心肌标志物荧光检测方法的建立

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分类号：密级：可公开UDC：编号:心肌标志物荧光检测方法的建立QUANTITATIVEDETERMINATIONOFMYOCARDIALMARKERSWITHFLUORESCENCEIMMUNEANALYSIS学位授予单位及代码：0703学科专业名称及代码：化学（070301）研究方向：生物与化学分析申请学位级别：硕士指导教师：于源华教授研究生：丁秋雨论文起止时间：2015.9.1—2016.12.1 长春理工大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的硕士学位论文，《心肌标志物荧光检测方法的建立》是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：年月日长春理工大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解“长春理工大学硕士、博士学位论文版权使用规定”，同意长春理工大学保留并向中国科学信息研究所、中国优秀博硕士学位论文全文数据库和CNKI系列数据库及其它国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权长春理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。作者签名：年月日导师签名：年月日 摘要近些年来，急性心肌梗死具有死亡率高及发病急等特点，已对人类健康产生重大的威胁。肌酸激酶同工酶（CK-MB）与肌红蛋白（Myo）是心肌细胞产生的重要心肌损伤有关标志物，对急性心肌梗死的诊断有着重要的临床意义。本研究利用荧光微球免疫分析方法对血液中的Myo以及CK-MB建立了定量检测分析方法，同时制备了定量检测试纸条。通过免疫层析技术与光致发光相结合，将一种单克隆抗体与荧光微球通过EDC与NHS进行偶联作成荧光标记物，将另一种对抗原不同作用靶点的抗体包被到NC膜上，最终两种单克隆抗体与样本中的目标被测物形成“三明治”的夹心结构，标记的荧光微球在紫外光激发波长为365nm下发出红光，通过荧光定量检测仪测定相对荧光强度从而定量检测Myo以及CK-MB的含量。本文通过荧光微球标记及表征、原料的筛选、免疫层析试纸条的构建及优化以方法学评估等系列实验。结果显示Myo试纸条线性范围25ng/ml~1500ng/ml，灵敏度为12.5ng/ml，CV<7%；CK-MB试纸条线性范围1ng/ml~1000ng/ml，灵敏度为1ng/ml，CV<8%。通过样本测试结果显示自制试纸条与购买的胶体金试纸条具有良好的相关性。但荧光试纸条定量，胶体金只能定性，而且荧光试纸条比较灵敏。本论文的实验结果为开发Myo以及CK-MB荧光检测方法及检测卡提供实验基础。关键词:肌红蛋白肌酸激酶同工酶荧光免疫分析法急性心肌梗死I ABSTRACTInrecentyears,acutemyocardialinfarctionwithhighmortalityandacuteonsetandothercharacteristics,hasasignificantthreattohumanhealth.Creatinekinaseisoenzyme(CK-MB)andmyoglobin(Myo)areimportantmarkersofmyocardialinjuryinmyocardialcells,andhaveimportantclinicalsignificanceinthediagnosisofacutemyocardialinfarction.Inthisstudy,thequantitativemethodofMyoandCK-MBinbloodwasestablishedbyusingfluorescentmicrospherewithimmunoassayanalysis,andaquantitativeteststripwasalsoprepared.Principleisthecombinationofimmunochromatographyandphotoluminescence.ThemonoclonalantibodyandfluorescentmicrosphereswereconjugatedtoafluorescentlabelbyEDCandNHS,andanotherantibodyagainstthedifferenttargetofantigenwascoatedontoNCmembrane.Finally,sandwichstructureconsistsoftwokindsofmonoclonalantibodiesandtheantigeninthesample.Theexcitationwavelengthofthefluorescentmicrosphereswas365nm,andredlightwasemittedunderultravioletlight.TherelativefluorescenceintensitywasmeasuredbyafluorescencequantitativedetectortoquantitativelydetectthecontentofMyoandCK-MB.Inthispaper,Ihavedoneaseriesofexperiments,suchasfluorescentmicrospherelabelingandcharacterization,screeningofrawmaterials,immunochromatographicteststripstobuildandoptimizemethodologicalassessment.Results:ThelinearrangeofMyoteststripwas25ng/ml~1500ng/ml,thelevelofsensitivitywas12.5ng/ml,CV<7%.ThelinearrangeofCK-MBteststripwas1ng/ml~1000ng/ml,thesensitivitywas1ng/ml,CV<8%.Sampletestresultsshowedthatfluorescentimmunochromatographicteststripsandthepurchaseofcolloidalgoldteststriphasagoodcorrelation.Butthefluorescentteststripscanbequantitativedetectionofsamples,colloidalgoldcanonlyqualitativedetection,andfluorescentteststripsmoresensitive.TheexperimentalresultsprovideexperimentalbasisforthedevelopmentofMyoandCK-MBfluorescencedetectionmethodanddetectioncard.KeyWords：MyoglobinCreatinekinaseisoenzymeFluorescenceimmunoassayAcutemyocardialinfarctionII 目录摘要....................................................................................................................................IABSTRACT....................................................................................................................II目录................................................................................................................................III第一章绪论......................................................................................................................11.1心肌损伤...........................................................................................................11.1.1急性心肌梗死........................................................................................11.1.2AMI的病因.............................................................................................11.1.3AMI的种类.............................................................................................21.1.4AMI的症状.............................................................................................21.1.5AMI的诊断.............................................................................................21.2肌酸激酶同工酶MB(CK-MB).......................................................................31.2.1CK-MB....................................................................................................31.2.2CK-MB的临床意义...............................................................................31.2.3CK-MB的检测方法...............................................................................41.3肌红蛋白(myoglobin，Myo)..........................................................................41.3.1Myo..........................................................................................................41.3.2Myo的临床意义.....................................................................................51.3.3Myo的检测方法.....................................................................................51.4荧光微球...........................................................................................................51.5蛋白质的免疫层析技术...................................................................................61.5.1免疫层析技术........................................................................................61.5.2荧光免疫层析分析法............................................................................71.6本课题的研究意义及主要内容.......................................................................81.6.1本课题研究的意义................................................................................81.6.2主要研究内容........................................................................................9第二章微球与抗体偶联................................................................................................102.1实验材料及仪器.............................................................................................102.1.1实验仪器..............................................................................................102.1.2实验试剂..............................................................................................102.2实验用溶液及其配制.....................................................................................112.3实验方法.........................................................................................................122.3.1抗原及抗体浓度测定..........................................................................122.3.2抗体效价测定......................................................................................13III 