豆豉中主要分离细菌对小鼠生化指标及肠道菌群的影响-论文.pdf

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营养与僳健食品-业斜枝Vo1．35N0．07。2014豆豉中主要分离细菌对小鼠生化指标及肠道菌群的影响董素琴，武晓丽，王报贵’，李胜杰’，王玉莲，徐锋(1．南昌大学生命科学与食品工程学院中德联合研究院，江西南昌330047；2．江西中医学院基础医学部，江西南昌330004)摘要：采用豆豉样品进行细菌分离培养和细菌16SrDNA基因PCR扩增、测序分析，并将分离所得细菌进行小鼠灌胃实验。结果显示，豆豉中的主要分离细菌为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、类肠膜魏斯氏茵、乳酸片球茵、戊糖片球菌、发酵乳杆茵、表皮葡萄球菌。并且，各菌对小鼠丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)各项生化指标基本无影响。然而，其中解淀粉芽孢杆茵DC02能极显著性地降低小鼠血糖(GLU)水平，该茵有望成为治疗糖尿病的潜在菌株。活菌计数结果表明，除表皮葡萄茵以外，豆豉中分离所得其它细菌均能改善肠道茵群结构。可见，豆豉中分离所得主要细茵对正常机体安全、无致病性。关键词：豆豉，细茵，生化指标，肠道茵群TheeffectofthemainbacteriaisolatedfrOmDouchionbiochemicaIindexesandtheintestinalflorainmiceDONGSu—qin，WUXiao—li，WANGBao—gui，LISheng—jie，WANGYu—lian，XUFeng，(1．Jiangxi-OAIJointResearchInstitute，NanchangUniversity，Nanchang330047，China；2．JiangxiUniversityofTCMInternationalEducationCollege，Nanchang330004，China)Abstract：BacteriaIstrainswasisolatedfrOmDouchiandthen16SrDNAgenewasamplifed．ThebacteriaIstrainswasusedforanimaIexperimentinthemethodofintragastricadministrationaftersequencinganalysis．Resultsshowedthatthemainbacteria＼ntheDouch＼wasBcillussubt||is．Bacillusamylouefaciens。WeisseIlaparamesenteroides．Pdiococcusacidilactici。Pdiococcuspentosaceus。Lactobacillusferment|umandStaphylococcusepidermidis．Bacillusamylofiquefacienscouldsignificantlydecreasethelevelofbloodglucose(GLU)inmiceafterintragastricadministration．andotherbacteriahadnoefectontheleveIofalanineaminotransferase(ALT)，aspartateaminotransferase(AST)，totalbilirubin(TBIL)，directbilirubin(DBIL)，creatinine(CREA)，ureanitrogen(BUN)，uricacid(UA)，bloodglucose(GLU)，triglyceride(TG)andtotalcholesterol(TC)．TheresultsofviablecountingmethodrevealedthatbacteriastrainsisolatedfrOmDouchicouldimprovethestructureofintestinaIfloraexceptStaphylococcusepidermidis．