《自体骨髓间充质干细胞移植治疗犬急性放射性肠病的疗效及相关机制的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号R4UDC612密级公开自体骨髓间充质干细胞移植治疗犬急性放射性肠病的疗效及相关机制的研究姚辉培养类别全日制学位类型专业学位一级学科(专业类)临床医学二级学科(专业)内科学（消化系病）研究方向放射性肠病的干细胞治疗指导教师郭晓钟教授（主任医师）培养单位西京消化病医院二O一七年十二月 博士学位论文 博士学位论文目录缩略语表...............................................................................................................................4中文摘要...............................................................................................................................6ABSTRACT.......................................................................................................................15前言.............................................................................................................................23文献回顾.............................................................................................................................25正文.............................................................................................................................31第一部分建立急性放射性肠损伤比格犬模型..........................................................311.材料.........................................................................................................................312.方法.........................................................................................................................323.结果.........................................................................................................................354.讨论.........................................................................................................................42小结............................................................................................................................45第二部分骨髓间充质干细胞移植治疗犬急性放射性肠病的疗效观察..................461.材料.........................................................................................................................462.方法.........................................................................................................................483.结果.........................................................................................................................524.讨论.........................................................................................................................60小结............................................................................................................................62第三部分骨髓间充质干细胞移植治疗犬急性放射性肠病的机制研究...................641.样本及试剂.............................................................................................................642.方法.........................................................................................................................653.结果.........................................................................................................................714.讨论..........................................................................................................................91小结............................................................................................................................97总结.............................................................................................................................98参考文献.............................................................................................................................99个人简历和研究成果.......................................................................................................109致谢...........................................................................................................................110 博士学位论文缩略语表缩略词英文全称中文全称ABMSCsAutologousbonemesenchymal自体骨髓间充质干细胞stemcellsAREacuteradiationenteritis急性放射性肠炎CTComputertomography计算机断层扫描EGLEpidermalgrowthfactorlikegrowth表皮样生长因子factorELISAEnzyme-linkedimmunosorbent酶联免疫试验assayFGFFibroblastgrowthfactor成纤维细胞生长因子FGFbBasicfibroblastgrowthfactor碱性成纤维细胞生长因子G-CSFGranulocyte-colonystimulating粒细胞集落刺激因子factorGM-CSFGranulocyteMacrophage-colony粒细胞-巨噬细胞集落刺激stimulatingfactor因子GyGray戈瑞HGFHepatocytegrowthfactor肝细胞生长因子HGFRHepatocytegrowthfactorreceptor肝细胞生长因子受体HPOThyperbaricoxygentherapy高压氧治疗IFNinterferon干扰素IGFInsulinlikegrowthfactor胰岛素样生长因子ILInterleukin白细胞介素-4- 博士学位论文缩略词英文全称中文全称IMRTIntensitymodulatedradiation调强放射治疗therapyKGFKeratinocytegrowthfactor角质细胞生长因子MCPMonocyteChemokineProtein单核细胞趋化因子MIPMacrophageinflammatoryprotein巨噬细胞炎症蛋白MMPMatrixmetalloproteinase基质金属蛋白酶MSCsmesenchymalstemcells间充质干细胞PDGFPlateletderivedgrowthfactor血小板衍生生长因子SCFstemcellfactor干细胞因子SDFStromalcell-derivedfactor基质细胞衍生因子TIMPTissueinhibitorof金属蛋白酶组织抑制剂metalloproteinaseTNFTumornecrosisfactor肿瘤坏死因子TPOthrombopoietin血小板生成素VEGFVascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子-5- 博士学位论文自体骨髓间充质干细胞移植治疗犬急性放射性肠病的疗效及相关机制的研究博士研究生：姚辉导师：郭晓钟教授辅导教师：陈江副教授第四军医大学西京消化病医院，西安710032资助基金项目：军队“十二五”重点课题（BWS12J009）中文摘要背景目前，随着核电站和其他民用放射源的不断增加，医疗中对肿瘤行放疗方法治疗的广泛应用，核泄漏事故、核辐射污染及放射性核损伤引起人们越来越多的关注。根据国际及国内相关的统计资料表明，对于急性放射性损伤的患者，如果受照射剂量在6Gy以下，大多数病人通过治疗可获得满意疗效；但当其受到辐射剂量超过8Gy时，几乎没有发现有病例能够长期存活。其中，重度骨髓型及肠型放射性疾病的研究，是摆在世界医学研究者面前的一个重大难题。急性放射病中的肠型急性放射病，具有病情危重，疾病进展迅速，生存时间相对较短的特点，其临床症状包括腹痛、呕吐、腹泻、血便、急性腹膜炎、肠梗阻等，临床救治成功率低。在肿瘤的多种综合治疗方法中，放疗一直发挥着不可替代的作用，放疗可通过放射线杀灭恶性肿瘤细胞，不可避免会损伤恶性病变周围不含有肿瘤细胞的正常细胞。有研究表明行盆腔、腹部肿瘤放疗的患者，75%以上可发生不同程度的放射性损伤，其中急性放射性肠炎可见于四分之一到四分之三的患者，现有的药物、营养支持、对症等治疗方式对此病的治疗效果不佳，因此寻找一种有效的治疗途径十分重要，应用干细胞修复-6- 博士学位论文损伤组织为治疗急性放射病提供一种新的重要的方法。干细胞的具有很强的增殖能力，并且具有多向分化功能，对于维持机体的内环境稳定和受损伤组织的修复极为重要。因此，干细胞研究也逐渐成为生命科学及医学领域研究的热点。间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）最初于骨髓中发现，可来源于自体或异体，可由骨髓、脐带等多种组织器官获取。MSCs在体内或者体外经诱导能分化为内皮细胞、骨细胞和脂肪细胞等。MSCs在体外可通过连续传代进行培养后，使其具有分化成为不同细胞的能力并得以保留。研究表明，骨髓来源的MSCs能准确的定位移植在损伤处并促进愈合。当腹部受到损伤辐射后，由于构成小肠肠壁的上皮细胞更新速度快，遇到电离辐射损伤时反应最为敏感。放射损伤可刺激MSC迁移到受损伤组织，促进该处组织修复及重建。研究发现一些细胞因子可起到抗辐射损伤的作用。本研究通过构建不同剂量下的比格犬急性放射性肠损伤模型，应用股动脉穿刺后行自体骨髓间充质干细胞移植以治疗犬急性放射性肠病，研究应用不同剂量照射前后及ABMSCs移植治疗后对比格犬的症状表现、内镜下特征及其肠功能进行分析，并采用蛋白芯片技术分析放射损伤前后及干细胞治疗后免疫因子表达的差异，为进一步明确干细胞治疗放射性肠病的机制研究及临床转化奠定基础。目的应用不同剂量的放射线照射比格犬用于构建急性放射性肠病损伤模型；采用ABMSCs移植的方法治疗不同剂量引起的急性放射性肠病，通过蛋白芯片技术对肠道损伤后及治疗后各种细胞因子表达差异进行分析，为急性放射性肠病的发生机制及干细胞治疗奠定理论及实践的基础。方法第一部分：建立放射性肠损伤比格犬模型。1、建立比格犬应用放射剂量性腹部损伤模型，将20只比格犬分别随机分为4组，每组纳入5只试验犬，分别命名为A、B、C、D组，将A组设为空白对照，B、C、D组分别应用10Gy、12Gy、14Gy的辐射剂量，剂量率为250cGy，以调强照射的形式行腹部靶区放射。2、观察放射肠损伤前后比格犬的一般情况包括：体温、体重、进食、活动、呕吐、腹泻、便血及生存时间等方面。3、观察不同剂量放射性肠道损伤下的严重程度分度。将急性放射性肠道损伤按照以下标准进行严重程度的区分：1度：每日腹泻2-3次，粪便呈粗大-7- 博士学位论文状态，肠道出血方式为隐性出血，腹部可呈微弱的绞痛或者疼痛；2度：每日腹泻4-6次，排便呈松散状态，肠道出血方式为间歇式出血，伴有中度的腹部绞痛或疼痛；3度：每日腹泻7-9次，排便呈稀松稠度，肠道出血方式为持续出血，伴有强烈的腹部绞痛或疼痛；4度：每日腹泻大于10次，排便呈水样，肠道出血为持续大量出血，腹部呈极度绞痛或疼痛。4、应用D-木糖含量测定的方法检测放射损伤后肠道吸收功能。5、化验血DAO分析辐射后肠道的屏障功能变化情况。6、于肠道放射损伤前后给予行肠镜检查，观察不同剂量辐射下的放射性肠炎的内镜下表现情况。7.肠镜下取肠道粘膜组织活检，对肠道黏膜损伤情况进行评分，具体评分标准根据肠道黏膜损伤情况由0-4分表现，其中0分为正常组织，1分为黏膜损伤面积较小，2分黏膜损伤面积在50%以下，3分黏膜损伤面积≥50%，4分为粘膜完全损失。炎症细胞浸润如下：0分为无或轻微，1分为轻度炎细胞浸润，2分为中度炎细胞浸润，3分为重度炎细胞浸润，4分为极重度炎细胞浸润。血管充血程度：0分为无或轻微血管充血，1分为轻度血管充血，2分为中度血管充血，3分为重度血管充血，4分为极重度血管充血。将各项分数相加则为该组织的病理总评分。8.将肠道活检组织应用透射电镜扫描观察放射损伤前后肠道组织的电镜下表现情况。第二部分：应用充质干细胞移植治疗不同剂量照射组犬急性放射性肠病的疗效观察。1、用不同辐射剂量（10Gy、12Gy、14Gy）照射比格犬并建立急性放射性肠病的损伤模型，将35只试验用比格犬随机分为7组（分别定义为A、B、C、D、E、F、G组），平均每5只动物分成1组，其中A组作为空白对照组，B组为10Gy照射后生理盐水治疗组，C组是12Gy照射后生理盐水治疗组，D组为14Gy照射后生理盐水治疗组，E组是10Gy照射后干细胞治疗组，F组为12Gy照射后干细胞治疗组，G组是14Gy照射后干细胞治疗组。对比格犬实行腹部划区照射，方式采取调强照射，剂量采用不同组相对应的照射剂量，观察辐射损伤后、干细胞治疗后实验比格犬的症状表现、肠镜下特征、肠道功能改变、生存时间，并使用组织病理学评分的方法来评价放射损伤引起的肠道损伤程度的情况。2、ABMSCs的培养以及鉴定：首先选取在比格犬胫骨平台部位抽取骨髓，Percoll密度梯度离心后原代培养，于贴壁大约75%后，用含有EDTA的胰蛋白酶进行消化，后进行传代。标记细胞，所用表面标记物具有特异性，本实验中选取CD29、CD44、CD45、CD90进行，标记完成后进入鉴定阶段，应用两种方法，第一种为免疫荧光法鉴定，第二种为流式细胞-8- 博士学位论文分析法。对所取标本进行成骨诱导分化，所得结果经鉴定明确后进入下一阶段。3、ABMSCs移植：需要通过股动脉穿刺植入，穿刺过程在DSA成像技术辅助下完成，将已标记细胞植入肠系膜动脉内，该部分血管为放射性损伤肠段供血。4、确定移植干细胞定植、归巢：采用细胞膜染料CM-Dil标记联合DAPI染色确定干细胞定植于受损伤的肠道组织。5、将急性放射性肠道损伤按照标准进行严重程度的区分1—4度。6、症状表现：每日观察比格犬的体温、活动、食欲、呕血、粪便、体重情况。7、肠道功能检测：应用D-木糖含量测定肠道吸收功能；化验血DAO分析肠道的屏障功能。8、肠镜检查及肠镜下活检：对实验用比格犬分别取正常、照射后及治疗后的肠镜，保存肠镜检查的图片，留取肠道粘膜活检标本保存备用。9、对肠道黏膜损伤情况进行评分：具体评分标准根据肠道黏膜损伤情况由0-4分表现，分数越高则损伤情况越严重。炎症细胞浸润评分从无到极重度炎细胞浸润分别评分为0-4分。血管充血程度：从无或轻微血管充血到极重度血管充血分别评分为0-4分。10、观察记录各组实验动物的生存时间。11、应用透射电镜扫描观察各组肠道组织的电镜下表现情况。第三部分：间充质干细胞移植治疗犬急性放射性肠病的初步机制研究。1、将试验用18只比格犬随机分为3组，分别为正常对照组、生理盐水组、ABMSCs治疗组，每组含有6只犬。2、应用ABMSCs治疗组比格犬培养骨髓间充质干细胞：经由比格犬胫骨平台完成骨髓抽取，Percoll密度梯度离心并原代培养；当这些骨髓间充质干细胞贴壁大概80%左右后，采取含有EDTA的胰蛋白酶进行消化，传代、扩增。3、以12Gy辐射剂量采用调强照射的方式分别对ABMSCs治疗组、生理盐水组、比格犬进行单次腹部照射，形成12Gy剂量的放射性肠病的比格犬动物组。3、ABMSCs体内移植治疗：于照射后2天（48小时）行股动脉穿刺，在DSA成像技术辅助下进行移植，将所标记细胞移植在肠系膜动脉内，使培养的犬干细胞到达受支配肠段。4、对实验用比格犬分别取正常、照射后及治疗后的肠镜，留取肠镜检查图片及肠道活检样本，对各组分别留取正常、照射后及治疗后至少3份肠道组织样本，用于蛋白芯片检测。5、对待检测样本经蛋白芯片QAC-CYT-1检测蛋白GM-CSF、VEGF、IL-2、IL-10、MCP-1、IL-6、RAGE、SCF、IL-8、TNF-α；经蛋白芯片QAC-CYT-2检测蛋白Erythropoietin、FGF-7、HGF、HGFR、IFN-γ、IL-1β、IL-12p40、IL-17A、MIP-1β、TNFRI。6、组织样品的准备。7、蛋白浓度测定。8、芯片操作流程。9、-9- 博士学位论文使用相对应的软件对QAC-CYT-1和QAC-CYT-2的数据结果进行统计分析。10、对筛选出具表达差异的细胞因子进行生化实验验证。11、应用差异基因GO富集分析方法探寻相关的基因通路，为进一步研究骨髓间充质干细胞治疗放射性肠损伤的分子机制奠定基础。结果1、成功建立了三个不同照射剂量下的犬急性放射性肠病模型1、采用10Gy、12Gy、14Gy放射剂量照射比格犬，并建立了急性放射性肠病的损伤模型，通过症状表现、内镜检查及组织学变化的评估方法可见犬在不同放射剂量由低到高增高的过程中，放射性肠道损伤程度亦呈增高趋势（P=0.002）。显示了在放射剂量由弱到强的增高的过程中，比格犬各种不适症状表现出来的时间随剂量增大而呈正相关，主要症状为一般状态变差，进食较少，呕吐胃内容物和大便次数增多及大便中带血等，且症状重，持续时间长。2、肠镜检查结果提示由于辐射剂量不同，肠镜检查的结果也不同。采用肠镜对比格犬肠道损伤情况进行检查，发现损伤程度与照射剂量呈现正相关，照射剂量较小者往往表现为充血、水肿等症状，病情略微加重的可能出现点状出血及出血表现，呈现出弥漫性充血及片状出血的肠道粘膜多见较大剂量照射，最严重者肠道可能出现溃疡及出血。结肠镜下肉眼可见表现：在14Gy照射组内镜可见多灶性和弥漫性的充血、水肿，有的可见片状出血和糜烂及溃疡；12Gy照射组内镜下可发现较为明显的充血和水肿，还可见点状、小片状的出血；10Gy照射组可见肠道粘膜大致平滑，有轻度的充血或水肿。可见放射剂量由大到小，比格犬肠镜下表现由重到轻。3、对病变部位进行组织学检查，发现损伤程度与辐射剂量同样呈现正相关，辐射剂量相对较小者粘膜损伤程度较轻，8Gy照射后大多只是轻度病变，而10-12Gy照射后病变会随着剂量加大而加重，严重者可能出现出血等表现。4、肠道吸收功能：放射损伤组实验动物的血清D-木糖浓度相比对照组呈下降表现，受到辐射损伤的剂量越大，D-木糖浓度下降越明显。5、肠道屏障功能：放射损伤组比格犬血DAO浓度相比对照组升高，受到辐射损伤的剂量越大，DAO升高越明显。5、生存状况：在照射后40天的时间内，10Gy照射组比格犬无死亡发生。在12Gy照射组中，有3只于照射后40天内死亡。14Gy照射组中比格犬：5只于照射后40天内死亡。2、对比格犬骨髓间充质干细胞进行培养并鉴定-10- 博士学位论文由比格犬的胫骨平台抽取骨髓，分离后将细胞于培养瓶或培养皿中对间充质干细胞进行培养、换液；运用流式细胞仪进行标记分析CD29、CD44、CD90、CD45。通过细胞免疫荧光证实，并对骨髓间充质干细胞进行鉴定，进一步行传代，体外扩增。对获取的间充质干细胞，将细胞内加入成骨诱导液对细胞进行诱导分化，观察间充质干细胞变化，该实验可以证明间充质干细胞具有分化功能，可以最终形成多种细胞。采用细胞膜染料CM-Dil标记联合DAPI染色确定干细胞可以归巢及定植于受损伤部位肠道。3、对犬急性放射性肠病进行骨髓间充质干细胞移植治疗有效对10Gy、12Gy、14Gy建模的犬急性放射性肠病行干细胞移植治疗。干细胞治疗组治疗后比格犬症状表现改善明显，腹泻、便血减轻，体温升高较生理盐水对照组减轻，体重下降幅度减小，肠道吸收及屏障功能检测提示干细胞治疗后肠道功能恢复较快。根据肠镜下肠道组织病理活检，对各组分别于干细胞治疗前（放射照射后第2天）及治疗后（放射线照射后第9天）对组进行病理损伤评分，结果提示：10Gy组比格犬干细胞治疗前、后的炎症细胞浸润评分显著变化（P=0.034），治疗后该项评分下降明显；10Gy组病理评分的总分在干细胞治疗后显著降低（P=0.003）；12Gy组比格犬干细胞治疗前、后炎症细胞浸润评分变化明显（P=0.003），治疗后该项评分下降；12Gy组病理总评分提示治疗后评分下降明显（P=0.005）。14Gy组干细胞治疗前、后病理损伤评分总分提示无显著差别（P＞0.05）。电镜观察提示干细胞治疗组治疗后肠道粘膜恢复较好。比较各个剂量照射后生理盐水治疗组及干细胞治疗组的生存时间，Kaplan-Meier生存曲线提示：经12Gy腹部照射后应用干细胞治疗组比格犬的生存时间较没有应用干细胞治疗组比格犬的生存时间延长（P<0.05）。可见骨髓间充质干细胞移植治疗急性放射性肠病对12Gy剂量照射组的比格犬起到很好的疗效。4、应用蛋白芯片技术检测QAC-CYT-1、QAC-CYT-2因子，根据检测结果行差异基因GO富集分析可能的基因通路，探讨骨髓间充质干细胞治疗急性放射性肠病的相关机制所列单张芯片分析提示：放射损伤后2天生理盐水治疗组与正常（空白对照组）相比，差异性表达因子（Foldchange选取大于2或小于0.5为差异性表达因子）如下：IL-2（Foldchange=0），-11- 博士学位论文IL-6（Foldchange=0），RAGE（Foldchange=0），TNF-α（Foldchange=0.040），MCP-1（Foldchange=0.266）、GM-CSF（Foldchange=0）、VEGF（Foldchange=0.134）、SCF（Foldchange=0.024）、IFN-γ（Foldchange=0），IL-1β（Foldchange=4.365），MIP-1β（Foldchange=2.109）。治疗后7天干细胞治疗组与正常组织（空白对照组）相比，差异性表达因子为：IL-2（Foldchange=0.130），RAGE（Foldchange=0.002），IL-8（Foldchange=935.046），TNF-α（Foldchange=0.031），MCP-1（Foldchange=16.724），GM-CSF（Foldchange=0.128），VEGF（Foldchange=0.0365）、IFN-γ（Foldchange=0），IL-1β（Foldchange=3.091），IL-12p40（Foldchange=0.469）。干细胞治疗组比格犬于治疗后第7天与放射损伤后第2天相比，差异性表达因子为：IL-8（Foldchange=750.675），MCP-1（Foldchange=62.847），VEGF（Foldchange=2.727），SCF（Foldchange=22.322）、Erythropoietin（Foldchange=0.119）。