抗人羧酸酯酶论文

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　　抗人羧酸酯酶论文.freelonoclonalantibodyagainsthumancarboxylesterasesⅡAbstractAIM:Topreparemonoclonalantibody(mAb)againsthumancarboxylesterasesⅡ(hCEⅡ)andcharacterizeitsproperties.METHODS:BALB/cmicemunizedanlivermicrosomeproteinAbatechniqueandpurifiedbyproteinGaffinitychromatography.ThetiterandspecificityofmAbmunohistochemicalstaining.Antigenassfingerprint(PMF)matchedanproteindatabase.PMFmunoprecipitationandmatrixassistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry(MALDITOFMS).RESULTS:OnecloneofhybridomasecretingspecificmAbagainsthCEⅡAbAbmunohistochemistrydemonstratedthatthemAbhadspecialbinationprotein,butnotoothmusclecellprotein.ImmunoprecipitationshoityedtobehCEⅡafterbeinganalyzedassspectrometry.CONCLUSION:ThemAbagainsthCEⅡancarboxylesterasesⅡ;monoclonalantibody;matrixassistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry摘要目的:制备鼠抗人羧酸酯酶Ⅱ（humancarboxylesterasesⅡ,hCEⅡ）单克隆抗体（mAb）并对其特性进行鉴定。方法:以含hCEⅡ的人肝脏微粒体蛋白混合抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备鼠抗hCEⅡ的mAb,并用ProteinG亲和层析法纯化mAb。用间接ELISA法测定mAb的效价,.freelAb的特异性、免疫组化染色法对mAb相应的抗原进行组织定位。用免疫沉淀和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrixassistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDITOFMS）得到相应的肽质量指纹谱（peptidemassfingerprint,PMF）,再通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对鉴定mAb对应的抗原。结果:获得1株可持续、稳定分泌抗hCEⅡ的mAb的杂交瘤细胞系。杂交瘤细胞分泌的mAbIg的亚类（型）为IgG1（κ）,腹水mAb的效价达1×10-7。r为62000处有1条清晰的带。免疫组化染色显示,该mAb可与肝细胞的浆蛋白结合（hCEⅡ存在于肝细胞浆内微粒体）,而不与血管平滑肌细胞内的蛋白结合。该mAb免疫沉淀物的Mr为62000,与hCEⅡ的Mr相符。对免疫沉淀的蛋白质进行质谱鉴定证实,该mAb对应的抗原为hCEⅡ。结论:制备出的鼠抗hCEⅡ的mAb效价高、特异性良好,为进一步研究hCEⅡ的功能及其在肝癌等癌症的诊断和治疗中的作用提供了工具。关键词人羧酸酯酶Ⅱ;单克隆抗体;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在蛋白质组学研究中,单克隆抗体（mAb）及其相关技术在蛋白质分子的定性、定量、定位、 蛋白翻译后修饰及蛋白蛋白相互研究中具有不可替代的作用。因而蛋白质组学的研究需要很多特异性好、高质量的mAb。本研究描述了用混合的人肝微粒体蛋白作抗原制备其鼠源性杂交瘤的策略。mAb对应的抗原是用免疫沉淀和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）得到相应的肽质量指纹谱（peptidemassfingerprint,PMF）,再通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对鉴定的。