新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究

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－＇Ｉ义－＇．设．＇＼．、分类号；Ｒ１８３．３密级：学号：２０口１０９０３２单位代码：１０７５９石河子大学巧女《隹洽新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究？＞，？？学位申请人柳小玲指导教师张万江申请学位口类级别医学硕壬学科、专业名称病理学与病理生望学巧究方向感染性疾病巧病望生理所在学院區学院申国？新疆？石河子２０１６年０５月 分类号:R183.3密级：学号：2013109032单位代码：10759石河子大学硕士学位论文新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究学位申请人柳小玲指导教师张万江申请学位门类级别医学硕士学科、专业名称病理学与病理生理学研究方向感染性疾病的病理生理所在学院医学院中国·新疆·石河子2016年05月 StudyonthebiologicalcharacteristicsandgenetictraitsofthenewstrainoftuberculosisvaccineADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByLIUXiao-ling（Pathologyandpathophysiology）DissertationSupervisor:ZHANGWan-jiangMay,2016 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人邑经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：＾月《日：啦＾时间ＰＷ是年使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部口或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。兩小於ＩＣＬ研究生签名：时间：３化年＾月反日导师签名；时间曰於户 摘要目的：探讨卡介苗（BCG）与结核分枝杆菌国际标准无毒株（H37Ra）构建的融合菌株（B/R菌株）的生长特性、定植性及遗传稳定性。方法：1.Sauton液体培养基分别培养BCG、H37Ra和B/R菌株，并在连续培养的第3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天（d）取菌液并测定其在波长600nm处的OD值。然后以时间（Time）为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制上述三种菌株的生长曲线。2.C57BL/6小鼠随机分3组，分别皮下接种BCG、H37Ra和B/R菌株的菌液0.1mL（含活菌数为61.0×10个），免疫后的第15、30、45、60及75天取各组小鼠脾脏、肺脏及肝脏，制成脏器组织匀浆，取匀浆液0.1mL接种于罗氏固体培养基斜面上，培养20天，分别计算三组菌株在不同脏器的菌落数(Log10cfu)。3.提取B/R菌株、BCG和H37Ra菌株的总RNA，进行纯度鉴定后并逆转录成cDNA，通过SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测上述三种菌株esat-6、ag85b、mpt70和mpt83基因的mRNA相对表达水平，比较三种不同菌株中esat-6、ag85b、mpt70和mpt83基因表达的差异。4.分别提取B/R菌株第1代到第20代的基因组DNA，以其为模版PCR分别扩增每代B/R菌株的esat-6、ag85b、mpt70和mpt83基因，比较分析B/R菌株的传代稳定性。结果：1.根据所绘生长曲线图，与亲本菌株BCG和H37Ra菌株相比，B/R菌株的生长适应期较长，6天后才开始进入生长对数期，27天后进入平台稳定期；2.在相同免疫时间下，B/R菌株在小鼠不同脏器内的Log10cfu均高于BCG和H37Ra菌株。其中，与BCG和H37Ra菌株组比较，B/R菌株在小鼠肝脏内的Log10cfu稍高，但差异无统计学意义(P>0.05)。且随着免疫时间的增加，三种菌株在小鼠肝脏内的Log10cfu有升有降，时间趋势不明显。在五个不同免疫时间点，B/R菌株在小鼠脾脏内的Log10cfu均明显高于BCG菌株，且差异有统计学意义(P<0.05)；在免疫后的15、45以及75天，B/R菌株在小鼠脾脏内的Log10cfu高于H37Ra菌株，且差异有统计学意义(P<0.05)。且随着免疫时间的增加，三种菌株在小鼠脾脏内的Log10cfu整体呈下降趋势，但在免疫后的75天，H37Ra和B/R菌株在小鼠脾脏内的Log10cfu较60天组有小幅度的上升，而BCG在小鼠脾脏内的Log10cfu仍呈下降趋势。在五个不同免疫时间点，B/R菌株在小鼠肺脏内的Log10cfu均明显高于BCG菌株，且差异有统计学意义(P<0.05)；在免疫后的15和45天，B/R菌株在小鼠肺脏内的Log10cfu高于H37Ra菌株，且差异有统计学意义(P<0.05)。且随着免疫时间的增加，三种菌株在小鼠肺脏内的Log10cfu明显呈下降趋势。3.qRT-PCR检测结果显示，与BCG菌株比较，mpt70和mpt83基因在B/R融合菌株中的mRNA表达量有不同程度的下调，但差异无统计学意义(P>0.05)；在H37Ra菌株中的mRNA表达量也有不同程度的下调，且差异有统计学意义(P<0.05)。与H37Ra菌株比较，mpt70和mpt83基因在B/R融合菌株和BCG菌株中的mRNA表达量均有不同程度的上调，且差异有统计学意义(P<0.05)；esat-6和ag85b在B/R菌株中的mRNA表达量均有不同程度的上调，且差异有统计学意义(P<0.05)。4.PCR扩增结果显示，第1代到第20代的B/R菌株均能扩增出的esat-6、ag85b、mpt70和mpt83四个目的基因，且大小位置相同，条带清晰明亮。I 结论：1.B/R菌株的生长周期为30天，其在小鼠体内至少可存活75天，且定植能力较强。2.B/R菌株在20个代次以内的基因水平达到了生物制品传代稳定性的要求。关键词：B/R融合菌株，BCG，H37Ra菌株，结核疫苗，生长特性，定植性，遗传性论文类型：A（基础研究）II AbstractObjective:Toinvestigatethefusionstrains(B/Rstrain)growthcharacteristics,colonizationandhereditaryconstructedbyBacillusCalmetteGuerin(BCG)andMycobacteriumtuberculosisH37Rastrains(H37Ra).Methods:1.BCG,H37RaandB/RstrainswereculturedinSautonBrothMediumrespectively,andmeasuredtheODvaluesofbacteriaBCG,H37RaandB/Rstrainsindifferentculturedtimeofthe3,6,9,12,15,18,21,24,27and30daysatawavelengthof600nm.Andthenwiththetime(Time)asthehorizontalcoordinates,OD600valuefortheverticalcoordinates,drawtheabovethreestrainsgrowthcurve.2.C57BL/6micewererandomlydividedinto3groups,andvaccinatedsubcutaneouslywithB/Rstrains,6BCGandH37Rabacterialiquid0.1ml(includingthenumberoflivingbacteriumwas1.0×10).Afterimmunized15,30,45,60and75days,thespleen,lungandliverofmiceweretakenintoandmadeintovisceratissuehomogenate,takeevenlyserous0.1mlinoculatedonthesurfaceoftheRochesolidmediumslantandculturedfor20days,countofthreegroupsofstrainsindifferentorgansofthecolonyformingunits(Log10cfu).3.ThetotalRNAofB/Rstrains,BCGandH37Rawereextracted,purifiedandreversetranscriptionintocDNA,afterusingSYBRGreenⅠQuantitativeReal-timePCR(qRT-PCR)respectivelytodetectthemRNAexpressionlevelsofesat-6,ag85b,mpt70andmpt83geneintheabovethreestrains.Tocompareandanalyzethedifferencesofesat-6,ag85b,mpt70andmpt83geneexpressionlevelinthreedifferentstrains.4.B/RstrainswereextractedfromthefirstgenerationtothetwentiethgenerationofgenomicDNA,theesat-6,ag85b,mpt70andmpt83geneswereamplifiedforeachgenerationofB/RstrainsbyusingthetemplatePCR,andcomparedandanalyzedthestabilityoftheB/Rstrains.Results:1.Accordingtothedrawagrowthcurve,comparedwithBCGandH37Rastrains,B/Rstrainsgrowthperiodforadaptationislong,and6daysafterbeganintothelogarithmicphase,and27daysintothestableplatform.2.Underthesameimmunetime,theLog10cfuofB/RstrainsindifferentorgansofmicewerehigherthanthoseofBCGandH37Rastrains.Amongthem,comparedwiththeBCGandH37Rastrains,theLog10cfuofB/Rstrainsintheliverofmicewereslightlyhigher,butthedifferencewasnotstatisticallysignificant(P>0.05).Andwiththeincreaseofimmunetime,threestrainsofLog10cfuintheliverofmicewereupanddown,thetimetrendisnotobvious;Infivedifferentimmunetime,theLog10cfuofB/RstraininthespleenofmiceweresignificantlyhigherthanthoseinBCGstrainsgroup,thedifferenceisstatisticallysignificant(P<0.05);Immuneafter15,60and75days,theLog10cfuofB/RstraininthespleenofmicethantheH37Rastrainsgroup,thedifferenceisstatisticallysignificant(P<0.05).Withtheincreasingtimeofimmunization,theLog10cfuofthreeIII strainsinthespleenofmiceshowedadownwardtrendoverall.Comparedwith60days,theLog10cfuofH37RaandB/Rstrainsinthespleenofmicehasasmallerincreaseinthe75daysafterimmunization,buttheLog10cfuofBCGinthespleenofmiceshowedadownwardtrend.Infivedifferentimmunetime,theLog10cfuofB/RstraininthelungsofmiceweresignificantlyhigherthanthoseinBCGstrainsgroup,thedifferenceisstatisticallysignificant(P<0.05);Immuneafter15daysand45days,theLog10cfuofB/RstrainsinthelungsofmicethanH37Rastrainsgroup,thedifferenceshavestatisticalsignificance(P<0.05).Andwiththeincreaseofimmunetime,theoverallLog10cfuofthethreestrainsinmicelungsshowedadownwardtrend.3.AccordingtotheresultofqRT-PCR,comparedwithBCGstrains,themRNArelativeexpressionlevelsofmpt70andmpt83genesinB/Rstrainsweredownregulated,thedifferencewasnotstatisticallysignificant(P>0.05);ThemRNArelativeexpressionlevelsofmpt70andmpt83genesinH37Rastrainswerealsodownregulated,butthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05);ComparedwithH37Rastrains,themRNArelativeexpressionlevelsofmpt70andmpt83genesinB/RstrainsandBCGstrainswereincreased,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05);ThemRNArelativeexpressionlevelsofesat-6andag85bgenesinB/Rstrainsalsowereincreased,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05)4.TheresultsofPCRshowedthatesat-6,ag85b,mpt70andmpt83genesofB/Rstrainfirsttotwentiethgenerationwereamplified,andthesizeinthesameposition,clearandbrightbands.Conclusions:1.ThegrowthcycleofB/Rstrainwas30days,andcouldsurviveinmiceforatleast75days,andthecolonizationabilitywasstronger.2.B/Rstrainsinthe20generationsofthegenelevelcanachievethequalityrequirementsofthestabilityofbiologicalproducts.Keywords：B/Rfusionstrains,BCGstrains,H37Rastrains,tuberculosisvaccine,growthcharacteristics,colonization,heredityTypeofthesis：A(Basicresearch)IV 