1tfollowsthatbacteriastrainsisolatedfrOmDouchiaresafefororganism．Keywords：Douchi：bacteria；biochemicaIindex；intestinaIflora中图分类号：TS201．4文献标识码：A文章编号：1002—0306(2014)07—0343—05豆豉起源于我国先秦时代，迄今已有两千多年在整个发酵过程中，这些微生物通过对原料大历史，同酱油、腐乳和豆酱一样是具有传统民族特色豆中有机物进行分解、重组等复杂的生化反应，最终的发酵制品，以其营养丰富、豉香诱人、风味独特而形成大豆异黄酮、大豆多肽、大豆低聚糖等各种活性享誉世界。然而，由于各地气候、水土、饮食习惯等物质，使得豆豉具有较好的保健功能，如抗氧化、不同因素，豆豉已形成了具有地方特色的产品。根抗血栓、抗菌、降血糖、降血脂、保护早期动脉粥样硬据制曲时参与的微生物不同，豆豉可分为毛霉型、曲化血管内皮损伤、抑制肿瘤细胞增殖、增强机体免霉型、根霉型和细菌型四大类。疫力等J。然而，至今豆豉中细菌对正常机体的安全性评价国内#1-仍未有报导。本工作拟通过生化实验收稿日期：2013—09—04通讯联系人探究豆豉中分离所得的主要细菌x,t4,鼠肝功能、肾作者简介：董素琴(1988一)，女，在读研究生，研究方向：营养与食品卫功能，血糖、血脂、及总胆固醇水平的影响，并利用传生学。统活菌计数方法验证分离所得菌株对肠道菌群的影基金项目：国家自然基金(81160494，31260363，31000048)。响，从而评价豆豉中分离所得细菌x,t正常机体的安 食品，II斜技营养与僳健ScienceandTechnologyofFoodIndustry全性。血糖、血脂及胆固醇水平。1材料与方法1．2．5活菌计数法选择性培养小鼠肠道菌传统平板活菌计数法能够对肠道菌群进行定量培养，较好1．1材料与仪器的反应肠道菌群结构，此种计数方法线性范围大，重豆豉南昌稻香园调味食品有限公司；氯化复性、平行性好，应用范围广J。各组小鼠粪便样品钠国药集团化学试剂有限公司；琼脂、MRS培养每隔14d收集一次。具体操作步骤如下：称取0．1g基北京索莱宝科技有限公司；MAC培养基、改良粪便于EP管中，加入0．9mL的生理盐水之后，震荡GAM培养基青岛高科园海博生物技术有限公司：混合均匀；将该混合液制备成从10到1O一不同浓酵母粉、蛋白胨、SBM培养基英国OXOID公司；度梯度的稀释液，各取100L涂布于4种不同选择BALB／c小鼠80只(18-20g，雌性)江西省南昌大性培养基中(MRS培养基用于选择性培养乳酸菌属，学动物科学部门。高速冷冻离心机美国Thermo公司；ZHWY—SBM培养基用于选择性培养肠球菌属、MAC培养基用于选择性培养肠杆菌属、改良GAM培养基用于选A2102C恒温培养箱上海智城分析仪器制造有限择性培养脆弱拟杆菌属)，肠杆菌和肠球菌置于37℃公司；YQX—II型厌氧培养箱上海跃进医疗器下需氧培养24h，乳酸菌和脆弱拟杆菌置于37℃下厌械厂。氧培养48h；计算每克粪便中对应的菌落数。1．2实验方法1．2．6数据处理采用spssl3．0进行数据处理分析，1．2．1豆豉中细菌的分离豆豉样品5g，浸泡于结果均用均数±标准差表示。数据差异分析采用单50mL无菌生理盐水中，15min后将样品进行10倍逐因素方差分析方法，P<0．05表示具有显著性差异，级梯度稀释，吸取100~zL10～、1O～、10。的稀释液分P<0．01表示具有极显著性差异。别涂布于LB平板和MRS平板。LB平板置于37℃恒温培养箱中需氧条件下倒置培养24h，MRS平板置2结果与讨论于37~(2厌氧培养箱中倒置培养48h。观察比较培养2．1豆豉中细菌的分离、鉴定结果基中的各菌落表面形态。对不同平板中具有不同形态特征的单菌落进一用接种针将平板上形态不同的菌落逐一挑出，步进行16SrDNA同源序列比对之后，发现豆豉中的培养过夜后用30％的甘油保菌，于一70~C冰箱中主要细菌为芽孢杆菌、片球菌、乳杆菌、魏斯氏菌等，保藏。