赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究

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目录目录摘要........................................................................................................................................IAbstract..................................................................................................................................II第一章猪附红细胞体病的研究进展................................................................................11.简介..............................................................................................................................12.病原学..........................................................................................................................12.1病原的历史来源及分类....................................................................................12.2病原的生物学特性............................................................................................23.致病机理......................................................................................................................34.临床症状与病理变化..................................................................................................45.诊断方法......................................................................................................................66.流行病学......................................................................................................................87.防治研究......................................................................................................................8第二章赣州地区猪附红细胞体病的流行病学调查......................................................101.材料与方法................................................................................................................101.1材料.................................................................................................................101.1.1实验动物和病原....................................................................................101.1.2主要仪器...............................................................................................101.1.3主要试剂................................................................................................101.2方法.................................................................................................................111.2.1相关试剂配制[22]....................................................................................111.2.2调查范围与对象....................................................................................111.2.3病料采集................................................................................................111.2.4实验室检测............................................................................................111.2.4.1猪附红细胞体的检测.................................................................111.2.4.1.1镜检法[23]............................................................................111.2.4.1.2ELISA检测.......................................................................121.2.4.1.3PCR法检测.......................................................................121.2.4.2其它病原的检测.........................................................................122.结果与分析..............................................................................................................122.1五种镜检检测方法的比较..............................................................................122.2镜检法、ELISA和PCR检测的比较...........................................................132.3不同内脏器官猪附红细胞体的检测率比较..................................................132.4不同地区猪附红细胞体发病和流行情况.....................................................142.5不同阶段的猪附红细胞体发病和流行情况.................................................152.6不同规模猪场猪附红细胞体发病和流行情况.............................................16i 目录2.7不同季节猪场猪附红细胞体发病和流行情况.............................................162.8猪附红细胞体病的发病模式调查..................................................................173.讨论............................................................................................................................183.1猪附红细胞体病的诊断方法.........................................................................183.2猪附红细胞体病的流行特点.........................................................................193.3猪附红细胞体病的发病模式.........................................................................193.4猪附红细胞体病的预防探讨.........................................................................20第三章猪附红细胞体病有效药物的筛选......................................................................211.