英汉缩略语名词对照表（ListofAbbreviations）缩略语英文全名中文全称MTBMycobacteriumtuberculosis结核分枝杆菌TBTuberculosis结核病BCGBacilleCalmette-Guérin卡介苗B/RB/Rfusionstrains融合菌株SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠ODOpticaldensity光密度值CFUColony-FormingUnits菌落形成单位qRT-PCRReal-timequantitativePCR实时荧光定量PCRRNARibonucleicacid核糖核酸mRNAMessengerRNA信使RNADNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸cDNAComplementaryDNA互补脱氧核糖核酸DEPCDiethypyrocar-bonate焦碳酸二乙酯WHOWorldhealthorganization世界卫生组织三羟甲基氨基甲烷-TETris-Ethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸pHpHvaluepH值bpBasepair碱基对μgMicrogram微克minminutes分钟rpmrotationperminute转/分钟V 目录中文摘要.............................................................................................................Ⅰ英文摘要.............................................................................................................Ⅲ英汉缩略语名词对照表.....................................................................................Ⅴ前言.......................................................................................................................1材料和方法...........................................................................................................4结果.....................................................................................................................17讨论.....................................................................................................................26结论.....................................................................................................................29参考文献.............................................................................................................30文献综述.............................................................................................................33致谢.............................................................................................................45作者简介.............................................................................................................46导师评阅语.........................................................................................................47VI 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究前言(Introduction)结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染所引起的世界性传染病，是全球发病率与死亡率最高的感染性疾病之一，严重损害人类健康和威胁世界经济的发展。根据世界卫生组织(WHO)公布的《2015年全球结核病[1]报告》显示，全球有1/3人群（约20亿）感染了MTB，而每年新发结核病例约960万（其中包括540万男性患者，320万的女性患者以及100万儿童患者），且有近150万人（其中包括40万的HIV感染者）死于结核病。随着人口流动增加、HIV与结核分枝杆菌伴发感染以及结核分枝杆菌多重耐药性菌株的出现，全球结核病疫情呈再度回升趋势且结核病[2]的防治工作也变得严峻而复杂。1.我国结核病的流行情况[1]根据《2015年全球结核病报告》，我国作为全球22个结核病高负担国家之一，目[3]前每年新发病人数约为130万，占全球发病总人数的14%左右，高居全球第二位。面对结核病如此严峻的防治工作，我国于1979年、1984年、1990年、2000年以及2010年共开展了5次全国性结核病流行病学的抽样调查工作，希望通过深入了解我国结核病的流行趋势，以期制定出更加有效的结核病防治策略来遏制结核病的流行，保障人民群众的身体健康。而根据2010年全国流行病学(结核病)调查的最新结果统计，对比1979年、1984年、1990年的患病率796/10万、550/10万、523/10万，我国的结核病总体患病率是有所下降，但患病率未见明显突破，维持在一个僵持不下的局面；分析其可能原因：1)结核病的发现率低。调查发现，未被及时诊断与治疗的病人成为疾病传播的重要传染源，所以说结核病的低发现率是目前导致结核病疫情难以控制的关键原因之一；2)人群MTB感染者基数大。调查结果显示，我国约有2.6亿的MTB感染者，其中约5%～10%的人在感染后可能发展为活动结核，并且由于目前我国尚未对MTB感染者釆取相关的预防措施，所以这些是导致结核病疫情不易控的另一重要原因；3）抗生素的滥用与泛用致使耐药菌株流行严重；4）中国庞大的人口基数致使我国的社会流动人口规模较其他国家[2,3]来说相对巨大。综上所述的四个重要因素也是我国结核病流行现状复杂化的关键，所以结核病的防治任务迫在眉睫。2.新型结核疫苗由于全球人口流动增加、HIV与结核分枝杆菌伴发感染以及结核分枝杆菌多重耐药菌株的出现，导致传统卡介苗（BacillusCalmette-Guerin，BCG）已不能满足人类预防结核病的需要。尽管BCG是WHO扩大免疫计划(EPI)中预防结核病的唯一许可疫苗，其应用范围广并且安全性好，但其效果不稳定（不同人群免疫保护率从0～80％不等），1 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究因此开发一种新型有效又可代替BCG的结核病疫苗是控制和预防结核的当务之急。[4]随着结核分枝杆菌全基因组测序的完成，结核新型疫苗的研制进入了一个全新的发展进程。就目前全球结核疫苗的研究情况而言，按其抗结核策略主要可以分为以下两类：1)可取代BCG的新型疫苗，此类新型结核疫苗包括重组BCG疫苗(例如：[6][7,8]rBCG:AureC-hly)和减毒活结核分枝杆菌疫苗；2)用于加强BCG保护效应的亚单位[11][12][13]疫苗。其中包括蛋白疫苗(Ag85B-ESAT6，MAV-85A，Mtb72F等)和核酸疫苗[14](HSP60)，而蛋白疫苗和DNA疫苗在小鼠实验中都显示出了较好的保护作用。但减毒活结核分枝杆菌疫苗的研究却最受关注，且多个国家针对其作为新型结核疫苗的研究项目已经被启动，目的就是为了研制出更加有效的减毒活疫苗以替代目前所使用的[9,10]BCG。根据《2015年全球结核病报告》关于结核疫苗方面的数据统计，目前国际上[1]较为关注的几项结核疫苗的研究，综合起来如下图所示。面对当今社会科研技术如此精湛的情况下，各种新型结核疫苗的研究不断兴起，然而就算如此，至今尚没有一种能[5]取代BCG的候选疫苗问世。3.传统卡介苗与结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra传统的卡介苗是由法国科学家Calmette和Guerin将牛型结核分枝杆菌经过230次的连续传代而获得的减毒活疫苗，是目前世界卫生组织（WHO）推荐用于预防结核病的唯一疫苗。然而处在当今如此复杂化的致病环境下，其作为预防性结核病疫苗也存在着诸多不足：1）在不同民族、不同地域以及不同国家的人群中，其免疫保护作用差异较大，效果不稳定（免疫保护率从0～80％不等），且在BCG的持续使用中其免疫效果也逐2 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究渐减退，同时也逐渐暴露出一些诸如不能有效预防成人型肺结核和潜伏性结核菌感染的[15]问题；2）不能适用于免疫缺陷者；3）易发生菌株变异等的情况。而与BCG相比，结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株（H37Ra菌株）具有较完整的免疫原性，且含[16]有BCG缺失的保护性抗原基因，如esat-6、ag85b等。有研究证明H37Ra免疫小鼠后可有效诱导机体产生特异性细胞免疫应答，能够抵抗MTB有毒株H37Rv菌株的攻击，[17,18]作为新型结核活菌疫苗的候选菌株已被广泛关注。H37Ra菌株是由人型结核分枝杆菌有毒株（国际标准强毒株）H37Rv菌株减毒而来的，尽管其毒力极弱，但是单独作为抗结核疫苗而被应用，于宿主的安全方面还欠考证。所以卡介苗和H37Ra菌株单独作为预防性结核病疫苗均存在着一定的不足和缺陷，然而两者在结核疫苗方面却又都具有各自的优点和优势，且卡介苗和H37Ra菌株在生物特性和遗传性状等方面又具有一定的互[19,20]补性。故本课题基于目前结核疫苗的研究现状，利用本课题组前期成功构建的融合菌株B/R菌株(BCG菌株和H37Ra菌株的融合菌株，简称B/R菌株)，进一步探讨其作为新型结核疫苗候选菌株在生物特性和遗传性状方面的研究。3 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究材料和方法(Materials&Methods)1.材料1.1主要仪器设备新疆石河子大学医学院《西部地区高发人兽共患传染性疾病防治》协同创新中心和《新疆地方与民族高发病》教育部重点实验室提供。表-1实验中用到的主要仪器设备Tab-1Themaininstruments仪器名称生产厂商生物安全柜美国Thermo公司一次性接菌环上海生物工程有限公司电热恒温水浴箱（型号SHH.W21）上海精宏实验设备有限公司CO2培养箱（型号S/N27709-1462）美国Forma公司冰箱（4℃和-20℃）合肥美菱公司冰箱（-80℃）美国Thermo公司超净工作台（型号SW-CJ-LFD）上海博讯实验设备有限公司数显电子天平上海天平仪器厂旋涡震荡混合器江苏金坛市医疗器械厂移液枪德国Eppendof公司产品高压消毒锅（型号S/N）日本SANYO公司电热恒温干燥箱（型号YLD-2000）湖北恒丰医疗器械有限公司磁力搅拌器（型号791）上海南汇电讯器械厂超纯水机（型号TYK-4021）乌鲁木齐超纯水机厂恒温震荡培养摇床上海博讯有限公司SYBRGreenI实时定量PCR仪瑞士罗氏公司微波炉日本松下电器公司凝胶成像分析系统美国BIO-Rad公司PCR扩增仪日本Takara公司磨菌管北京玻璃仪器厂1.2菌株结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株(简称H37Ra)、卡介苗菌株（简称BCG）均购自中国药品生物制品检定所，且由本实验室进行传代培养和保存。B/R融合菌株（简称B/R菌株）由本课题组构建、传代和保存。4 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究1.3主要试剂表-2实验中用到的主要试剂Tab-2Themainreagents试剂名称生产厂商谷氨酸钠北京索莱宝科技有限公司磷酸二氢钾天津市福尘化学试剂厂硫酸镁天津市福尘化学试剂厂柠檬酸铁铵天津市登科化学试剂有限公司柠檬酸镁天津市登科化学试剂有限公司丙三醇(甘油)天津永晟精细化工有限公司柠檬酸温州市化学用料厂孔雀绿天津市天达净化材料精细化工厂琼脂糖BIOWEST公司硫酸锌天津市福尘化学试剂厂5×TE上海生物工程有限责任公司RNeasyPlusUniversalMidiKit德国QIAGEN公司QuantiFastSYBRGreenPCRKit德国QIAGEN公司RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit美国ThermoScientific公司PCR引物上海生物工程有限责任公司DEPC美国Sigma公司溶菌酶北京索莱宝科技有限公司蛋白酶K美国Sigma公司氯仿上海生物工程有限责任公司HotMasterPCRMasterMix天根生化科技(北京)有限公司MarkerⅠ、Ⅱ天根生化科技(北京)有限公司Goldview北京索莱宝科技有限公司无水乙醇天津市登科化学试剂有限公司Tween-80天津化学试剂厂生理盐水（500mL）天津市登科化学试剂有限公司1.4主要试剂配制1.4.12%孔雀绿水溶液孔雀绿2g蒸馏水100mL称取2g孔雀绿粉末置于洁净的锥形瓶内，加入100mL蒸馏水后加温充分溶解，于高压锅中121℃高压灭菌20min，4℃冰箱冷藏保存。