间，35 第3章实验结果及分析每周予以禁食8h后称量体重（A）。（B）为12周实验后，各组小鼠体重之间的比较。与对照组相比#P﹤0.05，##p＜0.01，###p＜0.001；与CS组相比，*P<0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。3.2.2小鼠肺功能检测为了进一步观察CS对机体存在的损伤作用和蒲公英总黄酮对CS诱导的COPD模型的保护作用，参考文献[69]，我们使用肺功能检测仪检测小鼠FEV0.1、Cdyn和Raw等能够反映肺功能的相关指标，结果如图2.9所示。与正常对照组相比，CS组小鼠FEV0.1、Cdyn均显著降低，蒲公英给药治疗组均显著改善小鼠肺功能FEV0.1、Cdyn；同时，与正常对照组相比，CS组小鼠肺功能气道阻力Raw显著增加，Leaf-LD和Leaf-HD组可显著改善气道阻力的增加，而根部总黄酮效果不明显。说明蒲公英总黄酮能明显改善COPD小鼠肺功能，且茎叶总黄酮组效果好于根部总黄酮组。A:B:36 第3章实验结果及分析C:图2.9各组小鼠肺功能指标FEV0.1（A）、肺动态顺应性(Cdyn)（B）、气道阻力（Raw）（C）。实验结果以Mean±SD表示。与对照组相比#P﹤0.05，##p＜0.01，###p＜0.001，####p＜0.0001；与CS组相比，*P<0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。3.2.3小鼠肺组织氧化因子水平检测小鼠肺组织氧化因子水平变化趋势基本同细胞体外实验结果。如图2.10，与对照组相比，CS模型组的平均组织MDA水平升高（##p<0.01），而GSH水平和SOD活性下降。然而，与CS组相比，蒲公英处理组中的MDA水平降低，平均组织GSH水平、SOD活性增加，且以Leaf-LD和Leaf-HD组尤为显著，表明蒲公英总黄酮能减低COPD小鼠肺部氧化损伤，同时提高其部位抗氧化能力，并以蒲公英茎叶总黄酮最为有效。A:37 第3章实验结果及分析B:C:图2.10小鼠肺肺组织中MDA（A）、GSH（B）、SOD（C）氧化因子水平。实验结果以Mean±SD表示。与对照组相比#P﹤0.05，##p＜0.01；与CS组相比，*P<0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。3.2.4RT-PCR检测肺组织中Nrf2、SOD1、HO1mRNA表达量同样，荧光定量PCR法测定肺组织中Nrf2、SOD1、HO1mRNA的相对表达量，采用2-△△Ct法对结果进行相对定量分析，如图2.11所示，相比空白对照组，CS组Nrf2、SOD1、HO1mRNA表达量稍有升高，但无统计学差异，蒲公英总黄酮治疗组的Nrf2、SOD1mRNA表达量与CS组相比显著提高，治疗组中肺组织HO1mRNA表达量与CS组无明显差异。结果表明，香烟烟雾提取物没有明显激活Nrf2、SOD1、HO1mRNA的表达，蒲公英总黄酮显著增加细胞内抗氧化相关基因Nrf2和SOD1的表达量，起到抗氧化保护作用，并且蒲公英茎叶总黄酮作用效果强于根部总黄酮。38 第3章实验结果及分析A:B:C:图2.11各组肺组织中Nrf2、SOD1、HO1mRNA相对表达量。实验结果以Mean±SD表示。与CS组相比，*P<0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。3.2.5小鼠肺组织HE染色本实验即采用了BALB/c小鼠进行香烟烟雾诱导COPD模型方法，图2.12HE染色结果为各组典型病理组织表现，CON组中，肺组织内结构正常，肺泡间隔完整，无炎细胞浸润，细支气管管壁平滑，管腔内无上皮脱落及炎性渗出；经39 第3章实验结果及分析12周的香烟烟雾暴露，与CON组的健康小鼠相比，CS组小鼠肺内可见炎细胞浸润，在肺组织内可见肺泡扩张，支气管破损且可见上皮脱落，肺气肿形成，偶见肺泡内积液（出血或渗出物），符合慢性气道炎症病理表现，与临床上COPD患者病理变化相似，提示，本研究采用的动物BALB/c小鼠香烟烟雾暴露能成功诱导COPD模型。Root-LD和Root-HD组病理改变相当，可见轻度肺泡扩张，少量炎细胞浸润及上皮脱落；Leaf-LD和Leaf-HD组病理改变相当，仅可见轻度病理改变，少见炎细胞浸润、支气管破损及上皮脱落。以上结果表明，香烟烟雾暴露可对小鼠肺组织造成损伤，同时蒲公英总黄酮可明显改善肺组织损伤，且以蒲公英茎叶总黄酮效果明显。40 第3章实验结果及分析图2.12HE染色观察小鼠肺组织结构及炎性细胞浸润等病理改变和特征，左侧为200×，右侧为400×。CON对照组肺组织结构清晰，肺泡结构完整，气道黏膜结构完整，纤毛排列整41 第3章实验结果及分析齐，无炎症细胞浸润;CS模型组小鼠肺泡壁结构破坏，甚至断裂，部分融合形成肺大泡，间质增生，气道黏膜皱襞增多，纤毛枯缩成团，管腔内粘液分泌增多，炎症细胞浸润；蒲公英根部总黄酮治疗组小鼠肺组织仍可见轻度肺泡扩张，少量炎细胞浸润及上皮脱落；蒲公英茎叶总黄酮治疗组小鼠肺组织仅可见轻度病理改变，少见炎细胞浸润、支气管破损及上皮脱落。