2.3.3微球与抗体偶联条件优化..................................................................132.3.4荧光微球与抗体偶联表征..................................................................142.4结果.................................................................................................................152.4.1蛋白浓度测定结果..............................................................................152.4.2抗体效价..............................................................................................162.4.3偶联效率的测定..................................................................................182.4.4荧光微与抗体偶联表征......................................................................192.5小结.................................................................................................................20第三章材料筛选及处理液优化....................................................................................213.1实验仪器及试剂.............................................................................................213.1.1主要试剂..............................................................................................213.1.2主要仪器..............................................................................................213.2试剂卡材料的筛选.........................................................................................223.2.1NC膜的筛选.........................................................................................223.2.2释放垫的筛选......................................................................................223.2.3样品垫的筛选......................................................................................223.3释放垫处理优化.............................................................................................233.4稀释液（重悬液）优化.................................................................................233.5样品垫处理.....................................................................................................243.6结果.................................................................................................................253.6.1试剂卡材料的筛选..............................................................................253.6.2释放垫处理优化..................................................................................263.6.3稀释液（重悬液）优化......................................................................273.6.4样品垫处理..........................................................................................283.7本章小结.........................................................................................................28第四章荧光免疫层析试纸条的制备及优化................................................................304.1实验仪器及材料.............................................................................................304.1.1实验材料及试剂...................................................................................304.1.2主要实验仪器.......................................................................................304.2Myo试纸条的构建及优化..............................................................................304.2.1Myo试纸条T线浓度的确定..............................................................304.2.2Myo试纸条C线浓度的确定..............................................................314.2.3Myo试纸条检测特异性研究...............................................................314.2.4Myo检测时间的确定...........................................................................314.2.5Myo灵敏度的确定及检测标准曲线的建立.......................................314.2.6Myo试纸条重复性研究.......................................................................32IV 4.2.7Myo检测方法学比较及相关性测定...................................................324.2.8Myo免疫层析试纸条稳定性的研究...................................................324.3CK-MB试剂盒的构建及优化........................................................................324.3.1CK-MB试纸条T线浓度的确定.........................................................324.3.2CK-MB试纸条C线浓度的确定........................................................324.3.3CK-MB试纸条特异性研究.................................................................324.3.4CK-MB检测时间的确定....................................................................334.3.5CK-MB检测标准曲线的建立............................................................334.3.6CK-MB免疫层析试纸条重复性研究.................................................334.3.7CK-MB免疫层析试纸条方法学比较及相关性测定.........................334.3.8CK-MB免疫层析试纸条稳定性的研究.............................................334.4实验结果.........................................................................................................344.4.1Myo试纸条的构建及优化...................................................................344.4.2CK-MB试纸条的构建及优化.............................................................394.5本章小结.........................................................................................................45第五章结论与展望........................................................................................................465.1结论.................................................................................................................465.2展望.................................................................................................................47参考文献........................................................................................................................48致谢.................................................................................................................................52V 第一章绪论近年来，我国患心血管病(cardiovasculardisease，CVD)者的人数正急剧增加，且呈年青化，也是全世界患有疾病致死的最主要原因。