胃腺癌中差异表达lncrna筛选及相关功能分析研究

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授予单位代码10089学号或申请号20130054中国图书分类号R735.2HebeiMedicalUniversity博士学位论文专业学位胃腺癌中差异表达lncRNA筛选及相关功能分析研究研究生：谷建斌导师：李勇教授檀碧波副教授专业：外科学二级学院：第四医院2018年4月 目录中文摘要……………………………………………………………………1英文摘要………………………………………………………………………6英文缩写…………………………………………………………………14研究论文胃腺癌中差异表达lncRNA筛选及相关功能分析研究引言…………………………………………………………………….15第一部分胃腺癌组织与癌旁组织中差异lncRNA筛选及验证前言……………………………………………………………………17材料与方法……………………………………………………………18结果…………………………………………………………………26附图…………………………………………………………………30附表…………………………………………………………………38讨论…………………………………………………………………49小结…………………………………………………………………51参考文献…………………………………………………………51第二部分LncRNASNHG3在胃腺癌组织中的表达及临床意义前言……………………………………………………………………57材料与方法……………………………………………………………58结果…………………………………………………………………61附图…………………………………………………………………63附表…………………………………………………………………66讨论…………………………………………………………………68小结…………………………………………………………………69参考文献…………………………………………………………69第三部分LncRNASNHG3对胃癌细胞株生物学功能的影响及初步机制研究前言……………………………………………………………………71材料与方法………………………………………………………72结果……………………………………………………………………86附图……………………………………………………………………90附表…………………………………………………………………100 讨论…………………………………………………………………101小结…………………………………………………………………103参考文献…………………………………………………………..103结论………………………………………………………………………...106综述长链非编码RNA在胃癌中的研究进展…………………………107致谢………………………………………………………………………..129个人简历……………………………………………………………………130 胃腺癌中差异表达lncRNA筛选及相关功能分析研究摘要胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一，预后相对较差，严重威胁人类健康。我国是胃癌高发国家，每年胃癌新发病例占世界新发病例40%以上，死亡率居于第二位，是严重危害中国居民健康的主要疾病。由于我国进展期胃癌患者比例较高，即使接受了手术为主的综合治疗，5年生存率仍低于30%。为了扩展胃癌的治疗手段和提高胃癌患者的生存期，探索胃癌发病的分子机制、寻找诊断及预后的生物标志物以及治疗靶点的研究是目前亟待解决的课题。长链非编码RNA(longnon-codingRNA,1ncRNA)指长度超过200个核苷酸的非编码RNA，不具有开放阅读框，无蛋白翻译功能。长期以来，lncRNA被认为是基因组转录的“噪音”，无生物学功能。目前越来越多的研究结果显示lncRNA在调节基因表达的过程中起到了重要的作用，在多种肿瘤如胃癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌的发生、发展、转移以及复发过程中的重要作用也得到了证实。尽管己经取得一些进展，有关lncRNA在胃癌中所起的作用的研究还处于起步阶段，胃癌相关的lncRNA表达谱并未明了，lncRNA在胃癌病理机制中的具体作用了解较少。为此，我们应用高通量测序技术对胃腺癌和癌旁组织样本中的lncRNA进行筛选，以期发现在胃腺癌中差异表达的lncRNA；根据高通量测序结果及生物信息学分析所得数据，挑选在胃腺癌组织中相对高表达，并且可能具有生物学功能的lncRNA，分析其与胃腺癌临床病理资料的关系；利用小干扰RNA(siRNA)下调其表达，观察其对胃癌细胞的增殖、凋亡、转移等生物学行为的影响，并初步研究其可能机制。本次研究将有助于揭示胃腺癌的进展机制，同时也为胃腺癌的诊断、预后的生物标志物及靶向治疗药物的寻找与开发提供实验基础。第一部分胃腺癌组织与癌旁组织中差异lncRNA筛选及验证目的：为探讨胃腺癌中lncRNA的表达情况，本研究应用高通量测序1 检测lncRNA在胃腺癌组织中的表达谱，并明确lncRNA及mRNA在胃腺癌组织与癌旁组织中的表达是否存在差异。方法：提取3例胃腺癌患者的肿瘤组织与癌旁组织中的RNA，应用高通量测序技术构建胃腺癌中差异表达lncRNA及mRNA表达谱。建立差异表达的lncRNA及mRNA共表达网络，通过GO分析及KEGG富集分析预测差异表达lncRNA的生物功能。10例患者进行了测序表达谱的结果验证，选取4条lncRNA应用qRT-PCR验证高通量测序结果。结果：通过高通量测序技术，在胃腺癌组织和癌旁组织中找到74条差异表达的lncRNA，其中上调lncRNA有43条，下调的有31条（FDR<0.05）；449条差异表达的mRNA，其中上调的mRNA共有238条，下调的mRNA共有211条。与差异表达lncRNA共表达的差异表达的mRNA显著富集在胃酸分泌，补体途径、胰腺分泌、细胞因子及其受体相互作用以及JAK-STAT信号通路。选取的4条lncRNA，与癌旁组织相比，lncRNASNHG3在胃腺癌呈相对高表达(Z=2.7324，P=0.0065)；而ENSG00000259291、ENSG00000279146、Linc00261在癌组织中呈相对低表达(ENSG00000259291：Z=-2.0032，P=0.0452；ENSG00000279146：Z=-2.1544，P=0.0312；Linc00261：Z=-3.1371，P=0.0017)，qRT-PCR验证结果与高通量测序结果一致。小结：1.LncRNA高通量测序结果显示与癌旁组织相比，在胃腺癌组织中存在74条表达异常的lncRNA，其中上调的有43条，下调的有31条。2.高通量测序结果还显示在胃腺癌组织和癌旁组织中有449条差异表达的mRNA，其中上调的mRNA共有238条，下调的mRNA共有211条。3.选取差异表达的lncRNA通过qRT-PCR检测对测序结果进行验证，检测结果与高通量测序结果相一致，高通量测序结果可靠。第二部分LncRNASNHG3在胃腺癌组织中的表达及临床意义目的：探讨长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因3（smallnucleolarRNAhostgene3,SNHG3）在胃腺癌组织和对应的癌旁组织的差异表达，分析lncRNASNHG3的表达水平与临床病理学特征之间的关系。2 方法：收集2016年2月～2016年7月在河北医科大学第四医院住院手术切除的42例胃腺癌患者的胃腺癌组织标本及对应的癌旁组织，采用qRT-PCR检测lncRNASNHG3的表达水平，分析lncRNASNHG3的表达水平与临床病理学特征之间的关系。应用SAS9.1对数据进行分析，计量资料采用平均数士标准差或中位数M（P25～P75）表示，计量资料满足正态分布且方差齐同的比较，采用两组独立样本的t检验；方差不齐的非正态分布的计量资料采用秩和检验。计数资料采用卡方检验，当理论数＜5时，进行连续校正。结果：胃腺癌组织中lncRNASNHG3△CT值为4.87±1.38，癌旁组织中lncRNASNHG3△CT值为5.66±1.22,具有显著性差异(t=4.01,P=0.0002)。胃腺癌组织、癌旁组织的lncRNASNHG3相对表达量-△CT（2）分别是0.0358（0.0208～0.0860）、0.0215（0.0140～0.0330），具有显著性差异(Z=2.85,P=0.0043)。42对样本中，有30对（71.4%，30/42）的胃腺癌组织的lncRNASNHG3表达量高于癌旁组织，其中20对（47.6%，20/42）的胃腺癌组织中lncRNASNHG3表达量是癌旁组织的2倍及2倍以上。lncRNASNHG3的表达水平与胃腺癌患者临床病理资料应用χ2检验统计分析发现，60.6%的胃腺癌T3、T4期患者lncRNASNHG3的表达≥2倍，而在T1、T2期胃腺癌患者lncRNASNHG3的表达均<2倍，具有显著性差异(χ2=8.1252，P=0.0044)。淋巴结转移组中有57.6%的患者lncRNASNHG3的表达≥2倍，在无淋巴结转移组有11.1%患者lncRNASNHG3的表达≥2倍，具有显著性差异(χ2=4.399，P=0.039)。TNM分期III+IV期患者63.33%的lncRNASNHG3的表达≥2倍，显著高于I+II期患者的8.33％(χ2=10.395，P=0.0013)。LncRNASNHG3的表达水平与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、分化程度、血管侵犯、神经侵犯无关。小结：1.与癌旁组织相比，LncRNASNHG3在胃腺癌组织中的表达水平显著上调。2.胃腺癌组织中lncRNASNHG3的表达水平与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关，提示lncRNASNHG3在胃腺癌的发生、发展、侵袭、转移的过程中发挥了重要作用。3.LncRNASNHG3的表达水平与胃腺癌患者的年龄、性别、肿瘤大3 小、肿瘤位置、分化程度、血管侵犯、神经侵犯无关。第三部分LncRNASNHG3对胃癌细胞株生物学功能的影响及初步机制研究目的：探讨lncRNASNHG3在人胃癌细胞系与正常胃黏膜上皮细胞系中的差异表达，以及抑制lncRNASNHG3的表达对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响及可能机制。方法：利用siRNA技术敲低lncRNASNHG3的表达，通过CCK8、克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验、流式细胞技术测定从细胞水平初步探讨lncRNASNHG3对胃癌细胞功能的影响。Westernblot观察抑制lncRNASNHG3表达对胃癌细胞增殖和转移相关STAT3、MMP-2和P-STAT3蛋白的表达情况。结果：与胃正常粘膜上皮细胞GES1相比，人胃癌细胞株MGC-803、人胃癌细胞株BGC-823的lncRNASNHG3的相对表达量显著增高（MGC-803：P＜0.01;BGC-823：P＜0.05）。siRNA转染胃癌细胞株MGC-803、BGC-823对lncRNASNHG3表达的抑制作用明显。敲低lncRNASNHG3的表达可降低胃癌细胞株MGC-803、BGC-823的增殖能力（MGC-803，P<0.01；BGC-823，P<0.01），敲低lncRNASNHG3的表达后胃癌细胞株MGC-803和BGC-823的克隆形成能力减弱(MGC-803:P＜0.01,BGC-823:P＜0.01)，抑制胃癌细胞MGC-803和BGC-823进入G2/M期(MGC-803:P＜0.01,BGC-823:P＜0.01)，从而抑制其分裂增殖；诱导胃癌细胞MGC-803、BGC-823的凋亡(MGC-803:P＜0.001,BGC-823:P＜0.001)。敲低lncRNASNHG3的表达抑制了胃癌细胞MGC-803、BGC-823迁移(MGC-803:P<0.01;BGC-823:P<0.01)和侵袭能力(MGC-803:P<0.01;BGC-823:P<0.01)；敲低lncRNASNHG3后MGC-803和BGC-823细胞STAT3、MMP2蛋白的表达水平显著下降(MGC-803:P<0.05;BGC-823:P<0.05)，P-STAT3/STAT3的比值显著降低(MGC-803:P<0.05;BGC-823:P<0.05)。小结：1.通过敲低胃癌细胞中lncRNASNHG3的表达，发现胃癌细胞的增殖能力、克隆形成能力均受到显著抑制，抑制胃癌细胞进入G2/M期，胃癌4 细胞凋亡比例显著增加，迁移及侵袭能力均得到了显著削弱，说明lncRNASNHG3参与了胃癌细胞增殖与抗凋亡的同时，在侵袭和转移的过程中可能也扮演了重要的角色。2.敲低胃癌细胞中lncRNASNHG3的表达，可能是通过下调STAT3、MMP2的表达和STAT3的磷酸化水平，抑制了MGC-803和BGC-823细胞的增殖、侵袭过程，抑制长链非编码RNASNHG3基因有望应用于胃癌的靶向治疗。结论：1.高通量测序结果显示，与癌旁组织相比，在胃腺癌组织中存在差异表达的lncRNA和mRNA，其中74条表达异常的lncRNA，上调的有43条，下调的有31条；449条差异表达的mRNA，上调的有238条，下调的有211条。选取的差异表达的lncRNA通过qRT-PCR检测对测序结果进行验证，检测结果与高通量测序结果相一致，高通量测序结果是可靠的。2.LncRNASNHG3在胃腺癌组织中的表达水平显著上调，并与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关，而与胃腺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、分化程度、血管侵犯、神经侵犯无关。提示lncRNASNHG3在胃腺癌的发生、发展、侵袭、转移的过程中发挥了重要作用。3.敲低胃癌细胞中lncRNASNHG3的表达，胃癌细胞的增殖能力、克隆形成能力均受到显著抑制，抑制胃癌细胞进入G2/M期，胃癌细胞凋亡比例显著增加，迁移及侵袭能力均得到了显著削弱，说明lncRNASNHG3参与了胃癌细胞增殖与抗凋亡的同时，在侵袭和转移的过程中可能也扮演了重要的角色。这可能是通过下调STAT3、MMP2的表达和STAT3的磷酸化水平，抑制了胃癌细胞的增殖、侵袭过程，抑制lncRNASNHG3基因有望应用于胃癌的靶向治疗。