材料与方法................................................................................................................211.1材料.................................................................................................................211.1.1实验动物和病原...................................................................................211.1.2主要仪器...............................................................................................211.1.3主要试剂...............................................................................................211.2方法.................................................................................................................221.2.1相关试剂配制[22]...................................................................................221.2.2试验动物分组与处理............................................................................221.2.2.1治疗试验动物分组与处理.........................................................221.2.2.2治疗药物毒性试验动物分组与处理..........................................231.2.3临床症状观察和死亡情况分析............................................................231.2.4病原试验室检测....................................................................................231.2.4.1猪附红细胞体病原的镜检..........................................................231.2.4.2PCR法检测.................................................................................241.2.5猪生化指标的测定...............................................................................242.结果..........................................................................................................................242.1猪附红细胞体人工感染结果..........................................................................242.2试验各组猪治疗后采食量与饮水量结果......................................................242.3试验各组猪治疗后临床症状变化结果..........................................................252.4试验各组猪治疗后死亡情况及病理变化结果.............................................262.5试验各组猪治疗后镜检检测结果.................................................................262.6试验各组猪治疗后PCR检测结果...............................................................272.7猪生化指标的测定结果.................................................................................273.讨论............................................................................................................................283.1猪附红细胞体的有效药物分析.....................................................................283.2治疗猪附红细胞体的理想药物.....................................................................283.3猪附红细胞体的防治药物..............................................................................29第四章猪附红细胞体病的综合防治研究......................................................................291.材料与方法................................................................................................................301.1材料.................................................................................................................30ii 目录1.1.1实验动物................................................................................................301.1.2主要仪器................................................................................................301.1.3主要试剂................................................................................................301.2方法.................................................................................................................301.2.1相关试剂配制[22]..................................................................................301.2.2猪场防治措施.......................................................................................311.2.3临床症状观察和死亡情况分析...........................................................311.2.4病原实验室检测...................................................................................311.2.4.1猪附红细胞体病原的镜检：.....................................................311.2.4.2PCR法检测.................................................................................322.结果..........................................................................................................................322.1猪场发病和死亡情况.....................................................................................322.2发病猪治愈情况.............................................................................................322.3猪血液病原检测情况.....................................................................................333.讨论..........................................................................................................................333.1药物保健可以有效减少猪附红细胞体病的发生，是防控本病的有效途径................................................................................................................................333.2中草药对于预防猪附红细胞体具有一定的效果，可用于猪场猪附红细胞体病的防治............................................................................................................343.3应激是诱发猪附红细胞体病的主要因素之一，在猪应激时做好药物保健可减少本病的发生................................................................................................343.4减少猪群间机械传播猪附红细胞体病，可有效减少本病的发生.............34第五章结论....................................................................................................................35参考文献..............................................................................................................................36致谢......................................................................................................................................38作者简介..............................................................................................................................39iii 摘要摘要猪附红细胞体病在我国大部分地区广泛流行，已成为导致猪贫血、生产性能下降的重要传染病之一。本研究通过对赣州地区猪附红细胞体病进行流行病学调查，并筛选有效药物制定高效综合防治措施，结果如下：1、对赣州18个县（市、区)的40个年出栏1000头肉猪自繁自养猪场场中，选择30个猪场共收集到302个样本，分别对不同阶段猪群的猪附红细胞体感染情况，进行了流行病学调查。结果表明：PCR结合瑞氏染色法为最佳的实验室检测方法；猪附红细胞体病表现为高感染率、低发病率和死亡率、没有明显季节性成为流行新趋势；该病以混合感染、继发感染为主，是导致猪群感染本病后发病和死亡的主要因素。2、将40头感染发病猪分8组，每组5头猪，用不同药物进行治疗处理，结果显示：土霉素、强力霉素是防治猪附红细胞体病的理想抗生素，914A是治疗该病的高效药物，但其具有一定的毒副作用。