心血管一系列疾病也已经成为了[1-2]在中国城市人口中死亡概率和发病概率最高的疾病之一。2014年5月，世界卫生组织公布了世界范围内心血管疾病临床医学调查的最新数据显示，2013年全世界约有一千八百万人由于心血管疾病而死去，占世界因各种疾病而死亡的四分之一，这已经是世界人们死亡的最为主要的原因。据中国卫生部的信息披露，全国每年因心脏性疾[3]病猝死的人超过五十余万，在世界范围内排名第一。中国农村心血管病死亡率持续高于城市心血管病死亡率。据世界卫生组织统计,中国每年三百至四百万人死于各类心血管疾病，平均每十秒钟就有一个患者死亡，占各种疾病的死亡人数第一位。一半以上的人首次发作就是心肌梗死或者猝死。目前，心肌损伤疾病已成为对人们生命安[4]全产生比较严重威胁疾病之一。开发检测快速且准确的诊断心肌损伤的方法，并结合恰当的相关的治疗方案对疾病的诊断及预后有着十分重要的意义。1.1心肌损伤心肌损伤(Myocardialinjury)是指由多种原因所造成的心肌细胞死亡或者心肌的坏死，一般产生心肌损伤的主要原因是指心肌供血不足，这种心肌供血不足通常是由于心肌持续性缺血所导致的，也是患者发病的先兆。一些心肌炎、营养缺乏症以及大叶[5]性肺炎等常见疾病也可以诱发心肌损伤，然而一般多为儿童会发生此类疾病。快速并准确的诊断心肌损伤成为急性心肌梗死早期诊断重要的诊断标准,对病人的急性心肌梗死的快速诊断具有着重要的意义。[6]对于心肌损伤的常用的诊断主要是心电图诊断和心肌中的一些标志物的检测。由于普通标志物不易进行诊断心肌损伤过程中的微量心肌细胞坏死,所以需要对灵敏[7]度高和特异性强的标志物进行检测。1.1.1急性心肌梗死急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)，也称心肌梗死(myocardialinfarction，MI)，在冠状动脉病变的基础上所发生冠状动脉供血迅速减少或者中断使得[8]心肌持久而严重的缺血从而导致急性心肌坏死。最新定义为缺血引起任何大小的心肌坏死均为心肌梗死。具有发病快速，死亡率高等特点。1.1.2AMI的病因AMI的产生原因多种多样，错综复杂。当机体过度劳累及体力活动、失眠、精神紧张、强冷刺激等可引起交感神经的兴奋，从而机体产生儿茶酚胺并释放到血液中，1 使心肌细胞受损诱发AMI。通常当机体由于其它原因导致动脉血栓形成时，会在冠状动脉狭窄性粥样硬化病变的基础上引发管腔急性闭塞，而冠状动脉急性血栓堵塞就会引起AMI的发病。通常在机体发生冠状动脉粥样硬化时会形成类似粥样的斑块，内容物的促凝成分在病灶斑块破裂时暴露出来，导致血小板凝集形成血栓，就会发生心肌[9-10]持续性或者间歇性缺血，就会引起心肌损伤和AMI。若粥样斑块不破裂，则其可造成冠状动脉分支远端的堵塞，也会引起心肌损伤导致AMI。1.1.3AMI的种类关于AMI的分类,可以据心肌梗死实病灶占心室壁的厚度将AMI分为区域性心肌梗死及心内膜下心肌梗死两种类型。也可根据心电图和临床表现的不同进行不同的分类。按心电图的情况不同可以分为三大类。分别为Q波性和无Q波性、ST-段抬高型[11]以及非ST-段抬高型心肌梗死。还可以按心肌梗死的病理情况分为典型AMI和非典型AMI，它们的区别主要是临床表现不同。典型的AMI有胸部疼痛及胸闷等明显的现象，而非典型的AMI没有典型的AMI的症状，容易发生误诊事件。按心肌梗死病[12]人的年龄还可以分为青少年型和中老年型AMI等。1.1.4AMI的症状急性心肌梗死中一些中老年人为常见的发病人群，但是目前其发病人年龄趋势在[13]逐渐减小。病人典型的症状是胸部疼痛，胸闷气短，心率失常，一些人在发病时出现呼吸困难甚至休克等现象。由于不同病人的个人体质不同，个别个体还会出现食欲减退、恶心、呕吐、咳嗽、多痰、上肢麻木、头晕目弦等症状。AMI发生时，还会引起全身发热，高烧在三十八摄氏度左右。一些疼痛可能发生在罕见部位如脚趾、下巴等部位。约有三分之一人群在AMI发病前没有先兆症状，应该特别注意监测。1.1.5AMI的诊断目前，常用的方法是通过心电图监测配合心肌标志物的检测对AMI进行诊断的。典型AMI可根据特征性的心电图检测结果以及实验室检查进行诊断，二维超声心动图有助于对AMI的诊断。对AMI快速的诊断以及预后的及时治疗是降低其病死率和挽[14]救患者生命的关键。然而对于非典型的AMI患者来说其发病先兆不明显，心电图检测会造成检测时间长，不能及时诊断出结果，很可能使患者错过最佳治疗时机造成[15]死亡。综上所述心肌损伤标志物可以准确检测AMI，成为AMI早期诊断的重要依据。临床研究结果表明，AMI血液生化检测标志物的影响因素有以下几个方面：标志物的分子量的大小会影响AMI血液生化检测：一般小分子物质能够较容易透过心肌细胞膜，从而释放入血液循环系统中去。胞内分布情况也是重要影响因素：心肌细胞的细胞质中蛋白分子量小的比具有结构性的蛋白更加的容易释放到血液循环系统中，而细胞质中更容易被检测到的是含量较高的相关蛋白质。蛋白质的特异性、释放率及半衰期等其他因素也会有影响。最理想的有关损伤的标志物具有高度心脏特异性，在较长时间内无衰减且容易被测到，以及在心肌损伤时或发生后能够很快的进入血液并浓2 [16-17]度快速增高，最好能够较快的得出相关结果以及对临床学检测具有重要意义。但到目前为止，世界范围内找到完全符合以上标准的心肌损伤的检测标志物很难，所以[18-19]可以利用心肌标志物进行检测AMI的早期诊断。常用的心肌损伤标志物主要包括心肌肌钙蛋白I/T(cTnI、cTnT)、脂肪酸结合蛋白[20](H-FABP)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、和肽素(copetin)、肌红蛋白(Myo)、天[21]冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、全程反应蛋白(CRP)和肌酸激酶(CK)等。[22]其中cTnT普及性不如cTnI，广泛应用的肌钙蛋白I与肌酸激酶同工酶曾一度被认为是诊断AMI的“金标准”。肌酸激酶同工酶虽然没有cTnI的特异性强，cTnI可以检测出肌酸激酶同工酶不能检测出的轻微心肌损伤，但肌酸激酶同工酶仍可作为辅助[23]标志物进行AMI的诊断。肌红蛋白是心肌梗死的早期标记物并在心肌损伤发生后[24-25]最先出现最大值。虽然脂肪酸结合蛋白和肌红蛋白类似都可以成为AMI检测标志[26-27]物，但关于脂肪酸结合蛋白的检测有关产品还没有广泛应用。1.2肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)1.2.1CK-MB肌酸激酶同工酶又称血清肌酸激酶同工酶，是人体细胞内能量的代谢有关的具有[28]重要作用的酶。肌酸激酶在大多数组织中是丰富的。在条纹肌肉中活性高达225IU/g至12000IU/g。在心肌中CK活性为每克约有1600IU，其中15%至30%是CK-MB。CK-MB是存在于骨骼肌（1-3%）、心脏和脑中的肌酸激酶(CK)的一种同工酶，它由两个亚基M和B形成。急性肌肉损伤后，CK-MB会在骨骼肌中的百分比瞬时增加和循环水平升高。另外两种同功酶是由MM和BB这些亚基的组合成CK-MM与[29]CK-BB。CK-MM是骨骼和心肌中的主要同工酶。CK-BB主要在大脑中发现。而CK-MB同工酶主要在心肌中发现，在心肌组织中约占CK总比例的15%，同时也存[30]在于骨骼肌中，占CK总比例不足1%。CK-MB在心肌细胞内的主要是CK-MB2亚型存在的，在心肌受损发生后在豫肽酶作用下会将CK-MB2亚型变为CK-MB1亚[31]型。除了这些亚型外还有巨型肌酸激酶(MacroCK)等。这些CK同工酶的存在具有预后价值，因为1型MacroCK通常存在于发展为心血管或自身免疫过程的患者中，而2型MacroCK最常见于患有恶性增殖的患者。1.2.2CK-MB的临床意义临床上，测量一种或多种具体水平的心脏生物标志物用于确定心肌的损伤程度和评估患者的预后。CK-MB质量通常用于临床检测。CK和CK-MB在监测鉴别诊断心肌梗死患者中起重要作用。世界卫生组织对1994年AMI诊断的研究表明，CK-MB[32]在适当的临床环境中的非典型的上升和下降现象足以证实AMI是否发生。在急性症状入院后4至8小时内，血清总CK和血清CK-MB接近其各自的峰值活动。当胸3 痛发作时，CK-MB较早出现在血液中，据此特点CK-MB可以作为早期诊断AMI的[33-34][35]标志物。然而，事实上研究表明CK-MB2可用于AMI检测的早期阶段。CK-MB[36]可用于检测心肌梗死的范围以及判断是否再梗死。虽然由于CK-MB的特异性不如cTnI的特异性好，但是当cTnI结果不好诊断时，CK-MB仍可作为辅助标志物进行检[37]测AMI。当患者进行溶栓治疗时，可据CK-MB在心肌冠状动脉复通时流出来含量的多少来作为标志物评估治疗效果。1.2.3CK-MB的检测方法检测CK-MB的方法有很多种，如酶活力测定法、放射性免疫分析法、酶联免疫[38]（ELISA）定量检测方法、免疫比浊法、化学发光免疫分析检测法以及POCT免疫层析检测法等。CK-MB的酶活性是通过免疫抑制法来进行测定。原理是通过单克隆抗体与CK-MB中的M亚基活性部分结合，从而抑制M亚基的活性，然后通过测定B[39]亚基ATP的代谢量并将两倍的计算结果作为定量的检测出CK-MB的酶活力结果。[40]但这种方法不如化学发光方法特异性高，如在患有恶性肿瘤的病人中，CK-MB的活性增高明显，可能造成AMI的误诊。放射性免疫分析法会产生放射污染且重复性差。ELISA检测时间长，免疫比浊检测又需要大型仪器进行检测，而化学发光法检测CK-MB具有特异性强以及灵敏度高的特点将逐渐取代免疫抑制法以及放射性免疫分[41]析法，但是化学发光法不如POCT试剂检测方法操作简单，检测时间短且不需要大型的分析检测仪器，打破了只能在实验室进行固定检测的传统，大大降低了检测成本[42]。所以POCT将成为快速检测CK-MB的主要方法。而目前常用的POCT检测方法中包含胶体金免疫层析检测法以及量子点、荧光微球等荧光免疫层析检测法等。胶体金免疫层析可定性或半定量进行检测，而荧光免疫层析可实现CK-MB的定量检测。1.3肌红蛋白(myoglobin，Myo)1.3.1Myo肌红蛋白(myoglobin,Myo)主要分布在肌肉组织的肌浆中，它是由153个氨基酸所构成的一种单一的肽链，含量约为百分之零点二到百分之二，分子量大小约为17.8KDa。肌红蛋白是复合性色素类的蛋白，主链的四分之三长度折叠构成八个重要的螺[43]旋α螺旋的构象，使得肌红蛋白的蛋白质肽链折叠盘绕成一种球状蛋白结构。Myo[44]等电点pI为6.78，具有外部亲水性内部疏水的特点，属于可溶性蛋白质。Myo可与氧气结合，可把在肌细胞周围的毛细血管里的氧气运输到每个肌肉细胞中。这种携带氧气的方式是可逆的，在人体运动时可以保证肌肉细胞运动代谢时有充分的氧。Myo除了可以与氧气结合还可以与CO结合。由于Myo这种特殊的空间结构，可以使二价[45]铁离子不易氧化成三价铁离子，确保了Myo的结合氧的能力。Myo的结构变化受环境因素以及生产过程中的处理方法影响，而Myo的氧化还原状态不同，它的氧化还4 原电位也随之不同，铁离子的价态也可能不一样，这就会导致一些其他反应和现象的[46][47-48]发生。Myo还可以作为模拟酶来进行模拟过氧化物催化底物活性的研究。1.3.2Myo的临床意义Myo主要存在心肌细胞的胞质中，没有心肌损伤的人的Myo含量很小，而当人体心肌发生损伤时Myo会大量的表达，由于Myo分子量小，因此可以快速的释放进入血液中去，从而使血清中的Myo含量迅速升高。当急性心肌梗死发病前的几个小时时，那时的心电图检测不明显而其它标志物没有升高，此时Myo含量迅速升高，因此[49]Myo含量的检测对AMI具有非常重要意义。当人体的骨骼肌受损或者出现类似的症状时，人体血液中Myo的含量也会增加，[50]因此Myo对AMI的诊断的特异性不强，也就是说当检测出Myo为阳性时并不能准确的诊断病人有AMI的发病性。但当Myo的检测结果为阴性时，可以判断出检查者没有患AMI。根据临床检测结果可以得出Myo可以作为一种评估AMI预后和判断梗死面积的检测标志物。Myo在心肌细胞中的含量最高，且被广泛认为是有关心肌细胞[51]功能的重要的检测指标。Myo在人体中的半衰期短，当Myo检测含量重新突然增加，可以判断出检测者为梗死延展或是再梗死的情况发生。正常人体的Myo含量为10到80ng/mL。随着年纪，性别和种族的不同Myo的含量也是不同的，其中男性往往Myo的含量高于女性的Myo的含量，黑人的Myo含量高于白人Myo含量。因此不同的人群所参考的检测值不同，但一般检测限大于100ng/mL。由于人体在AMI发生后一到四小时Myo迅速升高，在4到12小时达到最大值，检测的时效性较高，若没有再梗死的发生则1到1.5天内可以自动恢复到正常范围。