关键词：胃癌，长链非编码RNA，小核仁RNA宿主基因3，增殖，侵袭5 ScreeningandfunctionalanalysisofdifferentialexpressionoflncRNAingastricadenocarcinomaABSTRACTGastriccancerisoneofthemostcommonmalignanttumorsintheworld.Theprognosisisrelativelypooranditisaseriousthreattohumanhealth.Chinaisacountrywithhighincidenceofgastriccancer.Everyyear,newcasesofgastriccanceraccountformorethan40%oftheworld'snewcases.Themortalityrateissecond.ItisamajordiseasethatseriouslyendangersthehealthofChineseresidents.BecauseofthehigherproportionofpatientswithadvancedgastriccancerinChina,the5yearsurvivalrateisstilllessthan30%,evenifthesurgeryisthemaincomprehensivetreatment.Inordertoexpandthetreatmentofgastriccancer,improvethesurvivaltimeofgastriccancerpatients,wewillexplorethemolecularmechanismofgastriccancerandfindthebiomarkersandtargetsfordiagnosisandprognosis.Longnon-codingRNA(lncRNA)isanon-codingRNAwithalengthofmorethan200nucleotides,anddoesnothaveanopenreadingframeandnoproteintranslationfunction.Foralongtime,lncRNAhasbeenconsidereda"noise"ofgenometranscriptionandhasnobiologicalfunction.Atpresent,moreandmorestudiesshowthatlncRNAplaysanimportantroleinregulatinggeneexpression.Italsohasbeenprovedtoplayanimportantroleintheoccurrence,development,metastasisandrecurrenceprocessofmanykindsoftumors,suchasgastriccancer,breastcancer,coloncancerandlivercancer.Althoughsomeprogresshasbeenmade,theresearchontheroleoflncRNAingastriccancerisstillinitsinfancy.ThelncRNAexpressionprofileofgastriccancerisnotclear.ThespecificroleoflncRNAinthepathogenesisofgastriccancerispoorlyunderstood.Forthispurpose,High-throughputsequencingtechnologyscreenedthedifferenceexpressionoflncRNAingastricadenocarcinomaandadjacenttissuesamples;accordingtothedatafromtheanalysisresultofthe6 high-throughputsequencingandbioinformatics,wechooserelativelyhighexpressioningastricadenocarcinomatissues,andmayhavethebiologicalfunctionoflncRNA.Therelationshipbetweenitandclinicopathologicaldataofgastricadenocarcinomawasanalyzed.WeusedsmallinterferingRNA(siRNA)anddown-regulationofitsexpressiontoobserveitseffectsongastriccancercellproliferation,apoptosis,metastasis,andpreliminarystudyonitsmechanism.Thisstudywillhelptorevealthemechanismoftheprogressionofgastricadenocarcinoma，provideanexperimentalbasisfortheexplorationanddevelopmentofbiomarkersforthediagnosisandprognosisofgastricadenocarcinomaandtheexplorationanddevelopmentoftargeteddrugs.PART1ScreeningandverificationofdifferentiallyexpressedlncRNAingastricadenocarcinomatissueandadjacentnontumortissueObjective:ToinvestigatetheexpressionoflncRNAingastricadenocarcinoma,high-throughputsequencingwasusedtodetectlncRNAexpressioningastricadenocarcinoma.ExploringwhethertherearedifferencesoflncRNAandmRNAingastricadenocarcinomaandadjacentnontumortissues.Methods:ThelncRNAandmRNAexpressionprofileof3gastricadenocarcinomatissuesand3adjacentnon-tumortissueswasobtainedthroughhighthroughputRNA-sequencing.DifferentiallyexpressedlncRNAs/mRNAs(DElncRNAs/DEmRNAs)wereidentifiedingastricadenocarcinoma.DElncRNA/DEmRNAco-expressionnetworkconstruction,GeneOntology(GO)andKyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG)enrichmentanalyseswereconductedtopredictthebiologicalfunctionsofDElncRNAs.Theresultsofhighthroughputsequencingresultsin10patientsandfourselectedlncRNAswereverifiedbyquantitativereal-timepolymerasechainreaction(qRT-PCR).Results:Totalof74DElncRNAsand449DEmRNAswereidentifiedingastricadenocarcinomacomparedwithadjacentnon-tumortissues.Among7 them,therewere43upregulatedlongnoncodingRNA,31downregulated(FDR<0.05),238upregulatedmRNA,and211downregulatedmRNA.TheqRT-PCRvalidationresultsofDElncRNAswereconsistentwithourbioinformaticsanalysisbasedonRNA-sequencing.TheDEmRNAsco-expressedwithDElncRNAsweresignificantlyenrichedingastricacidsecretion,complementandcoagulationcascades,pancreaticsecretion,cytokine-cytokinereceptorinteractionandJak-STATsignalingpathway.The4selectedlncRNA,comparedwiththeadjacentnontumortissues,lncRNASNHG3showedrelativelyhighexpressioningastriccancer(Z=2.7324,P=0.0065);ENSG00000259291,ENSG00000279146,Linc00261incancertissuesshowedrelativelylowexpression(ENSG00000259291:Z=-2.0032,P=0.0452;ENSG00000279146:P=0.0312;Z=-2.1544,Linc00261:Z=-3.1371,P=0.0017).QRT-PCRtestandhigh-throughputsequencingresultsconsistent.Summary:1.HumanlncRNAhigh-throughputsequencingresultsshowedthattherewere74aberrantlyexpressedlncRNAingastricadenocarcinomatissuescomparedwiththoseadjacentnontumortissues,ofwhich43wereupregulatedand31downregulated.2.Theresultsofhighthroughputsequencingalsoshowedthattherewere449differentiallyexpressedmRNAingastricadenocarcinomatissuesandadjacentnontumortissues,ofwhich238oftheupregulatedmRNAand211ofthedownregulatedmRNA.3.SelectingthelncRNAwithdifferentialexpression,andverifingthesequencingresultsbyqRT-PCR.Theresultswereconsistentwiththeresultsofhigh-throughputsequencing.Theresultsofhighthroughputsequencingwerereliable.PART2ExpressionoflncRNASNHG3ingastricadenocarcinomaanditsclinicalsignificanceObjective:ToinvestigatethedifferentialexpressionoflncRNAsmallnucleolarRNAhostgene3(SNHG3)ingastricadenocarcinomatissuesand8 correspondingadjacentnontumortissues,andtoanalyzetherelationshipbetweentheexpressionleveloflncRNASNHG3andgastricadenocarcinomaclinicopathologicalfeatures.Methods:FromFebruary2016toJuly2016,total42patientswithgastricadenocarcinomaunderwentsurgeryinDepartmentofGeneralSurgery,theFourthAffiliatedHospitalofHebeiMedicalUniversitywereincorporatedintoourstudy.Gastricadenocarcinomatissuesandadjacentnon-tumortissueswereobtainedfromthose42patients;therelativeexpressionlevelofSNHG3in42STADtissueswasdetectedthroughqRT-PCR.RelationshipsbetweenlncRNASNHG3expressionandclinicopthologicfeaturesofpatientswithgastricadenocarcinomawereanalyzed.AlldatawereanalyzedbySAS9.1statisticalsoftware.MeasurementdatawiththeaverageSDormedianM(P25~P75),Whenthemeasurementdatasatisfiednormaldistributionandthevariancewasthesame,twoindependentsamplesofttestareused.Countingdatawerecheckedbychisquaretest.Whenthenumberoftheoryislessthan5,continuouscorrectioniscarriedout.Results:The△CTvalueoflncRNASNHG3ingastricadenocarcinomatissuesandadjacentnon-tumortissueswasrespectively4.87±1.38and5.66±1.22,withasignificantdifference(t=4.01,P=0.0002).Therelative-△CTexpressionoflncRNASNHG3(2)ingastricadenocarcinomatissuesandadjacentnon-tumortissueswasrespectively0.0358(0.0208~0.0860)and0.0215(0.0140~0.0330),withsignificantdifference(Z=2.85,P=0.0043).Of42pairsofsamples,therewere30pairs(71.4%,30/42)oflncRNASNHG3expressioningastricadenocarcinomatissues,whichwerehigherthanthoseinadjacenttissues.Amongthem,20(47.6%,20/42)ofgastricadenocarcinomatissueshad2timesandmorethan2timestheexpressionleveloflncRNASNHG3.TheexpressionoflncRNASNHG3ingastricadenocarcinomapatientsandclinicalpathologicaldatawereanalyzedbychisquaretest,whichfoundthat60.6%ofgastricadenocarcinomapatientswithstageT3orT4wereequalorgreaterthan2timesexpressionoflncRNASNHG3,andzeropatientwithstageT1andT2wasequalorgreaterthan2times,withasignificant9 