3、本试验以3个年出栏2000头肉猪的自繁自养猪场，分成4组进行了猪附红细胞体病的防治措施研究。结果显示：药物保健可以有效减少猪附红细胞体病的发生，是防控该病的有效途径；应激是诱发猪附红细胞体病的主要因素之一，因此在天气变化、转栏时应及时添加强力霉素200g/吨，青蒿素、黄芪多糖、板蓝根复方提取物1000g/吨；减少猪群间蚊虫机械传播，可有效减少该病的发生。关键词：附红细胞体；赣州地区；流行病学；药物；综合防治I AbstractAbstractSwineEperythrozoonosisiswidlyprevalentinmostareasofourcountry,whichhasbecomeoneoftheimportantinfectiousdiseasesthatcausingtheswineanaemiaanddegradationofproductionperformance.ThisresearchinvestigatedtheepidemicofSwineEperythrozoonosisinGanzhouareaandfoundeffectivemedicineandformulatedeffectivecontrolmeasures.Resultsasfollowing:Firstly,302sampleswerecollectedfrom30pigfarmswhichwerechosenfrom40pigfamesthatproducing1000barrensowseveryyearin18countiesofGanzhou.TheinfectiousconditionofSwineEperythrozoonosisindifferentstagespigswereinvestigatedforepidemiology.Theresultsshowthat:ThePCRmethodcombinedwithray'sstainingisbestinlaboratorytesting,SwineEperythrozoonosisischaracterizedbyhighrateofinfection,lowmorbidity,mortalityandwithoutobviousepidemictrendofseasonal,andthediseasethatgivenprioritytowithmixedinfection,secondaryinfectionisprincipalfactorwhatleadtomorbidityandmortalityafterpigsinfected.Secondly,40infectedpigsweredividedeightgroups,eachgroupoffivepigs,andtreatedwithdifferentdrugs.TheresultsshowthatoxytetracyclineanddoxycyclinearebestantibioticstopreventandcureSwineEperythrozoonosis.914Aisahigh-efficiencymedicineoftreatthedisease,butwithcertainsideeffects.Thirdly,thisexperimentresearchthecontrolmeasuresofSwineEperythrozoonosisin3pigfarmswhichproduct2000pigseveryyear.Theresultdisplaythatthemedicinecaneffectivelyreducetheoccurrenceofthedisease,whichisaneffectivewayofpreventionandcontrolofthedisease.ThestressisoneofmainfactorstoinduceSwineEperythrozoonosis.sothefeedshouldadddoxycycline200g/ton,artemisinin,astragaluspolysaccharideandextractsfromradixisatidiscompound1000g/ton.Itcaneffectivelyreducethehappeningofthediseasetoreducemosquitomechanicaltransmissionacrosstheherdofswine.Keywords：eperythrozoonosis；Ganzhoucity；epidemiological；drug；comprehensivepreventionandcontrolII 第一章猪附红细胞体病的研究进展第一章猪附红细胞体病的研究进展1简介附红细胞体(Eperythrozoonsuis)是一种寄生于多种动物和人的红细胞表面或游离于血浆的人畜共患传染病病原体,人感染附红细胞体发病后表现为发热、乏力嗜睡、多汗等症状，感染严重者出现肝脾肿大、淋巴结肿大、贫血和黄疸等。猪感染附红细胞体后发病主要引起猪虚弱和贫血,导致生长缓慢,机体抵抗力下降，容易继发其它传染病；种猪可表现出繁殖障碍，诸如精子活力下降，母猪不发情、受胎率低、甚至流产和死胎等症状。其它动物如牛、羊、鸡等感染附红细胞体后根据感染严重情况可表现出不同的临床症状，一旦感染发病对生产性能的影响很大，因此，附红细胞体病是危害人畜健康的多发传染病。本病最早发生于美国，1932年，在当时Doyle把本病归类为猪的一种类立克次氏体病或类边虫病[1]。但是，本病的病原分类一直广受学者的争议，直到1950年Splitter将本病病原体正式命名为附红细胞体[2]。世界多地报道本病的发生，在我国1981年开始报道附红细胞病，发生于家兔[3]，相继在猪、绵羊、牛、兔、马、猫、犬、狐、鼠、鸟类、禽类等多种动物和人发现有附红细胞体的感染和发病。猪附红细胞体病最早报道于1982年[4]，由于近年来我国养殖业的快速发展，本病在大部分地区都有发病的相关报道，成为导致猪生产性能下降，降低养猪效益的重要传染病之一。由于附红细胞体是一种血液寄生虫，传染途径主要有接触传播、血源性传播、垂直传播，一些吸血昆虫诸如蚊子也是本病的主要传播方式之一，故在各种昆虫活动频繁的夏秋或雨水较多季节多发，也导致本病预防难度大。本病目前还没有疫苗用于预防，主要通过药物和饲养管理来对本病进行控制。鉴于本病的传播途径、感染动物的多样性、药物选择的局限性、疫苗的缺少等多种原因，本病的防控一直以来都是难点。2病原学2.1病原的历史来源及分类附红细胞体属典型的原核生物，起初认为附红细胞体属于原虫，后又归属霉形体目，现《伯杰氏细菌鉴定手册》，将其列为立克次体目，无浆体科，附红细胞体属。现今已知附红细胞体可分为绵羊附红细胞体、山羊附红细胞体、牛附红细胞体、牛温氏附红细胞体、猪附红细胞体、猪小附红细胞体、兔附红细胞体、鼠球状附红细胞体、猫附红细胞体、犬附红细胞体、鸡附红胞体和人附红细胞体等14种，不同种的附红细胞体都相对的特异性，都有相应的宿主，宿主特异性强。2005年，张浩吉等对病原的基因序列(16SrRNA)分析结果表明，猪附红细胞体不应属于立克次氏体，应将猪1 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究附红细胞体改名为猪嗜血性支原体[5]。2.2病原的生物学特性猪附红细胞体大小为0.25～1.3μm×0.5～2.5μm，其形态大体可有3种，球形、盘形、环形。未成熟附红细胞体呈球形，幼稚附红细胞体呈盘形，成熟附红细胞体呈环形。猪附红细胞体无明显的细胞器及核结构，形态结构有所差异，表现出多样性。一个红细胞上一般可附1～6个虫体，其中6～7个多见，被附着的红细胞变成齿轮状、菠萝状、星芒状或不规则形状(图1-1)。附红细胞体对苯胺色素易于着染，革兰氏染色阴性，姬姆萨染色呈紫红色(图1-2)，瑞氏染色呈淡蓝色(图1-3)。猪血液压片中附红细胞体具有运动性，能主动地前行、后退、扭转、翻滚或上下浮沉等运动[6]。猪附红细胞体为红细胞专性寄生，在人工培养基不能生长，也不能在血液外组织中人工培养。对理化因子抵抗力较弱，一般的消毒药均能杀死病原，如病原体在0.5%的石炭酸溶液37℃3h即可被杀灭。对低温抵抗力极强，猪附红细胞体在柠檬酸钠抗凝的血液中置4℃条件下可保存15天，在冰冻凝固的血液中可存活一个月，对青霉素类不敏感，而对强力霉素敏感。图1-1猪附红细胞体的吖啶橙染色荧光显微镜观察图1-2吉姆萨染色：红细胞被吉姆萨染色(A,C,E)和扫描电镜观察(B,D,F)（转引Groebel）液染成淡紫色，附红细胞体呈深蓝色附着于红细胞表面（转引自方满新）图1-3瑞氏染色：红细胞被染成淡蓝色，附红细胞体深蓝色着色较深（转引自方满新）2 第一章猪附红细胞体病的研究进展附红细胞体的遗传基因是双链DNA分子，Messick等[7]通过琼脂糖凝胶脉冲场梯度电泳研究对猪附红细胞体的基因序列进行了测序分析，该基因组长度为745kb，富含A/T碱基。邱松等[8]对猪附红细胞体进行蛋白分析研究，利用SDS-PAEG蛋白电泳对附红细胞体感染后的非洲绿猴肾细胞分析，结果表明附红细胞体存在三种不同分子量的蛋白，分别为18.4KD、25.0KD和45.0KD。近年来，广大研究人员为了更好地了解猪附红细胞体病，开始利用基因组学原理和技术对其全基因进行测序分析研究，取得了很好的研究成果。Messick等[9]在2011年终于获得了猪附红细胞体的全基因组序列，全长为742,431bp。并对该基因组进行了翻译表达分析，共编码约500个蛋白质，包括核苷酸合成酶类、蛋白质合成酶类、细胞结合蛋白、黏附素等，这些蛋白为猪附红细胞体侵袭宿主和致病能力的主要因子。并对某些蛋白酶和毒力基因进行了进一步的研究：亮氨酰氨肽酶（参与附红细胞体在宿主细胞内生长的关键酶）、毒力因子TrKa（抗血清的作用）、CvfA毒力因子（影响毒力基因表达）、RNA聚合酶（提高转录特异性，阻止宿主细胞的吞噬作用而引起机体的败血症）、MSG（类似于甘油醛3-磷酸脱氢酶，GAPDH）和α烯醇化酶构成复合体连接附红细胞体与红细胞——可促进红细胞裂解，使附红细胞体牢固地吸附在红细胞上[10]。3致病机理猪附红细胞体破坏红细胞，引起红细胞溶血，导致机体贫血，并诱发自身免疫系统疾病。附红细胞体感染后，在发生疾病时，会引起一种经凝集素介导的或与之有关的自身免疫溶血性贫血。在猪附红细胞体和红细胞膜相互作用过程中，红细胞膜被破坏而发生生物学功能的改变。附红细胞体吸附红细胞后，细胞膜的通透性增加和膜的脆性增加，红细胞易于溶解和破裂，从而导致被遮蔽的抗原暴露出来或者己有抗原发生变化，致使被自身免疫系统视为异物。同时，机体产生自身抗体即M型冷凝集素[11]，并攻击被感染的红细胞而发生溶血。感染导致II型过敏反应，并进一步引起红细胞的免疫性溶解，使红细胞数减少，血红蛋白下降，从而导致机体贫血。但在急性阶段引起贫血的机制仍不完全清楚。猪附红细胞体引起耳尖、尾以及四肢末端、腹下等部位明显地发红(图1-4、5、6)。图1-4图1-5图1-63 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究M型冷凝集素能否沉积在红细胞表面并引起红细胞的凝集关键在于温度，如果温度较高，这种冷凝集素就会从红细胞表面脱落；由于体表温度比身体中心的温度低，冷凝素会从红细胞表面脱离从而聚集在体表，使外周毛细血管中形成微凝血和血栓，局部血管堵塞，表现出局部黏膜和表皮出血、尤其是耳尖、尾以及四肢末端、腹下等部位明显地发红[12]。脏器组织血栓、炎症、变性、水肿、坏死等，主要是由于微循环功能出现障碍，附红细胞体在红细胞表面表达大量的黏附蛋白（多为脂蛋白），使得红细胞之间出现很强的黏附作用，导致血液黏度增高。机体肝、脾、肺、肾等脏器的病理损伤[13]。由于附红细胞体感染机体后，导致血液中NO和丙二醛含量升高，超氧化歧化酶活性降低，血浆NO自由基和氧自由基的大量蓄积，导致机体抗氧化能力降低，机体抵抗能力下降，导致机体脏器出现病理损伤；附红细胞体还会过度消耗葡萄糖，加剧了代谢产物乳酸的增加积累，引起酸中毒，从而细胞变性、肿胀和坏死。