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学校代码：10286分类号：O65密级：公开UDC：543学号：152316基于大豆过氧化物酶免疫传感的心肌疾病标志物检测研究生姓名：唐敏导师姓名：刘松琴教授申请学位类别理学硕士学位授予单位东南大学一级学科名称化学论文答辩日期2018年6月4日二级学科名称分析化学学位授予日期2018年月日答辩委员会主席丁收年评阅人王坤丁收年2018年6月6日 硕士学位论文基于大豆过氧化物酶免疫传感的心肌疾病标志物检测专业名称：分析化学研究生姓名：唐敏导师姓名：刘松琴教授 DETECTIONOFCARDIACDISEASEMARKERSBASEDONSOYBEANPEROXIDASEIMMUNOSENSINGAThesisSubmittedtoSoutheastUniversityFortheAcademicDegreeofMasterofScienceBYTangMinSupervisedbyLiuSongqinSchoolofChemistryandChemicalEngineeringSoutheastUniversityApril2018 东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所（含万方数据）、国家图书馆、《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布（包括以电子信息形式刊登）论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布（包括以电子信息形式刊登）授权东南大学研究生院办理。研究生签名：导师签名：日期： 摘要摘要心血管疾病是威胁人类健康的“头号杀手”，急性心肌梗塞（AMI）是主要的心血管疾病。AMI发病突然，急性期死亡率高，约为30%，在AMI的常用诊断方式中，对其生化标志物的检测异常重要。心肌肌钙蛋白I（cTnI）具有高度的心肌特异性，因而被视为诊断AMI的“金标准”，cTnI的灵敏准确检测对于AMI疾病的早期诊断治疗具有重大现实意义。同时，肌酸激酶（CK-MB）是心肌酶谱中具有较高心肌特异性的酶，肌红蛋白(Myo)由于其分子量较小，在AMI发病初期，血液中Myo的浓度迅速增加，因而其对于AMI的诊断具有很高的灵敏度。将血清中cTnI、CK-MB和Myo的检测集成于同一芯片，实现三种心肌疾病血清学标志物的同时检测，可为快速、灵敏、准确AMI的诊断与治疗提供依据和保障。基于此，本论文构建了基于大豆过氧化物酶（SBP）催化鲁米诺（luminol）-双氧水（H2O2）体系检测血清中AMI生化标志物的方法，主要包括以下两部分工作：（1）基于聚乙烯亚胺（PEI）良好的导电性、生物成膜性、以及具有还原性等特性制备了聚乙烯亚胺功能化的还原氧化石墨烯（PEI-RGO），并通过酰胺化反应在其表面固定捕获抗体（Ab1），利用抗原抗体间的特异性识别作用将cTnI抗原（Ag）和大豆过氧化物酶标记的检测抗体（SBP-Ab2）依次固定以形成夹心免疫复合物。在过氧化氢（H2O2）的存在下，利用SBP催化氧化luminol产生的电化学发光信号实现对cTnI的检测。检测的线性范围为5-30000pg/mL，检测限达到3.3pg/mL，构建的免疫传感器对cTnI的检测具有良好的选择性和重现性，同时，用于实际血浆样品的检测时，显示了较好的准确性，这为cTnI的检测提供了选择。（2）构建了一种生物免疫芯片实现对cTnI、CK-MB、Myo三种生化标志物的同时检测。将三种待测抗原对应的捕获抗体固定于硝酸纤维素膜表面，之后依次固定待测抗原和三种对应的检测抗体Ab2-SiO2-SBP形成双抗体夹心免疫结构。在增强剂的存在下，SBP催化luminol-H2O2产生很强的化学发光信号，采集对应位置的发光信号值从而对三种标志物进行同时检测。实验结果表明，免疫传感芯片对cTnI的线性检测范围为0.02-80ng/mL（检测限为0.006ng/mL），CK-MB的线性检测范围为0.2-120ng/mL（检测限为0.067ng/mL），Myo的线性检测范围为0.3-480ng/mL（检测限为0.1ng/mL）。关键词：电化学发光，化学发光，夹心免疫，大豆过氧化物酶，鲁米诺I AbstractAbstractCardiovasculardiseaseisthe“killer”threattohumanhealth,andtheacutemyocardialinfarction(AMI)isamajorcardiovasculardisease.TheonsetofAMIisSudden,andtheacutemortalityrateofabout30%.InthecommondiagnosticmethodsofAMI,thedetectionofitsbiochemicalmarkersisextremelyimportant.CardiactroponinI(cTnI)hashighmyocardialspecificityandisthereforeconsideredthe"goldstandard"forthediagnosisofAMI.ToachievesensitiveandaccuratedetectionofcTnIfortheearlydiagnosisandtreatmentofAMIdiseasehasgreatpracticalsignificance.Atthesametime,creatinekinase(CK-MB)isanenzymewithahighermyocardialspecificityinmyocardialenzymespectrum.Myoglobin(Myo)hasasmallmolecularweight,anditsconcentrationincreasessignificantlyintheearlystageofAMI,therefore,ithasahighersensitivityforthediagnosisofAMI.ThedetectionofcTnI,CK-MBandMyoinserumisintegratedintothesamechip,andthesimultaneousdetectionofthreebiomarkersofmyocardialdiseasescanprovidethebasisandguaranteefortherapid,sensitiveandaccuratediagnosisandtreatmentofAMI.Basedonthis,thispaperconstructedimmunosensorsbasedonsoybeanperoxidase(SBP)catalyzedluminol-hydrogenperoxide(H2O2)systemforthedetectionofbiochemicalmarkersofAMIinserum,includingthefollowingtwoparts:(1)Polyethylenimine-functionalizedgraphene(PEI-RGO)waspreparedbasedonthegoodelectricalconductivity,biofilmformationandreducibilityofpolyethyleneimine(PEI),andthecaptureantibody(Ab1)wasimmobilizedontoitssurfacebyamidereaction.Afterwards,thecTnIantigen(Ag)andthesoybeanperoxidase-labeleddetectionantibody(SBP-Ab2)wereincubatedcontinuouslytoformasandwichimmunecomplexbyrelyingonthespecificrecognitionbetweenantigenandantibody.Inthepresenceofhydrogenperoxide(H2O2),thesensitivedetectionofcTnIwasachievedusingtheelectrochemicalluminescentsignalgeneratedbySBPcatalyzedoxidationofluminol.ThelinearrangeforcTnIdetectionwas5-30000pg/mL,andthedetectionlimitwas3.3pg/mL.TheproposedimmunosensorhadgoodselectivityandreproducibilityforthedetectionofcTnI.Atthesametime,itwasusedforthedetectionofrealplasmasamplesandshowedacceptableaccuracy,whichprovidedachoiceforthedetectionofcTnI.(2)AbiologicalimmunechipwasconstructedtoachievethesimultaneousdetectionofthreebiochemicalmarkersofcTnI,CK-MBandMyo.Thethreecorrespondingcaptureantibodieswereimmobilizedontothesurfaceofthenitrocellulosemembrane,followedbyimmobilizationoftheantigensII AbstractandthecorrespondingdetectionantibodiesAb2-SiO2-SBPtoformadoubleantibodysandwichimmunologicalstructure.Inthepresenceoftheenhancer,SBPcatalyzedluminol-H2O2togenerateastrongchemiluminescentsignal,andtheluminescentsignalvalueatthecorrespondingpositionwasacquiredtoperformsimultaneousdetectionofthethreebiomarkers.TheresultsshowedthatthelineardetectionrangeforcTnIwas0.02-80ng/mL(detectionlimitof0.006ng/mL),thelineardetectionrangeforCK-MBwas0.2-120ng/mL(detectionlimitof0.067ng/mL),andthelineardetectionrangeforMyowas0.3-480ng/mL(detectionlimitof0.1ng/mL).Keywords:Electrochemiluminescence,Chemiluminescence,Sandwich-immune,Soybeanperoxidase,LuminolIII 目录目录摘要...........................................................................................................................................................IAbstract....................................................................................................................................................II目录........................................................................................................................................................IV第一章绪论............................................................................................................................................11.1引言..........................................................................................................................................11.2急性心肌梗塞的常用生化指标..............................................................................................11.2.1心肌肌钙蛋白..............................................................................................................11.2.2肌酸激酶......................................................................................................................21.2.3肌红蛋白......................................................................................................................31.2.4其它生物标志物..........................................................................................................31.3心肌肌钙蛋白I的常用检测方法...........................................................................................41.3.1酶联免疫吸附试验法..................................................................................................41.3.2化学发光免疫试验法..................................................................................................51.3.3荧光免疫试验法..........................................................................................................51.3.4电化学免疫试验法......................................................................................................61.3.5电化学发光免疫试验法..............................................................................................71.3.6表面等离子体共振免疫试验法..................................................................................81.4疾病生化标志物的多指标联合检测......................................................................................91.5大豆过氧化物酶的概述.......................................................................................................111.5.1大豆过氧化物酶与辣根过氧化物酶的比较...........................................................121.5.2过氧化物酶催化氧化luminol电化学发光的机理.................................................131.5.3过氧化物酶催化氧化luminol化学发光的机理.....................................................141.5.4大豆过氧化物酶的应用...........................................................................................141.6本论文的主要研究内容.......................................................................................................15第二章大豆过氧化物酶标记检测抗体作为信号放大剂用于心肌肌钙蛋白I的检测..................162.1前言.......................................................................................................................................162.2实验部分...............................................................................................................................172.2.1试剂与仪器...............................................................................................................172.2.2PEI-RGO复合材料的制备.......................................................................................18IV 