同时也存在葡萄球菌。虽然，大部分葡萄球菌被认1．2．2豆豉中细菌的鉴定将豆豉样品中分离得为是安全菌株，然而也有部分菌株被认为是具有潜到的单菌落分别接种到相应的液体培养基中，根据在安全隐患的。本实验在前期工作中也曾分离出以玻璃珠法提取各个单菌的基因组DNA，并以此为上细菌，具体鉴定结果如表1所示。即使枯草芽孢模板采用细菌通用引物]：27F(F)：5一杆菌是细菌型豆豉发酵过程中不可缺少的菌种，然AGAGTTYGATCCTGGCTCAG一3；1492R(R)：5一而曲霉型豆豉中也存在该菌种。管泳宇等人也曾从GGCTACC1TrG1丫rACGAC1_r一3进行16SrDNA基因片曲霉型豆豉中分离出1株枯草芽孢杆菌、1株产酸发段扩增。扩增产物送物上海生物52程有限公司测酵乳杆菌⋯。目前研究最为深入的日本纳豆的发酵序，测序结果在NCBI网页上运行BLAST程序，寻找菌种也为枯草芽孢杆菌，该菌种赋予了纳豆抗菌、溶16SrDNA序列具有较高同源性的参考菌株，对细菌血栓、抗癌等功效u。彭勇从豆豉中分离得到的解进行鉴定。淀粉芽孢杆菌具有高产溶栓酶的能力，因此本工1．2．3小鼠的饲养选取毛色光泽、健康活泼的作分离得到的解淀粉芽孢杆菌有望成为新型溶栓药BALB／e小鼠80只(18-20g，雌性)，随机分为8组，物，但需进一步实验验证。类肠膜魏斯氏菌、乳酸片每组10只，分笼饲养(10只／笼)。饲养房温度恒定球菌、戊糖片球菌、发酵乳杆菌均在厌氧条件下由在20℃，湿度45％～55％，并保持室内空气清新。MRS培养基分离所得，均属于乳酸菌属。其中肠膜自由采食、饮水，平衡一周后开始实验。将培养至对魏斯氏菌主要存在于蔬菜的发酵过程中。乳酸片球数期的含菌液5000r／min离心10min，收集菌体，用菌、戊糖片球菌、发酵乳杆菌因其较强的产酸能力和0．85％生理盐水调整至5X10cfu／mL备用。各实验明显的益生性能已被应用于各种发酵制品中。总组分别灌胃200I~L的菌体，正常对照组给予等量的之，豆豉因其各种微生物的存在使其具有特有的风生理盐水。每天灌胃一次，连续灌胃28d。味和功能。1．2．4小鼠血清生化指标的测定灌胃结束后，所2．2豆豉中主要分离细菌对小鼠生化指标的影响有小鼠禁食过夜，次日摘眼球取血，3000r／rain离心2．2．1豆豉中主要分离细菌对小鼠肝功能的影10min后取血清，4~C冰浴送至南昌大学第一附属医响肝脏是动物体内最大的消化腺，主要参与蛋白院全自动生化分析实验室用于血清生化指标的检质、糖原、胆固醇等多种物质的合成、贮存、代谢和转测。丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶化。肝脏功能异常直接导致体液失衡等一系列代谢(AST)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)4个指紊乱症发生，因此，肝功能正常可以作为豆豉中主要标用于评价肝功能状况；肌酐(CREA)、尿素氮分离细菌安全性评价的一个重要指标。血清中ALT(BUN)、尿酸(UA)3个指标用于评价肾功能状况；血升高通常表示肝脏有损伤。AST主要存在于心脏，糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)用于评价其次为肝脏和肾脏，因此血清中AST浓度升高主要 营养僳健食品摹II斜技Vo1．35,No．02014表2豆豉中主要分离细菌对小鼠血清生化指标的影响Table2Theeffectofthemainbacteriaisolatedfromdouchionthebiochemicalindexofmiceserllm注：表中表示与对照组比较具有极显著性差异，P<0．01。反映肝脏或心脏有损伤u。大部分的肝脏疾病都会机体正常的脂类代谢和糖代谢。不仅如此，DC02伴随黄疸的症状，这是由于肝脏无法继续将胆红素对肠道菌群的影响也可能是其能够降低小鼠血糖水排出，蓄积在体内，导致TBIL、DBIL浓度急剧升高。平的原因之一。