急性感染附红细胞体会出现严重的血凝障碍并引起出血；因病原体过量繁殖及其新陈代谢，使得机体的糖分解过多，从而出现低血糖，隐性感染动物血糖浓度下降25%左右，急性发病则更严重得多，患病动物往往因为血液中乳酸和丙酮酸含量上升从而出现酸中毒，感染后的红细胞携带氧气能力降低，影响肺脏气体交换，常导致机体呼吸困难[14]。近年来研究发现红细胞能够参与免疫调节，动物一旦感染附红细胞体病后，免疫功能下降，继发感染增加，有时不一定表现临床症状，在机体抵抗力下降或处于应激时附红细胞体感染率上升，感染的红细胞比例达到一定程度时才会引起发病。脾脏在生成免疫活性细胞、吞噬和清除血液中异物方面有不可估量的作用。当红细胞表面寄生有猪附红细胞体时，红细胞失去其变形性和可塑性，导致长时间在脾窦内滞留，从而被免疫活性细胞吞噬和清除。当脾脏被切除后，丧失这种功能，机体极易感染猪附红细胞体并迅速繁殖，同时加速了溶血性贫血的发生和黄疸及血红蛋白尿的形成。脾脏在机体抵抗猪附红细胞体的过程中发挥着比较重要的作用[15]。4临床症状与病理变化不同阶段的猪发病表现不同，一些隐性感染或机体抵抗力强的猪在感染猪附红细胞体后并不会表现出明显的发病症状，只是出现少量的机体抵抗力下降和少部位的皮肤发红症状。急性发病猪表现为体温急剧上升，达41℃以上，有些病情严重的猪可以高达42℃以上；精神萎靡，食欲减退以至废绝；全身皮肤发红，故又把本病称为猪“红皮病”（图1-7），皮肤比较典型的症状为毛孔出血，特别严重的甚至用手背摸一下猪皮肤，能够明显感受到手背上有血液；耳部、四肢末端、腹下等处皮肤由于血液淤血呈现出紫色瘀血斑；血液凝固不良，一旦出现伤口，血流不止，且血液呈暗红4 第一章猪附红细胞体病的研究进展色；猪贫血严重，由于大量红细胞的破坏，可视黏膜出现黄染，眼角有黄色粘稠分泌物（图1-8）；保育猪出现明显的呼吸道症状，一旦继发别的传染病，呼吸道疾病更加严重；大便干燥，有一些仔猪排黄色稀便。怀孕猪一旦感染本病，严重者除了具有保育猪出现的一些症状外，还会出现繁殖障碍，发生流产、早产，产死胎或木乃伊胎[16]。图1-7图1-8发病猪剖检病变主要表现为：皮肤黄染、毛孔出血、皮下水肿（图1-9）；心冠脂肪处有出血点或水肿；肺部出现水肿，可有大面积的出血和淤血、并呈现出肝样大理石样变（图1-10），部分病猪表现为胸膜炎，气管、支气管中常有白色泡沫样黏液；全身淋巴结明显肿大，切面多汁，棕黄色；脾脏色黑、质软，有不同程度肿大，并在周边有锯齿状凸起；肝脏也出现黄染，有出血点或斑块（图1-11）；肾脏有明显的针尖状出血点，表现为皮质出现细小、散在出血点[17]。图1-9图1-10图1-115 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究5诊断方法对猪附红细胞体病的诊断，应根据流行病学调查、临床症状和病理变化对发病猪进行疑似病例判断，如需确诊应进行更进一步的病原学诊断或血清学诊断。本病的诊断方法主要包括形态学诊断，补体结合试验，荧光抗体试验，间接血凝试验，酶联免疫吸附试验，聚合酶链式反应（PCR）技术。这些方法各有优缺点，应根据具体情况选择最优的诊断方法。形态学诊断：包括直接镜检方法和血液涂片染色镜检，直接镜检即采取末梢血液制成血液滴片，在显微镜下直接观察附红细胞体形态，作为判断猪是否感染附红细胞体的依据。鲜血镜检作为一种直观的检测方法，已经成为基层兽医站、临床一线检测附细胞体病的一种主要方法[18]。具体操作方法简单实用，通过取疑似病猪采血后抗凝处理，滴于载玻片上，加等量的生理盐水稀释，在400倍显微镜或1000倍油镜下观察，如红细胞边缘变形为齿轮状、星芒状或其它形状的不规则形态，且有数量不等的附红细胞体附着在红细胞表面，使红细胞在血浆中振颤或上下、左右摆动、伸展、翻滚、扭转运动（图1-12、13、14、15）。图1-12图1-13图1-12、13患病2天，体重75kg，育肥猪鲜血压片镜检图1-14图1-15图1-14、15患病7天，体重75kg；育肥猪鲜血压片镜检。6 第一章猪附红细胞体病的研究进展血涂片染色镜检：抗凝血涂片干燥后，用染色液进行染色镜检，多种染料都可对其进行染色，但经常采用瑞氏染色或姬姆萨染色，瑞氏染色在同一视野中可见呈紫红色、褐黄色、深褐色的附红细胞体，也可见到强折光性发亮的圆形小体；姬姆萨染色和瑞氏染色相同。也可用苯胺色素，革兰氏染色阴性。血清学试验主要有补体结合试验，荧光抗体试验，间接血凝试验，酶联免疫吸附试验（ELISA)。这些检测方法主要作为定性依据，作为猪是否感染猪附红细胞体的血清学依据，但存在血清学阴性的猪可能是病原携带者，并且在进行血液接触时可将病原传播给其它猪。分子生物学检测：利用PCR技术检测猪附红细胞体，最低检测基因组量为450pg，对脾脏切除猪人工感染后24h即可检测出，1994年研究人员对猪实验性感染猪附红细胞体后血液样品进行了PCR检测和间接血凝试验抗体检测比较，证实PCR方法优于间接血凝试验，且青年猪感染后抗体产生少。对附红细胞体的分子生物学检测和诊断，不仅为临床上更好的控制该病提供了很好的保障，也为进一步研究该病的发病机制提供了很好的手段，对其他动物的附红细胞体病的研究也是很好的借鉴[19]。以上三种方法进行比较分析结果如下：1、PCR技术是最为灵敏的检测方法，但对检测人员的素质、检测仪器和环境要求较高，在一般的实验室是无法进行该技术的检测的；同时，PCR技术由于高度敏感性，且是对病原进行检测，猪附红细胞体病很多是隐性感染，检测到猪体内有附红细胞体但并不代表就是猪附红细胞体病，这是应该值得注意的问题。但PCR技术的高敏感性对于猪附红细胞体病的流行病学调查具有重要的价值。2、血清学检测包含多种方法，不同种类的方法检测优缺点不尽相同，其灵敏度低于PCR技术，但对于检测疾病具有重要意义，病原携带者一般并不能检测出血清学反应。3、直接形态学检测方法，技术含量底普及度高，对人员、设备和环境的要求较低，在一般的实验室即可开展。因此，此法对于猪附红细胞体病的诊断有较大的帮助，一般的猪场都配有显微镜，可以进行本病的一般形态学检查。但形态学检查也存在一些局限性，通过形态学检测到附红细胞体并不代表就是猪发生了猪附红细胞体病，这些值得广大技术人员的注意。7 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究6流行病学猪附红细胞体病作为一种寄生于红细胞的寄生虫性猪传染病，世界各地均有本病的报道，在中国已经有20多年的流行病学历史，本病首先在兔中发现兔附红细胞体感染后发病，随后在猪身上发现有猪附红细胞体的感染发病。至今，我国大部分省市都有本病的报道，危害着养猪业的健康、持续发展。猪附红细胞体病的传播主要是通过血液传播，传播途径有蚊虫等媒介叮咬血源性传播、猪群间通过注射器和阉割等传播、母源传播等多种传播方式。附红细胞体感染的宿主很多，牛、羊、兔、猪、鸡和人都可感染，但大部分是隐性感染。有人做过调查[20]，各种阶段猪的感染率达80%～90%;人的感染阳性率可达86%;而鸡的阳性率更高，可达90%。但除了猪之外的其它动物发病率不高。本病在我国大部分地区流行性非常广泛，特别是在南方高热高湿的地区，夏季温度高，蚊子等媒介动物繁殖旺盛，近90%的县都有发生本病的病例，而隐形感染率则高达100%。鉴于本病的多种传播途径，以及多种动物都可成为附红细胞体的宿主，因此，本病几乎在所有猪群中都存在，很多没有出现典型临床症状的猪群主要表现为隐性感染和病原携带者。近年来，猪的附红细胞体病的流行呈现加重的趋势，很多地方发生本病，导致贫血和生产性能下降，而且容易继发感染其他疾病，使得养殖户经济损失较大。由于人能感染本病，引起了广大畜牧兽医工作者和医学工作者的关注。本病主要发生于温暖季节，夏季发病较多，冬季相对较少。但由于近年来猪免疫抑制性疾病的流行，猪群免疫力低下，多种病原混合感染，冬春季节也容易发生本病。猪附红细胞体病的发生往往与机体免疫力下降、动物代谢机能发生异常有关。因此，猪附红细胞体病的发病模式主要包括：一、应激因素。猪群在夏季炎热的时候，受到的热应激大，机体往往会出现免疫力降低的现象，加上夏季媒介动物如蚊子等繁殖旺盛，猪群容易发生猪附红细胞体病。同时，在免疫注射、天气骤变等应激因素存在下，猪的饲养管理没有到位，猪群也很容易发生猪附红细胞体病。二、猪群感染了其它传染病，特别是免疫抑制性疾病。如果猪群感染了猪瘟病毒、圆环病毒、猪蓝耳病病毒等病毒性传染病时，猪机体处于相对免疫力低下的状况，猪附红细胞体很容易趁虚而入，发生本病，一旦发生本病，可加剧猪感染其它疾病的机会。三、环境差，附红细胞体病原多，猪机体不能抵御感染。7防治研究目前没有专门的疫苗用于本病的预防，一般将支持疗法和预防性措施结合起来治疗。因为附红细胞体病一般呈隐性感染，并且没有更好的动物模型和培养手段，因此该病原的生活史、传播媒介、感染途径、发病机制、生活史、抗原的免疫原性、免疫诊断方面研究进展较慢，相比较而言，该病的临床诊断和治疗报道较多[7]。有研究表8 第一章猪附红细胞体病的研究进展明附红细胞体是在机体的骨髓中繁殖，再被释放到血液中，从而，许多有效药物不能彻底杀灭附红细胞体，只要停药，就会复发，这使得防治附红细胞体病很困难，也会对附红细胞体的治疗药物效果评价带来许多主观臆断[21]。目前有多种药物可以治疗猪附红细胞体病，但是真正有特效并能将虫体完全杀灭的药物还没有，特别是对较长病程和有严重症状的猪疗效均不好，现在应用较多的药物有贝尼尔、土霉素、黄连素等[14]。9 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究第二章赣州地区猪附红细胞体病的流行病学调查猪附红细胞体病在我国大部分地区流行非常广泛，特别是在南方高热高湿的地区，夏季温度高，蚊子等媒介动物繁殖旺盛，容易感染本病，导致贫血，引起生产性能下降，损害养殖户经济效益。流行病学调查对于了解和掌握某一传染病在某一地区的发病情况、流行趋势、传播途径、发病规律等特征，为指导当地生猪生产和疾病防控具有重要的指导意义。赣州位于我国南方亚热带地区，夏季高热高湿，蚊虫多，容易发生猪附红细胞体病，同时，赣州地区养猪业发达，大多数是规模猪场、年出栏量较大；因此，对赣州地区猪附红细胞体病进行流行病学调查，有助于指导基层兽医部门和猪场养殖技术人员更好地对本病进行预防，降低本病对养猪业的危害。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物和病原覆盖赣州18个县（市、区)的40个年出栏1000头肉猪自繁自养猪场哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、妊娠母猪、后备母猪、种公猪；猪附红细胞体标准病原由中国动物卫生及流行病学中心提供。1.1.2主要仪器紫外分光光度计Cary50Probe(Varian公司，美国)；梯度PCR仪HybaidPX2（Bio-Rad公司，美国）；核酸蛋白检测仪（Beckman公司，美国）；高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）；低温高速离心机（郑州中谱仪器设备有限公司）；荧光显微镜（上海赛默科技生物发展有限公司）；酸度计（梅特勒托利多国际贸易（上海）有限公司）；光学显微镜（上海赛默科技生物发展有限公司）；电子天平（常州万泰天平仪器有限公司）；磁力搅拌器（常州高德仪器制造有限公司）；无菌操作台（上海康路仪器设备有限公司）；振荡器（常州高德仪器制造有限公司）；微量移液器（德国BRAND公司）；压力蒸汽灭菌器（北京同德创业科技有限公司）；超纯水制备机（上海赫恩实业有限公司）；鼓风干燥箱（上海喆图科学仪器有限公司）。1.1.3主要试剂磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸、葡萄糖、Giemsa染料、瑞氏染料、NaCl、葡萄糖、甲醇、EDTA等试剂购置于赣州天健医疗器械公司；猪瘟病毒抗体ELISA试剂盒、猪蓝耳病病毒抗体ELISA试剂盒、猪蓝耳病毒RT-PCR检测试剂盒、伪狂犬抗体ELISA试剂盒均购置武汉科前生物科技有限公司；猪附红细胞体ELISA检测试剂盒购置于通蔚试剂（上海）有限公司。