临床上AMI病人也显示出心肌Myo检测的含量的[52]变化，建立一种灵敏且快速的检测肌红蛋白含量的方法对AMI的检测具有重要意义。1.3.3Myo的检测方法检测肌红蛋白的方法有很多，常用的方法有电化学检测法、放射免疫法分析法、[53-55]ELISA检测法以及荧光定量检测法等。利用分光光度计检测方法可以测定纯度较高的Myo含量，但在复杂成分中难以特异的检测出Myo，因此目前逐步被化学发光试剂取代。虽然POCT和免疫比独法的检测灵敏度以及检测抗干扰性均不如化学发光法,但也可用于Myo的含量检测。POCT试剂检测方法相比于传统方法其操作简单，检测时间短且不需要大型的分析检测仪器，打破了只能在实验室进行固定检测的传统，[56]大大降低了检测成本。1.4荧光微球常用的荧光微球一般指它的表面标有荧光物质或者是微球内部染色如内部螯合有[57]稀土元素的微小颗粒。其直径在十微米以下，在十纳米以上。当微球受到外界环境5 所给的能量刺激时，会被激发出不同波长的荧光。通常外形为球形，故称为荧光微球。荧光微球的都是利用载体与荧光染料形成的，可以根据载体的不种类将其进行分类。[58]可以分为多无机-有机的荧光微球以及有机-有机荧光微球。通常使用的荧光微球由于呈圆球状体积小，比表面积大可以用来当作标记物。因为它可提供物质吸附以及化学反应的一个载体，具有很好的热稳定性以及分散性，可以能过不同的制备方法及制备条件来制备不同粒径，不同颜色以及不同激发光及发射光的荧光微球。随着荧光标记技术不断发展及深入的研究以及对功能高分子材料的深入的研究,荧光微球有着十分稳定的形态结构、实验的重复性好、微球粒径均一、发光效率高及[59]单分散性好等特点，且基本受环境变化的影响不大，有着很好的生物相容性跟等优点,这些因素使荧光微球在很多领域中有着十分重要的应用，特别是在生物及医药、液相芯片技术、临床检测、疾病的快速准确诊断以及基因分析等方面的应用更为主要[60]。荧光微球兼有无机物和有机物的性能，同时还能发射荧光，利用这些特点目前更多地被应用到生物大分子的标记以及细胞的标记研究，还可以利用荧光微球的特点来[61]跟踪其功能化过程固定蛋白质分子等。荧光微球能够利用激发光的作用来发射出不同波长的光子，通常微小的刺激就能产生比较强的荧光信号，大大提高了检测的灵敏性，同时也会降低成本。因此荧光微球在药物筛选以及免疫分析方面有着较好的应用[62]前景。1.5蛋白质的免疫层析技术近年来，蛋白质检测分析方法多种多样。传统的检测方法虽然促进了有关蛋白质检测分析科学研究的发展，但这些方法往往要使用大型检测仪器并需要专业的技术操作，检测成本高且时间长，不利于当今的快速检测的发展方向。由于POCT快速检测方法的应用，不需要大型的分析检测仪器，大大提降低了检测成本，打破了只能在实验室进行固定检测的传统，为一些疾病的诊断减少了检测时间，相比于传统方法其操[63]作简单，是目前最具有发展前景的一种蛋白质检测技术。1.5.1免疫层析技术上世纪免疫层析技术逐渐发展起来。层析的技术可使用乳胶颗粒、胶体金、量子点以及荧光微球及荧光素等作为标记物的一项免疫检测新技术，标记物的制备以及操[64]作十分简单，不用专业人员操作及特殊的仪器设备，实验准确快速的检测。按照抗原与抗体结合的方式不同分为两类：一类是常用于检测抗原大于2KDa的大分子物质，如致病细菌、大分子蛋白质等的双抗体夹心法，另一类就是适用于含有单一抗原表面[65]结合位点的的小分子抗原的检测与分析的竞争法。夹心法原理是以硝酸纤维素膜为载体，在NC膜上包被检测线和质控线的抗体，6 通过毛细层析作用，将加在膜一边的待测物样品慢慢向吸水纸一边迁移，与膜载体上对待检测物质的抗体发生特异性结合的反应，制作的层析标记物会与检测物质特异性结合一起层析，然后被相应的包被抗体捕获而被固定到硝酸纤维膜上的检测线T线上，游离的没有结合检测物的标记物则会越过T线，与C线上的抗体特异性结合，从而固定到NC膜上。当样品中有检测物质时或检测物质浓度达到检测限时，NC膜上会出现两条线，以NC膜上T线显色情况以及显色深浅来定性或定量分析被检测物质的含量。从而得到直观的实验现象实现定性或定量的分析。竞争法原理是以硝酸纤维素膜为载体，在NC膜上包被检测线的抗原标准品和质控线的抗体，通过毛细层析作用，将加在膜一边的待测物样品慢慢向吸水纸一边迁移，与膜载体上对待检测物质的抗原发生竞争的反应，制作的层析标记物会与检测物质特异性结合一起层析，然后与相应的包被抗原竞争，没有结合检测物质的标记复合物会被固定到硝酸纤维膜上的检测线T线上，游离的结合检测物的标记物则会越过T线，与C线上的抗体特异性结合，从而固定到NC膜上。当待测样品中没有检测物质或者检测物质浓度没有达到检测限时，NC膜上只会出现两条线。以NC膜上T线显色情况以及显色深浅来定性或半定量分析被检测物质的含量，从而得到直观的实验现象实现定性或半定量的分析。样品的前处理也非常简单，血清、组织液以及尿液等都可无前处理直接进行检测，且检测显色十分的明显，抗原与抗体的反应特异性好，灵敏度高，检测时间短，一般检测只要五到十分钟即可得到检测结果，能够满足快速检测的需求。常用的标记物为胶体金纳米颗粒，胶体金标记的免疫层析技术已成为荧光素、[66]酶以及放射标免疫检测技术中广泛使用的一种检测技术。图1.1免疫层析原是图1.5.2荧光免疫层析分析法荧光免疫层析是将光致发光与层析技术及各种检测方法等结和的一种检测技术。与传统的胶体金免疫层析技术相比较，有着自己更加独特、灵敏的优势。样品只要做非常简单的预处理或者不需要做前期处理，对于荧光量子点可以通过激发出颜色方便[67]现场检测及应用。通常会采用具有亲和性强和特异性高的抗体与荧光标记物进行偶联标记，检测时间很短，一般只需要五到十分钟就可以检测出结果，而且结合配套仪7 器使用可以方便快捷准确定量的进行检测。也可以在同一个试纸条上做出多种或多项目的同时联合检测试纸卡。荧光标记物可以通过自身修饰与多种大分子蛋白共价偶联，包括大分子的抗原或者抗体、毒素、酶等，这种共价偶联会一直保留蛋白质相关的生[68]物活性，因此荧光微球可以应用于药物检测、食品、临床检测等多种领域。荧光标记物也可与多种分析仪器相结合使用，如常规光镜、X射线衍射分析仪及扫描电镜等。荧光免疫层析试纸条或检测卡由吸水纸、NC膜、释放垫、样品垫分别按顺序粘在PVC板上通过裁剪可为试纸条。夹心法试纸条的检测原理是利用PVC板为固相，荧光标记物与抗体偶联形成复合物平铺在释放垫上，NC膜上的T线和C线上分别包被一定量的单克隆抗体和多抗，样品液利用层析作用，在固相载体NC膜上流动，随着样品液中的待测抗原与释放垫上针对其检测荧光标记物与抗体偶联的复合物发生特异性的免疫反应，当一起迁移同时到达T线时，从而与检测线上的包被的抗体结合形成夹心结构，使得免疫复合物富集或者截留在检测线上，在相应的荧光物质的激发光的作用下发出相应颜色的可见光，根据颜色可判断阴性或阳性进行定性分析。也可以结合荧光检测仪进行荧光数据的收集处理，据仪器检测和对照线颜色的不同色差对比不同浓度的待测物质，进行定量分析。具体方案可以在硝酸纤维素（NC）膜上同时包被两条或多条平行线，根据显色线条的颜色及仪器分析结果相结合，将待测物含量限定在一定范围内。当用的包被抗体蛋白量不同会导致检测出不同灵敏度，来将显色情况等进行观察，从而通过分析来确定被测物质的浓度；通过精确控制样品的加样量以及NC膜上单克隆抗体的包被量、显色所用的时间及仪器分析的数据来实现定量检测的目的。随着层析技术的不断进步发展，从单模阶段到复合膜阶段，标记的物质也有所不同，如乳胶颗粒、微球、量子点以及近几年出现的脂质体等。对免疫荧光检测技术灵敏度以及多元检测以及定量分析的逐渐提高和改善。进一步提高了检测的灵敏度，许多荧光免疫试纸条的敏感度可达0.01µg/L，与ELISA相比较，此方法要远远高出[69]ELISA的检测灵敏度。将成为荧光疫技术的主要的发展趋向。1.6本课题的研究意义及主要内容1.6.1本课题研究的意义心肌损伤已成为世界瞩目的健康问题，目前通过检测心肌损伤标记物的含量这样可以提高临床对疾病的预防、快速准确的诊断以及治愈率，从而大大减轻了病人的痛苦及AMI的死亡率。随着POCT技术的不断发展，心肌损伤标志物的快速准确的检测方法得到了有效的解决。cTnI、Myo和CK-MB利用免疫层析技术的准确快速的定量检测已在临床上得到广泛的应用。本课题通过运用荧光微球标记，制作侧向层析试纸条，建立荧光定量免疫层析检8 测方法，满足市场上快速定量检测要求。对AMI的早期诊断具有重要意义。1.6.2主要研究内容（1）原料筛选：利用酶联吸附反应间接法对候选抗体的效价进行筛选；（2）偶联条件优化：利用EDC-NHS活化剂法将荧光微球与单抗进行活化并偶联；（3）检测卡材料优化：选取合适的纤维树脂膜、玻璃纤维、聚酯纤维等材料，制作荧光免疫侧向层析试纸条；（4）检测卡性能优化：对上述层析检测卡的包被浓度，检测时间等进行确定；（5）方法学验证：通过与胶体金检测卡进行对比检验，检验荧光免疫试纸条的可靠性及准确性。9 第二章微球与抗体偶联2.1实验材料及仪器2.1.1实验仪器表2-1主要实验仪器仪器名称及型号生产厂家恒温干燥箱上海博迅实业有限公司紫外分光光度计日本岛津公司超声清洗仪昆山市超声仪器有限公司微量移液器10μlEppendorf有限公司微量移液器200μlEppendorf有限公司微量移液器1000μlEppendorf有限公司微量移液器八通道200μlEppendorf有限公司小型高速离心机Centrifuge5427REppendorf有限公司水浴HH-501A型苏州威尔实验室用品有限公司电子技术天平JM型ELECTRONLCSCALE旋涡混合器MX-F型SCILOGEX酶标仪BioTek2.1.2实验试剂实验主要试剂如下表所示：10 表2-2主要实验试剂试剂名称纯度生产公司氯化钠AR北京化工碳酸钠AR北京化工吐温-20AR北京化工TMBAR北京鼎国生物公司氢氧化钠AR北京化工厂去离子水—实验室制备浓硫酸98%AR国药集团二甲基亚砜AR国药集团TRITONX-100ARsigma公司MESAR上海源叶EDCAR上海源叶NHSARSigma公司2-(4-吗啉)乙磺酸ARAmresco（MES）荧光微球—Huge肌红蛋白—HyTestanti-Myo7004—Medixanti-Myo7005—Medix牛血清白蛋白（BSA）AR德国罗氏公司2.2实验用溶液及其配制10mMPBS（pH7.4）缓冲液：准确量取Na2HPO4•12H2O3.58g，KH2PO4•H2O0.2g，NaCl8.0g，KCl0.2g，加入800mL去离子水，用1MNaOH调pH至7.4，再定容到1L，用高压锅灭菌待用。Baselinebuffer：10mMPBS，0.02%tween-20，0.1%BSA，pH7.4Blockingbuffer：10mMPBS，0.05%tween-20，1.0%BSA，pH7.4ELISA检测所用溶液：（1）包被液：0.05M的碳酸盐缓冲液（pH9.6）Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，无离子水加至1000ml，4℃保存，两周内11 使用。（2）洗涤液：0.05%PBS-T溶液（pH7.2）Na2HPO4•12H2O3.58g，KH2PO4•H2O0.2g，NaCl8.0g，KCl0.2g，0.5mlTween，无离子水加至900ml，用1MNaOH调pH至7.2，并定容到1000ml。（3）稀释液：同洗涤液。（4）TMB储液：50mgTMB，用5mlDMSO溶解，分装，4℃避光保存。（5）底物缓冲液：缓冲溶液的配制（pH=5.0）0.2M磷酸盐溶液：7.16gNa2HPO4•12H2O，加无离子水至1000ml。在用时用量筒称取48.6mL的0.1M柠檬酸液并称取51.4mL的0.2M磷酸盐液进行混合备用。（6）TMB应用液：10ml底物缓冲液+100μlTMB储液+0.8μl30%H2O2，现用现配。（7）终止液：2mmol/LH2SO4浓硫酸22.2ml，无离子水加至200ml。蛋白含量测定所用溶液标准BSA蛋白溶液：1毫克牛血清白蛋白，溶于1mL水中，配成1000μg/ml标准液。工作液A：称取BCA10g，Na2CO3H2O20g，Na2C4H4O（62H2O）1.6g，NaOH4g，NaHCO39.5g加入1L去离子水，用NaOH或NaHCO3调节pH值至11.25。工作液B：称取CuSO4·5H2O2g，加入去离子水50ml。2.3实验方法2.3.1抗原及抗体浓度测定配制BCA系列工作试剂，利用其蛋白质会在碱性条件下把二价的铜离子还原为+一价的铜离子，通常一个Cu会螯合两个BCA的分子，所以会把原来的绿色试剂变成明显的紫色，反应完成后可用酶标仪进行检测，溶液在562nm处有最大吸收值，其吸光值是与蛋白质的浓度成正比关系。利用这一原理绘制标准曲线，未知蛋白检测值带入到标准曲线即可计算出未知蛋白的浓度。将BSA配制成1mg/ml标准品，依次稀释到加入0、0.5、1、2.5、5、10、20、40μg/ml的BSA标准品。检测562nm处OD值，绘制标准曲线。具体方法如下：（1）吸取150微升不同浓度的BSA溶液及未知浓度的样品分别至96孔板中。（2）将150微升的配好的BCA分别液滴加到每个孔中，轻轻振荡并充分混匀。盖上微孔板并在37℃孵育2小时。12 （3）拿出当微孔板冷却到室温时，在波长为562nm处检测并记录对应的OD值。（4）将所有样品溶液在562nm处测得的OD值减去空白对照的OD值，计算结果。（5）用每个BSA标准品在562纳米处的平均读数和其相对应浓度（μg/ml）绘制标准曲线。然后再用该曲线进行判断每个待样品的浓度。2.3.2抗体效价测定抗体蛋白的基本效价通常利用的是ELISA的间接法来进行测定。