目录2.2.3SBP-Ab2偶联物的制备.............................................................................................192.2.4HRP-Ab2偶联物的制备............................................................................................192.2.5Ab1修饰电极的制备.................................................................................................202.2.6构建ECL免疫传感器用于cTnI的检测................................................................202.3结果与讨论...........................................................................................................................212.3.1PEI-RGO纳米复合材料的表征...............................................................................212.3.2电化学免疫传感器组装过程的表征.......................................................................222.3.3SBP-Ab2/Ag/Ab1/PEI-RGO修饰电极的电化学发光响应......................................242.3.4SBP修饰电极与HRP修饰电极对比......................................................................262.3.5优化ECL免疫试验的检测条件..............................................................................272.3.6cTnI的分析检测.......................................................................................................282.3.7免疫传感器的选择性和重现性...............................................................................292.3.8免疫传感器用于实际血浆样品的检测...................................................................302.4本章小结...............................................................................................................................31第三章基于大豆过氧化物酶构建的免疫传感芯片用于心肌梗塞生化标志物的检测.................333.1前言.......................................................................................................................................333.2实验部分...............................................................................................................................343.2.1试剂与仪器...............................................................................................................343.2.2氨基功能化的二氧化硅小球的制备.......................................................................353.2.3三种Ab2-SiO2-SBP生物探针的制备......................................................................353.2.4免疫传感芯片的构建...............................................................................................363.2.5化学发光免疫成像过程...........................................................................................373.3结果与讨论...........................................................................................................................383.3.1SiO2小球的形貌表征与其表面固定酶和抗体的验证............................................383.3.2化学发光免疫成像法同时检测cTnI、CK-MB和Myo........................................393.3.3SPTZ和MORP对luminol-H2O2化学发光体系的增强验证.................................403.3.4发光底物液浓度的优化...........................................................................................413.3.5cTnI、CK-MB和Myo的分析检测.........................................................................423.4本章小结...............................................................................................................................42第四章总结与展望.............................................................................................................................444.1总结.......................................................................................................................................444.2展望.......................................................................................................................................44V 目录参考文献...............................................................................................................................................46攻读硕士学位期间的研究成果...........................................................................................................59致谢.......................................................................................................................................................60VI 第一章绪论第一章绪论1.1引言在全球范围内，无论是男性还是女性，心血管疾病都是危害人类健康的“主要杀手”[1,2]，此外，心血管疾病的发病率和死亡率在低收入国家较高，高收入国家较低，同时，相比于农村地区，城市地区的发病率和死亡率更低[3]。此时发展更好的疾病风险评估和治疗方法来预防和控制心血管疾病成为必然的需求。急性心肌梗塞（AcuteMyocardialInfarction，AMI）是主要的心血管疾病，它主要是由冠状动脉阻塞引发的心脏供血不足导致的[4,5]。在急性心肌梗塞发生的短时间内，会对心肌细胞造成不可逆的损伤，并可能引发各种并发症，从而严重威胁患者的生命安全[6]。因而，对于急性心肌梗塞患者进行早期诊断并采取及时有效的治疗措施是降低心肌梗塞的死亡率并提高患者生存率的关键。目前对AMI疾病的常用诊断方式有三种：临床症状、心电图异常、以及生化标志物的检测。但由于1/3病人的临床症状表现不明显，约50%病人的心电图变化不能够用于AMI疾病的充分诊断，尤其，急性心包炎、左心室肥大、左束支传导阻滞等疾病的患者也会出现特征性ST段的变化[7,8]，而临床生化标志物以其高度的特异性、灵敏性而受到研究者的广泛青睐[9-11]，因而实现对AMI疾病临床生化标志物的灵敏检测对于其早期的诊断治疗具有重大意义。1.2急性心肌梗塞的常用生化指标心肌生化标志物是心肌的指示剂，理想的心肌生化标志物应具有如下特征：当心肌细胞发生损伤时，心肌生化标志物能够快速释放进入血液中参与循环，并具有较长的循环半周期；容易检测，并能较快获得可靠、有意义的检测结果；具有高度的心肌特异性和灵敏性，当血液中这些生化标志物的含量增加时能够很好的说明是由于心肌发生损伤所致[12,13]。常用的诊断急性心肌梗塞的生化标志物有以下几种：1.2.1心肌肌钙蛋白心肌肌钙蛋白（CardiacTroponin,cTn）是心肌细胞所特有的一种结构蛋白，是具有1 东南大学硕士学位论文高度心肌特异性和灵敏性的生物化学标志物[14,15]。通常，肌钙蛋白和原肌球蛋白沿着聚合的肌动蛋白，共同构成肌丝的骨架，其中，肌钙蛋白：原肌球蛋白：肌动蛋白比率为1：1：7[16]。心肌肌钙蛋白由三个亚基组成：cTnC（与Ca2+结合的亚基）、cTnI（抑制型的亚基）和cTnT（与原肌球蛋白结合的亚基），它们形成复合物共同调控钙离子（Ca2+）与肌动蛋白和肌球蛋白间的反应，进而调节肌肉的收缩活动。其中，cTnI是由具有独特氨基酸序列的基因形成的产物，并且其在胎儿和健康或者疾病状态的成人骨骼肌中都不表达，因而具有高度的心肌特异性[17-19]。cTnI是一种单链多肽，分子量为24kDa，在正常人的血液中，cTnI的含量一般低于0.3µg/L，当发生心肌损伤时，cTnI在4-12小时内被快速释放到血液中，并且可维持4-10天处于较高水平。发生心肌损伤时，细胞膜的完整性被破坏，细胞溶质中游离的肌钙蛋白快速透过细胞膜进入血液中，引起血液中肌钙蛋白水平的首次升高，随着损伤的加重，固定于细胞肌丝上的肌钙蛋白分解也渗透进入血液中，引起血清中肌钙蛋白水平的二次升高，如图1-1所示[20-22]。图1-1AMI发生后，cTnI释放动力学曲线[23]1.2.2肌酸激酶肌酸激酶（CreatineKinase，CK）是细胞内一种重要的能量代谢酶，在人体内广泛分布，其中，以骨骼肌中含量最多，其次为心肌、脑和平滑肌。VanderVeen等人在1966年[24]发现，肌酸激酶是一种二聚体，由M和B两个亚基组成，并能够形成CK-MM、CK-MB、CK-BB三种形式的同工酶。其中，对于CK-MB同工酶而言，其98%-99%存在于心肌细胞内，因而它是具有较高心肌特异性的酶[25]。CK-MB的相对分子量为862 第一章绪论kDa，当发生心肌梗塞时，CK-MB的含量在4-6小时内开始升高，并在12-24小时达到高峰，约为正常含量的20倍，大约2天降至正常值。1979年，世界卫生组织（WTO）会同一些主要的心脏病团体共同制定的诊断AMI的三条标准中，其中有一条就是测定CK-MB含量的变化，基于CK-MB对于心肌梗塞诊断的特异性和灵敏性，其在相当一段时间内，被视为诊断AMI的标准[26-28]。1.2.3肌红蛋白肌红蛋白（Myoglobin，Myo）是由一条珠蛋白多肽链和一个血红蛋白辅基组成的球状结合蛋白，是肌细胞中载氧的色素，参与葡萄糖的氧化过程，主要分布于心肌和骨骼肌中[29]。肌红蛋白相对分子量小，仅为17.8kDa，当发生心肌梗塞时，肌细胞细胞膜的完整性被破坏，肌红蛋白直接渗透进入血液中。由于其较小的分子量，使得在发生心肌梗塞后1.5小时血液中肌红蛋白的含量开始升高，并在5-12小时达到峰值，24小时时恢复为正常值。肌红蛋白含量的变化对于心肌梗塞的诊断具有很高的灵敏度，但是，当患者发生肾衰竭或者骨骼肌受损时也会引起血液中肌红蛋白含量的增加，其对于心肌的特异性较低，因而，将肌红蛋白与其它生物标志物（CK-MB、cTnI等）联合检测，以同时满足诊断的灵敏性和特异性要求[30]。1.2.4其它生物标志物其它的用于诊断急性心肌梗塞的生化标志物有：超敏C-反应蛋白（Hs-CRP）[31]、糖原磷酸化酶（GPBB）[32,33]、乳酸脱氢酶（LDH）[34,35]、门冬氨酸氨基转移酶（AST）[36]、心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）[37,38]、B型钠尿肽（BNP）[39,40]、肝细胞生长因子[41]等。实现对这些标志物的灵敏检测能够提高对AMI疾病诊断的灵敏性、识别患者疾病的危险分层、并采取相应的诊断措施。从总的发展趋势来看，随着现代医学研究的不断发展，心肌损伤的标志物从早先的检测酶的活性为主，发展到现如今的检测蛋白质的质量浓度，包含多种心肌损伤生化标志物的检测。同时，在单个生物标志物检测的基础上，将多个生物标志物进行联合互补检测，以此提高检测的准确度和灵敏度，从而弥补单一标志物检测的不足[42,43]。表1-1列出了心肌损伤的部分生化标志物及其特性。3 东南大学硕士学位论文表1-1部分心肌损伤标志物[23]半衰期标志物名称分子量（Da）临界值增高（h）高峰（h）恢复（d）（h）C反应蛋白（CRP）120000193mg/L612-242-3糖原磷酸化酶BB1880004-67µg/L2-412-241-2（GPBB）脂肪酸结合蛋白（FABP）145001-419µg/L2-66-121肌红蛋白（Myo）178000.2580µg/L2-66-121肌酸激酶MB（CK-MB）8600012-165µg/L6-1012-242-3心肌肌钙蛋白I（cTnI）240001-40.2µg/L6-1212-246-101.3心肌肌钙蛋白I的常用检测方法心肌肌钙蛋白I被视为诊断急性心肌梗塞的“金标准”，它作为良好的心肌指示剂，能够被用于AMI的诊断检测，实现对其灵敏准确的检测对于AMI疾病的早期诊断治疗具有重大意义。目前已经报道了多种研究方法实现对cTnI的灵敏准确检测。1.3.1酶联免疫吸附试验法Bodor等人[44]合成了八种对人的cTnI抗原能够特异性识别的单克隆抗体，并通过测试筛选出了五种具有心肌特异性的抗体，取其中的两种单克隆抗体用于免疫试验，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法（ELISA）将制备的单克隆抗体用于人和动物血清中cTnI的灵敏检测。首先，将能够特异性识别肌钙蛋白的捕获抗体固定到96孔板上，并在其上孵育cTnI抗原，接着依次孵育生物素功能化的检测抗体，碱性磷酸酶标记的亲和素，并通过酶催化PNPP的显色反应实现对cTnI的灵敏检测。实验结果表明，构建的这种夹心免疫的ELISA法对cTnI的检测具有很高的特异性和灵敏性，且具有比放射免疫试验更高的特异性，同时，他们构建的这种基于抗体的特异性夹心免疫试验能够很好地消除来自于组织的肌钙蛋白带来的可能的干扰。4 第一章绪论1.3.2化学发光免疫试验法Cho等人[45]构建了一种基于化学发光的ELISA-on-a-chip（EOC）生物传感器能够被用于即时监控检测cTnI。如图1-2所示，构建的这种EOC由底部和顶部两个塑料板构成，芯片底板由沿垂直和水平方向排列的两个流体通道组成。垂直方向的流动可实现抗原抗体间的免疫反应，水平方向的流动提供了酶的作用底物。该传感平台将免疫层析技术和酶示踪技术进行了结合，并利用CCD采集酶（HRP）催化氧化底物（luminol-H2O2）产生的化学发光信号从而为床旁检测的实现提供了可能。实验结果表明，构建的这种基于化学发光的EOC生物传感器的检测灵敏度比传统检测试剂盒的检测灵敏度提高了近10倍，展现了优越的检测性能。图1-2HRP作为示踪剂催化产生化学发光信号的检测示意图[45]1.3.3荧光免疫试验法Song等人[46]通过构建fluoro-microbeadguidingchip（FMGC）发展了一种新的生物免疫传感装置可用于cTnI的灵敏检测。如图1-3所示，设计的这种FMGC有四个免疫反应区域，能够实现高通量的同时检测。cTnI的检测是通过使用抗体标记的荧光微球形成的夹心免疫试验得以实现，首先，将anti-cTnI捕获抗体偶联固定于FMGC的表面形成自组装的传感单层，接着加入含有cTnI的样品到传感层进行免疫反应，最后加入anti-cTnI检测抗体偶联的荧光微球反应。样品中cTnI的浓度可通过肉眼计数对应区域荧光微球的数量从而进行准确检测，同时对芯片表面进行适当的处理能够极大地降低非特异性吸附实现较高的检测灵敏度。实验结果表明，构建的这种基于FMGC的生物传5 东南大学硕士学位论文感系统对cTnI的检测显示了较好的特异性和灵敏性，具有比传统ELISA方法更低的检测限和更宽的检测范围，同时实现了高通量检测。图1-3FMGC的设计图（A）和照片图（B），以及夹心免疫示意图（C），其中，System1为抗原-抗体结合过程，System2为加入生物素-亲和素结合过程[46]1.3.4电化学免疫试验法Feng等人[47]构建了一种新的能够同时进行多个分析的电化学免疫试验方法实现对cTnI和FABP的超灵敏检测。如图1-4所示，将捕获抗体固定在氧化石墨烯纳米带（GONRs）上，GONRs大的比表面积能够负载更多数量的捕获抗体从而能够有效进行信号放大。利用离子间的交换能力将Cd2+和Zn2+嵌入到磷酸钛纳米球中形成金属离子功能化的磷酸钛纳米球（TiP-metalion）标记物，其中，在TiP-Cd2+上固定anti-cTnI检测抗体，在TiP-Zn2+上固定anti-FABP检测抗体。生物耦合物中的金属离子能够通过方波伏安法被直接检测而不需要经过酸溶解和预浓缩的过程，这极大地简化了实验步骤，减少了检测时间，同时，金属离子功能化的磷酸钛纳米球中含有的高浓度的金属离子在还原过程中能够很好的放大检测信号。实验结果表明，构建的电化学免疫试验具有很好的稳定性、重现性和精确性，并且同时检测cTnI和FABP时，没有明显的交叉反应，展现了优良的检测性能。6 第一章绪论图1-4Ab2功能化的TiP-Cd2+和TiP-Zn2+探针的制备（A）和免疫传感器的构建过程示意图（B）[47]1.3.5电化学发光免疫试验法图1-5Ab2/luminol-Pt@AuNFs/ChOx探针制备过程（A）、电化学发光信号产生机理（B）、MnO2@MWNTs的制备过程（C）[48]袁若课题组[48]构建了一种基于luminol-Pt@AuNFs的电化学发光免疫传感平台用于cTnI的灵敏检测。如图1-5所示，luminol作为还原剂，将HAuCl4和H2PtCl6还原制备得到luminol-Pt@AuNFs纳米花结构的复合物，并在该复合物表面负载生物胆碱氧化酶（ChOx）和anti-cTnI检测抗体，其对于H2O2的氧化具有很好的催化性能。MnO2功能7 东南大学硕士学位论文化的多壁碳纳米管也能够很好的催化H2O2的氧化，并且其较大的比表面积能够负载更多数量的anti-cTnI捕获抗体从而提高检测的灵敏度，良好的导电性有利于电极表面的电子传递。由于生物胆碱氧化酶比传统的葡萄糖氧化酶具有更高的催化效率，因而在电化学发光传感体系中，选择生物胆碱氧化酶氧化生物胆碱产生H2O2，并利用luminol-Pt@AuNFs模拟HRP催化H2O2的氧化反应，进一步氧化luminol产生电化学发光信号。实验结果表明，设计的这种生物胆碱氧化酶和Pt@AuNFs类双酶体系能够显著地放大luminol的电化学发光信号，并对cTnI的检测具有很好的灵敏度和选择性。1.3.6表面等离子体共振免疫试验法Wei等人[49]构建了一种基于表面等离子体共振（SPR）的无需标记的夹心免疫传感方法用于cTnI的测量。如图1-6所示，在芯片表面镀一层金膜，并用香柏油将芯片固定于棱镜的底部，首先用巯基丙酸将金膜表面进行活化使其带有羧基，接着用EDC/NHS活化金膜表面的羧基，之后加入亲和素孵育制得亲和素功能化的金膜。