difference(χ2=8.1252，P=0.0044).57.6%patientsinlymphnodemetastasisgroupand11.1%patientsinthegroupwithoutlymphnodemetastasiswereequalorgreaterthan2timesexpressionoflncRNASNHG3,withasignificantdifference(χ2=4.399,P=0.039).TheexpressionleveloflncRNASNHG3wasnotrelatedtoage,gender,tumorsize,tumorlocation,degreeofdifferentiation,vascularinvasionandnerveinvasion.Summary:1.TheexpressionlevelofLncRNASNHG3ingastricadenocarcinomawassignificantlyhigherthanthatintheadjacentnontumortissues.2.TheexpressionleveloflncRNASNHG3ingastricadenocarcinomatissuesissignificantlycorrelatedwiththedepthofinvasion,lymphnodemetastasisandTNMstage,suggestingthatlncRNASNHG3playsanimportantroleintheoccurrence,development,invasionandmetastasisofgastricadenocarcinoma.3.TheexpressionleveloflncRNASNHG3wasnotrelatedtoage,gender,tumorsize,tumorlocation,degreeofdifferentiation,vascularinvasionandnerveinvasion.PART3TheeffectofLncRNASNHG3onthebiologicalfunctionofgastriccancercelllineanditspreliminarymechanismObjective:ToinvestigatelncRNASNHG3expressioninhumangastriccancercelllinesandnormalgastricepithelialcelllines,andtheeffectoftheinhibitedexpressionoflncRNASNHG3ontheproliferation,migrationandinvasionofgastriccancercellsanditspossiblemechanism.Methods:TheexpressionoflncRNASNHG3wasdownregulatedbysiRNAknockdown.TheeffectsoflncRNASNHG3onthefunctionofgastriccancercellswerepreliminarilystudiedbyCCK8,colonyformationassay,Transwellmigrationandinvasionassay,andflowcytometry.WesternblotwasusedtoobservetheexpressionofSTAT3,MMP-2,andP-STAT3proteinrelatedtotheproliferationandmetastasisofgastriccancercellsbyinhibitingtheexpressionoflncRNASNHG3.10 Results:TheexpressionoflncRNASNHG3inhumangastriccancercelllineMGC-803(P<0.01)andBGC-823(P<0.05)increasedsignificantlycomparedwithGES1innormalgastricmucosalepithelialcells.SiRNAtransfectedgastriccancercelllineMGC-803andBGC-823hadobviousinhibitioneffectonlncRNASNHG3expression.TheexpressionoflncRNASNHG3onreductioncanreducetheMGC-803andBGC-823gastriccancercelllineproliferation（MGC-803，P<0.01；BGC-823，P<0.01）.Knocking-downtheexpressionoflncRNASNHG3candecreasethecloningofMGC-803andBGC-823gastriccancercelllineformationcapacity(MGC-803:P＜0.01,BGC-823:P＜0.01),andinhibitMGC-803andBGC-823intoG2/Mphase(MGC-803:P＜0.01,BGC-823:P＜0.01),inhibittheproliferation;TheapoptosisofMGC-803andBGC-823ingastriccancercellswasinduced(MGC-803:P＜0.001,BGC-823:P＜0.001).KnockingdowntheexpressionoflncRNASNHG3caninhibitthemigration(MGC-803:P<0.01;BGC-823:P<0.01)andinvasion(MGC-803:P<0.01;BGC-823:P<0.01)ofMGC-803andBGC-823;AfterknockingdownlncRNASNHG3,theexpressionlevelofSTAT3andMMP2proteininMGC-803andBGC-823decreasedsignificantly(MGC-803:P＜0.05,BGC-823:P＜0.05),andtheratioofP-STAT3/STAT3decreasedsignificantly(MGC-803:P＜0.05,BGC-823:P＜0.05).Summary:1.KnockingdowntheexpressionoflncRNASNHG3，tumorcellproliferationandcolonyformationabilitywasinhibitedsignificantly。MGC-803andBGC-823wereinhibitedintoG2/Mphase.Theproportionofapoptosisofgastriccancercellssignificantlyincreased.Themigrationandinvasionabilityhavebeensignificantlyweakened,indicatingthatlncRNASNHG3isinvolvedingastriccancercellproliferationandantiapoptosis.LncRNASNHG3mayplayanimportantroleintheprocessofinvasionandmetastasis.2.KnockingdowntheexpressionoflncRNASNHG3ingastriccancercellsmayinhibittheproliferationandinvasionprocessofMGC-803and11 BGC-823cellsbydownregulatingtheexpressionofSTAT3andMMP2andthelevelofSTAT3phosphorylation.LncRNASNHG3geneisexpectedtobeappliedintargetedtherapyofgastriccancer.Conclusion:1.High-throughputsequencingresultsshowedthattherewere74aberrantlyexpressedlncRNAingastricadenocarcinomatissuescomparedwiththoseadjacentnontumortissues,ofwhich43wereupregulatedand31downregulated,449differentiallyexpressedmRNAingastricadenocarcinomatissuesandpairedadjacentnontumortissues,ofwhich238oftheupregulatedmRNAand211ofthedownregulatedmRNA.SelectingthelncRNAwithdifferentialexpression,andverifingthesequencingresultsbyqRT-PCR.Theresultswereconsistentwiththeresultsofhigh-throughputsequencing.Theresultsofhighthroughputsequencingwerereliable.2.TheexpressionlevelofLncRNASNHG3ingastricadenocarcinomawassignificantlyhigherthanthatintheadjacentnontumortissues,significantlycorrelatedwiththedepthofinvasion,lymphnodemetastasisandTNMstage;andnotrelatedtoage,gender,tumorsize,tumorlocation,degreeofdifferentiation,vascularinvasionandnerveinvasion.ItwassuggestingthatlncRNASNHG3playsanimportantroleintheoccurrence,development,invasionandmetastasisofgastricadenocarcinoma.3.KnockingdowntheexpressionoflncRNASNHG3，tumorcellproliferationandcolonyformationabilitywasinhibitedsignificantly.MGC-803andBGC-823wereinhibitedintoG2/Mphase.Theproportionofapoptosisofgastriccancercellssignificantlyincreased.Themigrationandinvasionabilityhavebeensignificantlyweakened,indicatingthatlncRNASNHG3isinvolvedingastriccancercellproliferationandantiapoptosis.LncRNASNHG3mayplayanimportantroleintheprocessofinvasionandmetastasis.ItmayinhibittheproliferationandinvasionofgastriccancercellsbydownregulatingtheexpressionofSTAT3andMMP2andthephosphorylationlevelofSTAT3.KnockingdownthelncRNASNHG3geneisexpectedtobeappliedintargetedtherapyofgastriccancer.12 Keywords:Gastriccancer,Longnon-codingRNA,SNHG3,Proliferation,Invasion.13 英文缩写英文缩写英文全称中文全称lncRNAlongnon-codingRNA长链非编码RNASNHG3smallnucleolarRNAhostgene3小核仁RNA宿主基因3cDNAcomplementarydeoxyribonucleic互补脱氧核糖核酸acidCTCyclethresholdCT值ddH2ODoubledistillatedwater双蒸水DEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯dNTPdeoxyribonucleoside三磷酸脱氧核糖核苷triphosphateFBSfetalbovineserum胎牛血清PBSphosphatebufferedsaline磷酸缓冲盐溶液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应PAGEpolyacrylamidegel聚丙烯酰胺凝胶电泳electrophoresisSDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠ECLenhancedchemiluminescence增强化学发光法DMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜qRT-PCRQuantitativereal-timepolymerase实时定量聚合酶链式反chainreaction应siRNAsmallinterferingRNA小干扰RNASTAT3signaltransducerandactivatorof信号传导与活化转录因transcription3子3ECMextracellularmatrix细胞外基质MMPmatrixmetalloproteinase基质金属蛋白酶14 胃腺癌中差异表达lncRNA筛选及相关功能分析研究引言胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一，预后相对较差，严重威胁人类健康。2012年全球胃癌新发病例约50%的病例发生在亚洲东部，主要集中在中国[1]。我国是胃癌高发国家，2015年中国胃癌新发病例约为67.9万例，胃癌[2]死亡病例约为49.8万例，是严重危害中国居民健康的主要疾病。由于我国进展期胃癌患者比例较高，即使接受了手术为主的综合治疗，5年生存[3]率仍低于30%。胃癌的发病机制复杂，包括遗传因素、环境因素等多个方面。为了扩展胃癌的治疗手段，提高胃癌患者的生存期，探索胃癌发病的分子机制，寻找诊断及预后的生物标志物以及治疗靶点的研究受到越来越多学者的重视。基因组测序工程显示,在人类基因组序列中，仅有1.5%的核酸序列用于蛋白质编码，而占据人类基因组98.5%的是非蛋白编码序列。长链非编码RNA(longnon-codingRNA,1ncRNA)指长度超过200个核苷酸的非编码RNA，不具有开放阅读框，无蛋白翻译功能。长期以来，1ncRNA被认[4]为是基因组转录的“噪音”，无生物学功能。近年来的的研究结果显示，[5-6]在肿瘤组织和正常组织中有一系列的差异表达的lncRNA，在多种肿瘤如胃癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、甲状腺癌的发生、发展、转移以及复发[7-11]过程中的重要作用也得到了证实。尽管己经取得一些进展，有关lncRNA在胃癌中所起的作用的尤其是在胃癌的研究还处于起步阶段，相关的lncRNA表达谱并未明了，lncRNA在胃癌病理机制中的具体作用了解较少。为此，我们应用高通量测序技术对胃腺癌和癌旁组织样本中的lncRNA进行筛选，以期发现在胃腺癌中差异表达的lncRNA；根据高通量测序结果及生物信息学分析所得数据，挑选在胃腺癌组织中相对高表达，并且可能具有生物学功能的lncRNA，分析其与胃腺癌临床病理特征的关系；利用小干扰RNA(siRNA)下调其表达，观察其对胃癌细胞的增殖、凋亡、转移等生物学行为的影响，并初步研究其可能机制。本次研究将有助于揭示胃腺癌的进展机制，同时也为胃腺癌的诊断、预后的生物标志物及靶向治15 疗药物的寻找与开发提供实验基础。16 第一部分胃腺癌组织与癌旁组织中差异lncRNA筛选及验证前言根据世界卫生组织的最新报道，胃癌的发病率居于恶性肿瘤全球发病率的第5位，其死亡率更是高居第3位，成为了一个重要的公共卫生问题。中国每年胃癌新发病例占世界新发病例40%以上，在我国，超过80%的[12-13]新发病例一经诊断已达进展期，手术、化疗效果差，预后不良。胃癌的高死亡率和不良预后迫切需要高效的诊断标志物和新的药物治疗靶点，目前在临床上应用的常规胃癌标志物检测的敏感度和特异度有待提高。因此，探寻新的胃癌诊断、预后标志物和治疗靶点成为胃癌研究领域的当务之急。