间接ELISA法程序如下：（1）将抗原用包被液稀释到2μg/mL的量，做成12孔的酶标条每个梯度各两条，100μL/孔，置37℃衡温箱中孵育0.5h。（2）直接弃掉上清，使用洗涤液各清洗三遍，每个孔加入200μl，每次清洗三分钟；牛血清白蛋白按3%比例配制，每孔加样200微升，恒温37℃封闭1个小时。（3）直接弃掉上清，使用洗涤液各清洗三遍，每个孔加入200μl，每次清洗3分钟；用抗体按1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000的比例稀释，并纵向分别加入酶标板并且每个梯度的样品加两列条，每孔加入100μL，恒温37℃孵育0.5小时。（4）直接弃掉上清，使用洗涤液各清洗三遍，每个孔加入200μl洗涤液，每次清洗三分钟；用洗涤液按1:3000倍将经HRP标记过的山羊抗小鼠二抗进行加样，将100μl二抗加到孔中，37度温箱反应1个小时。（5）弃掉上清，用洗涤液洗涤3遍，每孔200μl，每次静止3分钟，再用蒸馏水洗涤2遍，每孔200μl，3min/次；再加入TMB应用液，每孔加100μl，在25℃避光反应5～20min左右；最后，再分别加入五十微升的终止液，中止5分钟，并使用酶标仪来测定双波长的OD值，波长分别为450nm与630nm，以阳性孔中的OD值约为1时，且P/N≥2.0的抗体的最大的稀释倍数作为抗原及被测抗体的最佳使用效价。2.3.3微球与抗体偶联条件优化利用EDC/NHS将羧基修饰的荧光微球与抗体产生共价键偶联。首先用EDC跟NHS活化剂将荧光微球表面的羧基进行活化，活化后的荧光微球与蛋白质表面氨基进行共价连接，使蛋白与荧光微球结合形成荧光标记物。由于所选用的Myo抗体与CK-MB抗体同属小鼠IgG1型，其分子量大小与结构相类似，故在荧光微球与抗体偶联条件中选用Myo单克隆抗体作为优化条件摸索，所以通过摸索一种单克隆抗体偶联条件即可，CK-MB抗体偶联条件与Myo单克隆抗体偶联条件相同。方法如下：（1）清洗：取出微球10μl加上100μl的MES（pH6.0）缓冲液，13000rpm离心25分钟，反复清洗2次，弃上清，加入100μlMES（pH6.0）缓冲液，放入超声清洗仪超声15min使其均匀分散。（2）活化：配制EDC与NHS溶液，根据文献资料可知当EDC:NHS为1:1时活13 化比例最佳，分别取出10μl的0.001摩尔每升的EDC及0.001摩尔每升NHS加入到清洗后的微球溶液中进行活化1.5小时。（3）清洗：取出后13000rpm离心25分钟，反复清洗2次，最后加入100微升的PB缓冲液，放入超声清洗仪超声15min使其均匀分散。（4）偶联：按微球与抗体比为10:1到5:1比例的加入抗体蛋白，进行偶联。（5）清洗：13000rpm离心25分钟，留取上清检测偶联率，反复清洗2次。加入重悬液进行重悬超声超声15min使其均匀分散放入4℃备用。测定偶联效率的方法是通过检测偶联前和偶联后的抗体浓度变化进行偶联效率的计算，方法如下：（1）利用紫外分光光度计进行检测，波长（280nm）。空白的偶联缓冲液进行调零。测量偶联前的IgG溶液吸光值，记为OD0(可根据实际情况进行稀释)。（2）将偶联后的抗体与微球复合物进行离心，测量上清的OD值，记为OD1。再将复合物利用缓冲液PB进行清洗，离心后测上清OD值，记为OD2。（3）实际偶联率的计算，可用下列公式2.1表示：OD0−()OD1+OD2偶联效率=×100%（2.1）OD0设计实验如表2-3，按下表所示条件同时做9组实验，进行蛋白偶联最佳条件的摸索。表2-3不同条件偶联率测定抗体终浓度编号温度（℃）时间(小时)pH（mg/ml）132.25200.56232.252517332.25301.58464.52018564.5251.56664.5300.57796.75201.57896.75250.58996.7530162.3.4荧光微球与抗体偶联表征利用扫描电子显微镜对市售荧光微分析鉴定其粒径、形状及分散度。首先进行样品的前处理。将购买的荧光微球进行清洗，分别取两个1.5毫升的EP管，加入10μl荧光微球加入到100μl的MES（pH6.0）缓冲液中，13000转离心时间为25min，反复清洗2次。用MES（pH6.0）缓冲液中重悬超声15分钟。留一管放入4℃备用。另14 一管加入相同比例的0.001mol/mLEDC与NHS各10μl，室温25摄氏度活化1.5小时。13000转离心25分钟反复清洗两次。用PB缓冲溶液进行重悬，超声15min，加入32.25μg/ml的IgG，室温偶联1小时。13000转离心时间为25分钟，吸出液体，用PB缓冲溶液进行重悬，超声15分钟，反复清洗2次。将两管样品用扫描电子显微镜检测分析。2.4结果2.4.1蛋白浓度测定结果反应完成后可用酶标仪进行检测，溶液在562nm处有最大OD值，其吸光值是与蛋白质的浓度成正比关系。测得0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的BSA标准品在562nm处OD值，结果如下表2-4所示，2根据表格绘制标准曲线图2-1。其中R>0.99。表2-4蛋白浓度检测结果BSA浓度μg/ml00.512.55102040OD值0.140.150.1530.1650.1990.2920.4780.8040.9BCA标准曲线0.80.70.6值0.5OD0.40.30.2y=0.0169x+0.1293R²=0.99830.1001020304050BSA浓度μg/ml图2.1BCA标准曲线Myo、CK-MB抗原及抗体分别稀释1000倍进行检测，在96孔酶标板中分别加入150μl待测样品，加入150μlBCA工作液，在562nm处测得OD值如下表：表2-5抗原抗体检测数据Anti-Myo7Anti-Myo7Anti-CK-MAnti-CK-M名称MyoCK-MB004005B7501B7502OD值0.2030.240.4440.510.2280.24315 根据标准曲线y=0.01683x+0.13141并乘以稀释倍数计算出蛋白浓度。Anti-Myo7004浓度为6.45mg/ml，Anti-Myo7005浓度为4.94mg/ml，Myo浓度为4.25mg/ml，Anti-CK-MB7501浓度为5.74mg/ml，Anti-CK-MB7502浓度为6.63mg/ml，CK-MB浓度为22.49mg/ml。2.4.2抗体效价利用包被抗原浓度为2μg/mL，将每个酶标孔中加入一百微升，包被时间为30分钟，其后依次将抗体预先稀释到1mg/ml，再将其依次按照1:1000、1:2000、1:4000等比稀释至1:128000，再分别加100μl至包被好抗原到酶标孔中，30min孵育后，再分别加酶标二抗，孵育半小时后再加入TMB液进行显色反应，通过460纳米波长的OD值检测，Myo两种抗体及CK-MB两种抗体测得OD值如下表所示：表2-6Myo抗体的效价稀释度1:10001:20001:40001:80001:160001:320001:640001:128000空白anti-70040.8230.830.7060.5520.3630.2480.1630.1120.055anti-70050.9290.7970.6790.5220.3640.240.1740.1320.0541Anti-Myo7004效价0.90.80.70.6值0.5OD0.40.3y=-0.1176x+1.0036R²=0.96810.20.100123456789稀释倍数序号图2.2anti-Myo7004效价分析16 1Anti-Myo7005效价0.90.80.70.6值0.5OD0.4y=-0.1211x+1.02440.3R²=0.97820.20.100123456789稀释倍数序号图2.3anti-Myo7005效价分析最终检测结果表明抗体效价anti-Myo7005抗体的效价高于anti-Myo7004抗体的效价，即亲和性7005>7004；由于包被抗体为固定相，所以选择亲和性更好的抗体作为包被用于捕获抗原，则我们将anti-Myo7005作为包被抗体，用于捕获抗原；将anti-Myo7004作为标记抗体，用于提供检测信号。表2-7CK-MB抗体的效价稀释度1:10001:20001:40001:80001:160001:320001:640001:128000空白孔anti-75011.31.10.980.9220.8720.7860.6960.5380.054anti-75020.790.6560.4950.4180.3530.2690.1620.1220.0561.4Anti-CK-MB7501效价1.210.8值OD0.6y=-0.0951x+1.32710.4R²=0.96520.200123456789稀释倍数序号17 图2.4anti-CK-MB7501效价分析0.9Anti-CK-MB7502效价0.80.70.60.5值OD0.40.3y=-0.0939x+0.83080.2R²=0.97550.100123456789稀释倍数序号图2.5anti-CK-MB7502效价分析最终检测结果表明抗体效价anti-CK-MB7501抗体的效价高于anti-CK-MB7502抗体的效价，即亲和性7501>7502。由于包被抗体为固定相，所以选择亲和性更好的抗体作为包被用于捕获抗原，则我们将anti-CK-MB7501作为包被抗体，用于捕获抗原；将anti-CK-MB7502作为标记抗体，用于提供检测信号。2.4.3偶联效率的测定通过对9组实验结果的检测来进行偶联条件优化，如下表2-8所示最终确定最佳的偶联条件为pH为7.0的缓冲溶液中，抗体终浓度为32.25μg/ml，温度为25℃，反应1h时为最佳偶联条件。表2-8偶联效率结果序号OD0OD1OD2偶联效率%10.1650.020.00485.220.1650.0110.00391.730.1650.0290.00579.340.3220.0770.00475.450.3220.0390.00187.560.3220.0290.00290.370.6760.0580.00790.280.6760.0970.04978.390.6760.0610.00690.218 2.4.4荧光微与抗体偶联表征通过对市售荧光微球扫描电子显微镜分析鉴定其粒径、形状及分散均匀度。如下图2.6所示，随机选取100个粒子，经过测量计算得到其平均直径为145nm，标准偏差为1.00nm，变异系数为5.78%，颗粒分散均匀呈圆球状，无聚沉。通过扫描电子显微镜进行荧光微球与抗体偶联后标记物的表征。如图2.7可以看出微球与抗体偶联后粒径明显增大，证明偶联成功并且分散度好，无聚沉现像。图2.6荧光微球表征图2.7荧光微球与抗体偶联表征19 2.5小结本章实验通过BCA法测得蛋白含量分别为Anti-Myo7004浓度为6.45mg/ml，Anti-Myo7005浓度为4.94mg/ml，Myo浓度为4.25mg/ml，Anti-CK-MB7501浓度为5.74mg/ml，Anti-CK-MB7502浓度为6.63mg/ml，CK-MB浓度为22.49mg/ml。并通过ELISA的方法成功的筛选出最佳包被抗体，由于包被抗体是固定相，所以必须选用效价高的抗体作为包被抗体用来捕获抗原，而标记抗体是流动相，因此效价略低的作为标记抗体，用于检测荧光信号。通过抗体效价的分析表明明抗体效价anti-Myo7005抗体的效价高于anti-Myo7004抗体的效价，即亲和性7005>7004。则将anti-Myo7005作为包被抗体，用于捕获抗原；将anti-Myo7004作为标记抗体，用于提供检测信号。anti-CK-MB7501抗体的效价高于anti-CK-MB7502抗体的效价，即亲和性7501>7502。则将anti-CK-MB7501作为包被抗体，用于捕获抗原；将anti-CK-MB7502作为标记抗体，用于提供检测信号。本章进行了荧光微球与抗体偶联率的优化实验，正交实验对偶联的条件进行优化，最终确定最佳的偶联条件为pH为7.0的缓冲溶液中，抗体终浓度为32.25μg/mL，温度为25℃，反应1h时条件最佳。实验还对购买的荧光微球进行扫描电子显微镜的表征鉴定及分析，荧光微球的平均粒径为145nm，呈圆球状，颗粒分散均匀，无聚沉。通过微球与抗体偶联后的标记物的描电子显微镜进行表征实验分析。可以看出微球与抗体偶联后粒径明显增大，证明偶联成功并且分散度好，无聚沉现像。为后继实验奠定了基础。20 第三章材料筛选及处理液优化3.1实验仪器及试剂3.1.1主要试剂表3-1主要试剂材料名称生产公司牛血清蛋白(BSA)罗氏公司whatmanAE99NC膜whatmanSatoriusCNl40NC膜SatoriusMilliporeNC膜135MilliporePVC板上海杰一生物有限公司玻璃聚酯纤维膜上海杰一生物有限公司蔗糖国药集团聚乙二醇20000（PEG20000）国药集团海藻糖国药集团氢氧化钠国药集团盐酸国药集团TritonX-100sigma公司2-(4-吗啉)乙磺酸（MES）AmrescoEDC上海源叶有限公司NHS上海源叶有限公司羊抗鼠多抗IgG上海生工肌红蛋白HyTestanti-Myo7004Medixanti-Myo7005Medix肌酸激酶同工酶Biospacificanti-CKMB7501Medixanti-CKMB7502Medix3.1.2主要仪器实验主要仪器如下表3-2所示：21 表3-2主要仪器实验仪器生产公司三维平面点膜仪上海金标小型高速离心机Centrifuge5427R德国Eppendorf公司电子技术天平JM型ELECTRONLCSCALE旋涡混合器MX-F型SCILOGEX微波炉G80F23DCSL-F7(R0)格兰仕荧光侧向层析检测仪上海捷宁真空冻干机宁波新芝生物科技有限公司3.2试剂卡材料的筛选免疫荧光层析试检测卡一般包括样品垫、释放垫、层析垫及吸水纸四大组成部分，其中所需要的材质包括NC膜、玻璃纤维素、聚酯纤维素、无纺布等。