5 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究1.4.2125mg/ml溶菌酶溶菌酶0.125gRNase-Free去离子水1mL0.125g溶菌酶中加入1mLRNase-Free去离子水，混匀，-20℃冰箱冷冻保存、备用。1.4.320mg/ml蛋白酶K蛋白酶K0.02gRNase-Free去离子水1mL0.02g蛋白酶K中加入1mLRNase-Free去离子水，摇匀，-20℃冰箱冷冻保存、备用。1.4.41.5%琼脂糖凝胶琼脂糖粉1.5g1×TAE100mL称取琼脂糖粉末1.5g，加入100mL1×TAE溶液，微波炉加热（30s/2次）熔解至液体透亮，待温度降至50℃～60℃，加入8µL核酸染料Goldview，缓慢摇匀，轻缓倒入凝胶槽内20-30min，待自然凝固后取出置于1×TAE溶液内保存，近期使用。1.4.51%的琼脂糖凝胶琼脂糖粉0.4g1×TAE40mL称取琼脂糖粉0.4g，加入40mL1×TAE溶液，微波炉加热（30s/2次）熔解至液体透亮，待温度降至50℃～60℃，加入2.5μL核酸染料Goldview，缓慢摇匀，轻缓倒入凝胶槽内20-30min，待自然凝固后取出置于1×TAE溶液内保存，近期使用。1.4.6DEPC水的配置DEPC0.1g双蒸水100mL称取DEPC0.1g加入到100mL的双蒸水中，配成0.1%的DEPC溶液，室温处理过夜，于高压锅中121℃高压灭菌30min，除去残留的DEPC。1.4.710%SDS溶液SDS干粉10g去离子水100mL称取10gSDS干粉，加入灭菌去离子水80mL充分溶解后，定容至100mL，常温贮6 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究存备用。1.4.825％蔗糖溶液蔗糖25g去离子水100mL称取蔗糖25g，加入灭菌去离子水80mL充分溶解后，定容至100mL，121℃20min高压灭菌后4℃保存备用。1.4.910mg/mLRNaseA溶液RNaseA0.01g超纯水1000μL称取RNaseA0.01g，加入1000μL灭菌超纯水充分溶解后，4℃冰箱贮存备用。1.4.100.05%Tween80灭菌生理盐水溶液Tween800.25mL生理盐水500mL取0.25mL的Tween80原液置于高压灭菌的洁净玻璃瓶中，加入500mL生理盐水，充分缓慢混匀，121℃，20min高压灭菌后，4℃保存。1.4.11罗氏固体培养基的制备成分用量天门冬素（或纯度≥95%的谷氨酸钠）3.6g磷酸二氢钾1.2g柠檬酸镁0.3g硫酸镁0.12g丙三醇6mL新鲜鸡卵液500mL2%孔雀绿水溶液10mL蒸馏水300mL制备方法：1)基础液的配制：量取300mL的单次蒸馏水倒入1000mL的无菌烧杯中，相继加入谷氨酸钠3.6g、磷酸二氢钾1.2g、柠檬酸镁0.3g、硫酸镁0.12g和丙三醇6mL后，短时间多次加热使其完全溶解后，待自然冷却，备用。2)新鲜鸡卵液的制备：自来水清洗新鲜鸡蛋壳表面，把鸡蛋放于75%酒精或其他已配7 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究置好的消毒液。20~30min取出鸡蛋，滤纸擦干，开口，收集鸡蛋卵液至烧杯600mL刻度线处，然后充分搅匀（筷子或者搅拌器挑取部分鸡卵液，液体如清水样快速滴落，无丝状物），静置30min，用无菌纱布6~8层过滤鸡蛋卵液，取500mL。3)将第1）步骤中配制好的基础液与第2）步骤所制备的新鲜鸡蛋卵液进行混匀后，无菌注射器加入2%孔雀绿水溶液10mL（根据基础液与新鲜鸡蛋卵液的容量而进行调整），充分搅拌混匀，静置60min，将配置好的培养基分装到标准螺旋盖的无菌培养管中，每个无菌培养管7mL，倾斜放置于水浴锅架子上，培养基斜面约占无菌培养2管的2/3，斜面面积约4~5cm，经85℃蒸汽凝固灭菌器两次间歇灭菌50min~60min，待自然冷却。新制成的罗氏培养基颜色应呈绿色，培养基的斜面光滑，有一定的韧性和酸碱缓冲能力。4)制备好的培养基需进行无菌试验：将制备好的培养基放入37℃恒温箱或者室温下的实验室操作台上，24h后检查各培养管内有无杂菌生长，检查证实无污染后，4℃冰箱冷藏、避光保存，保质期1个月。1.4.12苏通（sauton）液体培养基的制备成分用量磷酸氢二钾0.5g硫酸镁0.5g柠檬酸2.0g天门冬素（或纯度≥95%的谷氨酸钠）4.0g柠檬酸铁铵0.05g硫酸锌0.01g甘油60mL双蒸水800mL量取300mL的双蒸水倒入1000mL的无菌锥形瓶中，相继加入磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，柠檬酸2g，天门冬素4g，柠檬酸铁铵0.05g，硫酸锌0.01g，甘油60mL。常规搅拌直至完全溶解后，氨水调节PH值至7.4～7.5，加双蒸水定容至1000mL，分装至锥形瓶（250mL规格），121℃高压灭菌30min，待自然冷却后置于4℃冷藏保存，备用。1.5实验动物C57BL/6雌性小鼠，6～8周龄，平均体重20±2g，由石河子大学医学院实验动物中心提供，饲养于石河子大学医学院《西部地区高发人兽共患传染性疾病防治》协同创新中心实验室（BSL-3）。8 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究2.实验方法2.1结核菌株的培养分别将BCG菌株、H37Ra菌株、B/R菌株接种于罗氏固体培养基中，置37℃恒温培养箱中培养，平均每周观察一次，一般需4周才能长成肉眼可见的菌落。培养基斜面上的菌落颜色为米黄色，不透明。生长良好的菌落较湿润，边缘圆整，菌落中央隆起呈颗粒、结节或菜花状。2.2结核菌株菌悬液的制备生物安全柜内，挑取罗氏固体培养基上培养时间为2~4周且生长状态良好的结核菌株的单个菌落，将其缓慢轻柔的置于已高压灭菌好的结核磨菌器的底部后，加入少量（1mL左右）含0.05％Tween-80的生理盐水（或Sauton液体培养基），进行充分研磨(8min~10min)直至混合液均匀浑浊无颗粒样菌落存在。最后用麦氏比浊仪对细菌浓度进行测定，用含0.05％Tween-80的生理盐水（或Sauton液体培养基）调整细菌浓度为71×10/mL。冻存管分装并标记（实验操作人员的姓名、配制时间、所配菌株名称以及菌液有效期），封口膜严密封口，-80℃冰箱冷冻保存备用。注意事项:1)在结核菌株菌悬液的整个制备过程中，操作人必须严格在生物安全柜内进行操作，并认真做好生物安全的相关防护（橡胶手套2层，N95口罩+棉口罩2层。）2)严格控制菌落处于安全可控范围，避免产生气溶胶。3)实验过程中产生的废弃物应严格按照《实验室生物安全》处理条例的相关规定，进行121℃高温高压灭菌处理后严密分装，再进行紫外线物理杀菌，加倍防止将病原微生物带出而污染环境。2.3结核菌株生长曲线的测定将上述制备好的所需菌悬液从-80℃冰箱中取出，待其完全融化后，取冻存管内混合菌液1mL，加入到含有100mLSauton液体培养基的锥形瓶（250mL规格）内，置37℃恒温震荡培养摇床内进行振荡培养，然后每隔3d取上述锥形瓶内的菌液1mL~2mL，测菌液在波长600nm处的OD值（测菌液OD值前先用Sauton液体培养基进行“调零”校准），连续测定30天。以测试的培养时间点（Time）为横坐标，所测菌液的OD600值为纵坐标，绘制BCG菌株、H37Ra菌株以及B/R菌株的生长曲线，并观察其培养过程中的生长特点。2.4菌株感染动物120只C57BL/6雌性小鼠，随机分成3组，每组30只小鼠。每组小鼠分别皮下注6射已制备好的H37Ra、BCG和B/R菌株的菌悬液0.1mL（含活菌数为1.0×10个）。9 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究2.5细菌在器官内定植实验感染小鼠15d、30d、45d、60d、75d后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，然后无菌条件下解剖小鼠并分离肝脏、脾脏和肺脏。组织匀浆器充分磨碎上述脏器，用含0.05％Tween-80的生理盐水（或Sauton液体培养基）将组织匀浆进行稀释，混匀，吸取0.1mL脏器匀浆液标本使其均匀接种于罗氏固体培养基上(每一只小鼠的每一个脏器标本重复接种三个培养管)，然后放在5%CO2，37℃恒温培养箱中，培养20天后计数罗氏培养基斜面上的菌落数。[21]计算公式：S(CFU)=M×(O+V)/O×10M3个罗氏培养管上菌落数的均数；10接种量为0.1mL，相当于1/10g为常数；×10为每g器官里的结核菌数；O为器官的重量(g)；V为加入NS或Sauton液体培养基的体积，1mL=lg；S为每只小鼠该脏器的结核菌数，单位为（CFU/g）。2.6融合菌株B/R菌株的连续传代培养表-3B/R菌株连续传代培养时间一览表Tab-3TableofcontinuoussubculturetimeofB/Rstrain菌株传代菌株冻存代次时间时间操作人数量（管）数量（管）（年-月-日）（年-月-日）0（原代）2013-09-29112013-10-217FC12013-10-21122013-11-124FC22013-11-1262013-12-047FC/LXL32013-12-0492014-01-1010FC/LXL42014-01-10122014-03-126LXL52014-03-1292013-04-044LXL62013-04-0462014-05-093LXL72014-05-0962014-06-027LXL82014-06-02122014-07-108LXL92014-07-10152014-09-2111LXL102014-09-21202014-10-198LXL112014-10-19122014-11-134LXL122014-11-1392014-12-063LXL10 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究菌株传代菌株冻存代次时间数量时间操作人数量（管）（年-月-日）（管）（年-月-日）132014-12-0662015-01-127LXL142015-01-12152015-03-085LXL152015-03-0892015-04-036LXL162015-04-03122015-05-166LXL/ZHY/ZS172015-05-16122015-06-054LXL/ZHY182015-06-0592015-06-254LXL192015-06-2562015-07-157LXL/ZS202015-07-15122015-08-0510ZHY/ZS2.7结核菌株总RNA的提取按照RNeasyPlusUniversalMidiKitRNA提取试剂盒的说明书提取前期培养的BCG、H37Ra菌株和B/R菌株的总RNA，具体操作步骤如下：1)用接菌环收集5~6次的上述结核菌株标本，放入含300μL5×TE（0.01Mtris-HCl，pH8.0，0.001MEDTA）溶液的无酶EP管（2mL规格）中，水浴锅中80℃灭活30min。然后加入溶菌酶（0.2g/mL）80μL、蛋白酶K（0.02g/mL）20μL，用涡旋震动混匀器将上述溶液震荡混匀10min后，静置10min左右。然后将无酶EP管严密封口后，再次混匀，放置于水浴锅中37℃水浴过夜（12h左右）。2)次日，无酶EP管中加入600μL裂解液（QIAzol），放置10min，涡旋震动10min强力混匀后，室温（25℃）静置3-5min。3)加入100μLgDNAEliminatorSolution，盖上EP管盖，强力混匀15s。4)加入180μL氯仿，盖上EP管盖，强力混匀15s，室温静止2-3min。然后12000×g4℃离心15min。（离心之后，EP管中的液体分为3相：上层无色液相（包含RNA，体积约3mL）；白色中间相；下层红色有机相。）5)取上层无色液相（约为600μL）转移至一个新的无酶离心管中。6)加入同体积（约600μL）的70%乙醇，枪头吹打彻底均匀后（沉淀重悬），快速进入下一步骤。7)取上述约700μL的样品置2mL收集管中的RNeasyMinispincolumn粉色（试剂盒提供）上。轻盖上收集管的盖子，室温（25℃）8000×g离心15s，弃去流出液。剩余的上述沉淀重悬液体样品继续重复本次操作。8)在RNeasyspincolumn中加入700μLBufferRWT（BufferRWT加入2体积后乙醇（96%-100%）的混合液体），轻盖上管盖，室温≥8000×g离心15s洗膜，弃去流出液。离心之后，将RNeasyspincolumn轻轻从收集管中取下，操作过程中RNeasyspin11 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究column不能接触到流出液。确保收集管中的液体已经完全弃去。9)在RNeasyspincolumn加入500μLBufferRPE（BufferRPE加入4体积后乙醇（96%-100%）的混合液体），轻盖上管盖，室温≥8000×g离心15s洗膜，弃流出液。10)在RNeasyspincolumn再次加入500μLBufferRPE，≥8000xg离心2min洗膜。实验中长时间的离心，可以使膜干燥。然后，确保在RNA洗脱时没有乙醇残留。注：离心之后，将RNeasyspincolumn轻轻从收集管上取出，不要接触到流出液，以防沾带上乙醇。11)将RNeasyspincolumn放置于一个新的2mL收集管（试剂盒提供）中。然后直接向离心柱膜中加入30-50μLRNase-free水。轻轻地盖上管盖。静置1min（充分洗脱RNA）。然后，室温≥8000xg离心1min。12)再次加入30-50μLRNase-free水重复第11步，或是将第11步的洗脱液再次加入到离心柱膜中，重复第11步（提高所提RNA浓度）。13)得到的RNA置-80℃冰箱冻存，备用。2.8RNA的质量检测吸取上述提取的RNA1-2μL，用Nanodrop2000紫外分光光度计对其浓度和纯度进行测定；用1.0%琼脂糖凝胶电泳对其完整性进行检测。2.9结核菌株总RNA的反转录反应按照RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit反转录试剂盒的说明书反转录上述所提菌株的总RNA，具体操作步骤如下：1)冰上溶解所提菌株的总RNA。室温（15–25°C）溶解oligo(dT)18primer、nuclease-freeWater、5×ReactionBuffer、RiboLockRNaseInhibitor、mMdNTPMix和RevertAidM-Mulv-ReverseTranscriptase。