LncRNA是最近肿瘤方面研究的热点，lncRNA参加了多种不同的生[14][15][16][17-19]物学过程，诸如发育、细胞分化、包括癌症在内的多种疾病。在肿瘤的发生、发展、转移以及复发过程中，甚至参与肿瘤耐药性的产生，lncRNA均起到了重要作用，因此对lncRNA进行深入研究，能够为肿瘤的诊断和治疗提供重要的科学依据。LncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA，不具有开放阅读框，无蛋白翻译功能。其几乎能参与整个生命周期基因调控的每一步：包括染色体剂量补偿，印迹，表观遗传调控，转录，mRNA剪[20]接和翻译等。按照1ncRNA分子功能的不同,研究人员将1ncRNA分为[21]4种：(1)信号分子;(2)诱饵分子;(3)引导分子;(4)支架分子。lncRNA可[22]在转录及转录后水平调控蛋白的表达。有的lncRNA可具有致癌作用，如HOX转录反义RNA(HOXtranscriptantisenseRNA,HOTAIR)，它是第一个被发现具有反式转录调控作用的lncRNA，作为分子支架发挥作用。[7-8]HOTAIR在胃癌淋巴结转移、腹膜播散的患者高表达，提示预后不良。有的lncRNA则具有抑癌作用，如在胰腺癌和乳腺癌中，MEG3可以抑制[9,23]MDM2蛋白的表达从而活化p53通路达到抑癌作用；有的lncRNA兼[24-25]具有致癌及抑癌的双重作用。17 LncRNA的表达谱在多数癌组织表达与癌旁组织是有显著差异的，如[10][9][11][7]结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等，但是，尽管己经取得一些进展，有关lncRNA在胃癌中所起的作用的研究还处于起步阶段，对其临床意义还了解较少。本部分研究以3对胃腺癌组织和癌旁组织为研究对象，应用高通量测序技术构建胃腺癌中差异表达lncRNA及mRNA表达谱，建立差异表达的lncRNA及mRNA共表达网络，通过GO分析及KEGG富集分析预测差异表达lncRNA的生物功能，并选取4条lncRNA应用qRT-PCR验证高通量测序结果。以期能够发现与胃癌发展、预后、治疗等相关的lncRNA，探索新的胃癌高效诊断标志物、发展新的治疗方案、发现新的治疗靶点从而开发新型的治疗药物或新的治疗策略。材料与方法1研究对象收集2016年2月～2016年4月在河北医科大学第四医院手术切除的13例胃腺癌标本及癌旁5cm处胃粘膜组织标本，所有病例均经病理诊断证实为胃腺癌，除外合并其他恶性肿瘤、以及术前接受放疗、化疗和其他针对胃腺癌治疗的患者。3例用于lncRNA高通量测序检测，其余用于高通量测序表达谱结果的验证。用于lncRNA高通量测序检测的3例胃腺癌患者和高通量测序表达谱结果验证的10例胃腺癌患者的基本临床病理资料分别见Table1-1、Table1-2。该实验所用标本通过河北医科大学第四医院医院伦理委员会讨论通过，并征得患者知情同意。2实验仪器和试剂2.1主要仪器低温离心机美国Thermo公司高速冷冻离心机德国Eppendorf公司超低温冰箱Millus公司NanoDropND-2000美国NanoDrop公司Agilent2100Bioanalyzer美国Agilent公司ThermalcyclerS1000美国Bio-Rad公司18 +GelDocXR美国Bio-Rad公司StepOnePlus美国ABI公司Hiseq4000美国Illumina公司Rotergene3000澳大利亚Corbett公司100-1000μl微量移液器美国Thermo公司20-200μl微量移液器美国Thermo公司10-100μl微量移液器美国Thermo公司2-20μl微量移液器美国Thermo公司0.5-10μl微量移液器美国Thermo公司0.1-2.5μl微量移液器美国Thermo公司洁净工作台美国FarmaScientific无酶1000μl吸头美国SSI公司无酶200μl吸头美国SSI公司无酶10μl吸头美国SSI公司无酶1.5mLEP管美国SSI公司PCR管美国SSI公司2.2主要试剂TRIzol试剂美国Invitrogen公司氯仿北京化工厂异丙醇上海化学试剂有限公司无水乙醇北京化工厂焦碳酸二乙醋(DEPC)美国sigma公司M-MLV反转录试剂盒美国promega公司SYBRGreenPCRMasterMix试剂全式金公司盒目的基因引物上海生工公司Ribo-ZeroMagnetickit美国Epicentre公司randomprimer日本TAKARA公司SuperscriptII美国Invitrogen公司USER酶美国NEB公司3研究方法19 3.1组织标本的采集及处理冻存管高压灭菌备用，于手术室选取洁净区域，冻存管编号，组织样本离体后用生理盐水清洗血渍，取胃癌及距癌灶5cm远的癌旁组织各1块(约200mg)，将所取组织样本一式两份，一份送常规病理检查，一份尽快投入液氮中速冻。为减少RNA降解等情况发生，从样本离体到投入液氮的时间间隔不超过15分钟。液氮速冻后，组织样本保存在-80℃冰箱中。在标本记录本上详细记录患者信息。3.2LncRNA的高通量测序选取3例胃腺癌组织及对应距癌灶5cm远的癌旁组织标本，交由北京贝瑞和康生物技术有限公司应用高通量测序完成lncRNA表达谱的检测。高通量测序的简要步骤如下：3.2.1组织样本RNA的提取1)用液氮预冷研钵，组织样品约100mg放入加有液氮的研钵中，在液氮下把组织样品充分研磨成粉末。2)把样品粉末转入到装有TRIzol裂解液的2.0mLEP管中，（每mL裂解液可加50mg组织样品）剧烈震荡，充分混匀，平放室温静置5-10min。3)10000rpm，4℃离心5min。4)吸取上清液至新的2.0mLEP管中，每毫升裂解液加入200μL氯仿/异戊醇，剧烈颠倒混匀。5)10000rpm，4℃离心10min。6)吸取上清液至新的1.5mL离心管，注意不要吸到中间蛋白层，加入等上清液体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀。7)放入-20℃冰箱沉淀1h。8)13600rpm，4℃离心20min。9)吸弃上清，加入1mL75%乙醇，用移液器吹洗沉淀。10)10000rpm，4℃离心3min，吸弃上清，短暂离心，吸去残留液体，晾干3-5min。11)用30-100μLDEPC水或者RNase-free水溶解沉淀。12)置于-80℃冰箱保存。3.2.2样品检测20 使用Agilent2100Bioanalyzer(AgilentRNA6000NanoKit)检测totalRNA的浓度、RIN值、28S/18S和片段大小。3.2.2.1RNA浓度及纯度测定1)分光光度计检测，生成浓度、吸光度(OD260,OD280)等参数;2)计算OD260/OD280比值，比值介于1.8-2.2之间，判断样品纯度，越接近2.0样品纯度越高，若比值小于1.8或大于2.2则说明样品己被DNA、蛋白质污染或样品已降解。RNA浓度为OD260×2000(ug/uL)，RNA浓度应≥200ng/μL。3.2.2.2RNA完整性检测琼脂糖凝胶电泳显示28s条带的亮度大约是18s条带的2倍；Agilent2100BioAnalyzer对TotalRNA进行检测，28s和18s的RNA比值≥1:1，且RIN≥7，RNA总量5ug的RNA为质量合格TotalRNA，可作为测序建库起始样品。3.2.3建立文库3.2.3.1去除rRNA及质量控制以Ribo-ZeroMagnetickit(Epicentre)对5ugRNA进行去核糖体RNA处理，具体操作方法参照kitprotocol。3.2.3.2去除rRNA后的TotalRNA片段化1)rRNA-depletedRNA样品在含有二价阳离子的buffer中经高温打断，利用randomprimer(TAKARA)以SuperscriptII(Invitrogen)随机反转录合成cDNA第一链；2)合成cDNA第二链，在该反应体系中以dUTP替代dNTP中的dTTP。3)对双链cDNA做末端修复和3’末端加A；4)连接IlluminaTruseqadaptor，产物经纯化后以USER酶(NEB)做消化处理，目的为切断含有dUTP的cDNA第二链；5)纯化消化产物，以IlluminaP5、P7引物做PCR扩增；6)扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶选择350-500bp目的条带，回收产物即为终文库；3.2.3.3以qPCR方法对文库进行质控，之后安排文库上机。检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，稀释至2nM。变性稀释后的文库加入到21 FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，在cBot上完成桥式PCR扩增，最后使用IlluminaHiseq4000平台进行测序，由贝瑞和康生物技术有限公司完成。3.2.4原始数据处理3.2.4.1Illumina测序得到的原始图像数据经过BaseCalling转化为序列数据，即FASTQ格式，得到最原始的测序数据文件，即rawdata或rawreads。3.2.4.2原始测序数据质控Illumina测序属于第二代测序技术，对所有测序reads的每个circle进行碱基分布和质量波动的统计，从宏观上直观地反映出样本的测序质量和文库构建质量。针对每一个样本的原始测序数据进行测序相关质量评[26]估，包括(1)A/T/G/C碱基含量分布统计，一般情况下A与T相等，C与G相等，各碱基所占百分比会因物种的差异而不同。模糊碱基N所占比例越低，说明未知碱基越少，测序样本受系统AT偏好影响越小。(2)碱[26]基质量分布统计，(3)碱基错误率分布统计。一般情况下，单个碱基位置的测序错误率应该低于1%。3.2.4.3测序数据质量剪切及统计原始测序数据中会包含测序接头序列、低质量读段、N率较高序列及长度过短序列，为保证后续的生物信息分析的准确性，使用软件SeqPrep（https://github.com/jstjohn/SeqPrep）、Sickle（https://github.com/najoshi/sickle）对原始测序数据进行过滤，从而得到高质量的测序数据[27]（cleandata）以保证后续分析的顺利进行，具体步骤及顺序如下：1)去除reads中的接头序列，去除由于接头自连等原因导致没有插入片段的reads；2)将序列末端（3’端）低质量（质量值小于20）的碱基修剪掉，如剩余序列中仍然有质量值小于10则将整条序列剔除，否则保留；3)去除含N比率超过10%的reads；4)舍弃去adapter及质量修剪后长度小于20bp的序列。对质量剪切后的序列进行数据量统计，结果见Table1-3。3.3与参考基因组比对将质控后得到的高质量测序序列与指定的参考基因组比对，参考基因组来自于EnsembleGRCh38v84。使用软件：TopHat22 http://tophat.cbcb.umd.edu/)，CleanData与参考基因组比对结果见Table1-4。3.4LncRNA分析3.4.1LncRNA及mRNA差异表达分析3.4.1.1样本差异表达分析1)将胃腺癌组织和癌旁组织样本分别设为实验组和对照组。转录本或基因在这两组样本中表达量应用FPKM值表示，FPKM是每百万测序片[28]段中来自于某一条基因每千碱基长度片段数。Cuffdiff是Cufflinks套件里用来计算差异表达的一个工具，Cuffdiff利用Tophat比对的结果，调用Cufflinks计算每个基因/转录本的表达量，通过负二项分布模型预估基因[29]及转录本差异表达的程度，检测其是否存在差异性表达。(公式1:FPKM计算公式)2)符合定量检测成功、|log2FC|>1(FC，即FoldChange，指该基因/转录本在两样本间差异倍数；log2FC，差异表达倍数的对数，log2FC>1是上调基因，log2FC<-1是下调基因)且p-value<0.05三个筛选条件，从[29]Cuffdiff软件分析结果中找出具有显著差异表达的基因及转录本。利用FDR（falsediscoveryrate）方法对p-value校正后得到FDR值。FDR值越低差异越显著，将FDR值阈值设为0.05。3.4.1.2表达模式的聚类分析一般来说，同一类样品能通过聚类出现在同一个簇中，聚在同一个簇[8]中的基因或长链非编码RNA可能具有相似的生物学功能。将有显著差异的基因/转录本进行表达模式聚类分析，通常表达模式相似的基因有相似的功能，采用距离计算算法：样本间为spearman，基因间为pearson，采用的聚类方法为hcluster（complete算法）。3.4.1.3差异表达mRNA的GO富集分析GO(GeneOntology,http://www.geneontology.org/)是基因本体论联合会建立的数据库，其目的在于标准化不同数据库中的关于基因和基因产物的生物学术语，对基因和蛋白功能进行限定和描述。利用GO数据库，可以将基因按照它们参与的生物学过程、构成细胞的组分，实现的分子功23 能等进行分类。对差异基因进行GO功能显著性富集分析，研究其在GO中分布情况，可以说明差异基因的功能富集情况，在基因功能水平阐明样本间的差异。本分析使用软件Goatools(https://github.com/tanghaibao/Goatools)进行富集分析，使用方法为Fisher精确检验。当经过校正的p值（p_fdr）≤0.05时，认为此GO功能存在显著富集情况。通过此实验可明确差异表达基因主要的生物学功能。3.4.1.4差异表达mRNA的KEGG通路富集分析选取差异表达基因进行Pathway富集分析。生物体内各种生物学功能是靠不同基因相互协调完成的，Pathway分析有助于进一步了解基因生物学功能。KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，京都基因和基因组百科全书，http://www.genome.jp/kegg/）数据库内容较为全面，是Pathway主要的公共数据库。富集分析方法通常是分析一组基因在某个功能节点上是否出现过，原理是由单个基因的注释分析发展为基因集合的注释分析。富集分析提高了研究的可靠性，能够识别出与生物现象最相关的生物学过程。分析使用KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)进行KEGGPATHWAY富集分析,使用Fisher精确检验进行计算。经过校正的p值（CorrectedP-Value）以0.05为阈值，满足此条件的KEGG通路定义为在差异表达基因中显著富集的KEGG通路。3.5LncRNA与mRNA的关联分析LncRNA的功能跟与其共表达的蛋白编码基因相关，可以通过样本间lncRNA与蛋白编码基因的表达量相关性分析或共表达分析方法来研究lncRNA的功能。使用Pearson相关系数法分析样本间lncRNA与蛋白编码基因的相关性；该分析中，采用Pearson相关系数法分析样本间lncRNA[30]与蛋白编码基因的相关性，阈值使用0.9。4LncRNAqRT-PCR验证高通量测序结果4.1RNA的逆转录1)每个样品取1μgRNA作为模板RNA，30μmmol/LoligodT1ug放入PCR管中。2)70℃加热5分钟，冰上放置2分钟。3)5×逆转录缓冲液5uL，10mmol/LdNTP5uL，200U/μLM-MLVRT24 200u，加入DEPC水至25uL。4)混匀PCR管，37℃反应60分钟。85℃5分钟4.2qRT-PCR在NCBI网站检索到基因的序列，使用primer5软件设计引物，将设计好的引物交由上海生工公司合成。