人羧酸酯酶Ⅱ（carboxylesterasesⅡ,EC3.1.1.1,hCEⅡ）是羧酸酯酶亚家族中的成员,由550个氨基酸组成,相对分子质量（Mr）为61807。羧酸酯酶属于B族脂酶,为一种丝氨酸酶,在肝脏、小肠、结肠、心脏、脑、睾丸及肾脏等组织中均有表达。血清中的hCEⅡ主要在肝脏中合成,并通过高尔基体分泌到血循环中1。最近研究表明,hCE可作为肝癌的新标志物2。由于目前国际市场上还没有抗hCEⅡ的mAb的销售,为此,我们应用杂交瘤技术,制备了抗hCEⅡ的mAb,并进行了特性鉴定,为hCEⅡ的纯化,hCEⅡ检测试剂盒的研制,后续制备mAb亲和层析柱,以及肝癌等的研究提供了重要的制剂。1材料和方法1.1材料6周龄雌性BALB/c小鼠,由哈尔滨医科大学动物中心提供。小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0为本室保存。福氏佐剂及3,3,5,5四甲基联苯胺（TMB）购自Sigma公司。即用型SABC免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。HRP山羊抗小鼠IgG购自JacksonImmunoResearch公司。RPMI1640培养基购自Hyclone公司。PEG4000购自北京夏斯生物公司。Ig亚类鉴定试剂盒购自HyCultbiotechnologybv公司。免疫沉淀试剂盒购自PIERCE公司。硝酸纤维素膜购自BIORAD公司。加强化学发光试剂盒（ECLPlus）购自AmershamBiosciences公司。其他试剂均为国产分析纯。酶标仪（MK3型）为Thermo公司产品。质谱鉴定由上海基康生物技术有限公司完成。正常人肝脏组织,由“人类肝脏蛋白质组计划”基金项目提供。1.2方法1.2.1人肝脏微粒体蛋白的制备取正常人的肝脏10g剪碎,用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白,并制成肝匀浆。将肝匀浆离心3次（依次为10000g30min、30000g60min及100000g60min）。取沉淀,悬浮于含有200mL/L甘油、5g/L胆酸钠、2mg/L抑肽酶、2mg/L亮肽素、1mg/L胃酶抑素及1mmol/L苯甲基磺酰氟的磷酸钾盐缓冲液中,用Bradford法进行蛋白定量后,置-80℃保存备用。1.2.2抗hCEⅡ的mAb的制备采用石晓娟等3报道的方法（略有改进）进行免疫。取1mg人肝微粒体蛋白加500μ L的去离子水与等量的完全福氏佐剂充分乳化后,于BALB/c小鼠（2只）的背部注射两点,每点约50μL,剩余的腹腔注射。3周后加强免疫,剂量同前,用不完全福氏佐剂充分乳化后,注射于小鼠腹腔。以后隔两周加强免疫1次。从第3次加强免疫起,每次免疫后7d,经尾静脉采血测定抗血清的效价。共加强免疫4次后,选择抗血清效价较高的小鼠,在进行细胞融合前3d,用不加佐剂的人肝微粒体蛋白腹腔注射冲击免疫1次。细胞融合、亚克隆及腹水的制备均按实验室常规方法进行。mAb腹水的纯化采用ProteinG免疫亲和层析法4,用AmershamAKTAprimemAb纯化系统进行。纯化后mAb经SDSPAGE分离后,用BIORADquantityone软件分析其纯度。1.2.3mAb的特性鉴定①效价测定:采用间接ELISA法。以1mg/L人肝微粒体蛋白包被酶标板,依次加入不同浓度的腹水及1∶3000HRP山羊抗小鼠IgG,加TMB显色后,用酶标仪测定A450值。②Ig类和亚类的鉴定:按Ig亚类鉴定试剂盒的说明书进行。③特异性鉴定:采用r通过MALDITOFMS测量,即得到相应的PMF数据,通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对鉴定mAb对应的抗原5,6。2结果2.1杂交瘤细胞株的建立按常规方法融合、间接ELISA法筛选及3次亚克隆后,得到1株可持续、稳定分泌抗hCEⅡmAb的杂交瘤细胞系株（21D9）,经体外连续传代培养,液氮冻存半年以上,复苏后仍生长良好,说明其分泌mAb的性能稳定。2.2mAb的纯化及纯度鉴定采用ProteinG免疫亲和层析法纯化mAb腹水后,经SDSPAGE分离表明,出现一条Mr约为55000的带（重链）,另一条Mr约为25000的带（轻链）,未见其他的带（图1）。用BIORADquantityone软件分析其纯度为96%,为后续制备mAb的亲和层析柱提供了保障。