融化后，将试剂盒中各试剂管轻弹混匀，然后瞬时离心收集附着于管壁上的试剂水滴，置于冰上。2)按照表4，在冰上准备gDNA去除反应体系。然后按照RNA模板的量进行分装。整个实验需要保持冰上操作。表-4基因组DNA消除反应的组成Tab-4GenomicDNAeliminationreactioncomponents组成体积终浓度5×ReactionBuffer1μL1×TemplateRNA1μLDNAenzymeI1μLRNase-freewater7μL总体积10μL12 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究3)37℃孵育30min，然后立即置冰上。4)然后加入1μL50mMEDTA，65℃孵育10min。5)使用制备好的RNA为模板，按照表5准备反转录反应体系，进行逆转录反应。轻弹混匀并瞬时离心后置于冰上（置于冰上的200μL无酶PCR管中的反应物，按照如下表格中的顺序加入）。表-5反转录反应的组成Tab-5Reverse-transcriptionreactioncomponents组成体积终浓度oligo(dT)18primer1μL1×TemplateRNA2μLnuclease-freeWater9μL总体积12μL6)PCR仪65℃孵育5min，冰上冷却，瞬时离心后，再置于冰上冷却。7)按照顺序加入下列组分组成体积终浓度5×ReactionBuffer4μL1×RiboLockRNaseInhibitor1μL10mMdNTPMix2μL2μLRevertAidM-Mulv-ReverseTranscriptase1μL总体积20μL8)轻弹混匀，瞬时离心。9)42℃孵育60min。10)70℃孵育5min，瞬时离心，放于-80℃冰箱保存备用。2.10SYBRGreenI实时荧光定量PCR1)反应体系试剂体积终浓度2×UltraSYBRMixture12.5μL1×ForwardPrimer,10μM0.5μL0.2μMReversePrimer,10μM0.5μL0.2μMTemplatecDNA1.0μLnuclease-freeWater10.5μL总体积25.0μL13 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究2)反应条件步骤温度时间预变性95℃10min变性95℃15s40个循环退火/延伸57℃/60℃1min融解曲线分析95℃15s60℃1min60℃15s3)数据采集实验过程中，不同菌株esat-6、ag85b、mpt70、mpt83和内参SigA基因的cDNA各设3个平行反应孔。采用SYBRGreenI实时荧光定量PCR仪配套的7500software—△Ctv2.0.6软件完成数据采集，根据基因相对表达量２的公式计算目的基因的mRNA的相对表达量。2.11结核菌株基因组DNA的制备1)用一次性无菌接菌环挑取足量（5-6次）生长状态良好的结核菌株菌落置含有300μL1×TEbuffer溶液的无菌EP管（2mL规格）中，严密封口后放入80℃恒温水浴锅中灭活30-40min；2)从水浴锅中取出EP管，放到涡旋震荡器上震荡20min或者用1000μL枪头适度研磨制成灭活的菌悬液，然后再依次加入10%SDS溶液500μL，125g/L溶菌酶溶液80μL，25%蔗糖溶液50μL及20g/L蛋白酶K溶液20μL，轻弹EP管混匀后放入37℃恒温水浴锅水浴5h。3)将水浴后的菌悬液3000rpm，4℃，离心10min。4)移上清液于一新的无菌EP管中，然后加入等体积酚︰氯仿（1︰1）混合液700μL抽提一次，常温下温和混匀10min后，12000rpm，4℃离心10min。5)取上清液至一新的无菌EP管中，加入RNaseA至终浓度100μL/mL，37℃温育1h；再加入等体积酚︰氯仿溶液抽提一次，12000rpm，4℃离心10min。6)取上清液至一新的无菌EP管中，再加入等体积酚︰氯仿︰异戊醇(25︰24︰1），混匀后12000rpm，4℃离心10min。7)移上清至一新的无菌EP管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇混匀，-20℃冰箱沉淀过夜。8)取出上述混合物，10000rpm，4℃离心10min，弃上清。9)加入70%乙醇洗涤沉淀，室温下轻柔的混匀10min，10000rpm，4℃离心10min，弃上清。10)室温空气充分干燥后加入适量1×TEbuffer溶液，4℃放置3h。14 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究11)取少量上述样品溶液（1-2μL）用于DNA浓度及纯度的检测，（3-5μL）用于琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余的置于-20℃冰箱中贮存备用。2.12PCR扩增esat-6、ag85b、mpt70和mpt83基因1)反应体系试剂体积2×PCRMasterMix12.5μLForwardPrimer0.5μLReversePrimer0.5μLTemplateDNA2μLddH2O9.5μL总体积25μL2)反应条件步骤温度时间预变性95℃5min变性95℃45s退火67℃45s35个循环延伸72℃45s终延伸72℃10min3)电泳吸取5μL的PCR扩增产物，用1.5%琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳120V30min。2.13引物的设计及合成根据GeneBank上提供的H37Rv菌株esat-6、ag85b、mpt70、mpt83和内参SigA基因的序列，用Primer5和Oligo软件设计上述基因引物，由上海生物工程有限公司合成。具体引物序列见表6和表7。表-6PCR扩增引物Tab-6PCRprimers基因名称引物序列扩增片段（bp）退火温度（℃）FP:CGCGGATCCATGACAGAGCAGCAGTGGAATesat628867RP:CCCAAGCTTTGCGAACATCCCAGTGACGTFP:CGCGGATCCTCAGCCGGCGCCTAACGAag85b97867RP:CCCAAGCTTGATGACAGACGTGAGCCGAAA15 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究基因名称引物序列扩增片段（bp）退火温度（℃）FP:CGCGGATCCAAGGTAAAGAACACAATTGCGmpt7058267RP:CCCAAGCTTGCGCCGGAGGCATTAGCACFP:CGCGGATCCATCAACGTTCAGGCCAAACCmpt8366367RP:CCCAAGCTTGCTGTGCCGGGGGCATCAG表-7esat-6、ag85b、mpt70和mpt83基因及内参基因SigA的引物序列Tab-7Primersequencesofesat-6,ag85b,mpt70,mpt83geneandreferencegeneSigA基因名称引物序列扩增片段（bp）退火温度（℃）FP:CATTCATTCCCTCCTTGACGesat613258RP:GCGTTGTTCAGCTCGGTAGFP:TGCGGTTTATCTGCTCGACag85b14458RP:CAGTCGCTGTAGAAGCTGGAFP:CAACAGCGGTCAGTACACGmpt7012458RP:TACGTGGTAGGTCAGGATGCFP:CTGAACCCGGATGTGAATCTmpt8312558RP:TTGGCGTCAGTCTTGAGTTGFP:TCGAGGTGATCAACAAGCTGSigA25455-60RP:CTGCAGCAAAGTGAAGGACA3.统计分析采用SPSS17.0软件进行统计学分析，对不同菌株在肝脏、脾脏和肺脏定植的Log10cfu以及不同菌株esat-6、ag85b、mpt70和mpt83基因的△Ct值进行正态性检验及方差齐性检验，所有数据采用均数±标准差（±s）表示。比较之间有无统计学差异，采用One-WayANOVA单因素方差分析，用Student-Newman-Keus（S-N-K法）做两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。16 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究结果(Results)1.结核菌株的培养将BCG、H37Ra和B/R菌株接种于罗氏固体培养基中，置5%CO2、37℃恒温培养箱中进行培养，每周观察菌落的生长情况，一般需2~4周能长成肉眼可见的菌落。培养基斜面上的菌落颜色为米黄色，不透明。生长良好的菌落较湿润，边缘圆整，菌落中央隆起呈颗粒、结节或菜花状。（见图1）。图1B/R菌株、H37Ra菌株以及BCG的培养Fig.1ThecultivationofB/Rfusionstrains,BCGstrainsandH37Rastrains2.结核菌株生长曲线的测定BCG和H37Ra菌株培养3天后即进入生长对数期，培养24天后进入平台稳定期。B/R菌株培养6天后才进入生长对数期阶段，培养27天后进入平台稳定期。如图2所示，B/R菌株的生长周期与BCG和H37Ra两亲本菌株的生长周期整体上相近。但生长调整期为6天，比BCG和H37Ra两亲本菌株的3天时间稍长。图2BCG、H37Ra和B/R菌株的生长曲线Fig.2ThegrowthcurveofB/Rfusionstrains,BCGstrainsandH37Rastrains17 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究3.B/R融合菌株在小鼠各脏器的定植情况3.1B/R融合菌株在小鼠肝脏的定植情况皮下接种B/R菌株、BCG和H37Ra菌株后的15、30、45、60和75天，在小鼠肝脏的定植情况见表1，图3。在相同的免疫时间点，小鼠肝脏内定植的Log10cfu以B/R菌株最高，其次H37Ra菌株，BCG菌株最低，但三组之间进行比较差异无统计学意义（P>0.05）。且随着免疫时间的增加，三种菌株在小鼠肝脏内的Log10cfu有升有降，时间趋势无显著性特点。表1细菌在小鼠肝脏定植情况（±s,n=6）Tab.1Thecolonizationofbacteriainmiceliver（Log10cfu）（±s,n=6）Log10cfu（肝脏）时间B/RH37RaBCG15d2.08±0.161.96±0.101.84±0.0730d2.16±0.081.86±0.201.69±0.2345d2.01±0.071.85±0.131.87±0.0860d2.13±0.101.99±0.091.87±0.1375d2.04±0.091.93±0.191.79±0.12图3细菌在小鼠肝脏定植情况Fig.3Thecolonizationofbacteriainmiceliver（Log10cfu）3.2B/R融合菌株在小鼠脾脏的定植情况皮下接种B/R菌株、BCG和H37Ra菌株后的15、30、45、60和75天，在小鼠脾脏的18 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究定植情况见表2，图4。在相同的免疫时间点，B/R菌株在小鼠脾脏内定植的Log10cfu以B/R菌株最高，其次H37Ra菌株，BCG菌株最低。其中，在五个不同免疫时间点，B/R菌株在小鼠脾脏内定植的Log10cfu均明显高于BCG菌株，差异有统计学意义（P<0.05）；在免疫后的15、60以及75天，B/R菌株在小鼠脾脏内定植的Log10cfu高于H37Ra菌株，差异有统计学意义（P<0.05），其他免疫时间点B/R菌株在小鼠脾脏内定植的Log10cfu也稍高于H37Ra菌株，但差异无显著性（P>0.05）。且随着免疫时间的增加，三种菌株在小鼠脾脏内定植的Log10cfu整体呈下降趋势，其中以BCG菌株的下降趋势最为明显。但在免疫后的75天，H37Ra和B/R菌株在小鼠脾脏内的Log10cfu较60天有小幅度的上升，而BCG在小鼠脾脏内的Log10cfu仍呈下降趋势。表2细菌在小鼠脾脏定植情况（±s,n=6）Tab.2Thecolonizationofbacteriainmicespleen（Log10cfu）（±s,n=6）Log10cfu（脾脏）时间B/RH37RaBCG△＃15d3.75±0.113.65±0.063.56±0.09＃30d3.62±0.103.59±0.043.30±0.06＃45d3.45±0.073.41±0.073.28±0.11△＃60d3.25±0.053.21±0.033.12±0.03△＃75d3.34±0.093.26±0.053.05±0.07注：△与H37Ra比较P<0.05；＃与BCG比较P<0.05Not：△comparedwithH37RagroupP<0.05;＃comparedwithBCGgroupP<0.05图4细菌在小鼠脾脏定植情况Fig.4Thecolonizationofbacteriainmicespleen（Log10cfu）19 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究3.3B/R融合菌株在小鼠肺脏的定植情况皮下接种B/R菌株、BCG和H37Ra菌株后的15、30、45、60和75天，在小鼠肺脏的定植情况见表3，图5。相同免疫时间下，B/R菌株在小鼠肺脏内定植的Log10cfu以B/R菌株最高，其次H37Ra菌株，BCG菌株最低。其中，在五个不同免疫时间点，B/R菌株在小鼠肺脏内定植的Log10cfu均明显高于BCG菌株，差异有统计学意义（P<0.05）；在免疫后的15和45天，B/R菌株在小鼠肺脏内的Log10cfu高于H37Ra菌株，差异有统计学意义（P<0.05），其他免疫时间点B/R菌株在小鼠脾脏内定植的Log10cfu也高于H37Ra组，但差异无显著性（P>0.05）。且随着免疫时间的增加，三种菌株在小鼠肺脏内定植的Log10cfu整体呈下降趋势。表3细菌在小鼠肺脏定植情况（±s,n=6）Tab.3Thecolonizationofbacteriainmicelung（Log10cfu）（±s,n=6）Log10cfu（肺脏）时间B/RH37RaBCG△＃15d3.49±0.103.26±0.112.98±0.11＃30d3.24±0.073.11±0.082.77±0.17△＃45d3.13±0.042.89±0.162.57±0.17＃60d2.86±0.112.83±0.122.32±0.05＃75d2.54±0.182.44±0.162.13±0.06注：△与H37Ra比较P<0.05；＃与BCG比较P<0.05Not：△comparedwithH37RagroupP<0.05;＃comparedwithBCGgroupP<0.05图5细菌在小鼠肺脏定植情况Fig.5Thecolonizationofbacteriainmicelung（Log10cfu）20 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究4.