与正常组织相比，放射损伤后表达下调的细胞因子有：IL-2、IL-6、RAGE、TNF-α、MCP-1、GM-CSF、VEGF、SCF、IFN-γ，放射损伤后表达上调的细胞因子有IL-1β、MIP-1β。与损伤组织相比，干细胞治疗后表达下调的细胞因子有：Erythropoietin，治疗后表达上调的细胞因子有：IL-8、MCP-1、VEGF。与正常组织比，干细胞治疗后表达下调的细胞因子有：IFN-γ、IL-12p40，干细胞治疗后表达上调的细胞因子有：IL-8、MCP-1。芯片统计分析提示：治疗后第7天，与生理盐水治疗组相比，干细胞治疗组于表达上调并且具有统计学意义的细胞因子有：MCP-1（P=0.039）。应用RaybiothechELISA检测试剂盒检测比格犬肠道中MCP-1的含量。结果统计分析提示：治疗后第7天，肠道中的MCP-1含量在生理盐水治疗组测得值为2839.20±63.03pg/mg，在干细胞治疗组测得值为2988.20±80.41pg/mg，两者相比较P=0.012，有统计学差异。经软件行各组比格犬肠道组织差异基因GO富集分析提示，最有可能参与放射性肠道损伤、干细胞修复的基因通路为Cytokine-cytokinereceptorinteraction、Africantrypanosomiasis通路、Malaria通路；最有可能参与干细胞治疗的基因通路为Cytokine-cytokinereceptorinteraction通路和Malaria通路。-12- 博士学位论文结论1、成功建立了不同放射剂量损伤下的比格犬急性放射性肠病模型，分析实验动物的症状表现、肠道功能变化、内镜下和组织学变化及生存时间等，提示随着辐射剂量的增大，包括精神萎靡、呕吐、腹泻、血便在内的系列临床症状出现的时间越早，症状越严重，病症持续时间越长。随着照射损伤剂量的增加，肠道功能变化明显，观察比格犬肠镜下损伤程度亦呈加重趋势，组织学变化更为明显；且生存时间会缩短。2、骨髓间充质干细胞经培养、传代、鉴定后，在DSA成像下经股动脉移植ABMSCs治疗比格犬急性放射性肠病，CM-Dil标记证实ABMSCs可归巢及定植于受损伤肠道。症状表现、肠道功能变化、内镜下和组织学变化均证实ABMSCs治疗组较生理盐水对照组各方面的改善更为明显。Kaplan-Meier生存曲线提示经12Gy腹部照射后应用干细胞治疗组比格犬的生存时间较没有应用干细胞治疗组比格犬的生存时间延长（P<0.05）。提示骨髓间充质干细胞移植治疗急性放射性肠病具有明显的治疗效果。3、应用蛋白芯片技术检测QAC-CYT-1、QAC-CYT-2因子，所列单张芯片结果提示：与正常组织相比，放射损伤后表达下调的细胞因子有：IL-2、IL-6、RAGE、TNF-α、MCP-1、GM-CSF、VEGF、SCF、IFN-γ，放射损伤后表达上调的细胞因子有IL-1b、MIP-1b。与损伤组织相比，治疗后表达下调的细胞因子有：Erythropoietin，治疗后表达上调的细胞因子有：IL-8、MCP-1、VEGF。与正常组织比，干细胞治疗后表达下调的细胞因子有：IFN-γ、IL-12p40，干细胞治疗后表达上调的细胞因子有：IL-8、MCP-1。芯片统计分析提示：与生理盐水治疗组相比，干细胞治疗后治疗后表达上调并且具有统计学意义的细胞因子有：MCP-1（P=0.039）。应用RaybiothechELISA检测试剂盒检测治疗7天后肠道中的MCP-1含量在干细胞治疗组较生理盐水治疗组升高，在生理盐水治疗组测得值为2839.20±63.03pg/mg，在干细胞治疗组测得值为2988.20±80.41pg/mg，两者相比较P=0.012，有统计学差异。差异基因GO富集分析提示：Cytokine-cytokinereceptorinteraction通路和Malaria通路可能为参与放射损伤及干细胞修复的基因通路。-13- 博士学位论文关键词：骨髓间充质干细胞、移植、急性放射性肠病、比格犬、治疗、蛋白芯片-14- 博士学位论文Theprotectiveeffectsandcytokineschangesoftransplantingautologousbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsindogswithacuteradioactiveenteritisCandidatefordoctor:YaohuiSupervisor:GuoxiaozhongTutor:ChenjiangXijingHospitalofDigestiveDiseases,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,ChinaSponsoredPrograms:TheMilitaryKeyProgramduringtheTwelfthFive-yearPlanPeriod(BWS12J009)AbstractBackgroundsPeopleenjoygreatconvenienceprovidedbycivilnuclearenergy;atthesametime,weshouldnotignoreitsnegativeeffects.Withthedevelopmentofnuclearstationsandcivilradiologicalnuclearequipments,theycanalsobringextremeworryaboutthediseasesinducedbyradiationexposureandnuclearattacks.Theworldwidescientificresearchshowsthatpatientswithacuteradiationsicknesscangetsatisfactorytherapeuticeffectsiftheradiationdoseisunder6Gy,andalmostnocaseoflongtimesurvivaltimeisreportediftheradiationdoseisover8Gy.Severebonemarrowformsandintestinalformsofacuteradiationsicknessbringbigchallengetoscientists.Patientswithintestinalformsofacute-15- 博士学位论文radiationsicknesswhichmeansrapidprogressionandshortsurvivalperiodwillgetlowtreatmentsuccessrate.Theclinicalsymptomsofthesepatientsareasfollows:abdominalpain,vomiting,diarrhea,bloodystool,acuteperitonitisandintestinalobstruction.Radiotherapyisacommonmethodforthetreatmentoftumor.Whenitkillstumorcells,italsohassomeeffectsonsurroundingnormaltissueandcells.Studieshaveshownthatinpatientswithpelvicandabdominaltumorradiationtherapy,over75%patientsoccurdifferentdegreesofradiationdamageandtheincidenceofacuteradiationenteritiswas25%-75%.Acuteradiationsicknessmeansthatradiationdamagecausestissuesandcellsdamage,sostemcellswhichcanrepairdamagedtissueprovideanimportantwayforthetreatmentofacuteradiationsickness.Stemcelltechnologyisoneofthemostdynamicareasinlifesciencesresearchcurrently.Asweknow,stemcellsexhibitthecapacityforself-renewaltoregenerateordifferentiatefortissuerepairanditisveryimportantformaintaininginternalenvironmentstableandrecoveringdamagedtissues.Mesenchymalstemcells(MSCs)originatefromtheearlystageofmesodermandectodermandtheywerefoundinbonemarrowatfirst.Theyalsocomefromadiposeandumbilicalcordblood.Invivoorvitro,MSCsinducedbycertainconditionscandifferentiateintofat,cartilage,bone,nerve,muscle,cardiacmuscle,avarietyofothertypessuchasendothelialcells.Studiesshowthatthetransplantationofstemcellsmayremarkablyaffecttheradiationenteritismainlycharacterizedbycryptstemcelldamaged.Itisreportedthatbonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)transplantedtotheintestinaltissuecouldrepairthedamagedtissuebyepitheliumrenewalpotentialarisingfromthehighlevelofstemcellproliferationability.Smallintestinaldamageistheheaviestwhentheabdominalradiationdamagehappens.Thesmallintestinalepithelialcellsmetabolismisactiveandtheyaresensitivetoradiation.BMSCswithstrongproliferationability,multi-directionaldifferentiationpotential,lowimmunogenicityareeasilyisolatedfrombonemarrow,purificatedandamplificatedinvitro.BMSCspalyanimportantroleinsupportinghematopoieticfunction.Theycanalsopromotethestemcells’implantation,self-replicatingandimmuneregulation.Radiationinjurycanstimulate-16- 博士学位论文MSCstomigratetothedamagedtissuesandthenMSCspromotetissue’srepairandreconstruction.ResearchersfindthatsomecytokinessuchasIL-1、IL-6、IL-8、IL-11、TNF-α、G-CSFcanplayaroleagainstradiationinjury.ThesafetyofMSCstreatmentisgood.MSCsarethoughttobethemostadvancedcelltherapytools,withtheavailabilityofFDA-approvedclinicalproducts.WehavealsodevelopedclinicalresearchonABMSCstransplantationintreatinginflammatoryboweldiseasewithasatisfactoryeffect.Inthisstudy,webuiltmodelsofradiationenteropathywithdifferentradiationdoseinBeagledogs.WelaunchedanexperimentalstudyonABMSCintreatingradiationenteropathyandusedQuantibodyCanineCytokineArrayinordertoexploreitspossiblemechanism.ObjectiveDevelopingBeagledogsmodelofacuteradiationenteropathywithdifferentradiationdoses,andtodetecttheeffectsofABMSCstransplantationintreatingradiationenteropathy.QuantibodyCanineCytokineArrayisusedinordertoexplorethepossiblemechanismofABMSCstransplantationintreatingradiationenteropathy.MethodsPartone:1.TheconstructionofacuteradiationenteritismodelsofBeagledogs.Twentydogsweredividedinto4groupsrandomly:controlgroup(groupA),10Gyradiationgroup（groupB）,12Gyradiationgroup（groupC）,14Gyradiationgroup（groupD）.GroupB、C、DBeagledogsweregivensingle-dosefromXraydeliveredatdoseratesof250cGy/min.2.Weinvestigatedclinicalfeaturesofthedogsbeforeandafterradiation,includingdiarrhea,intestinalbleeding,stoolstate,abdominalpain,bodyweightandtemperature.TheKaplan-Meiermethodwasusedtoanalyzethesurvivalrateofirradiateddogs.3.Thedegreesofintestinaltractinjuryforallanimalmodelsafterradiationexposurewereevaluatedfromhistologicalfeatures.4.Intestinalabsorptiontest:Thedogswereadministered5%D-xylosebyoralgavageandthebloodD-xylosecontentwasmeasuredinthefixedtimewithin7dayspost-irradiation.Thesampletreatmentwasperformedbyphloroglucinolcolorimetricmethod.5.Intestinalbarrierfunctiontest:PlasmaDAOactivitywastestedbyELISAinthetestgroupswithin7daysafterradiation.-17- 博士学位论文6.Wealsorecordedendoscopicdamageoftheanimals.7.Endoscopieswereperformedbeforeandafterradiation,andchangesofintestinalmucosawereobservedfromimaging,morphologicalpointofview.Theywereevaluatedaccordingtotheappearanceofthemucosaldamage,vascularcongestion,andinflammatoryinfiltration.Accordingtothescore,theintestinaldamagewasstratifiedasabsentorslight(0),mild(1,2,3,4),moderate(5,6,7,8),orsevere(9,10,11,12).Parttwo:1.Theconstructionofacuteradiationenteritismodelofdogs.Thirty-fivedogsweredividedinto7groupsrandomly:controlgroup(groupA),10Gyradiationwithsalinetransplantationgroup(groupB),12Gyradiationwithsalinetransplantationgroup(groupC),14Gyradiationwithsalinetransplantationgroup(groupD),10GyradiationwithMSCstransplantationgroup(groupE),12GyradiationwithMSCstransplantationgroup(groupF)and14GyradiationwithMSCstransplantationgroup(groupG).GroupB、C、D、E、F、GBeagledogstreatedbytridimensionalconformalradiotherapy(3D-CRT)onabdominalirradiationweregivensingle-dosefromXraydeliveredatdoseratesof250cGy/min.Weinvestigatedclinicalfeatures,intestinalabsorptionandbarrierfunction,endoscopicandhistologicdamageoftheanimalsindifferentgroups.ThedegreesofintestinaltractinjuryforallanimalmodelsafterradiationandafterMSCstransplantationtreatmentwereevaluatedfromhistologicalfeatures.Kaplan-Meiersurvivalanalysiswasusedtoobservethesurvivaltimeofallexperimentalanimalsgroups.2.ThecultureofABMSCs:PercolldensitycentrifugationswereusedtodissociateBMSCsfromcaninetibialplateau.IdentificationofABMSCs:ThesurfacemarkersofCD29,CD44,CD45andCD90wereusedtotoidentifytheculturedBMSCsbyimmunofluorescenceandflowcytometry.TheosteogenicdifferentiationsandidentificationswerecarriedonBMSCs.MTTassaywasusedobservethecellviability.3.ABMSCstransplantation:ABMSCsweretransplantedintothemesentericarteryusingfemoralarterypunctureandDSAimagingtechnology.4.Fouraspectsincludingdiarrhea,intestinalbleeding,stoolstate,abdominalpainwereinvolvedthegradingonsymptomsofintestinalradiationinjury.Thefourgradesweredividedaccordingtotheseverityofintestinalradiationinjury.5.Clinicalfeatures:Thechangesofbodyweightand-18- 博士学位论文temperaturewereobservedafterirradiationandafterMSCstransplantation.Wealsorecordedthediarrhea,intestinalbleeding,stoolstate,abdominalpainoftheanimals.6.EndoscopieswereperformedbeforeandafterABMSCstransplantation,andchangesofintestinalmucosawereobservedfromimaging,morphologicalpointofview,includingtheappearanceofthemucosaldamage,vascularcongestionandinflammatoryinfiltration.Accordingtothescore,theintestinaldamagewasstratifiedasabsentorslight(0),mild(1-4),moderate(5-8),orsevere(9-12).8.Comparisonofsurvivaltimeofallexperimentalanimalsgroupswasconductedintheobservedtimepoints.Partthree:1.Eighteendogsweredividedinto3groupsrandomly:controlgroup,normalsaline(NS)groupandMSCstransplantationgroup.2.ThecultureofABMSCsinMSCstransplantationgroup:PercolldensitycentrifugationswereusedtodissociateBMSCsfromcanines.IdentificationofABMSCs:ThesurfacemarkersofCD29,CD44,CD45andCD90wereusedtotoidentifytheculturedBMSCsbyimmunofluorescenceandflowcytometry.TheosteogenicdifferentiationsandidentificationswerecarriedonBMSCs.3.Theconstructionofacuteradiationenteritismodelofdogs:18Beagledogstreatedbytridimensionalconformalradiotherapy(3D-CRT)onabdominalirradiationweregivensingle-dosefromXraydeliveredatdoseratesof250cGy/min.12Gywasusedasradiationdose.3.ABMSCstransplantation:ABMSCsweretransplantedintothemesentericarteryusingfemoralarterypunctureandDSAimagingtechnology.4.EndoscopywereperformedbeforeandafterABMSCstransplantation,indifferentgroupsandtheintestinalsampleswerereservedforQuantibodyCanineCytokineArray1andQuantibodyCanineCytokineArray2analysis.5.QAC-CYT1wasusedtotestGM-CSF、VEGF、IL-2、IL-10、MCP-1、IL-6、RAGE、SCF、IL-8、TNF-α.QAC-CYT2wasusedtotestErythropoietin、FGF-7、HGF、HGFR、IFN-γ、IL-1β、IL-12p40、IL-17A、MIP-1β、TNFRI.6.Preparationofsamples.7.Handlingglassslides.8.Completelyairdrytheglassslide.9.Preparecytokinestandarddilutions.10.Incubationandfluorescencedetection.11.DataanalysiswithQAC-CYT1andQAC-CYT2.12.ThecytokineslevelschangeswereevaluatedusingELISA.13.GeneontologyanalysiswasusedtoexplorethepossiblemechanismandpossiblegenepathwayofABMSCtransplantationintreating-19- 