3.2.6免疫组化检测小鼠肺组织中8-OHdG、Nrf2、SOD1和HO1蛋白的表达42 第3章实验结果及分析43 第3章实验结果及分析44 第3章实验结果及分析45 第3章实验结果及分析46 第3章实验结果及分析E:免疫组化灰度值分析图2.13各组肺中8-OHdG、Nrf2、SOD1和HO1蛋白的分布表达（A、B、C、D）。图中棕色颗粒物为阳性表达，左侧为200X，右侧为400X。图A肺中8-OHdG阳性表达位于肺泡壁细胞及支气管上皮细胞，图B肺中Nrf2阳性表达位于肺泡壁细胞及支气管上皮细胞，图C肺中SOD1阳性表达位于肺泡壁细胞、支气管上皮细胞，图D肺中HO1阳性表达位于肺泡壁细胞、巨噬细胞及支气管上皮细胞。图E为灰度值分析。实验结果以Mean±SD表示。与对照组相比#P﹤0.05，##p＜0.01，###p＜0.001；与CS组相比，*P<0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。47 第4章讨论第4章讨论48 第4章讨论氧化应激是吸烟导致肺部损伤的重要机制之一，抗氧化剂能一定程度上抑制吸烟导致的肺损伤，抑制脂质过氧化反应可有效清除体内自由基及超氧阴离子。黄酮类成分具有多酚羟基结构，遇到活性氧自由基时，容易丢失酚羟基上的氢，具有直接消除活性氧或自由基的作用。由于CS中的游离氧离子和炎症反应释放的内源性氧自由基均可引起肺部严重的氧化应激损伤，加速肺功能的下降及肺部结构的病变，因此能有效清除机体氧自由基或增加体内抗氧化物质以清除这些氧化剂小分子物质，这将对防治COPD的病程进展有重大意义。本研究体外实验发现，蒲公英总黄酮可降低细胞中ROS、LDH和MDA水平，同时增加细胞中SOD、GSH抗氧化酶的活性；同样，体内实验发现，蒲公英总黄酮可降低肺组织氧化损伤标志物MDA及8-OHdG，同时增加体内抗氧化酶系统的SOD和GSH的活性，且明显改善小鼠肺功能，增加肺顺应性，降低气道阻力，降低肺部炎症反应。以上发现均表明蒲公英总黄酮具有明显的抗氧化损伤作用，且蒲公英茎叶总黄酮效果优于蒲公英根总黄酮。大量研究表明，Keap1-Nrf2-ARE信号通路被认为是机体最重要的内源性抗[70]氧化应激通路。Keap1-Nrf2-ARE信号通路可调控多种II相解毒酶（如NQO1、HO1、GPX）和抗氧化酶（SOD1）基因的表达，这些酶存在于各种细胞器和亚细胞群体中，一起参与代谢反应。在机制研究中，PCR、WesternBlotting及免疫组化结果显示，蒲公英总黄酮可以上调内源性抗氧化物质Nrf2、SOD1和HO1的mRNA水平和蛋白表达，使得机体总ROS的减少，LDH和MDA的降低，SOD和GSH的增加，从而起到抗氧化应激损伤作用，改善肺部功能，降低肺部炎症反应，且上述作用效果为蒲公英茎叶总黄酮强于蒲公英根总黄酮，表明相同醇提取条件下，蒲公英茎叶黄酮含量及成分均优于蒲公英根中的总黄酮，这也验证了黄酮类化合物是天然的强抗氧化剂，其抗氧化能力与其含量成正相关。其中，HO1在细胞蛋白水平及肺组织mRNA水平上作用不明显，无统计学差异，可能与激活其他相关信号通路有关，并且HO1的表达在不同的致病时间点也会存在变化，故需要进一步研究与探讨综上所述，本实验揭示了蒲公英根总黄酮与茎叶总黄酮对香烟烟雾诱导的慢性阻塞性肺疾病的抗氧化损伤作用及其潜在作用机制：通过上调机体内Nrf2、SOD1和HO1的水平，增强内源性抗氧化因子的表达量，从而抑制ROS等氧化49 第4章讨论剂的产生，减弱肺部氧化损伤和炎症反应，改善肺功能。本研究为临床进一步筛选新型有效防治COPD药物提供实验基础，同时也为蒲公英临床用药部位的选择提供指导意见。50 第5章结论第5章结论51 参考文献参考文献[1]Allinson,J.P.&Wedzicha,J.A.UpdateinChronicObstructivePulmonaryDisease2016.AmJRespirCritCareMed196,414–424(2017).[2]VogelmeierCF,CrinerGJ,MartinezFJ,AnzuetoA,BarnesPJ,BourbeauJ,etal.GlobalStrategyfortheDiagnosis,Management,andPreventionofChronicObstructiveLungDisease2017.Report:GOLDExecutiveSummary.Americanjournalofrespiratoryandcriticalcaremedicine.2017.[3]Zhou,Y.,Zhong,N.-S.,Li,X.,Chen,S.,Zheng,J.,Zhao,D.,etal.(2017).TiotropiuminEarly-StageChronicObstructivePulmonaryDisease.TheNewEnglandJournalofMedicine,377(10),923–935.[4]YangN,TianG,ZhuM.,etal.ProtectiveeffectsoforganicacidcomponentfromTaraxacummongolicumHand-Mazz.againstLPS-inducedinflammation:RegulatingtheTLR4/IKK/NF-κBsignalpathway[J].JournalofEthnopharmacology,2016,194:395-402.