细菌总RNA的提取提取的细菌总RNA吸光度比值（A260/A280）在1.8～2.0之间，A260大于1，浓度在280ug/μL左右。用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，可见23SRNA、16SRNA以及5SRNA条带清晰如图6所示，提示提取的总RNA完整性良好。图6菌株的总RNA电泳图1,2：B/R菌株RNA3,4：BCG菌株RNA5,6：H37Ra菌株RNAFig.6TotalRNAelectrophoresisofstrains1,2B/RstrainsRNA3,4BCGstrainsRNA5,6H37RastrainsRNA5.B/R菌株中esat6、ag85b、mpt70和mpt83免疫保护抗原基因的mRNA相对表达量5.1mpt70基因的mRNA相对表达水平BCG、H37Ra以及B/R菌株中mpt70基因的△Ct检测结果见表4。根据基因表达-△Ct量2的公式计算上述三种菌株中mpt70基因的mRNA相对表达量见图7。与BCG菌株比较，mpt70基因在B/R融合菌株中的mRNA表达水平下调0.08倍，差异无统计学意义（P>0.05）；在H37Ra菌株中的mRNA表达水平下调0.71倍，差异有统计学意义（P<0.05）。与H37Ra菌株比较，mpt70基因在B/R融合菌株中的mRNA表达水平上调3.17倍，差异有统计学意义（P<0.05）；在BCG菌株中的mRNA表达水平上调3.45倍，差异有统计学意义（P<0.05）。表4mpt70基因在不同菌株中△Ct值的检测结果（±s,n=5）Tab.4△Ctresultofmpt70geneexpressionindifferentstrains（±s,n=5）分组次数均值±标准差F值P值Groupn±sFvaluePvalue△BCG5-0.39±0.15△B/R5-0.26±0.19412.6520.00<0.05H37Ra51.41±0.17＃注：△与H37Ra比较P<0.05；＃与BCG比较P<0.05Not：△comparedwithH37RagroupP<0.05;＃comparedwithBCGgroupP<0.0521 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究图7mpt70基因的mRNA表达水平Fig.7mpt70geneexpressionatmRNAlevel5.2mpt83基因的mRNA相对表达水平BCG、H37Ra以及B/R菌株中mpt83基因的△Ct检测结果见表5。根据基因表达-△Ct量2的公式计算上述三种菌株中mpt83基因的mRNA相对表达量见图8。与BCG菌株比较，mpt83基因在B/R融合菌株中的mRNA表达水平下调0.09倍，差异无统计学意义（P>0.05）；在H37Ra菌株中的mRNA表达水平下调0.52倍，差异有统计学意义（P<0.05）。与H37Ra菌株比较，mpt83基因在B/R融合菌株中的mRNA表达水平上调1.90倍，差异有统计学意义（P<0.05）；在BCG菌株中的mRNA表达水平上调2.08倍，差异有统计学意义（P<0.05）。表5mpt83基因在不同菌株中△Ct值的检测结果（±s,n=5）Tab.5△Ctresultofmpt83geneexpressionindifferentstrains（±s,n=5）分组次数均值±标准差F值P值Groupn±sFvaluePvalue△BCG5-1.35±0.15△B/R5-1.22±0.17167.1810.00<0.05H37Ra50.28±0.16＃注：△与H37Ra比较P<0.05；＃与BCG比较P<0.05Not：△comparedwithH37RagroupP<0.05;＃comparedwithBCGgroupP<0.0522 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究图8mpt83基因的mRNA表达水平Fig.8mpt83geneexpressionatmRNAlevel5.3esat6基因的mRNA相对表达水平BCG、H37Ra以及B/R菌株中esat6基因的△Ct检测结果见表6。根据基因表达量-△Ct2的公式计算上述三种菌株中esat6基因的mRNA相对表达量见图9。与H37Ra菌株比较，esat6基因在B/R融合菌株中的mRNA表达水平上调2.01倍，差异有统计学意义（P<0.05）。esat6基因在BCG菌株中缺失表达。表6esat6基因在不同菌株中△Ct值的检测结果（±s,n=5）Tab.6△Ctresultofesat6geneexpressionindifferentstrains（±s,n=5）分组次数均值±标准差F值P值Groupn±sFvaluePvalueH37Ra5-0.30±0.16△B/R50.69±0.1913.8830.00<0.05BCG5—注：△与H37Ra比较P<0.05Not：△comparedwithH37RagroupP<0.0523 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究图9esat6基因的mRNA表达水平Fig.9esat6geneexpressionatmRNAlevel5.4ag85b基因的mRNA相对表达水平BCG、H37Ra以及B/R菌株中ag85b基因的△Ct检测结果见表7。根据基因表达量-△Ct2的公式计算上述三种菌株中ag85b基因的mRNA相对表达量见图10。与H37Ra菌株比较，ag85b基因在B/R融合菌株中的mRNA表达水平上调1.92倍，差异有统计学意义（P<0.05）。ag85b基因在BCG菌株中缺失表达。表7ag85b基因在不同菌株中△Ct值的检测结果（±s,n=5）Tab.7△Ctresultofag85bgeneexpressionindifferentstrains（±s,n=5）分组次数均值±标准差F值P值Groupn±sFvaluePvalueH37Ra50.31±0.31△B/R51.42±0.2312.4680.00<0.05BCG5—注：△与H37Ra比较P<0.05Not：△comparedwithH37RagroupP<0.0524 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究图10ag85b基因的mRNA表达水平Fig.10ag85bgeneexpressionatmRNAlevel6.B/R融合菌株中esat6、ag85b、mpt70和mpt83基因水平的稳定性将B/R菌株传代培养20个代次，提取第1代至第20代B/R菌株的基因组DNA，并以其为模版，PCR分别扩增esat6、ag85b、mpt70和mpt83四个重要的抗原免疫性基因。结果显示从第1代到第20代的B/R菌株中均可扩增获得esat-6（288bp）、ag85b（978bp）、mpt70（582bp）以及mpt83（663bp）基因，且大小位置相同，条带清晰明亮。由此证明B/R融合菌株在20个代次内的基因水平达到了生物制品的要求。如图11显示的是第1、4、7、10、15、20代次扩增条带的结果。M147101520M147101520M147101520M147101520esat6ag85bmpt70mpt83图11B/R融合菌株esat6、ag85b、mpt70和mpt83基因水平的稳定性Fig.11Thestabilityofesat6,ag85b,mpt70andmpt83geneexpressionlevelatB/Rfusionstrains25 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究讨论（Discussion）研究表明，面对现今如此复杂化的结核流行现状，传统的BCG既不能阻止内源性[22]休眠结核菌的复燃，也不能阻止成人外源性结核菌的再感染，并且其在结核病的免疫保护力方面也存在较大差异（保护效果0～80%不等），而且其对已感染过非结核分枝杆菌人群的保护效果也存在明显不足，因此BCG已不能为常见成人肺结核提供很好的免疫保护，同时也让全球结核病的发病率有了再度回升的趋势。由于人口流动增加、HIV与结核分枝杆菌伴发感染以及多重耐药（multidrug-resistant,MDR）和广泛耐药（extensivelydrug-resistant,XDR）结核分枝杆菌的出现，致使结核病的致病因素更加复杂化，同时结核病的预防工作也变得更加艰难。因此探索和研发一种比BCG更为安全、有效且能够广泛被应用的结核疫苗是当今国际社会刻不容缓的重大科学任务。首先，理想的结核疫苗需要在免疫接种的宿主体内有一定的生长繁殖能力又称定植性，这样可以持续不断地刺激宿主的机体产生免疫应答，发挥抗结核分枝杆菌感染的作用，从而预防结核病发生。其次，理想的结核疫苗需要在一定的传代过程中保证疫苗本身具有遗传稳定性，这样可以保证疫苗免疫原性的稳定持久，进而保证疫苗被免疫接种在不同人群中所产生的免疫保护力相近或者无明显差异。而且疫苗遗传稳定不仅减少了疫苗本身一些主要免疫抗原的缺失或突变的可能性，也保证了免疫应答的有效性，大大减少了疫苗被免疫接种的次数，只需一次或少数几次。因此，本试验是以课题组前期成功构建的B/R融合菌株为抗结核病的候选疫苗菌株，重点研究其在定植特性和遗传稳定性方面的情况。用于抗结核感染的候选疫苗菌株需要其本身能够在被免疫接种的宿主体内定植下来，并且在其所免疫的宿主体内定植的时间长短与其被免疫接种后所诱导宿主产生的记忆性免疫具有密切的相关性。通过Sauton液体培养基对BCG、H37Ra以及B/R菌株进行培养，测定不同培养时间点下菌液的OD值，绘制出上述三种菌株的生长曲线图，观察B/R菌株作为候选疫苗菌株与BCG和H37Ra菌株两亲本菌株在生长特性方面是否一致。而根据所绘的生长曲线图可以发现，B/R菌株在培养早期阶段它的生长适应期较BCG和H37Ra菌株长，培养6天后才开始进入对数生长期，这可能是由于前期电融合构建该菌株的过程中电压对菌株本身所造成的伤害，致使融合菌株在后期培养过程中需较长时间适应培养环境并调整生长状态。而在对数生长阶段，所测B/R菌株菌液的OD600值在同一时间点较BCG和H37Ra菌株要高，这可能提示B/R菌株作为候选疫苗菌株其在体外培养过程中具有一定生长繁殖能力，并且这种生长繁殖能力较其两亲本菌株较强。通过后续动物体内实验进一步验证发现，B/R菌株、BCG和H37Ra菌株在小鼠的肝脏、脾脏和肺脏内定植的Log10cfu以B/R菌株最高，其次为H37Ra菌株，BCG菌株最低。其中，B/R菌株在小鼠肝脏内定植的Log10cfu高于BCG和H37Ra菌株组，但差异无显著性（P>0.05）；26 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究而在一定的免疫时间点，B/R菌株在小鼠脾脏和肺脏内定植的Log10cfu也高于BCG和H37Ra菌株且差异具有统计学意义（P<0.05）。这可能提示B/R菌株作为候选疫苗菌株其在宿主体内的定植性较BCG和H37Ra两亲本菌株较强。同时还发现B/R菌株、BCG和H37Ra三种菌株在小鼠肝脏、脾脏以及肺脏定植的Log10cfu以脾脏最高，肺脏次之，肝脏最少。这可能是因为脾脏本身作为机体重要的免疫器官其富含淋巴细胞，且大多吞噬了细菌的巨噬细胞也会经淋巴血液循环聚集停留在脾脏中而免疫性细胞所识别、提呈、裂解或清除，只有少量吞噬了细菌的巨噬细胞经血循环定居于肺脏和肝脏，因此三种菌株在小鼠脾脏内定植的Log10cfu最高。由于结核分枝杆菌主要通过飞沫传播经呼吸道进入机体而感染肺脏，且常见为肺结核，提示肺脏较肝脏可能更易被MTB定植感染，所以肺脏内定植的Log10cfu次之，肝脏最低。并且发现随着免疫时间的增加，三种菌株在小鼠脾脏和肺脏内定植的Log10cfu整体呈下降趋势，这可能是由于随着免疫时间的增加，小鼠机体的免疫细胞通过识别、提呈以及裂解或清除等一系列的免疫保护机制清除了部分MTB，从而使小鼠脾脏和肺脏内定植的Log10cfu呈下降趋势。综上所述，B/R菌株作为候选结核疫苗在小鼠宿主体内具有一定的定植能力，且定植时间至少为75天，这对拟选择B/R融合菌株作为候选活菌疫苗具有重要的数据性参考意义。结核分枝杆菌是微生物界典型的细胞内寄生菌，其主要寄居于巨噬细胞（MΦ）的吞噬小体内，通过抑制吞噬体与溶酶体的融合，让溶酶体酶激活受到阻遏，避开特异性抗体和CTL对自身的免疫攻击，从而得以在宿主细胞内安全的存活生长。研究证明，+传统的BCG并不能有效的刺激CD8T细胞免疫反应，主要原因是因为缺少了Th1细胞介导参与的细胞免疫反应，而能够强效诱导Th1细胞免疫反应就需要有诱导其产生强烈免疫反应的特异性保护抗原。这主要是因为特异性的保护性抗原能够通过免疫识别作用诱发机体产生一系列强有效的细胞免疫反应，从而清除如结核分枝杆菌此类细胞内寄生的病原体。所以说特异性保护抗原在抗结核感染方面占有重大地位，这对结核候选疫苗[23]研发在起到了重要的指导作用。BCG和H37Ra菌株单独作为预防结核病的疫苗都存在着一定的不足和缺陷，但在生[19,20]物特性和遗传性状等方面它们又具有一定的互补性。首先，BCG是由WHO组织推荐用于预防结核病的疫苗，从1948年研发成功以来接种数量已超过30亿人次，是全球范围内应用最为广泛的抗结核疫苗，其并发症极少且安全性好。但传统的卡介苗在体外长[24]期传代培养过程中不断丢失保护性抗原基因致使其免疫原性及保护力大大降低。而研究发现，H37Ra菌株却拥有BCG缺失的这些具有重要免疫保护作用的抗原基因（例如：[16]esat-6，ag85b），并且这些基因能够刺激和诱导机体产生强烈的细胞免疫应答，在结[25-27]核病的防治中有着重要的作用。其次，人型结核杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株是[28]Steeken等人于1934年从人型结核杆菌H37Rv有毒菌株中分离而获得的减毒株，其具有较完整的免疫原性，但对人类还是存在一定的毒力作用。所以本课题组前期成功构建的B/R菌株，以BCG和H37Ra为亲本利用原生质体融合技术电融合而成，集合了BCG和H37Ra菌株双亲特异性状于一体，以期其能够弥补BCG27 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究和H37Ra菌株单独作为结核病疫苗菌株存在的缺陷，拟作为结核候选疫苗菌株而进行进一步的研究。Greenwald等的研究证明mpt83和mpt70是牛分枝杆菌主要的特异性分泌抗原，不但能够刺激机体产生强效的细胞免疫反应，也能够引发机体的体液免疫，具有[29-31]重要的免疫原性和免疫保护作用，并在M.bovisBCG中也特异性表达。分泌性蛋白esat-6和ag85b是人型结核分枝杆菌特有的抗原，且存在于H37Ra菌株中，但非致病性的分枝杆菌以及M.bovisBCG中并不存在，两者均能够刺激机体产生强效的细胞免疫以及[32,33]体液免疫。因此，对上述四种特异性保护抗原基因传代稳定性的研究，是B/R菌株作为结核候选疫苗菌株进一步有益探索。qRT-PCR检测结果显示，与BCG菌株比较，mpt70在B/R融合菌株中的mRNA表达水平下调0.08倍，差异无统计学意义（P>0.05）；mpt83在B/R融合菌株中的mRNA表达水平下调0.09倍，差异无统计学意义（P>0.05）。