10 第二章赣州地区猪附红细胞体病的流行病学调查1.2方法1.2.1相关试剂配制[22]0.15mol/LpH7.2PBS洗涤液l：将Na2HPO4·12H2O19.34g，KH2PO42.86g和NaCl4.25g溶于蒸馏水，调pH值并定容至1000mL，高压灭菌20min，4℃冰箱保存备用。0.15mol/LpH7.2PBS洗涤液2：将Tween-20和EDTA分别按0.15％和1.0％加入到0.15mol/LpH7.2PBS洗涤液1中，高压灭菌20min，4℃冰箱保存备用。阿氏液：将葡萄糖2.05g，氯化钠0.42g，柠檬酸钠0.80g溶于100mL蒸馏水，10％柠檬酸调节pH至6.1，过滤，分装，高压灭菌10min，4℃冰箱保存备用。姬姆萨染色液(Giemsa)：将姬姆萨染料粉0.69g溶解于5mL甘油，置55℃~60℃水浴2h后，加50mL甲醇，静置24h。瑞氏染色液：将瑞氏染色试剂0.1g和lmL甘油置于研钵中混匀并研磨均匀后溶于60mL中性甲醇，盛于棕色广口瓶，静置1周。1.2.2调查范围与对象赣州18个县（市、区)的40个年出栏1000头肉猪自繁自养猪场进行流行病学调查，分别对猪场各阶段（哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、妊娠母猪、后备母猪、种公猪）猪附红细胞体感染和发病情况进行调查。1.2.3病料采集结合流行病学调查、临床症状和病理剖检变化，对疑似猪附红细胞体病的病猪进行病料采集。分别采取血液、脾脏、肝脏、肾脏、肺等病变明显的内脏器官，低温保存。检测猪附红细胞体的血液用肝素钠做抗凝处理，需要进行细菌分离鉴定培养的进行细菌分离培养。1.2.4实验室检测1.2.4.1猪附红细胞体的检测1.2.4.1.1镜检法[23]分别采取以下不同的检测方法对检测样本进行检测，比较不同检测方法的检出率和优劣。A、直接镜检法：用吸管吸取新鲜的抗凝血l滴加5mL生理盐水混匀，吸取1滴于载玻片上，加盖玻片，置高倍镜下观察。若红细胞失去球形立体形状，边缘不整而呈齿轮状、星芒状、不规则多边形等扁平样形状，虫体聚集在红细胞周围或膜上，呈球形、逗点形、杆状或颗粒状，来回调微可见虫体有一定的折光度，就判定为阳性。B、直接涂片法：用吸管吸取新鲜的抗凝血少许置载玻片上推成薄层，放在显微镜高倍下直接观察。若视野中虫体呈球形、逗点形、杆状或颗粒状，有附红细胞体寄生的细胞成菠萝状、锯齿状和星状等不规则形状，就判定为阳性。11 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究C、革兰氏染色法：用吸管吸取新鲜的抗凝血少许置载玻片上推成薄层，用革兰氏染色法进行染色，放在显微镜高倍下观察，猪附红细胞体革兰氏染色阴性，成红色。若看到虫体呈球形、逗点形、杆状或颗粒状的附红细胞体，就判定为阳性。D、瑞氏染色法：取鲜血的抗凝血少许置于载玻片上推成薄层，制成血膜片自然干燥后，盖上一块比涂抹点略大的清洁滤纸片，然后在其上小心滴加瑞氏染色液，染色3～5min，加等量PH6.4的磷酸盐缓冲液(或等量超纯水)轻轻晃动玻片,均匀静置5分钟，再直接用水冲洗，吸干或烘干。放置在油镜下观察，视野中有形态不一的附红细胞体，并来回微调具有折光性，可判定阳性。E、姬姆萨染色法：血片自然干燥后，经甲醇固定并干燥后，浸入姬姆萨染液中，染色30min以上，取出水洗．吸干或烘干放置在油镜下观察，视野中有形态不一的附红细胞体，并来回微调具有折光性，可判定阳性。判定标准（以上4种直接镜检法）猪附红细胞体对红细胞感染率在10％以下定为+，10％～50％定为++，50％～75％为+++，75％以上为++++。高倍镜下观察红细胞分布区20个视野没有看到猪附红细胞体，红细胞形态正常则判定为阴性。1.2.4.1.2ELISA检测猪附红细胞体ELISA检测试剂盒购置于通蔚试剂（上海）有限公司，按照说明书对具有代表性的100个样本进行ELISA检测，判断其阳性率，参考其它检测方法进行对比。1.2.4.1.3PCR法检测委托华中农大检测中心进行检测1.2.4.2其它病原的检测猪瘟和伪狂犬的检测通过ELISA检测试剂盒进行检测；猪蓝耳病除了通过ELISA检测试剂盒进行检测外，还通过PCR法检测区分高致病蓝耳病和经典蓝耳病；猪副嗜血杆菌、放线杆菌、链球菌等细菌的检测，通过分离鉴定和生化试验进行检测[24]。以上病原的检测都送往华中农大检测中心进行检测。2结果与分析2.1五种镜检检测方法的比较对新鲜血液用PCR检测结果为阳性的100个样本，分别用五种不同镜检检测法进行复检。结果如表2-1。从表中可以看出：不同的检测方法检测结果有明显不同，以上5种镜检方法都有未能检出的样本，这说明镜检法检测猪附红细胞体存在漏检的现象，这可能是由于镜检法容易受检测人为因素的影响。12 第二章赣州地区猪附红细胞体病的流行病学调查表2-1猪附红细胞体不同镜检法的检出率比较Table2-1SwineEperythrozoondifferentmicroscopymethod—++++++++++直接镜检法1015253515直接涂片法1112273515革兰氏染色法812283616瑞氏染色法510303817姬姆萨染色法612323515虽然以上五种镜检法都有漏检样本，但可以明显看出检出率高低顺序为：瑞氏染色法>姬姆萨染色法>革兰氏染色法>直接镜检法>直接涂片法。瑞氏染色法和姬姆萨染色法明显优于其它镜检检测方法。2.2镜检法、ELISA和PCR检测的比较对30个待检测新鲜血液样本和20个4℃保存1个月的血液样本分别进行进行瑞氏染色法镜检法、ELISA和PCR检测。检测结果如下表2-2。表2-2检测血液样本检测结果Table2-2testingbloodsamplestestresults30个待检测新鲜血液样本20个4℃保存1个月的血液样本检测结果瑞氏染色法ELISAPCR瑞氏染色法ELISAPCR阳性20242821719阴性10621831从上表中可以看出三种检测方法检出率：PCR法>ELISA>瑞氏染色法；不同的检测方法对样本的要求不同，从20个4℃保存1个月的血液样本的检测结果可以看出，瑞氏染色法对待检样本的要求较高，而PCR法要求则相对较低。镜检法一般要求新鲜血液，而PCR法和ELISA一般不受影响。因此，镜检法虽然对设备和人员的要求相对较低，而且检测费用低廉，但一般用于新鲜血液的检测，如果不能立即检测的样本，则应该采用ELISA或PCR法。2.3不同内脏器官猪附红细胞体的检测率比较对50个疑似猪附红细胞体病的病猪，分别采集血液、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏，用PCR法进行检测。检测结果如下表2-3。从以上表中结果可以看出：不同内脏猪附红细胞体病的检测率均有所不同，检出率：血液>脾脏>肝脏>肾脏>肺脏>腹股沟淋巴结。13 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究表2-3不同内脏器官猪附红细胞体病检出率Table2-3differentinternalorgansofSwineEperythrozoonosisdiseasedetection检测各内脏器官结果血液脾脏肝脏肺脏肾脏腹股沟淋巴结阳性504946434542阴性0147582.4不同地区猪附红细胞体发病和流行情况2014年1月1日至2014年12月份期间，收集到送检猪场30个，共计302个样本，这些样本采集新鲜血液进行瑞氏染色镜检，其中发生镜检阳性的猪附红细胞体病样本抽取有代表性的部分样本进行PCR确诊；对于一些未有明显猪附红细胞体病的猪样本直接进行PCR检测。这些猪场分别覆盖赣州市18个县（市、区），其中定南（2个）、龙南（1）、全南（1）、寻乌（1）、安远（2个）、信丰（2个）、大余（2个）、崇义（1）、上犹（2）、南康（3个）、章贡（1）、兴国（1个）、于都（2）、瑞金（2个）、宁都（2个）、石城（2）、会昌（1）、赣县（2）。结果如下表2-4：表2-4不同区域猪附红细胞体发病和流行情况Table2-4differentregionsoftheSwineEperythrozoonosisandepidemicdisease总计阳性阴性发病数死亡数带虫率发病率死亡率定南2221112695%55%27%龙南10915290%50%20%全南88052100%63%25%寻乌10916290%60%20%安远2120113595%62%24%信丰19190169100%84%47%大余1817113894%72%44%崇义121025283%42%17%上犹191636184%32%5%南康31301251497%81%45%章贡77042100%57%29%兴国121115292%42%17%于都2119216790%76%33%瑞金19190137100%68%37%宁都2118311486%52%19%石城2019112595%60%25%会昌121119592%75%42%赣县2018212590%60%25%总计302281211888893%62%29%注：带虫率=阳性数/调查总样本数；发病率=发病数/调查总样本数；死亡率=死亡数/调查总样本数。14 第二章赣州地区猪附红细胞体病的流行病学调查从上表中可以看出赣州18个县（市、区）都有猪附红细胞体病的存在，而且猪附红细胞体的猪群带虫率高达93%，发病率为62%，死亡率29%。这说明猪附红细胞体在赣州地区流行很广，几乎大部分猪场的猪群体内都含有猪附红细胞体，成为广泛的带虫者；但发病率不高，并不是所有的带虫猪都会发病；死亡率也不高。各县市区虽然都有本病的存在，但存在明显的区别。信丰、大余、南康、瑞金、于都、会昌的发病率和死亡率明显高于其它区域，宁都、兴国、上犹、崇义、龙南则明显低于其它区域，尤其是上犹。信丰、大余、南康都是养猪密度大，且集约化较高的区域，所以本病的发病率和死亡率都较高；而于都虽然集约化程度不高，但养猪总量大，而且会昌、于都靠近养猪大县。而作为赣州地区集约化程度很高的定南为什么本病的发病率和死亡率都不是太高，这可能是由于定南作为我市主要的养猪发达区域，受到广东省的影响，养殖理念较先进，平时药物预防保健做得较好，本病得到较好的控制；定南的本病带虫率为95%，更加印证了这个原因。上犹、崇义、宁都这3个县带虫率低于90%，这可能是由于这些县处于养猪密集度低，而且山清水秀环境好，远离养殖密集区域；虽然宁都也是养殖大县，但主要养殖产业为三黄鸡，且面积大、总量大，但养猪集约化低。2.5不同阶段的猪附红细胞体发病和流行情况送检的30个猪场共计302个样本中，包括种公猪、母猪、哺乳仔猪、保育猪、育肥猪。各阶段的猪附红细胞体发病率、死亡率、带虫率等结果如下表2-5。表2-5不同猪群猪附红细胞体发病和流行情况Table2-5differentswineherdofSwineEperythrozoonosisandepidemicdisease总计阳性阴性发病数死亡数带虫率发病率死亡率种公猪3130113397%42%10%母猪5049122698%44%12%哺乳仔猪76688593389%78%43%保育猪73676542792%74%37%育肥猪70675401993%56%26%注：带虫率=阳性数/调查总样本数；发病率=发病数/调查总样本数；死亡率=死亡数/调查总样本数。从上表中可以看出：1、种公猪和母猪的猪附红细胞体病带虫率明显高于哺乳仔猪、保育猪、育肥猪，表现为：母猪>种公猪>育肥猪>保育猪>哺乳仔猪；这可能是由于蚊虫叮咬使得种公猪和母猪隐性感染率高，而哺乳仔猪由于药物预防保健以及和其它阶段猪的接触少导致其带虫率低于其它阶段的猪。2、发病率和死亡率则表现为：哺乳仔猪>保育猪>育肥猪>母猪>种公猪。哺乳仔猪由于抗病能力差，一旦感染猪附红细胞体，危害明显高于其它各阶段的猪。