图1抗hCEⅡmAb的SDSPAGE分析（略）Fig1SDSPAGEanalysisofmAbagainsthCEⅡM:Proteinmarker;1:PurifiedmAb.2.3抗hCEⅡmAb的特性鉴定①效价测定:间接ELISA检测表明,腹水mAb的效价达1×10-7。②Ig亚类及型的鉴定:用Ig亚类鉴定试剂盒检测表明,该mAb为IgG1（κ）。③特异性鉴定:以制备的人肝脏微粒体蛋白作为抗原,以抗hCEⅡmAb作为一抗,进行还原及非还原性r约为62000处出现1条清晰的带,与hCEⅡ的Mr相符（图2）,说明所制备的mAb能与还原及非还原的人肝脏中的羧酸酯酶结合。 图2抗hCEⅡmAb特异性的还原与非还原条件下:Proteinmarker;1:NonreducedhCEⅡinhumanliver;2:ReducedhCEⅡinhumanliver.2.4肝细胞浆蛋白的免疫组化染色检测免疫组化染色的结果显示,在1000倍光镜下,可见抗hCEⅡmAb与肝细胞的浆蛋白结合（hCEⅡ存在于肝细胞质内微粒体。图3箭头1为阳性区,箭头3为肝细胞核）,而不与血管平滑肌细胞内的蛋白结合（图3箭头2阴性区,箭头4为平滑肌细胞核）,表明人肝细胞的浆蛋白中含有hCEⅡ抗原。图3人肝组织中hCEⅡ抗原的免疫组化染色检测（略）Fig3DetectionofhCEⅡantigeninhumanlivertissuebyimmunohistochemicalstaining(×1000)2.5人肝微粒体蛋白抗原的鉴定①r约为62000处出现1条清晰的带,与hCEⅡ的Mr（为61807）相符。mAb与其免疫沉淀形成的抗原抗体复合物,分别在Mr约为62000、55000、25000处出现3条清晰的带,分别与hCEⅡ、IgG的重链及轻链分子量相符。以纯化后的抗hCEⅡmAb作为抗原,虽不能与一抗mAb结合但可与二抗结合而显色,因而在Mr约为55000处出现1条清晰的带,与抗体重链的Mr相符（图3）。以上说明,与mAb相对应抗原的Mr约为62000。②质谱鉴定:免疫沉淀产物经SDSPAGE分离后作考马斯亮蓝染色,将凝胶上抗原蛋白带切下做质谱分析表明,该人肝微粒体蛋白抗原为hCEⅡ（图4、5、6）。图4免疫沉淀后所获蛋白的:Proteinmarker;1:Humanlivermicrosomeprotein;2:Proteinobtainedafterimmunoprecipitation;3:AntihCEⅡmAb.图5人肝脏微粒体蛋白抗原与hCEⅡ的氨基酸序列比较（略）Fig5parisonofaminoacidsequencesbetanlivermicrosomeproteinantigenandhCEⅡantigenMatchedpeptidesmunoprecipitationsideoflysineorarginineberofmassvaluessearched:55.Numberofmassvaluesmatched:13.Sequencecoverage:27%.图6Mascot在人类蛋白质数据库中检索的结果（略）Fig6TheresultofprobabilitybasedMascotTopscore:99.Scoreis－10×Log(P),Ab的杂交瘤细胞系。mAb的腹水经ProteinG亲和层析纯化后,纯度达96%。间接ELISA测定表明,mAb腹水的效价达1×10-7。r约为62000处出现1条清晰的带,与羧酸酯酶的Mr相符,表明该mAb为抗人肝微粒体蛋白的抗体。还原及非还原性ALDITOFMS得到相应的PMF数据。通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对鉴定出mAb对应的抗原为hCEⅡ 。迄今,还没有纯化出天然的hCEⅡ。以往研究表明,hCEⅡ的亚细胞分布具有明显的差异性,在人肝、肾及脑等组织中,hCEⅡ主要位于微粒体的可溶性部分7。根据这一特点,我们采用蔗糖密度梯度离心法,用正常人肝脏组织制备含有天然hCEⅡ的人肝微粒体蛋白混合抗原。这样,便可在没有天然hCEⅡ抗原的情况下,制备出效价高、特异性良好的抗天然hCEⅡ的mAb。抗hCEⅡ的mAb在蛋白质组学中具有重要的作用。另外,由于hCEⅡ可促进依立替康、卡培他滨等抗癌药的代谢8,9,因而,抗hCEⅡmAb的制备,对于增强抗癌药物的疗效也具有重要的作用。最近研究表明,hCE可作为肝癌的标志物2。为此,抗hCEⅡmAb的制备,对建立检测hCEⅡ的方法,精确分析其在肝癌组织及血清中的含量也具有重要的意义。