与H37Ra菌株比较，mpt70在B/R融合菌株中的mRNA表达水平上调3.17倍，差异有统计学意义（P<0.05）；mpt83在B/R融合菌株中的mRNA表达水平上调1.90倍，差异有统计学意义（P<0.05）；esat6在B/R融合菌株中的mRNA表达水平上调2.01倍，差异有统计学意义（P<0.05）；ag85b在B/R融合菌株中的mRNA表达水平上调1.92倍，差异有统计学意义（P<0.05）。结果显示esat6、ag85b、mpt70和mpt83在B/R融合菌株中均有表达，并且相较于BCG和H37Ra两亲本菌株四种基因的相对表达量均有所不同，且具有统计学意义。结果表明本课题组前期成功构建的B/R融合菌株能够很好的有效表达上述四种特异性保护抗原基因，提示B/R菌株从BCG和H37Ra两亲本菌株处获得了mpt70、mpt83、esat6以及ag85b四种特异性保护抗原的遗传信息，这将大大提高B/R菌株作为结核候选疫苗的机会，同时也为后期疫苗在传代稳定性方面的检测提供了方向。[34]研发疫苗最大的挑战就是疫苗安全性的检验。首先，传代稳定性是疫苗临床研究的安全性基础，也是疫苗安全性方面检测必不可少的项目。其次，候选疫苗菌株特异性抗原基因的传代稳定性能够很大程度上确保疫苗在后续的连续传代培养过程中不会因为发生基因的丢失或蛋白表达不稳定的情况而影响其在抗结核感染中的免疫效果。对于本研究B/R菌株来说，保护性抗原基因在菌株传代过程中的稳定表达是作为结核候选疫苗探索研究过程中最为关键的检测项目之一。将B/R菌株连续传代培养20个代次，并提取每代B/R菌株的基因组DNA并PCR扩增esat6、ag85b、mpt70和mpt83四种特异性保护抗原基因。结果显示（如图3-11），从第1代到第20代的B/R菌株均可扩增得到esat-6（288bp）、ag85b（978bp）、mpt70（582bp）和mpt83（663bp）四个保护性抗原基因的条带，且大小位置相同，条带清晰明亮。提示B/R菌株在20个代次内，其基因水平达到了生物制品传代稳定的要求。综上所述，本实验研究的B/R融合菌株在C57BL/6小鼠体内各脏器内均能定植生长，且在小鼠体内至少可以生长存活75天，并且其定植能力比BCG和H37Ra较强。同时B/R融合菌株作为结核候选疫苗菌株，它继承了两亲本菌株BCG和H37Ra优良的基因遗传信息，且在20个代次以内其分子遗传学特性较稳定。28 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究结论(Conclusion)1.B/R菌株的生长周期为30天，其在小鼠体内至少可存活75天，且定植能力较强。2.B/R菌株在个代次内的基因水平达到了生物制品传代稳定性的要求。29 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究参考文献(Reference)[1]WHO.2015.http://www.who.int[2]WorldHealthOrganization.Globaltuberculosisconcml-epidemiology,strategy,financing[R/OL].WorldHealthOrganization2009.WHO/HTM/TB/2009.411.[3]全国结核病流行病学调查技术指导组.第五次全国结核病流行病学抽样调查报告.中华结核呼吸杂志,2012,25(1):3-7.[4]Cole,ST,etal.DecipheringthebiologyofMycobacteriumtuberculosisfromthecompletegenomesequence[J].Nature,1998,393(6685):537-44.[5]OrmeIM．Tuberculosisvaccines：currentprogress．Drugs，2005；65(17)：2437—2444．[6]GrodeL,SeilerP,BaumannS,HessJ,BrinkmannV,NasserEddineA,etal.IncreasedvaccineefficacyagainsttuberculosisofrecombinantMycobacteriumbovisbacilliCalmette-Guerinmutantsthatsecretelisteriolysin.JClinInvest2005;115(9):2472-9.[7]SaxnbandaniurthyVK,DerrickSC,JalapathyKV,ChenB,RussellRQMorrisSL,etal.Long-termprotectionagainsttuberculosisfollowingvaccinationwithaseverelyattenuateddoublelysineandpantothenateauxotrophofMycobacteriumtuberculosis.InfectImmun2005;73(2):1196-203.[8]MartinC,WilliamsA,Hernandez-PandoR,CardonaPJ,GormleyE,BordatY,etal.TheliveMycobacteriumtuberculosisphoPmutantstrainismoreattenuatedthanBCGandconfersprotectiveimmunityagainsttuberculosisinmiceandguineapigs.Vaccine200624(17):3408-19.[9]Orme,IM.Currentprogressintuberculosisvaccinedevelopment[J].Vaccine,2005,23(17-18):2105-8.[10]WilliamsA,etal.EvaluationofvaccinesintheEUTBVaccineClusterusingaguineapigaerosolinfectionmodeloftuberculosis[J].Tuberculosis(Edinb),2005,85(1-2):29-38.[11]WeinrichOlsenA,vanPinxterenLA,MengOkkelsL,BirkRasmussenP,AndersenP.Protectionofmicewithatuberculosissubunitvaccinebasedonafusionproteinofantigen85bandesat-6.InfectImmun2001;69(5):2773-8.[12]VerreckFA,VervenneRA,KondovaI,vanKralingenKW,RemarqueEJ,BraskampG,etal.MVA.85AboostingofBCGandanattenuated,phoPdeficientM.tuberculosisvaccinebothshowprotectiveefficacyagainsttuberculosisinrhesusmacaques.PLoSOne2009;4(4):e5264.[13]SkeikyYA,AldersonMR,OvendalePJ,GuderianJA,BrandtL,DillonDC,etal.Differentialimmuneresponsesandprotectiveefficacyinducedbycomponentsofatuberculosispolyproteinvaccine,Mtb72F,deliveredasnakedDNAorrecombinantprotein.JImmunol2004;172(12):7618-28.[14]SkeikyYA,SadoffJC.Advancesintuberculosisvaccinestrategies.NatRevMicrobiol2006;4(6):469-76.[15]FattoriniL.Strategiesforthedevelopmentofnewtuberculosisvaccines[J].MinervaMed.2007,98(2):109-11930 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新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究1996,157:3527-3533.[33]RenshawPS,PanagiotidouP,WhelanA,etal.CFP10compleximplicationsforpathogenesisandvirulence[J].BiolChem,2002,277(24):21598-21603.[34]ZhangTY,SunL,LiuWJ,etal.Geneticstabilityofrecombinantfowlpoxvirusvaccineexpressingfusionproteingeneofnewcastledieasevirus[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine,2006,28(4):405-407.32 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究文献综述(Review)结核病免疫作用及新型疫苗的研究进展柳小玲张万江摘要：结核病是由结核杆菌感染引起的一种世界性传染病，也是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。据估计，目前全球约有1/3的人口感染了结核杆菌，其中5%～10%将发展成为活动性结核病。在结核杆菌感染机体后，抗结核保护性免疫需要CD4+、CD8+T细胞、巨噬细胞及细胞因子等的共同作用，使得侵入和寄生于细胞内的结核杆菌被杀灭。在这个过程中，多种细胞、细胞因子相互辅助，相互影响，组成了机体抵抗结核杆菌感染的重要防线。卡介苗是世界上唯一获准用于预防结核病的疫苗，但其对成人肺结核的保护效率差别很大(0%～80%)，并存在一定缺陷。尽管已报道的有多种新型结核疫苗，如重组BCG、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗等，但其效果需要经过长期的临床实践检验才可下定论。所以深入研究宿主抗结核分枝杆菌的免疫机制，将为研制安全、有效的新型疫苗奠定理论基础，并为设计切实可行的防治方案提供指导作用。关键字：结核病；免疫；卡介苗；疫苗Studyprogressoftuberculosis(TB)immunefunctionandnewvaccinesLIUXiao-ling,ZHANGWan-jiangAbstract:Tuberculosis(TB)isaworldwideinfectiousdiseasecausedbymycobacteriumtuberculosisinfection,isalsoasinglepathogeninfectioncauseinfectiousdiseasemortalityratesarethehighest.Itisestimatedthataboutathirdofthepopulationworldwideinfectedwithmycobacteriumtuberculosis,5%~10%willdevelopactiveTB.Mycobacterium++tuberculosisinfectioninthebody,afteranti-tuberculosisprotectiveimmunitytoCD4,CD8Tcells,macrophagesandcytokines,etc,thefunctionofintrusionandparasitizemycobacteriumtuberculosiswaskillinthecell.Inthisprocess,avarietyofcellsandcytokinesauxiliarytoeachother,influenceeachother,formedthebodyresistancemycobacteriumtuberculosisinfectionimportantlineofdefense.BCGistheworld'sonlyapprovedforuseinavaccinetopreventTB,butitsprotectionofadulttuberculosisefficiencydifferenceisverybig(0%~80%),andtherearesomedefects.Despitethereportedavariety33 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究ofnewTBvaccines,suchasrecombinantBCG,attenuatedvaccine,subunitvaccine,DNAvaccine,butitseffectneedthroughlong-termclinicalpracticetesttopindown.So,thefurtherstudyofthehostimmunemechanismofantimycobacteriumtuberculosis,todevelopsafeandeffectivenewvaccinetolaythetheoreticalfoundation,andprovideguidancetodesignthefeasiblecontrolscheme.Keywords:Tuberculosis;immunity;BacillusCalmette-Guérin,BCG;vaccine结核病是由结核分枝杆菌(MycobacteriumTuberculosis,MTB)感染引起的一种世界性传染病，也是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。据世界卫生组织(WHO)2012年的最新统计数据显示，全球有860万人罹患结核病，130万人死于结核病。据估计，目前全球约有1/3的人口感染了结核杆菌，其中5%～10%将发展成为活动性结核[1]病。近年来随着人口流动增加、HIV与结核杆菌伴发感染以及结核分枝杆菌多重耐药[2-3]性菌株的出现等原因，使全球结核病疫情再度回升，全球结核病疫情严峻而复杂。卡介苗(BacillusCalmette-Guerinvaccine,BCG)是法国科学家Calmette和Guerin将牛型结核分枝杆菌经过230次连续传代而制成的减毒活菌苗，而牛型结核分枝杆菌在体外长期传代培养过程中，会出现具有重要免疫保护作用的抗原基因的不断丢失。Harboe等研究发现结核分枝杆菌中具有重要免疫保护作用的抗原基因（例如：esat-6基因）不［4］存在于卡介苗中，这使得卡介苗的免疫原性及保护力大大降低。同时随着多重耐药（multidrug-resistant,MDR）结核分枝杆菌和广泛耐药（extensivelydrug-resistant,XDR）结核分枝杆菌的出现，传统BCG已不能满足人类预防结核病的需要。