然后利用生物素-亲和素之间的高度亲和作用将生物素化的anti-cTnI捕获抗体固定于金膜表面，并利用抗原抗体间的特异性识别作用依次将cTnI抗原和anti-cTnI检测抗体固定于金膜表面，通过测量共振波长的变化实现对cTnI的检测。实验结果表明，在中间层中引入生物素-亲和素比单纯的单层巯基丙酸传感膜的检测灵敏度增加了至少两倍，同时，与直接免疫法检测cTnI固定于捕获抗体上时引发的共振波长的变化相比，采用夹心免疫法检测固定上第二检测抗体之后引发的共振波长的变化灵敏度更高，比直接免疫法检测的灵敏度提高了近10倍。这种基于SPR构建的免疫传感系统分析速度快，且无需标记，为临床血清中cTnI的检测提供了可能。图1-6SPR检测过程示意图[49]8 第一章绪论1.4疾病生化标志物的多指标联合检测疾病生化标志物的快速、准确、高通量检测对于其早期诊断治疗具有至关重要的作用[50,51]。当没有肿瘤时，血液中的肿瘤标志物处于痕量水平，一旦有肿瘤形成，这些标志物在血液中的含量便会升高。在疾病的早期阶段，大多数生化标志物的浓度极低且单个标志物在癌症诊断中的特异性有限[52,53]导致需要灵敏的多重免疫测定实验来检测一组肿瘤标志物，这不但增加了工作量，而且需要较长的检测时间，可能导致错过最佳诊疗时间。基于此，研究者们设计了多组分的免疫传感阵列实现对多个组分的同时高通量检测，从而实现对疾病的快速诊断。鞠熀先老师课题组[53]利用丝网印刷技术和流动注射技术构建了一种电化学免疫传感阵列实现对唐氏综合症四种生化标志物的同时检测分析。检测过程如图1-7所示，在氧化还原介体接枝的生物聚合物（CHIT-TBO）修饰的丝网印刷碳电极阵列中固定癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（α-AFP）、β-人绒毛膜促性腺激素（β-HCG）和癌抗原125（CA125）四种分析物,并通过竞争性免疫反应固定上相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体，在TBO作为介质存在下，通过监测HRP催化H2O2的反应中电流的变化实现检测过程。他们构建的这种电化学免疫传感阵列简单快速、分析时间短、能够实现高通量同时检测四种标志物、并且获得了较低的检测限，为多个分析物的同时检测提供了选择。图1-7免疫传感阵列示意图[53]9 东南大学硕士学位论文同时，他们[54]还构建了一种基于化学发光的免疫传感阵列实现对唐氏综合症四种标志物的同时检测分析。如图1-8所示，将生物素化的DNA与含有多个G-四联体序列的信号DNA组装到金纳米粒子表面，然后与氯化血红素反应形成多层hemin/G-quadruplexDNAzyme包裹的金纳米颗粒（M-DNAzyme/AuNP）生物探针。它可以通过生物素与链霉亲和素之间的识别作用结合到双抗体夹心结构的生物素化检测抗体上，并催化luminol-H2O2产生强烈的化学发光信号，通过电荷耦合装置收集对应位置的化学发光信号实现检测过程。他们设计的这种免疫传感阵列测定方法简单、廉价且以高通量的方式显示出高的灵敏度和宽的线性范围。作为通用信号标记和蛋白质芯片的DNAzyme/AuNP可适用于批量生产，能够用于经济，便携的多分析物测定，这使其在临床和其他相关领域显示出巨大的应用潜力。图1-8M-DNAzyme/AuNP的制备过程（A）,免疫传感制备及化学发光过程（B），四种血清标志物的化学发光免疫传感阵列（C）[54]10 第一章绪论同时，我们课题组[55]也构建了蛋白芯片实现对唐氏综合症四个肿瘤标记物的同时检测分析。如图1-9所示，利用点样仪在硝酸纤维素膜的表面固定四种捕获抗体，并依次固定待测抗原、生物素化的检测抗体、大豆过氧化物酶标记的链霉亲和素（SBP-SA）形成免疫复合物，利用SBP催化luminol-H2O2产生强的稳定的化学发光信号，用CCD采集对应位置的发光信号从而实现同时检测过程。设计的这种蛋白芯片简单便捷，能够实现高通量检测四种唐氏综合征筛查相关的标志物，并具有较好的选择性、稳定性和重现性，这使其具有很好的应用前景，同时，拓宽了SBP的应用。图1-9蛋白芯片构建与检测过程[55]1.5大豆过氧化物酶的概述大豆过氧化物酶（Soybeanperoxidase，SBP）是一种存在于大豆种皮中的糖蛋白，分子量为37kDa，属于植物过氧化物酶家族Ⅲ类酶中的分泌型的植物过氧化物酶[56]。其结构如图1-10A，SBP分子由两个不同的结构域组成，含有2个Ca2+，中间包埋的血红素辅基结构域由77%的α-螺旋、7%的β-折叠和16%的β-转角组成。SBP由306个氨基酸残基组成，并含有分子量约18%的糖基，等电点为3.9，属于酸性蛋白质。11 东南大学硕士学位论文1.5.1大豆过氧化物酶与辣根过氧化物酶的比较大豆过氧化物酶与辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase，HRP）同属于植物过氧化物酶家族的Ⅲ类酶。它们的结构如图1-10所示，它们具有相似的三维结构，氨基酸序列表现出57%的一致性，并具有如下共同特征：都包含有Fe(III)原卟啉辅酶基团、具有相似的催化机理、保留有相同的催化残基、且都包含有1个色氨酸、4个二硫键、以及位于血红素远端和近端的2个Ca2+结合位点和8个聚糖[57]。图1-10SBP（A）和HRP（B）的三维结构图[58]与辣根过氧化物酶相比，SBP具有如下优势：一、SBP来源于广泛的大豆产业，将大豆的种皮经过普通的处理之后即可得到具有高效催化性能的大豆过氧化物酶，这极大地减少了精细纯化蛋白的费用[59]。二、相比于HRP，阴离子的SBP具有更好的热稳定性，这可能是因为二者中与血红素相连的氨基酸活性位点不同，SBP中的Met37和血红素中的C8基团有很强的亲和作用，使得SBP能够更紧密地与血红素相连，从而使得SBP分子结构具有更强的稳定性[60]。三、SBP具有更宽的pH作用范围，SBP的最适pH为5-6，并在pH3-8的范围内保持较高的活性，作用范围可达pH2-11。四、SBP作用的底物范围宽，它不但能够氧化一般过氧化物酶的作用底物，如对甲苯酚、联苯三酚、抗坏血酸、苯胺、NADH等，而且还能够氧化多种木素单体模型物。五、SBP具有更好的催化活性和稳定性，阴离子的SBP在没有增强剂存在时就能够很好的催化luminol-H2O2的化学发光反应，同时，SBP不容易被氧化反应产物作用而失活，因而会产生较长时间的发光信号。但是，HRP催化氧化反应的效率较低，它催化H2O2氧化luminol的过程中需要加入发光增强剂，同时，在HRP催化增强的化学发光反应中，H2O2的氧化自由基产物容易使得阳离子的HRP失活从而导致发光的快速衰减[61]。12 第一章绪论1.5.2过氧化物酶催化氧化luminol电化学发光的机理图1-11碱性溶液中luminol的电化学发光机理[62]电化学发光是一种将电能转化为辐射能的方法，主要包括物质聚集在电极表面，经过电子转移反应之后形成中间激发态，进而从激发态回到基态并伴随发射光的过程。1929年科学工作者首次报道了luminol在电极上的光发射反应，通过在电极上施加2.8V的电压，在碱性水溶液中检测到了luminol的电化学发光信号。在此之后越来越多的学者加入了研究luminol电化学发光的队伍中[63-65]。luminol在电极上的电化学发光反应过程如图1-11所示，首先，luminol在碱性溶液中去质子化形成阴离子，随后经过电化学氧化过程，同时过氧化物酶催化底物H2O2形成活性氧自由基，电化学氧化反应形成的中间产物进一步被活性氧氧化为3-氨基邻苯二甲酸激发态，随后激发态回到基态并于425nm处发射蓝光。反应途径随施加电压的不同而有微小的差异，同时，luminol的氧化反应是不可逆过程，电化学发光信号会随时间的推移出现减弱现象[66]。luminol-H2O2体系的电化学发光反应能够被用于多种分析物的检测，其中，对H2O2的检测能够达到皮摩尔的灵敏度[67,68]，luminol自身的检测能够达到亚纳摩尔的浓度[69,70]。13 东南大学硕士学位论文1.5.3过氧化物酶催化氧化luminol化学发光的机理阳离子的HRP和阴离子的SBP都能够催化氧化luminol产生化学发光信号，并且它们催化luminol-H2O2体系产生化学发光信号的机理相似，但是SBP比HRP具有更好的催化活性和稳定性。SBP催化氧化luminol产生化学发光的过程如下所示[71]：其中，E、EI和EII分别表示过氧化物酶和它的两个中间化合物，A和A分别表示luminol和它的单电子氧化自由基产物。首先，过氧化物酶与H2O2反应生成中间化合物EI，之后该中间化合物EI与luminol反应生成中间化合物EII和luminol的单电子氧化自由基，随后EII与luminol反应回到其基态E，同时也有luminol的单电子氧化自由基产物生成，此时，氧化态的不稳定的luminol单电子氧化自由基产物容易转化为3-氨基邻苯二甲酸，这一过程中伴随发射425nm的蓝光。1.5.4大豆过氧化物酶的应用虽然HRP是传统使用的过氧化物酶，但是，随着SBP在九十年代的出现，它就引起了广大研究者的兴趣，SBP以其卓越的催化活性和稳定性等而被广泛应用。其应用主要集中在以下几个领域：（1）生物传感领域：SBP在宽范围的pH中都能较好的保持其活性，这为其在生物传感领域的应用提供了可能。第一个将SBP应用于生物传感器的是Vreeke及其同事，他们在1995年使用锇基介导的热稳定有线大豆过氧化物酶电极，促进电子在电极表面的转移[72]，并取得了很好的检测结果。之后，SBP被广泛应用于生物传感领域，其中SBP大多作为中间媒介物，催化H[73]2O2发生电化学氧化过程进而实现电化学检测过程。（2）环境保护领域：通过氧化偶联反应，大豆过氧化物酶被用于催化一系列的酚类和苯胺类化合物的转化，从而实现对废水的处理。这一过程是通过酶催化H2O2的产物进一步将污染物氧化为自由基，然后其自发的偶联形成二聚体，二聚体通常是酶的底物，可转化为自由基以参与进一步的氧化偶联反应，由此产生连续较大的产物，直到它们从溶液中沉淀出来，通过过滤或沉淀的方法除去沉淀物即可[74]。14 第一章绪论（3）有机和高分子合成领域：大豆过氧化物酶能够在2-丙醇/磷酸盐缓冲溶液中催化腰果酚的氧化聚合，并在6小时内产生62%的聚卡多醇，实验结果表明，相比于其它溶剂，使用2-丙醇为溶剂时，获得的产率是最高的[75]，反应过程是通过大豆过氧化物酶催化氧化H2O2的产物进一步氧化聚合腰果酚实现的。（4）分析和诊断试剂盒领域：SBP作为标记酶可被固定于抗原或抗体上，利用夹心免疫法、间接免疫法、竞争免疫法等可用于检测一系列的疾病生化标志物[55,76]，并且可制备成试剂盒用于实际应用检测。与此同时，基于SBP制备的试剂盒可存储一年，其性能和质量均高于传统的基于HRP构建的免疫试剂盒（HRP制得的试剂盒的存储期一般为4个月），具有很好的应用价值。1.6本论文的主要研究内容AMI是主要的心血管疾病，对其进行早期的诊断监测有利于疾病的早期分层治疗，cTnI作为灵敏的心肌指示剂，被视为诊断AMI的“金标准”，CK-MB是心肌酶谱中具有较高心肌特异性的酶，Myo由于其分子量较小，在AMI发病初期，血液中Myo的浓度就快速增加，因而其对于AMI的诊断具有很高的灵敏度。因此建立免疫试验方法实现对这些心肌生化标志物的灵敏检测具有十分重要的意义。具体工作如下：（1）利用聚乙烯亚胺对氧化石墨烯进行还原成功制备了聚乙烯亚胺功能化的石墨烯，制备的这种纳米复合材料在水溶液中具有很好的分散性和稳定性，将其修饰于电极表面其良好的导电性有利于电子的传递，同时其大的比表面积有利于捕获抗体的固定。此外，合成SBP标记的检测抗体，采用夹心免疫法在电极表面形成SBP标记的免疫复合物，在H2O2的存在下，SBP能够放大luminol的电化学发光信号从而实现对cTnI的灵敏检测。（2）构建一种生物免疫芯片，实现对三种心肌生化标志物的同时检测。在硝酸纤维素膜的表面固定上三种捕获抗体，然后依次加入对应的抗原和Ab2-SiO2-SBP检测抗体进行孵育形成夹心免疫复合物，在发光增强剂SPTZ和MORP的作用下，SBP催化H2O2氧化luminol产生化学发光信号，采集对应位置的发光强度实现高通量的同时检测过程。15 第二章大豆过氧化物酶标记检测抗体作为信号放大剂用于心肌肌钙蛋白I的检测第二章大豆过氧化物酶标记检测抗体作为信号放大剂用于心肌肌钙蛋白I的检测2.1前言心肌肌钙蛋白I（cTnI）由于其独特的心肌特异性和选择性，被视为诊断急性心肌梗塞的“金标准”。实现对cTnI的灵敏检测有利于急性心肌梗塞疾病（AMI）初期的预防、诊断和治疗，同时有助于对急性冠状动脉综合症患者的危险进行分层[77,78]，从而采取相应的治疗措施。cTnI是由211个氨基酸组成的多肽单链，分子量为23.9kDa，只存在于心肌中[79]。当发生心肌损伤时，cTnI被快速释放到血液中，并且心肌损伤程度越严重，释放到血液中的cTnI的含量越多[80]。欧洲心脏病协会和美国心脏病协会宣布称当血清中cTnI的浓度在0.1到2ng/mL的浓度范围内时表明心肌细胞坏死[81]。目前，研究者已经构建了一些免疫试验方法用于检测血清/血浆中cTnI的含量，主要有酶联免疫吸附试验法（ELISA）[82]、化学发光免疫试验法[45,83]、荧光免疫实验法[84,85]、基于表面等离子体共振的免疫试验法[49,86]、基于比色的免疫试验法[87]。在这些免疫试验方法中，其中一些具有无须标记、快速和高通量检测cTnI的特点，甚至一些方法已经被用于实际的临床诊断应用。然而在一些需要更高灵敏度检测的领域，这些方法的应用受到了一定的限制，尤其，血清中低浓度cTnI的灵敏检测对于疾病早期阶段的介入治疗具有十分重要的作用。大豆过氧化物酶（SBP）是一种糖蛋白，隶属于植物过氧化物酶家族的Ⅲ类酶，分子量为37kDa。SBP由三部分组成：13个α-螺旋，2个β-链和4个主要的活性部位残基提供其活性[56,88]。SBP催化过氧化氢（H2O2）的产物能够氧化一系列的有机无机化合物，其催化机理与传统使用的辣根过氧化物酶（HRP）催化H2O2的机理相似。在催化过程中，首先铁卟啉被H2O2氧化产生中间态化合物I，随后发生单电子的还原反应并形成中间化合物II，随后中间化合物II快速分解并返回其基态[89,90]。相比于HRP，SBP能够在更宽范围的温度和pH条件下保持活性，这一特性为SBP在生物传感和诊断领域的应用提供了潜在的可能。Sakharov和他的同事将大豆过氧化物酶标记的抗体用于酶联免疫吸附试验和化学发光的免疫试验，他们将SBP标记的抗体和HRP标记的抗体进行16 东南大学硕士学位论文了比较，结果表明SBP标记的抗体形成的免疫传感器具有明显的的优势[61,91]。我们课题组之前的研究也证实了SBP催化的luminol-H2O2化学发光反应的发光强度随时间的衰减比HRP催化的发光反应衰减的慢，这主要是因为HRP催化H2O2的产物会使得阳离子的HRP失活[76]，其它的研究也得出了相同的结论[92,93]。这些卓越的性能使得SBP在生物传感领域具有广泛的应用。电化学发光（ECL）是一种将电化学技术与化学发光法相结合的技术，主要包括物质在电极表面的聚集并发生电子转移反应形成激发态，之后由激发态回到基态并伴随发射光的过程[65,94]。与传统的免疫试验方法相比，ECL免疫试验法具有分析速度快，灵敏度高的特点，这些优势使得其被广泛应用于疾病相关生化标志物的检测分析[95-97]。本章利用静电作用将带正电荷的聚乙烯亚胺（PEI）与带负电荷的氧化石墨烯（GO）结合形成均匀稳定的分散液，之后，PEI作为还原剂、助分散剂、表面修饰剂和聚合物电解质将GO进行还原制备了具有良好导电性、成膜性、并在水中能够均匀分散的聚乙烯亚胺功能化的还原氧化石墨烯（PEI-RGO）。对合成的PEI-RGO进行了相关表征。合成了大豆过氧化物酶标记的检测抗体（SBP-Ab2），并采用相同的方法合成了辣根过氧化物酶标记的检测抗体（HRP-Ab2）作为对照。应用合成的SBP-Ab2构建电化学发光夹心免疫传感器，研究了luminol在该SBP修饰电极上的电化学发光响应行为。将合成的PEI-RGO纳米复合材料修饰于玻碳电极表面，之后，以戊二醛为交联剂，将anti-cTnI捕获抗体固定到电极表面，并依靠抗原-抗体间的特异性识别作用，将cTnI抗原和SBP-Ab2依次固定到电极表面形成夹心免疫传感器，对传感器构建过程中的每一步组装进行了相关表征。猜测了这种SBP修饰电极对luminol-H2O2电化学发光过程的可能的催化机理，并利用luminol产生的强的稳定的电化学发光信号实现对cTnI的定量灵敏检测。2.2实验部分2.2.1试剂与仪器两种鼠抗人的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体（anti-cTnI捕获抗体，Ab1，3.51mg/mL；anti-cTnI检测抗体，Ab2，1.85mg/mL）以及纯化的人的心肌肌钙蛋白I（cTnI，Ag，2.45mg/mL）购于美国R&Dsystems有限公司。人体绒毛膜促性腺激素（HCG）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、前列腺特异性抗原（PSA）都是从美国Fitzgerald工业公司购买。临床血浆样品由南京鼓楼医院提供。大豆过氧化物酶（SBP，EC1.11.1.7，RZ3.29）购买于17 第二章大豆过氧化物酶标记检测抗体作为信号放大剂用于心肌肌钙蛋白I的检测美国Bio-ResearchProducts有限公司，辣根过氧化物酶（HRP，EC1.11.1.7，RZ3.4）购买于BBI生命科学公司。牛血清白蛋白（BSA）购于南京凯基生物科技有限公司。氧化石墨购于南京先锋纳米材料科技有限公司。鲁米诺（luminol）和聚乙烯亚胺（PEI，50%水溶液）购于Sigma-Aldrich贸易有限公司。透析袋（Mw=8000～14000）购于南京晶格化学科技有限公司。高碘酸钠（NaIO4）、硼氢化钠（NaBH4）、氯化钾（KCl）、双氧水（H2O2）、乙二醇（C2H6O2）、无水乙醇（C2H5OH）、戊二醛（C5H8O2）、磷酸二氢钠（NaH2PO42H20）、磷酸氢二钠（Na2HPO412H20）、醋酸钠（CH3COONa）、冰醋酸（CH3COOH）、碳酸钠（Na2CO3）、碳酸氢钠（NaHCO3）购于国药集团化学试剂有限公司。铁氰化钾（K3Fe(CN)6）和亚铁氰化钾（K4[Fe(CN)6]3H20）购于上海凌峰化学试剂有限公司。超滤离心管（体积：0.5mL；分子量：30kDa）购于Millipore公司。10mM磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4）由10mMNaH2PO42H20、10mMNa2HPO412H20和0.15MNaCl混合制备而成，50mM碳酸盐缓冲溶液（CBS，pH9.6）由50mMNa2CO3和50mMNaHCO3混合制备而成，50mM醋酸盐缓冲溶液（HAc-NaAc，pH5.6）由CH3COOH和50mMCH3COONa调节制备而成。所有试剂除特别说明外均为分析纯，所有试剂在使用前都未经额外处理，整个实验过程中使用Thermo超纯水（阻抗>18MΩ·cm），实验中所有溶液均用超纯水配置。离心机（Eppendorf，Germany）用于分离除去未完全剥离的氧化石墨以及合成的SBP-Ab2复合物中游离的SBP，透射电子显微镜（TEM，JEM-2100，Japan）用于观察合成的PEI-RGO的形貌，紫外可见吸收光谱（UV-vis，AgilentTechnologies，USA）和拉曼光谱（Roman，ThermoFisherScientificCompany，USA）用于表征氧化石墨烯还原前后组成和结构的变化。电化学工作站CHI750C（上海辰华仪器有限公司，中国）用于表征电化学免疫传感器组装过程中循环伏安（CV）的变化，电化学工作站versaSTAT3（普林斯顿应用研究公司，美国）用于监测电化学免疫传感器组装过程中电化学阻抗（EIS）的变化，表面等离子体共振（SPR，长春应用化学研究所，中国）用于监测免疫传感器构建过程中金片表面共振角的变化，MPI-E电化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司，中国）用于电化学发光信号的测量。