PrimersetnamePrimer(5＇to3＇)SNHG3-FAGACAGATTCGCAGTGGTCGSNHG3-RGTCTCCATGGCCCACTTCTGLinc00261-FCAGATTCAGTGACACATTCLinc00261-RTGCCTTTCTTTGCTCCAATENSG00000259291-FGTAGGGCTTTGCACAAGTGGENSG00000259291-RTTCGATACTTGAACGCCCCCENSG00000279146-FCAGGGGAACGTCATGAGGAGENSG00000279146-RCTGAGGTTCAATGCCTCGCTβ-Actin-FCACCCCAGCCATGTACGTTGβ-Actin-RAATGTCACGCACGATTTCCCPCR反应体系：试剂加入量2×SYBRGREENMix10μLPrimerF(10μM)0.5μLPrimerR(10μM)0.5μLcDNA2μLRNase-freeddH2O补齐至20μLPCR程序：程序温度时间Pre-incubation95℃30s95℃10sAmplification60℃10s(40cycles)72℃20s25 95℃15sMeltingCurves60℃1min95℃15s5以β-Actin作为内参，计算组织中lncRNA表达量。△CT=CTlncRNA－CTβ-Actin；△△CT=（CTlncRNA－CTβ-Actin）实验组－（CTlncRNA－CTβ-Actin）对照组[31]；癌组织和癌旁组织的相对表达量统计时，各样本的相对表达量-△CT=2，比较lncRNA在不同组织的变化。6统计学方法用SAS9.1对数据进行分析，正态计量资料采用平均数士标准差表示，非正态计量资料采用中位数M（P25～P75）表示，计量资料满足正态分布且方差齐同的比较，采用两组独立样本的t检验；方差不齐的非正态分布的计量资料采用秩和检验。对于mRNA和lncRNAs的聚类分析应用R平台[32][33](http://www.r-project.org/)进行分层聚类分析。Circos图展示差异表达lncRNA和mRNA在染色体上的分布。以P＜0.05为差异有统计学意义。结果1RNA质量检测结果利用紫外线吸收法测定组织中提取的RNA浓度。260nm代表核酸的值，RNA在此处具有较高的吸收峰。280nm代表蛋白质的值，蛋白质在此处具有较高的吸收峰。通常根据OD260/OD280比值判定提取的RNA浓度及纯度。OD260/OD280比值介于1.8-2.2时质量合格，越接近2.0样品纯度越高。当比值小于1.8时，说明存在蛋白或其它有机物污染。比值大于2.2时表明部分RNA己降解。利用Agilent2100BioAnalyzer对TotalRNA进行检测，得出RNAIntegrityNumber(RIN)，RIN数值越高所提取的RNA完整性越好。当RIN数值>7时认为RNA具有良好的完整性，可进行测序实验。高通量测序部分组织的RNA含量与纯度数值见Table1-5。利用凝胶成像系统显示提取的总RNA的28S、18S清晰可见，5S条带较为模糊，28S条带的亮度大约是18S条带的2倍。提示总RNA完整性较好（Fig.1-1）。26 2差异lncRNA明确lncRNA在胃腺癌和癌旁组织中表达情况是这部分实验的重点，对3例胃腺癌患者肿瘤组织和癌旁组织进行高通量测序，通过计算表达量的FPKM值，检测其是否存在差异性表达。筛选标准为:|log2FC|>1，且FDR<0.05。|log2FC|越大，样品间差异越大，FDR值越小，差异基因可靠性越高。结果分析显示，胃腺癌组织与癌旁组织相比，胃腺癌组织中具有2倍（|log2FC|>1）以上差异的lncRNA有74条，其中上调lncRNA有43条（table1-6），下调的有31条（FDR<0.05）（table1-7）；。上调lncRNA差异最显著的为ENSG00000282408，上调了263倍（log2FC=8.04，FDR=0.002386），下调的lncRNA差异最显著的为ENSG00000232352，下调至0.0079倍（log2FC=-6.99，FDR=0.002386）。ScatterPlot散点图（Fig.1-2）可见两组样本表达差异在2倍以上的lncRNA，偏离了对角线程度越大的点表明该lncRNA在两个样本间表达差异越大。火山图（Volcano-plots）（Fig.1-3A）可见两组样本表达差异在2倍以上的lncRNAs，图中显著上调的基因应用红色点表示，显著下调的基因应用蓝色点表示，非显著差异基因应用黑色点表示；左边和右边的点分别为差异表达下调和上调的基因。3LncRNA的聚类分析为了更直观的表现胃腺癌组织与癌旁组织样本中差异长链非编码RNA表达，对具有2倍以上差异的lncRNA进行聚类分析，绘制了上调和下调lncRNA的HierarchicalClustering聚类图（Fig.1-4），图中每列表示一个组织样本，每行表示一个基因，图中的颜色表示基因在该组样本中表达量的大小（log10FPKM)。4差异表达LncRNA转录本分类为了对胃腺癌中差异表达的1ncRNA进行分类，通过与mRNA转录本的位置进行比较，我们将差异表达的1ncRNA进行分类统计。74条在胃腺癌中差异到达的LncRNA中有5条senselncRNA，22条antisenselncRNA，35条intergeniclncRNA，4条processedtranscripts，其它类8条（Fig.1-5）。5mRNA测序结果5.1差异表达mRNA数据分析结果27 为明确mRNA在胃腺癌中的表达情况，我们对3例胃腺癌患者肿瘤组织和癌旁组织进行高通量测序，通过计算表达量的FPKM值，检测mRNA是否存在差异表达。筛选标准为:|log2FC|>1，且FDR<0.05。|log2FC|越大，样品间差异越大，FDR值越小，差异基因可靠性越高。经过分析后发现449条差异表达的mRNA。其中上调的mRNA共有238条(Table1-8)，下调的mRNA共有211条((Table1-9)。上调和下调最显著的mRNA分别为S100A2（log2FC=7.183158953，FDR=0.003374）和NTRK3（log2FC=-8.491899371，FDR=0.003374）。5.2差异表达mRNA的火山图分析火山图（Volcano-plots）（Fig.1-3B）可见两组样本表达差异在2倍以上的mRNAs，图中显著上调的基因应用红色点表示，显著下调的基因应用蓝色点表示，非显著差异基因应用黑色点表示；左边和右边的点分别为差异表达下调和上调的基因。5.3差异表达mRNA的聚类分析如果表达模式相似，基因常常具有相似功能。聚类分析的目的是在相似的基础上将数据进行分类。为了了解差异表达mRNA在不同样本间的表达情况。我们将449条有2倍以上差异的mRNAs进行聚类分析，绘制了上调和下调mRNAs的HierarchicalClustering聚类图（Fig.1-6）。6差异表达lncRNA与差异表达mRNA比较分析用circos图展示差异表达的lncRNA与差异表达mRNA在染色体上的分布，图中（Fig.1-7）最外层是染色体的分布，中间层是差异表达mRNA在染色体上的分布，最里层是差异表达lncRNA在染色体上的分布，红色表示上调，蓝色表示下调，高度表示log2(Foldchange)的值。7LncRNA与mRNA共表达分析根据差异lncRNAs和差异mRNAs的表达水平，应用pearsoncorrelationcoefficient(PCC)建立了74条差异lncRNAs和449条差异mRNAs的共表达关系，筛选标准[34]为|PCC|≥0.9，共74条差异lncRNAs和445条差异mRNAs建立了共表达网络，包括了519个点和2993条边。图中（Fig.1-8）红色菱形代表上调的mRNA，蓝色菱形代表下调的mRNA，橙色椭圆代表上调的lncRNA，灰色椭圆代表下调的lncRNA。图中（Fig.1-9）分别是Linc00261、Linc01105、SNHG3与mRNAs的共表达28 网络，四边形代表了lncRNA，红色表示上调，兰色表示下调；椭圆为mRNAs，黄色表示上调，绿色表示下调。8差异表达mRNA的GO分析GO分析包括分子功能，生物过程和细胞组分三部分。通过GO分析可知差异表达的mRNAs和哪些生物学功能有关。利用GO数据库对与mRNA异常表达相关通路功能进行分析[35]，利用P<0.05作为筛选条件，发现有72条结果具有显著意义。GO分析显示（见Table1-10）细胞组分中最显著的富集在细胞外基质，胞外区；生物过程最显著的富集在细胞粘附和生物粘附；分子功能最显著的富集在钙离子结合和受体结合。9差异表达mRNA的KEGG分析为了解差异表达mRNA所参与的通路信息，利用KEGGPATHWAY[36]数据库对与mRNA异常表达相关通路进行分析，利用P<0.05作为筛选条件，发现有20条通路具有显著意义(Table1-11)。胃酸分泌、补体途径、胰腺分泌、细胞因子及其受体相互作用、Jak-STAT信号通路是与胃腺癌相关的较显著的通路。我们还发现，一些与差异lncRNA共表达的差异mRNA显著的富集在以上的信号通路中。与LINC01105和SEM3B-AS1共表达的KCNE2、与LINC01105和LINC00261共表达的KCNJ15、与LINC00982共表达的SSTR2显著富集与胃酸分泌；与H19和HOTAIR共表达的CLCA4显著富集于胰腺分泌；与H19和HOTAIR共表达的CSF3R显著富集与癌症通路、Jak-STAT信号通路、细胞因子及其受体相互作用。与LINC01105和LINC00261共表达的RYR2显著富集于胰腺分泌和钙信号通路。10qRT-PCR验证高通量测序结果为了验证高通量测序结果的可靠性，我们在差异倍数2倍以上，FDR<0.05的lncRNA中选取了4条，设计引物进行qRT-PCR。结果如Table1-12所示，在10对胃腺癌与癌旁组织中，lncRNASNHG3在胃腺癌呈相对高表达，具有显著差异(Z=2.7324，P=0.0065)。而ENSG00000259291、ENSG00000279146、Linc00261（ENSG00000259974）在癌组织中呈相对低表达(ENSG00000259291：Z=-2.0032，P=0.0452；ENSG00000279146：Z=-2.1544，P=0.0312；Linc00261：Z=-3.1371，P=0.0017)，这些结果也和高通量测序结果相符合。这说明，高通量测序结果准确可信。29 附图图1-1总RNA变性琼脂糖凝胶电泳图Fig.1-1DenaturingAgaroseGelElectrophoresisofTotalRNA.图1-2胃腺癌及癌旁组织中的lncRNA的散点图Fig.1-2ScatterplotoflncRNAingastricandadjacentnon-tumortissues.CindicatedgastricadenocarcinomaandNindicatedadjacentnon-tumorsamples.Theredpointindicatesasignificantup-regulatedgene,andthebluepointindicatesasignificantdown-regulationgene,andtheblackpointisanonsignificantdifferencegene.30 AB图1-3胃腺癌及癌旁组织中lncRNA和mRNA表达的火山图Fig.1-3VolcanospotoflncRNAandmRNAexpressioningastricadenocarcinomaandadjacentnon-tumorsamples.CindicatedgastricadenocarcinomaandNindicatedadjacentnon-tumorsamples.(A)volcanospotoflncRNAexpressioningastricadenocarcinomagroupandadjacentnon-tumorgroup;(B)volcanospotofmRNAexpressioningastricadenocarcinomagroupandadjacentnon-tumorgroup.Redspotandbluespotrespectivelyindicatedup-regulatedanddown-regulatedgenesingastricadenocarcinoma.31 图1-4胃腺癌和癌旁组织中差异表达lncRNAs的表达水平分层聚类分析Fig.1-4HierarchicalclusteringanalysisoftheexpressionlevelsofdifferentialexpressionlncRNAsingastricadenocarcinomaandadjacentnon-tumortissues.CrepresentedgastricadenocarcinomatissuesandNrepresentedadjacentnon-tumortissues.RowandcolumnrepresenteddifferentialexpressionlncRNAsandtissuesamples.Thecolorscaleindicatedlog10FPKMoftheexpressionlevelsofdifferentialexpressionlncRNAs.Redandgreenindicatedup-regulationanddown-regulation.32 图1-5差异表达lncRNAs的生物类型Fig.1-5ThebiotypeofdifferentialexpressionlncRNAs33 图1-6胃腺癌和癌旁组织中差异表达的mRNAs的表达水平分层聚类分析Fig.1-6HierarchicalclusteringanalysisoftheexpressionlevelsofdifferentialexpressionmRNAsinadvancedgastricadenocarcinomaandadjacentnon-tumortissues.CrepresentedgastricadenocarcinomatissuesandNrepresentedadjacentnon-tumortissues.RowandcolumnrepresenteddifferentialexpressionmRNAsandtissuesamples.Thecolorscaleindicatedlog10FPKMoftheexpressionlevelsofdifferentialexpressionmRNAs.Redandgreenindicatedup-regulationanddown-regulation.34 图1-7差异表达lncRNAs与差异表达mRNAs染色体上分布的Circos图Fig.1-7CircosplotofthedistributionofDElncRNAs/DEmRNAsonchromosomes.Theouterlayerofbluecyclewasthechromosomemapofthehumangenome.ThelargerinnerlayerandsmallerinnerlayerrepresentedthedistributionofdifferentialexpressionmRNAsanddifferentialexpressionlncRNAsondifferentchromosome,respectively.Redcolorindicatedup-regulationandbluecolorindicateddown-regulation.Theheightofthebarinthelargerinnerlayerandinthesmallerinnerlayerrepresentedlog2FCofexpressionlevelsofdifferentialexpressionlncRNAsanddifferentialexpressionmRNAs.35 