本文将围绕结核病相关免疫作用以及当前新疫苗研发进展作如下综述。1.抗结核杆菌免疫作用的研究据统计显示，在暴露于结核杆菌环境下以后，约30%的人会感染结核；而这部分人群中，仅10～40%会发生原发性活动性结核病，而其余60～90%并无明显的临床症状，处于结核潜伏期，只有2～23%的人群会在一生中的某一时期（尤其是成年以后），由于体内结核菌重新复燃而引起结核病。其中，艾滋病的共感染促使5～10%的结核潜[5]伏期人群因结核杆菌的复燃而引起活动性结核。虽然关于免疫系统如何控制潜伏期的感染以及导致再活化的因素还不清楚，但可以确定结核杆菌感染的过程取决于宿主、环[6]境、病原之间的相互作用(Fig.1)，它既能够引起急性感染，又能引起无症状潜伏感染。34 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究Fig.1Overviewoftheimmuneresponseintuberculosis.ControlofMycobacteriumtuberculosisismainlytheresultofproductiveteamworkbetweenTcellpopulationsandmacrophages.1.1巨噬细胞抗结核的免疫作用结核分枝杆菌是典型的胞内寄生菌。感染早期，巨噬细胞是结核杆菌通过呼吸道进入机体后遭遇的首个细胞亚群，也是结核杆菌主要感染的宿主细胞。巨噬细胞与结核杆菌的接触需要通过与不同的细胞受体分子结合来发挥作用的，如补体受体（complementreceptors）、Fc受体（FCR）、Toll样受体、甘露糖受体（mannosereceptors）、表面活性剂蛋白（surfactantprotein）受体、清道夫受体（scavengerreceptors）等。研究发现结核杆菌与补体受体3（CR3）结合，可以阻止巨噬细胞的呼吸爆发（respiratoryburst），阻[7]断了包含有细菌的吞噬体的成熟，因此阻止了其与溶酶体结合；与Fc受体的结合，可以增加活性氧中间产物（reactiveoxygenintermediates,ROI）的产生并可以促进吞噬体和[8]溶酶体融合；与Toll样受体家族（Toll-likereceptorfamily）结合（如TLR-2），可以激[8]活巨噬细胞产生IL-12和iNOS。除了通过不同受体与结核杆菌发生作用，巨噬细胞还可将含结核分枝杆菌的吞噬体传递至溶酶体，借助溶酶体酶杀伤结核分枝杆菌。巨噬细胞在吞噬过程中，神经鞘氨醇激酶(sphingesinekinase)发挥类似Ca2+信号驱动器作用，促进吞噬溶酶体成熟。但结核分枝杆菌可通过抑制神经鞘氨醇激酶来抑制吞噬溶酶体成[9]熟，从而逃避巨噬细胞的杀伤。同时吞噬体表面的磷脂酰肌醇-3-磷酸盐(phosphatidylinositol-3-phosphate,PI3P)是巨噬细胞胞膜上一种重要的调节运输脂类及重35 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究要组成成分,吞噬小体与溶酶体融合时受到PI3P分子的帮助并对吞噬小体的形成有重[10]大意义。可是一旦机体感染了结核分枝杆菌，MTB通过抑制PI3激酶活性，进而阻碍PI3P分子的生物合成过程，从而抑制吞噬小体与溶酶体的融合；MTB在感染机体后也会分泌出一种酸性磷酸酶SamP，这种物质会对PI3P分子水解，经过一系列的过[11]程达到抑制吞噬小体与溶酶体结合的目的，使结核杆菌能在早期吞噬小体中存活。这类包含有活结核杆菌的特殊吞噬体，使巨噬细胞MHC-II类抗原递呈分子表达下调、抗原递呈能力下降，并且使巨噬细胞对IFN-γ作用不敏感，让结核分枝杆菌产生免疫逃逸[12]。简而言之，如果结核杆菌的毒力不够强，则会被溶酶体中的酶消化降解而杀死；反之，它们就能长期寄生于细胞内，并能逐步产生结核的病理改变。巨噬细胞被结核杆菌感染后将导致一系列炎症细胞因子和趋化因子的释放，然后这些细胞因子作用于巨噬细胞本身，使之产生一系列变化，活化巨噬细胞。一方面活化的巨噬细胞通过分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IL-18[13]及转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ,TGF-β)等，使细胞内溶酶体数量增加、酶活性增高、氧化代谢率增高、吞噬能力增强等，从而发挥免疫调节作用。IFN-γ是激活巨噬细胞抵抗细胞内病原体的最主要因子，可增加巨噬细胞清除结核分枝杆菌的活性，诱导Th0细胞向Th1细胞分化，活化更多的效应细胞和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)。TNF-α可使很多免疫细胞游走并定位在结核分枝杆菌存在的部位，对包围感染部位、防止病原体扩散起重要作用。IL-1、IL-6促进T细胞，B细胞增殖活化；IL-12能诱导IFN-γ而抑制IL-4产生，激活自然杀伤(naturalkiller,NK)细胞和T细胞；IL-12及IL-18能促进T细胞、NK细胞增殖和分化，并产生IFN-γ，增强机体细胞免疫功能；TGF-β是阻止过度炎症反应、减轻组织免疫病理损伤的细胞免疫抑制因子。另一方面巨噬细胞被细胞因子激活以后，细胞内会产生大量的过氧化氢和其他过氧化物，这些物质能够抑制和杀灭细菌而控制结核杆菌的感染和发病。近年来的研究发现，巨噬细胞内L-精氨酸的代谢产物，包括NO，NO2-和NO3-，尤其是一氧化氮对结核杆菌有很强的抑制和杀灭作用。并且在多种结核病患者的活组织检查中可以发现，结核性肉芽肿部位诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)浓度[14]明显增高。而且结核分枝杆菌的最终清除过程发生在活化的巨噬细胞内部，经活性氮中间体（reactivenitrogenintermediates，RNI）和活性氧中间体（reactiveoxygenintermediates，ROI）完成，所以杀灭结核杆菌的关键是要将巨噬细胞的充分活化，并将未活化被感染的巨噬细胞有效清除。研究证明IFN-γ可以通过刺激产生ROI和RNI促[15]进吞噬小体的成熟，以激活巨噬细胞抵抗结核杆菌。同时，巨噬细胞的凋亡也是宿主清除结核杆菌、限制其在体内繁衍和播散的重要机制之一。研究表明，巨噬细胞感染结核分枝杆菌后，可通过诱导自身凋亡对其进行清除。其中，多种促凋亡因子参与结核分枝杆菌感染诱导的巨噬细胞凋亡过程，如TNF-a、Fas-FasL系统、Bcl及Caspase家族[16]。而TNF-α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）则可以有效的限制结核杆菌在巨噬细胞内的生长和增殖。此外，典型的结核肉芽肿形成（granulomaformation）36 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究也可以有效限制结核杆菌在体内的扩散，当巨噬细胞消灭内部的结核杆菌后，肉芽肿逐渐消散趋于自愈。在炎症成熟期，单核细胞融合成多核巨细胞，大量的淋巴细胞聚集在其周围，形成肉芽肿。并且早期巨噬细胞分泌的细胞因子如IL-l和IL-6等炎症性细胞因子通过刺激巨噬细胞活化，从而促进了结核肉芽肿的形成。因此，巨噬细胞对结核杆菌的作用可归纳为以下几点。（1）在静息（未活化）状态下，为结核杆菌提供栖身的场所。（2）巨噬细胞能够加工递呈结核杆菌抗原，激活T细胞的免疫反应。（3）经细胞因子，尤其是IFN-γ和TNF-α活化后，参与巨噬细胞凋亡过程以及肉芽肿形成路径来限制[17]结核杆菌的繁衍与播散，但不能将其彻底清除。1.2T细胞抗结核的免疫作用++细胞免疫中，参与巨噬细胞活化的关键细胞为CD4T,CD8T细胞，也有研究认为[18,19]γδT细胞发挥一定作用。结核分枝杆菌被巨噬细胞吞噬后，存在于吞噬体(phagosome)中，相关的抗原被加工后将与MHCⅡ类分子结合，呈递至细胞表面，激活+CD4T细胞。而也有一些结核分枝杆菌的抗原可以进入细胞质中，通过MHCⅠ途径最+终激活CD8T细胞。被感染的细胞释放的抗原也可被其它的抗原递呈细胞(APC)摄取，[20,21]这些APC再继续完成其他相关细胞的活化(Fig.1.2)。Fig.1.2Antigenprocessing/presentationpathwaysandactivationofdifferentTcellsubsets.β2m(β2-microglobulin);DN(double-negative);ER(endoplasmicreticulum);TAP(ransporterofantigenprocessing).+CD4T细胞在不同的条件下(如抗原、细胞因子等)，可分化为两类辅助性T细胞，即一型辅助性T细胞(Thl)和二型辅助性T细胞(Th2)。Th1主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α等细胞因子，它们可以激活巨噬细胞，引发细胞介导的炎症反应和细胞杀伤功能，以达到抵抗病原微生物的效果。而Th2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，其中IL-437 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究是刺激B细胞反应的主要细胞因子，诱导并促进体液免疫反应。尽管一般认为体液免疫[22,不太可能在保护性免疫中发挥主要作用，但有实验表明抗体也具有一定的保护功能23]。Th1与Th2之间有着相互抑制的作用，如IFN-γ可以抑制Th2的增殖，而IL-10可以抑制Th1释放Ⅰ型的细胞因子。由于结核杆菌的细胞内寄生特点，Th2为主的体液免疫反应不能对其发挥显著的控制作用，只有以Th1为主的细胞免疫反应才能有效控制结核杆菌在细胞内的生长和增殖。机体对结核杆菌的免疫反应，Th1和Th2可同时存在，也可以其中一种为主。通常认为，天然免疫反应会对获得性免疫反应的类型产生深远的影响。比如，巨噬细胞对结核杆菌的抗原进行加工以后，表位肽与MHCⅡ类分子结合+后呈递给CD4T细胞。巨噬细胞产生的IL-12可促使以Th1为主的免疫反应，与此相+对，如果CD4T细胞在巨噬细胞产生的IL-10作用下，则会产生以Th2为主的免疫反+[24]应。因此CD4T淋巴细胞在抗结核感染保护性免疫反应中起着重要的作用：(1)分泌+细胞因子，活化的CD4T细胞通过分泌IL-2,IFN-γ,TNF-α等Th1型细胞因子，对巨噬+细胞进行活化，同时，这些细胞因子可以刺激CD8T细胞的活化。(2)直接激活、调控、+影响其它细胞，如巨噬细胞、CD8T细胞。(3)细胞杀伤作用，直接裂解结核杆菌感染+的细胞，但多数情况下并不直接杀灭结核杆菌。(4)研究表明，CD4T细胞对结核杆菌+抗原可表现出较高的增殖免疫应答，提示记忆性CD4T细胞对抵抗再次入侵的结核杆[25]菌有积极保护作用。+CD8T淋巴细胞在抵御结核杆菌过程中也起着极为重要的作用。巨噬细胞中结核++杆菌的抗原表位肽与MHCⅠ类分子结合后经递呈，激活CD8T淋巴细胞。CD8T淋巴细胞抵抗结核杆菌作用机制与CD4T淋巴细胞发挥的辅助作用不同，它具有细胞毒性[26]作用，能够对细胞表面呈现有结核特异性表位肽的细胞有杀伤作用。如果吞噬了结核杆菌的巨噬细胞未被充分活化，不能有效杀灭结核杆菌，则会被CD8杀伤性T细胞杀死。被裂解的巨噬细胞释放出的结核杆菌，再被杀菌能力更强的巨噬细胞所吞噬、杀灭。+另一方面，活化的CD8T细胞还能通过分泌IL-2,IFN-γ等细胞因子进一步加强巨噬细+胞的活化。所以，CD8T淋巴细胞主要是通过细胞杀伤作用，裂解被感染细胞，杀灭或释放胞内的结核杆菌。同时分泌细胞因子，如IL-2,IFN-γ，调节周围细胞功能，达到[27,28]控制结核杆菌的作用。综上所述，在结核杆菌感染机体后，抗原递呈细胞将结核杆菌吞噬，对其进行加工处理，把特异性抗原表位递呈给T细胞，并将其激活，激活后的T细胞反过来再激活巨噬细胞，使得侵入和寄生于细胞内的结核杆菌被杀灭。在这个过程中，多种细胞、细胞[18]因子相互辅助，相互影响，组成了机体抵抗结核杆菌感染的重要防线(Fig.2)。38 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究Fig.2Mainfeaturesoftuberculosis:frominfectiontohostdefence.TherearethreepotentialoutcomesofinfectionofthehumanhostinMycobacteriumtuberculosis.a)thefrequencyofabortiveinfectionresultinginspontaneoushealingisunknown,butisassumedtobeminute.b)intheimmunocompromisedhost,diseasecandevelopdirectlyafterinfection.c)inmostcases,mycobacteriaareinitiallycontainedanddiseasedevelopslaterasaresultofreachvation.2.卡介苗的缺陷从1921年至今，卡介苗是世界上唯一获准用于预防结核病的疫苗，由于其价廉与[29]高安全性的特性，全球大约有40亿人接受过BCG免疫。但是目前研究发现，在不同地区不同人群中，卡介苗对成人肺结核的保护效率差别很大(0%～80%)，并且给AIDS[30]等免疫功能受损的患者接种卡介苗后还可能导致严重的播散性结核病，并且接种卡介苗后，还会对结核病患者的实验室诊断产生一定的影响。而造成卡介苗保护效力差异的主要原因，可能和下述几个方面的原因有关。（1）非结核分枝杆菌的影响:非结核分枝杆菌可以造成人体对结核抗原的免疫反应，这种预存反应可以拮抗BCG诱导免疫保护反应，并且如果非结核分枝杆菌的感染己经诱导了对结核杆菌的免疫力，那么BCG的免疫效力就难以评估。（2）卡介苗菌株差异:BCG菌株不同，其相应的免疫原性和效力的差异会造成临床试验的显著差异。（3）结核杆菌的毒力差异:由于各地流行结核菌株不同，也可影响临床试验的结果。（4）各地区内源性和外源性的结核感染的差异:BCG控制内源性结核复燃的效果，不同于预防外源性结核感染的效果，因此各地区二种患病状态的差异将影响试验结果。（5）人群基因背景的差异：不同人群对BCG免疫应答水平差异直接影响了试验结果。（6）地域的差异:不同的国家、地区临床试验明显不同，这也影响了对BCG效果的评价。因此，研究和开发更加安全有效的结核疫苗势在必行。39 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究3.新型结核疫苗的研究近年来，结核疫苗的研究集中于各型的分枝杆菌及亚单位疫苗方面，疫苗形式主要包括重组BCG疫苗、减毒疫苗、蛋白质亚单位疫苗、DNA疫苗等。3.1重组BCG重组BCG是采用提高某一免疫保护相关抗原的表达量（如rBCG30），或去除毒力因子并引入某种功能蛋白以增加原始BCG的胞内加工释放（如rBCG△ureC:hly），以提[30]高抗原递呈，加强细胞免疫，提高保护力。