博士学位论文radiationenteropathy.Results1.WebuiltBeagledogsmodelsofacuteradiationenteropathywithdifferentdosessuccessfully.1)Establishanassessmentmethodofcombiningsymptommanifestations,endoscopyandhistologicalchanges.Usingthismethod,wefoundthattheseverityofclinicalsymptomswasrelatedtoradiationdose.Withtheradiationdoseincreasing,thesymptomsincludingvomiting,diarrhea,becameearlier,heavierandlongerforduration.2)Theendoscopicimagesshowedthattheintestinaltractdamageswerecorrelatedwiththeirradiationdoses.Intestinalmucosaldamagecausedbyradiationmayexhibitcongestion,edema,punctatecongestion,hemorrhage,diffusecongestion,haemorrhage,ulcerationandexfoliationfrommildtosevere(10Gy-14Gy)dependingonirradiationdose.3)Afterirradiation,alloftheanimalsexhibitedchangesinbodytemperaturewithdifferentranges.Therewasadecliningtrendinweightateachdetectiontimepointforalldogs.4)Histologicalchangesshowedmucosalinjuryaggravatedwithirradiationincreased.Themildchangesappearedinthe8Gygroup,anddogstreatedwith10-14Gyexhibitedpartiallydamagedmucosa,glandulardilatation,inflammatoryinfiltration,vascularcongestionandhemorrhage.5)Kaplan-Meiersurvivalanalysisfoundthatearlytoxicityandmortalityweredependentuponthetotaldose.,andhigh-doseabdominalirradiationwaslinkedtosevereintestinaltoxicityandincreasedmortality.Duringaperiodof40dayspost-irradiation,theirradiateddogsreceivinghigherdosessurvivedshorterthanthosereceivinglowerdoses(P﹤0.001).2.Weisolated,culturedandeffectivelylabledforthedogbonemarrowmesenchymalstemcellssuccessfully.BothobservationfromimmunofluorescencestainingtechnologyandflowcytometricanalysiswithspecialantibodyconfirmedthatculturedBMSCsweresuccessful.BMSCshadthepotentialtodifferentiateintoosteoblastsinvitro，whichhadbeentestedbyinducingBMSCstodifferentiateintoosteoblastsinvitro.3.Theintestinalmucosalinjuryshowedatrendofthemoreseriouspathologicalinjurywiththegreaterradiationdose.IngroupEandgroupF,theinflammatoryinfiltrationscoresafterMSCstransplantationwerelowerthanthatbeforeMSCstreatment(P=0.034,-20- 博士学位论文P=0.003respectively).WealsoobservedsignificantlowertotalhistologicscoresafterMSCstransplantationingroupEandgroupF(P=0.003,P=0.005respectively).Duringaperiodof40dayspost-irradiation,theirradiateddogsreceivinghigherdosessurvivedshorterthanthosereceivinglowerdoses(P﹤0.001).ComparedwithgroupC,groupFexhibitedsubstantiallylongersurvivaltime(P=0.049)andimprovedreliefofclinicalsymptoms.AutologousbonemarrowstemcellstransplantationswerecapableofcuringacuteradiationenteritisinwithBeagledogsadoseof12Gyattheirabdomens.4.MechanismsofBMSCstreatedacuteradiationenteropathymayexhibitthesecretionandchangesofcytokines.Wefoundthechangesinasingleantibodyarraybetweenradiationgroupandcontrolgroup:IL-2(Foldchange=0),IL-6(Foldchange=0),RAGE(Foldchange=0),TNF-α(Foldchange=0.040),MCP-1(Foldchange=0.266),GM-CSF(Foldchange=0),VEGF(Foldchange=0.134),SCF(Foldchange=0.024),IFN-γ(Foldchange=0),IL-1b(Foldchange=4.365),MIP-1β(Foldchange=2.109).Betweentreatmentgroupandcontrolgroup,wefoundthechangesasfollows:IL-2(Foldchange=0.130)，RAGE(Foldchange=0.002),IL-8(Foldchange=935.046),TNF-α(Foldchange=0.031),MCP-1(Foldchange=16.724),GM-CSF(Foldchange=0.128),VEGF(Foldchange=0.0365),IFN-γ(Foldchange=0),IL-1β(Foldchange=3.091),IL-12p40(Foldchange=0.469).Betweentreatmentgroupandradiationgroup,thechangesweredetectedasfollows:IL-8(Foldchange=750.675),MCP-1(Foldchange=62.847),VEGF(Foldchange=2.727),SCF(Foldchange=22.322),Erythropoietin(Foldchange=0.119).Inmultipleantibodyarrayanalysis,MCP-1showedsignificantdifferencebetweenMSCstransplantationgroupandNSgroup(P=0.039),andELISAanalysisalsoshowedthedifference(P=0.012).AndgeneontologyanalysisshowsthatCytokine-cytokinereceptorinteraction,AfricantrypanosomiasiandMalariamaybethepossiblegenepathways.Conclusions1.Beagledogsmodelsofacuteradiationenteropathyhavebeenestablishedsuccessfully,andanimalclinicalmanifestations,endoscopicperformance,histologicalchangesandsurvivaltimetoevaluateradiationintestinaldamageatdifferentirradiationdoseshavebeenbuilt.Withtheradiationdoseincreasing,thesymptomsincludingvomiting,diarrhea,-21- 博士学位论文becameearlier,heavierandlongerforduration.Theendoscopicimagesshowedthattheintestinaltractdamagewerecorrelatedwiththeirradiationdoses.Intestinalmucosaldamagecausedbyradiationmayexhibitcongestion,edema,punctatecongestion,hemorrhage,diffusecongestion,haemorrhage,ulcerationandexfoliationfrommildtosevere(10Gyto14Gy)dependingonirradiationdose.2.Weisolated,culturedandeffectivelylabledthedogbonemarrowmesenchymalstemcellssuccessfully.ABMSCsweretransplantedintothemesentericarteryusingfemoralarterypunctureandDSAimagingtechnology2daysafterradiation.Kaplan-Meiersurvivalanalysisfoundthatearlytoxicityandmortalityweredependentuponthetotaldose.ComparedwithgroupC(12GyradiationwithMSCstransplantationgroup),groupF(12GyradiationwithMSCstransplantationgroup)exhibitedsubstantiallylongersurvivaltime(P=0.049)andimprovedsymptomsrelief、histologychangesandintestinalfunction.3.WefoundthatABMSCstransplantationcouldimproveanimalclinicalsymptomsandplayanimportantroleinrepairingradiationdamage.Comparedwithsalinetreatmentgroup,MCP-1showedincreaseinABMSCstreatmentgroup(P=0.039).ELISAanalysisalsoshowedthedifferencebetweenABMSCstreatmentgroupandsalinetreatmentgroup(P=0.012).GeneontologyanalysisshowedthatCytokine-cytokinereceptorinteraction,AfricantrypanosomiasiandMalariamightbethepossiblegenepathways.Keywords：autologousbonemarrowmesenchymalstemcells;transplantation;Acuteradiationenteropathy;Beagledogs;treatment;QuantibodyCanineCytokineArray-22- 博士学位论文前言放射性肠道损伤是战时核武器爆炸、和平时核电站事故及民用核设施泄漏时发生的常见损伤，也是临床上盆腹腔肿瘤化疗时常见的并发症。小肠属于能够快速自我更新的组织，由于小肠上皮具有等线性排列这一特殊的解剖结构，因此电离辐射成为胃肠道的重要损伤因素。放射性损伤可以破坏肠道的上皮细胞，损伤肠道粘膜屏障的结构与功能。急性放射性肠炎（acuteradiationenteritis，ARE）可以引起大量细菌及毒素侵入血液及淋巴系统，引起菌血症及毒血症，甚至引起全身炎症反应综合征和多器官功能不全及衰竭，严重者危及生命。慢性放射性肠病可导致肠壁粘膜的萎缩，肠道纤维化及肠壁血管的硬化。临床表现包括发热、腹痛、腹泻、血便、进食差等。现有的治疗方法主要是保护消化粘膜、营养支持等对症治疗，包括抗感染、营养肠道粘膜、止血、止痛、调节肠道菌群等药物，高压氧治疗（hyperbaricoxygentherapy，HPOT）对于药物治疗欠佳的放射性肠炎有一定的疗效，中医中药治疗可在一定程度上改善临床症状，但目前还没有一种方法能够有效治疗放射性肠道损伤，因此寻找一种新的可能替代的值得探索。研究表明间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）可以定植于肠道，促进肠道功能修复，为放射性肠病患者带来了福音。骨髓间充质干细胞（bonemesenchymalstemcells，BMSCs）存在于骨髓内，作为一种成体干细胞，其具备多向分化潜能，可以自我更新，并具有很强的增殖能力。骨髓源性的干细胞具有良好的可塑性和多向分化性，可以定植于肠道上皮，促进小肠绒毛高度增加及隐窝细胞重建。干细胞可以定植于肠道及分化为有功能的肠道上皮细胞已经具有了较好的理论基础，临床领域的研究还处于探索状态。对于间充质干细胞移植治疗放射性肠病以大鼠为研究对象较为多见，以大型动物为研究对象相对较少，比格犬的肠道解剖结构相比于啮齿类小动物更加接近人类的肠道解剖，研究自体骨髓间充质干细胞移植治疗比格犬急性放射性肠病对探讨干细胞治疗放射性肠道损伤及机制具有十分重要的意义。本研究时间为2015年3月至2017年8月，对实验用比格犬进行研究，通过调强照射建立不同剂量下诱导的犬放射性肠病模型；体外分离比格犬骨髓间充质干细胞，经鉴定、培养、传代后，采用股动脉穿刺在DSA下造影，将标记的骨髓间充质-23- 博士学位论文干细胞移植到肠系膜动脉以行干细胞移植治疗，观察不同剂量照射下比格犬临床表现、肠道损伤情况、生存时间等；观察不同剂量照射下的比格犬的干细胞移植治疗效果。选取接受骨髓间充质干细胞移植治疗后效果较好的放射剂量，以该剂量调强放射建立犬急性放射性肠道损伤模型，于照射后接受自体骨髓干细胞移植治疗，分别获取各组比格犬正常状态、放射损伤后、治疗后的肠镜下肠道组织为样本，经蛋白芯片QAC-CYT-1、QAC-CYT-2分别检测蛋白GM-CSF、VEGF、IL-2、IL-10、MCP-1、IL-6、RAGE、SCF、IL-8、TNF-α，Erythropoietin、FGF-7、HGF、HGFR、IFN-γ、IL-1β、IL-12p40、IL-17A、MIP-1β、TNFRI。并应用QAC-CYT-1软件和QAC-CYT-2软件进行数据分析，找出差异表达的细胞因子；根据检测结果做蛋白芯片后通路分析，为下一步的通路机制研究打下基础。-24- 博士学位论文文献回顾一、放射性肠道损伤的研究概况肠壁的小肠粘膜上皮细胞发育更新速度快，是电离辐射的敏感组织。当放射源辐射到受害者腹部并且放射损伤的剂量足够时，肠道易为放射损伤的靶器官和靶组织。研究表明，骨髓来源的MSCs能定植于损伤准确的定位移植在损伤处，并促进该处损伤的愈合[1]。当腹部受到损伤辐射后，小肠受损伤程度最大，放射损伤可刺激MSC迁移到受损伤组织，促进该处组织修复及重建[2]。研究发现，细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-11、TNF-ɑ、G-CSF、SCF等可起到对抗辐射损伤的作用[3]。临床中作为盆腔恶性肿瘤的常用治疗方式的放射治疗，在为肿瘤患者解除病痛的同时，也发挥着双刃剑的作用。放射性肠炎病人的不断增加给该治疗方法在肿瘤疾病治疗中的广泛应用带来了新的困扰[4]。放射性肠病可累及小肠、结肠以及直肠，出现呕吐、腹泻、血便等消化道症状。根据受到辐射的剂量大小以及病理改变等情况，急性放射性肠病可被分为骨髓型急性放射病、脑型急性放射病及肠型急性放射病[5]，作为辐射敏感器官，肠型急性放射病是非常具有科研价值的一种疾病，因为急性期在及时治疗2至3周后可治愈；若辐射剂量超出胃肠道耐受范围，可发生严重消化道不良反应，甚至危及生命。一直以来，有关放射性肠炎的发生机制研究仍然不是十分清楚，有研究认为主要原因是放射线对肠道组织细胞的直接损伤引起，由于在肠道中正常组织细胞对放射线损害的抵抗力相比与肿瘤织细胞而言要更差，放射线释放出来的能量可引起肠道细胞发生变化，DNA的螺旋由于氧自由基的生成被破坏，使DNA的转录及复制过程受到阻碍，引起肠道细胞死亡[6]，使肠道的机械功能、化学功能、免疫及生物屏障功能受到极大的损害，产生放射性肠炎。放射线可以对细胞产生损害，发生组织学变化，导致细胞发生病理改变，首先可以对细胞核进行破坏，使细胞分化出现问题，黏膜干细胞死亡；放射线可以直接损伤微血管，这也是造成黏膜干细胞损伤的一个原因；放射损伤发生后可出现前列腺素E2等水平上升。组织学改变主要包括：肠壁炎性渗出、水肿；肠绒毛数量减少、长度减低；肠道粘膜功能受损，营养物质吸收减低。有研究发现，多种基因在放射损伤的过程中发挥作用，在不同情况下引-25- 博士学位论文起不同反应，如BRCA2、TP53、FGF2等[7-12]。放射性肠病的临床及病理表现呈异质性，程度会有轻重差别，造成病变的影响因素较多，主要包括如下3个方面：1、患者一般情况、既往病史和习惯嗜好都对病情产生影响，如年龄较大者表现相对严重，既往有代谢性疾病或者吸烟者相对于其他患者表现明显，但却是一个综合作用结果；患者基因型；遗传变异性。2、辐射的剂量、部位、方式及剂量率等辐射相关因素；研究显示当辐射剂量在10Gy以上时，造血系统将会受到严重损害，骨髓造血遭受抑制，并且病变不可逆，胃肠道同样呈现严重病变情况，并且这种伤害也无法逆转；肠道的不同部位对于放射线敏感性是不相同的，研究发现直肠对辐射的抵抗力比小肠和结肠要高一些。3、防治相关因素包括：给药途径、给药时机、给药剂量、药物种类、治疗方法等。急性放射性肠病患者的最终有可能会造成死亡，导致这一后果直接原因比较多见的是感染，甚至出现败血症，当感染无法控制时机体各器官功能紊乱，造成酸碱平衡电解质失调，引起不可逆后果。当人体在应激状态时，胃肠黏膜首先受损，导致其功能衰竭，这也是死亡的一个常见原因，除此之外造血系统损害也会引起严重后果。对患者生存质量造成严重影响，给患者和家属带来经济及心理负担，严重影响肿瘤患者的放疗计划，给予医护工作带来极大不便。放射性肠病目前治疗上仍以抗感染、营养支持、保护消化道粘膜、止泻、调节肠道菌群等对症、支持治疗为主。针对原发性疾病缺乏有效方法，无法从根本上给予解决。在预防方面可以给患者应用蒙脱石、硫糖铝、角质细胞生长因子（KGF）、益生菌类药物、氯苯哌酰胺、生长抑素类药物等[13-15]。亦有报道高压氧治疗对此病的治疗有一定的缓解作用。放射性肠损伤的研究中多应用啮齿类小动物作为放射损伤的动物模型来进行研究，主要包括种类如下：全身照射或腹部照射造成小鼠胃肠损伤的模型、全身照射外加腹部局部照射建立胃肠损伤模型、活体解剖直视下选定的肠段定位照射造成的肠损伤模型。因此，应用大型更接近人类的实验动物建立放射性肠道损伤模型，探索一种更加适用的治疗方法是当务之急，希望可以针对于放射性肠炎进行根治治疗，力求达到安全高效。二、骨髓间充质干细胞移植治疗放射性肠病1、干细胞与放射性肠病对于难以治疗的放射损伤，干细胞治疗开启了一种全新的有希望的治疗方法-26- 博士学位论文[16]。研究表明MSCs可有效治疗肠型急性放射病[17-19]。骨髓间充质干细胞是目前干细胞研究的热点和重点[20]，研究发现干细胞可以促进局部放射性损伤的愈合[21]。间充质干细胞（MSCs）作为一种成体干细，可进行自我高度的更新并且具备向多个器官组织细胞分化的可能性。我们可以从多种组织器官中得到MSCs，MSCs本身可分化为各个胚层包括内胚层、中胚层和外胚层细胞和神经细胞等，MSCs能够通过归巢的方式到达至损伤的组织，考虑损伤部位释放较多炎性因子[22]。损伤处的MSCs可分化为损伤部位的细胞类型，可分泌一些细胞因子、生长因子参与组织修复[23]。研究发现MSCs在体内及体外均可以抑制免疫反应，通过细胞间接触和分泌可溶性抗炎因子，抑制T细胞和B细胞活化，减弱具有能进行抗原提呈功能的树突状细胞的功能，调节肠道免疫应答[24]。MSCs可分泌多种生长因子、白细胞介素、趋化因子、细胞基质分子等，如GM-CSF、干细胞受体（SCF）、TPO、IL-6、IL-11、flt3配体、基质细胞衍生因子-1（SDF-1），能够自我更新及多向分化，广泛应用于多种器官、组织的创伤修复。主要机制包括：MSCs能够通过归巢等方式迁移到受到损伤的组织局部，通过具有的多向分化潜能可被诱导分化为肠道上皮细胞等；可使受损伤的肠组织局部干细胞增殖及分化被激活，使细胞凋亡受到抑制，受损害的肠道得以组织修复；其还具有分泌多种类型的细胞因子，参与机体免疫功能调节，使受损肠道组织细胞的结构与功能得到修复，达到抗炎的作用。在欧美已经有多种干细胞相关产品在临床转化及应用中，已经证明其安全性和有效性。干细胞的基础、临床研究领域可涉及到多个学科，包括内科系统的血液科、心血管科、消化科、肾内科、内分泌、皮肤科，还包括神经外科、骨科、眼科等专业。MSCs在临床上用于治疗UC、克罗恩病及肠道移植物抗宿主病，有研究显示MSCs用于治疗克罗恩病人的瘘管，有75%的瘘管于8周后愈合[25]。应用干细胞治疗溃疡性结肠炎在临床中也取得了良好的治疗的效果。2、骨髓间充质干细胞应用于治疗放射性肠病方面的研究2.1骨髓间充质干细胞治疗放射性损伤的相关基础性研究骨髓间充质干细胞是近年来医学和生命科学领域研究的热点，骨髓间充质干细胞在生物学方面有如下的特点：骨髓间充质干细胞能够粘附于培养皿或瓶上贴壁生长；细胞表面抗原表型呈阴性的包括有CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR，抗原表型呈阳性的包括有CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、-27- 博士学位论文CD105、CD124；主要组织相容性复合体I在BMSCs中可表达中等水平的阳性，而主要组织相容性复合体Ⅱ不表达；对共刺激分子B7-1、CD40和CD86等也不表达的。由于缺乏共刺激分子，T细胞反应活性丧失，呈免疫耐受和低免疫原性表现[26]。经过体外分离、培养及扩增后的BMSCs可移植到放射损伤者体内，并能够较长时间在体内存活，仍保持其具有的多个方向分化的潜能，在放射性损伤环境中可诱导BMSCs进一步扩增，参与组织修复或者再生的过程，达到干细胞移植治疗放射损伤的目的，在多种组织和器官的实验性放射损伤可以观察到BMSCs在：骨骼肌、放射性皮肤损伤、肾损伤、睾丸组织放射损伤、放射性肺损伤、小肠绒毛上皮细胞损伤、放射性腮腺损伤、急性放射性肝损伤、放射性神经系统损伤等[27-41]中的修复功能。研究表明细胞因子对放射性损伤的防治有较好的防治效果。观察发现细胞因子IL-11（interleukin-11，IL-11）能保护受到辐射损伤的啮齿类小鼠的肠隐窝干细胞和肠道组织粘膜上皮细胞，并减轻射线对肠粘膜造成的损伤。IL-11可以下调炎症反应、保护肠道粘膜，使包括TNF-а、IL-1β和干扰素等的促炎因子表达降低，调节巨噬细胞等的免疫活性，从细胞生物学方面的研究证实IL-11使小肠绒毛干祖细胞有丝分裂活性增强，促进受放射性损害的肠壁上皮细胞由静止期进入到细胞周期循环期，对细胞DNA的合成、有丝分裂进程有促进功能，并促进细胞增殖，使肠道炎症得以缓解[42,43]。炎性细胞因子白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）可参与固有免疫应答，又参与获得性免疫应答，调节应答细胞活性，促进NK细胞分泌IFN-γ，使T细胞分泌IFN-γ增加，对Th1细胞分化有促进作用，发挥对不同种免疫类型的调节功能[44]。有研究表明IL-12可以促进放射线所致细胞DNA断裂的修复[45]。一项对患有放射性肠炎的患者的肠粘膜行免疫组化检查的结果显示，其细胞因子IL-1、IL-6、IL-8在放射性肠炎患者的肠道组织中的表达水平较正常肠道粘膜组织中相应细胞因子的水平较为明显升高[46]。VEGF促进体内新生血管的生成，其是一种特异性并且与血管生长密切相关联的一种生长因子，并能够通过和血管内皮细胞表面特异性的受体结合发挥作用[47]。应用血管扩张药物治疗放射性损伤可以明显改善组织的血供，这提示促进血管生成可作为放射性损伤的有效治疗方式。VEGF在机体内可促进血管生成及建立侧支循环，其不仅促进微血管生成，还能够促进大血管的生成，降低放射性损伤引起的血管内皮凋亡，促进放射损伤部位的血流恢复[48,49]。在动物实验中的研究证明，MSCs能够以归巢的方式聚集于肠损害的部位并促进组织再生，可使肠道-28- 博士学位论文炎性介质TNF-α、IL-1β及环氧合酶-2（COX-2）显著减少，而生长因子b-FGF、HGF、VEGF升高明显，发挥抗炎和促进修复的作用，使大鼠体重增加并且便血等临床症状改善[50]。BMSCs可分化为多种骨髓基质细胞，重建放射损伤组织的造血微环境，可分泌IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14和GM-CSF等多种细胞因子参与造血损伤的修复[51]。