图1-8445条差异表达的mRNAs和74条差异表达的差异lncRNAs的共表达网络Fig.1-8Co-expressionnetworkof445differentialexpressionmRNAsand74differentialexpressionlncRNAs.CircularnoderepresenteddifferentialexpressionmRNAandrectanglenoderepresenteddifferentialexpressionlncRNA.Yellowwasup-regulateddifferentialexpressionmRNAandgreenwasdown-regulateddifferentialexpressionmRNA;Redindicatedup-regulateddifferentialexpressionlncRNAandblueindicateddown-regulateddifferentialexpressionlncRNA.36 ABC图1-9差异表达的lncRNAs和mRNAs共表达的子网络Fig.1-9Sub-networksofDElncRNAs/DEmRNAsco-expression.A:thesub-networkofLINC00261;B:thesub-networkofLINC01105;C:thesub-networkofSNHG3;CircularnoderepresentedDEmRNAandrectanglenoderepresentedDElncRNA.Yellowwasup-regulatedDEmRNAandgreenwasdown-regulatedDEmRNA;Redindicatedup-regulatedDElncRNAandblueindicateddown-regulatedDElncRNA.DEmRNA：DifferentialexpressionmRNA.DElncRNA:DifferentialexpressionlncRNA.37 附表表1-1高通量测序的3例胃腺癌患者临床病理信息Table1-1TheclinicalandpathologicalinformationofpatientswithgastricadenocarcinomaforRNA-SeqNumberGenderAgeDifferentiationHistologicaltypeTNMstage1Male65poorlyadenocarcinomaT4aN1M02Male58poorlyadenocarcinomaT4aN1M03Female68poorlyadenocarcinomaT4aN1M0表1-2qRT-PCR验证的胃腺癌的患者临床病理信息Table1-2TheclinicalandpathologicalinformationofpatientswithgastricadenocarcinomaforqRT-PCRvalidationNumberGenderAgeDifferentiationHistologicaltypeTNMstage1Male45poorly-moderatelyadenocarcinomaT4aN1M02Male49poorly-moderatelyadenocarcinomaT4aN1M03Male67poorly-moderatelyadenocarcinomaT4aN0M04Female69poorlyadenocarcinomaT3N3M05Male70poorly-moderatelyadenocarcinomaT3N1M06Male77moderatelyadenocarcinomaT3N0M07Male67poorlyadenocarcinomaT3N2M08Male72moderatelyadenocarcinomaT3N2M09Male66poorlyadenocarcinomaT4aN3M010Male50poorlyadenocarcinomaT4aN0M038 表1-3样本高通量测序的rawsequenceTable1-3Therawsequenceofhigh-throughputsequencingofsamplesSamplesCleanreadsBasepairsError%Q20%Q30%GC%1C104874284128662231820.027897.0593.5745.481N103724778126382700380.030396.0891.7345.522C94596168115831364500.028296.8793.2145.12N88640770108754004020.02896.9793.3848.083C115223050141071157770.028596.7692.9845.613N98382204120665139480.028396.8793.1847.64C:gastricadenocarcinomatissues;N:adjacentnontumortissues表1-4所有样本的映射率Table1-4ThemappedratioofallsamplesMappedMappedUnipMappedUnipMappedSampleTotalReadsReadsRatioReadsRatio1C1048742847381911870.39%6359808260.64%1N1037247787516796572.47%6124098159.04%2C1152230509413413681.70%8188643471.07%2N983822047809463479.38%5271047553.58%3C945961687351928977.72%6308651066.69%3N886407707153164480.70%5096843457.50%C:gastricadenocarcinomatissues;N:adjacentnontumortissues39 表1-5总RNA质量及浓度Table1-5ThequalitycontroloftheRNAfromthefrozentissueSampleCon.(ng/μl)Volume(μl)Total(ug)OD260/280RIN28S/18SResultN1246215.171.837.01.5QualifiedN226253078.751.977.61.7QualifiedN315483655.731.897.31.6QualifiedC112963646.661.867.21.5QualifiedC222533067.591.957.51.7QualifiedC312543543.891.897.21.5QualifiedC:gastricadenocarcinomatissues;N:adjacentnontumortissues40 表1-6胃腺癌中上调的差异表达的lncRNAsTable1-6Theup-regulatedDifferentialexpressionlncRNAsingastricadenocarcinomaEnsemblGeneIDGeneSymbollog2FCpvalueFDRENSG00000282408RP3-335E1.18.045.00E-050.00238636ENSG00000229618AC011288.26.395.00E-050.00238636ENSG00000254166CASC19/LINC012456.275.00E-050.00238636ENSG00000229167RP11-73M7.16.005.00E-050.00238636ENSG00000250124CTC-261N6.25.675.00E-050.00238636ENSG00000269989RP11-635N19.35.655.00E-050.00238636ENSG00000272468RP1-86C11.75.435.00E-050.00238636ENSG00000248103CTC-338M12.95.315.00E-050.00238636ENSG00000273165RP11-1057B6.15.252.00E-040.00820313ENSG00000230316FEZF1-AS15.255.00E-050.00238636ENSG00000268707RP11-247A12.75.211.00E-040.004375ENSG00000232803SLCO4A1-AS15.185.00E-050.00238636ENSG00000275857AC009133.215.175.00E-050.00238636ENSG00000249550LINC012345.165.00E-050.00238636ENSG00000269974RP11-932O9.105.105.00E-050.00238636ENSG00000273305RP11-440D17.45.055.00E-050.00238636ENSG00000228742RP5-884M6.14.995.00E-050.00238636ENSG00000232555AC104088.14.950.000150.00635081ENSG00000233834AC005083.14.846.00E-040.0238636ENSG00000255774AP000439.34.775.00E-050.00238636ENSG00000232756RP5-1185I7.14.745.00E-050.00238636ENSG00000130600H194.555.00E-050.00238636ENSG00000237166AC007163.34.375.00E-050.00238636ENSG00000234155RP11-30P6.64.365.00E-050.00238636ENSG00000272079LA16c-380H5.54.345.00E-050.00238636ENSG00000229404LINC008584.335.00E-050.00238636ENSG00000245261RP3-330M21.54.265.00E-050.00238636ENSG00000254872RP13-870H17.34.232.00E-040.00820312ENSG00000280009CTD-2123J17.24.135.00E-050.00238636ENSG00000228630HOTAIR4.135.00E-050.00238636ENSG00000279396AC130469.14.111.00E-040.004375ENSG00000257893RP11-587P21.23.995.00E-050.00238636ENSG00000271824AC009014.33.901.00E-040.004375ENSG00000270557RP11-546J1.13.841.00E-040.004375ENSG00000233968RP11-354E11.23.735.00E-050.00238636ENSG00000184809B3GALT5-AS13.615.00E-050.00238636ENSG00000233101HOXB-AS33.495.00E-050.00238636ENSG00000277701RP11-734K23.93.360.00130.0461149ENSG00000253364RP11-731F5.23.260.000150.0063508141 ENSG00000172965MIR4435-2HG2.753.00E-040.0121154ENSG00000274979RP11-1143G9.51.910.00110.0401042ENSG00000270069MIR222HG1.870.000750.0289522ENSG00000242125SNHG31.738.00E-040.030434842 表1-7胃腺癌中下调的差异表达的lncRNAsTable1-7Thedown-regulatedDifferentialexpressionlncRNAsingastricadenocarcinomaEnsemblGeneIDGeneSymbollog2FCpvalueFDRENSG00000232352SEMA3B-AS1-6.992927015.00E-050.00238636ENSG00000259417LINC01314-6.006864485.00E-050.00238636ENSG00000272159RP11-350N15.6-5.912151645.00E-050.00238636ENSG00000272810U91328.22-5.801065511.00E-040.004375ENSG00000259827RP11-343H19.2-5.593494215.00E-050.00238636ENSG00000225521AC005237.4-5.526766825.00E-050.00238636ENSG00000274015CTD-2302E22.6-5.401633885.00E-050.00238636ENSG00000259039RP11-409I10.2-5.17966635.00E-050.00238636ENSG00000250331LINC01340-5.097315825.00E-050.00238636ENSG00000250472RP11-731F5.2-5.061832355.00E-050.00238636ENSG00000264754CTD-2653B5.1-5.041799315.00E-050.00238636ENSG00000232044LINC01105-5.001686930.00130.0461149ENSG00000177133LINC00982-4.981227995.00E-050.00238636ENSG00000257052RP3-330M21.5-4.971847015.00E-050.00238636ENSG00000254431RP11-550A5.2-4.80620035.00E-050.00238636ENSG00000243295CTD-2185K10.1-4.626234695.00E-050.00238636ENSG00000235280MCF2L-AS1-4.620469115.00E-050.00238636ENSG00000279586AP000711.1-4.610292565.00E-050.00238636ENSG00000226792LINC00371-4.368216585.00E-050.00238636ENSG00000271945RP11-354K4.2-4.286555915.00E-050.00238636ENSG00000249706RP11-89B16.1-4.260281645.00E-050.00238636ENSG00000279146RP11-117L5.3-4.003386365.00E-050.00238636ENSG00000279923CTD-2008E3.1-3.944286885.00E-050.00238636ENSG00000279930LA16c-312E8.4-3.861042235.00E-050.00238636ENSG00000228035RP4-663N10.1-3.716003165.00E-050.00238636ENSG00000261055RP11-195M16.3-3.663663415.00E-050.00238636ENSG00000259291RP11-617F23.1-2.886146335.00E-050.00238636ENSG00000278948RP5-1039K5.12-2.704312415.00E-050.00238636ENSG00000259974LINC00261-2.676333939.00E-040.0332746ENSG00000280381RP11-197N18.8-2.06666080.000850.031875ENSG00000188242PP7080-1.728634990.000750.028952243 