吸水垫的作用是提供吸水作用力，促使样液由样品垫向吸水垫层析，是唯一不需要预处理的部分。层析垫由NC膜构成，由于具有较高的亲和性可将一定量的蛋白吸附到其表面，所以膜上可包被有多抗（C线）和单克隆抗体（T线）。释放垫可以提供稳定的环境来保持荧光微球与标记蛋白复合物的活性，在层析过程中促使荧光微球与抗体蛋白复合物迅速复溶并在层析时与液体一同流动。样品垫吸收样品液体，用以改变加入液体的物理性质，也可使维持层析系统的相对稳定，避免检测样品不同造成检测误差。因此，在制作免疫层析试剂卡前需根据检测物质及标记物的不同进行试剂卡材料的筛选。3.2.1NC膜的筛选从millipore，SARTORIUS和whatman三个厂家中筛选进口硝酸纤维素膜作为层析垫材料。根据4cm水的层析时间作为筛选依据。根据层析速度，孔径通过的分子大小，及有无背衬进行筛选。3.2.2释放垫的筛选根据释放垫上所包被的微球标记抗体在层析后残留量作为筛选依据。从杰一生物、金标生物、Millipore、Ahlstrom筛选进口、国产玻纤膜、聚酯纤维素膜来作为释放垫材料。将依次将释放垫切为5mm×4mm小块，每块用移液器滴入5μl制备好的荧光微球与抗体标记物溶液，-80℃冷冻5min，于真空冻干机中冻干1h，贴于PVC板上组装成试纸条，根据结合垫上荧光微球与抗体复合物的释放是否完全来判定释放垫的选择。3.2.3样品垫的筛选金标生物所提供6种玻璃纤维素膜中筛选出一种材料作为样品垫材料。依次将样品垫切为15mm×4mm小条，贴于PVC板上，用移液器在样品垫一端滴入100μl小22 牛血清开始计时，根据小牛血清从样品垫一端到浸泡完整个样品垫时间判定样品垫选择。3.3释放垫处理优化由于所选用的Ahlstrom公司6613聚酯纤维素膜释放垫为疏水材料，在制作释放垫过程中为了更多的吸附荧光微球与抗体偶联标记物，也为了在检测过程中更容易释放的微球与抗体偶联复合物。故将对释放垫进行预处理，降低检测过程中释放微球与抗体偶联复合物残留量，提高检测灵敏度。由于海澡糖可以提高样本的热稳定性；Tween-20是一种离子型的表面活性剂，有利于抗体与其实物质非特异性结合的分离；PEG-20000起到大分子骨架支撑作用。因此本课题根据经验设计9种释放垫的预处理液，配方如下表3-3所示，将四种物质按下表所示加样比例加入到10mlPB（pH7.4）缓冲溶液中，充分振荡混匀。剪取4cm×4cm的6613聚酯纤维素膜释放垫分别在1~9组溶液中浸泡，放入小盒中4℃冰箱下过夜处理，第二天从冰箱取出后在37摄氏度烘箱中烘干120min，再加入荧光微球与抗体的复合物，放入-80℃冰箱冷冻8min，用真空冻干机进行冻干，再将其用于试纸条的组装，通过观察冻干后复合标记物的分散均匀度从而选取最好的释放垫处理液组成成分。表3-3释放垫处理配方组别Tween-20(%)海澡糖(%)PEG-20000(%)BSA(%)10.10.500.520.110.2130.11.50.41.540.20.50.21.550.210.40.560.21.50170.40.50.4180.4101.590.41.50.20.53.4稀释液（重悬液）优化荧光微球与抗体进行偶联后的标记物，经过清洗离心去上清最后得到偶联复合物的沉淀，利用重悬液进行重悬，重悬液中含有牛血清白蛋白及酪蛋白钠，可以对没有偶联的荧光微球起到封闭的作用，但如果牛血清白蛋白及酪蛋白钠过多的话则会减慢23 层析速率，易在NC膜上出现滞留现象。蔗糖有很好的保水功能，一定浓度的蔗糖可以使扩散速度减慢，也能防止潜水现象，使NC膜上的出线位置更加的准确，也可防止表面活性剂在层析过程中的流失。在进行烘干时，蔗糖会在释放垫表面形成光滑的面从而在干燥过程中有效的解决了抗体牢固结合于释放垫上不易释放的问题。Tritonx-100是一种非离子型表面活性剂能溶解脂质，可用于稀释血清。根据经验设计9组重悬液配方如下表3-4所示，同时进行9组抗体偶联平行实验，当抗体与荧光微球偶联后，清洗去上清，分别加入1~9组重悬液重悬。组装试剂条，通过加入标准品，观察血清释放垫的释放程度验证处理后的效果并对比层析效果来选取最佳的配方。表3-4稀释液配方组别蔗糖(%)Tritonx-100(%)BSA(%)酪蛋白钠(%)1100.50.5211113131.51.543011.55311.50.56330.517501.518510.51.595310.53.5样品垫处理由于本课题检测样本为血清样本，根据相关文献的报道和经验，血清样本中可能有杂蛋白干扰抗原抗体的结合，故将在血清样本滴入样品垫结合后由样品垫上处理液预先对血清样本进行处理，降低检测背景信号，试纸条的检测灵敏度与特异性将会比未经处理的样品垫试纸条的层析效果更加明显升高。本课题根据经验设计9组样品垫的处理液，处理液的配方如下表3-5所示，并对比层析效果来选取好的配方，栽取5cm×5cm的做优选出来的样品垫分别在1~9组溶液中浸泡，四摄氏度冰箱下浸泡十二小时处理，处理后从冰箱取出，37摄氏度烘箱中恒温烘干两小时，再将其用于试纸条的组装，通过加入标准品标血清释放垫的释放程度验证处理后的效果。24 表3-5样品垫的处理液配方组别Tween-20(%)蔗糖(%)PEG-20000(%)BSA(%)100.500.52010.11301.50.21.540.20.50.11.550.210.20.560.21.50170.40.50.2180.4101.590.41.50.10.53.6结果3.6.1试剂卡材料的筛选吸水垫在整个层析的最末端。吸水纸的质量会影响层析效果，好的吸水纸能够使层析顺利的进行。一般选择各种厚度的滤纸材料，而一般层析会选择质量好的纯棉滤纸，由于它的吸水性好，稳定的吸水速率多种厚度可选择，根据10分钟层析结束后吸水纸中荧光微球距离吸水纸尾端距离作为评价标准，最终确定杰一生物公司H5072高密度吸水滤纸作为吸水纸。从millipore，SARTORIUS和whatman三个厂家中筛选进口硝酸纤维素膜作为层析垫材料。根据4cm水的层析时间作为筛选依据。如下表3-6所示，最终确定SARTORIUS公司CN140型号的NC膜作为层析垫材料。表3-6NC膜的筛选型号层析速度分子大小聚脂背衬millipore135较快8μm是whatmanAE99慢8μm否SARTOURIUS140适中8μm是根据释放垫上所包被的微球标记抗体在层析后残留量作为筛选依据，如下图3.1实验结果所示，最终确定Ahlstrom公司6613聚酯纤维素膜作为释放垫材质。25 图3.1释放垫材质的筛选样品垫根据其亲水性与疏水性作为评价标准（亲水记为“+”，疏水记为“-”），亲水性太好，样品容易流动过快，使释放垫反应时间过短，使假阴性增加，但如果疏水性过强则会使样液不流动，增加了反应时间，甚至出现样液不流动现象。由实验后下表分析可以确定型号为GLB02玻璃纤维膜亲水性适中，最终作为样品垫。表3-7样品垫的筛选样品编号亲水性“+/-”GL0194++RB65++MA0270-GLB02+SB08-RB45--3.6.2释放垫处理优化在制作释放垫过程中为了更多的吸附荧光微球与抗体偶联复合物，也为了在检测过程中更容易的释放微球与抗体偶联复合物。通过9组实验，用真空冻干机进行冻干，再将其用于试纸条的组装，通过观察释放垫的亲水性以及冻干后复合标记物的分散均匀度等，结果如下表所示，从而选取最好的释放垫处理液组成成分，即pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液加入0.4%的Tween-20，1.5%的海澡糖，0.2%的PEG-20000，0.5%的BSA。将释放垫放入处理液中浸泡30min。真空冻干2小时。26 表3-8释放垫处理后效果序号亲水性（-/+）冻干后复合标记物的分散均匀度1+不均匀，边缘效应严重，无粉末析出2+较均匀，有边缘效应，无粉末析出3+均匀，无边缘效应，有粉末析出4++十分均匀，有边缘效应，有粉末析出5++均匀，无边缘效应，无粉末析出6++不均匀，边缘效应严重，无粉末析出7+++均匀，无边缘效应，有粉末析出8+++不均匀，边缘效应严重，有粉末析出9+++十分均匀，无边缘效应，无粉末析出3.6.3稀释液（重悬液）优化当抗体与荧光微球偶联后，清洗去上清，分别加入1~9组重悬液重悬，组装试剂条，通过加入标准品标血清释放垫的释放程度验证处理后的效果并对比层析效果来选取好的配方。实验结果如下图所示。从图中可以看出，1、2、3、4、7、8、9组有明显的背景值，且还会发生标记物的堵塞。而5、6两组背景相对干净，由图可看出6组背景更为干净。所以最终选择pH为7.2的PB缓冲溶液加入3%的蔗糖，3%的Tritonx-100，0.5%的BSA，1%酪蛋白钠配制重悬液。但是6组还有一些背景，可以通过样品垫的处理还解决此问题。图3.2重悬液的处理结果27 3.6.4样品垫处理由于检测血清样本中有可能杂蛋白干扰抗原抗体的结合，故将在血清样本滴入样品垫结合后由样品垫上处理液预先对血清样本进行处理，可降低检测背景信号。由下图实验结果中分析可知，第5组背景清晰，有效的低检测背景信号。即样品垫可提前放入处理液中浸泡处理，处理液最佳配方为pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液里加入0.2%的Tween-20，1%的蔗糖，0.2%的PEG-20000及0.5%的BSA。将样品垫放入处理液中浸泡30min，真空冻干2小时。图3.3样品垫处理结果3.7本章小结本章通过一系列的选择，最终确定以GLB02型号作为试纸条的样品垫，SatoriusCNl40硝酸纤维素膜作为试纸条的NC膜，以最终确定Ahlstrom公司6613聚酯纤维素膜作为释放垫材质。在制作释放垫过程中为了更多的吸附荧光微球与抗体偶联复合物，也为了在检测过程中更容易的释放微球与抗体偶联复合物，由于海澡糖可以提高样本的热稳定性；Tween-20是一种离子型的表面活性剂，有利于抗体与其实物质非特异性结合的分离；PEG-20000起到大分子骨架支撑作用，从而选取最好的释放垫处理液组成成分，即pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液加入0.4%的Tween-20，1.5%的海澡糖，0.2%的PEG-20000，0.5%的BSA。将释放垫放入处理液中浸泡30min。重悬液对荧光微球与抗体复合物的稀释十分重要，通过优化最终选择pH为7.2的PB缓冲溶液加入3%的蔗糖，3%的Tritonx-100，0.5%的BSA，1%酪蛋白钠配制重悬液。样品垫可提前放入处理液中浸泡处理，处理液最佳配方为pH为7.2的磷酸盐28 缓冲溶液含有0.2%的Tween-20，1%的蔗糖，0.2%的PEG-20000及0.5%的BSA。将样品垫放入处理液中浸泡30min，真空冻干2小时。由样品垫上处理液预先对血清样本进行处理，降低检测背景信号，试纸条的检测灵敏度与特异性将会比未经处理的样品垫试纸条的层析效果更加的明显。29 第四章荧光免疫层析试纸条的制备及优化制作荧光免疫层析试纸条并进行条件的优化，利用2.3.3的方法将抗体与荧光微球进行偶联，并通过荧光定量检测仪在激发波长为365nm处进行检测，荧光微球的发射波长为628nm，通过荧光强度计算分析来进行定量检测目的蛋白的含量。4.1实验仪器及材料4.1.1实验材料及试剂表4-1实验材料及试剂材料名称生产公司牛血清蛋白(BSA)罗氏公司SatoriusCNl40NC膜上海捷宁有限公司PVC板上海捷宁有限公司羊抗鼠多抗IgG上海生工肌红蛋白杭州启泰生物有限公司anti-Myo7004杭州启泰生物有限公司anti-Myo7005杭州启泰生物有限公司肌酸激酶同工酶Hytest公司anti-CKMB7501北京博雅翔达科贸有限公司anti-CKMB7502北京博雅翔达科贸有限公司4.1.2主要实验仪器表4-2主要实验仪器实验仪器生产公司三维平面点膜仪上海金标小型高速离心机Centrifuge5427R德国Eppendorf公司超声清洗仪ELECTRONLCSCALE旋涡混合器MX-F型SCILOGEX恒温干燥箱格兰仕荧光侧向层析检测仪上海捷宁4.2Myo试纸条的构建及优化4.2.1Myo试纸条T线浓度的确定将Anti-myo7005抗体稀释成0.156mg/ml、0.313mg/ml、0.625mg/ml、1.25mg/ml、30 2.5mg/ml共5个浓度。T线设定的喷出量为每厘米1.0μl喷到硝酸纤维素膜上，C线上多抗按设定的喷出量每厘米1.0μl，浓度为1.0mg/mL，37℃恒温培养箱放置2h；将喷涂并烘干的NC膜粘贴到PVC板上组成检测卡，每组各制作10个检测卡，各加入Myo抗原标准品200ng，用0.01摩尔每升的pH7.4的PBS稀释抗原滴加样品，通过荧光层析检测仪来检测荧光强度并求出算数平均值。利用检测仪来检测T线荧光强度并结合T线的显色情况来确定Myo单克隆抗体的包被浓度。4.2.2Myo试纸条C线浓度的确定根据实验确定了T线包被浓度，现将每毫升中含0.5mg、1mg、1.5mg，2mg共四个浓度的羊抗鼠IgG，按为每厘米1.0μl常规喷量在NC膜上划线，将其包被到NC膜上作为C线，组装成试纸条后，用10mmol/L的PBSpH为7.4稀释抗原后再加入样品，利用荧光检测仪器来检测，通过对检测结果分析来选择C线荧光强度适中且显色比T线略浅或与检测线颜色差不多的试纸条的C线的包被抗体浓度作为质控线的工作浓度。4.2.3Myo试纸条检测特异性研究选取已知浓度心肌标志物CK-MB、cTnI、CRP的标准品溶液，来验证免疫层析试纸条特异性，分别添加CK-MB、cTnI、CRP标准品，用PBS将样品稀释到终浓度为1、10、50、100、200、400ng/ml。