研究发现，成熟干细胞抗辐射作用是通过非同源重组修复DNA双链来实现；肠道隐窝基底柱状干细胞完成DNA双链修复是通过同源重组和非同源重组两种途径[52]。有实验表明，在肠损伤部位能够发现肌成纤维样细胞、上皮细胞可能来源于骨髓干细胞，分化的骨髓干细胞可于损伤的肠段中发现[28]。在一项灵长类动物接受致死剂量的全身照射以后，在对其施行骨髓间充质干细胞移植治疗的实验研究中显示，高浓度的干细胞分布和增殖可见于受损伤的胃肠道组织中。外源性骨髓间充质干细胞一方面促进肠道上皮细胞自我更新，另一方面帮助恢复肠道分泌功能。2.2骨髓间充质干细胞移植治疗放射性肠病的相关机制研究目前发现的可能参与BMSCs修复放射性损伤组织的机制包括：BMSCs细胞因其具备归巢能力，可用于修复放射性组织损伤。研究发现，放射损伤的微环境可诱导更多的BMSCs向损伤部位归巢，达到治疗的效果[53]。在BMSCs归巢后可进行扩增并保持分化[54]。趋化蛋白SDF-1及配体CXCR4相互作用贯穿归巢和植入过程的始终[55]。当组织受到创伤后SDF-1的表达上调，由于其在局部浓度的增高会另其向外周扩散，顺着浓度梯度差引领CXCR4(+)BMSCs沿SDF-1抵达受损害部位，使损伤组织的修复得以实现。SDF-1可抑制BMSCs的细胞凋亡、增强其增殖活性，促进归巢。放射性损伤发生时会产生大量的活性氧自由基及脂质过氧化，使机体组织抗氧化能力减弱。BMSCs在放射性损伤的过程中能够对机体内部氧自由基平衡进行调节。有研究认为BMSCs产生营养因子，调节造血干细胞微环境，可修复辐射对造血系统的损害[56]。BMSCs可通过组织修复和功能修复完成对可逆的肠道损伤的修复作用，具体包括启动内源性增殖和抑制放射性损伤所致的细胞凋亡[33]。BMSCs能分泌多种细胞因子，如IL-2、IL-4、IL-6、IL-11，以及VEGF、FGF、KGF、FGFb、PDGFb、R-spendin1等；对肠道粘膜损伤修复、再生及抗炎等发挥效应[57,58]。BMSCs还能够分泌SDF-l、IGF-l、EGL等发挥旁分泌功能。有相关研究提示IGF-l能够起到抑制PUMA的作用，-29- 博士学位论文可经由PI3K1AKT/P53通路来实现，并且能够阻断辐射损害所致的肠道干细胞的凋亡途径。BMSCs由于具有多种方向分化的潜力、拥有较强的增殖能力，而且遗传背景稳定，不发生免疫排斥，不涉及胚胎干细胞应用伦理，有望更多的应用于辐射所致机体损害的研究，在肠道组织研究中发挥了的修复功能。目前的研究显示BMSCs在治疗不同类型的辐射损伤机制中具体涉及的蛋白、通路、基因仍有待进一步研究；不同种类、不同剂量的的放射损害后BMSCs移植治疗的时间点选取及其在受体内存活时间；能否有效的向特定的受损伤组织分化。在BMSCs治疗放射性肠病中的研究作为科研的热点之一，对基础和临床医学具有较强的现实意义。-30- 博士学位论文正文第一部分建立急性放射性肠损伤比格犬模型1材料1.1实验动物普通级比格犬，20只，雌雄均可，按照实验动物管理及使用指南的要求，执行目前国际通用的动物实验3R（精致化、减量、取代）原则做好动物的饲养及使用。比格犬由沈阳军区总医院动物实验中心提供[经沈阳军区总医院实验动物伦理委员会批准，许可证号SYXK(军)2012-0002]。1.2试剂和材料试剂名称生产公司DMEM低糖Hyclone，美国Percoll分离液Pharmacia，美国D-木糖Sigma,美国胎牛血清Gibco，美国抗生素哈尔滨哈药集团，哈尔滨间苯三酚国药集团，中国冰醋酸国药集团，中国盐酸国药集团，中国犬DAOElisa试剂盒MyBioSource,美国聚乙二醇4000散BeaufourIpsen，德国硫酸镁东北制药，沈阳开塞露南粤药业，深圳甲醛国药集团，中国戊二醇国药集团，中国-31- 博士学位论文Spurr低粘度树脂包埋试剂盒海德生物，北京L-多聚赖氨酸Sigma，美国多聚甲醛国药集团，中国1.3仪器和设备仪器名称生产公司解剖显微镜尼康，日本荧光显微镜奥林巴斯，日本倒置显微镜尼康，日本超净台苏州净化液氮罐MVE，美国水浴锅江苏天由X线直线加速器Siemens,德国螺旋CTSiemens,德国电子小肠镜FUJINON，日本透射电镜JSM-1200EXJEOL，日本定位模具杭州，中国2方法2.1实验动物及分组经过医院伦理委员会批准后购买。健康比格犬，普通级，20只，雌雄不限，严格按照实验动物管理及使用指南的要求执行，同时按照目前国际通用的动物实验3R（精致化、减量、取代）原则做好动物的饲养及使用。将20只比格犬随机分为4组（A-D组），每组5只动物，分别为对照组（定义为A组）、10Gy照射组（定义为B组）、12Gy照射组（定义为C组）、14Gy照射组（定义为D组）。2.2照射方式及照射剂量对B、C、D组比格犬进行麻醉，所用药物为丙泊酚，微泵持续滴入，剂量为0.5ml/kg，并对实验动物进行气管插管，由专用模具进行固定，确定肠道情况，通过CT扫描明确部位，做照射前准备，获得扫描后图像模拟计划设计，应用软件采用治-32- 博士学位论文疗计划系统（Pinnacle3.0，ADAC），根据模拟结果确定照射计划。首先进行定位，由螺旋CT准确定位在下腹，获得扫描图像后再次传到治疗计划系统，确定精确靶区，据结果分配照射剂量。靶区划定由放疗技师经手动勾画来完成，在此过程中要注意重要脏器位置，照射时尽可能避开，防止引起伤害，造成不可挽回损伤。以计划靶区体积PTV确定照射剂量（图1），一般需要在95%以上处方剂量。应用6MeV直线加速器（西门子公司，德国）对其进行单次剂量的辐射。照射剂量分别设为10、12、14Gy，剂量率250cGy。其中，B组实验动物应用10Gy剂量照射；C组实验动物应用12Gy剂量照射；D组实验动物应用14Gy剂量照射。图1靶区划分及照射剂量体积直方图2.3观察实验动物的症状表现观察各组实验用比格犬的症状表现及生命体征，每天于固定时间记录，包括：动物的体重、体温、食欲、呕血、粪便、体重等情况。按照表1进行放射性肠道损伤的分度评估。表1急性放射性肠道损伤的分度[59]症状1度2度3度4度腹泻频率（次/天）2-34-67-9≥10稠度粗大松散稀松水样出血隐性间歇式出血持续出血持续大量出血腹部绞痛或疼痛微弱中度强烈极度-33- 博士学位论文2.4辅助治疗辅助治疗是在实验用比格犬进食较差、行肠镜检查之前的清洁肠道阶段及实验动物的体重持续减低之时进行。给予比格犬行静脉滴注15-20ml/kg体积的林格氏液，每日静滴1-2次行辅助治疗，治疗结束时间至比格犬消化道症状缓解或者实验终止结束。2.5肠镜检查及病理活检观察放射损伤前后试验动物的肠镜下表现情况，常规肠道准备需提前一天进行，经比格犬口灌服复方聚乙二醇电解质溶液，可分3-4次灌服总量1000ml左右，选取时间间隔为30分钟。观察操作当日晨起的肠道清洁状况，必要时再次灌入硫酸镁粉，与100ml糖盐水一起送入，共25g。进行肠镜检查前给予开塞露清理肠道粪便，一般需要提前2个小时，所用药物剂量为110ml，保持肠道清洁，方便图像采集。应用无痛肠镜检查，操作前对其进行全麻，获得粘膜图像，并留取典型样本6-8块，这些样本要妥善保存，以备后期试验应用。对一部分样本需要进行病理检查，并用4%福尔马林溶液保存，。电镜标本需要固定，所用药物为0.25%戊二醛，通过这种方式进行保存。如果要对标本进行蛋白检测，则需要应用液氮罐保存，样本取出后需要迅速放入，应用此种方式保存下来的样本才能进行此项检查。如果需要做冰冻切片，首先要进行液氮处理，迅速进行冷冻，在放入冰箱前要给予OCT包埋，冰箱温度要求为-80℃。2.6D-木糖检测肠道吸收功能给予实验用比格犬以0.5g/kg的剂量由口灌服5%的木糖，时间选择在X线辐射损伤后1周内每日9时进行，于灌服木糖1小时及2小时后经静脉采血，离心后备用。取5µl血清或标准液，加入1000µl显色剂（冰乙酸200ml、间苯二酚1g、盐酸12ml），设空白管对照，混匀充分后，行8min沸水浴，冷却流水达室温，测定554nm处分光光度计吸收值，行标准曲线绘制。2.7血DAO检测肠道屏障功能用超纯水把辐射损伤前后血清样本行10倍的稀释，按犬DAOElisaKit实验方法，将抗体包被后，每孔之中加进样品或标准品100μl，把等容量PH为7.0-7.2的PBS加入对照孔，将50μl由辣根过氧化物酶标二抗加入除了对照孔外的每孔之中，-34- 博士学位论文经37℃给予孵育1小时，行5次洗涤，给予加入A、B底物，经20℃给予孵育15分钟，加进终止液，后上机操作并将酶标仪设为450nm处行检测。2.8肠道组织病理对实验用比格犬分别取正常、照射后及干细胞治疗后的肠镜下肠道组织粘膜活检，将标本置于4%甲醛溶液中固定，石蜡包埋切片，层厚4μm，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，贴片行苏木精-伊红法染色；梯度乙醇进行脱水、二甲苯透明封片，经由显微镜下观察。肠道粘膜损伤的病理评分细则如下[60,61]:肠道粘膜损伤情况：0分镜下表现为正常粘膜组织；1分镜下表现为表面上皮损伤；2分镜下表现为粘膜损伤、受损面积﹤50%；3分镜下表现为粘膜损伤、受损面积≥50%；4分镜下表现为粘膜完全损失。炎症细胞浸润：无或轻微（0分）、轻度（1分）、中度（2分）、重度（3分）、极重度（4分）。血管充血程度：无或轻微（0分）、轻度（1分）、中度（2分）、重度（3分）、极重度（4分）。由两名高年资病理医师分别对上述三方面进行评分，并计算总分。2.9统计学处理应用SPSS17.0统计学软件数据行数据的统计分析，计量资料应用均数±标准差（±s），比较统计采用独立样本t检验；计数资料描述频数（百分比），比较采用χ2检验或非参数检验，各组指标在照射前后的差异比较采用配对样本t检验，以双侧P﹤0.05为差异有显著的统计学意义。3结果3.1比格犬的一般症状表现经不同剂量的放射线放射之后实验动物可表现出轻重程度不同的症状，包括精神不振、食欲下降、恶心呕吐，腹泻血便、体重减低、体温变化等。B组实验用比格犬，于放射损伤后3-4天出现精神不振、食欲下降、恶心、呕吐，-35- 博士学位论文症状持续续7-9天；C组、D组实验用比格犬，于辐射损伤后2天出现上述症状，且严重程度随放射剂量的增量而表现为更为严重。腹泻症状同样表现出剂量相关性，随着辐射剂量由B组到D组的逐渐递增，腹泻和便血的症状表现为逐渐加重。B组于照射后3-4天起出现黄色稀便，可持续8-10天左右，C组、D组比格犬于放射损伤后2天出现间断排黑便、暗红色及红色血便。3.2比格犬的肠道损伤分度根据临床症状可将放射性肠道损伤分为1、2、3、4度，于照射后48小时评估B、C、D组实验动物的临床损伤程度（表2），结果提示随着照射剂量的增加，放射性肠道损伤程度呈增高趋势（P=0.002），D组的损伤程度相对最重，B组的损伤程度相对较偏轻，其中C组的放射损伤程度高于B组（P=0.003），D组的放射损伤程度高于B组（P=0.005）。表2不同组比格犬放射性肠道损伤程度第一只第二只第三只第四只第五只A组（空白）00000B组1度1度1度1度2度C组2度3度2度2度3度D组3度2度3度2度3度3.3比格犬的体温受到辐射组的比格犬在受到腹部放射损伤后体温发生变化（表3、图2），表现为受到照射后体温逐渐升高，在辐射后1周左右达到高峰。B组比格犬体温于照射后1周内升高的幅度小于C组和D组，受照射剂量越大组的动物体温波动的越明显，*标处提示与对照组（A组）相比，P<0.05，有统计学意义。表3受辐射后各组比格犬体温（℃）放射后第1天放射后第3天放射后第5天放射后第7天A组（空白）38.78±0.2638.76±0.3138.76±0.3138.76±0.30B组38.88±0.2239.16±0.3039.48±0.16*39.56±0.20*C组38.80±0.1639.26±0.34*39.54±0.15*39.58±0.28*-36- 博士学位论文D组38.88±0.1839.30±0.37*39.70±0.16*40.03±0.38*图2各组比格犬体温随时间变化曲线3.4比格犬的体重受到腹部放射损伤组的比格犬体重发生不同程度的改变（表4、图3），表现为受到辐射后1周左右的时间内出现较为明显的下降，受辐射剂量相对较大的D组比格犬的体重下降幅度较B、C组的体重下降相对明显，*标处提示与对照组（A组）相比，P<0.05，有统计学意义。表4受辐射后各组比格犬体重（Kg）放射后第1天放射后第3天放射后第5天放射后第7天A组14.28±0.8314.34±0.7914.34±0.7914.34±0.83B组14.24±0.6113.98±0.5913.52±0.5513.46±0.56C组13.88±0.6113.78±0.6413.18±0.58*12.50±0.64D组14.18±0.8113.96±0.7413.38±0.7512.40±0.70*-37- 博士学位论文图3各组比格犬体重随时间变化曲线3.5肠道吸收功能放射损伤组实验动物的血清D-木糖浓度相比对照组呈下降表现（表5、表6、图4），受到辐射损伤的剂量越大，D-木糖浓度下降越明显。*标处提示与对照组（A组）相比，P<0.05，有统计学意义。表51小时后血清D-木糖浓度（mg/mL）放射后第1天放射后第3天放射后第5天放射后第7天A组（空白）103.92±2.97104.97±3.58103.69±3.33102.65±2.79B组97.13±4.61*95.80±7.79*90.11±13.49*83.96±10.32*C组92.96±1.03*88.97±1.98*86.35±3.82*82.83±3.49*D组85.36±10.28*81.12±13.87*78.98±15.65*76.01±17.36*表62小时后血清D-木糖浓度（mg/mL）放射后第1天放射后第3天放射后第5天放射后第7天A组（空白）98.23±2.56*100.35±3.47*99.36±3.12*98.65±2.86*B组88.32±5.78*91.79±8.2387.42±12.78*78.87±9.76*C组85.63±1.95*82.79±2.06*82.73±3.95*78.92±3.51*D组77.95±11.33*75.28±14.36*70.69±15.43*69.96±16.38*-38- 博士学位论文图4各组比格犬血清D-木糖浓度随时间变化曲线3.6肠道屏障功能放射损伤组比格犬血DAO浓度相比对照组（A组）升高，受到辐射损伤的剂量越大，DAO升高越明显（表7、图5）。*标处提示与对照组（A组）相比，P<0.05，有统计学意义。14Gy照射组浓度变化差异明显。表7不同剂量照射组血DAO浓度（ng/mL）放射后第1天放射后第3天放射后第5天放射后第7天A组（空白）215.32±5.37215.08±4.69214.96±5.12215.65±4.96B组226.12±10.78221.79±9.23240.72±9.78*220.87±13.73C组233.65±10.38*237.75±11.29*245.73±12.12*222.19±15.28D组243.06±19.33*249.18±18.62*259.96±18.12*260.65±19.87*-39- 博士学位论文图5各组比格犬血DAO随时间变化曲线3.7比格犬的内镜下表现各组的动物于照射后第3天行肠镜检查（图6），可见镜下表现随照射剂量而有所不同。B组镜下粘膜大致平滑，可见轻度充血、水肿，C组镜下表现为点状出血及较为明显的充血、水肿，D组镜下多表现为片状出血及多灶及弥漫的充血、水肿。提示随着照射剂量的增大，比格犬肠镜下观察损伤程度呈加重趋势。其中图A为正常肠道粘膜组织，图B、图C、图D分别为10Gy、12Gy、14Gy照射后第2天肠镜下表现。-40- 博士学位论文图6不同剂量照射后的肠镜下表现3.8透射电镜结果透射电镜下观察肠道粘膜组织(图7)，其中图A、图B为正常肠道粘膜组织结构，可见绒毛排列整齐，柱状上皮细胞形态规则。图C、图D为放射损伤后肠道粘膜组织结构，可见绒毛缺损，细胞核核型不规则，核内异染色质边集，呈调亡早期样改变，线粒体空泡变性，粗面内质网扩张，紧靠细胞核。图7透射电镜下观察正常与放射损伤后的肠道3.9肠道粘膜损伤的病理评分通过粘膜损伤、炎症细胞浸润、血管充血三方面评分各组比格犬（表8、图8），肠道粘膜病理损伤总分与剂量正相关。B、C、D组比格犬组间分析有统计学差异（P=0.001）,其中B、C组比较P=0.016，C、D组比较P=0.044，A、D组比较P<0.001。表8不同组比格犬放射后肠道粘膜病理损伤评分犬数粘膜损伤炎症细胞浸润血管充血总分A组（空白）50.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.0B组51.2±0.42.2±0.41.2±0.44.6±0.5C组52.4±0.52.8±0.41.4±0.56.6±1.3D组52.5±0.73.0±0.01.5±0.77.5±0.7-41- 博士学位论文图8各组比格犬照射后病理组织HE染色(Bars,200μm)3.10生存状况分析不同组比格犬生存情况（表9）。B组（10Gy照射组）于照射后40天内全部存活。C组（12Gy照射组）中有3只比格犬分别于照射后7天、19天和23天死亡。D组（14Gy照射组）的5只实验动物在辐射后5、7、8、9、16天死亡。生存时间统计分析提示：各组比格犬之间的生存时间有显著差异（P<0.001），随着照射剂量由10Gy、12Gy到14Gy的提高，相对应组比格犬的生存时间会缩短。表9不同组比格犬生存时间（天/d）第一只第二只第三只第四只第五只A组>40d>40d>40d>40d>40dB组>40d>40d>40d>40d>40dC组>40d7d23d>40d19dD组5d9d8d16d7d4讨论随着现代科学与技术的不断发展进步，核技术越来越多的应用于军事、科研、医疗、工业、农业等广泛领域，与此带来的相关放射损伤包括核武器爆炸、核泄漏事故、放疗并发症、核辐射事故等。由于恶性肿瘤发病率的增多，放疗应用越来越普及，有研究指出，超过70%的恶性肿瘤治疗过程中需要放疗治疗，在接受盆腔及腹腔放疗治疗的患者中，相当多的一部分人群的非肿瘤组织受到放射性损伤，放射性胃肠病作为常见并发症，可占到放疗并发症的80%以上[62-64]。肠道上皮细胞因为-42- 博士学位论文生长代谢较为活跃，对电离辐射相对敏感，成为了放射损伤的主要受损器官。放射性肠道损伤的临床表现以胃肠道病变为主要症状，包括频繁呕血、血便、重度腹泻、水电解质代谢紊乱等，作为一种急性放射病，病程包括初期、假愈期、极期三阶段，重度辐射损伤破坏小肠绒毛的完整性，隐窝细胞死亡，肠道粘膜溃疡、出血、坏死，肠道菌群易位，甚至腹膜炎、肠梗阻、肠脓肿、肠瘘的发生，最终发生败血症、全身多器官功能衰竭、死亡等[65]。本研究建立了以比格犬为研究对象的不同辐射剂量下急性放射性肠病损伤模型，选取犬行放射性肠病建模基于以下几点原因：首先是国内外报道的研究放射性肠病应用犬类的相对少见，早期科研受时代科研条件的限制，对深度的机制探索不多；其次犬类动物和人类肠道解剖相似度高，症状表现类似，利于研究者以模拟临床诊疗的模式对犬类动物放射性肠损伤展开研究；最后是在研究放射损伤方面扩充了大型动物的研究资料，为由干细胞治疗放射损害从科研进一步转化到临床探索出更多的可能[66]。既往对啮齿类小动物放射性肠病模型建立大多通过全身照射和全腹部照射两种方式来实现，前者大剂量照射增大放射毒性损伤，可导致多器官功能损害，受辐射早期死亡率高，而采用较低的辐射剂量率会使实验动物更易接受。基于既往上述相关研究，本实验中比格犬于准备放射之前通过专用模具固定并由螺旋CT扫描确定肠道情况，应用CT扫描定位后由治疗计划系统（Pinnacle3.0，ADAC）软件进行图像模拟计划，划分靶区并分配照射剂量。划定靶区的放疗技师在手画过程中根据经验保护重要的脏器，照射时尽可能避开，以免引起重要脏器的损伤。本研究应用6MeV直线加速器，以250cGy剂量率进行单次剂量的辐射，照射剂量分别设为10、12、14Gy，并成功建立起不同剂量下的急性放射性肠病的比格犬模型。既往研究表明，犬类急性放射性肠病的前期症状包括有：精神不振，恶心，呕吐，腹泻，血便等，这些症状和人类放射性肠病的早期症状类似。研究表明人类受到急性全身辐射后可迅速出现呕吐，在受到辐射后2天可出现腹泻，早期症状的出现时间呈剂量依赖，在全身照射或者局部腹部照射研究中均如此。本研究提示在照射剂量为10Gy组实验用比格犬，于放射损伤后3-4天出现上述症状表现；照射剂量为12Gy和14Gy组比格犬，上述症状出现于辐射损伤后2天，剂量越高则症状出现的越早，且症状表现更为严重。腹泻及便血症状同样表现出剂量相关，随辐射剂量由12Gy到14Gy的递增，腹泻、便血的症状表现为加重。于放射损伤后2天可在12Gy、-43- 博士学位论文14Gy组比格犬观察到间断排黑便、暗红色及红色血便。这种急性消化道毒性、症状表现出的时间与剂量的相关性，与既往在人类急性放射病临床中观察到的相似。D-木糖测定用于评估肠道的吸收方面的功能，DAO用于评估肠道屏障功能，这两者均可用于评估肠道的急性放射性损伤。既往研究表明，由于木糖不能够在机体内进行代谢，故血清中木糖浓度的变化情况可反映出肠吸收方面的功能[67,68]。本研究提示血清D-木糖测定作为急性放射性肠病一项诊断和评价方法，能够快速、简便，灵敏、有效的测定肠道的吸收功能，对放射引起的肠病的损伤程度有提示意义。作为反映肠道粘膜完整性的指标，血DAO的变化水平可以相对灵敏的提示放射引起的肠屏障的受损害程度。本实验血D-木糖及血DAO浓度测定提示放射损伤后肠道吸收和屏障功能均受到影响，且呈剂量依赖性，放射剂量越大，肠道的吸收及屏障功能损害越严重。内镜检查是临床工作中普遍应用一种消化道检查方式，在研究实验动物的放射性肠道损伤方面也是重要的方法，主要优势包括观察直观准确；可反复操作，便于不同时间点观察肠道情况；利于不同部位肠道粘膜组织病理活检、取材；侵入性检查但是不必处死动物取得标本；有利于对照研究组织病理，判断损伤、治疗效果等。本研究对比格犬于腹部放射损伤前后均行内镜检查，观察了不同辐射剂量所引起比格犬放射性肠病的内镜下及组织病理下的损伤情况。研究发现，内镜下观察到比格犬肠道毛细血管扩张、水肿，点状及片状充血，甚至糜烂、溃疡等表现与人类放射性肠病的患者类似，也与既往的研究接近[69]。肠镜下便于获取肠道粘膜组织，行病理染色并行病理损伤评分，达到初步量化放射损害程度，便于研究辐射剂量与肠损害的关联。电镜下分析肠黏膜组织细胞的镜下超微结构，有利于直观观测肠黏膜细胞的病理生理过程，同样是本研究的重要观察指标。本研究应用观察放射性肠损伤模型比格犬的症状表现，测定肠道的吸收和屏障功能，行内镜检查观察镜下特点及取病理行组织学评分的方法，来综合评价和研究放射性肠病比格犬的肠道损伤程度。以比格犬接受不同剂量的腹部辐射来建立放射性肠损伤模型，对放射性肠道损伤程度进行评估。应用这种方法，我们发现研究表明，随着放射损伤剂量由10Gy、12Gy、14Gy的不断增加，实验组比格犬的症状表现程度为由轻度到重度，肠道功能的变化体现为从轻微到明显，内镜及组织病理学的损伤表现为从轻度到中重度，生存时间表现出随着辐射损伤剂量的增加而缩短。-44- 博士学位论文小结1、本研究采用调强照射腹部的方式构建出不同辐射剂量下的比格犬急性放射性肠病模型。2、本研究观察放射性肠损伤比格犬的症状表现，放射肠损伤症状分度，测定肠道的吸收和屏障功能，观察各组生存时间，综合评价提示比格犬的肠道损伤程度与剂量相关。3、对比格犬进行肠镜检查观察肠道损伤特点及取病理行组织学评分的方法，为进一步疗效的研究奠定基础。-45- 博士学位论文第二部分骨髓间充质干细胞移植治疗犬急性放射性肠病的疗效观察1材料1.1实验动物健康比格犬，普通级，35只，雌雄均可，按照实验动物管理及使用指南的要求，执行目前国际通用的动物实验3R原则饲养及使用实验动物。实验用比格犬经沈阳军区总医院实验动物伦理委员会批准，由医院动物实验中心提供[许可证号SYXK(军)2012-0002]。1.2试剂和材料试剂名称生产公司DMEM低糖培养液Hyclone，美国Percoll分离液Pharmacia，美国PBSHyclone，美国抗生素广州白云山，广州碘海醇注射液扬子江药业，中国冰醋酸国药集团，中国盐酸国药集团，中国聚乙二醇深圳万和，深圳硫酸镁东北制药，沈阳复方甘油灌肠液南粤药业，深圳甲醛国药集团，中国戊二醇国药集团，中国0.9%氯化钠注射液上海百特，中国L-多聚赖氨酸Sigma，美国胎牛血清Gibco，美国-46- 博士学位论文0.25%胰蛋白酶Hyclone，美国MTT华美，中国二甲基亚砜Sigma，美国牛血清白蛋白Sigma，美国DAPISigma，美国EDTASigma，美国兔抗犬CD29Santacruz,美国大鼠抗犬CD44Santacruz,美国羊抗兔红色荧光二抗博奥森，北京羊抗大鼠绿色荧光二抗博奥森，北京PE标记的羊抗兔二抗博奥森，北京PE标记的大鼠抗犬CD90eBioscience,美国FITC标记的大鼠抗犬CD45eBioscience,美国PE标记兔IgG抗体博奥森，北京PE标记大鼠IgG抗体博奥森，北京FITC标记大鼠IgG抗体博奥森，北京TGF-β1Peprotech,美国1.3仪器和设备仪器名称生产公司普通显微镜尼康，日本倒置显微镜尼康，日本荧光显微镜奥林巴斯，日本超净台苏州净化液氮罐MVE，美国水浴锅江苏天由X线直线加速器Siemens,德国螺旋CTSiemens,德国-47- 博士学位论文电子小肠镜FUJINON，日本透射电镜JSM-1200EXJEOL，日本低温冰箱Forma，美国低温高速离心机Beckman，美国酶标仪Bio-Rad，美国流式细胞仪BeckmanCoulter,美国冰冻切片机Leica，德国二氧化碳孵箱Forma，美国电子天平Sartorius，美国定位模具杭州，中国2方法2.1实验动物及分组比格犬经过医院伦理委员会批准后购买35只健康比格犬，普通级，雌雄均可，按照目前国际通用3R原则饲养及使用实验动物，并按实验动物管理及使用指南严格执行。