表1-8胃腺癌中前30位上调的差异表达的mRNAsTable1-8Thetop30up-regulateddifferentialexpressionmRNAsingastricadenocarcinomagene_idlog2FCpvalueFDRENSG000001967547.185.00E-050.00337364ENSG000001868326.795.00E-050.00337364ENSG000001284226.720.000650.0262905ENSG000002417946.555.00E-050.00337364ENSG000001703736.355.00E-050.00337364ENSG000001435465.625.00E-050.00337364ENSG000001195475.265.00E-050.00337364ENSG000001881005.225.00E-050.00337364ENSG000001595164.985.00E-050.00337364ENSG000001717114.875.00E-050.00337364ENSG000001435364.825.00E-050.00337364ENSG000001257804.670.000150.00830821ENSG000001499684.625.00E-050.00337364ENSG000001633474.490.000450.0198214ENSG000001654744.395.00E-050.00337364ENSG000001241024.390.000350.0161348ENSG000001693474.325.00E-050.00337364ENSG000001565104.150.000650.0262905ENSG000000999534.130.000150.00830821ENSG000001632074.135.00E-050.00337364ENSG000001676564.115.00E-050.00337364ENSG000002116604.070.0010.0363824ENSG000002577434.045.00E-050.00337364ENSG000001137224.035.00E-050.00337364ENSG000001879083.985.00E-050.00337364ENSG000001376733.977.00E-040.0280832ENSG000001690353.915.00E-050.00337364ENSG000001733913.895.00E-050.00337364ENSG000002636393.705.00E-050.00337364ENSG000001330483.695.00E-050.0033736444 表1-9胃腺癌中前30位下调的差异表达的mRNAsTable1-9Thetop30down-regulateddifferentialexpressionmRNAsingastricadenocarcinomagene_idlog2FCpvalueFDRENSG00000140538-8.495.00E-050.003374ENSG00000182333-7.915.00E-050.003374ENSG00000157017-7.422.00E-040.010417ENSG00000196482-6.645.00E-050.003374ENSG00000164128-6.190.001350.045544ENSG00000168079-5.560.00140.047017ENSG00000185615-5.085.00E-050.003374ENSG00000157445-4.955.00E-050.003374ENSG00000187045-4.935.00E-050.003374ENSG00000167779-4.825.00E-050.003374ENSG00000166165-4.705.00E-050.003374ENSG00000196616-4.665.00E-050.003374ENSG00000159197-4.535.00E-050.003374ENSG00000159212-4.525.00E-050.003374ENSG00000100604-4.465.00E-050.003374ENSG00000147606-4.432.00E-040.010417ENSG00000163394-4.375.00E-050.003374ENSG00000110195-4.365.00E-050.003374ENSG00000133800-4.365.00E-050.003374ENSG00000168702-4.175.00E-050.003374ENSG00000163815-4.105.00E-050.003374ENSG00000170561-4.092.00E-040.010417ENSG00000164764-4.080.001050.037923ENSG00000266964-4.070.000150.008308ENSG00000126218-4.065.00E-050.003374ENSG00000187922-4.030.001450.048368ENSG00000143196-3.935.00E-050.003374ENSG00000163328-3.875.00E-050.003374ENSG00000138615-3.855.00E-050.003374ENSG00000109956-3.710.00120.04181445 表1-10异常表达的mRNAs的GO富集分析Table1-10GOtermenrichmentofdysregulatedmRNAsGOIDGOtermsP-valueFDRCellcomponent(top5)GO:0031012extracellularmatrix8.79E-114.84E-07GO:0005576extracellularregion1.19E-106.57E-07GO:0031988membrane-boundedvesicle1.60E-108.79E-07GO:0005615extracellularspace1.64E-109.05E-07GO:0031982vesicle2.14E-101.18E-06Biologicalprocess(top5)GO:0007155celladhesion1.83E-101.01E-06GO:0022610biologicaladhesion2.16E-101.19E-06GO:0044763single-organismcellularprocess2.75E-101.52E-06GO:0044699single-organismprocess3.15E-101.73E-06GO:0050896responsetostimulus2.85E-091.57E-05Molecularfunction(top5)GO:0005509calciumionbinding2.63E-080.000145GO:0005102receptorbinding1.16E-070.000636GO:0004866endopeptidaseinhibitoractivity5.07E-060.0279GO:0061135endopeptidaseregulatoractivity7.81E-060.043GO:0005254chloridechannelactivity8.67E-060.047846 表1-11胃腺癌中异常表达的mRNAs的KEGG富集分析Table1-11KEGGpathwayenrichmentofdysregulatedmRNAsingastricadenocarcinomaItemsItems_DetailsFDRGeneshsa04971Gastricacidsecretion1.98E-05SLC9A4,CALML3,CFTR,ADCY2,KCNE2,KCNJ15,SLC26A7,KCNQ1,SSTR2hsa04610Complementandcoagulation5.21E-05F10,F2R,SERPINA1,C5,C8A,F5,CR2,C7cascadeshsa04972Pancreaticsecretion9.20E-05CFTR,CLCA4,ADCY2,CLCA2,KCNQ1,RYR2,TRPC1,CCKAR,PLA2G4Ehsa04640Hematopoieticcelllineage0.001457KIT,ITGA2,CSF3R,CSF3,CR2,MME,IL11RAhsa05322Systemiclupuserythematosus0.001691HIST1H2BM,C5,C8A,HIST1H2AE,HIST1H2BE,FCGR3A,C7hsa05020Priondiseases0.001992C5,C8A,C7hsa00480Glutathionemetabolism0.002214IDH2,GSTP1,RRM2,PGD,GSTA4hsa00980Metabolismofxenobioticsby0.002473AKR1C4,CYP2B6,DHDH,GSTP1,GSTA4,cytochromeP450ADH1Bhsa04060Cytokine-cytokinereceptor0.002843KIT,CXCL9,CXCL5,CXCL1,CCR8,LIFR,interactionEDA,TNFSF15,CSF3R,CSF3,IL11RAhsa00590Arachidonicacidmetabolism0.002877CYP2B6,ALOX12B,PTGIS,PLA2G4E,PTGS2hsa04640Hematopoieticcelllineage0.002996KIT,CSF3R,CSF3,IL11RAhsa00010Glycolysis/Gluconeogenesis0.00308FBP2,ALDOB,HKDC1hsa00051Fructoseandmannosemetabolism0.00308FBP2,ALDOB,HKDC1hsa04970Salivarysecretion0.003109CALML3,ADCY2,MUC5B,DMBT1,AQP5,CST1hsa04978Mineralabsorption0.003124MT2A,SLC26A9,HEPH,MT1E,SLC9A3hsa04020Calciumsignalingpathway0.003165ADCY2,RYR2,TRPC1,CCKARhsa05200Pathwaysincancer0.003449HIF1A,KIT,LAMA2,ITGA2,CSF3R,FGF13,GSTP1,WNT5A,BRCA2,LAMC2,PTGS2,MMP1hsa05412Arrhythmogenicrightventricular0.007626RYR2,LAMA2,ITGA2,CACNA2D3,CDH2cardiomyopathyhsa04630Jak-STATsignalingpathway0.007986CSF3R,CSF3,IL11RAhsa00532Glycosaminoglycanbiosynthesis-0.00833XYLT2,B3GAT1,CHST3chondroitinsulfateFDR:falsediscoveryrate.47 表1-12qRT-PCR验证胃腺癌和癌旁组织中的差异表达的lncRNAsTable1-12qRT-PCRvalidationofdysregulateddifferentialexpressionlncRNAsingastricadenocarcinomacomparedwithnon-tumortissues－△CTExpressionlevel（2）LncRNAZPTumorNontumor0.05010.0215SNHG32.73240.0065**(0.0252～0.0854)(0.0165～0.0232)ENSG0000020.11840.2194-2.00320.0452*59291(0.0976～0.2176)(0.1895～0.3268)ENSG0000020.05450.0742-2.15440.0312*79146(0.0347～0.0647)(0.0605～0.0886)LincRNA0.00070.0082-3.13710.0017**00261(0.0002～0.0017)(0.0031～0.0143)*representedP<0.05and**representedP<0.01.48 讨论胃癌在世界范围内是第五位最常见的癌症，致死率排名第三，每年大约新诊断胃癌100万人，大约70万人死于该病，占了世界癌症相关死亡的[37]10%。现阶段胃癌的诊断主要依靠电子胃镜结合病理学检查，以及相关的肿瘤标记物，如癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA199)和糖类抗原724(CA724)，但敏感性和特异性不高，同时，作为中晚期胃癌主要手段的手术和化疗效果较差，因此，人们在不断寻找能够作为胃癌诊断的生物学标志物和相关的治疗靶点。众多研究发现，长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)在肿瘤的形成和进展的过程中起到重要的作用。目前已经发现，在肿瘤组织[5-6]和正常组织中有一系列的差异表达的lncRNA，这些差异表达的[38-39]lncRNA有可能作为肿瘤诊断的标志物，甚至可以预测患者的预后。LncRNA参与到胃癌的发生、进展、转移的过程中，已证实H19、HOTAIR、MALAT-1、MEG3、Linc00152、Linc00261等lncRNA对胃癌的恶性生物[40-45]学行为起到重要的调控作用。但胃癌中大多数lncRNA的异常表达以及其调控和潜在的作用机制仍未明确，胃癌中lncRNA的病理生理作用需要进一步的研究和阐明。目前对lncRNA研究中较成熟的技术有基因芯片技术及转录组高通量测序[8]技术。转录组（transcriptome）指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有mRNA的集合。高通量转录组测序技术有以下优势：1）数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在交叉反应和背景噪音问题。2）高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。3）全基因组分析：无需预先设计特异性探针能够直接对任何物种进行转录组分析；同时能够检测未知基因，发现新的转[46]录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。在本实验中，我们应用高通量测序检测了3例胃腺癌患者的肿瘤组织和癌旁组织，进一步明确胃腺癌中异常表达的lncRNAs，结果分析显示，胃腺癌组织与癌旁组织相比，胃腺癌组织中具有2倍（|log2FC|>1）以上差异的长链非编码RNA有74条，其中上调长链非编码RNA有43条（表49 1），下调的有31条（FDR<0.05）（表2）；。上调长链非编码RNA差异最显著的为ENSG00000282408，上调了263倍（log2FC=8.04，FDR=0.002386），下调的长链非编码RNA差异最显著的为ENSG00000232352，下调至0.0079倍（log2FC=-6.99，FDR=0.002386）。