以每个样品加样100μl，每个浓度样品检测5组，将样品加入到检测卡进行检测并统计结果。判断试纸条的检测特异性。4.2.4Myo检测时间的确定将Anti-Myo7005抗体与羊抗小鼠多抗喷到NC膜上分别包被到T线和C线上，质量浓度均分别为1.25mg/ml与1.5mg/ml，喷量均为1.0μl/cm，37℃恒温干燥2小时。贴好样品垫、释放垫、NC膜以及吸水纸后将其切成4mm宽的条片组装试剂卡。将制备好的检测卡放入加了干燥剂的密封铝的袋中保存备用。取200ng/mL的Myo标准品溶液100μl加到检测卡中，待样品溶液将NC膜完全的润浸时开始计时，每隔2min用荧光检仪读1次数据，直到30分钟后。通过整理数据计算T/C值，当T/C值稳定时反应达到动态平衡，即可确定检测时间。4.2.5Myo灵敏度的确定及检测标准曲线的建立按最佳包被量分别包被到T线和C线，按喷量为每厘米1.0微升的量划到NC膜上。荧光微球与抗体偶联免疫复合物添加到释放垫上，制作试纸条，并组装检测卡。将Myo标准品配制成0ng/ml，12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml的浓度，加样量为100μl加样，在荧光读数仪上检测，每个样品使用5条试纸条来检测，通过荧光免疫层析仪检测读数，求出算数平均值。并确定其灵敏性与检测线性范围，制作标准曲线。加样10分钟后比较各加样浓度下的检测卡的显色情况及数据处理。取T线刚刚显色的浓度为我们的检测限。31 4.2.6Myo试纸条重复性研究在同样的条件下，一批制作30个试纸条，分别做3批，加入Myo标准品浓度为每毫升100.0、400.0、800.0ng进行检测，每个浓度样品重复检测三次，检测结果计算出检测CV值大小。选用不同批次的检测卡中，进行相同条件的检测计算回收率，同时计算其批内差和批间差对检测卡的重复性和稳定性进行评价。4.2.7Myo检测方法学比较及相关性测定通过对市售的胶体金试剂卡的检测方法进行比较，通过利用检出抗原浓度做对比。同时将Myo标准品按浓度为12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml加入到胶体金检测卡及Myo免疫层析检测卡检测，每个浓度做3组重复实验，判断其检测相关性。4.2.8Myo免疫层析试纸条稳定性的研究研究根据阿伦尼乌斯经验式，37℃加速热稳定性考察模拟试剂的稳定性，37℃三十天相当于室温半年时间，同时对于37℃稳定性的研究也可反映出试纸条在运输过程中环境不确定因素的影响。将Myo免疫层析试纸条在37摄氏度下密封放置一个月，使用仪器来检测并研究试纸条的T线与C线的显色情况以及灵敏度在0、7、15、23、30天5个时间点来考察试纸条的稳定性性。4.3CK-MB试剂盒的构建及优化4.3.1CK-MB试纸条T线浓度的确定将Anti-CK-MB7501稀释成0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml、2.0mg/ml。共5个浓度。T线设定的喷出量为每厘米1.0μl喷到硝酸纤维素膜上，C线上多抗按设定的喷出量每厘米1.0μl，浓度为1.0mg/mL，37℃恒温培养箱放置2h；将喷涂并烘干的NC膜组装成试纸条，每组各制作10个检测卡，各加入CK-MB抗原标准品100ng，用0.01mol/LpH7.4的PBS稀释抗原滴加样品，通过荧光层析检测仪来检测荧光强度并求出算数平均值。利用检测仪来检测T线荧光强度并结合T线的显色情况来确定CK-MB单克隆抗体的包被浓度。4.3.2CK-MB试纸条C线浓度的确定根据实验确定了T线包被浓度，现将每毫升中含0.5、1、1.5、2mg的共四个浓度的羊抗鼠IgG。按为每厘米1.0μl常规喷量在NC膜上划线，将其包被到NC膜上作为C线，组装成试纸条后，用10mmol/L的PBSpH为7.4稀释抗原后再加入样品，利用荧光检测仪器来检测，通过对检测结果分析来选择C线荧光强度适中且显色比T线略浅或与检测线颜色差不多的试纸条的C线的包被抗体浓度作为质控线的工作浓度。4.3.3CK-MB试纸条特异性研究肌酸激酶同工酶的同源物质是CK-MM与CK-BB。当在正常待测样品中添加相同32 浓度的CK-MM和CK-BB标准品，制备用PBS将样品稀释到终浓度为每毫升50、200、400、800、1000、1200ng加标样品各5份，通过对正常检测样品、添加了CK-MM的检测样品以及添加了CK-BB的待测样品的检测，分别取0.1ml加入到试纸条的样品垫处进行检测并统计结果。4.3.4CK-MB检测时间的确定将Anti-CK-MB7501抗体与羊抗小鼠多抗喷到NC膜上分别包被到T线和C线上，质量浓度均分别为7501为1.6mg/ml与2.0mg/ml，喷量均为1.0μl/cm，37℃恒温干燥2小时。贴好样品垫、释放垫、NC膜以及吸水纸后将其切成4mm宽的条片组装试剂卡。将制备好的检测卡放入加了干燥剂的密封铝的袋中保存备用。取100ng/mL的CK-MB标准品溶100μl加到检测卡中，待样品溶液将NC膜完全的润浸时开始计时，每隔2min用荧光检仪读1次数据，直到30分钟后。通过整理数据计算T/C值，当T/C值稳定时反应达到动态平衡，即可确定检测时间。4.3.5CK-MB检测标准曲线的建立按最佳包被量分别包被到T线和C线，按喷量为每厘米1.0微升的量划到NC膜上。荧光标记的免疫复合物添加到释放垫上，按0ng/ml，1ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、125ng/ml、625ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml、2000ng/ml的CK-MB标准品加样，在荧光检测仪上检测，并确定其灵敏性与检测线性范围。每个浓度使用5条试纸条来检测，通过荧光免疫层析检测仪检测荧光强度，求出算数平均值。加样12分钟后比较各加样浓度下的检测卡的显色情况及数据处理。取T线刚刚显色的浓度为我们的检测限。4.3.6CK-MB免疫层析试纸条重复性研究在同样的条件下，一批制作30个试纸条，分别做3批，加入CK-MB标准品浓度为每毫升25、125、625ng进行检测，每个浓度样品重复检测三次，检测结果计算出检测CV值大小。选用不同批次的检测卡中，进行相同条件的检测计算回收率，同时计算其批内差和批间差对检测卡的重复性和稳定性进行评价。4.3.7CK-MB免疫层析试纸条方法学比较及相关性测定通过对市售的胶体金试剂卡的检测方法进行比较，通过利用检出抗原浓度做对比。同时将CK-MB标准品按浓度为0、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml加入到胶体金检测卡及CK-MB免疫层析检测卡检测，每个浓度做3组重复实验，判断其检测相关性。4.3.8CK-MB免疫层析试纸条稳定性的研究研究根据阿伦尼乌斯经验式，37℃加速热稳定性考察模拟试剂的稳定性，37℃三十天相当于室温半年时间，同时对于37℃稳定性的研究也可反映出试纸条在运输过程中环境不确定因素的影响。将CK-MB免疫层析试纸条在37摄氏度下密封放置一个月，使用仪器来检测并研究试纸条的T线与C线的显色情况以及灵敏度在0、7、15、23、33 30天5个时间点来考察试纸条的稳定性性。4.4实验结果4.4.1Myo试纸条的构建及优化4.4.1.1Myo包被浓度的确定将anti-myo7005稀释成0.156mg/ml、0.313mg/ml、0.625mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml。每组各制作6个试剂卡，加入标准品后检测T线荧光数值如表4-3所示，随着包被浓度的增加，荧光强度也随着增加，但当包被浓度为2.5mg/ml增加幅度不明显，荧光数值与前一数值相差不多，所以最终确定T线包被浓度7005为1.25mg/ml。表4-3Myo试纸条T线浓度检测结果Anti-myo7005浓度(mg/ml)0.1560.3130.6251.252.5荧光强度1025.343098.765897.637586.677611.35图4.1Myo的T线浓度结果将包羊抗小鼠多抗稀释成0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml。将T线包被浓度固定为1.25mg/ml。每组各制作6个试剂卡，各加入抗原200ng通过荧光免疫层析检测仪读取数据，求出算数平均值。结果如表4-4所示，当包被浓度为1.5mg/mL与2mg/mL时C线颜色比较亮，且数值相差不多，为了不造成浪费，所以选用1.5mg/mL作为最佳包被浓度。表4-4Myo试纸条C线浓度检测结果多抗浓度(mg/ml)0.511.52荧光强度3453.386578.398241.318346.7834 图4.2Myo的C线浓度结果4.4.1.2Myo试纸条特异性研究目前常用来AMI的标志物有很多，利用对这些常用的检测物质如CRP、CK-MB、cTnI等进行检测，可以评价实验室自制的荧光的特异性是否良好，检测结果如下表4-5所示：常用的标志物如CRP、CK-MB、cTnI不会与此检测卡发生交叉反应，表明本检测卡特异性良好。表4-5Myo试纸条特异性检测结果AMI相关加样浓度（ng/ml）标志物11050100200400CRP——————Mb——————CK-MB——————4.4.1.3Myo检测时间的确定由于免疫层析的进行时液体不断流动，荧光检测仪器检测到的数据处于不断的变化中，当数据稳定时说明层析完成。此时启记录的时间为最佳检测时间。如图4.3所示,当检测到8min时，记录的T/C值趋于平稳,最后达到稳定值。为了能够准确的检测反应时测得的物质的含量，将10分钟定为最快的检测时间。35 2Myo检测时间1.81.61.41.2值1T/C0.80.60.40.20024681012141618202224262830时间/min图4.3Myo检测时间分析结果4.4.1.4Myo检测标准曲线的建立将Myo标准品稀释成25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml。每组各制作5个检测卡，通过荧光免疫层析检测仪检测荧光强度计算T/C线的荧光比值，求出算数平均值，结果如下表4-6所示，根据数据制作出标准曲线，由标准曲线可知，当范围为25ng/ml-1.5μg/ml时线性关系良好，2R>0.98如图4.4。表4-6不同样品浓度检测结果Myong/ml12.5255010020040080010001500T/C值0.0670.5120.8461.0871.2861.4801.6111.6921.7902Myo标准曲线1.81.61.41.2值1T/C0.80.6y=0.2984ln(x)-0.34950.4R²=0.98410.2010100100010000样品浓度ng/ml图4.4Myo标准曲线36 当Myo的含量刚好达到检测卡的灵敏度时，C线与T线同时显色。所以当T线刚刚显色时的检测的Myo的含量即为该试纸条的可检测的灵敏度。通过对稀释的不同梯度浓度的Myo样品溶液进行检测，表明在Myo浓度为每毫升0ng-1.5μg时检测线呈现由无色到红色的明显的梯度的变化，由标准曲线可知，线性范围为25ng/ml-1.5μg/ml。如图4.3，Myo标准溶液浓度分别为每毫升0、12.5ng、25ng、50ng、100ng、200ng、400ng、800ng、1000ng、1500ng。当Myo含量大于12.5ng/ml时检测线呈现显著红色无明显差距变化，即灵敏度12.5ng/ml。当Myo浓度小于12.5ng/ml时，此荧光检测卡检测不出结果。图4.5Myo标准品溶液不同浓度检测结果4.4.1.5Myo试纸条重复性研究在同样的条件下，一批制作30个试纸条，分别做3批，选用不同批次的试纸条对不同浓度的Myo标准品，每个条件重复三次，取平均值进行检测，检测结果如下表4-7所示，回收率在89%-122%之间，CV值<7%。结果显示批内批间重复性较好。表4-7Myo试纸条批间批内重复性结果Myo浓度批内批间(ng/ml)回收率%CV值%回收率%CV值%1001223.598.34.44001165.789.95.08001095.896.16.14.4.1.6Myo免疫层析试纸条方法学比较及相关性测定由实验结果取其中一组图片如图4.6及图4.7选可以看出，Myo的荧光微球试纸条与市售胶体金试纸条的相关性较好。检测结果都呈梯度显色。37 图4.6Myo荧光检测试纸条检测结果图4.7Myo胶体金检测试纸条检测结果由表4-8的对比结果可知，Myo胶体金的检测限为50ng/ml，而Myo荧光微球的检测灵敏度明显比胶体金的值高。因此，在免疫层析方法中，荧光微球标记的荧光免疫层析试纸条检测样品更加灵敏。38 表4-8Myo荧光免疫层析试纸条与胶体金方法比较结果Myo浓度荧光试纸条胶体金试纸条(ng/ml)1231230——————12.5+++———25+++—+—50++++++100++++++400++++++800++++++4.4.1.7Myo免疫层析试纸条稳定性的研究试纸条在组装完后，对其稳定性进行测试结果如下表4-9所示，在37℃放置30天的检测结果显示，C线与T线显色正常，且灵敏度没有变化，证明Myo荧光免疫试纸条稳定性好，可在密封室温保存半年之久。