2.2.2PEI-RGO复合材料的制备1.GO的制备18 东南大学硕士学位论文称取180mg氧化石墨粉末将其分散于60mL的超纯水中，并于超声波中超声6h，将超声之后所得溶液在3000rpm/min转速下离心30min除去未完全剥离的氧化石墨，此时的上清液即为均匀的氧化石墨烯分散液。之后，将制备的这种氧化石墨烯分散液在透析袋中透析一周除去溶液中残存的盐离子。2.PEI-RGO的制备取3mL上述制备的氧化石墨烯分散液（约2mg/mL）用超纯水稀释到50mL，并在搅拌的条件下，将上述稀释后的氧化石墨烯分散液（约0.12mg/mL）逐滴加入到10mL的聚乙烯亚胺溶液（0.2wt%）中搅拌并超声，随后将混合物加热到135℃并保持回流5h（这一反应过程中混合物的颜色由棕色变为黑色）。反应结束之后，将产物在13200rpm/min的转速下离心并用超纯水洗涤数次，将最终的制备的PEI-RGO复合材料分散到7.5mL的超纯水中备用。2.2.3SBP-Ab2偶联物的制备采用高碘酸钠法制备大豆过氧化物酶标记的检测抗体（SBP-Ab2），首先，称取4mg大豆过氧化物酶粉末溶解于500L的磷酸盐缓冲溶液中，取20L12.8mg/mL的NaIO4溶液（用醋酸盐缓冲溶液溶解）与上述SBP溶液（20L）混合，并将混合之后的溶液在室温下搅拌15min。这一反应过程中NaIO4将SBP分子中的糖苷键氧化为醛基，此时溶液颜色变为翠绿色。随后向上述混合溶液中加入20L乙二醇（1%）反应30min，乙二醇可将过量的NaIO4反应除去，然后将反应后的混合溶液转移至超滤离心管（体积：0.5mL，分子量：30kDa）中，用200µL碳酸盐缓冲溶液离心清洗3次。采用碳酸盐缓冲溶液的目的是为后续的席夫碱反应提供碱性条件。接着取86LAb2溶液（1.85mg/mL）加入上述溶液中并于4℃搅拌反应过夜。反应结束之后，取20µL硼氢化钠溶液（5mg/mL）加入上述反应完的混合液中并在4℃的条件下反应2h，这主要是为了将上述合成的酶-抗体偶联物中形成的碳氮双键进行还原。最后，将上述合成的SBP-Ab2离心并用磷酸盐缓冲溶液清洗3次，并将最终的离心产物重新分散到100µL的磷酸盐缓冲溶液中置于4℃保存备用。2.2.4HRP-Ab2偶联物的制备为了将HRP修饰电极的电化学发光响应与SBP修饰电极的电化学发光响应进行对比，采用与上述相同的高碘酸钠法合成了辣根过氧化物酶标记的检测抗体（HRP-Ab2）。19 第二章大豆过氧化物酶标记检测抗体作为信号放大剂用于心肌肌钙蛋白I的检测其中，除了将上述反应中的SBP换成HRP，其余反应条件均不变。并将最终合成的HRP-Ab2分散到100µL的磷酸盐缓冲溶液中置于4℃保存备用。2.2.5Ab1修饰电极的制备基于PEI-RGO修饰的玻碳电极构建电化学夹心免疫传感器的过程如图2-1所示，在修饰电极之前，首先将玻碳电极（GCE）依次用0.3µm和0.05µm的氧化铝粉末在麂皮上进行打磨，之后用乙醇和水依次超声清洗并用氮气吹干。然后，取5µL上述制备的PEI-RGO悬浮液滴涂到处理过后的洁净的玻碳电极表面并在室温下干燥制得PEI-RGO修饰的玻碳电极（PEI-RGO/GCE）。然后将上述电极浸没到2.5%的戊二醛溶液中浸泡0.5h，接着用PBS冲洗三次。再然后，取5µL的Ab1溶液（50µg/mL）滴加到上述修饰电极表面反应过夜，这一反应是通过戊二醛作交联剂，利用氨基与醛基间的酰胺反应将Ab1固定到电极表面。最后，将上述修饰电极浸到3%BSA溶液中反应45min以封闭电极表面多余的活性位点，并用PBS冲洗三次。最终，Ab1修饰的电极（Ab1/PEI-RGO/GCE）制备得到并于4℃保存备用。图2-1基于PEI-RGO修饰的玻碳电极构建电化学夹心免疫传感器的过程示意图2.2.6构建ECL免疫传感器用于cTnI的检测采用电化学发光夹心免疫传感试验检测cTnI抗原（Ag），首先，在上述制备的修饰电极上滴加5µL包含cTnI的溶液孵育反应1h，反应结束之后用PBS冲洗三次。随后，滴涂5µL上述合成的SBP-Ab2再孵育反应1h，接着与上述相同的步骤冲洗三次，制备20 东南大学硕士学位论文得到最终的修饰电极（SBP-Ab2/Ag/Ab1/PEI-RGO/GCE）并用于后续的电化学发光检测过程。电化学发光信号的测量采用三电极体系，修饰的玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极（SCE）和铂丝电极分别作为参比电极和对电极。电解液是包含有0.1mMluminol和1.2mMH2O2的5mLPBS(pH7.4)2.3结果与讨论2.3.1PEI-RGO纳米复合材料的表征1.紫外-可见吸收光谱（UV-vis）表征利用紫外-可见光谱对PEI原位还原将GO转化为RGO的过程进行了监测，如图2-2所示，GO在232nm处出现了明显的特征吸收峰，这是由于石墨烯sp2区域典型的π→π*电子转移引起的。还原之后，PEI-RGO在268nm处出现了明显的特征吸收峰。与GO相比，PEI-RGO的特征吸收峰出现了36nm红移，这一结果表明石墨烯纳米片中的π电子偶联得到了恢复并且大部分的GO已经被还原[98,99]。0.60.4b0.2AbsorptionValuea0.0300450600750Wavelength/nm图2-2GO（a）和PEI-RGO（b）的紫外吸收图2.拉曼光谱（Raman）表征拉曼光谱的表征可以反映石墨烯还原前后的结构变化情况。拉曼图谱的变化如图2-3所示，GO的拉曼图谱显示在1349cm-1和1595cm-1处有两个特征吸收峰，分别对应于石墨烯的D带和G带。D带的出现与石墨烯结构中的空穴、边界、无定形碳原子等形成的缺陷有关，而G带的出现对应于sp2杂化碳原子的E2g声子的一级散射，D带与G带的峰强度比值（ID/IG）的变化反映石墨烯表面电子耦联状态的变化情况。通过水21 第二章大豆过氧化物酶标记检测抗体作为信号放大剂用于心肌肌钙蛋白I的检测热还原反应之后，ID/IG从GO的1.24增加到PEI-RGO的1.71，ID/IG的比值与石墨烯表面碳原子sp2区域的面积成反比，I2D/IG比值的增加说明了更小的sp区域的形成，同时，PEI分子上的氨基与GO表面的环氧基的反应也会引起ID/IG的增大。以上这些很好的说明了GO被成功还原为RGO[100,101]。1200800a400Intensity/a.u.b0800120016002000-1RamanShift/cm图2-3GO（a）和PEI-RGO（b）的Raman变化图3.电子显微镜表征透射电子显微镜（TEM）用来表征合成的PEI-RGO的形貌。如图2-4所示，PEI-RGO的透射电镜图显示了透明的、褶皱卷曲的石墨烯纳米片的形成[102-104]。所有的这些结果都说明了PEI-RGO纳米复合材料的成功合成。图2-4PEI-RGO的TEM图2.3.2电化学免疫传感器组装过程的表征1.循环伏安（CV）表征免疫传感器的构建是以戊二醛为交联剂，利用醛基与氨基间的酰胺反应将Ab1共价固定到PEI-RGO修饰电极表面，并利用抗原抗体间的特异性的亲和作用依次将抗原Ag，22 东南大学硕士学位论文大豆过氧化物酶标记的检测抗体SBP-Ab2固定到电极表面形成最终的修饰电极（SBP-Ab2/Ag/Ab1/PEI-RGO/GCE）。循环伏安图谱是在10mMPBS（包含5.0mM[Fe(CN)3-/4-6]）中检测的，用于表征免疫传感器组装过程中每一步的变化情况。如图2-5所示，裸电极在铁氰化钾溶液中呈现出一对良好的氧化还原峰（曲线a），当电极上修饰上PEI-RGO之后，由于电活性的[Fe(CN)3-/4-6]与PEI-RGO复合物间的电子转移速度加快从而使得峰电流极大地增加（曲线b）。然而，当Ab1固定到PEI-RGO修饰电极上之后，由于蛋白质的绝缘作用使得氧化还原峰电流明显降低（曲线c）。接着，在电极表面依次孵育BSA、Ag和SBP-Ab2，氧化还原峰电流依次减弱（曲线d、e和f），这可能是由于电极表面非导电的蛋白层的绝缘效应引起的[105,106]。10050A0a-50bCurrent/c-100def-150-0.20.00.20.40.6Potential/V图2-5电化学发光免疫传感器组装过程中的CV变化图，其中，a、b、c、d、e、f分别对应裸的、PEI-RGO、Ab1/PEI-RGO、BSA/Ab1/PEI-RGO、Ag/BSA/Ab1/PEI-RGO、SBP-Ab2/Ag/BSA/Ab1/PEI-RGO修饰的玻碳电极2.电化学阻抗（EIS）表征同时，我们对修饰电极组装过程中电化学阻抗图谱的变化也进行了检测。如图2-6所示，从图中可以明显看到，相比于裸的玻碳电极（曲线a），PEI-RGO修饰的电极（曲线b）具有更小的阻抗值，这主要是因为PEI-RGO复合材料具有良好导电性，能够加速电极表面的电子转移。当在电极表面进一步组装上Ab1、BSA、Ag和SBP-Ab2之后，电极表面电子转移的阻抗值依次增加（曲线c、d、e和f），这主要是由于非导电的蛋白修饰在电极表面阻碍了电子转移所引起的阻抗值的增加。因此，循环伏安图和电化学阻抗图谱的结果都很好的证明了免疫传感器在电极表面的成功组装。23 第二章大豆过氧化物酶标记检测抗体作为信号放大剂用于心肌肌钙蛋白I的检测1500010000a5000bcZim/ohmsd0ef0700014000210002800035000Zre/ohms图2-6电化学发光免疫传感器组装过程中的EIS变化图，其中，a、b、c、d、e、f分别对应裸的、PEI-RGO、Ab1/PEI-RGO、BSA/Ab1/PEI-RGO、Ag/BSA/Ab1/PEI-RGO、SBP-Ab2/Ag/BSA/Ab1/PEI-RGO修饰的玻碳电极2.3.3SBP-Ab2/Ag/Ab1/PEI-RGO修饰电极的电化学发光响应构建的免疫传感器的电化学发光行为是在包含0.1mMluminol的10mMpH7.4的PBS中一步步进行表征检测的。如图2-7A所示，由于带正电荷的聚电解质PEI比带负电荷的GO具有更优良的导电性，因而PEI修饰电极的ECL信号（曲线b）比GO修饰电极的ECL信号（曲线a）增强了约2.2倍。然而，当PEI-RGO纳米复合物修饰于玻碳电极表面时，由于PEI和RGO都具有较好的导电性，协同效应使得PEI-RGO的导电性优于单纯的PEI，表现为PEI-RGO修饰电极的ECL信号比PEI修饰电极的ECL信号有更进一步的增强（曲线c）。之后，当Ab1固定偶联到电极表面时，由于惰性蛋白生物分子会阻碍电极表面电子的转移从而使得Ab1修饰电极上luminol的ECL信号明显降低（曲线d）。随后在电极表面继续组装Ag和Ab2，对应的蛋白修饰电极的ECL信号依次降低（曲线e和f），这主要是因为修饰在电极表面的非导电的蛋白层会阻碍luminol和电极间的电子传递。然而，当在Ag/Ab1/PEI-RGO修饰电极表面孵育组装上SBP-Ab2之后，luminol的电化学发光的发光强度（曲线g）比孵育前出现了极大的提高，这可能是由于通过SBP的电子隧道和luminol与SBP的电活性基团（heme）间的电子交换共同作用的结果[107]。24 东南大学硕士学位论文40a1600abbAcBc30d1200deeff20800gECLintensity10400图2-7不同修饰电极上ECL-时间变化曲线图（A），其中，a、b、c、d、e、f、g曲线分别表示GO、00PEI、PEI0-RGO、2Ab1/PEI4-RGO6、Ag/Ab81/PEI0-RGO、2Ab2/Ag/Ab41/PEI6-RGO8、SBP-Ab2/Ag/Ab1/PEI-RGOTime/SecTime/Sec修饰的玻碳电极在包含0.1mMluminol的10mMPBS(pH7.4)溶液中的电化学发光响应；不同修饰电极上ECL-时间变化曲线图（B），其中，a曲线表示PEI-RGO修饰电极在10mMPBS（pH7.4）溶液中只包含0.1mMluminol的发光响应，b曲线表示PEI-RGO修饰电极在10mMPBS（pH7.4）溶液中包含0.1mMluminol和1.2mMH2O2的电化学发光响应，c、d、e、f曲线分别表示Ab1/PEI-RGO、Ag/Ab1/PEI-RGO、Ab2/Ag/Ab1/PEI-RGO、SBP-Ab2/Ag/Ab1/PEI-RGO修饰的玻碳电极在包含0.1mMluminol和1.2mMH2O2的10mMPBS（pH7.4）溶液中的电化学发光响应图2-7B展示了在包含有luminol的电解液中引入H2O2之后，免疫传感器不同组装阶段的电化学发光响应。对于PEI-RGO修饰电极，电解液中H2O2的引入对luminol的电化学发光有着极大地影响，从图中可以看到加入H2O2之后，PEI-RGO修饰电极的ECL信号比没有加H2O2的ECL信号增加了近32倍（曲线a和b），ECL信号的增强可能是由于在电解液中加入H2O2之后，它能够聚集在电极表面与luminol的电化学氧化产物反应产生激发态的3-氨基邻苯二甲酸二价阴离子，其回到基态的过程伴随发射光，产生强的电化学发光信号[107,108]。随后，在电极表面依次偶联接上Ab1和Ag，luminol的ECL信号依次逐渐减弱（曲线c和d），这与只含有luminol的电解液中检测到的结果相似，但是由于H2O2的引入，电化学发光信号值比没有H2O2存在的相同修饰电极的ECL响应强。同样地，在Ag/Ab1/PEI-RGO修饰电极表面孵育上Ab2之后，ECL信号继续减弱（曲线e）。然而，当SBP-Ab2孵育组装到Ag/Ab1/PEI-RGO修饰电极表面之后，luminol25 第二章大豆过氧化物酶标记检测抗体作为信号放大剂用于心肌肌钙蛋白I的检测的ECL响应比孵育前有了极大地增强（曲线f），ECL信号的增强可能是由于电解液中存在H2O2时，SBP能够放大luminol的ECL信号产生很强的发光信号。为了验证这一猜想，我们研究了SBP修饰的玻碳电极在不同电解液中的ECL响应行为，如图2-8所示，当电解液中只包含有1.2mMH2O2时，SBP-Ab2修饰电极没有检测到任何的ECL信号（曲线a），这是因为此时没有能够产生ECL信号的发光物质存在。当电解液中只包含有0.1mMluminol时，SBP-Ab2修饰电极只检测到很微弱的ECL信号（曲线b），然而，当luminol和H2O2同时存在于电解液中时，SBP-Ab2/Ag/Ab1/PEI-RGO修饰电极的ECL信号急剧增强（曲线c）。这很好的说明了检测到的ECL信号是由luminol产生的并且在H2O2的存在下，SBP能够极大地放大luminol的ECL信号。这可能是由－于SBP催化H2O2的产物能够使得鲁米诺阴离子（L）氧化为3-氨基邻苯二甲酸二价阴2－*[65]离子（AP）更容易些，并最终产生更强的发光信号值。1600a1600aAbBbcc12001200800800ECLintensity40040000024680.00.10.20.30.4Time/SecE/V(vs.SCE)图2-8ECL-时间变化图（A）和ECL-电压变化图（B）对SBP-Ab2/Ag/Ab1/PEI-RGO修饰电极在10mMpH7.4PBS溶液包含1.2mMH2O2（a）、0.1mMluminol（b）以及0.1mMluminol和1.2mMH2O2（c）溶液中的电化学发光响应2.3.4SBP修饰电极与HRP修饰电极对比制备了HRP标记的检测抗体（HRP-Ab2）并利用抗原抗体间特异性的亲和识别作用将其固定在Ag/Ab1/PEI-RGO修饰电极表面，并将SBP修饰电极的ECL响应与HRP修饰电极的ECL响应进行了比较。结果如图2-9所示，SBP修饰电极的ECL信号（曲线b）比HRP修饰电极的ECL信号（曲线a）强，且增强大约67%。此外，HRP和SBP修饰电极的ECL信号随时间都出现了衰减，对于HRP修饰电极，在持续监测100s之26 东南大学硕士学位论文后，ECL信号减弱了12.92%，但对于SBP修饰电极，在相同的实验条件下，ECL信号只衰减了7.02%，这可能是由于HRP催化H2O2产生的活性氧自由基使得阳离子的HRP失活而导致的发光衰减较快[5]。综上所述，对于luminol-H2O2电化学发光体系，SBP比HRP具有更好的催化活性和稳定性，这与之前报道的结果相一致[95,97]。200015001000500ECLintensity0ba020406080100Time/Sec图2-9ECL-时间变化图对HRP-Ab2（a）和SBP-Ab2（b）修饰的玻碳电极在包含0.1mMluminol和1.2mMH2O2的10mMpH7.4PBS溶液中的电化学发光响应2.3.5优化ECL免疫试验的检测条件为了提高免疫试验的灵敏度，我们对免疫传感器组装过程中Ab1的浓度进行了优化，固定到电极表面的Ab1分子数量越多，通过免疫反应固定的SBP-Ab2数量越多，从而能有效增强ECL信号。然而，当电极表面固定的Ab1分子数量过多时，非导电的蛋白会严重阻碍luminol与电极间的电子转移从而减弱ECL信号。如图2-10A所示，当Ab1浓度达到40µg/mL时，测得的ECL响应信号值最大，因此，40µg/mL的Ab1被用于最终免疫传感的构建。抗原抗体间的免疫响应时间对于免疫传感器的构建有着很大影响，如图2-10B所示，ECL信号强度随着免疫反应孵育时间的增加而逐渐增加，并在60min之后趋于稳定，因此选用60min作为最优的免疫反应时间用于后续实验。H2O2对于luminol的电化学发光行为具有重大影响，H2O2作为luminol电化学发光反应的共反应剂在SBP的催化下能够极大地增强luminol的ECL信号。如图2-11C所示，随着H2O2浓度的增加，ECL信号不断增强并在H2O2浓度为1.2mM时达到最大值，因此，选用1.2mM的H2O2为最优浓度用于整个实验的测定。27 第二章大豆过氧化物酶标记检测抗体作为信号放大剂用于心肌肌钙蛋白I的检测16001600AB1600C1200120014008008001200ECLintensity4001000图2-10免疫传感器构建过程中捕获抗体浓度的优化（400A），cTnI在Ab1/PEI-RGO修饰电极上的孵育0203040506070204060801004006008001000时间优化（concentrationofAbB），电解液中加入的1/H(2Og/mL2浓度的优化（)C），其中，incubationtime/minA和B图中所有的ECL信号值都是H2O2concentration在包含0.1mMluminol和1.2mMH2O2的10mMpH7.4的PBS中检测所得，C图中的ECL信号是在包含0.1mMluminol和不同浓度的H2O2中检测所得2.3.6cTnI的分析检测在最优的实验条件下，构建的免疫传感器用于心肌肌钙蛋白I的定量分析检测。从图2-12可以看出，ECL信号强度随着cTnI浓度的增加而逐渐增加，图2-11中的插图为ECL信号强度与cTnI浓度的相关关系图。从图中我们可以看到，ECL信号强度与cTnI的浓度在5-30000pg/mL的范围内呈现良好的线性关系，检测限为3.3pg/mL（信噪比为3）。线性回归方程为I=-214.7＋476.9logc，相关系数为R2=0.9959，其中，I表示ECL信号的强度，c表示cTnI的浓度。20002000150010001500ECLintensity500010001234-1log(c/pgmL)500ECLintensity02468Time/Sec图2-11免疫传感器在包含0.1mMluminol和1.2mMH2O2的10mMpH7.4PBS中的ECL响应值随cTnI浓度的变化示意图，插图为ECL强度与cTnI浓度的线性关系图28 东南大学硕士学位论文表2-1列出了我们构建的免疫试验方法与之前文献报道的免疫试验方法用于cTnI检测的线性范围和检测限，从表中可以看到，与之前文献报道的方法相比，像电化学免疫试验法、光磁免疫试验法、酶联免疫吸附试验法，本文所构建的免疫传感器具有更低的检测限。同时，将我们设计的电化学发光法与文献报道的电化学发光法用于cTnI抗原检测也进行了比较，结果表明，我们构建的免疫传感器检测cTnI的检测限比之前文献报道的方法检测限也要低，由此说明我们构建的免疫传感器用于cTnI抗原的检测具有更好的性能。血清cTnI的浓度在0.1-2ng/mL范围内表明心肌细胞坏死，因而高浓度的cTnI在检测时需要先将样品进行适当稀释之后再进行检测。表2-1构建的免疫试验方法与之前文献报道的其它免疫试验方法用于cTnI检测的比较线性范围检测限测量方法参考文献（ng/mL）（ng/mL）电化学免疫试验法0.8－5.00.5Guoetal.