15 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究2.6不同规模猪场猪附红细胞体发病和流行情况送检的30个猪场具体包括自繁自养母猪场500头母猪以上6个、100～500头母猪以上10个、100头肉猪以上肉猪场6个、100头以下肉猪场8个；不同规模猪场带虫率、发病率和死亡率，结果如表2-6。表2-6不同规模猪场猪附红细胞体发病和流行情况Table2-6differentscaleSwineSwineEperythrozoonosisandepidemicdisease总计阳性阴性发病数死亡数带虫率发病率死亡率500+母猪73694411895%56%25%100～500头母猪1171143632397%54%20%100+肉猪52475382390%73%44%－100肉猪60519462485%77%40%注：带虫率=阳性数/调查总样本数；发病率=发病数/调查总样本数；死亡率=死亡数/调查总样本数。从表中可以看出：1、带虫率检测结果：100～500头母猪猪场>500+母猪>100+肉－猪>100肉猪；集约化养殖比小规模养殖猪附红细胞体的阴性感染率更高，这可能是由于猪附红细胞体病的多种传播方式导致猪群内容易出现广泛的隐性带虫猪。2、发－++病率为：100肉猪>100肉猪>500母猪>100～500头母猪猪场；结合猪群带虫情况分析，这说明集约化程度越低，饲养管理和疾病防控等技术受限，导致猪附红细胞体病的发病率更高。3、死亡率为：100+肉猪>100－肉猪>500+母猪>100～500头母猪猪场；导致这个现象的原因可能与集约化程度高低、饲养管理和疾病防控等技术水平相关。本结果中表明：猪群集约化程度与猪群猪附红细胞体的隐性感染成正相关，集约化程度越高，带虫率越高；猪附红细胞体病的发病和死亡与饲养管理和疾病防控等技术水平成负相关，低下的饲养管理水平和疾病防控技术容易导致本病的高发病和高死亡。2.7不同季节猪场猪附红细胞体发病和流行情况在188个猪附红细胞体病的病例样本中，春、夏、秋、冬不同季节的发病猪数量和死亡情况，如下表2-7。16 第二章赣州地区猪附红细胞体病的流行病学调查表2-7不同季节猪附红细胞体发病和流行情况Table2-7differentseasonsSwineEperythrozoonosisyandepidemicdisease各季节春节夏季秋季冬季发病数36943127死亡数15441316死亡率42%47%42%59%注：本表中的死亡率=死亡数/发病数.从上表中可以看出：1、猪附红细胞体病春、夏、秋、冬四个季节的发病数为夏季>春季>秋季>冬季；但死亡率为冬季>夏季>春季和秋季；2、冬季猪附红细胞体病发病数占整个发病数的14%（27/188），死亡率更是达到59%。冬季无蚊虫，猪附红细胞体病的传播媒介受到限制，因此冬季猪附红细胞体病应该很少发病；而本研究结果中冬季本病的发生占总发病数的14%，而且死亡数占发病数的59%，这值得广大研究者的研究。结合猪附红细胞体病的高带虫率来看，媒介传播应该不是本病的唯一重要传播途径，一些器械性传播也是本病的重要传播途径；同时，本病的发生还有别的一些因素，如应激、继发感染、免疫抑制性疾病的存在等，这些造成了本病的流行规律和以前有很大的不同。2.8猪附红细胞体病的发病模式调查本研究中对于发病猪场的猪群，除了对猪附红细胞体进行检测外，还根据临床症状和病理变化对其它疑似猪瘟、蓝耳病、伪狂犬、猪副嗜血杆菌、弓形虫等重要疾病进行检测，以掌握猪附红细胞体病与其它疾病的综合发病规律，研究本病的发病模式。在经过确诊为猪附红细胞体病的188个病猪和88个死亡猪中，根据病猪的发病特点和死亡猪的病理剖检变化，对疑似其它疾病的猪群采取ELISA或PCR检测方法进行其它疾病的确诊，病原为细菌的进行分离培养和生化指标鉴定。结果如下表2-8表2-8猪附红细胞体混合感染结果Table2-8SwineEperythrozoonosismixedinfectionresults各种传染病合计HCPRPRRSPCVHpsAPPSSTPMpEDAR其它无发病猪1884116232131211916212151310死亡猪881981571385433010注：猪瘟（HC）、猪伪狂犬（PR）、猪蓝耳病（PRRS）、猪圆环病毒（PCV）、猪副嗜血杆菌（Hps）、猪传染性胸膜肺炎（APP）、猪链球菌（SS）、猪弓形虫病（TP）、猪支原体病（Mp）、猪大肠杆菌病（ED）、猪萎缩性鼻炎（AR）。从上表中可以看出：猪附红细胞体病往往都是混合感染为主，单纯的猪附红细胞体病发病猪群很少，17 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究本研究中只有10例是本病单一感染发病的；同时，在本研究中发现，单一感染本病的发病猪群中，如果没有继发感染，死亡数为0。猪附红细胞体病和其它传染病混合感染发病时，并不仅仅是某一种传染病，存在多种病原混合感染的情况。猪附红细胞体病和其它传染病混合感染发病时，常见为猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒、猪副嗜血杆菌、猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌、猪伪狂犬、猪弓形虫病、猪支原体病，最多为猪瘟。本病与其它疾病混合感染的死亡猪群中，猪瘟、蓝耳病、猪副嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎较多。猪免疫抑制性疾病（猪蓝耳病、猪圆环病毒）的感染，促进了猪附红细胞体病的发生，这是由于猪免疫抑制性疾病损害了猪免疫系统，机体抵抗力下降，从而诱发了本病的发生；猪支原体病虽然不是典型的免疫抑制性疾病，但由于其损害了猪的呼吸系统，破坏了黏膜免疫屏障，导致猪群容易诱发疾病。一些危害较大的疾病如猪瘟，一旦猪群因为免疫接种没有做好，猪瘟疾病的发生容易诱发本病；本病还容易和弓形虫混合感染发病，且能引起死亡；常见的危害较大的细菌性疾病也是本病的主要混合感染性疾病，如猪副嗜血杆菌病和猪传染性胸膜肺炎。3讨论3.1猪附红细胞体病的诊断方法猪附红细胞体病作为一种寄生在红细胞的原虫，其诊断是预防和治疗本病的基础，如何更加高效、准确地对发病猪群进行本病的诊断，是研究人员一直关注的焦点。随着免疫学技术和分子生物学技术的快速发展，运用这些先进技术在畜禽疾病防治中有助于促进畜禽疾病诊断和防控的快速发展。猪附红细胞体病的常规检测法主要为镜检法，包括瑞氏染色法、姬姆萨染色法、革兰氏染色法、直接镜检法、直接涂片法等方法，这些检测方法具有操作简便、快速、对设备和人员要求较低，易于在基层兽医运用。以前对本病的试验室检测主要就是通过镜检来开展。本研究中发现这五种镜检法中瑞氏染色镜检法的检出率最高，适合基层实验室检测猪附红细胞体病。但是，瑞氏染色镜检法也有部分未能检测出的样本，而且对样本的要求较高，只能检测新鲜血液样本，一旦一些不能提供新鲜血液，本病的检测就无从开展。以上这些缺点使得瑞氏染色镜检法检测本病的实验室诊断仍然具有很大的局限性。ELISA是运用最广、效果最佳的免疫学检测法之一，具有灵敏度高和对检测样本要求不高等优点；PCR技术是目前检测疾病病原中灵敏度最高、特异性最强的检测方法之一，由于近年来该技术在兽医诊疗技术中的广泛运用，运用PCR技术在检测18 第二章赣州地区猪附红细胞体病的流行病学调查猪附红细胞体病的研究中已经取得了较大进展。本研究中发现PCR检测法和ELISA在检测猪附红细胞体病中检出率都明显高于镜检法，不仅能够检测新鲜血液样本，而且能够检测其它内脏器官和保存的病料，因此，这两种方法是猪附红细胞体病比较理想的检测方法。PCR检测法高于ELISA,但由于该技术的高敏感性和猪附红细胞体病的隐性感染的特点，运用PCR法检出猪感染有附红细胞体，也并不代表猪发生附红细胞体病。因此，运用PCR技术诊断猪附红细胞体病应结合临床症状和病理剖检变化来进行，PCR检测阳性、有具有明显的猪附红细胞体病的临床症状和病理变化才能确诊为猪附红细胞体病。不同的内脏器官，猪附红细胞体病的检测率并不相同，本研究结果发现，猪血液中的检出率最高，而且结合上述研究结果（血液样本检测猪附红细胞体病的可操作性），检测血液样本是检测猪附红细胞体病的理想部位。因此，猪附红细胞体病的理想诊断方法：根据发病猪的临床症状和病理剖检变化，确定为疑似本病。如果在基层兽医站或猪场，可采取瑞氏染色镜检法进行本病的初步确诊。如果需要确诊，应该采取ELISA或PCR检测，PCR检出率相对更高。3.2猪附红细胞体病的流行特点猪附红细胞体病在猪群中流行范围广，是赣州地区影响养猪生产效益的重要传染病之一。猪附红细胞体的流行具有明显的新趋势：高感染率、低发病率和死亡率、没有明显的季节性、发病和死亡受猪群免疫和抗病能力的影响。猪附红细胞体在赣州地区流行很广，几乎大部分猪场的猪群体内都含有猪附红细胞体的感染，特别是养猪大县和饲养管理水平较差区域的猪场；养殖的集约化程度与本病的发生具有一定的相关性，集约化程度越高的猪场，虽然隐性感染率非常高，但发病和死亡数少；采用先进的饲养管理和疾病防治技术能够显著降低本病发病和死亡；抗病能力差的哺乳仔猪和保育猪受本病的危害明显高于其它各阶段的猪。猪附红细胞体病虽然在夏季的发病率和死亡率仍然较高，但春、夏、秋、冬四个季节都可发病和死亡，特别是在冬季，没有蚊虫的传播仍然有本病的发生；这些因素说明本病发生的季节性已经不是很明显，这些因素可能是由于本病的传播途径的多样化，诸如器械传播、垂直传播、交配传播等，以及应激、继发感染、免疫抑制性疾病的存在等。3.3猪附红细胞体病的发病模式猪附红细胞体病的发病模式具有明显的新趋势，主要以混合感染、继发感染为主，单一的感染发病极少。混合感染、继发感染是导致猪群感染本病后发病和死亡的主要因素，不仅表现为2种病原的混合感染，还表现为多种病原的混合感染。猪免疫抑制性疾病（猪蓝耳病、猪圆环病毒）的感染，能够促进本病的发生，这19 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究些应该值得养殖生产者的注意；为了猪群的稳定，猪场应控制好猪蓝耳病、猪圆环病毒病，尽量减少猪场带毒和控制其不发病。一些重要的猪疾病容易诱发本病的发生，如猪瘟和伪狂犬、喘气病、猪副嗜血杆菌病、猪传染性胸膜肺炎等。这说明要减少猪附红细胞体病的发生，应该做好猪群的基础免疫、减少猪群发病。应激也是猪附红细胞体病发病的主要诱发因素，高热、高湿、低温、气候变化、转栏等能够使猪群附红细胞体病从隐性感染转变为发病和死亡。3.4猪附红细胞体病的预防探讨猪附红细胞体病预防应该以控制猪免疫抑制性疾病（猪蓝耳病、猪圆环病毒）和主要猪场疫病，减少应激，做好基础免疫，加强饲养管理，做好药物保健等为主。本病的高隐性感染率和无疫苗预防接种、传播途径的特殊性等特点决定了本病的预防具有特殊性。20 第三章猪附红细胞体病有效药物的筛选第三章猪附红细胞体病有效药物的筛选近年来，养猪业得到快速发展，集约化养猪已经逐渐取代散户养猪，疾病防控的难点也越来越大。猪附红细胞体病是近年来影响养猪生产效益的重要疫病之一，特别是在赣州地区，夏季的高热使得本病的危害远远高于其它区域。对于本病的防控，由于本病病原是寄生于红细胞，不同于一般的细菌和病毒，至今还没有研究开发出预防本病的疫苗，而且药物防控本病又不同于一般的疾病。这一系列的因素使得本病的预防难度较大，只能通过有效的药物来进行防控。目前治疗猪附红细胞体病的药物都存在“一旦停药，就会复发”的现状，这给附红细胞体病的防治带来很大因难。虽然用于治疗猪附红细胞体病的药物有多种，但是真正特效并能将虫体完全消除的药物还没有，往往都存在一个难点：效果好的药物虽然能把附红细胞体杀灭效果增加，但毒性大，对动物机体损伤强，一旦用量偏大，多者中毒死亡，少者出现很强的毒副作用，安全的抗生素又存在效果差的问题。为了更加有效地防控猪附红细胞体病，有必要对目前的一些药物进行综合评价，并筛选出安全、高效的药物来预防本病。本研究中通过对发病猪群进行多种药物治疗试验，结合药物对机体的毒性反应和病原的抑制作用来综合评价药物的可行性。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物和病原90头健康的保育猪，经过新鲜抗凝血瑞氏染色镜检和PCR确诊为附红细胞体阴性。