研究证明，嗜酸乳杆菌、干酪乳表2显示，各组小鼠经灌胃28d细菌后，A、AST、杆菌、鼠李糖植物乳杆菌均有不同程度的降低血糖TBIL、DBIL水平与对照组相比稍有浮动，但没有显功效。¨，然而具体降血糖机制仍未阐明。著性差异，说明豆豉中各细菌对小鼠肝脏细胞完整2．3豆豉中主要分离细菌对小鼠肠道茵群的影响性及肝功能没有任何损害性。肠道菌群的动态平衡对人体的身体健康起着重表1豆豉中分离出的主要细菌16SrDNA测序鉴定结果要作用，因此肠道菌群结构变化可以作为评价豆豉中主要分离细菌安全性的又一指标。如表3所Table1Theidentificationresultsof16srDNAofthemainbacteriaisolatedfromDouchi示，对照组小鼠的肠道菌群数量基本处于平稳状态，仅仅呈现缓慢波动，其中肠球菌的数量在(8．28±0．44)～(8．38±0．43)(1g(cfu／g))范围内、肠杆菌的数量在(7．804-1．00)～(8．574-0．11)(1g(cfu／g))范围内、脆弱拟杆菌数量在(8．704-0．35)～(8．964-0．35)(1g(efu／g))、乳酸菌数量在(9．074-0．70)～(9．40±0．26)(1g(efu／g))范围内。豆豉中的枯草芽孢杆菌能够形成大量与豆豉风味相关的酶类物质，对于豆豉的发酵过程起着非常重要的作用。实验组小鼠经灌胃枯草芽孢杆菌DC0114d后，肠球菌和肠杆菌数量明显下降。肠球2．2．2豆豉中主要分离细菌对小鼠肾功能的影响菌数量在第14d时下降至7．204-0．1Olg(cfu／g)，并且CREA、BUN、UA三个生化指标均能较准确的反应肾至28d时数量持续降低。肠杆菌数量在14、28d时分实质病变程度。CREA是肌酸和磷酸肌酸的最终代别降至6．73±0．38、6．98±0．861g(cfu／g)。经灌胃解谢产物；UA是蛋白质的正常代谢产物；BUN是蛋白淀粉芽孢杆菌DC02的小鼠从第14d开始肠道内肠质代谢的终末产物。这些代谢废物和其它毒性物球菌数量逐渐降低，在28d时脆弱拟杆菌的数量也质，通过血液进入肾脏，经肾小球滤过或肾小管分明显减少，然而乳酸菌的数量在整个灌胃周期总呈泌，随尿液排出体外。在正常机体中CREA、BUN、现递增的趋势。该变化可能是由于解淀粉芽孢杆菌uA的生成与排泄速度处于动态平衡状态，当体液中自身的代谢物质所致。解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢CREA、BUN、UA含量发生明显变化时，可认为肾功杆菌一样，其丰富的自身次级代谢产物具有多种生能受损，主要表现为尿路结石、痛风、水肿等症状。物活性-z，并且能够抑制多种致病性真菌与细菌的从表2可以看出，豆豉中各细菌对小鼠肾排泄功能生长。无干扰，实验组小鼠CREA、BUN、uA数值与对照组类肠膜魏斯氏菌DC03虽然对小鼠肠道中肠杆小鼠相比没有显著性差异。菌、肠球菌、脆弱拟杆菌的数量影响没有统计学意2．2．3豆豉中主要分离细菌对小鼠血糖、血脂及胆义，却明显增加了乳酸菌的数量，在28d时，小鼠肠固醇水平的影响各实验组小鼠的血脂与胆固醇水道中乳酸菌数量达到9．734-0．45(1g(efu／g))的平与对照组小鼠接近，然而经连续灌胃解淀粉芽孢水平。杆菌DC0228d后，该实验组血糖值急剧降低。该现乳酸片球菌DC04在灌胃前期能够有效的抑制象的产生可能是由于解淀粉芽孢杆菌能够产生多种肠杆菌、脆弱拟杆菌。28d后脆弱拟杆菌的数量由胞外酶，如：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，继而影响了9．24-0．88(1g(cfu／g))下降至7．85±0．42(1g(cfu／g))。 农品，II斜枝营养僳健ScienceandTechnologyofFoodIndustry表3豆豉中主要分离细菌对小鼠肠道菌群的影响(1gefu／g)Table3TheeffectofthemainbacteriaisolatedfromDouchiontheintestinalfloraofmice注：表中表示与灌胃第Od比较，P