[109]光磁免疫试验法0.03－6.50.03Dittmeretal.[110]酶联免疫吸附试验法0.1－1000.027Choetal.[45]电化学发光免疫试验法0.1-10000.06Lietal.[111]电化学发光免疫试验法0.005－300.003本文工作2.3.7免疫传感器的选择性和重现性为了验证构建的免疫传感器对cTnI检测的特异性，用HCG（10ng/mL）、TNF-α（10ng/mL）、PSA（10ng/mL）和BSA（3%）分别代替cTnI用于构建免疫传感器，结果如图2-12A所示，HCG、TNF-α、PSA和BSA构建的免疫传感器只检测到了很微弱的ECL信号，但是在相同的实验条件下，用cTnI孵育构建的免疫传感器却检测了很强的ECL信号，因此，我们所构建的免疫传感器对于cTnI的检测具有很好的选择性和特异性。免疫传感器的重现性是通过批内试验精确性和批间试验精确性进行评估的。批内试验精确性的评估是通过在同一根电极上孵育10ng/mL的cTnI形成免疫复合物并连续检测10次的ECL信号值所得，批间精确性的评估是通过在10根电极上分别孵育10ng/mL29 第二章大豆过氧化物酶标记检测抗体作为信号放大剂用于心肌肌钙蛋白I的检测的cTnI形成免疫复合物，分别收集每根电极的ECL信号值而得。结果如图2-12B和2-12C所示，批内试验的相对标准偏差为3.98%，批间试验的相对标准偏差为5.59%，这一结果表明我们所构建的免疫传感器具有很好的重现性。2000A16001200800400ECLintensity0cTnI3HCG2TNF-αPSA1BSA240024002000B2000C1600160012001200800800ECLintensity400400001234567891012345678910CycleNumberElectrodeNumber图2-12分别用10ng/mLcTnI、10ng/mLHCG、10ng/mLTNF-α、10ng/mLPSA和3%BSA构建的免疫传感器的ECL响应（A），实验数据为三组平行实验所得；批内试验：构建的免疫传感器在同一根电极上检测十次（B）；批间试验：构建的免疫传感器在不同电极上检测十次（C）2.3.8免疫传感器用于实际血浆样品的检测同时，为了评估构建的免疫传感器用于实际人的血浆样品中cTnI检测的实际应用性能，从南京鼓楼医院采集患有急性心肌梗塞患者的血浆样品并用本工作中构建的免疫试验方法进行检测。在对患者的血浆样品进行适当的稀释之后，在处理过的样品中加入一系列已知浓度的cTnI并用于检测。结果显示在表2-2中，构建的免疫传感器检测患者30 东南大学硕士学位论文血浆中cTnI的ECL信号值的相对标准偏差在3.01%-8.66%范围内，回收率在94.40%-103.14%的变化范围内，结果表明本工作设计的免疫传感器具有较好的准确性，并为实际人的血浆样品中cTnI的定量检测提供了很好的选择。表2-2将构建的免疫传感器用于人的血浆样品中cTnI的定量分析检测血浆样品加入的量（ng/mL）检测到的量（ng/mL）相对标准偏差（%）回收率（%）10.02000.01777.6994.4020.100000.099028.6699.1830.250000.258483.01103.1440.500000.481653.5496.4651.00001.02974.00102.912.4本章小结本章主要合成了聚乙烯亚胺功能化的石墨烯纳米复合材料，将其修饰于电极表面时，能够加速电极表面电子的传递，同时良好的成膜性使其能够在电极表面稳定存在。此外，合成了大豆过氧化物酶标记的检测抗体，采用相同的高碘酸钠法合成了辣根过氧化物酶标记的检测抗体作为对照，并构建了一种基于大豆过氧化物酶作为信号放大剂的免疫传感平台用于心肌肌钙蛋白I（急性心肌梗塞的确定生化标志物）的灵敏检测。通过夹心免疫法，在PEI-RGO纳米复合材料修饰的玻碳电极表面，依次固定Ab1，Ag和SBP-Ab2形成夹心免疫复合物，并将最终构建的SBP修饰电极用于luminol-H2O2电化学发光体系的催化应用。实验结果表明，在H2O2的存在下，SBP修饰电极对luminol的电化学发光具有很好的信号放大作用，产生了较强且稳定的电化学发光信号。同时将SBP修饰电极与HRP修饰电极进行了对比，结果表明SBP修饰电极催化luminol产生的ECL信号比HRP修饰电极催化luminol产生的ECL信号强67%，同时，SBP修饰电极和HRP修饰电极的ECL信号均随时间而衰减，在持续监测100s后，HRP修饰电极的ECL信号降低了12.92%，但是在相同的实验条件下，SBP修饰电极的ECL强度只降低了7.02%。这一结果表明SBP修饰电极对于luminol-H2O2电化学发光体系具有更好的催化活性和31 第二章大豆过氧化物酶标记检测抗体作为信号放大剂用于心肌肌钙蛋白I的检测稳定性。此外，本工作所构建的电化学发光免疫传感器具有宽的线性范围，低的检测限，良好的选择性和重现性，并且对于实际血浆样品中cTnI的检测具有良好的准确性，这为构建的免疫传感器用于其它生物标志物的检测提供了选择。32 第三章基于大豆过氧化物酶构建的免疫传感芯片用于心肌梗塞生化标志物的检测第三章基于大豆过氧化物酶构建的免疫传感芯片用于心肌梗塞生化标志物的检测3.1前言全球范围内，急性心肌梗塞（AMI）作为主要的心血管疾病，是导致发病率和死亡率的主要诱因。目前，每年有300多万人患有急性ST段抬高心肌梗死（STEMI），有超过400万人患有非ST段抬高心肌梗死（NSTEMI）[6]。心肌梗塞高死亡率的原因是多样的：一、遗传因素、吸烟行为、不健康的饮食习惯或缺乏运动等都可能导致大量无症状个体有发生第一次心脏病的严重危险。二、医学治疗不能够对无症状的高危人群和已确诊冠心病的患者采取有效的预防措施，存在疾病复发和死亡的高风险[112]。三、大约三分之一患有进展性心肌梗死的患者由于在到达医院之前未接受任何有效治疗而死亡[113]。因而，心肌梗塞是非常重要的健康问题，需要广大研究和医疗工作者的广泛关注[114]。此时，发展灵敏准确的检测方法实现对心肌梗塞生化标志物的灵敏检测对于AMI的预防诊断具有十分重要的现实意义。生化指标的连续测量现在普遍被认为是判断或排除AMI的重要决定因素[115,116]。过去50年来，人们对心肌疾病生化标志物的研究不断完善。作为早期的标志物，肌红蛋白（Myo）表现出极好的早期阴性预测值（在入院后2小时内接近100%）以排除AMI[117,118]。心脏急救室计划[119]描述的模型记录了对于肌酸激酶MB同功酶（CK-MB）质量的呈现，结果表明在患者3、6和9小时后的连续测试显示急性缺血性冠状动脉综合症表现为无诊断或模棱两可的心电图的症状比连续系列心电图，超声心动图和分级运动试验更有效（显示出100%敏感性和100%阴性预测值）。此外，研究表明，对心肌细胞具有高度灵敏性和特异性的心肌肌钙蛋白（cTnI）对AMI的检测具有极好的预示作用[120,121]，同时，心肌肌钙蛋白在识别患者风险方面显示出强大的功能[9,122]。因此，设计一种芯片实现对这三种生化指标的同时检测分析具有重大的现实意义。研究表明，传统使用的辣根过氧化物酶（HRP）催化luminol-H2O2化学发光体系时，在加入发光增强剂时能产生较强的发光信号，但同时发光信号随时间的衰减较快，这主要是由于反应过程中形成的活性自由基物质与酶结合使得酶的活性损失导致的发光减33 东南大学硕士学位论文弱[123]。然而阴离子的大豆过氧化物酶（SBP）催化luminol-H2O2发光体系时，发光信号衰减速度相对较慢，能产生较长时间的发光信号[71,124]。除此之外，SBP良好的热稳定性、结构稳定性、催化活性、以及能够在较宽范围的pH内保持活性等优点[57,61,71]使得其能够被广泛应用。基于此，本章构建了一种基于大豆过氧化物酶标记的夹心免疫传感芯片实现对AMI疾病三种生化标志物（cTnI、CK-MB、Myo）的同时检测。首先合成了二氧化硅小球，并在其表面修饰上检测抗体（Ab2）和SBP作为标记物，二氧化硅小球大的比表面积有利于固定较多数量的抗体和酶，从而提高检测的灵敏度。同时将三种待测抗原对应的单克隆捕获抗体固定于硝酸纤维素膜构成的芯片表面，并利用抗原抗体间的特异性识别作用依次将待测抗原和标记的检测抗体固定到芯片表面形成夹心免疫复合物，然后利用SBP催化luminol-H2O2体系产生的化学发光信号从而实现对三种生化标志物的检测。3.2实验部分3.2.1试剂与仪器两种鼠抗人的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体（anti-cTnI捕获抗体，Ab1，3.51mg/mL；anti-cTnI检测抗体，Ab2，1.85mg/mL）和纯化的人的心肌肌钙蛋白I（cTnI，Ag，2.45mg/mL）；两种鼠抗的人的肌酸激酶单克隆抗体（anti-CK-MB捕获抗体，Ab1，2.38mg/mL；anti-CK-MB检测抗体，Ab2，5.2mg/mL）和人的肌酸激酶（CK-MB，Ag，1.75mg/mL）；两种鼠抗的人的肌红蛋白单克隆抗体（anti-Myo捕获抗体，Ab1，6.4mg/mL；anti-Myo检测抗体，Ab2，1.5mg/mL）和人的肌红蛋白（Myo，Ag，2.34mg/mL）均购买于美国R&Dsystems有限公司。大豆过氧化物酶（SBP，EC1.11.1.7，RZ3.29）购买于美国Bio-ResearchProducts有限公司。牛血清白蛋白（BSA）购买于南京凯基生物科技有限公司。鲁米诺（luminol）、3-(10’-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸盐（SPTZ）、4-马琳吡啶（MORP）、正硅酸乙酯（TEOS）购于Sigma-Aldrich试剂公司。双氧水（H2O2）、无水乙醇（C2H5OH）、二甲基亚砜（DMSO）、戊二醛（C5H8O2）、氨水（NH3H20）、氢氧化钠（NaOH）、磷酸二氢钠（NaH2PO42H20）、磷酸氢二钠（Na2HPO412H20）、盐酸（HCl）、硫酸铵三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）购买于国药集团化学试剂有限公司。3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）购自aladdin科技股份有限公司。硝酸纤维素膜（NC膜，孔径：0.45µm）购买于whatman有限责任公司。10mM磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4）由10mM34 第三章基于大豆过氧化物酶构建的免疫传感芯片用于心肌梗塞生化标志物的检测NaH2PO42H20、10mMNa2HPO412H20和0.15MNaCl混合制备而成。50mMTris-HCl缓冲溶液（pH8.5）由50mMTris和1MHCl混合调节而成。TBST洗液是在50mMpH7.5Tris-HCl缓冲溶液中加入0.3%Tween-20制备所得。实验中所有试剂除特别说明外均为分析纯，所有试剂在使用前都未经额外处理，整个实验过程中使用Thermo超纯水（阻抗>18MΩ·cm），实验中所有溶液均用超纯水配置。离心机（Eppendorf，Germany）用于分离除去制备的Ab2-SiO2-SBP复合物中游离的SBP和Ab2，恒温振荡器（LABSTAR，Germany）用于在SiO2表面进行检测抗体和大豆过氧化物酶的固定，IKA摇床（Germany）用于提供整个免疫实验反应所需的平衡环境，扫描电子显微镜（SEM）用于表征合成的SiO2的形貌，CCD生物芯片阅读仪（北北京尚诚世达机电设备有限公司）用于实验中化学发光图像的采集。3.2.2氨基功能化的二氧化硅小球的制备在制备Ab2-SiO2-SBP生物探针之前，首先合成二氧化硅小球，向清洗干净的100mL的圆底烧瓶中依次加入20mL无水乙醇、6mL去离子水和4mL氨水，随后搅拌5min使其混合均匀。同时，向50mL干净的烧杯中加入30mL无水乙醇，并取1.7mL正硅酸乙酯（TEOS）迅速加入上述乙醇溶液中超声混匀。接着，将上述TEOS/乙醇溶液倒入圆底烧瓶中，并于25℃水浴反应75min，反应15min后溶液即变为乳白色。反应结束之后，将上述反应所得的二氧化硅小球依次用去离子水和乙醇洗涤三次，并将离心的固体产物在烘箱中烘干备用。将上述制备的二氧化硅小球进行氨基功能化，称取0.1g上述制备的二氧化硅小球固体粉末分散于15mL甲苯中，并加入100µLAPTES，于110℃回流反应20h，反应结束后，将所得的氨基功能化的二氧化硅小球在8000rpm的转速下依次用乙醇和去离子水洗涤三次，并重新分散于30mL去离子水中备用。3.2.3三种Ab2-SiO2-SBP生物探针的制备Ab2-SiO2-SBP生物探针的制备是采用戊二醛作交联剂，利用酰胺反应将检测抗体和大豆过氧化物酶固定到二氧化硅小球的表面。anti-cTnI-SiO2-SBP的制备过程如图3-1所示：取250µL上述制备的氨基功能化的二氧化硅小球，用2.5%戊二醛稀释至500µL，在4℃反应1h，使得二氧化硅小球表面带有醛基，反应结束之后，10000rpm的转速下离心10min除去多余的戊二醛，并重新分散于500µL的PBS中。然后，加入30µL35 东南大学硕士学位论文anti-cTnI检测抗体（100µg/mL）和50µLSBP（1mg/mL）在4℃反应18h，之后加入500µL3%BSA反应1h，反应结束之后，将反应混合液在9000rpm的转速下离心10min除去多余未结合的酶和抗体，并将所得产物重新分散于500µL的PBS中备用。anti-Myo-SiO2-SBP的制备过程与anti-cTnI-SiO2-SBP的制备过程相同，差别是加入的抗体不同，制备anti-Myo-SiO2-SBP时加入30µL对应的anti-Myo检测抗体。anti-CK-MB-SiO2-SBP的制备过程也与上述大体相同，不同之处在于取100µL氨基功能化的二氧化硅小球用2.5%戊二醛稀释至500µL，同时，加入的酶和检测抗体的量有所变化，制备anti-CK-MB-SiO2-SBP时，加入3µLanti-CK-MB（100µg/mL）和6.4µLSBP（1mg/mL）进行反应即可。图3-1Ab2-SiO2-SBP的制备过程示意图3.2.4免疫传感芯片的构建如图3-2所示，设计的免疫传感芯片是3行×8列，第一行每孔点样为1mg/mL的心肌肌钙蛋白单克隆捕获抗体，第二行点样为1mg/mL的肌酸激酶单克隆捕获抗体，第三行点样为1mg/mL的肌红蛋白单克隆捕获抗体。一个芯片含有24个反应孔（所有反应孔均为1×1cm2）,整个传感芯片的尺寸为8.5×4.5cm2。点样缓冲液为0.1mMPBS中含有0.6mg/mL蔗糖和10µg/mL甲基紫，用点样缓冲液将三种捕获抗体稀释至1mg/mL再进行点样。采用孔径为0.45µm的白色硝酸纤维素膜为底板，并采用BiodotAD6000点样仪吸取捕获抗体于NC膜表面进行点样，其中，控制点样温度为22-24℃，点样湿度为50%，每个样品点所需点样体积为20nL。点样之后，将固定有捕获抗体的NC膜置于4℃反应过夜，此时的NC膜表面具有较好的弹性和湿润度，有利于进行下一步无底框架的组装。之后将NC膜固定于无底的24孔框架上，并于恒温恒湿箱中干燥1-2h，此时含有24个反应室的免疫传感芯片初步组装完成。最后，在上述芯片的每个反应孔中加入150µL5%BSA室温反应2h，以此封闭NC膜表面非特异性的活性位点，最终，将上述制备好的固定有三种捕获抗体的免疫传感芯片置于4℃避光保存备用。36 第三章基于大豆过氧化物酶构建的免疫传感芯片用于心肌梗塞生化标志物的检测图3-2芯片实物拍摄图3.2.5化学发光免疫成像过程利用大豆过氧化物酶催化luminol-H2O2体系产生化学发光信号从而实现对三种心肌梗塞生化标志物的灵敏检测。检测过程如图3-3所示，在反应之前，首先将固定有三种捕获抗体的无底免疫传感芯片的底部用胶布进行封闭，以保持NC膜与芯片底部间的压力，从而有效避免膜的渗透。然后，在第一行每个反应孔中加入100µL50ng/mL的cTnI，第二行每个反应孔中加入100µL50ng/mL的CK-MB，第三行每个反应孔中加入100µL50ng/mL的Myo，并于250rpm的转速下室温孵育30min，反应结束之后，用TBST洗液在250rpm转速下洗涤3次，每次洗10min。接着，在第一行每个反应孔中加入100µL上述制备的anti-cTnI-SiO2-SBP，第二行每个反应孔中加入100µL上述制备的anti-CK-MB-SiO2-SBP，第三行每个反应孔中加入100µL上述制备的anti-Myo-SiO2-SBP，并在250rpm的转速下室温孵育30min，反应结束之后，采用与上述相同的洗涤步骤，用TBST洗液洗涤三次。最后，每孔加入40µL发光底物液（含有2mMluminol、10mMH2O2、0.6mMSPTZ和0.3mMMORP的50mMpH8.5的Tris-HCl缓冲溶液），并利用CCD采集各孔对应点的化学发光信号值，从而实现单块芯片上三种心肌疾病生化标志物的同时检测。37 东南大学硕士学位论文图3-3免疫传感芯片的构建组装与检测过程示意图3.3结果与讨论3.3.1SiO2小球的形貌表征与其表面固定酶和抗体的验证图3-4所示为合成的SiO2小球的扫描电镜表征图，从图中可以观察到，这种合成的二氧化硅小球分散较为均匀，尺寸大约为350nm，其较大的比表面积有利于后续酶和抗体在其表面的固定。图3-4SiO2的扫描电镜图在SiO2小球的表面进行氨基功能化之后，以戊二醛为交联剂，利用酰胺反应将大豆过氧化物酶和检测抗体固定于硅球的表面，形成三种Ab2-SiO2-SBP生物检测探针。在96孔板中检测三种探针的活性，取合成的anti-cTnI-SiO2-SBP、38 第三章基于大豆过氧化物酶构建的免疫传感芯片用于心肌梗塞生化标志物的检测anti-CK-MB-SiO2-SBP、anti-Myo-SiO2-SBP各100µL分别加入96孔板中，然后加入30µL发光底物液，之后采集各孔的化学发光信号，结果如图3-5所示，三种探针分别催化luminol-H2O2化学发光体系均产生了较好的发光信号，说明了酶和检测抗体在SiO2小球表面的成功组装。图3-5Ab2-SiO2-SBP活性验证，其中，A、B、C分别为anti-cTnI-SiO2-SBP、anti-CK-MB-SiO2-SBP、anti-Myo-SiO2-SBP催化产生的化学发光图像，发光底物液为50mMpH8.5的Tris-HCl缓冲溶液中含有2mMluminol，10mMH2O2，0.6mMSPTZ和0.3mMMORP3.3.2化学发光免疫成像法同时检测cTnI、CK-MB和Myo为了验证设计的免疫传感芯片能够实现对三种心肌疾病生化标志物的同时检测，我们做了相应的控制实验。如图3-6所示，当在固定有捕获抗体的免疫芯片上的第一行第一个孔中只加入50ng/mLcTnI抗原，第二行第一个孔中只加入50ng/mLCK-MB抗原，第三行第一个孔中只加入50ng/mLMyo抗原反应（a），反应结束之后加入发光底液之后均未观察到任何光斑（A），同时读取的发光信号值非常低，几乎为零（B）。当在固定有捕获抗体的免疫芯片上的第一行第二个孔中只加入制备的anti-cTnI-SiO2-SBP探针，第二行第二个孔中只加入制备的anti-CK-MB-SiO2-SBP探针，第三行第二个孔中只加入制备的anti-Myo-SiO2-SBP探针进行反应（b），反应结束后加入发光底液仍未观察到任何的光斑出现，但是背景比只有抗原存在时偏亮一些（A），同时采集的发光信号值也比只有抗原存在时稍有偏高（B），这可能是由于微量的Ab2-SiO2-SBP残留在NC膜表面催化产生发光从而使得背景增高。然而，当在免疫芯片上第一行第三个孔中同时加入50ng/mLcTnI抗原和anti-cTnI-SiO2-SBP探针反应，第二行第三个孔中同时加入50ng/mLCK-MB抗原和anti-CK-MB-SiO2-SBP探针反应，第三行第三个孔中同时加入50ng/mLMyo抗原和anti-Myo-SiO2-SBP探针反应（c），反应结束后加入发光底物液，在对应点处观察到了明显的光斑出现（A），同时，采集到的化学发光信号值出现了急剧增加（B），这主要是由于当抗原和酶标记的检测抗体同时存在时，依靠抗原抗体间的特异39 东南大学硕士学位论文性识别作用形成夹心免疫复合物，此时，酶催化luminol-H2O2体系产生很强的化学发光信号[69,92]。