表4-9Myo免疫层析试纸条稳定性结果37℃放置（天）07152330C线+++++T线+++++灵敏度（ng/ml）12.512.512.512.512.54.4.2CK-MB试纸条的构建及优化4.4.2.1CK-MB包被浓度的筛选将Anti-CK-MB7501稀释成0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml、2.0mg/ml。每组各制作6个试剂卡，通过荧光免疫层析检测仪检测荧光强度，求出算数平均值如下表4-10所示，随着包被浓度的增加，荧光强度也随着增加，但当包被浓度为2.0mg/mL时数值增加幅度不大，荧光数值与前一数值相差不多，所以最终确定T线包被浓度7501为1.6mg/ml。表4-10CK-MB试纸条T线浓度检测结果anti-CK-MB7501浓度(mg/ml)0.20.40.81.62荧光强度330.341108.765367.697365.567581.5739 图4.8CK-MB的T线浓度结果包羊抗小鼠多抗稀释0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml。将T线包被浓度固定为1.6mg/mL。每组各制作6个试剂卡，各加入抗原100ng通过荧光免疫层析检测仪检测荧光强度，求出算数平均值，结果如表4-11所示，包被浓度为2.0mg/mL时荧光信号最强，肉眼观察最亮。最终确定C线包被浓度为2.0mg/ml。表4-11CK-MB试纸条C线浓度检测结果多抗浓度(mg/ml)0.511.52荧光强度2108.493587.427689.568216.54图4.9CK-MB的C线浓度结果4.4.2.2CK-MB试纸条特异性研究CK-MB试纸条特异性研究检测结果如下表4-12所示：当CK-BB浓度为800ng/ml时即可检测出信号，会造成交叉反应，影响检测结果。当CK-MM浓度为l200ng/ml时可检测出信号，相对CK-BB来说对检测结果的有较小的影响。表明CK-MM与CK-BB会与此试纸条发生交叉反应。表4-12CK-MB试纸条特异性分析结果CK-MB加样浓度（ng/ml）同源物质5020040080010001200CK-MM—————+CK-BB———+++4.4.2.3CK-MB检测时间的确定40 由于免疫层析的进行时液体不断流动，荧光检测仪器检测到的数据处于不断的变化中，当数据稳定时说明层析完成。此时记录的时间为最佳检测时间。如图4.10所示，当检测到12min时，记录的T/C值趋于平稳，最后达到稳定值。为了能够准确的检测反应时测得的物质的含量，将12分钟定为最快的检测时间。2CK-MB检测时间1.81.61.41.2值1T/C0.80.60.40.20024681012141618202224262830检测时间/min图4.10CK-MB检测时间4.4.2.4CK-MB检测标准曲线的建立将CK-MB标准品稀释成1ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、125ng/ml、625ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml、2000ng/ml。每组各制作5个检测卡，通过荧光免疫层析检测仪检测荧光强度计算T/C线的荧光比值，求出算数平均值结果如下表4-13所示，根据表格制作出标准曲线，如图4.7所示，由标准曲线可知，当范围为1ng/ml-1.0μg/ml时2线性关系良好，R>0.99如图4.11。表4-13CK-MB不同浓度标准品检测结果CK-MBng/ml1525125625100015002000T/C值0.4980.7560.9971.2111.4901.5791.6811.75641 1.8CK-MB标准曲线1.61.41.2值1T/C0.80.6y=0.1543ln(x)+0.49430.4R²=0.99830.201101001000样品浓度ng/ml图4.11CK-MB标准曲线当CK-MB的含量刚好达到试纸条的灵敏度时，C线与T线同时显色。所以当T线刚刚显色时的检测的CK-MB的含量即为该试纸条的可检测的灵敏度。通过对稀释的不同梯度浓度的CK-MB样品溶液进行检测，表明在CK-MB浓度为每毫升0ng-2μg时检测线呈现由无色到红色的明显的梯度的变化，如图4.12，CK-MB标准溶液浓度分别为每毫升0.1ng、1ng、5ng、25ng、125ng、625ng、1000ng、1500ng、2000ng。当CK-MB含量大于1.0ng/ml时检测线呈现显著红色无明显差距变化，即灵敏度1.0ng/ml。线性范围为当范围为1ng/ml-1.0μg/ml。当CK-MB浓度小于1.0ng/ml时，此荧光检测卡检测不出结果。图4.12CK-MB标准品溶液不同浓度检测结果4.4.2.5.CK-MB免疫层析试纸条批内和批间的重复性研究42 在同样的条件下，一批制作30个试纸条，分别做3批，选用不同批次的试纸条对不同浓度的CK-MB标准品，每个条件重复三次，取平均值进行检测，检测结果如下表4-14所示，回收率在84%-108.3%之间，CV值<8%。结果显示批内批间重复性较好。表4-14CK-MB试纸条批间批内重复性结果CK-MB浓批内批间度(ng/ml)回收率%CV值%回收率%CV值%2597.244.697.247.712584.514.8104.97.4625108.33.1105.65.54.4.2.6CK-MB免疫层析试纸条方法学比较及相关性测定由实验结果选出其中一组图片如图4.13及图4.14可以看出，CK-MB的荧光微球试纸条与市售胶体金试纸条的相关性较好。检测结果都呈梯度显色。图4.13CK-MB荧光检测试纸条检测结果43 图4.14CK-MB胶体金检测试纸条检测结果由表4-15的对比结果可知，CK-MB胶体金的检测限为5ng/ml，而CK-MB荧光微球的灵敏度明显比胶体金的值高。因此，在免疫层析方法中，荧光微球标记制作免疫层析试纸条检测CK-MB可提高检测灵敏度。表4-15CK-MB荧光免疫层析试纸条与胶体金方法比较结果CK-MB荧光试纸条胶体金试纸条浓度123123(ng/ml)0——————1+++———5+++++—50++++++100++++++200++++++400++++++4.4.2.7CK-MB免疫层析试纸条稳定性的研究试纸条在组装完后，对其稳定性进行测试结果如下表4-16所示，在37℃放置30天的检测结果显示，C线与T线显色正常，且灵敏度在第23天时开始变化，证明在37℃放置23天CK-MB免疫层析试纸条稳定性较差。初步可以确定试剂检测卡的稳定性良好。44 表4-16CK-MB免疫层析试纸条稳定性结果37℃放置（天）07152330C线+++++T线+++++灵敏度（ng/ml）1112.554.5本章小结本章实验构建了Myo及CK-MB荧光免疫层析试纸条，通过各种实验条件的优化，最终确定了MyoT线包被7005抗体浓度为1.25mg/ml，C线包被浓度为1.5mg/ml。检测时间确为10min。与常用的标志物如CRP、CK-MB、cTnI不会与此试纸条发生交叉反应；根据数据制作出标准曲线，由标准曲线可知，当范围为25ng/ml-1.5μg/ml2时线性关系良好，R>0.98，故可知其线性范围为25ng/ml-1.5μg/ml。与胶体金免疫层析方法相比，荧光检测方法的灵敏度高为12.5ng/ml。实现定量分析，且批间批内重复性、异性稳及特定性良好，CV<7%。CK-MB荧光免疫层析试纸条T线包被7005抗体浓度为1.6mg/ml，C线包被浓度为2.0mg/mL。当CK-BB浓度为800ng/ml时即可检测出信号，会造成交叉反应，影响检测结果。当CK-MM浓度为l200ng/ml时可检测出信号，相对CK-BB来说对检测结果的有较小的影响。表明CK-MM与CK-BB会与此试纸条发生交叉反应。由标准2曲线可知，当范围为1ng/ml-1.0μg/ml时线性关系良好，R>0.99，故可知其线性范围为1ng/ml-1.0μg/ml。与胶体金方法相比其灵敏度高为1ng/ml。结合荧光检测仪器进行检测，成功建立了标准曲线，实现定量检测CK-MB含量。且批间批内重复性及稳定性好，CV<8%。45 第五章结论与展望5.1结论随着检测科学技术的发展，POCT技术已成为医学检验方面最热门的一项技术。化学分析仪器也趋于简单化和便捷化，成本越来越低，无需专业人员培训，可以在采样现场进行检测，使一些物质成分的检测更加快速。检测结果准确及快速等特点被广泛的应用于诊断学及食品安全等各领域中。本实验荧光免疫层析方法是将层析技术与荧光微球标记技术相结合而发展起来的一种快速免疫诊断技术。制备了检测Myo与CK-MB的荧光免疫层析试纸条，以荧光微球为标记物，利用抗原抗体特异性结合的原理，利用EDC与NHS偶联方法构建了Myo及CK-MB荧光免疫层析试纸条，实现了对AMI定量并快速的检测，探索研究了微球与抗体最佳偶联条件，构建了并优化了试纸条的性能。本论文具体结论如下：(1)本实验通过BCA法测得蛋白含量分别为Anti-Myo7004浓度为6.45mg/ml，Anti-Myo7005浓度为4.94mg/ml，Myo浓度为4.25mg/ml，Anti-CK-MB7501浓度为5.74mg/ml，Anti-CK-MB7502浓度为6.63mg/ml，CK-MB浓度为22.49mg/ml。并通过ELISA的方法成功的筛选出最佳包被抗体，由于包被抗体是固定相，所以必须选用效价高的抗体作为包被抗体用来捕获抗原，而标记抗体是流动相，因此效价略低的作为标记抗体，用于检测荧光信号。(2)进行了荧光微球与抗体偶联效率的优化实验，正交实验对偶联条件进行优化，最终确定最佳的偶联条件为pH为7.0的缓冲溶液中，抗体终浓度为32.25μg/mL，温度为25℃，反应1h时条件最佳。为制作荧光免疫层析试纸条奠定了坚实的基础。(3)实验构建了Myo及CK-MB荧光免疫层析试纸条，通过各种实验条件的优化，最终确定了MyoT线包被7005抗体浓度为1.25mg/ml，C线包被浓度为1.5mg/ml。与常用的标志物如CRP、CK-MB、cTnI不会与此试纸条发生交叉反应；根据数据制作出标准曲线，由标准曲线可知，当范围为25ng/ml-1.5μg/ml时线性关系良好，2R>0.98，故可知其线性范围为25ng/ml-1.5μg/ml。与胶体金免疫层析方法相比，其灵敏度高为12.5ng/ml，特异性好。检测时间确为10min，建立标准曲线，实现定量分析，且批间批内重复性及稳定性好，CV<7%。(4)CK-MB荧光免疫层析试纸条T线包被7005抗体浓度为1.6mg/ml，C线包被浓度为2.0mg/mL。当CK-BB浓度为800ng/ml时即可检测出信号，会造成交叉反应，影响检测结果。当CK-MM浓度为l200ng/ml时可检测出信号，相对CK-BB来说对检测结果的有较小的影响。表明CK-MM与CK-BB会与此试纸条发生交叉反应。由标2准曲线可知，当范围为1ng/ml-1.0μg/ml时线性关系良好，R>0.99，故可知其线性范46 围为1ng/ml-1.0μg/ml。与胶体金方法相比其灵敏度高为1ng/ml。结合荧光检测仪器进行检测，成功建立了标准曲线，实现定量检测CK-MB含量。且批间批内重复性及稳定性好，CV<8%。在室温下放置可放半年之久且稳定性良好。对临床上对AMI的快速准确检测具有重要的作用。5.2展望本论文目前利用荧光标记物荧光微球对心肌标志物Myo与CK-MB的单克隆抗体进行标记，在免疫层析试纸条这种方法的应用所取得了一些成果，后期研究工作将着重在以下几方面开始。（1）全血样品的检测。荧光免疫层试纸条使用血清作为检测样品，加样前须对检测样品进行提前处理，为了更加体现荧光层析的优点，样品必须能够同时使用血浆和全血样品。在全血样品中血红细胞破裂会对背景产生的各种干扰等因素的发生，从而[70]影响检测效果。接下来的工作会着重解决在复杂体系中准确检测目标蛋白的问题，并通过优化检测方法，制作出灵敏度高及抗干扰性强的免疫层析试纸条。（2）两种及两种以上标志物的联合检测。本论文研究的荧光微球与心肌标志物的单克隆抗体复合探针能够较好的提高蛋白质检测的灵敏度，但是检测试纸条分开检测不如联合检测起来方便快速，所以建立心肌标志物的联合检测可以在提高检测方法灵敏度的使同时操作更加简单快速。（3）在微球类型上进一步扩展，可选择不同激发波长的荧光微球或不同粒径大小的荧光微球进行试验，以提高检测效果。（4）进一步拓宽应用领域。将荧光定量免疫层析检测方法扩展到其他疾病检测、食品安全检测等检测领域。47 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致谢转眼间短短的两年半的硕士生研究生涯即将结束，面临毕业，内心始终无法平静。回想学校生活，不仅让我学到了科学知识，也教会了我很多做人的道理。每每想到这些，心中总会充满着感恩。首先，感谢长春理工大学为我提供学习、进步的地方，为我提供的科研工作提供了便携的生活条件、良好的学习环境以及许多学习的机会。其次、特别感谢我的指导教师于源华教授，是她对科学的不断探索，求真务实的工作态度以及为了科研而无私奉献的工作精神深深的吸引了我，也影响了我。于源华老师品德高尚，学识渊博，从我论文的选题，实验方案的设计，再到实验有条不稳的进行，每一个过程都有包含着老师指导思想，在此特别感谢恩师的教导。从于老师的言传身教中学到的科研方法将使我终生受益!感谢师兄、师姐等对我的指导。感谢实验室的兄弟姐妹的支持与鼓励。感谢师弟师妹对我的帮助。我要感谢我的家人，你们永远在我的身后默默的支持着我，关心着我。家是我最温馨的港湾，爸爸妈妈年纪已高，但你们还在为了我上学而努力的拼搏，你们省吃俭用，为我操心。你们对我的好，我会永远的记在心里，这份恩情永世不忘！特别感谢我的老师和每一位亲朋好友，你们全心全意的支持和关爱，使我能够不断地克服重重困难，也是我努力完成学业的动力。最后感谢论文评审专家及在百忙之中参加答辩的各位老师，谢谢。52