将35只比格犬随机分为7组（A-G组），每组5只动物，分别为空白对照组（A组）、10Gy照射后生理盐水治疗组（B组）、12Gy照射后生理盐水治疗组（C组）、14Gy照射后生理盐水治疗组（D组）、10Gy照射后干细胞治疗组（E组）、12Gy照射后干细胞治疗组（F组）、14Gy照射后干细胞治疗组（G组），其中为空白对照组，B、C、D组应用生理盐水治疗，E、F、G组行干细胞移植治疗。2.2照射方式及照射剂量用使药物丙泊酚对B、C、D、E、F、G组比格犬由微泵持续滴入（剂量为0.5ml/kg）进行麻醉，行气管插管，专用模具进行固定比格犬，通过CT扫描明确肠道部位，行照射前准备，应用软件为Pinnacle3.0/ADAC治疗计划系统，首先进行定位，由螺旋CT准确定位在右下腹，获得扫描图像后再次传到治疗计划系统，确定精确靶区，配照射剂量。靶区划定由放疗技师勾画完成，过程中要注意避开骨、肝、脾、胃、肾等脏器位置。需要至少95%以上处方剂量。剂量率为250cGy，B组、E组实验动物应用10Gy剂量照射；C组、F组实验动物应用12Gy剂量照射；D组、G组实验动-48- 博士学位论文物应用14Gy剂量照射。2.3骨髓间充质干细胞培养及鉴定2.3.1在放射照射损伤前2周左右对E、F和G组的比格犬抽取骨髓。首先将实验动物进行固定，然后给予全麻，所用药物为丙泊酚，当动物被麻醉后进行皮肤消毒，主要针对操作部分进行，穿刺部位选在胫骨平台，所用器具为一次性骨髓穿刺针，进入骨髓腔后抽取10ml骨髓，所用器具为20ml注射器，事先经500U肝素进行处理。将取出的骨髓进行离心，大约为10分钟，所用仪器为1000r/min离心机，应用PBS液洗涤2次，后重悬，使用Percoll液（密度为1.063g/ml）给予行梯度分离，两部分交界处会有白色的絮状沉淀，吸取絮状物部分，应用DMEM进行洗涤，行细胞计数后，加进10%的胎牛血清作为培养液，把细胞分别装进25cm2细胞培养瓶中并应用培养液进行培养。细胞培养箱设置的温度为37℃，CO2浓度为5%，在细胞培养箱中培养细胞。72-96小时后换液，把没有贴壁的细胞弃去，置换为新鲜的培养液进行进一步培养。平均间隔2-3天更换一次培养液。对细胞进行原代培养，当贴壁80%时，应用胰蛋白酶消化，浓度为0.25%，其中含有EDTA，消化完成后再次离心，进入1:2传代。2.3.2BMSCs的鉴定：细胞培养到一定数量时进入鉴定阶段，一般需要十天时间，所用方法为免疫荧光法，取出含有细胞的培养液，保留细胞，并用PBS进行冲洗，后者浓度要求为0.01mol/L，一共进行3次；再应用多聚甲醛进行固定，浓度要求为4%，温度要求为室温，固定时间为30min，再应用PBS液行3次冲洗，每次冲洗时间为3min；后行10%的羊血清封闭30min；加进一抗抗兔抗犬CD29和大鼠抗犬，前者浓度为1：200，后者浓度为1：300，静置一夜，温度要求为4℃。再次应用PBS液进行冲洗3次，每次冲洗时间为3min；加入浓度为1∶100羊抗兔红色荧光标记的二抗和浓度为1∶100羊抗大鼠FITC绿色荧光二抗，静置1小时，温度要求为常温，再用PBS液冲洗3次，每次3min；阴性对照组不同之处在于不加入一抗，仅应用PBS冲洗。应用甘油封片，要求浓度为50%，观察细胞情况，所用器具为荧光显微镜，同时拍片留档。2.3.3BMSCs的流式分析：对第4代BMSCs进行流式分析，事先需要将其制成混悬液，对特征性标记分子进行观测。调整混悬液浓度，使其能够达到1×107/ml，-49- 博士学位论文制备完成后取出100μl。PE标记羊抗兔CD29间标抗体及相应的兔IgG各取5μl，PE标记大鼠抗犬CD90直标抗体与对照大鼠IgG抗体各取5μl，FITC标记大鼠抗犬CD45直标抗体与对照大鼠IgG抗体（1∶50）各取5μl，分别加入到混悬液中进行孵育，时间为30min，温度设定为4℃。加入BSA细胞洗液，浓度为5%，容量为400μl，对其进行离心，转速设定为1000r/min，温度设定为4℃，共进行5min，再次进行洗涤，一共2次。经过上述制备后才能上机。2.3.4成骨诱导分化：所采骨髓细胞进行传代培养，当达到贴壁80%时，应用胰蛋白酶消化，浓度为0.25%，其内含有EDTA，消化完成后再次离心，所得物质可进行1:2传代。将DMEM成骨条件培养液加入传代后的细胞当中，其中主要成分有地塞米松、维生素C和β-磷酸甘油钠，浓度分别为10nmol/L、50μmol/L、10mmol/L，同时设定一个阴性对照组，该细胞培养液中只含有DMEM成分。再次进行传代，每3天为周期，直到第3代，此时可对所培养的细胞进行计数，进入染色阶段。2.3.5茜素红染色：将以上所制备的细胞爬片进行固定，所用药物为多聚甲醛，浓度要求为40g/L，再用乙醇固定，时间为1小时，浓度为95%，之后进行染色，所用药物为茜素红，浓度要求为2%。2.3.6MTT法绘制BMSCs生长曲线：进行上述消化处理后的细胞开始离心，时间为3min，转速设定为1000rpm/min，当上述液体成为混悬液后可以开始计数。对液体浓度进行调整，要求达到1×104个/ml。取100ul液体进行接种，所用工具为96孔板，一共需要7块，每块需要接种7孔，空白对照3孔。第二天开始每天取一块板进行孵育，向各孔加入MTT溶液，浓度要求为5mg/ml，容积为10ul，以37℃的温度行孵育4个小时。将上清液弃去，于每个孔中加进150ul的DMOS，给予行10min的震荡。以490nm为波长使用酶标仪对每个孔的吸光度值进行测定，对5孔的最终测量值进行汇总，计算平均值。这一过程需要7天，最终完成细胞生物曲线图，这一工作需要GraphPadPrism工具进行辅助。2.3.7体外标记BMSCs：培养的细胞达80-90%的融合时，将培养基弃去，利用胰蛋白酶消化BMSCs，后将细胞浓度进行稀释至1×108/ml，于每毫升液体之中加进CM-Dil细胞标记液5μL、DAPI染色液5μg，给予充分混合后，放入37℃孵箱内进行30min的孵育，以2000r/min给予5min离心，将上清液弃去，经PBS洗涤2次。-50- 博士学位论文于低温中备用。2.4骨髓间充质干细胞培养及移植治疗骨髓抽取时间被定在放射照射损伤前两周，对E、F和G组实验动物进行固定，术前采用全麻方式麻醉，所用药物为丙泊酚，选取胫骨平台作为穿刺部位，局部进行皮肤消毒，经骨髓穿刺针抽取骨髓共10ml，所用20ml注射器已先用500U肝素进行处理，确保对标本进行抗凝。骨髓抽取后进行离心，转速设定为1000r/min，时间设定为10分钟，应用PBS液洗涤2次，后重悬，使用Percoll液（密度为1.063g/ml）给予行梯度分离，试管中可见白色絮状物，取出后应用DMEM液洗涤，制备完成后可以进行细胞计数，加入培养液，成分为胎牛血清，浓度为10%，把细胞分别装进25cm2细胞培养瓶中并应用培养液进行培养。细胞培养箱设置的温度为37℃，CO2浓度为5%，在细胞培养箱中培养细胞。72-96小时后换液，将没有贴壁的细胞弃去，置换为新鲜的培养液进行进一步培养。平均间隔2-3天更换一次培养液。当贴壁达到80%时应用胰蛋白酶消化，其中含有EDTA成分，浓度可以达到0.25%，对于经过上述处理后的细胞进行离心，将所获细胞进行1:2传代。在E、F、G组三组比格犬于接受照射48小时后为时间点给予行ABMSCs移植治疗。将禁食水时间超过8小时以上的比格犬后在手术台上给予固定，需要给实验动物进行全身麻醉，所用药物为丙泊酚，后进行气管插管，对其进行股动脉穿刺，穿刺前首先进行皮肤消毒，穿刺方法为经皮改良的Seldinger法，整个过程需DSA辅助，选择肠系膜上动脉及肠系膜下动脉造影成功后，向动脉内注入已标记CM-Dil、DAPI染料的BMSCs，干细胞浓度为1×108/mL，细胞移植数量为4×109/kg体重。术后常规局部加压包扎，防止穿刺点渗血，局部压迫超过4小时，患肢制动4小时。B、C、D组比格犬同样给予股动脉穿刺的方法，向肠系膜动脉内注入不含有干细胞的生理盐水，作为生理盐水治疗组。2.5肠镜检查及肠道活检组织处理前一天行肠道准备，应用复方聚乙二醇电解质溶液经犬口灌入行肠道准备，可分3-4次经口灌服，每次时间间隔为30min左右，总容积1000ml。操作当日晨起根据情况给予灌入硫酸镁粉25g。进行肠镜检查前给予开塞露清理肠道粪便保持肠道清洁，便于图像采集。操作前对其进行全麻，并留取典型样本6-8块。行病理检查应用-51- 博士学位论文福尔马林溶液（4%）保存；电镜标本需应用戊二醛（0.25%）固定；蛋白检测标本放入液氮中；冰冻切片，标本液氮迅速处理后给予OCT包埋，置于-80℃冰箱。冰冻切片标本由组织包埋后固定，设置切片机厚度为10μm，由载玻片经多聚赖氨酸预处理后封闭，荧光显微镜下行CM-Dil染色观察，并行细胞核（DAPI）染色来共同标记。病理HE染色包括脱蜡、乙醇脱水（由高到低）、苏木精染色、伊红染色、乙醇脱水（由低到高）、二甲苯透明、封片。普鲁士蓝染色步骤为：多聚甲醛（40g/L）固定30min后，PBS清洗3次，干燥，将500uL亚铁氰化钾水（2%）与盐酸（6%）的混匀液滴于玻片后，37℃条件下孵育30min，PBS清洗3次，核固红染色1min，PBS清洗3次。2.6观察指标BMSCs培养、免疫荧光鉴定、流式鉴定、成骨诱导、定植检测等情况。观察照射后及干细胞治疗后比格犬的临床表现、肠镜特点及生存状况。临床表现：观察比格犬的体温、活动、食欲、呕血、粪便、体重情况。治疗前后肠道吸收、屏障功能变化情况。肠道粘膜损伤病理评分细则为：0分为正常肠粘膜；1分表皮损伤；2分和3分为粘膜损伤（2分受损面积﹤50%；3分受损面积≥50%）；4分为粘膜完全损失。炎症细胞浸润：无或轻微（0分）、轻度（1分）、中度（2分）、重度（3分）、极重度（4分）。血管充血程度：无或轻微（0分）、轻度（1分）、中度（2分）、重度（3分）、极重度（4分）。由两名高年资病理医师进行评分。2.7统计学处理应用SPSS17.0统计学软件对数据进行分析，计量资料描述采用均数±标准差（±s），比较采用独立样本t检验；计数资料描述频数（百分比），比较采用χ2检验或非参数检验，各组指标前后的差异比较采用配对样本t检验，用Kaplan-Meier曲线进行存活率动态曲线的比较。以双侧P﹤0.05为差异有显著的统计学意义。3结果3.1BMSCs的培养和鉴定3.1.1BMSCs培养：于培养3天之后弃掉没有能够附壁生长的细胞，加入新培养液，于显微镜下观-52- 博士学位论文察（图9），可见换液后的细胞表现为的典型细胞形态，包括有菱形、三角形及多边形等，呈旋涡状，中心密集，可见有典型的细胞集落形成。图9光镜下观察骨髓间充质干细胞（×100）3.1.2免疫荧光鉴定法：将所培养的生长良好的细胞由骨髓间充质细胞表面的特异性DAPI细胞核与CD44、CD29DE蛋白染色后，在荧光显微镜下观测染色结果：其中绿色部分为特异性CD44蛋白染色，中间呈亮度较高的蓝色部分为DAPI细胞核染色，红色部分为特异性CD29染色。三色重合表现为浅黄色，细胞核及细胞膜的位置显示确切，红、绿两色重合在细胞膜位置。3.1.3流式鉴定法：鉴定之前，需先进行同型的对照管分析，后再行样品管鉴定，并确保上机前管内样本处于均匀状态。CD90阳性比率达95.1%，CD29阳性率为96.3%，与荧光显微镜下观察情况基本一致。CD45阳性比率仅为1.9%。3.1.4成骨诱导：在培养基液中导入间质干细胞进行诱导培养，在显微镜下，第5d可见细胞表现为短梭形并且体积变大；第11d时细胞呈多边形，且胞质中细胞颗粒数量增多；第16d时细胞间可见钙质沉着，胞质内充满颗粒，且呈现集中生长的现象。由茜素红染色显示为红色结节。-53- 博士学位论文3.1.5BMSCs生长曲线检测方法：MTT检测法提示细胞的生长趋势具备一定的规律性，其中1-3d内，细胞的生长速度相对缓慢，3-7d内，细胞表现为对数生长期，7d之后细胞的生长速度较为缓慢。3.1.6BMSCs定植情况：所获得的肠组织冰冻切片经由荧光显微镜观察（图10），图A可见红色细胞由细胞膜染料CM-Dil标记，图B所示经DAPI染色为蓝色标记的细胞核，联合红色染色细胞重叠后呈紫色，可确认为所移植的BMSCs定植存在于肠道组织。图10肠组织冰冻切片CM-Dil染色流式细胞仪分析提示（图11），CM-Dil标记的BMSCs其阳性标记率达到99.6%。图11CM-Dil标记BMSCs的流式分析-54- 博士学位论文3.2比格犬的临床表现B、C、D组实验动物于照射并接受生理盐水治疗后表现出呕吐、血便，症状程度随剂量增加而表现更为严重，其中C、D组治疗后1天仍出现较为频繁的呕吐黄色胃内容物及间断排黑色、暗红色血便，治疗后1周症状缓解不明显。E、F、G组比格犬照射并接受干细胞移植治疗后1周上述症状均有不同程度的减轻。F组与C组实验动物相比，接受治疗后体温有所下降、体重下降幅度减小。统计分析提示空白对照组、生理盐水治疗组（B、C、D组）、干细胞治疗组（E、F、G组）体温及体重于照射后及治疗后的变化情况（图12、图13），其中d1为照射后第1天，d3为照射后第3天（治疗后第1天）。统计分析提示：干细胞治疗后第5天起，干细胞治疗组的体温下降与生理盐水治疗组相比有意义（P<0.05）；干细胞治疗后第7天起，干细胞治疗组的体重恢复与生理盐水治疗组相比有意义（P<0.05）。图12不同组别的体温变化图13不同组别的体重变化-55- 博士学位论文3.3比格犬的内镜下表现各组比格犬于组照射后第2天观察，B、E组镜下见大多粘膜平滑，可见轻微充血、水肿；C、F组见点状出血、多灶充血及水肿等；D、G组见片状、弥漫充血、水肿、糜烂及粘膜的明显损伤。提示随着照射剂量的增大，比格犬肠镜下观察损伤程度呈加重趋势。各组动物于治疗后第7天（照射后第9天）行肠镜检查，比较各剂量照射后不同治疗组内镜下表现。治疗后一周观察（图14），可见F组比格犬经干细胞治疗后内镜下表现较C组经生理盐水治疗组明显好转。图14C组与F组比格犬治疗后7天肠镜下表现图15、图16为比格犬于治疗后的肠镜下表现，其中图A分别为14Gy、12Gy照射剂后经生理盐水对照组治疗后的内镜表现，图片B为干细胞治疗组经干细胞移植治疗后的内镜表现，图B相对于图A可见肠道粘膜出血、水肿、充血明显好转，肠道粘膜恢复明显，提示干细胞治疗有效。图15生理盐水对照组与干细胞治疗组肠镜表现（14Gy组）-56- 博士学位论文图16生理盐水对照组与干细胞治疗组肠镜表现（12Gy组）3.4比格犬的病理损伤情况据肠镜下肠道组织病理活检，分别于干细胞治疗前（照射后第2天）及治疗后（照射后第9天）对各组比格犬进行病理损伤评分（表10）。结果显示，10Gy组比格犬于干细胞治疗后的炎症细胞浸润评分放射损伤后的炎症细胞浸润评分显著变化（P=0.034），治疗后该项评分下降明显；10Gy组病理评分的总分在干细胞治疗后显著降低（P=0.003）；12Gy组比格犬干细胞治疗前、后炎症细胞浸润评分变化明显（P=0.003），治疗后该项评分下降；12Gy组病理总评分提示治疗后评分下降明显（P=0.005）。14Gy组干细胞治疗前、后病理损伤评分总分提示无显著差别（P＞0.05）。表10不同组比格犬照射后、治疗后肠道粘膜病理损伤评分粘膜损伤炎症细胞浸润血管充血总分A组（空白）0.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.010Gy照射后1.2±0.42.2±0.41.2±0.44.6±0.5B组治疗后1.2±0.42.0±0.01.0±0.04.2±0.1E组治疗后1.0±0.01.0±0.01.0±0.03.0±0.012G照射后2.4±0.52.8±0.41.4±0.56.6±1.3C组治疗后1.8±0.42.5±0.71.0±0.05.3±0.4F组治疗后1.8±0.41.2±0.41.0±0.04.0±0.714Gy照射后2.5±0.73.0±0.01.5±0.77.5±0.7D组治疗后2.0±0.03.0±0.41.2±0.46.2±0.3G组治疗后2.0±0.01.5±0.71.0±0.04.5±0.7-57- 博士学位论文F组比格犬于治疗前、后行肠镜检查并取肠道粘膜病理（图17）。治疗之前（图before组)：肠道粘膜中等程度的损伤，肠粘膜下层腺体扩张（++），伴有中性粒细胞为主的混合性炎细胞浸润（+++），大部分肠粘膜坏死、糜烂，可见结构模糊。干细胞治疗后（图after组），各项病理损伤程度明显减轻。图17F组干细胞治疗前、后病理(Bars,100和50μm)3.5生存状况B组于照射后40天内全部存活，C组中有3只比格犬分别40天内死亡，D组5只实验动物在辐射后40天内死亡，E组于照射后40天内全部存活，F组中5只比格犬生存期均超过40天，G组有3只比格犬于照射后40天内死亡，其余2只于照射后40天存活。Kaplan-Meier生存曲线（图18）统计分析提示各组比格犬之间的生存时间有显著差异（P<0.001），随着照射剂量由10Gy、12Gy到14Gy的提高，相对应组比格犬的生存时间会缩短。Kaplan-Meier生存曲线（图19）分析提示：经12Gy腹部照射后应用干细胞治疗组比格犬（F组）的生存时间较没有应用干细胞治疗组比格犬（C组）的生存时间延长（P=0.049）。-58- 博士学位论文图18各组比格犬的生存曲线（Kaplan-Meier曲线）图19C组与F组比格犬的生存曲线（Kaplan-Meier曲线）3.7肠道吸收功能和屏障功能分别照射损伤后第1、3、5、7天抽取犬血检测DAO水平，于灌服D-木糖1小时之后抽血检验。提示照射后第5天起，C组D-木糖值明显下降，其浓度为85.21±5.36mg/ml，与治疗组浓度值90.48±2.09mg/ml相比有统计学差异，P值＜0.05。F组治疗后血DAO含量降低，提示肠道粘膜屏障功能一定程度的恢复，统计分析提示照射后第3天、第5天、第7天F组与C组相比DAO水平无统计学差别，P﹥0.05。-59- 博士学位论文3.8透射电镜结果电镜检查提示：正常对照组比格犬，电镜下可见小肠绒毛整齐，细胞形态正常，未见炎性细胞浸润、血管外渗血、细胞凋亡等表现。放射损伤后，电镜下观察肠道组织可见炎性细胞浸润、血管外渗出、肠绒毛部分脱失，粗面内质网扩张、细胞核边集等凋亡现象。干细胞治疗后，可见肠绒毛恢复到基本正常，粗面内质网轻度扩张，细胞早期凋亡及炎症表现减轻，可见核糖体增多。4讨论放射性肠病的疾病发生机制复杂，目前尚无统一定论，有研究认为：放射性肠道损伤中P53及NF-κB这两条信号通路参与疾病发生，上述两条通路均可诱导细胞凋亡，放射损伤会抑制肠道上皮细胞的增殖，此类细胞由于对放射损伤非常敏感会增加调亡细胞，有研究发现胰蛋白酶激活受体2在放射损伤早期有重要意义[70-73]。目前研究倾向认为，肠道血管内皮细胞和隐窝上皮细胞都参与到了放射性肠道损伤，其中隐窝上皮细胞是放射损伤更为重要的靶点[74-77]。炎性细胞因子分泌失衡也是促进肠道放射性损伤的重要因素，研究认为放射损伤发生后肠道屏障功能减弱，肠道内T、B淋巴细胞数量减少明显，淋巴细胞也会因放射剂量增大而坏死，大量炎性因子的分泌包括：IL-6、IL-1β、TNF-α等进一步促进肠道的辐射损伤。对于放射性肠病的治疗，常规的治疗方法包括补液、抗生素、纠正水电解质平衡紊乱、营养支持、肠道粘膜保护剂、肠道益生菌、细胞因子、对症治疗等，常规方法治疗疗效有限，中医中药治疗也有被尝试，有报道蜂蜜、参苓白术提取物用于治疗放射性肠病，证明参苓白术复方灌胃后治疗局部腹部放射性损伤能够提高实验动物的存活率，起到修复小肠上皮的作用[78]。间充质干细胞（MSCs）的培养和体外扩增技术相对成熟，由于其可分化为多种细胞，因此广泛应用于各种器官（肺、皮肤、胃肠道、烧伤）的放射损伤的修复。研究表明MSCs可参与全身照射后的组织修复，可植入损伤的肌肉、皮肤、骨骼、肠道等多处组织器官，既往在灵长类动物的放射损伤实验中发现，MSCs在胃肠道组织中的植入量最高，说明MSCs植入肠道后会对辐射损伤的肠道组织起到治疗修复效果。有研究认为MSCs有抗组织及器官纤维化的作用，通过对Ⅰ型及Ⅲ型胶原沉积的抑制，还有对基质金属蛋白酶1（matrixmetalloproteinase,MMP-1）以及金属蛋白-60- 博士学位论文酶组织抑制剂1（tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMP-1）等表达的抑制来实现[51]。临床及病理研究结果均表明，MSCs治疗受放射性损伤的啮齿类小动物，在生存时间、体重变化、病理损伤方面均有较好的治疗效果[79]。研究表明间充质干细胞能对放射损伤后的组织修复及抑制免疫反应等起到保护作用，向经致死剂量照射后的小鼠体内注入间充质干细胞能够提高其存活率[17]。肠道干细胞于肠道粘膜遭到损伤以后能够沿隐窝绒毛轴分化成熟将凋亡细胞取代修复损伤[80]。间充质干细胞抑制各种免疫细胞活性，分泌多种细胞因子，抑制炎性损害[81]，还能通过激活旁分泌，于放射损伤的肠道局部植入，修复放射损伤[82]。小鼠研究实验证实间充质干细胞移植后辐射后实验动物的小肠绒毛高度以及隐窝深度可恢复[83]。干细胞移植通过促进空肠、回肠损伤的再生、修复，来促进放射性肠道损伤的治疗[84,85]。由此可见，MSCs以种子细胞及基因治疗载体的形式治疗放射性肠病是积极可行的，全球领域内[86]迄今注册的200余项间充质干细胞研究试验中，十分之一以上与肠道器官相关，可见MSCs在肠道疾病放射损伤治疗方面应用的广泛性。间充质干细胞修复放射性肠道损伤主要表现为促进损伤组织修复和减轻肠道组织的炎性损伤，相关理论基础有：作为免疫赦免细胞可保证在异体移植时无移植排斥反应；可分泌不同种类的细胞因子并归巢至损伤部位，进行调节免疫并抑制炎症反应；对纤维化和隐窝干细胞凋亡的抑制作用。间充质干细胞（MSCs）的免疫调节功能表现为可抑制多种类免疫细胞的活性，比如可抑制树突状细胞对外源性抗原物质的提呈、迁移至外周、成熟；还能抑制T、B淋巴细胞、NK细胞；分泌各种细胞因子，抑制IL-12、IL-1β、TNF-α、IFN-γ分泌，促进IL-4、IL-10抑制性炎性介质的分泌，抑制性炎性介质可抑制巨噬细胞、T细胞，对IL-8、IL-6、IL-1等炎性介质有对抗作用，MSCs可影响调节性T细胞及Th1/Th2免疫平衡而发挥调节作用。MSCs修复损伤组织的机制还包括旁分泌、自身分化及内源修复的启动，分泌VEGF、IGF、HGF等生长因子促血管生成，细胞因子通过促细胞增殖、抗凋亡等作用发挥修复损伤的作用[87]。可见，MSCs归巢后诱导分化为损伤所需类型细胞，激活局部干细胞增殖、分化、修复，分泌细胞因子参与调节免疫、修复结构和功能。理论上看，基因修饰间充质干细胞治疗放射性肠病将干细胞治疗放射性肠病和生长因子治疗放射性肠病的两种优势结合起来，有研究发现应用基因修饰的MSCs治疗放射性肠病效果优于仅用干细胞治疗。-61- 博士学位论文作为放射损伤的研究对象，比格犬为相对于啮齿类小动物，因解剖更接近人类进而科研意义更重大。放射性肠道损伤依辐射强度不一样镜下表现为：毛细血管扩张、充血、水肿、糜烂、溃疡、狭窄及坏死等[88]。我们观察了不同剂量放射线照射组比格犬的临床、内镜表现并进行了肠道粘膜损伤程度的病理学评分，结果提示实验动物肠道损害程度随腹部受辐射剂量增大而变大，实验动物生存时间伴随腹部受辐射剂量的增大而缩短，这与既往报道的放射性肠损伤及致死率呈剂量依赖特点相一致[89]。至今临床中受到剂量大于8.0Gy放射病病例国内外尚无长期存活报道，大多于照射后8-17天死亡[90,91]。本研究提示比格犬在腹部接受10Gy照射剂量后，在照射后的40天内全部存活，原因包括物种间的差别，还包括与既往给予全身照射方式不同，本研究运用的是更加针对腹部放射病的单次腹部调强照方式来造模，对专科肠病的研究观察更有利。既往对啮齿类动物给予全身照射或全腹部照射实验表明，全身照射模式比腹部照射模式可致更为复杂的多器官损害，就仅局限于探讨放射性肠道损伤相关机制而言，干扰因素极大增多，最终结果可信度降低。如果辐射总剂量过高会引起急性毒性及早期致死率增高，相对而言，低剂量率耐受性好，低剂量分次照射相对能明显降低相应风险，本研究显示，应用骨髓间充质干细胞移植治疗10Gy及12Gy照射组的放射性肠道损伤，肠道粘膜损伤病理评分于治疗后降低表明干细胞疗效较好，炎症细胞浸润评分降低提示BMSCs可能参与调节肠道的炎症反应。生存曲线分析提示12Gy照射组经行BMSCs移植治疗后生存时间延长，提示BMSCs在12Gy剂量的放射性肠道损伤治疗中作用重要。干细胞治疗为难治性放射病带来了一种有希望的治疗方法，间充质干细胞可向上皮、血管内皮等多种类型的细胞进行分化，间充质干细胞治疗放射性肠道损伤、促进肠损害修复修复机制可能为：迁移、诱导分化，对局部干细胞增殖及分化的激活，抑制其凋亡，自分泌，旁分泌，调控炎症反应等[16]。具体参与的修复机制将在下一步的研究中证实。小结1、采用调强照射的方式选用不同辐射剂量(10Gy、12Gy、14Gy)腹部照射比格犬并建立急性放射性肠病损伤模型。-62- 博士学位论文2、从比格犬骨髓中提取间充质干细胞，进行培养、扩增及鉴定及定植检测，用于自体骨髓间充质干细胞移植治疗。3、应用自体骨髓间充质干细胞移植治疗犬急性放射性肠损伤，观察比格犬症状表现及肠镜下特征，进行损伤及治疗后的组织病理学评分，观察病理及电镜下表现，观察临床效果和生存期，为下一步机制研究奠定基础。-63- 博士学位论文第三部分骨髓间充质干细胞移植治疗犬急性放射性肠病的机制研究1.样本及试剂1.1实验样本：健康比格犬，普通级，18只，雌雄均可，由沈阳军区总医院动物实验中心提供[许可证号SYXK(军)2012-0002]。将18只比格犬随机分为3组，每组6只动物，为正常对照组、生理盐水治疗组、ABMSCs治疗组。实验样本为小肠粘膜组织，分别来源于各组比格犬的正常、放射损伤后及治疗后的小肠组织。1.2主要试剂：QAC-CYT-1试剂盒、QAC-CYT-2试剂盒试剂盒包括内容：试剂盒置于-20℃，初始应用后，玻片芯片、细胞因子标准混合粉末、检测抗体混合物、Cy3-链霉亲和素应置于-20℃，其余试剂置4℃，免于反复冻融。