图3-6只有相应抗原存在（a）、只有相应检测抗体存在（b）、抗原和检测抗体都存在（c）时的化学发光图像（A），（B）表示（A）中对应的发光值3.3.3SPTZ和MORP对luminol-H2O2化学发光体系的增强验证研究表明，阴离子的SBP能够催化luminol-H2O2体系产生化学发光信号，并且，SPTZ和MORP能够很好地增强该体系的化学发光信号，从而提高分析检测的灵敏度，并降低检测限[125,126]。对此我们进行了实验验证，以50ng/mL的cTnI抗原和anti-cTnI-SiO2-SBP探针形成免疫复合物催化产生发光信号为例，结果如图3-7所示，当发光底物液中无luminol存在时（a），未检测到任何的发光信号，说明检测到的化学发光信号是由luminol产生的，当发光底物液中无H2O2存在时（b），采集到了非常微弱的发光信号，当发光底物液中luminol和H2O2共存，但是无增强剂存在时（c），检测到的发光信号比无H2O2存在时的发光信号强很多，这主要是因为SBP催化luminol-H2O2体系产生的发光信号[71]。然而，当在luminol-H2O2发光底物液中分别引入增强剂MORP（d）和SPTZ（e）时，检测到的发光信号出现不同程度的增加，其中，SPTZ比MORP的增强效果更显著。随后，向发光底物液中同时加入SPTZ和MORP两种增强剂（f），采集到的发光值比分别加入两种单纯的增强剂时检测到的发光值都强，并且比无增强剂存在时的luminol-H2O2体系检测的发光信号值增强了470%，上述实验结果表明了SPTZ和MORP对SBP催化的luminol-H2O2体系的化学发光信号具有显著的增强作用。40 第三章基于大豆过氧化物酶构建的免疫传感芯片用于心肌梗塞生化标志物的检测320024001600CLintensity8000abcdef图3-7发光底液分别在无luminol（a）、无H2O2（b）、无增强剂（c）、只有增强剂MORP（d）、只有增强剂SPTZ（e）、同时含有增强剂SPTZ和MORP（f）时检测的发光信号值3.3.4发光底物液浓度的优化为了采集到最佳的化学发光信号，我们对发光底物液中H2O2、SPTZ和MORP的浓度进行了优化。如图3-8所示，化学发光信号强度值随发光底液中H2O2、SPTZ和MORP浓度的增加而逐渐增加，并在H2O2浓度达到10mM、SPTZ浓度达到0.8mM、MORP浓度达到0.2mM时分别达到了最大发光强度，之后，随着浓度增加，发光信号值反而降低。因此，发光底物液中各物质的最优浓度为10mMH2O2、0.8mMSPTZ和0.2mMMORP。3200ABC32003200240024002400160016001600CLintensitycTnIcTnICK-MBCK-MBMyoMyo80080080036912150.30.60.91.20.10.2H2O2concentration/mMSPTZconcentration/mMMORPconcentration/mM图3-8发光底物液中H2O2（A）、SPTZ（B）和MORP（C）浓度的优化41 东南大学硕士学位论文3.3.5cTnI、CK-MB和Myo的分析检测经过两步免疫反应之后，形成三种双抗体夹心免疫复合物，随后，加入化学发光底物液引发化学发光反应。化学发光强度随待测抗原浓度的变化如图3-9所示，对于cTnI抗原，发光强度随cTnI的浓度在0.02-80ng/mL的范围内呈现良好的线性关系，检测限为0.006ng/mL（信噪比为3）。对于CK-MB抗原，发光强度随CK-MB的浓度在0.2-120ng/mL的范围内呈现良好的线性关系，检测限为0.067ng/mL（信噪比为3）。对于Myo抗原，发光强度随Myo的浓度在0.3-480ng/mL的范围内呈现良好的线性关系，检测限为0.1ng/mL（信噪比为3）。各图中分别插入对应的线性回归方程，其中，I表示化学发光强度，c表示对应抗原的浓度。32004000ABC3200I=2243.31+611.67logcI=1412.74+638.86logcI=2137.39+530.7logR2=0.99437R2=0.991993200R2=0.9911424002400160024001600CLintensity8008001600-1.6-0.80.00.81.6-0.80.00.81.62.4-0.80.00.8logc(cTnI)/ngmL-1logc(CK-MB)/ngmL-1logc(Myo)/ng图3-9化学发光强度随cTnI浓度变化关系图（A），其中，cTnI的浓度（ng/mL）依次为：0.02、0.07、0.2、0.8、2、10、40、80；发光强度随CK-MB浓度变化关系图（B），其中，CK-MB的浓度（ng/mL）依次为：0.2、0.8、2、5、10、30、50、120；发光强度随Myo浓度变化关系图（C），其中，Myo的浓度（ng/mL）依次为：0.3、0.8、5、10、80、120、240、4803.4本章小结本章合成了二氧化硅小球，并通过戊二醛作用在其表面固定上检测抗体和大豆过氧化物酶形成anti-cTnI-SiO2-SBP、anti-CK-MB-SiO2-SBP、anti-Myo-SiO2-SBP三种生物探针。同时，利用点样仪在NC膜表面固定三种捕获抗体构建生物免疫传感芯片，依靠抗原抗体间的识别作用依次固定待测抗原和对应的生物探针形成三种免疫复合物，通过采集对应位置产生的发光强度实现对三种心肌梗塞生化标志物（cTnI、CK-MB、Myo）的同时检测。一方面，二氧化硅小球大的比表面积有利于在其表面更多数量的抗体和酶，42 第三章基于大豆过氧化物酶构建的免疫传感芯片用于心肌梗塞生化标志物的检测以此提高检测信号，另一方面，当在发光底物液中加入SPTZ和MORP两种发光增强剂时，SBP催化luminol-H2O2产生的化学发光信号比无增强剂存在时的发光信号增强了470%，极大地增强了检测信号，提高了检测的灵敏度。AMI疾病三种生化指标的同时灵敏检测对于AMI疾病的监控诊断具有重要意义，因而本工作的研究方法对于AMI疾病的诊断具有很好的借鉴意义。43 第四章总结与展望第四章总结与展望4.1总结本论文基于大豆过氧化物酶催化luminol-H2O2体系产生的电化学/化学发光信号主要完成了以下工作：（1）制备了聚乙烯亚胺功能化的还原氧化石墨烯，这种复合材料在水溶液中具有较好的分散性和稳定性，并具有良好的成膜性。将其修饰于玻碳电极表面，其大的比表面积有利于anti-cTnI捕获抗体的固定，并依次孵育cTnI抗原和SBP-Ab2形成夹心免疫复合物，利用SBP催化luminol-H2O2产生的强的稳定的电化学发光信号实现对cTnI的灵敏检测。比较了HRP修饰电极与SBP修饰电极催化氧化luminol产生电化学发光信号的差异，证实了SBP对luminol-H2O2电化学发光体系体系具有更好的催化活性和稳定性。在最优的实验条件下，得到cTnI的线性检测范围，评估了构建的免疫传感器用于cTnI检测的特异性、选择性、重现性、并用于实际患者血浆样品的检测，获得了较好的检测结果。（2）合成了分散均匀的二氧化硅小球，并在其表面固定检测抗体和大豆过氧化物酶形成anti-cTnI-SiO2-SBP、anti-CK-MB-SiO2-SBP、anti-Myo-SiO2-SBP三种生物探针。采用双抗体夹心免疫法实现对三种心肌梗塞生化标志物（cTnI、CK-MB、Myo）的同时检测。首先依靠物理吸附作用，将三种捕获抗体固定到硝酸纤维素膜表面构建生物免疫传感芯片，之后依次固定抗原和对应的检测抗体形成夹心免疫复合物，通过采集对应位置的发光信号实现三种指标的同时检测过程。验证了发光增强剂（SPTZ和MORP）对SBP催化的luminol-H2O2化学发光体系的增强作用，对发光底物液中各物质的浓度进行了优化，并在最优条件下，制得了三种指标的线性检测范围。4.2展望疾病生化标志物的灵敏准确检测对于疾病的早期预防诊断具有重大意义，近些年，研究者在这方面做出了很多努力，也取得了很大的进展，但是仍需要改进。一方面，对于一些超低浓度标志物的检测需要继续探索新的检测方法，同时，现有的检测方法中有44 东南大学硕士学位论文的存在稳定性和重现性不是很好的问题，然而对于疾病标志物的检测必须要精准，否则就失去了检测的意义，就这个角度而言，在提高检测灵敏度的同时，提高检测方法的特异性和稳定性是我们今后需要努力的方向。另一方面，发展多指标联合检测芯片实现便捷准确的检测，降低检测成本，满足不同市场应用需求也是今后需要努力的方向。45 参考文献参考文献[1]SarangadharanI,RegmiA,ChenYW,etal.HighsensitivitycardiactroponinIdetectioninphysiologicalenvironmentusingAlGaN/GaNHighElectronMobilityTransistor(HEMT)Biosensors[J].Biosensors&Bioelectronics,2018,100:282-289.[2]Correctionto:HeartDiseaseandStrokeStatistics-2017Update:AReportfromtheAmericanHeartAssociation[J].Circulation,2017,136(10):e196.[3]YusufS,RangarajanS,TeoK,etal.Cardiovascularriskandeventsin17low-,middle-,andhigh-incomecountries[J].NEnglJMed,2014,371(9):818-827.[4]ThygesenK,AlpertJS,JaffeAS,etal.Thirduniversaldefinitionofmyocardialinfarction[J].JAmCollCardiol,2012,60(16):1581-1598.[5]LiuT,LiangLL,XiaoP,etal.Alabel-freecardiacbiomarkerimmunosensorbasedonphase-shiftedmicrofiberBragggrating[J].Biosensors&Bioelectronics,2018,100:155-160.[6]WhiteHD,ChewDP.Acutemyocardialinfarction[J].TheLancet,2008,372(9638):570-584.[7]BakkerAJ,KoelemayMJW,GorgelsJ,etal.Failureofnewbiochemicalmarkerstoexcludeacutemyocardial-infarctionatadmission[J].Lancet,1993,342(8881):1220-1222.[8]ReichlinT,HochholzerW,BassettiS,etal.EarlyDiagnosisofMyocardialInfarctionwithSensitiveCardiacTroponinAssays[J].NewEnglandJournalofMedicine,2009,361(9):858-867.[9]LiuQ,AroonyadetN,SongY,etal.HighlySensitiveandQuickDetectionofAcuteMyocardialInfarctionBiomarkersUsingIn2O3NanoribbonBiosensorsFabricatedUsingShadowMasks[J].ACSnano,2016,10(11):10117-10125.[10]TutejaSK,ChenR,KukkarM,etal.Alabel-freeelectrochemicalimmunosensorforthedetectionofcardiacmarkerusinggraphenequantumdots(GQDs)[J].BiosensorsandBioelectronics,2016,86:548-556.46 东南大学硕士学位论文[11]StorrowAB,ChristensonRH,NowakRM,etal.DiagnosticperformanceofcardiacTroponinIforearlyrule-inandrule-outofacutemyocardialinfarction:Resultsofaprospectivemulticentertrial[J].Clinicalbiochemistry,2015,48(4-5):254-259.[12]CrossDB.Detectionofreperfusionafterthrombolytictherapybytheanalysisofreleasedbiochemicalmarkers[J].AustralianandNewZealandJournalofMedicine,1998,28(4):565-568.[13]ChanD,NgLL.Biomarkersinacutemyocardialinfarction[J].BMCMedicine,2010,8:34.[14]NieJ,GeorgeK,DuanF,etal.HistologicalevidenceforreversiblecardiomyocytechangesandserumcardiactroponinTelevationafterexerciseinrats[J].Physiologicalreports,2016,4(24).[15]CaselliC,CangemiG,MasottiS,etal.PlasmacardiactroponinIconcentrationsinhealthyneonates,childrenandadolescentsmeasuredwithahighsensitiveimmunoassaymethod:highsensitivetroponinIinpediatricage[J].ClinicaChimicaActa,2016,458:68-71.[16]TakedaS,YamashitaA,MaedaK,etal.StructureofthecoredomainofhumancardiactroponinintheCa2+-saturatedform[J].Nature,2003,424(6944):35-41.[17]AdamsJE,BodorGS,DavilaromanVG,etal.Cardiactroponin-I-amarkerwithhighspecificityforcardiacinjury[J].Circulation,1993,88(1):101-106.[18]GunsolusI,SandovalY,SmithSW,etal.RenalDysfunctionInfluencestheDiagnosticandPrognosticPerformanceofHigh-SensitivityCardiacTroponinI[J].JournaloftheAmericanSocietyofNephrology,2018:29(2):636-643.[19]BodorGS,PorterfieldD,VossEM,etal.Cardiactroponin-Iisnotexpressedinfetalandhealthyordiseasedadulthumanskeletal-muscletissue[J].ClinicalChemistry,1995,41(12):1710-1715.[20]WuAHB,AppleFS,GiblerWB,etal.NationalAcademyofClinicalBiochemistrystandardsoflaboratorypractice:Recommendationsfortheuseofcardiacmarkersincoronaryarterydiseases[J].ClinicalChemistry,1999,45(7):1104-1121.47 参考文献[21]ZaninottoM,AltinierS,LachinM,etal.FluoroenzymometricmethodtomeasurecardiactroponinIinseraofpatientswithmyocardialinfarction[J].ClinicalChemistry,1996,42(9):1460-1466.[22]ZimmetH.Thetwilightzoneoftroponins[J].Heart,lung&circulation,2003,12Suppl2:S90-4.[23]郭会时人心肌肌钙蛋白I的几种监测方法及其应用研究[D]：[博士学位论文].南京：东南大学生物科学与医学工程学院，2005[24]VanderveenKJ,WillebrandsAF.Isoenzymesofcreatinephosphokinaseintissueextractsandinnormalandpathologicalsera[J].ClinicaChimicaActa,1966,13(3):312-316.[25]ForebackCC.Biochemicaldiagnosisofmyocardialinfarction[J].HenryFordHospitalmedicaljournal,1991,39(3-4):159-64.[26]VikenesK,vonderLippeG,FarstadM,etal.ClinicalapplicabilityofcreatinekinaseMBmassandtheelectrocardiogramversusconventionalcardiacenzymesinthediagnosisofacutemyocardialinfarction[J].InternationalJournalofCardiology,1997,59(1):11-20.[27]唐萍.生化指标检测在急性心肌梗死诊断中的应用[J].现代医药卫生,2004,20(16):1626-1627.[28]KanemitsuF,OkigakiT.Creatine-kinaseisoenzymes[J].JournalofChromatography-BiomedicalApplications,1988,429:399-417.[29]FandrichM,FletcherMA,DobsonCM.Amyloidfibrilsfrommusclemyoglobin-Evenanordinaryglobularproteincanassumearogueguiseifconditionsareright[J].Nature,2001,410(6825):165-166.[30]McCordJ,NowakRM,McCulloughPA,etal.Ninety-minuteexclusionofacutemyocardialinfarctionbyuseofquantitativepoint-of-caretestingofmyoglobinandtroponinI[J].Circulation,2001,104(13):1483-1488.[31]KimS-W,KangH-J,BaeK-Y,etal.Interactionsbetweenpro-inflammatorycytokinesandstatinsondepressioninpatientswithacutecoronarysyndrome[J].ProgressinNeuro-Psychopharmacology&BiologicalPsychiatry,2018,80:250-254.[32]DobricM,OstojicM,GigaV,etal.GlycogenphosphorylaseBBinmyocardialinfarction[J].ClinicaChimicaActa,2015,438:107-111.48 东南大学硕士学位论文[33]LippiG,MattiuzziC,ComelliI,etal.GlycogenphosphorylaseisoenzymeBBinthediagnosisofacutemyocardialinfarction:ameta-analysis[J].BiochemiaMedica,2013,23(1):78-82.