猪附红细胞体标准病原由中国动物卫生及流行病学中心提供。1.1.2主要仪器梯度PCR仪HybaidPX2（Bio-Rad公司，美国）；高速冷冻离心（Eppendorf公司，德国）；低温高速离心机（郑州中谱仪器设备有限公司）；酸度计（梅特勒托利多国际贸易（上海）有限公司）；光学显微镜（上海赛默科技生物发展有限公司）；电子天平（常州万泰天平仪器有限公司）；磁力搅拌器（常州高德仪器制造有限公司）；无菌操作台（上海康路仪器设备有限公司）；振荡器（常州高德仪器制造有限公司）；微量移液器（德国BRAND公司）；压力蒸汽灭菌器（北京同德创业科技有限公司）；超纯水制备机（上海赫恩实业有限公司）；鼓风干燥箱（上海喆图科学仪器有限公司）。1.1.3主要试剂磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸、葡萄糖、瑞氏染料、NaCl、葡萄糖、甲醇、EDTA等试剂购置于赣州天健医疗器械公司；贝尼尔购置湖南农大兽药厂；914A购21 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究置赣州华医动物药业有限公司；土霉素、强力霉素、四环素、磺胺六甲氧嘧啶、二甲氧苄氨嘧啶，氨基比林分别购置于河北远征兽药有限公司；附红净购置武汉农大兽药厂；青蒿素、黄芪多糖、板蓝根分别购置于江西中成药业有限公司。1.2方法1.2.1相关试剂配制[22]0.15mol/LpH7.2PBS洗涤液l：将Na2HPO4·12H2O19.34g，KH2PO42.86g和NaCl4.25g溶于蒸馏水，调pH值并定容至1000mL，高压灭菌20min，4℃冰箱保存备用。0.15mol/LpH7.2PBS洗涤液2：将Tween-20和EDTA分别按0.15％和1.0％加入到0.15mol/LpH7.2PBS洗涤液1中，高压灭菌20min，4℃冰箱保存备用。阿氏液：将葡萄糖2.05g，氯化钠0.42g，柠檬酸钠0.80g溶于100mL蒸馏水，10％柠檬酸调节pH至6.1，过滤，分装，高压灭菌10min，4℃冰箱保存备用。姬姆萨染色液(Giemsa)：将姬姆萨染料粉0.69g溶解于5mL甘油，置55℃~60℃水浴2h后，加50mL甲醇，静置24h。瑞氏染色液：将瑞氏染色试剂0.1g和lmL甘油置于研钵中混匀并研磨均匀后溶于60mL中性甲醇，盛于棕色广口瓶，静置1周。1.2.2试验动物分组与处理1.2.2.1治疗试验动物分组与处理对40头健康保育猪进行肌肉注射标准阳性猪附红细胞体病原，注射后48h进行采集静脉血抗凝处理后瑞氏染色镜检和PCR确诊，并观察猪体温和临床症状。按照瑞氏染色镜检和PCR检测结果确定感染成功的猪进行分组，把40头感染成功发病的猪分为8组，每组5头猪，分别为I组、II组、III组、IV组、V组、VI、VII组、VIII组；IX组为对照组，5头健康保育猪。各组处理方法如下表3-1：22 第三章猪附红细胞体病有效药物的筛选表3-1试验各组猪药物使用情况Table3-1testgroupsofSwinedrugusage实验分组使用药物剂量用法I组土霉素+氨基比林40mg/kg.w肌注,2次/d,连用3dII组强力霉素+氨基比林50mg/kg.w肌注,2次/d,连用3dIII组四环素+氨基比林30mg/kg.w肌注,2次/d,连用3d第一天：70mg/kg.w；磺胺六甲氧嘧啶+二甲氧苄氨IV组第二天：50mg/kg.w；肌注,2次/d,嘧啶+氨基比林第三天：30mg/kg.w；V组914A+氨基比林30mg/kg.w肌注,2次/d,连用3dVI组附红净+氨基比林30mg/kg.w肌注,2次/d,连用3dVII组贝尼尔+氨基比林30mg/kg.w肌注,2次/d,连用3d青蒿素、黄芪多糖、板蓝根中VIII组用量按照说明书进行饮水,连用7d药提取物+氨基比林对照组，给予充足的饮水和饲IX组料1.2.2.2治疗药物毒性试验动物分组与处理为评价药物毒性作用，把健康猪45头分别分为I组、II组、III组、IV组、V组、VI、VII组、VIII组，处理方法按照治疗试验中药物用法用量进行，但不采用氨基比林；IX组为对照组，不采取任何药物处理。1.2.3临床症状观察和死亡情况分析每天记录试验各组猪的饮水量和采食量，观察猪的精神状态、毛色、粪便等状况；一旦出现试验猪死亡，马上进行病理剖检，观察血液、脾脏、肝脏、肾脏、肺等病变。同时每天采集猪新鲜血液进行抗凝处理，连续7天，血液进行猪附红细胞体病的病原检测，并分析其血液生化指标。1.2.4病原试验室检测分别在治疗后24h、48h、72h、5d、7d采集试验猪静脉血，进行病原检测。1.2.4.1猪附红细胞体病原的镜检瑞氏染色法：取鲜血的抗凝血少许置于载玻片上推成薄层，制成血膜片自然干燥后，盖上一块比涂抹点略大的清洁滤纸片，然后在其上小心滴加瑞氏染色液，染色3～5min，直接用水冲洗，吸干或烘干。放置在油镜下观察，视野中有形态不一的附红细胞体，并来回微调具有折光性，可判定阳性。判定标准：猪附红细胞体对红细胞感染率在10％以下定为+，10％～50％定为++，23 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究50％～75％为+++，75％以上为++++。高倍镜下观察红细胞分布区20个视野没有看到猪附红细胞体，红细胞形态正常则判定为阴性。1.2.4.2PCR法检测参考第二章1.2.4.1.3进行PCR法检测。1.2.5猪生化指标的测定分别在治疗后24h、48h、72h、5d、7d采集试验猪静脉血，进行血液生化指标的检测，包括转氨酶、白蛋白、球蛋白等指标，以了解药物对猪的损害情况，评价药物毒性情况。2结果2.1猪附红细胞体人工感染结果试验猪40头在感染猪附红细胞体后48h表现出了典型的猪附红细胞体病的临床症状：体温为41℃以上，皮肤发红、出血，血液凝固不良，成酱油色，精神萎靡，不吃料，有些出现明显的呼吸道症状。并进行采集静脉血抗凝处理后瑞氏染色镜检和PCR确诊；瑞氏染色镜检结果为35头表现为++++，5头猪为+++，PCR检测结果都是阳性。2.2试验各组猪治疗后采食量与饮水量结果试验各组在治疗后24h、48h、72h、5d、7d的采食量和饮水量结果如下表3-2。表3-2试验各组猪治疗后采食量、饮水量变化结果Table3-2testgroupsofSwinefeedintake,waterquantitychangeaftertreatmentresults试验采食量饮水量分组24h48h72h5d7d24h48h72h5d7dI组0.100.230.570.920.971.31.61.11.31.01II组0.070.350.620.950.981.41.51.21.21.10III组0.050.260.530.870.911.31.41.31.61.11IV组0.110.370.480.810.831.41.61.51.31.2V组0.120.260.610.950.941.31.61.21.251.21VI组0.080.210.590.940.951.31.71.21.41.15VII组0.120.250.530.930.951.21.51.31.21.2VIII组0.130.320.670.730.981.251.471.351.21.15备注：试验各组猪采食量和饮水量结果为平均数，计算方法为以对照组猪平均采食量或饮水量为基数的倍数。I组为土霉素治疗组，II组为强力霉素治疗组，III组为四环素治疗组，IV组为磺胺六甲氧嘧啶+二甲氧苄氨嘧啶治疗组，V组为914A组，VI组为附红净治疗组，VII组为贝尼尔治疗组，VII组为中草药治疗组。24 第三章猪附红细胞体病有效药物的筛选从采食量来看抗生素I至IV组中，I组土霉素治疗组、II组强力霉素治疗组在治疗5d、7d后的恢复较好，好于III组四环素治疗组、IV组磺胺六甲氧嘧啶+二甲氧苄氨嘧啶治疗组，也好于V组914A组、VI组附红净治疗组、VII组贝尼尔治疗组；VII组中草药治疗组虽然在早期治疗后采食量恢复更慢，但到7天后几乎恢复至正常。从饮水量看，试验各组虽然有一定的区别，但总体上是在疾病初期由于发热和疾病的原因，饮水量增加，在后期逐渐恢复至接近正常水平。2.3试验各组猪治疗后临床症状变化结果试验各组在治疗后体温和临床症状变化结果如下表3-3。表3-3试验各组猪治疗后临床症状Table3-3testgroupsofSwinesclinicalsymptomsaftertreatment试验体温（℃）临床症状分组24h48h72h5d7d24h48h72h5d7dI组41.240.840.139.238.1++++++++++++II组41.440.539.739.337.9++++++++++++III组41.240.940.139.539.8+++++++++++++++IV组41.440.740.339.639.3+++++++++++++++V组41.340.740.239.538.3+++++++++++VI组41.540.740.439.338.3++++++++++++VII组41.340.54039.138.2+++++++++++++VIII组41.240.340.240.239.3++++++++++++++++备注：临床症状指标根据精神状况、毛色、皮肤、呼吸、粪便等症状来区分，++++（极严重）：精神状况极差、毛色无光泽、食欲几乎废绝、皮肤发红、毛孔出血、贫血、血液稀薄、呼吸可有急促、粪便可能出血拉稀；+++（严重）：精神状况较差、毛色无光泽、能吃一点料、皮肤发红、毛孔出血、贫血、血液稀薄、呼吸可有急促、粪便可能出血拉稀；++（一般）：精神状况较差、毛色有一定光泽、能吃部分料、皮肤微红；+（稍不正常）：精神状况恢复较好、毛色有一定光泽、吃料接近正常采食。从上表中可以看出，试验各组在使用药物治疗结合氨基比林退烧后体温都能够降低，但I组土霉素治疗组、II组强力霉素治疗组、V组914A组、VI组附红净治疗组、VII组贝尼尔治疗组都能够在用药治疗后5d、7d恢复至正常水平；虽然在早期治疗后采食量恢复更慢，但到7天后几乎恢复至正常。III组四环素治疗组、IV组磺胺六甲氧嘧啶+二甲氧苄氨嘧啶治疗、VII组中草药治疗组在治疗5d、7d后仍然具有发热情况。从临床症状结果分析来看：I组土霉素治疗组、II组强力霉素治疗组、V组914A25 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究组效果好于其它各组，四环素治疗组、磺胺六甲氧嘧啶+二甲氧苄氨嘧啶治疗组可能是抗虫效果不佳，附红净治疗组、贝尼尔治疗组虽然能够把附红细胞体杀灭效果良好，但可能由于毒性作用，导致效果更差。2.4试验各组猪治疗后死亡情况及病理变化结果试验各组在治疗过程中猪死亡情况结果如下表3-4。表3-4试验各组猪治疗后死亡情况及病理变化Table3-4testgroupsofSwinesdeathsandpathologicalchangesaftertreatment试验死亡数备注分组24h48h72h5d7dI组0/50/50/50/50/5无死亡猪II组0/50/50/50/50/5无死亡猪III组0/51/52/40/20/2死亡猪出现肝脏出血点、脾脏边缘齿轮状突起。IV组0/51/51/41/30/2死亡猪出现脾脏边缘齿轮状突起、肾脏出血点。V组0/50/50/50/50/5无死亡猪VI组0/50/51/50/40/4死亡猪出现肝脏出血点。VII组0/51/50/40/40/4死亡猪出现肝脏出血点。VIII组0/51/50/40/40/4脾脏边缘齿轮状突起。从以上结果可以看出，I组土霉素治疗组、II组强力霉素治疗组、V组914A组没有出现死亡猪；III组四环素治疗组、IV组磺胺六甲氧嘧啶+二甲氧苄氨嘧啶治疗组能够出现了2头猪死亡，治疗效果不佳；VI组附红净治疗组、VII组贝尼尔治疗组出现了1头猪死亡，可能是由于药物毒性富集作用，死亡猪肝脏出血点；VII组中草药治疗组可能存在药效来得慢，也出现了1头死亡。2.5试验各组猪治疗后镜检检测结果试验各组在治疗后猪血液镜检检测结果如下表3-5。