盒子成分如下：试剂名称生产公司定量芯片（Quantibody®ArrayGlassChip）Raybiotech，美国样品稀释液（SampleDiluent）Raybiotech，美国20×洗液I（20XWashBufferI）Raybiotech，美国20×洗液II（20XWashBufferII）Raybiotech，美国标准品混合物（LyophilizedcytokinestandardRaybiotech，美国mix*）检测抗体混合物（Detectionantibodycocktail）Raybiotech，美国Cy3-链霉亲和素（Cy3equivalentRaybiotech，美国dye-conjugatedStreptavidin）玻片清洗和干燥器（Slidewasher/Dryer）Raybiotech，美国-64- 博士学位论文RaybiotechELISA检测试剂盒Raybiotech，美国操作手册（Manual）Raybiotech，美国1.3仪器和材料仪器名称生产公司塑料离心管(2-5ml，50ml)Corning，美国摇床宇晗医疗器械，济南塑料保鲜膜妙洁，台湾铝箔纸烤乐仕，上海双蒸馏水汇源，沈阳InnoScan300MicroarrayScanne荧Raybiotech，美国光扫描仪酶标分析仪Tecan，瑞士2.方法2.1骨髓间充质干细胞培养于12Gy照射前2周将ABMSCs治疗组的6只比格犬于操作台上进行固定后，麻醉药物应用丙泊酚，穿刺部位及周围皮肤进行消毒，于胫骨平台处应用一次性的骨髓穿刺针穿刺成功后，用内含50U/ml肝素规格为20毫升的注射器抽取10毫升骨髓，以1000r/min的转速进行离心处理10min后，使用PBS液给予2次洗涤，之后重悬，应用Percoll液（密度是1.063g/ml）予以梯次分离，从而获取交接处的白色絮状物，经DMEM进行洗涤后，统计细胞数量，注入含有浓度为10%的胎牛血清DMEM培养基液内，再分装规格为25cm2的细胞培养容器内。细胞培养箱内环境保持为二氧化碳浓度为5%，37摄氏度恒温状态，培养72h后进行换液，并剔除未附壁细胞，并注入新鲜培养基做进一步培养。每2-3d更换一次基液。当MSCs细胞的贴壁率在80%时，使用EDTA浓度为0.25%的蛋白酶进行消化，在离心处理后依照1:2比例进行传代。-65- 博士学位论文2.2照射方式及照射剂量将生理盐水组和ABMSCs治疗组共12只比格犬全麻生效及气管插管成功后，将其使用专用器械模具进行固定，照射前行CT扫描确定肠道处的位置，同时把CT扫描图像传送至Pinnacle3.0，ADAC治疗计划系统给予行模拟计划，制定采用定量的X射线对肠道辐射的放射计划，并确保95%以上的剂量能够进入靶区。使用德国Siemens公司生产的6MeV直线粒子加速器对腹部进行单次定量剂量的放射。照射剂量给予设定为12Gy，剂量率给予设为250cGy。2.3骨髓间充质干细胞的移植治疗实验用ABMSCs治疗组比格犬于照射后48小时的时间点，给予行自体骨髓间充质干细胞移植治疗。将比格犬完全禁食水8个小时之后将其固定在操作台上，应用丙泊酚药物给予全身麻醉成功后给予行气管插管，给予比格犬下半部分皮肤消毒，采用改良Seldinger法对股动脉进行穿刺，股动脉穿刺于数字剪影血管造影术（DSA）下实行，根据造模型损害的肠段部位，经导管行选择性肠系膜动脉造影，将浓度达到1×108/mL的BMSCs基液缓慢匀速注射于肠系膜动脉中，移植细胞数量为4×109/kg。在术后对穿刺部进行加压包扎处理，患处肢体加压包扎并压迫4小时以上，患肢处制动4小时。2.4肠镜检查及病理活检提前检查前24小时行肠道准备，于检查前一天内给予口服1000ml复方聚乙二醇电解质溶液，共分4次而且每次的间隔时间30min左右。在检查当天晨起根据情况将25g硫酸镁粉加入至100ml的糖盐水中给予灌服。在行肠镜检查之前的2小时给予110ml的开塞露肛门内注入将残存粪便清理干净。肠镜检查于动物全麻状态下进行，将采集的图像进行存盘，并保留小肠处的1-2块经典样本，放入-80℃冰箱冷冻保存，行下一步的蛋白芯片检测。行肠镜检查时间：对实验用比格犬分别于正常状态下（照射前）、照射后（照射后第2天）及干细胞移植治疗后1周（照射后第9天）行肠镜检查并给予肠镜下取病理。2.5组织样品的准备把2XCellLysisBuffer液体以双蒸馏水或蒸馏水进行两倍稀释以做备用，配制ProteaseInhibitorCocktail（蛋白酶抑制剂），将此抑制剂放入小管内进行离心处理-66- 博士学位论文后，加入一倍稀释的CellLysisBuffer裂解液60µL，将溶解蛋白酶抑制剂均匀溶解。取配制好的蛋白酶抑制剂50µL，注入至4750µL且浓度为一倍稀释的细胞裂解液中，混合均匀的液体即为配制好的增添蛋白抑制剂的组织裂解液。向组织内加进裂解液，应用高速分散切割机于冰上对组织破碎。于冰上裂解0.5h，每隔5min时间间隔振荡一次。应用13000rpm冷冻离心机进行20min的离心。2.6配制BSA标准液及BCA工作液BSA标准液：取9支洁净的离心管，并由A-I九个字母分别标记，向B-I离心管中注入PH为8.0偏碱性的PBS溶液，剂量分别为：125µL、325µL、175µL、325µL、325µL、325µL、400µL、400µL。向A-C离心管中分别加入BSA标准品储存液，剂量分别为：300µL、375µL、325µL，混合均匀后液体的浓度分别为2000ug/ml、1500ug/ml、1000ug/ml，将此三种样品作为标准品。取出B离心管中175µL标准品注入D管内，混合均匀后即为浓度是750ug/ml的标准品D，取出C离心管中325µL标准品注入E管内，混合均匀后即为浓度是500ug/ml的标准品E，取出E离心管中325µL的标准品注入F管中，混合均匀后即为浓度是250ug/ml的标准品F，取出F离心管中的325µL标准品注入G管内，混合均匀后即为浓度是125ug/ml的标准品G，取出G离心管中100µL的标准品注入H管内，混合均匀后即为浓度是25ug/ml的标准品H，I离心管内蛋白质浓度为零。标准品系列稀释如下表所示：标准品编号稀释液PBS体积/ul标准品蛋白来源及体积标准品蛋白质终浓度/ulug/mlA0300ulBSA标准品储存液2000B125375ulBSA标准品储存液1500C325325ulBSA标准品储存液1000D175175ul标准品B750E325325ul标准品C500F325325ul标准品E250G325325ul标准品F125H400100ul标准品G25-67- 博士学位论文I40000计算所用到全部BCA工作液的体积。计算公式为：（标准品+待测样品）×重复孔数量×200µL。配制BCA液：依照A：B的比例为50:1的比率进行配制，将50体积的BCA试剂A注入至1体积的BCA试剂B中，并充分摇匀。注：该两种试剂混合后，会快速出现浑浊现象，待混合均匀后转变为澄清状态。2.7检测方法选取10µL的待测样品或标准品，分别加至微孔板中。于每孔之中加进200ul的BCA工作液，给予轻度的震动并使其混匀充分，于37℃温度下给予放置30min。待期温度下降至室温，设置波长范围为540~595nm使用酶标仪对吸光度对其进行检测，最佳波长长度被认为是562nm。以BSA标准品测得的吸光度值为依据绘制标准曲线。通过标样品的稀释倍数与标准曲线的稀释倍数来计算样品蛋白质的浓度。测定结果如下：编号ug/ml13988.33324342.53183044600.83355884.16766450.83376234.16782646.66793825.833106509.167编号ug/ml12318.3326960.0036393.3342926.6754951.6765451.677=88293.339=105235.0013=1410193.33-68- 博士学位论文2.8芯片操作流程2.8.1玻片芯片的完全干燥于盒子之内取出玻片芯片，于室内温度下给予平衡约20-30min以后，打开玻片芯片胆道包装袋，将密封条揭开，把芯片置于真空的干燥器内进行为时1-2小时自然干燥处理。由于玻片芯片的灵敏度极高，注意不要触碰到玻片芯片的表面，仅能通过玻片的四周与之接触；在实验操作过程中，需佩戴无粉尘掉落的橡胶手套，避免使试剂及玻片受到污染，勿将玻片打碎，注意将实验环境保持整洁。2.8.2标准品的配置细胞因子标准品梯度稀释图将500µL的样品稀释液添加至细胞因子标准混合物的小管之中，将标准品进行重新的溶解。于打开小管之前行快速离心操作，上下轻轻吹打将粉末溶解，把此管标记为Std1。选6支洁净的离心管，并以Std1-Std6进行标记，于每个小管之内加入200µL样品稀释液。将100µL的Std1加进至Std2之中并给予轻轻混合，再将100µLStd2取出后加进至Std3之中，按这种梯度继续稀释到Std6。将100µL样品稀释液取出至另一新离心管之中，将其标记为CNTRL，作为阴性对照。由于不同细胞因子的初始浓度不同，所以以Std1-6梯度进行稀释后，所得细胞因子的系列浓度也是不同的。2.8.3芯片操作流程于每孔之中加入样品稀释液100µL后，于室温下摇床之上给予孵育1h，对定量抗体芯片进行封闭。抽去各个孔内的缓冲液，加进100µL标准液和样品至孔中，给予稀释至500ug/ml，于4℃温度下进行夜间孵育。使用ThermoScientificWellwashVersa洗板机对两个流程行清洗操作，先用一倍洗液I行清洗，采用每孔250µL的剂量，进行8次的清洗，每次清洗给予10s时间的震荡，选高为震荡强度，应用去离-69- 博士学位论文子水对洗液I进行20倍稀释。其次，选用一倍稀释洗液II通道进行清洗，以每孔250µL的剂量一倍稀释洗液II进行5次清洗，5次清洗均进行为时10s的高度震荡操作，使用去离子水进行稀释20×洗液II。离心对抗体和混合物的小管进行检测，之后把样品稀释液1.4ml加入，均匀混合之后再次给予快速的离心。于每个孔之中加进检测抗体80µL，于RT摇床上进行2h的孵育。在试剂与样品的孵育过程中，应当注意玻片覆盖是否完全，避免出现玻片干燥与产生气泡的现象。在清洗与孵育的过程中，应保持在摇床上进行连续慢摇动作。在孵育环节中，应当注意使用密封条将玻片、芯片进行密封，若孵育时长大于2h,或是试剂育样品体积小于70µL时，需检查孔附近是否有由于临近液体汽化所溢出导致污染现象的发生。样品孵育过程、密闭过程、Cy3-链霉亲和素孵育过程以及检测抗体孵育过程能够于4℃下孵育过夜，注意一定要非常严格的对玻片芯片进行封闭，避免液体的蒸发。采用洗板机清洗玻片，先采用一倍稀释的洗液I对其进行清洗，每孔250µL的1×洗液I进行8次的清洗，每次清洗给予10s时间的震荡，选高为震荡强度，应用去离子水对于洗液I进行20倍稀释。其次，换用一倍稀释洗液II通道进行清洗，以每孔250µL的剂量一倍稀释洗液II进行5次清洗，5次清洗均进行为时10s的高度震荡操作，应用去离子水进行稀释20×洗液II。对Cy3-链霉亲和素小管进行离心，将样品的稀释液1.4ml加进，给予均匀混合之后再次给予快速的离心。将80µL的Cy3-链霉亲和素注入至每个孔内，用锡箔纸将玻片进行覆盖，进行避光孵育。采用RT摇床之上给予1个小时的孵育。应用芯片洗板机对洗玻片进行清洗，清洗可分成两个步骤，第一步先使用1×洗液I对其进行清洗，每个孔250µL的1×洗液I进行8次清洗，每次给予10s时间的震荡，选高设为震荡强度，采用去离子水对于洗液I进行20倍稀释。第二步换用一倍稀释洗液II通道清洗，以每孔250µL的剂量一倍稀释洗液II进行5次清洗，5次清洗均进行为时10s的高度震荡操作，使用去离子水对洗液II进行20倍稀释。荧光检测：1）拆掉玻片框架，要十分注意避免手指触碰到贴有抗体的一面。2）使用激光扫描仪进行信号扫描，应用绿色通道或Cy3通道，激光频率为532纳米的InnoScan300Microarray扫描仪(31390Carbonne-France，产地：Parcd'ActivitésActivestre)，工作参数设置为resoLution:10µm；WaveLengh:532nm。最后将采集到的数据采用QAC-CYT-1、QAC-CYT-2数据分析软件进行分析。将筛选出的有统计学意义的因子-70- 博士学位论文用RaybiotechELISA检测试剂盒行ELISA分析验证。3.结果3.1应用QAC-CYT-1检测因子在单张芯片中的含量图20中不同颜色编号代表单张芯片所排列的不同肠组织标本，图21中不同的颜色代表待检测的不同因子。Pai图20QAC-CYT-1检测因子在样品中的含量-71- 博士学位论文图21QAC-CYT-1检测样品中的不同因子的表达3.2应用QAC-CYT-2检测因子在单张芯片中的含量图22中不同颜色编号代表单张芯片所排列的不同肠组织标本，图23中不同的颜色代表待检测的不同因子。图22QAC-CYT-2检测因子在样品中的含量-72- 博士学位论文图23QAC-CYT-2检测样品中的不同因子的表达3.3应用QAC-CYT-1和应用QAC-CYT-2检测单张芯片总体分析图24QAC-CYT-1检测样品中各因子含量的总体分析-73- 博士学位论文图25QAC-CYT-2检测样品中各因子含量的总体分析3.4QAC-CYT-1检测细胞因子在单张芯片样品中的含量图26、图27、图28、图29、图30、图31、图32、图33、图34、图35为应用QAC-CYT-1检测到的单张芯片中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、MCP-1、RAGE、SCF、TNF-α、VEGF的含量。图26IL-2在单张芯片样品中的含量-74- 博士学位论文图27IL-6在单张芯片样品中的含量图28IL-8在单张芯片样品中的含量-75- 博士学位论文图29IL-10在单张芯片样品中的含量图30GM-CSF在单张芯片样品中的含量-76- 博士学位论文图31MCP-1在单张芯片样品中的含量图32RAGE在单张芯片样品中的含量-77- 博士学位论文图33SCF在单张芯片样品中的含量图34TNF-α在单张芯片样品中的含量-78- 博士学位论文图35VEGF在单张芯片样品中的含量3.5QAC-CYT-2检测细胞因子在单张芯片样品中的含量图36、图37、图38、图39、图40、图41、图42、图43、图44、图45为应用QAC-CYT-2检测到的单张芯片中Erythropoietin、FGF-7、HGF、HGFR、IFN-γ、IL-1β、IL-12p40、IL-17A、MIP-1β、TNFRI的含量。-79- 博士学位论文图36Erythropoietin在单张芯片样品中的含量图37FGF-7在单张芯片样品中的含量-80- 博士学位论文图38HGF在单张芯片样品中的含量图39HGFR在单张芯片样品中的含量-81- 博士学位论文图40IFN-γ在单张芯片样品中的含量图41IL-1β在单张芯片样品中的含量-82- 博士学位论文图42IL-12p40在单张芯片样品中的含量图43IL-17A在单张芯片样品中的含量-83- 博士学位论文图44MIP-1β在单张芯片样品中的含量图45TNFRI在单一芯片样品中的含量-84- 博士学位论文3.6芯片结果本研究中所列单张芯片数据分析提示：放射损伤后2天正常（空白对照组）与损伤组相比（图46、图47），差异性表达因子（Foldchange选取大于2或小于0.5为差异性表达因子）如下：IL-2（Foldchange=0），IL-6（Foldchange=0），RAGE（Foldchange=0），TNF-α（Foldchange=0.040），MCP-1（Foldchange=0.266）、GM-CSF（Foldchange=0）、VEGF（Foldchange=0.134）、SCF（Foldchange=0.024）；IFN-γ（Foldchange=0），IL-1β（Foldchange=4.365），MIP-1β（Foldchange=2.109）。图46待测因子在正常与放射损伤后样品中的含量-85- 博士学位论文图47待测因子在正常肠道与放射损伤后样品中的含量干细胞治疗组治疗后7天与正常组织（空白对照组）相比（图48、图49），差异性表达因子为：IL-2（Foldchange=0.130），RAGE（Foldchange=0.002），IL-8（Foldchange=935.046），TNF-α（Foldchange=0.031），MCP-1（Foldchange=16.724），GM-CSF（Foldchange=0.128），VEGF（Foldchange=0.0365）；IFN-γ（Foldchange=0），IL-1β（Foldchange=3.091），IL-12p40（Foldchange=0.469）。图48待测因子在正常肠道与干细胞治疗后样品中的含量-86- 博士学位论文图49待测因子在正常肠道与干细胞治疗后样品中的含量细胞治疗组比格犬于治疗后第7天与放射损伤后第2天相比（图50），差异性表达因子为：IL-8（Foldchange=750.675），MCP-1（Foldchange=62.847），VEGF（Foldchange=2.727），SCF（Foldchange=22.322）；Erythropoietin（Foldchange=0.119）。图50待测因子在放射损伤后与干细胞治疗后肠道样品的含量-87- 博士学位论文与正常组织相比，放射损伤后表达下调的细胞因子有：IL-2、IL-6、RAGE、TNF-α、MCP-1、GM-CSF、VEGF、SCF、IFN-γ；放射损伤后表达上调的细胞因子有IL-1β、MIP-1β。与损伤组织相比，干细胞治疗后表达上调的细胞因子有：IL-8、MCP-1、SCF等。3.7芯片统计分析应用QAC-CYT-1和QAC-CYT-2芯片统计分析软件分析多张芯片检测结果提示（图51、表11）：与生理盐水治疗组相比，干细胞治疗组治疗后表达上调并且具有统计学意义的细胞因子有MCP-1（P=0.039）。图51治疗7天后各组比格犬细胞因子表达表11多张芯片统计分析生理盐水治疗组与干细胞治疗组于治疗后7天细胞因子细胞因子Foldchange值P值IL-21.516850.62154IL-60.791270.813IL-830.431890.25605IL-101.294480.75613GM-CSF________MCP-14.711100.03886RAGE1.206790.84883-88- 博士学位论文SCF1.317730.71149TNF-α1.637670.67994VEGF0.971530.9569Erythropoietin0.109960.41592FGF-79.436890.2193HGF0.472140.66229HGF-R1.214760.59413IFN-γ00.38928IL-1β21.240830.30648IL-12p400.832410.78669IL-17A________MIP-1β0.894340.86386TNFRI1.192900.807293.8血清学检查结果应用RaybiothechELISA检测试剂盒及酶标仪Tecan检测各组比格犬肠道中MCP-1含量。治疗7天后肠道中的MCP-1含量在生理盐水治疗组测得值为2839.20±63.03pg/mg，在干细胞治疗组测得值为2988.20±80.41pg/mg，两者相比较P=0.012，有统计学差异（图52）。图52生理盐水组与干细胞治疗组中MCP-1的表达-89- 博士学位论文3.9差异基因GO富集分析GeneOntology（简称GO）属于基因功能国际标准分类体系。富集分析方法说明：采取的方法是fisher精确检验，数据包是clusterProfiler，来自R/bioconductor，挑选的标准是落在某个term/GO上差异的基因数目≥2，P-value﹤0.05，画图中取得term/GO是按照enrichfactor的值从大到小降序排列，取前12个结果。enrichfactor定义=（某个term中的差异基因数目/总的差异基因数目）/（数据库term中总的基因数目/数据库中总的基因数目）统计软件研究肠道组织差异基因GO富集分析（图53、图54），提示最有可能参与放射性肠损伤及干细胞治疗放射性肠病的基因通路为Cytokine-cytokinereceptorinteraction通路、Africantrypanosomiasis通路、Malaria通路。最有可能参与骨髓间充质干细胞修复放射性肠损伤的通路为Cytokine-cytokinereceptorinteraction通路和Malaria通路。图53正常组和放射损伤组肠道组织差异基因GO富集分析-90- 博士学位论文图54生理盐水组和干细胞治疗组肠道组织差异基因GO富集分析讨论细胞因子不仅在固有免疫及细胞凋亡中发挥作用，对于血管的再生以及细胞的增殖分化方面作用同样十分重要。细胞因子通过在不同类型的免疫细胞之间形成相互作用的关系，调节细胞应答适应环境变化，并且维持稳态。另外，细胞因子参与多种疾病的进程，包括肿瘤、心血管疾病、消化道疾病等[92-97]。传统对细胞因子进行检测以及进行定量方法能够通过ELISA（酶联免疫试验，enzyme-linkedimmunosorbentassay）得以实现。在这一方法中，目标蛋白固定于固相载体，固定的蛋白然后和酶联抗体相结合。酶联复合物的检测可以通过应用能够产生可检测到信号的底物来实现可视化。这种传统方法对单一蛋白检测效果很好，整个过程耗费时间并且需要相对较大量的样品量。因此，小样品量的保存成为一个主要问题。微阵列即芯片技术在过去十几年的革新解决了这个问题。定量抗体芯片是以多重的双抗体夹心ELISA为基础的定量阵列平台，使研究者准确同时检测到多种目标因子。它把ELISA法的高度敏感性和特异性与芯片的高产量结合起来。类似-91- 博士学位论文于经典的双抗体夹心方法的ELISA，芯片应用一对细胞因子特异性的抗体来检测。俘获抗体首先局限于玻璃表面，在与样品孵化繁殖后，目标细胞因子被局限于固态表面，而后第二种检测抗体经由生物素标记后被加入，该抗体可以识别一种不同的目标细胞因子的抗原决定基。细胞因子-抗体-生物素复合物可以通过加入链霉亲和素结合的Cy3等效的染料，应用激光扫描。与传统的ELISA法不同，定量抗体产品应用的是阵列形式，通过把多种细胞因子特异性的俘获抗体阵列在载玻片，使得不同种类的细胞因子在一次实验过程中即可完成检测。蛋白芯片以蛋白质作为研究目标，蛋白芯片基本原理为：经化学的方式处理固态的载体，固定再将已知蛋白，待测蛋白与之特异的结合并被捕获，再经由洗涤、纯化、确认、分析；能够获多种欲知的生物信息如未知蛋白组分、蛋白序列、表达水平、生物功能、与其他分子相互之间的调控关系。RayBiotech蛋白芯片原理包括夹心法芯片原理和标记法芯片原理。细胞因子作为一种可溶性低分子量蛋白，能够由其他因子或者免疫原、丝裂原刺激细胞所产生，其能够调节免疫、促造血、促活化、刺激增殖、促分化，还能够促进骨髓造血等功能。其特点为结合受体发挥作用，是在较低浓度下便有生物学活性的小分子多肽，可发挥自分泌功能，也能够产生内分泌作用，还可以起到旁分泌效果，细胞因子本身及不同细胞因子之间可发挥出多效、重叠、拮抗、协同的生物学效果，所涉及到的免疫系统网络十分复杂。在实验第二部分和既往研究中我们发现，BMSCs移植治疗放射性肠病的最佳时机是受辐射后48小时，这给时间段肠道受辐射损伤最为严重，我们认为在这个时间点行BMSCs移植治疗会收获到良好的疗效。在第一部分实验中可以观察到，生存时间统计分析表明经过12Gy剂量照射后行BMSCs移植治疗的生存时间长于未行BMSCs移植治疗的比格犬，症状分析、肠道病理损伤评分等结果表明BMSCs移植对12Gy这一剂量的放射性肠损伤效果较好，故本研究将照射剂量设为12Gy。通过蛋白芯片QAC-CYT-1检测BMSCs移植治疗放射性肠病过程中，经蛋白技术检测蛋白GM-CSF、VEGF、IL-2、IL-10、MCP-1、IL-6、RAGE、SCF、IL-8、TNF-α，并采用和QAC-CYT-1相关的分析软件来对数据进行分析比较，研究上述细胞因子在不同组的正常肠道、放射损伤后、治疗后表达差异，为干细胞治疗放射性肠病的机制研究进一步打下基础。本研究使用RayBiotech蛋白芯片，QAC-CYT-1是针对犬类动物设计的一组蛋白-92- 博士学位论文因子检测芯片。该芯片研究的免疫因子如下：GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因）作为免疫家族中的一种集落刺激因子，可促造血干细胞增殖、分化，还可以对造血祖细胞增殖分化起到促进作用；IL-2、IL-6、IL-8、IL-10作为白细胞介素、家族成员，与大多数的炎症因子不同，IL-10通常被认为起到炎症抑制因子的作用；MCP-1作为趋化因子，趋化、激活多种免疫细胞；TNF-α属于肿瘤坏死因子超家族，能够调节机体的适应性免疫应答，还能够对靶细胞进行杀伤，以及对细胞凋亡进行诱导；作为SCF（干细胞因子），CD117是其受体。活化的T细胞尤其是Th1产生IL-2，刺激T细胞的生长及促进T细胞的分化是IL-2的重要功能，IL-2能够使NK细胞得到激活，也能够使巨噬细胞得以激活，对CTL的功能有显著的促进作用。多种类型的免疫细胞包括T细胞、内皮细胞、单核细胞等能够产生IL-6，IL-6能诱导急性期反应蛋白产生，发挥对T细胞生长分化和B细胞生长分化的促进作用，可是CTL细胞功能进一步增强。IL-10作为一种炎症抑制因子在多项研究中被关注，Th2细胞、单核细胞等多种细胞能够生成IL-10，IL-10不仅对单核细胞产生抑制，对Th1生成的细胞因子也有抑制作用，IL-10对B细胞的增殖起到正向促进作用。巨噬细胞能够产生GM-CSF，研究发现T细胞也能够生成GM-CSF，GM-CSF对树突状细胞的生长、分化有明显的促进效果，GM-CSF能够激活巨噬细胞。主要由基质细胞可产生SCF，内皮细胞及胚胎细胞等也能够生成SCF，其对造血干细胞分化明显促进作用，在对肥大细胞的增殖、活化等免疫调节中发挥正向促进作用。包括巨噬细胞及NK细胞等在内的多种免疫细胞能够生成TNF-α，参与靶细胞杀伤，促细胞凋亡。VEGF能够由包括肿瘤细胞在内的多种细胞产生，对血管生成及淋巴管生成有促进作用，参与多种创伤修复愈合。IL-8主要产生于成纤维细胞、内皮细胞等，主要功能为趋化中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、T细胞。