[34]SanchezNavarroR,BlancoMartinS,DeHaroT,etal.EvolutionofcoefficientsCKMM3/MM1,CKMB2/MB1andLD1/LD2inpatientswithacutemyocardialinfarction[J].ClinicalChemistry,2009,55(6):A67-A67.[35]HuijgenHJ,SandersGTB,KosterRW,etal.Theclinicalvalueoflactatedehydrogenaseinserum:Aquantitativereview[J].EuropeanJournalofClinicalChemistryandClinicalBiochemistry,1997,35(8):569-579.[36]HanYD,SongSY,LeeJH,etal.Multienzyme-modifiedbiosensingsurfacefortheelectrochemicalanalysisofaspartatetransaminaseandalaninetransaminaseinhumanplasma[J].AnalyticalandBioanalyticalChemistry,2011,400(3):797-805.[37]ChanCPY,SandersonJE,GlatzJFC,etal.Asuperiorearlymyocardialinfarctionmarker-Humanheart-typefattyacid-bindingprotein[J].ZeitschriftFurKardiologie,2004,93(5):388-397.[38]ChenL,GuoX,YangF.Roleofheart-typefattyacidbindingproteininearlydetectionofacutemyocardialinfarctionincomparisonwithcTnI,CK-MBandmyoglobin[J].JournalofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,2004,24(5):449-451.[39]deLemosJA,MorrowDA,BentleyJH,etal.TheprognosticvalueofB-typenatriureticpeptideinpatientswithacutecoronarysyndromes[J].NewEnglandJournalofMedicine,2001,345(14):1014-1021.[40]AnkerSD,CoatsAJS.Plasmabrainnatriureticpeptideasanindicatorofleftventricularsystolicfunctionandlong-termsurvivalafteracutemyocardialinfarction[J].Circulation,1997,95(2):538-538.[41]WollertKC,KempfT,PeterT,etal.Prognosticvalueofgrowth-differentiationfactor-15inpatientswithnon-ST-elevationacutecoronarysyndrome[J].Circulation,2007,115(8):962-971.49 参考文献[42]JugM,RumenjakV,AlpezaI,etal.Clinicalvalueofbiochemicalmarkersinthediagnosisofacutemyocardialinfarction[J].ActamedicaCroatica:casopisHravatskeakademijemedicinskihznanosti,2000,54(3):113-7.[43]JurlanderB,ClemmensenP,WagnerGS,etal.Veryearlydiagnosisandriskstratificationofpatientsadmittedwithsuspectedacutemyocardialinfarctionbythecombinedevaluationofasingleserumvalueofcardiactroponin-T,myoglobin,andcreatinekinaseMBmass[J].EuropeanHeartJournal,2000,21(5):382-389.[44]BodorGS,PorterS,LandtY,etal.DevelopmentofMonoclonalAntibodiesforanAssayofCardiacTroponin-landPreliminaryResultsinSuspectedCasesofMyocardialInfarction[J].ClinicalChemistry,1992,38(11):2203-2214.[45]ChoI-H,PaekE-H,KimY-K,etal.Chemiluminometricenzyme-linkedimmunosorbentassays(ELISA)-on-a-chipbiosensorbasedoncross-flowchromatography[J].AnalyticaChimicaActa,2009,632(2):247-255.[46]SongSY,HanYD,KimK,etal.Afluoro-microbeadguidingchipforsimpleandquantifiableimmunoassayofcardiactroponinI(cTnI)[J].Biosensors&Bioelectronics,2011,26(9):3818-3824.[47]FengLN,BianZP,PengJ,etal.Ultrasensitivemultianalyteelectrochemicalimmunoassaybasedonmetalionfunctionalizedtitaniumphosphatenanospheres[J].AnalChem,2012,84(18):7810-7815.[48]ZhouY,ZhuoY,LiaoN,etal.Ultrasensitiveimmunoassaybasedonapseudobienzymeamplifyingsystemofcholineoxidaseandluminol-reducedPt@Auhybridnanoflowers[J].ChemCommun,2014,50(93):14627-14630.[49]WeiJ,MuY,SongD,etal.AnovelsandwichimmunosensingmethodformeasuringcardiactroponinIinsera[J].AnalyticalBiochemistry,2003,321(2):209-216.[50]StoevaSI,LeeJS,SmithJE,etal.Multiplexeddetectionofproteincancermarkerswithbiobarcodednanoparticleprobes[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2006,128(26):8378-8379.50 东南大学硕士学位论文[51]YuX,MungeB,PatelV,etal.Carbonnanotubeamplificationstrategiesforhighlysensitiveimmunodetectionofcancerbiomarkers[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2006,128(34):11199-11205.[52]WuJ,FuZ,YanF,etal.Biomedicalandclinicalapplicationsofimmunoassaysandimmunosensorsfortumormarkers[J].TrACTrendsinAnalyticalChemistry,2007,26(7):679-688.[53]WuJ,YanF,TangJ,etal.Adisposablemultianalyteelectrochemicalimmunosensorarrayforautomatedsimultaneousdeterminationoftumormarkers[J].Clinicalchemistry,2007,53(8):1495-1502.[54]ZongC,WuJ,XuJ,etal.Multilayerhemin/G-quadruplexwrappedgoldnanoparticlesastagforultrasensitivemultipleximmunoassaybychemiluminescenceimaging[J].BiosensorsandBioelectronics,2013,43:372-378.[55]ZhaoF,ChaiD,LuJ,etal.Novelchemiluminescentimagingmicrotiterplatesforhigh-throughputdetectionofmultipleserumbiomarkersrelatedtoDown'ssyndromeviasoybeanperoxidaseaslabelenzyme[J].AnalBioanalChem,2015,407(20):6117-6126.[56]HenriksenA,MirzaO,IndianiC,etal.Structureofsoybeanseedcoatperoxidase:Aplantperoxidasewithunusualstabilityandhaem-apoproteininteractions[J].ProteinScience,2001,10(1):108-115.[57]KamalJKA,BehereDV.Activity,stabilityandconformationalflexibilityofseedcoatsoybeanperoxidase[J].JournalofInorganicBiochemistry,2003,94(3):236-242.[58]赵芳基于大豆过氧化物酶标记免疫蛋白芯片研制[D]：[硕士学位论文].南京：东南大学化学化工学院，2015[59]SteevenszA,Al-AnsariMM,TaylorKE,etal.Comparisonofsoybeanperoxidasewithlaccaseintheremovalofphenolfromsyntheticandrefinerywastewatersamples[J].JournalofChemicalTechnology&Biotechnology,2009,84(5):761-769.[60]McEldoonJP,DordickJS.Unusualthermalstabilityofsoybeanperoxidase[J].BiotechnologyProgress,1996,12(4):555-558.[61]SakharovIY,BerlinaAN,ZherdevAV,etal.Advantagesofsoybeanperoxidaseoverhorseradishperoxidaseastheenzymelabelinchemiluminescentenzyme-linked51 参考文献immunosorbentassayofsulfamethoxypyridazine[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2010,58(6):3284-3289.[62]RichterMM.Electrochemiluminescence(ECL)[J].ChemicalReviews,2004,104(6):3003-3036.[63]KongD,HuangS,ChengJ,etal.Sensitivedeterminationofbromhexinehydrochloridebasedonitsquenchingeffectonluminol/H2O2electrochemiluminescencesystem[J].Luminescence,2018,33(4):698-703.[64]YangDP,GuoW,CaiZ,etal.HighlysensitiveelectrochemiluminescencebiosensorforcholesteroldetectionbasedonAgNPs-BSA-MnO2nanosheetswithsuperiorbiocompatibilityandsynergisticcatalyticactivity[J].SensorsandActuatorsB:Chemical,2018,260:642-649.[65]ZhouB,QiuY,WenQ,etal.DualElectrochemiluminescenceSignalSystemforInSituandSimultaneousEvaluationofMultipleCell-SurfaceReceptors[J].ACSappliedmaterials&interfaces,2017,9(3):2074-2082.[66]TangM,ZhouZ,ShangguanL,etal.ElectrochemiluminescentdetectionofcardiactroponinIbyusingsoybeanperoxidaselabeled-antibodyassignalamplifier[J].Talanta,2018,180:47-53.[67]MarquetteCA,BlumLJ.Luminolelectrochemiluminescence-basedfibreopticbiosensorsforflowinjectionanalysisofglucoseandlactateinnaturalsamples[J].AnalyticaChimicaActa,1999,381(1):1-10.[68]LecaB,BlumLJ.Luminolelectrochemiluminescencewithscreen-printedelectrodesforlow-costdisposableoxidase-basedopticalsensors[J].Analyst,2000,125(5):789-791.[69]JirkaGP,MartinAF,NiemanTA.PHandconcentrationresponsesurfacesfortheluminol-H2O2electrogeneratedchemiluminescencereaction[J].AnalyticaChimicaActa,1993,284(2):345-349.[70]KearneyNJ,HallCE,JewsburyRA,etal.Electrogeneratedchemiluminescenceusingplatinumelectrodeswithhydrogenperoxidepre-treatment[J].AnalyticalCommunications,1996,33(8):269-270.52 东南大学硕士学位论文[71]AlpeevaIS,SakharovIY.Soybeanperoxidase-catalyzedoxidationofluminolbyhydrogenperoxide[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2005,53(14):5784-5788.[72]VreekeMS,YongKT,HellerA.Athermostablehydrogen-peroxidesensor-basedonwiringofsoybeanperoxidase[J].AnalyticalChemistry,1995,67(23):4247-4249.[73]RyanBJ,CarolanN,O'FagainC.Horseradishandsoybeanperoxidases:comparabletoolsforalternativeniches?[J].TrendsinBiotechnology,2006,24(8):355-363.[74]PatapasJ,Al-AnsariMM,TaylorKE,etal.Removalofdinitrotoluenesfromwaterviareductionwithironandperoxidase-catalyzedoxidativepolymerization:acomparisonbetweenArthromycesramosusperoxidaseandsoybeanperoxidase[J].Chemosphere,2007,67(8):1485-1491.[75]KimYH,AnES,SongBK,etal.Polymerizationofcardanolusingsoybeanperoxidaseanditspotentialapplicationasanti-biofilmcoatingmaterial[J].BiotechnologyLetters,2003,25(18):1521-1524.[76]LiuA,ZhaoF,ZhaoY,etal.Aportablechemiluminescenceimagingimmunoassayforsimultaneousdetectionofdifferentisoformsofprostatespecificantigeninserum[J].BiosensBioelectron,2016,81:97-102.[77]ThygesenK,AlpertJS,JaffeAS,etal.ThirdUniversalDefinitionofMyocardialInfarction[J].Circulation,2012,126(16):2020-2035.[78]AppleFS,CollinsonPO,ApplicatiITFC.AnalyticalCharacteristicsofHigh-SensitivityCardiacTroponinAssays[J].ClinicalChemistry,2012,58(1):54-61.[79]HaiderKH,StimsonWH.Cardiactroponin-I–abiochemicalmarkerforcardiaccellnecrosis[J].DiseaseMarkers,1993,11(5-6):205-215.[80]WuAHB,FengYJ,MooreR,etal.CharacterizationofcardiactroponinsubunitreleaseintoserumafteracutemyocardialinfarctionandcomparisonofassaysfortroponinTandI[J].ClinicalChemistry,1998,44(6):1198-1208.[81]GalvaniM,PanteghiniM,OttaniF,etal.Thenewdefinitionofmyocardialinfarction:analysisoftheESC/ACCConsensusDocumentandreflectionsonitsapplicabilitytothe53 参考文献ItalianHealthSystem[J].Italianheartjournal:officialjournaloftheItalianFederationofCardiology,2002,3(9):543-557.[82]ParkJ-S,ChoMK,LeeEJ,etal.Ahighlysensitiveandselectivediagnosticassaybasedonvirusnanoparticles[J].NatureNanotechnology,2009,4(4):259-264.[83]LippiG,FerrariA,GandiniG,etal.AnalyticalevaluationofthenewBeckmanCoulterAccesshighsensitivitycardiactroponinIimmunoassay[J].ClinicalChemistryandLaboratoryMedicine(CCLM),2017,56(1):157-161.