从以上结果可以看出：I组土霉素治疗组、II组强力霉素治疗组、V组914A组、VI组附红净治疗组、VII组贝尼尔治疗组这5猪的猪血液镜检检测结果表明这五种药物对猪附红细胞体具有明显的杀灭作用；III组四环素治疗组、IV组磺胺六甲氧嘧啶+二甲氧苄氨嘧啶治疗组的镜检检测结果表明这两种药物对附红细胞体的杀灭作用较差；VII组中草药治疗组说明中草药对附红细胞体虽然有一定的抑制作用，但效果与前面几种药物相比，明显更差。26 第三章猪附红细胞体病有效药物的筛选表3-5试验各组猪治疗后镜检检测结果Table3-5testgroupsofSwinemicroscopytestresultsaftertreatment试验+++以上阴性分组24h48h72h5d7d24h48h72h5d7dI组5/54/51/50/50/50/50/50/50/54/5II组5/53/53/50/50/50/50/50/50/54/5III组5/53/53/41/21/20/50/50/40/20/2IV组5/53/43/30/20/20/50/40/30/20/2V组5/54/51/50/50/50/50/50/50/54/5VI组5/54/52/50/40/40/50/50/50/44/4VII组5/54/52/40/40/40/50/50/40/44/4VIII组5/54/52/41/40/40/50/50/40/40/42.6试验各组猪治疗后PCR检测结果试验各组在治疗后猪血液镜检检测结果如下表3-6。表3-6试验各组猪治疗后PCR检测结果Table3-6testgroupsofSwinePCRdetectionresultsaftertreatmentPCR检测结果阳性比试验分组24h48h72h5d7dI组5/55/55/55/54/5II组5/55/55/55/54/5III组5/55/54/42/22/2IV组5/54/43/32/22/2V组5/55/55/54/53/5VI组5/55/55/54/43/4VII组5/55/54/44/43/4VIII组5/55/54/44/44/4从以上结果可以看出，通过后I组土霉素治疗组、II组强力霉素治疗组在治疗后7d5头猪中有1头猪血液的猪附红细胞体PCR检测结果阴性；V组914A治疗组在治疗后5d就有1头转阴性，治疗后7d就有2头转阴性；VI组附红净治疗组、VII组贝尼尔治疗组在治疗后7d有1头转阴性；其它各组没有出现转阴性猪。因此，V组914A治疗组在杀灭猪附红细胞体方面效果最好，I组土霉素治疗组、II组强力霉素治疗组、VI组附红净治疗组、VII组贝尼尔治疗组分别次之，但附红净、贝尼尔存在毒性作用。27 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究2.7猪生化指标的测定结果试验各组在药物治疗后24h、48h、72h、5d、7d静脉血生化指标的检测结果如下表3-7。表3-7试验各组猪治疗后PCR检测结果Table3-7testgroupsofSwinePCRdetectionresultsfruitaftertreatment试验血液生化指标不正常猪数量分组24h48h72h5d7dI组0/50/51/50/50/5II组0/50/51/50/50/5III组0/50/51/50/50/5IV组0/50/51/50/50/5V组1/52/52/51/50/5VI组2/54/55/50/50/5VII组3/54/54/50/50/5VIII组0/50/50/50/50/5对照组0/50/50/50/50/5备注：通过检测转氨酶、白蛋白、球蛋白等生化指标，以评价药物对猪毒性情况。从检测结果中可以看出I组土霉素、II组强力霉素、III组四环素、IV组磺胺六甲氧嘧啶+二甲氧苄氨嘧啶都有1头猪血液生化指标不正常；V组914A、VI组附红净、VII组贝尼尔这3组的血液生化指标不正常猪个数明显高于其它各组，而且V组914A又高于VI组附红净和VII组贝尼尔；VII组中草药血液生化指标正常。因此，从生化指标可以得出以上8种药物的安全性为中草药〉土霉素、强力霉素、四环素、磺胺六甲氧嘧啶+二甲氧苄氨嘧啶>914A>附红净、贝尼尔。3讨论3.1猪附红细胞体的有效药物分析通过药物治疗试验后附红细胞体杀灭或抑制效果结果可以得出：土霉素、强力霉素是比较理想的抗生素；914A、附红净、贝尼尔对杀灭猪附红细胞体效果明显；四环素、磺胺六甲氧嘧啶+二甲氧苄氨嘧啶虽然能够在一定程度上抑制或杀灭猪附红细胞体，但效果不甚理想；青蒿素、黄芪多糖、板蓝根中药提取物对于直接杀灭猪附红细胞体效果不佳，但应该考虑其在提高猪群免疫力和抑制病原繁殖方面的作用，有助于预防和治疗猪附红细胞体病。28 第三章猪附红细胞体病有效药物的筛选3.2治疗猪附红细胞体的理想药物理想的猪附红细胞体病预防或治疗药物的选择，不仅要考虑药物对病原的杀灭作用，而且还应该考虑药物毒性作用本身。从本试验结果得出土霉素、强力霉素不仅在抑制或杀灭猪附红细胞体病原方面效果理想，而且对猪毒性作用较低，是治疗猪附红细胞体病比较理想的抗生素药物。而结合治疗后猪治愈率、死亡率以及采食量等指标分析可以得出，土霉素、强力霉素在治疗猪附红细胞体病方面具有良好的效果，是值得广泛使用于本病预防的药物。914A在杀灭猪附红细胞体病原方面效果甚佳，好于土霉素、强力霉素，但存在一定的毒性作用，因此，914A也是理想的治疗猪附红细胞体病药物，但考虑到其存在一定的毒性作用，应该要考虑其用法用量。附红净、贝尼尔是杀灭猪附红细胞体病原的理想药物，但由于其毒性作用较大，因此，采用这两种药物治疗猪附红细胞体病时一定要考虑其毒副作用，谨慎使用。3.3猪附红细胞体的防治药物对猪附红细胞体的预防，应该选择安全、高效的药物，还应采取一些毒副作用小的中草药制剂。通过本试验结果分析，对应预防本病，可以考虑采用青蒿素、黄芪多糖、板蓝根中药提取物，配合强力霉素或土霉素，也可采取适量的914A。29 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究第四章猪附红细胞体病的综合防治研究猪附红细胞体病在赣州地区已经成为影响养猪生产效益的重要传染病之一，采取有效的防治措施是猪场减少猪附红细胞体病发生的主要途径。由于近年来猪附红细胞体病的流行趋势朝着规模化、集约化的方式发展，单纯采取药物已经不能很好地控制本病，应该采取综合措施，高效的疫苗接种免疫和合理的药物预防保健，以及先进的饲养管理模式。本试验通过对几个规模猪场猪附红细胞体病的不同防治措施控制猪附红细胞体病，来探索适合赣州地区的猪附红细胞体病的综合防治措施。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物3个年出栏2000头肉猪的自繁自养猪场，经流行病学调查、病原检测为猪附红细胞体发病严重猪场。1.1.2主要仪器梯度PCR仪HybaidPX2（Bio-Rad公司，美国）；高速冷冻离心（Eppendorf公司，德国）；低温高速离心机（郑州中谱仪器设备有限公司）；酸度计（梅特勒托利多国际贸易（上海）有限公司）；光学显微镜（上海赛默科技生物发展有限公司）；电子天平（常州万泰天平仪器有限公司）；磁力搅拌器（常州高德仪器制造有限公司）；无菌操作台（上海康路仪器设备有限公司）；振荡器（常州高德仪器制造有限公司）；微量移液器（德国BRAND公司）；压力蒸汽灭菌器（北京同德创业科技有限公司）；超纯水制备机（上海赫恩实业有限公司）；鼓风干燥箱（上海喆图科学仪器有限公司）。注射器（赣州天健医疗器械公司）1.1.3主要试剂磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸、葡萄糖、瑞氏染料、NaCl、葡萄糖、甲醇、EDTA等试剂购置于赣州天健医疗器械公司；914A购置赣州华医动物药业有限公司；土霉素、强力霉素、氨基比林分别购置于河北远征兽药有限公司；青蒿素、黄芪多糖、板蓝根分别购置于江西中成药有限公司。1.2方法1.2.1相关试剂配制[22]0.15mol/LpH7.2PBS洗涤液l：将Na2HPO4·12H2O19.34g，KH2PO42.86g和NaCl4.25g溶于蒸馏水，调pH值并定容至1000mL，高压灭菌20min，4℃冰箱保存备用。0.15mol/LpH7.2PBS洗涤液2：将Tween-20和EDTA分别按0.15％和1.0％加入30 第四章猪附红细胞体病的综合防治研究到0.15mol/LpH7.2PBS洗涤液1中，高压灭菌20min，4℃冰箱保存备用。阿氏液：将葡萄糖2.05g，氯化钠0.42g，柠檬酸钠0.80g溶于100mL蒸馏水，10％柠檬酸调节pH至6.1，过滤，分装，高压灭菌10min，4℃冰箱保存备用。姬姆萨染色液(Giemsa)：将姬姆萨染料粉0.69g溶解于5mL甘油，置55℃~60℃水浴2h后，加50mL甲醇，静置24h。瑞氏染色液：将瑞氏染色试剂0.1g和lmL甘油置于研钵中混匀并研磨均匀后溶于60mL中性甲醇，盛于棕色广口瓶，静置1周。1.2.2猪场防治措施以3个年出栏2000头肉猪的自繁自养猪场为例，进行猪附红细胞体病的防治措施研究。试验分为4组，分别为I组、II组、III组、IV组，处理方式如下：I组：对猪场内所有猪每个月在饲料中添加强力霉素300g/吨，青蒿素、黄芪多糖、板蓝根复方提取物1000g/吨，并做好定期驱虫；同时，在天气变化、转栏时添加强力霉素200g/吨，青蒿素、黄芪多糖、板蓝根复方提取物1000g/吨；发病猪用914A进行治疗。II组：对猪场内所有猪每个月在饲料中添加强力霉素300g/吨；同时，在天气变化、转栏时添加强力霉素200g/吨，青蒿素、黄芪多糖、板蓝根复方提取物1000g/吨；发病猪用914A进行治疗。III组：对猪场内所有猪每个月在饲料中添加强力霉素300g/吨；发病猪用914A进行治疗。IV组：某猪场挑选50头保育猪，同时每个月在饲料中添加强力霉素300g/吨。发病猪用914A进行治疗。1.2.3临床症状观察和死亡情况分析每天记录试验各组猪的饮水量和采食量，观察猪的精神状态、毛色、粪便等状况；一旦出现试验猪死亡，马上进行病理剖检，观察血液、脾脏、肝脏、肾脏、肺等病变。同时每天采集猪新鲜血液进行抗凝处理，连续7天，血液进行猪附红细胞体病的病原检测，并分析其血液生化指标。1.2.4病原实验室检测随机抽取20头采静脉血，进行病原检测。1.2.4.1猪附红细胞体病原的镜检：瑞氏染色法：取鲜血的抗凝血少许置于载玻片上推成薄层，制成血膜片自然干燥后，盖上一块比涂抹点略大的清洁滤纸片，然后在其上小心滴加瑞氏染色液，染色3～5min，直接用水冲洗，吸干或烘干。放置在油镜下观察，视野中有形态不一的附红细胞体，并来回微调具有折光性，可判定阳性。31 赣州地区猪附红细胞体病流行病学调查及综合防治研究判定标准：猪附红细胞体对红细胞感染率在10％以下定为+，10％～50％定为++。50％～75％为+++，75％以上为++++：高倍镜下观察红细胞分布区20个视野没有看到猪附红细胞体，红细胞形态正常则判定为阴性。1.2.4.2PCR法检测参考第二章1.2.4.1.3进行PCR法检测。2结果2.1猪场发病和死亡情况试验各组发病率、死亡率结果如下表4-1。表4-1猪场发病与死亡情况Table4-1Swinemorbidityandmortality试验发病率（%）死亡率（%）分组母猪仔猪保育猪育肥猪母猪仔猪保育猪育肥猪I组510831322II组6211813313113III组1323369514134IV组——15———5—从以上结果可以看出：母猪的发病率I组IV组>II组>III组。试验各组随机抽取的猪进行猪血液镜检检测结果如下表4-4。表4-4试验各组猪治疗后PCR检测结果Table4-4testgroupsofSwinePCRdetectionresultsaftertreatmentPCR检测结果阳性率（%）试验分组母猪仔猪保育猪育肥猪I组99828895II组100879299III组1009194100IV组——89—从以上结果可以看出，4个试验组中，母猪、仔猪、育肥猪这3个阶段的猪猪附红细胞体感染阳性率为I组