单核细胞可生成MCP-1，其他免疫细胞如成纤维细胞及上皮细胞也可以生成MCP-1，主要功能包括趋化T细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞。既往多项研究发现，一些细胞因子例如IL-1、IL-6、IL-8、IL-11、TNF-ɑ、G-CSF、SCF等可起到对抗放射性损伤和组织修复的作用[3]。既往研究提示BMSCs其可通过促抗炎因子IL-10分泌，抑制炎性因子IL-17分泌及促肠道生长因子KGF、FGF-2、PDGF-B生成以发挥对比格犬肠道抗放射损伤修复作用，有实验提示多种基因在放射性损伤的不同途径中发挥不同作用，如DNA修复基因BRCA1、BRCA2、ATM；细-93- 博士学位论文胞凋亡基因BCL2、TP53、抗氧化物酶SOD1、生长因子、FGF2以及VEGF等[7-12]。炎性细胞因子分泌失衡也是促进肠道放射性损伤的重要因素，研究认为放射损伤发生后肠道屏障功能减弱，肠道内的免疫细胞包括巨噬细胞的数量、T、B淋巴细胞数量及中性粒细胞的数量会有明显的降低，淋巴细胞也会因放射剂量增大而坏死，大量炎性因子的分泌包括：IL-1β、TNF-α、IL-6等进一步促进肠道的辐射损伤。既往有研究显示MSCs可分泌多种白细胞介素、趋化因子、生长因子、细胞基质分子如GM-CSF、SCF、TPO、IL-6、IL-11、flt3配体、基质细胞衍生因子-1（SDF-1），参与辐射损伤的修复。有研究显示MSCs能够分泌不同种类的细胞因子，对以下细胞因子包括IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α的分泌有抑制作用，促进分泌IL-10、IL-4抑制性炎性介质，IL-4、IL-10这类抑制性炎性介质可抑制巨噬细胞、T细胞，对炎性介质IL-6、IL-8、IL-1等发挥对抗作用。MSCs发挥免疫调节作用还可以通过对调节性T细胞以及对Th1/Th2细胞免疫平衡的影响来实现。MSCs修复损伤组织的原理还可能包括：旁分泌、自身分化及内源修复的启动，可分泌VEGF、IGF、HGF等生长因子促血管生成，细胞因子通过促细胞增殖、抗凋亡等作用修复损伤组织[83]。MSCs可通过表达及分泌MCP-1参与调节T细胞迁移与凋亡，参与不同器官及细胞损伤的修复[99-102]。本实验研究结果提示，所列单张芯片分析表明：放射损伤后较正常肠道组织下调的细胞因子有IL-2、IL-6、RAGE、TNF-α、MCP-1、GM-CSF、VEGF、SCF，干细胞移植治疗后较损伤期明显上调的细胞因子包括IL-8、MCP-1、VEGF。芯片统计分析提示：与生理盐水治疗组相比，干细胞治疗组治疗后表达上调并且具有统计学意义的细胞因子有：MCP-1（P=0.039）。提示多种细胞因子可能参与了损伤及其相关的修复，MCP-1在参与间充质干细胞治疗放射性肠病的过程中起到非常重要的作用。生化实验应用ELISA的方法验证了肠道中的MCP-1含量于干细胞治疗组较生理盐水对照组升高并且具有统计意义。QAC-CYT-2可检的细胞因子主要包括以下几种，Erythropoietin：可通过与受体结合，进而介导红细胞的增殖及分化过程。FGF7能够对趋化因子产生激动效果，还能够参与到成纤维细胞生长因子受体的信号通路中去，促进间充质细胞增殖，促进角化蛋白的增殖、迁移，该蛋白位于细胞表面。HGFR通过与HGF配体结合，调节细胞外基质至细胞质内的信号转导。可调节多种生理过程，包括增生、分化、形-94- 博士学位论文态发育和生存时间。HGF与HGFR结合发挥免疫调节作用。IFN-γ由淋巴细胞被特异性的抗原或有丝分裂原激活产生。IFN-γ不仅有抗病毒的活性，还有许多重要的免疫控制功能。它是一种强有力的巨噬细胞激活剂，它对变异细胞有抗增殖作用，能够增强Ⅰ型干扰素的抗病毒作用以及上调干扰素的抗肿瘤作用。IL-1β，能够强力促进炎症反应。最初作为内生致热原被发现，促进前列腺素合成、中性粒细胞活化、T细胞活化和细胞因子产生、B细胞活化和抗体生成，成纤维细胞增生和胶原蛋白生成。IL-17A能够对细胞因子起到激活作用，与细胞因子受体结合，在细胞对IL-1的免疫应答中起作用，在炎性反应中正向调节细胞因子的产生，正向调节IL-23的生成，促进IL-6的分泌。MIP-1β(CCL4)：能够激动趋化因子，与CCR趋化因子的受体相互结合，参与细胞对药物的免疫应答，调节细胞对IFN-γ、IL-1及TNF-α的应答，参与炎症反应，能够趋化包含淋巴、单核及中性粒在内的多种免疫细胞。TNFRI能够与TNF结合激活参与免疫应答，即可负向调节炎症应答，也可正向调节炎性反应，调节细胞增殖、凋亡等。IL-12是一种二硫化物连接的异二聚体蛋白（p70）,由p35和p40两个亚组组成，这两亚组分别由两种不同的基因编码。树突状、单核巨噬及B细胞等其他种类型的抗原提呈细胞均能够生成IL-12，能够对Th1细胞增殖起到明显促进作用在多种疾病中产生作用。急性放射性肠病中，放射损伤可引起小肠隐窝干细胞不能及时更新及补充死亡的小肠隐窝上皮细胞，引起小肠绒毛的脱落和死亡，研究发现，维持肠道粘膜稳态重建的主要是Lgr5标记的连续分裂的隐窝干细胞，重建放射损伤后的肠道粘膜的为Bmi1标记的静脉隐窝干细胞[98]。放射性损伤可引起血管内皮细胞凋亡等功能功障碍，导致新的血管生成难度增大。BMSCs参与免疫调节、减轻炎症反应的具体机制尚不十分清楚，推测可能和如下因素相关。BMSCs不仅能够表达出多种类型的表面抗原，并且能够分泌不同种细胞的粘附分子，介导免疫功能细胞和炎症发生部位之间的粘附，发挥抑制髓过氧化物酶，抑制细胞间粘附分子-1表达及抑制炎症反应的作用。BMSCs能对淋巴细胞的增殖产生抑制，分泌包括转化生长因子以及肝细胞生长因子在内的多种可溶性免疫调节因子。BMSCs不但对免疫细胞的增殖、活化有抑制功能，还能够抑制细胞因子的分泌，参与诱导T淋巴细胞凋亡，增加有负向调节功能的T淋巴细胞亚群[103]。肠道放射损伤修复依赖于外环境分泌的细胞因子和蛋白生长因子，有研究发现相关因-95- 博士学位论文子包括KGF，FGF2，GM-CSF等。有研究表明KGF参与到细胞的分化、增殖以及DAN修复过程。啮齿类小动物放射性肠病模型相关研究发现这些因子可参与到放射性肠损伤的修复过程中，可以有效的减轻电离辐射创伤，可能的机制包括直接作用在肠干细胞来提高肠隐窝干细胞的增殖[58]。有实验研究表明FGF和PDGF-B均可帮助促进上皮细胞生长[104]。既往有研究证明了血清中KGF、FGF2及PDGR-B三种蛋白于放射损伤后和干细胞移植治疗后的变化，提示治疗后三种蛋白不同程度的增高，其中FGF2增高最明显[105]。可见BMSCs治疗急性放射性肠病一方面可能通过与隐窝肠干细胞作用来促进上皮再生，另一方面通过自分泌、旁分泌各种因子来间接修复损伤的肠道。多数有关MSCs的研究中证明干细胞下调IL-12的表达，抑制炎症反应，本研究中示例单张芯片分析结果显示：治疗与正常组织相比，差异性表达因子包括IL-12p40，治疗后较正常组织表达下调，与既往研究结果相似；本研究中单张芯片发现正常与损伤组织相比差异性表达因子包括IFN-γ，IL-1β，MIP-1β，其中与正常组织相比，放射损伤后表达下调的细胞因子有：IFN-γ，放射损伤后表达上调的细胞因子有IL-1β、MIP-1β。但除了MCP-1，多张芯片统计分析未发现其他待检测细胞因子在干细胞治疗组与生理盐水治疗组、空白对照组中有统计学意义，这考虑与研究动物种属、干细胞治疗后取材时间、肠镜下取材位置不同等相关。基因GO富集分析：我们推测与放射性肠损伤、干细胞治疗放射性肠病相关联的基因通路中可能有Cytokine-cytokinereceptorinteraction，Africantrypanosomiasis，Malaria等几种通路。这为下一步可能进行的基因芯片分析进一步提供方向。在骨髓间充质干细胞移植治疗的具体应用实践中，干细胞移植治疗的时机选择机移植干细胞数量，还有干细胞移植治疗次数一直是研究的热点，本次实验选择移植时机在放射性损伤后48小时，通过对12Gy剂量组的放射损伤及自体骨髓间充质干细胞移植治疗，收到较好的临床效果。通过蛋白芯片技术分析正常肠道组织、放射损伤后肠道组织、移植治疗后肠道组织QAC-CYT-1、QAC-CYT-2中不同免疫因子表达的差别，初步推测BMSCs移植可以上调MCP-1。通过基因通路分析提示Cytokine-cytokinereceptorinteraction，Malaria通路可能参与干细胞修复放射性肠损伤过程。-96- 博士学位论文小结1、在体外成功的分离、培养了比格犬骨髓间充质干细胞并进行传代扩增。2、采用调强照射的方式以12Gy照射剂量对比格犬进行单次腹部照射建立急性放射性肠病模型。3、运用股动脉穿刺法将骨髓间充质干细胞注入肠系膜动脉行BMSCs移植治疗急性放射性肠病。采集各组实验动物肠道正常组织、放射损伤后、治疗后组织为样品。4、应用QAC-CYT-1及QAC-CYT-2试剂盒试剂盒做细胞因子检测，并应用QAC-CYT-1、QAC-CYT-2分析软件分析统计各种细胞因子的变化，芯片统计分析提示：与生理盐水治疗组相比，干细胞治疗后治疗后表达上调并且具有统计学意义的细胞因子有：MCP-1（P=0.039）；ELISA检测提示两者相比较P=0.012，有统计学差异。为下一步可能的通路机制方面研究做好准备。5、统计软件行肠道组织差异基因GO富集分析，提示最有可能参与放射性肠损伤及干细胞治疗放射性肠病的基因通路为Cytokine-cytokinereceptorinteraction通路、Africantrypanosomiasis通路、Malaria通路。最有可能参与骨髓间充质干细胞修复放射性肠损伤的通路为Cytokine-cytokinereceptorinteraction通路和Malaria通路。。-97- 博士学位论文总结1、成功建立起不同放射剂量损伤下的比格犬急性放射性肠病模型，分析实验动物的症状特点、内镜下表现及组织学变化情况、生存时间等，提示伴随着辐射剂量的增大，包括精神萎靡、呕吐、腹泻、血便在内的系列症状出现的时间越早，症状越严重，病症持续时间越长；随着照射损伤剂量的增加，观察比格犬肠镜下损伤程度亦呈加重趋势；随着照射剂量由10Gy、12Gy到14Gy的提高，相对应组比格犬的生存时间会缩短。2、分离、培养、鉴定并传代骨髓间充质干细胞，于照射后2天（48小时）在DSA成像技术下采用股动脉穿刺，将标记的ABMSCs移植至放射性损伤相关肠段的肠系膜动脉，行CM-Dil、DAPI标记染色证实ABMSCs可归巢及定植于受损伤肠道。给予行干细胞移植的方法治疗10Gy、12Gy及14Gy剂量照射组比格犬的急性放射性肠病。Kaplan-Meier生存曲线提示：经12Gy腹部照射后应用干细胞治疗组比格犬的生存时间较没有应用干细胞治疗组比格犬的生存时间延长（P<0.05）。肠道病理损伤评分提示：12Gy组于干细胞治疗后炎症浸润评分及总评分下降明显（P<0.05）。12Gy组于干细胞治疗后肠道吸收、屏障功能及症状缓解均较为明显，电镜下观察到修复效果明显。可见间充质干细胞移植治疗对12Gy剂量照射组犬急性放射性肠病起到很好的疗效。3、在骨髓间充质干细胞移植治疗具体应用并服务到临床的实际工作中，干细胞移植治疗的时机选择及移植干细胞数量，还有干细胞移植治疗次数一直是研究的热点，本次实验选择移植时机在放射性损伤后48小时，通过对12Gy剂量组的放射损伤行间充质干细胞移植治疗，收到较好的效果。通过蛋白芯片技术分析不同组的正常肠道组织、放射损伤后肠道组织、治疗后肠道组织经QAC-CYT-1和QAC-CYT-2检测不同免疫因子表达的差别，初步推测BMSCs移植可能上调MCP-1，通过基因通路分析提示Cytokine-cytokinereceptorinteraction通路，Africantrypanosomiasis通路，Malaria通路有可能在放射性肠损伤以及干细胞治疗中起到重要作用。这为下一步可能更多的样本量、更多变化因素的实验及可能进一步的基因芯片分析、更详细的探索参与放射损伤及干细胞治疗修复及的分子、基因的研究打下基础。-98- 博士学位论文参考文献[1]WnY,ChenI,ScottPG,etal.Mesenchymalstemcellsenhancewoundhealingthroughdifferentiationandangiogenesis.StemCells,2007,25(10):2648-2659.[2]BadiavasEV,AbediM,ButmarcJ,etal.Participationofbonemarrowderivedcellsincutaneouswoundhealing.CellPhysiol,2003,196(2):245-250.[3]NetaR,PerlsteinR,VogelSN,etal.Roleofinterleukin6(IL-6)inprotectionfromlethalirradiationandinendocrineresponsestoIL-1andtumornecrosisfactor.JExpMed,1992,175(3):689-694.[4]ZhuW,GongJ,LiY,etal.Aretrospectivestudyofsurgicaltreatmentofchronicradiationenteritis.JSurgOncol,2012,105(7):632-636.[5]李国民，李晓兵，邵云，等.急性放射病的病理诊断与分型诊断.中华放射医学与防护杂志，2007,27（1）：46-48.[6]LeadonSA.RepairofDNAdamageproducedbyionizingradiation:aminireview.SeminRadiatOncol,1996,6(4):295-305.[7]O’DriscollM,JeggoPA.Theroleofdouble-strandbreakrepair-insightsfromhumangenetics.NatRevGenet.2006,7:45-54.[8]PetriniJH,StrackerTH.ThecellularresponsetoDNAdouble-strandbreaks:definingthesensorsandmediators.TrendsCellBiol.2003,13:458-462.[9]TaylorRC,CullenSP,MartinSJ.Apoptosis:controlleddemolitionatthecellularlevel.NatRevMolCellBiol.2008,9:231-241.[10]BranzeiD,FoianiM.RegulationofDNArepairthroughoutthecellcycle.NatRevMolCellBiol.2008,9:297-308.[11]MikkelsenRB,WardmanP.Biologicalchemistryofreactiveoxygenandnitrogenandradiation-inducedsignaltransductionmechanisms.Oncogene.2003,22:5734-5754[12]OlssonAK,DimbergA,KreugerJ,etal.VEGFreceptorsignalling-incontrolofvascularfunction.NatRevMolCellBiol.2006,7:359-371-99- 博士学位论文[13]ResbeutM,MarteauP,CowenD,etal.Arandomizeddoubleblindplacebocontrolledmulticenterstudyofmesalazineforthepreventionofacuteradiationenteritis.RadiotherOncol.1997,44:59-63.[14]DoddMJ,MiaskowskiC,GreenspanD,etal.Radiation-inducedmucositis:arandomizedclinicaltrialofmicronizedsucralfateversussalt&sodamouthwashes.CancerInvest.2003,21:21-33.[15]T.Zimmerer,U.Bçcker,F.Wenzetal.MedicalPreventionandTreatmentofAcuteandChronicRadiationInducedEnteritis–IsthereanyProvenTherapy?AshortReview.ZGastroenterol.2008,46:441–448.[16]BeyE,PratM,DuhamelP,etal.Emergingtherapyforimprovingwoundrepairofsevereradiationburnsusinglocalbonemarrow-derivedstemcelladministrations.WoundRepairRegen,2010,18(1):50-58.[17]KudoK,LiuY,TakahashiK,etal.Transplantationofmesenchymalstemcellstopreventradiation-inducedintestinalinjuryinmice.JRadiatRes,2010,51(1):73-79.[18]ChangP,QuY,LiuY,etal.Multi-therapeuticeffectsofhumanadipose-derivedmesenchymalstemcellsonradiation-inducedintestinalinjury.CellDeathDis,2013,4:e685.[19]宋祥福，孙冰雪，张静春，等.骨髓间充质干细胞对放射性回肠损伤的病理观察.实验动物与比较医学，2012,32（3）：191-194.[20]MezeyE.Thetherapeuticpotentialofbonemarrowderivedstromalcells.JCellBiochem,2011,112(10):2683-2687.[21]BoomsmaRA,GeenenDL.Mesenchymalstemcellssecretemultiplecytokinesthatpromoteangiogenesisandhavecontrastingeffectsonchemotaxisandapoptosis.PloSOne,2012,7(4):e35685.[22]FoxJM,ChamberlainG,AshtonBA,etal.Recentadvancesintotheunderstandingofmesenchymalstemcelltrafficking.BrJHaematol,2007,137(6):491-502.[23]YooKH,JangIK,LeeMW,etal.Comparisonofimmunomodulatorypropertiesofmesenchymalstemcellsderivedfromadulthumantissues.CellImmunol,2009,259(2):150-156.-100- 博士学位论文[24]DuijvesteinM,BrinkGR,HommesDW.Stemcellsaspotentialnoveltherapeuticstrategyforinflammatoryboweldisease.JCrohnsColitis,2008,2(2):99-106.[25]Garcia-OlmoD,Garcia-ArranzM,HerrerosD,etal.AphaseIclinicaltrialofthetreatmentofCrohn’sfistulabyadiposemesenchymalstemcelltransplantation.DisColonRectum,2005,48(7):1416-1423.[26]BernardoME,ZaffaroniN,NovaraF,etal.Humanbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsdonotundergotransformationafterlong-terminvitrocultureanddonotexhibittelomeremaintenancemechanisms.CancerRes,2007,67(19):9142-9149.[27]CatersonEJ,NestiLJ,DanielsonKG,etal.Humanmarrowderivedmesenchymalprogenitorcells:isolation,cultureexpansion,andanalysisofdifferentiation.MolBiotechnol,2002,20(3):245-256.[28]AgayD,ScherthanH,ForcheronF,etal.Multipotentmesenchymalstemcellgraftingtotreatcutaneousradiationsyndrome:Developmentofanewminipigmodel.ExperimentalHematology,2010,38(10):945-956.[29]LiH,FuX,OuyangY,etal.Adultbone-marrow-derivedmesenchymalstemcellscontributetowoundhealingofskinappendages.[J].CellTissueRes,2006,326(3):725-736.[30]蒋玲，李真慧，娄琳，等.骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肾脏辐射损伤.中国组织工程研究与临床康复，2009,13（45）:8906-8910.[31]郭洪波，蒋玲，孟伟，等.间充质干细胞对睾丸辐射损伤的影响.实用医学杂志，2011,27（15）:2708-2711.[32]YanX,LiuY,HanQ,etal.InjuredmicroenvironmentdirectlyguidesthedifferentiationofengraftedFlk-1mesenchymalstemcellinlung.ExpHematol,2007,35(9)：1466-1475.[33]SėmontA,MouiseddineM,FrancoisS,etal.Mesenchymalstemcellsimprovesmallintestinalintegritythroughregulationofendogenousepithelialcellhomeostasis.CellDeathDiffer,2010,17(6)：952-961.[34]LombaertIM,BrunstingJF,WierengaPK,etal.Rescueofsalivaryglandfunctionafterstemcelltransplantationinirradiatedglands.PLoSOne,2008,3(4):c2063.-101- 博士学位论文[35]LinCY,ChangFH,ChenCY,etal.Celltherapyforsalivaryglandregeneration.JDentRes,2011,90(3):341-346.[36]SatoY,ArakiH,KatoJ,etal.Humanmesenchymalstemcellsxenografteddirectlytoratliveraredifferentiatedintohumanhepatocyteswithoutfusion.Blood,2005,106(2):756-763.[37]KalcS,KarihalooA,ClarkPR,etal.Bonemarrowstemcellscontributetorepairoftheischemicallyinjuredrenaltubule.JClinInvest,2003,112(1):42-49.[38]WrightKT,MasriWE,OsmanA,etal.Bonemarrowforthetreatmentofspinalcordinjury:mechanismsandclinicalapplications.StemCells,2011,29(2):169-178.[39]胡海燕，孟伟.骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑组织辐射损伤.广东医学，2010,31（10）:1248-1250.[40]FrancoisS,MouiseddineM,MathieuN,etal.Humanmesenchymalstemcellsfavourhealingofthecutaneousradiationsyndromeinaxenogenictransplantmodel.AnnHematol,2007,86(1):1-8.[41]毛任翔，祁少海，舒斌，等.骨髓间充质干细胞-透明质酸复合物对放射性溃疡创面愈合的影响.中华损伤与修复杂志（电子版），2009,4（5）：517-525.[42]PetersonRL,BozzaMM,DornerAJ.Interleukin-11inducesintestinalepithelialcellgrowtharrestthrougheffectsonretinoblastomaproteinphosphorylation.AmJPathol,1996,149:895-902.[43]PottenCS.Protectionofthesmallintestinalclonogenicstemcellsfromradiationinduceddamagebypretreatmentwithinterleukin-11alsoincreasesmurinesurvivaltime.StemCell,1996,14:452-459.