[5]ParkCM,JinKS,LeeYW,etal.LuteolinandchicoricacidsynergisticallyinhibitedinflammatoryresponsesviainactivationofPI3K-AktpathwayandimpairmentofNF-kBtranslocationinLPSstimulatedRAW264.7cells[J].EuropeanJournalofPharmacology,2011,660(2-3):454-459.[6]WangS,WangY,LiuX,etal.Anti-inflammatoryandanti-arthriticeffectsoftaraxasterolonadjuvant-inducedarthritisinrats[J].JournalofEthnopharmacology,2016,187:42-48.[7]Madani,A.,Alack,K.,Richter,M.J.&Krüger,K.Immune-regulatingeffectsofexerciseoncigarettesmoke-inducedinflammation.JInflammRes11,155–167(2018).[8]Zhu,B.,Wang,Y.,Ming,J.,Chen,W.&Zhang,L.DiseaseburdenofCOPDinChina:asystematicreview.InternationalJournalofChronicObstructivePulmonaryDisease13,1353–1364(2018).[9]钟南山.慢性阻塞性肺疾病在中国[J].中国实用内科杂志.2011,331(5):321-322.[10]上海市第十三届人民代表大会常务委员会第十五次会议,《上海市公共场所控制吸烟条例》[Z].2010-03-01.[11]BhatTariqA,KalathilSureshGopi,BognerPaulNetal.SecondhandSmokeInducesInflammationandImpairsImmunitytoRespiratoryInfections.[J].J.Immunol.,2018,200(8):2927-2940.[12]KozlowskiLT,MehtaNY,SweeneyCT,etal.FilterventilationandnicotinecontentoftobaccoincigarettesfromCanada,theΜnitedKingdom,andtheΜnitedStates[J].TobaccoControl,1998,7(4):369-75.52 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作者简介及在学期间所取得的科研成果作者简介及在学期间所取得的科研成果作者简介：陈芳，女，1991年10月出生于湖北省荆州市，汉族；2010年9月考入广州医科大学第一临床学院攻读医学学士学位；2015年9月考入吉林大学基础医学院微生物学专业攻读理学硕士学位。发表论文：(1)陈芳，王宇晨，关雪娃，庞志强，路艳娇，王国强，郑敬彤，朱海林，王放.毛酸浆果乙醇提取物抗炎作用及其机制研究[J].药物评价研究，2016，39（5）：747-752.(2)王亚茹，李雅萌，杨娜，周柏松，陈芳，刘金平，李平亚.蒲公英属植物的化学成分和药理作用研究进展[J].特产研究，2017，（4）：67-74.(3)王亚茹，李雅萌，郑炳真，周柏松，杨娜，陈芳，刘金平，李平亚.ICP-MS法比较蒲公英根与茎叶中人体必需微量元素的含量[J].特产研究，2017，（3）：33-38.(4)XuewaGuan,YanjiaoLu,GuoqiangWang,PeterGibson,FangChen,etal.TheRoleofRegulatoryTCellinNontypeableHaemophilusinfluenzae-InducedAcuteExacerbationofChronicObstructivePulmonaryDisease.Mediatorsofinflammation2018,1–14(2018).58 致谢致谢三年的硕士生涯匆匆而过，感谢每个给予我帮助与指导的老师和师兄师姐们，感谢你们陪我度过这三年书窗生涯，伴我进步与成长。首先，感谢我敬爱的导师王放老师，感谢您在这三年中对我的谆谆教导和悉心指点，对我学习和生活上投入了很多的心血和精力。您的为人处世、科研求学的态度，都时刻给予我前进的方向。一日为师，终生为父，名师之恩永于心。其次要感谢路艳娇师姐、王国强师兄和王亚伟师兄，在我的实验出现问题不能顺利解决的时候，在我写文章出现苦恼时候，您们都会第一时间帮助我，帮我找出问题所在，提出解决办法，帮助我渡过一个个难关。最后要感谢关雪娃同学、方克勇同学以及实验室的师弟师妹们，感谢你们在我需要帮助的时候义不容辞的伸出援手。和你们在一起的日子是我最难忘的时光，也给我留下了美好的回忆。离别不是永久，我们一定会再相聚。59