[84]BhatnagarD,KumarV,KumarA,etal.GraphenequantumdotsFRETbasedsensorforearlydetectionofheartattackinhuman[J].BiosensorsandBioelectronics,2016,79:495-499.[85]LiuD,LuX,YangY,etal.AnovelfluorescentaptasensorforthehighlysensitiveandselectivedetectionofcardiactroponinIbasedonagrapheneoxideplatform[J].Analyticalandbioanalyticalchemistry,2018:1-7.[86]ZhangJ,WangY,WongTI,etal.Electrofocusing-enhancedlocalizedsurfaceplasmonresonancebiosensors[J].Nanoscale,2015,7(41):17244-17248.[87]WuW-Y,BianZ-P,WangW,etal.PDMSgoldnanoparticlecompositefilm-basedsilverenhancedcolorimetricdetectionofcardiactroponinI[J].SensorsandActuatorsB-Chemical,2010,147(1):298-303.[88]KamalJKA,BehereDV.Thermalandconformationalstabilityofseedcoatsoybeanperoxidase[J].Biochemistry,2002,41(29):9034-9042.[89]HenriksenA,SmithAT,GajhedeM.ThestructuresofthehorseradishperoxidaseC-ferulicacidcomplexandtheternarycomplexwithcyanidesuggesthowperoxidasesoxidizesmallphenolicsubstrates[J].JournalofBiologicalChemistry,1999,274(49):35005-35011.[90]AlpeevaIS,SakharovIY.Luminoloxidationcatalyzedbyroyalpalmleafperoxidase[J].AppliedBiochemistryandMicrobiology,2007,43(1):25-28.[91]YuF-Y,VdovenkoMM,WangJ-J,etal.ComparisonofEnzyme-LinkedImmunosorbentAssayswithChemiluminescentandColorimetricDetectionfortheDeterminationofOchratoxinAinFood[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2011,59(3):809-813.54 东南大学硕士学位论文[92]ShiL,LiuX,NiuW,etal.HydrogenperoxidebiosensorbasedondirectelectrochemistryofsoybeanPeroxidaseimmobilizedonsingle-walledcarbonnanohornmodifiedelectrode[J].Biosensors&Bioelectronics,2009,24(5):1159-1163.[93]SakharovIY,AlpeevaIS,EfremovEE.Useofsoybeanperoxidaseinchemiluminescentenzyme-linkedimmunosorbentassay[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2006,54(5):1584-1587.[94]BertoncelloP,ForsterRJ.Nanostructuredmaterialsforelectrochemiluminescence(ECL)-baseddetectionmethods:Recentadvancesandfutureperspectives[J].Biosensors&Bioelectronics,2009,24(11):3191-3200.[95]LiaoY,ZhouX,FuY,etal.LinearRu(bpy)32+–PolymerasaUniversalProbeforSensitiveDetectionofBiomarkerswithControllableElectrochemiluminescenceSignal-AmplifyingRatio[J].Analyticalchemistry,2017,89(23):13016-13023.[96]JuzgadoA,SoldàA,OstricA,etal.Highlysensitiveelectrochemiluminescencedetectionofaprostatecancerbiomarker[J].JournalofMaterialsChemistryB,2017,5(32):6681-6687.[97]WangJ-X,ZhuoY,ZhouY,etal.CeriaDopedZincOxideNanoflowersEnhancedLuminol-BasedElectrochemiluminescenceImmunosensorforAmyloid-betaDetection[J].AcsAppliedMaterials&Interfaces,2016,8(20):12968-12975.[98]WangZ,ZhangJ,ChenP,etal.Label-free,electrochemicaldetectionofmethicillin-resistantstaphylococcusaureusDNAwithreducedgrapheneoxide-modifiedelectrodes[J].Biosensors&Bioelectronics,2011,26(9):3881-3886.[99]MaJ,WangX,LiuY,etal.ReductionofgrapheneoxidewithL-lysinetopreparereducedgrapheneoxidestabilizedwithpolysaccharidepolyelectrolyte[J].JournalofMaterialsChemistryA,2013,1(6):2192-2201.[100]WangS,YuD,DaiL,etal.Polyelectrolyte-FunctionalizedGrapheneasMetal-FreeElectrocatalystsforOxygenReduction[J].AcsNano,2011,5(8):6202-6209.[101]LiuF,SongS,XueD,etal.FoldedStructuredGraphenePaperforHighPerformanceElectrodeMaterials[J].AdvancedMaterials,2012,24(8):1089-1094.55 参考文献[102]YangJ,WangJ,TangY,etal.LiFePO4-grapheneasasuperiorcathodematerialforrechargeablelithiumbatteries:impactofstackedgrapheneandunfoldedgraphene[J].Energy&EnvironmentalScience,2013,6(5):1521-1528.[103]ZhouK,ZhuY,YangX,etal.AnovelhydrogenperoxidebiosensorbasedonAu-graphene-HRP-chitosanbiocomposites[J].ElectrochimicaActa,2010,55(9):3055-3060.[104]LiuH,KuilaT,KimNH,etal.Insitusynthesisofthereducedgrapheneoxide-polyethyleneiminecompositeanditsgasbarrierproperties[J].JournalofMaterialsChemistryA,2013,1(11):3739-3746.[105]ChenL,GuB,ZhuG,etal.ElectrontransferpropertiesandelectrocatalyticbehavioroftyrosinaseonZnOnanorod[J].JournalofElectroanalyticalChemistry,2008,617(1):7-13.[106]CaoY,YuanR,ChaiY,etal.UltrasensitiveluminolelectrochemiluminescenceforproteindetectionbasedoninsitugeneratedhydrogenperoxideascoreactantwithglucoseoxidaseanchoredAuNPs@MWCNTslabeling[J].Biosensors&Bioelectronics,2012,31(1):305-309.[107]ShumyantsevaVV,IvanovYD,BistolasN,etal.DirectelectrontransferofcytochromeP45002B4atelectrodesmodifiedwithnonionicdetergentandcolloidalclaynanoparticles[J].AnalyticalChemistry,2004,76(20):6046-6052.[108]XuS,LiuY,WangT,etal.PositivePotentialOperationofaCathodicElectrogeneratedChemiluminescenceImmunosensorBasedonLuminolandGrapheneforCancerBiomarkerDetection[J].AnalyticalChemistry,2011,83(10):3817-3823.[109]GuoHS,HeNY,GeSX,etal.MCM-41mesoporousmaterialmodifiedcarbonpasteelectrodeforthedeterminationofcardiactroponinIbyanodicstrippingvoltammetry[J].Talanta,2005,68(1):61-66.[110]DittmerWU,EversTH,HardemanWM,etal.Rapid,highsensitivity,point-of-caretestforcardiactroponinbasedonoptomagneticbiosensor[J].ClinicaChimicaActa,2010,411(11-12):868-873.[111]LiF,YuY,CuiH,etal.Label-freeelectrochemiluminescenceimmunosensorforcardiactroponinIusingluminolfunctionalizedgoldnanoparticlesasasensingplatform[J].Analyst,2013,138(6):1844-1850.56 东南大学硕士学位论文[112]KotsevaK,WoodD,DeBackerG,etal.Clinicalrealityofcoronarypreventionguidelines:acomparisonofEUROASPIREIandIIinninecountries[J].Lancet,2001,357(9261):995-1001.[113]BerlinD.Suddendeathduetocardiacarrhythmias[J].NewEnglandJournalofMedicine,2002,346(12):946-946.[114]BoersmaE,MercadoN,PoldermansD,etal.Acutemyocardialinfarction[J].Lancet,2003,361(9360):847-858.[115]NigamPK.Biochemicalmarkersofmyocardialinjury[J].Indianjournalofclinicalbiochemistry:IJCB,2007,22(1):10.[116]TunstallpedoeH,KuulasmaaK,AmouyelP,etal.Myocardial-infractionandcoronarydeathsintheworld-health-organizationmonicalproject-registrationprocedures,eventrates,andcase-fatalityratesin38populationsfrom21countriesin4continents[J].Circulation,1994,90(1):583-612.[117]MontagueC,KircherT.Myoglobinintheearlyevaluationofacutechestpain[J].AmericanJournalofClinicalPathology,1995,104(4):472-476.[118]LeeHY,ChoiJS,GuruprasathP,etal.Anelectrochemicalbiosensorbasedonamyoglobin-specificbindingpeptideforearlydiagnosisofacutemyocardialinfarction[J].AnalyticalSciences,2015,31(7):699-704.[119]GiblerWB,RunyonJP,LevyRC,etal.Arapiddiagnosticandtreatmentcenterforpatientswithchestpainintheemergencydepartment[J].AnnalsofEmergencyMedicine,1995,25(1):1-8.[120]GimenezMR,TwerenboldR,JaegerC,etal.One-hourrule-inandrule-outofacutemyocardialinfarctionusinghigh-sensitivitycardiactroponinI[J].TheAmericanjournalofmedicine,2015,128(8):861-870.[121]BoeddinghausJ,NestelbergerT,TwerenboldR,etal.DirectComparisonof4VeryEarlyRule-OutStrategiesforAcuteMyocardialInfarctionUsingHigh-SensitivityCardiacTroponinIClinicalPerspective[J].Circulation,2017,135(17):1597-1611.57 参考文献[122]AntmanEM,TanasijevicMJ,ThompsonB,etal.Cardiac-specifictroponinIlevelstopredicttheriskofmortalityinpatientswithacutecoronarysyndromes[J].NewEnglandJournalofMedicine,1996,335(18):1342-1349.[123]KapeluichYL,RubtsovaMY,EgorovAM.Enhancedchemiluminescencereactionappliedtothestudyofhorseradishperoxidasestabilityinthecourseofp-iodophenoloxidation[J].JournalofBioluminescenceandChemiluminescence,1997,12(6):299-308.[124]MarchisT,CerratoG,MagnaccaG,etal.Immobilizationofsoybeanperoxidaseonaminopropylglassbeads:Structuralandkineticstudies[J].BiochemicalEngineeringJournal,2012,6728-34.[125]MarzocchiE,GrilliS,DellaCianaL,etal.Chemiluminescentdetectionsystemsofhorseradishperoxidaseemployingnucleophilicacylationcatalysts[J].AnalyticalBiochemistry,2008,377(2):189-194.[126]VdovenkoMM,DellaCianaL,SakharovIY.3-(10'-Phenothiazinyl)propane-1-sulfonateisapotentenhancerofsoybeanperoxidase-inducedchemiluminescence[J].AnalyticalBiochemistry,2009,392(1):54-58.58 攻读硕士学位期间的研究成果攻读硕士学位期间的研究成果攻读硕士学位期间发表的论文：1.MinTang,ZhenxianZhou,LiShangguan,FangZhao,SongqinLiu*,ElectrochemiluminescentdetectionofcardiactroponinIbyusingsoybeanperoxidaselabeled-antibodyassignalamplifier,Talanta,2018,180,47-53.2.唐敏，赵芳，刘松琴*.大豆过氧化物酶作为信号放大剂用于心肌肌钙蛋白的电化学检测.2017年4月14日-4月16日，南昌，第十三届全国电分析化学会议论文集，480.59 致谢致谢光阴似箭，岁月如歌，转眼间，三年的研究生求学生涯即将结束，我也在东大度过了我人生当中美好的三年。站在毕业的门槛上，回首过往的岁月，有实验不顺时的焦虑迷茫，有收获成果时的兴高采烈，有实验室一起活动时的欢声笑语，所有的点点滴滴，构成了三年的研究生生活。值此论文驻笔之际，对所有帮助过我的老师、同学、朋友以及家人致以最衷心的感谢！首先，我要感谢我的指导老师刘松琴教授，刘老师科学严谨、认真负责的治学态度，锐意创新的学术作风，“谋定而后动，态度决定一切，细节决定成败”的处事原则，让我受益颇深。正是在刘老师的悉心指导下，我的工作得以顺利完成。同时，在生活上，刘老师给予我们无私的关心帮助，并借生活中的小事教给我们很多道理，使我受益良多。能够师从刘老师，我觉得自己很幸运。在此向刘老师表达我最真挚的感谢！感谢张袁健老师、卫伟老师、李颖老师、刘安然老师给予我的学习和生活上的指导和帮助，真心感谢你们！同时，在实验室这个大家庭里，师兄师姐师弟师妹们也给我莫大的帮助和鼓励，使我度过了难忘的三年时光。在此感谢课题组赵岳五、上官莉、米利、姜玲、张芬、韦源青、汪侃、周思思、田召燕、邵凤英等各位师兄师姐的建议与指导，感谢马晓兰、马梦瑶、吴欣然、李智德、刘世玉等同学给予我的帮助与鼓励，感谢赵凯歌、高雅琼师妹们给予我生活上的关怀与鼓励。此外，我还要特别感谢我的家人，是他们给予我生活上我无微不至的关怀，同时给予我精神上的鼓励与支持，他们始终是我最坚强的后盾，给予我无私的爱与关怀。借此机会向我的父母和亲人致以最诚挚的感谢！最后，衷心感谢各位评审论文和参加论文答辩的专家，感谢他们在百忙之中抽出宝贵的时间对我的工作给予的批评与指导。唐敏二零一八年四月60
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