[44]SalemML,GillandersWE,LiangTJ,etal.Review:novelnonviraldeliveryapproachesforinterleukin-12proteinandgenesystems:curbingtoxicityandenhancingadjuvantactivity.JInterferonCytokineRes,2006,26(9):593-608.[45]SchwarzA,StanderS,BerneburgM,etal.Interleukin-12suppressesultravioletradiation-inducedapoptosisbyinducingDNArepair.NatCellBiol,2002,4(1):26-31.[46]IndaramAV,VisvalingamV,LockeM.Mucosalcytokineproductioninradiation-inducedproctosigmoiditiscomparedwithinflammatoryboweldisease.AmJ-102- 博士学位论文Gastroenterol,2000,95:1221-1225.[47]CoultasL,ChawengsaksophakK,RossantJ.EndothelialcellsandVEGFinvascualrdevelopment.Nature,2005,438(7070):937-945.[48]SimsekG,GürocakS,KaradağN,etal.Protectiveeffectsofresveratrolonsalivaryglanddamageinducedbytotalbodyirradiationinrats.Laryngoscope,2012,122(12):2743-2748.[49]TakikawaM,SumiY,TanakaY,etal.ProtectiveeffectofprostaglandinE.onradiation-inducedproliferativeinhibitionandapoptosisinkeratinocytesandhealingofradiation-inducedskininjuryinrats.JRadiatRes,2012,53(3):385-394.[50]TanakaF,TominagaK,OchiM,etal.Exogenousadministrationofmesenchymalstemcellsamelioratesdextransulfatesodiuminducedcolitisviaanti-inflammatoryactionindamagedtissueinrats.LifeSci,2008,83(23-24):771-779.[51]GuoJ,LinGS,BaoCY,etal.Anti-inflammationroleformesenchymalstemcellstransplantationinmyocardialinfarction[J].Inflammation,2007,30(3-4):97-104.[52]HuaG,ThinTH,FeldmanR,etal.Cryptbasecolumnarstemcellsinsmallintestinesofmiceareradioresistant.Gastroenterology.2012,143(5):1266-1276.[53]FrancoisS,BensidhoumM,MouiseddineM,etal.Localirradiationnotonlyinduceshomingofhumanmesenchymalstemcellsatexposedsitesbutpromotestheirwidespreadengraftmenttomultipleorgans:astudyoftheirquantitativedistributionafterirradiationdamage.StemCells,2006,24(4):1020-1029.[54]MouiseddineM,FrancoisS,SémontA,etal.Humanmesenchymalstemcellshomespecificallytoradiation-injuredtissuesinanon-obesediabetes/severecombinedimmunodeficiencymousemodel.BrJRadiol,2007,80Spec:S49-S55.[55]KitaoriT,ItoH,SchwarzEM,etal.Stromalcell-derivedfactor1/CXCR4signalingiscriticalfortherecruitmentofmesenchymalstemcellstothefracturesiteduringskeletalrepairinamousemodel.ArthritisRheum,2009,60（3）：813-823.[56]LangeC,Brunswig-SpickenheierB,Cappallo-ObermannH,etal.Radiationrescue:mesenchymalstromalcellsprotectfromlethalirradiation.PloSOne,2011,6(1):e14486.-103- 博士学位论文[57]SubhrajitSaha,PayelBhanja,RafiKabarriti,etal.BoneMarrowStromalCellTransplantationMitigatesRadiation-InducedGastrointestinalSyndromeinMice.PLoSOne.2011,6:e24072.[58]BhanjaP,SahaS,KabarritiR,etal.ProtectiveroleofR-spondin1,anintestinalstemcellgrowthfactor,againstradiation-inducedgastrointestinalsyndromeinmice.PLoSOne.2009,4:e8014.[59]闵锐，潘真，李雨.急性放射病的分度和治疗.国外医学﹒放射医学核医学分册，200529（6）：272-278.[60]ChangJX,ChenS,MaLP,etal.Functionalandmorphologicalchangesofthegutbarrierduringtherestitutionprocessafterhemorrhagicshock.WorldJGastroenterol,200511(35):5485-5491.[61]SousaMV,PriolliDG,PortesAV,etal.Evaluationbycomputerizedmorphometryofhistopathologicalalterationsofthecolonwallinsegmentswithandwithoutintestinaltransitinrats.ActaCirBras,200823(5):417-424.[62]WangJ,BoemaM,FuQ,etal.Significanceofendothelialdysfunctioninthepathogenesisofearlyanddelayedradiationenteropathy.WorldJGastroenterol,2007,13(22):3047-3955.[63]CiorbaMA,StensonWF.Probiotictherapyinradiation-inducedintestinalinjuryandrepair.AnnNYAcadSci,2009,1165:190-194.[64]SpyropoulosBG,MisiakosEP,FotiadisC,etal.Antioxidantpropertiesofprobioticsandtheirprotectiveeffectsinthepathogenesisofradiation-inducedenteritisandcolitis.DigDisSci,2011,56(2):285-294.[65]Guzman-SteinG,BonsackM,LibertyJ,etal.Abdominalradiationcausesbacterialtranslocation.JSurgRes,1989,46(2):104-107.[66]MasonKA,WithersHR,McBrideWH,etal.Comparisonofthegastrointestinalsyndromeaftertotal-bodyortotal-abdominalirradiation.RadiatRes.1989,117:480-488.[67]ButsJP,MorinCL,RoyCC,etal.One-hourbloodxylosetest::areliableindexofsmallbowelfunction.JPedicarics.1978,90:729-733.[68]LefebvreHP,FerréJP,WatsonAD,etal.Smallbowelmotilityandcolonictransitare-104- 博士学位论文alteredindogswithmoderaterenalfailure.AmJ.PhysiolRegulIntegrCompPhysiol.2001,281:R230-238.[69]KanS,ChunM,JinYM,etal.Aratmodelforradiation-inducedproctitis.JKoreanMedSci.2000,15:682-689.[70]LeibowitzBJ,QiuW,LiuH,etal.Uncouplingp53functionsinradiation-inducedintestinaldamageviaPUMAandp21.MolCancerRes,2011,9(5):616-626.[71]WangY,MengA,LangH,etal.ActivationofnuclearfactorkappaBinvivoselectivelyprotectsthemurinesmallintestineagainstionizingradiation-induceddamage.CancerRes,2004,64(17):6240-6246[72]PerkinsND,GilmoreTD.Goodcop,badcop:thedifferentfacesofNF-kappaB.CellDeathDiffer,2006,13(5):759-772.[73]WangJ,BoemaM,KulkamiA,etal.Activationofproteaseactivatedreceptor2byexogenousagonistexacerbatesearlyradiationinjuryinratintestine.IntJRadiatOncolBiolPhys,2010,77(4):1206-1212.[74]BrownM.Whatcausestheradiationgastrointestinalsyndrome?:overview.IntJRadiatOncolBiolPhys,2008,70(3):799-800[75]GargS,BoermaM,WangJ,etal.Influenceofsublethaltotal-bodyirradiationonimmunecellpopulationsintheintestinalmucosa.RadiatRes,2010,173(4):469-478.[76]LinardC,BilliardF,BenderitterM.IntestinalirradiationandfibrosisinaTh1-deficientenvironment.IntJRadiatOncolBiolPhys,2012,84(1):266-273.[77]PanésJ,SalasA.Mechanismsunderlyingthebeneficialeffectsofstemcelltherapiesforinflammatoryboweldiseases.Gut,2009,58(7):898-900.[78]GaoZ,HeS,HanY,etal.ChineseprescriptionShenlingbaizhuExtractpreventsradiation-inducedsmallintestinalinjuryinmice.MilMedSci,2011,10(35):769-779.[79]KlimbergVS,SalloumRM,KasperM,etal.Oralglutamineaccelerateshealingofthesmallintestineandimprovesoutcomeafterwholeabdominalradiation.ArchSurg,1990,125(8):1040-1045.[80]AnisaS,DeborahCR.Intestinalstemcellsandepithelial-mesenchymalinteractionsinthecryptandstemcellniche.TranslRes,2010,156(3):180-187.-105- 博士学位论文[81]JiangH,QuL,LiY,etal.Bonemarrowmesenchymalstemcellsreduceintestinalischemia/reperfusioninjuriesinrats.JSurgRes,2011,168(1):127-134.[82]ChenH,MinXH,WangQY,etal.Pre-activationofmesenchymalstemcellswithTNF-alpha,IL-1betaandnitricoxideenhancesitsparacrineeffectsonradiation-inducedintestinalinjury.SciRep,2015,5(5):1-14.[83]SemontA,FrancoisS,MouiseddineM,etal.Mesenchymalstemcellsincreaseself-renewalofsmallintestinalepitheliumandacceleratestructuralrecoveryafterradiationinjury.AdvExpMedBiol,2006,585:19-30.[84]王彦，刘强，杜利清，等.肠辐射损伤模型鼠的间充质干细胞移植研究.陕西医学杂志，201140（8）:939-947.[85]宋祥福，孙冰雪，张静春，等.同种异体大鼠骨髓间充质干细胞移植对放射性空肠损伤的修复作用.中国比较医学杂志，201121(8):63-65[86]VoswinkelJ,ChapelA.Mesenchymalstemcellsandrheumatism.Stateoftheart.ZRheumatol,2012,71(7):619-623.[87]AlisonMR,LovellMJ,DirekzeNC,etal.Stemcellplasticityandtumorformation.EurJCancer,2006,42(9)：1247-1258.[88]GoldnerG,TomicekB,BeckerG,etal.Proctitisafterexternal-beamradiotherapyforprostatecancerclassifiedbyViennarectoscopyscoreandcorrelatedwithEORTC/RTOGscoreforlaterectaltoxicity:resultsofaprospectivemulticenterstudyof166patients.IntJRadiatOncolBiolPhys,200767(1):78-83.[89]姚辉，郭晓钟，王迪，等.骨髓间充质干细胞移植治疗犬急性放射性肠病临床观察.临床军医杂志，2016，44（12）:1239-1242[90]余长林，乔建辉，罗卫东，等.一例肠型急性放射病的临床报告.中华放射医学与防护杂志，2007,27（1）:11-16.[91]ChibaS,SaitoA,OgawaS,etal.Transplantationforaccidentalacutehigh-dosetotalbodyneutronandgamma-radiationexposure.BoneMarrowTransplant,2002,29(11):935-939.[92]MardonesR,JofrėCM,TobarL,etal.Mesenchymalstemcelltherapyinthetreatmentofhiposteoarthritis.JHipPreservSurg,2017,4(2):159-163.-106- 博士学位论文[93]SammaliE,AliaC,VeglianteG,etal.Intravenousinfusionofhumanbonemarrowmesenchymalstromalcellspromotesfunctionalrecoveryandneuroplasticityafterischemicstrokeinmice.SciRep,2017,7(1):6962.[94]MuroiK,MiyamuraK,OkadaM,etal.Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells(JR-031)forsteroid-refractorygradeⅢorⅣacutegraft-versus-hostdisease:aphaseⅡ/Ⅲstudy.IntJHematol,2016,103(2):243-250.[95]JakobsenKK,GrønhøjC,JensenDH,etal.Mesenchymalstemcelltherapyforlaryngotrachealstenosis:Asystematicreviewofpreclinicalstudies.PLoSOne,2017,12(9):e0185283.[96]BartolucciJ,VerdugoFJ,GonzálezPL,etal.SafetyandEfficacyofintravenousInfusionofUmbilicalCordMesenchymalStemCellsinPatientsWithHeartFailure:APhase1/2RandomizedControlledTrial(RIMECARDTrial[RandomizedClinicalTrialofIntravenousInfusionUmbilicalCordMesenchymalStemCellsonCardiopathy]).CircRes,2017,121(10):1192-1204.[97]LiuZ,HuGD,LuoXB,etal.Potentialofbonemarrowmesenchymalstemcellsinrejuvenationoftheagedskinofrats.BomedRep,2017,6(3):279-284.[98]YanKS,ChiaLA,LiX,etal.TheintestinalstemcellmarkersBmi1andLgr5identifytwofunctionallydistinctpopulations.ProcNatlAcadSciUSA,2012,109(2):466-471.[99]AkiyamaK,ChenC,WangD,etal.Mesenchymalstemcell-inducedimmunoregulationinvolvesFasligand/Fas-mediatedTcellapotosis.Cellstemcell,2012,10(5):544-555.[100]HamzaAH,AI-BishriWM,DamiatiLA,etal.Mesenchymalstemcells:afutureexperimentalexplorationforrecessionofdiabeticnephropathy.RenFail,2017,39(1):67-76.[101]LeeSH,JinKS,BangOY,etal.DifferentialMigrationofMesenchymalStemCellstoIschemicRegionsafterMiddleCerebralArteryOcclusioninRats.PLoSOne,2015,10(8):e0134920[102]LiX,DuW,MaFX,etal.HighConcentrationsofTNF-αInduceCellDeathduring-107- 博士学位论文InteractionsbetweenHumanUmbilicalCordMesenchymalStemCellsandPeripheralBloodMononuclearCells.PLoSOne,2015,10(5):e0128647.[103]RenG,ZhangL,ZhaoX,etal.Mesenchymalstemcell-mediatedimmunosuppressionoccursviaconcertedactionofchemokinesandnitricoxide.CellStemCell,2008,2(2):141-150[104]ParisF,FuksZ,KangA,etal.Endothelialapoptosisastheprimarylesioninitiatingintestinalradiationdamageinmice.Science.2001,293:293-297.[105]XuW,ChenJ,LiuX,etal.Autologousbonemarrowstromalcelltransplantationasatreatmentforacuteradiationenteritisinducedbyamoderatedoseofradiationindogs.TranslRes,2016,171:38-51.-108- 博士学位论文个人简历和研究成果姓名：姚辉性别：女籍贯：黑龙江省哈尔滨市出生年月：1982年08月29日入学日期：2014年8月毕业院校：第四军医大学1999年7月-2004年7月：第四军医大学2004年8月-2006年7月：解放军202医院2006年8月-2009年7月：第四军医大学硕士研究生2009年8月-2014年7月：沈阳军区总医院消化内科2014年8月-至今：第四军医大学博士研究生在校期间发表文章1.姚辉，郭晓钟，王迪，等.骨髓间充质干细胞移植治疗犬急性放射性肠病临床观察.临床军医杂志，2016，44（12）:1239-12422.姚辉，郭晓钟，祁兴顺，等.胰腺炎并发胰周血管异常的临床分析.中华胰腺病杂志，2017，17（3）:158-1613.BingHan,HuiYao,LichunShao,etal.SelectionoftreatmentmodalitiesforhepatocellularcarcinomaatstagesT1andT2:ApreliminaryanalysisbasedontheSurveillance,Epidemiology,andEndResultsregistrydatabase.JournalofBUON,2018,23(3).ACCEPTANCE4.HuiYao,JianjunLi,JiangChen,etal.Theprotectiveeffectsandcytokineschangesoftransplantingautologousbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsindogswithacuteradioactiveenteritis.CELLTRANSPLANT.Underreview5.任丽楠，郭晓钟，李宏宇，姚辉,等.鼠药中毒引起消化道出血25例临床诊治分析.现代生物医学进展，2014，23：4513-4515-109- 博士学位论文致谢博士研究生生活即将结束，辛苦与收获及希望并存。感谢专家、师长们的教导和鼓励，感谢亲人们的理解和支持，感谢同学们和同事们的倾情帮助和真心关怀，点滴成绩的取得及成长进步与大家的支持鼓励密不可分。在此于本人博士毕业之际，向对我的学业和工作给予过指导、帮助及鼓励的领导们、师长们、同事们、同学们及家人们致以最真挚的感谢！首先，向我的导师郭晓钟教授表示最衷心的感谢，感谢您的悉心培养及亲切指导，您渊博的学识、求真务实的科研态度、不断探索的治学精神、迎难而上的科研勇气、高尚的医德、精湛的医术，待病人如亲人的善良，都为我做出了榜样和示范。您的自信乐观、积极向上、追求卓越的品质深刻影响到我的学习、工作及科研的各个方面，并将受益终身。在此再次向我的导师表示最诚挚的敬意和感谢。感谢陈江副教授在贯穿整个实验过程的各个方面给予具体的细心指导和帮助支持；感谢王迪老师在动物实验介入治疗方面所做的大量的工作；感谢祁兴顺博士后数据统计方面的支持帮助；感谢李宏宇副主任医师、邵晓冬副主任医师、吴春燕老师在研究生阶段的工作学习中给予的辅导和帮助；感谢刘旭、张永国、田野、刘微微及梁振东等科室内镜组人员在内镜方面的大量工作；感谢我院动物实验科的王洋主任、安阳、郭天革、雷于晏等技师在动物实验方面不辞劳苦的专业工作；感谢放射治疗科闫英主任、张海波主治医师、程志华主治医师、孙强技师等在实验动物照射方面给予的热情帮助。另外，要特别感谢我的家人、同学、同事、朋友，你们永远是我的坚强后盾，你们的关心及爱护给予我极大的动力和支持，伴我走过这段辛苦又美好的时光。最后，对于给予我支持和帮助的人们再一次表示衷心的感谢！姚辉2017年12月-110-
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