比较基因组学提供了卡介苗和结核杆菌毒株之间差异的重要信息，揭示BCG中缺失了许多重要的基因。用DNA芯片、细菌人工染色体文库(BAC)和比较蛋白组学等技术，研究发现在结核分枝杆菌有毒株中存在的RD1—RD16区域及其所编码的129个开放读码框架，在BCG减毒和反复传代过程中全[31,32]部缺失，这其中有些基因似乎与毒力相关，其缺失可能导致了BCG保护效力的下降。因此，从RD1—RD16中选择合适的基因重新导入BCG中，可能是增强传统BCG保护效力的途径之一。RD1区是所有缺失片段中最具特征的，该基因片段在所有BCG菌株和大部分环境分枝杆菌中均缺失，但在结核分枝杆菌复合群的所有菌株中却普遍存在[33,34]。用蛋白组学方法分析发现，把RD1区重新导入BCG中，所表达的蛋白谱与有毒[34]力的牛型分枝杆菌和结核分枝杆菌的几乎完全相同。小鼠动物模型研究显示，这些变化与毒力增加无关，但RD1区的重新导入能使BCG基因组分泌表达缺失的结核杆菌早[35]期分泌抗原-6（ESAT-6），且rBCG::RD1保护效力要高于BCG对照组。研究发现，表达和分泌结核杆菌免疫优势抗原Ag85B的重组BCG与传统BCG相比，能提高其保[36]护水平。综上所述，重组BCG通过表达重要抗原基因(BCG减毒传代过程中缺失的或者本身存在于BCG中的基因)的方式加强传统BCG的保护效力可能是改进结核疫苗质量的重要方法之一。3.2减毒疫苗减毒疫苗是通过敲除结核分枝杆菌相关毒力基因，但却保留其所有保护性相关抗原基因的方法来研制结核分枝杆菌的减毒活疫苗。目前，人们已经建立了许多目的基因敲[37]除的突变株，并且通过单基因破坏的方式验证了其作为减毒活疫苗的可行性。尽管该方法已引起人们极大的兴趣，即使改造过的减毒活疫苗研制成功，但减毒活疫苗仍然存在毒力恢复的风险，所以在实际应用中其存在的安全性问题仍将是一个必须克服的重大[36]课题。迄今为止，许多己构建好的减毒株都被认为毒性太大，以至于不能继续开展后续研究。而且，所有已构建好的结核分枝杆菌完全减毒株中，经评估发现其保护效力没[38]有一个能够超过BCG。3.3蛋白亚单位疫苗蛋白亚单位疫苗可以不受机体已被分枝杆菌刺激的影响，能特异性地诱导CD4+40 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究Th1细胞和CD8+CTL活化,有效诱导机体免疫反应，并且使用安全性好，备受研究者的[39]青睐。结核分枝杆菌大约有4000个基因，编码数千种蛋白质。至今已有多种结核分枝杆菌分泌的蛋白被鉴定、纯化，目前研究得较多的有：早期分泌性抗原靶蛋白-6(ESAT-6)、MPT64、抗原85复合体、CFP10、Mtb8.4、Hsp复合体等。研究发现，单[40]个抗原制成的亚单位疫苗其免疫效力往往有限。Olsen等采用纯化的蛋白ESAT6,Ag85B，ESAT6+Ag85B,Ag85B-ESAT6,BCG以及佐剂MPL-DDA分别免疫小鼠。结果表明，与阴性对照组相比，即使注射小剂量((0.01ug)Ag85B-ESAT6也能使小鼠肺部细菌数显著减少((P<0.01)，当Ag85B-ESAT6的注射剂量为0.1-10ug时能诱导较高水平的保护作用(P<0.001)，融合蛋白诱导的保护作用强于单纯Ag85B,ESAT6或BCG。此外Ag85B-ESAT6融合蛋白能在小鼠中诱导长期的抗结核免疫记忆。说明多个表位联合免疫或其融合蛋白免疫可诱导有效的保护力。但亚单位疫苗必须配以适宜的佐剂，多次接种才能达到效果，对于选择何种佐剂和免疫调节剂(例如细胞因子)，都存在着争议，同时其在体内的滞留时间和产生的免疫应答持续的时间均比较短，使它的临床推广受到限[41]制。3.4DNA疫苗DNA疫苗的作用机理是以DNA为载体，携带免疫保护性抗原，让外源基因在真核细胞内表达，表达出来的蛋白质抗原和MHC的I类分子结合后被呈递到细胞的表面，再被CD8T淋巴细胞的受体识别而诱发CTL的细胞毒反应，同时也可刺激机体[42]产生一定的体液免疫反应。Kamath等将ESAT-6,MPT-64和Ag85B的基因分别插入真核表达载体，构建了三种TB基因疫苗，对C57BL/6雌性小鼠胫前肌肉注射进行免疫，MTBH37Rv通过雾化吸入进行攻击试验，结果表明三种基因疫苗联合免疫比单独使用其中任何一种具有更好的免疫保护效果。但三种基因疫苗无论联合还是单独免疫其保护效应均不及BCG对照组。尽管这样，多表位DNA基因疫苗的研制仍将是今后结核疫苗发展的一个重要方向。4.结语综上所述，一种理想的结核病疫苗，应该能够预防各个阶段的结核杆菌感染，包括原发性结核杆菌感染、潜伏期结核杆菌感染以及内源性结核杆菌复燃后的再感染。并且抗结核保护性免疫需要CD4+、CD8+T细胞、巨噬细胞及细胞因子等的共同作用。近年来，尽管各种新型疫苗的不断问世，但是由于研究的候选疫苗中仅有少数在动物实验中能达到与BCG差不多的免疫保护效果，当然也有一些被证明有比BCG更好的效果。并且这些仅在动物模型中短期研究的候选疫苗还需进行广泛的临床试验，其真正效果必须像BCG一样经过长期的实践检验方可下定论。所以深入研究宿主抗结核分枝杆菌的免疫机制，将有助于研制出安全、有效的新型疫苗，设计出切实可行的防治方案。41 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究参考文献：[1]WHO.2013.http://www.who.int[2]WorldHealthOrganization.Globaltuberculosisconcml-epidemiology,strategy,financing[R/OL].WorldHealthOrganization2009.WHO/HTM/TB/2009.411.[3]FergusonLA,RhoadsJ.Multidrug-resistantandextensivelydrug-resistanttuberculosis:Thenewfaceofanolddisease.JAmAcadNursePract,2009,21(11):603-609.[4]BrooksJV,FrankAA,KeenMA,BelisleJT,OrmeIM.Boostingvaccinefortuberculosis[J].InfectImmun2009;69:2714–7.[5]CollinsHL,KaufmannSH.Prospectsforbettertuberculosisvaccines[J].LancetInfectDis,2001,1(1):21-28[6]KAUFMANNSH,HUSSEYG,LAMBERTPH.Newvaccinesfortuberculosis[J].Lancet,2010,375:2110-2119[7]STURGILL-KOSZYCKIS,SCHLESINGERPH,CHAKRABORTYP,etal.LackofacidificationinMycobacteriumphagosomesproducedbyexclusionofthevesicularproton-ATPase[J].Science,1994,263:678-681[8]BRIGHTBILLHD,LIBRATYDH,KRUTZIKSR,etal.Hostdefensemechanismstriggeredbymicrobiallipoproteinsthroughtoll-likereceptors[J].Science,1999,285:732-736[9]KusnerDJ.Mechanismsofmycobacterialpersistenceintuberculosis[J].ClinImmunol,2005,114(3):239-247.[10]AmitK,PandeyandChristopherM.Mycobacterialpersistencerequirestheutilizationofhostcholesterol[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciemesoftheAmerica,2008,105(11):4376-80.[11]VergneI,ChuaJ,DercticV.Tuberculosistoxinblockingphagosomematurationinhibitsa+novelCa2/calmodulin-PI3KhVPS34cascade[J].JExpMed,2003,198(4):653-9.[12]ReilingN,EhlersS,HOlscherC.MyDthsandun-TOLLedtruths:sensor,instructiveandeffectorimmunitytotuberculosis[J].ImmunolLett,2008,116(1):15-23.[13]BasuSK,KumarD,GanqulyN,RaoKV,SharmaP.Mycobacteriumtuberculosissecretedantigen(MTSA-10)inhibitsmacrophageresponsetolipopolysaccharidebyredoxregulationofphosphatases[J].IndianJExpBiol,2009,47(6):505-519.[14]SurekaK,SanyalS,BasuJ,KunduM.Polyphosphatekinase2:amodulatorofnucleosidediphosphatekinaseactivityinmycobacteria[J].MolMicrobiol,2009,74(5):1187-1197.[15]VANCREVELR,OTTENHOFFTH,VANDERMEERJW.InnateimmunitytoMycobacteriumtuberculosis[J].ClinicalMicrobiologyReviews,2002,15:294-309.[16]BocchinoM,GalatiD,SanduzziA,ColizziV,BrunettiE,MancinoG.Roleof42 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新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究致谢(Acknowledgments)时间飞逝，转眼间，三年的研究生求学生活即将结束，站在毕业的门槛上，回首往昔，奋斗和辛劳成为丝丝的记忆，甜美与欢笑也都尘埃落定。值此毕业论文完成之际，我谨向所有关心、爱护、帮助我的人们表示最诚挚的感谢与最美好的祝愿。首先，我要向三年来给予我悉心指导，无私帮助的导师张万江教授致以崇高的敬意和最衷心的感谢!三年来，导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。导师不仅在学习上对我谆谆教诲、耳提面命，在生活上，也对我关爱有加、关心备至。我的每一个进步都倾注了导师大量的心血，再次向我的导师张万江教授表示真诚的谢意与祝福！特别感谢章乐副教授、袁俐教授、王远志副教授及吴芳老师、李永祥老师在教学实践和论文开题中给予我的指导和帮助，以及实验过程中给予我耐心的技术讲解和指导。感谢朱彬师哥、李瑞山师哥、邬博师哥、王钊师哥、何丽师姐、张玉清师姐在实验和论文写作方面给予的指导和帮助。感谢我的同学王君、张培培、梁粟、胡娜、潘欢、武丹、方海瑞、刘春燕在实验中给予的无私帮助和支持。感谢朱荟云师妹、张大龙师弟、武青青师妹、张帅师弟、杨俊停师弟、郭鹏师弟、唐苏予师弟在学习、生活中给予的热心帮助。感谢我的家人，无论何时何地一直给予我最珍贵的精神力量！最后，在论文完成之际，向所有指导、关心和帮助我的各位老师、同学、朋友以及我的家人表示最真挚的谢意！研究生:柳小玲2016年5月45 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究作者简介柳小玲，女，汉族，生于1989年7月，籍贯四川。2013年毕业于石河子大学医学院，医学检验专业，获医学学士学位。2013年9月推荐免试入石河子大学医学院就读硕士研究生，专业为病理学与病理生理学专业，研究方向为感染性疾病的病理生理，导师张万江教授。在学期间主要参与的研究项目1．参加了国家自然基金项目《结核杆菌PhoPR双组分系统对新疆地区广泛流行的耐药结核杆菌临床分离株耐药性产生的的调控作用及其机制研究》，项目批准号：81260261。2．参加了国家自然基金项目《结核杆菌对感染宿主巨噬细胞铁代谢的调控作用及其机制研究》，项目批准号：81160192。3．参加了新疆生产建设兵团医药专项资金资助项目《构建及选育新型结核病疫苗菌株的实验研究》，项目批准号:2012BA022。4．石河子大学高层次人才科研启动项目：MtbPPS对新疆地区流行的优势强毒结核杆菌临床分离株毒性的作用及其机制项目编号：RCZX201446。在学期间发表的文章1.柳小玲,吴芳,吴江东,章乐等.新型结核病疫苗融合菌株制备及其免疫学特性的研究[J].中国病原生物学杂志,2016,11(1):21-24.2.Xiao-lingLiu,FangWu,Jiang-dongWu.etal.Studyonthebiologicalcharacteristicsandgenetictraitsofthenewstrainoftuberculosisvaccine（投稿中）3.王君,吴芳,柳小玲等.利用融合PCR技术和T载体克隆技术构建结核分枝杆菌PhoPR双组分系统缺失突变载体[J].中国人兽共患病学报,2016,32(3):92-96.4.张培培,雷英,吴芳,柳小玲等.pup/mpa/dop/paf基因过表达的结核杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株和结核杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株的构建[J].中国病原生物学杂志,2015,10(12):1068-1073,1077.5.邬博,吴芳,雷英,王君,柳小玲等.PhoPR双组分信号转导系统对结核分枝杆菌持留性的调控机制研究[J].中国人兽共患病学报,2015,31(2):116-120.46 新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研巧石巧子大学硕±研究生学位论文导师评閒表研究生姓名柳小玲学制３年专业病理学与病理生理学研究方向感染性疾病的病理生理学术评语：该生课题为《新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究》，本项目研究就是在卡介苗菌株与结核分枝杆菌国际标准无毒株Ｈ３７Ｒａ株的融合菌株构建成功的实验基础上，一步对构建的融合菌株的生长特性进、体外传代稳定性、及在动物宿主体内的定植特性和体内的传代稳定性进行深入的研究，Ｗ期在研制新型、安全、高效的结核病疫苗方向取得进一步的有益探索。，、、本研究立题新颖，构思严谨实验设计完整合理，技术路线清晰，结果真实可靠。该研究生具备严肃的科学态度和严谨求实的科研作风，科研动手能力强，勤奋钻研，善于，论据充分思考，论文撰写观点明确，条理性和逻辑性强。同意作为硕±论文提交答辩委员会进入答辩过程。指导獅签字如方年約（日Ｉ４７