通过高通量转录组测序我们还发现449条差异表达的mRNA，其中上调的mRNA共有238条，下调的mRNA共有211条。上调和下调最显著的mRNA分别为S100A2（log2FC=7.183158953，FDR=0.003374）和NTRK3（log2FC=-8.491899371，FDR=0.003374）。为了验证高通量测序结果的可靠性，我们选取4条长链非编码RNA进行Real-timePCR验证，分析得出高通量测序结果与验证结果一致，高通量测序结果是可靠的。本实验结果表明，与癌旁组织相比，胃腺癌组织中存在着差异表达的lncRNAs和mRNAs，提示在胃腺癌的发展、转移的过程中，差异表达的lncRNAs及mRNAs可能参与了某些调节过程。由于lncRNA本身并不编码蛋白质，它们能够调控基因的甲基化水[8]平、染色体修饰及招募蛋白、沉默基因等参与生物学过程的调控。本实验中通过GO分析发现差异表达基因中有72条结果具有显著意义，在细胞组分中最显著的富集在细胞外基质，胞外区；生物过程最显著的富集在细胞粘附和生物粘附；分子功能最显著的富集在钙离子结合和受体结合。KEEG通路分析发现筛选出的差异表达基因，有20条通路具有显著意义(表6)。胃酸分泌、补体途径、胰腺分泌、细胞因子及其受体相互作用、Jak-STAT信号通路是与胃腺癌相关的较显著的通路。我们还发现，一些与差异lncRNA共表达的差异mRNA显著的富集在以上的信号通路中。与LINC00261共表达的KCNJ15、与LINC00982共表达的SSTR2显著富集于胃酸分泌；与H19和HOTAIR共表达的CSF3R显著富集于癌症通路、JAK-STAT信号通路、细胞因子及其受体相互作用。近来的研究表明，H19、HOTAIR、LINC00261、LINC00982与胃癌的发生、发展、增[47-50]殖、侵袭、转移等生物学行为密切相关；JAK-STAT信号通路则是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。生理状态下，JAK-STAT通路的激活快速而短暂,而在人类原位肿瘤及肿瘤细胞株中，JAK-STAT[51]通路持续激活，持续活化的STATs(尤其是STAT3)可以通过刺激细胞增50 [52]殖、抑制细胞凋亡进而导致肿瘤的形成。研究表明，在胃癌中的[53]JAK-STAT通路异常激活。据此我们推测差异表达的lncRNAs在胃腺癌的形成及进展过程中起到了重要作用，但是其中哪些长链非编码RNA具有功能性，这些功能性lncRNA是如何参与肿瘤过程还要进一步验证。总之，我们本部分的工作成功利用高通量测序对胃腺癌与癌旁组织进行差异表达lncRNAs的筛选，为胃腺癌在lncRNAs层面的研究做出了初步探索以及为后续的相关研究提供了前期基础。小结1.LncRNA高通量测序结果显示，与癌旁组织相比，在胃腺癌组织中存在74条表达异常的lncRNA，其中上调的有43条，下调的有31条。2.高通量测序结果还显示在胃腺癌组织和癌旁组织中有449条差异表达的mRNA，其中上调的mRNA共有238条，下调的mRNA共有211条。3.选取差异表达的lncRNA通过qRT-PCR检测对测序结果进行验证，检测结果与高通量测序结果相一致，高通量测序结果可靠。参考文献1.FerlayJ,SoerjomataramI,DikshitR,etal.Cancerincidenceandmortalityworldwide:sources,methodsandmajorpatternsinGLOBOCAN2012[J].IntJCancer,2015,136(5):E359-386.2.ChenWQ,ZhengRS,BaadePD,etal.CancerstatisticsinChina,2015[J].CACancerJClin,2016,66(2):115-132.3.AjaniJA,BentremDJ,BeshS,etal.Gastriccancer,version2.2013:featuredupdatestotheNCCNGuidelines[J].JNatlComprCancNetw,2013,11(5):531-546.4.PrietoC,RisuenoA,FontanilloC,etal.Humangenecoexpressionlandscape:confidentnetworkderivedfromtissuetranscriptomicprofiles.PLoSOne,2008,3:e3911.51 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第二部分LncRNASNHG3在胃腺癌组织中的表达及临床意义前言[1]胃癌是严重威胁人类健康的全球性疾病之一，而我国每年胃癌新[2]发病例占世界新发病例40%以上，死亡率居于第二位。胃癌的病因涉及遗传因素、表观遗传因素、环境因素等多种因素及环节，具体机制尚未完全阐明。早期胃癌的治疗效果较好，在进展期胃癌的治疗中，手术、放疗、化疗是治疗的主要方法，但是易于局部淋巴结、肝脏、腹腔转移，预后较[3-4]差，5年生存率低于30%。为了能更有效的预防及治疗胃癌，就要从决定性基因入手，找到其影响因素，并能通过拮抗影响因子找到从根本解决胃癌的新方法。前期实验中，我们应用高通量转录本测序显示，与癌旁组织相比，在胃腺癌组织中存在表达差异达2倍以上的74条lncRNA，其中上调的有43条，下调的有31条，提示在胃腺癌生物学过程中，lncRNA发挥了重要作用。我们在发现的74条差异表达的lncRNA中，经检索文献，发现lncRNASNHG3在肝细胞肝癌中应用qRT-PCR检测其表达水平显著增高，与TheCancerGenomeAtlas(TCGA)中的肝细胞肝癌的结果一致(P<0.0001)；SNHG3的表达水平与肿瘤大小(P=0.003)、门静脉瘤栓(P=0.014)、复发(P=0.038)显著相关，高表达水平的SNHG3与总生存期(OS;P<0.0001)、无病生存期(DFS;P<0.0001)显著相关。多变量分析显示SNHG3是肝细胞肝癌的独立预后因素(P<0.001)。SNHG3可以作为肝细胞肝癌不良预后的指[5]标。在结直肠癌中，SNHG3表达显著上调，其异常高表达是结直肠癌病人不良预后的指标。功能获得和功能缺失试验显示SNHG3能够促进结直肠癌细胞的增殖，进一步研究发现SNHG3是通过作为内源性竞争性RNA(ceRNA)与miR-182-5p相互竞争，导致c-Myc表达升高并作用于c-Myc的目[6]的基因，从而促进了结直肠癌进展。lncRNASNHG5在胃癌的表达中显著降低，其可抑制胃癌细胞的增殖和转移，可以作为胃癌治疗的药物作用[7]靶点。而在胃癌中尚未有lncRNASNHG3的表达及临床意义的报道，因57 此，我们决定将lncRNASNHG3作为研究对象，对其在胃癌中的表达情况进行检测，并结合临床资料进行分析，通过与这些因素之间的关系探讨其可能的作用机制，为进一步探讨其作用奠定基础。材料与方法1研究对象收集2016年2月～2016年7月在河北医科大学第四医院手术切除的42例胃腺癌标本及5cm处胃粘膜组织标本，所有病例均经病理诊断证实为胃腺癌，除外合并其他恶性肿瘤、以及术前接受放疗、化疗和其他针对胃腺癌治疗的患者。其中男性32例，女性10例，年龄26~77岁，伴淋巴结转移者33例，TNM分期I期2例，II期10例，III期27例，IV期3例。该实验所用标本通过河北医科大学第四医院伦理委员会讨论通过，并征得患者知情同意。2实验仪器和试剂2.1主要仪器低温离心机美国Thermo公司高速冷冻离心机德国Eppendorf公司超低温冰箱Millus公司NanoDropND-2000美国NanoDrop公司Agilent2100Bioanalyzer美国Agilent公司Rotergene3000澳大利亚Corbett公司100-1000μl微量移液器美国Thermo公司20-200μl微量移液器美国Thermo公司10-100μl微量移液器美国Thermo公司2-20μl微量移液器美国Thermo公司0.5-10μl微量移液器美国Thermo公司0.1-2.5μl微量移液器美国Thermo公司洁净工作台美国FarmaScientific无酶1000μl吸头美国SSI公司无酶200μl吸头美国SSI公司58 无酶10μl吸头美国SSI公司无酶1.5mLEP管美国SSI公司PCR管美国SSI公司2.2主要试剂TRIzol试剂美国Invitrogen公司氯仿北京化工厂异丙醇上海化学试剂有限公司无水乙醇北京化工厂焦碳酸二乙醋(DEPC)美国sigma公司M-MLV反转录试剂盒美国promega公司SYBRGreenPCRMasterMix试剂全式金公司盒β-Actin引物上海生工公司目的基因引物上海生工公司3研究方法3.1组织标本的采集及处理冻存管高压灭菌备用，于手术室选取洁净区域，冻存管编号，组织样本离体后用生理盐水清洗血渍，取胃癌及距癌灶5cm远的癌旁组织各1块(约200mg)，将所取组织样本一式两份，一份送常规病理检查，一份尽快投入液氮中速冻。为减少RNA降解等情况发生，从样本离体到投入液氮的时间间隔不超过15分钟。液氮速冻后，组织样本保存在-80℃冰箱中。在标本记录本上详细记录患者信息。3.2.1组织样本RNA的提取同第一部分。3.2.2样品检测3.2.2.1RNA浓度及纯度测定同第一部分。3.2.2.2RNA完整性检测同第一部分。3.3RNA的逆转录1)每个样品取1μgRNA作为模板RNA，30μmmol/loligodT1ug放入59 PCR管中。2)70℃加热5分钟，冰上放置2分钟。3)5×逆转录缓冲液5uL，10mmol/ldNTP5uL，200U/μlM-MLVRT200units，加入DEPC水至25uL。4)混匀PCR管，37℃反应60分钟。85℃5分钟3.4qRT-PCR在NCBI网站检索到基因的序列，使用primer5软件设计引物，将设计好的引物交由上海生工公司合成。PrimersetnamePrimer(5＇to3＇)SNHG3-FAGACAGATTCGCAGTGGTCGSNHG3-RGTCTCCATGGCCCACTTCTGβ-Actin–FCACCCCAGCCATGTACGTTGβ-Actin–RAATGTCACGCACGATTTCCC3.4.1PCR反应体系：同第一部分。3.4.2PCR程序：同第一部分。3.5以β-Actin作为内参，计算组织中lncRNASNHG3表达量，△CT=CTlncRNA－CTβ-Actin；△△CT=（CTlncRNA－CTβ-Actin）实验组－（CTlncRNA－CTβ-Actin）对照组；癌组织和癌旁组织的表达量统计时，各样本的相对表达量=2-△CT，2－△△CT表示癌组织lncRNASNHG3表达量相对于癌旁组织的变化倍数。4统计学方法用SAS9.1对数据进行分析，正态计量资料采用平均数士标准差表示，非正态计量资料采用中位数M（P25～P75）表示，计量资料满足正态分布且方差齐同的比较，采用两组独立样本的t检验；方差不齐的非正态分布的计量资料采用秩和检验。计数资料采用卡方检验，当理论数＜5时，进行连续校正。以P＜0.05为差异有统计学意义。60 结果1RNA质量检测组织中的总RNA的OD260/OD280比值均在1.8-2.2之间，说明总RNA纯度是合格的，质量较好。凝胶成像系统显示提取的总RNA的28S条带的亮度大约是18S条带的2倍，提示总RNA完整性较好。2qRT-PCR2.1qRT-PCR的熔解曲线与扩增曲线qRT-PCR结束后，测定熔解曲线，β-Actin及LncRNASNHG3产物熔解曲线均为单一曲线（Fig.2-1），说明反应未出现非特异性扩增。qRT-PCR产物扩增曲线显示结果重复性好，实验精确度高，Fig.2-2为其中一组胃癌组织及癌旁组织的扩增曲线。2.2qRT-PCR结果结果如Fig.2-3所示:胃腺癌组织中lncRNASNHG3△CT值为4.87±1.38,癌旁组织中lncRNASNHG3△CT值为5.66±1.22,具有显著性差异(t=4.01,P=0.0002)。胃腺癌组织、癌旁组织的lncRNASNHG3相对表-△CT达量（2）分别是0.0358（0.0208～0.0860）、0.0215（0.0140～0.0330），具有显著性差异(Z=2.85,P=0.0043)，见Table2-1。42对样本中，有30对（71.4%，30/42）的胃腺癌组织的lncRNASNHG3表达量高于癌旁组织，其中20对（47.6%，20/42）的胃腺癌组织中lncRNASNHG3表达量是癌旁组织的2倍及2倍以上，见Fig.2-3。3LncRNASNHG3与临床病理的关系根据lncRNASNHG3在42例胃腺癌组织中的相对表达量是否≥2倍，将胃腺癌样本分为≥2倍组和＜2倍组。将lncRNASNHG3的表达水平与胃腺癌患者临床病理资料进行χ2检验统计分析发现，60.6%的胃腺癌T3+T4期患者lncRNASNHG3的表达≥2倍，而在T1+T2期胃腺癌患者lncRNASNHG3的表达均<2倍，具有显著性差异(χ2=8.1252，P=0.0044)。淋巴结转移组中有57.6%的患者lncRNASNHG3的表达≥2倍，在无淋巴结转移组有11.1%患者lncRNASNHG3的表达≥2倍，具有显著性差异(χ2=4.399，P=0.039)。TNM分期III+IV期患者63.33%的lncRNASNHG3的表达≥2倍，显著高于I+II期患者的8.33％(χ2=10.395，P=0.0013)。LncRNASNHG3的61 表达水平与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、分化程度、血管侵犯、神经侵犯无关，见Table2-2。62 附图AB图2-1胃腺癌与癌旁组织中lncRNASNHG3及β-Actin的熔解曲线Fig.2-1ThemeltingcurvesoflncRNASNHG3andβ-Actiningastricadenocarcinomaandadjacentnon-tumortissues.A:themeltingcurveofβ-Actin,B:themeltingcurveoflongnoncodingRNASNHG3.63 AB图2-2其中一组胃腺癌与癌旁组织lncRNASNHG3及β-Actin的扩增曲线Fig.2-2TheamplificationcurvesoflncRNASNHG3andβ-Actiningastricadenocarcinomaandadjacentnon-tumortissues.A:theamplificationcurveofβ-Actin(left)andlncRNASNHG3(right)innoncanceroustissues.B:theamplificationcurveofβ-Actin(left)andlncRNASNHG3(right)ingastriccarcinoma.64 **AB图2-3LncRNASNHG3在胃腺癌组织和癌旁组织中的表达Fig.2-3RelativeexpressionleveloflncRNASNHG3ingastricadenocarcinomatissueandadjacentnon-tumortissues.A:△CTValuesof-△△CTlncRNASNHG3.B:RelativeexpressionleveloflncRNASNHG3(2).**P＜0.0165 附表表2-1lncRNASNHG3在胃腺癌组织和癌旁组织中的表达Table2-1ExpressionoflncRNASNHG3ingastricadenocarcinomatissueandadjacentnon-tumortissues－△CTExpressionlevel（2）LncRNAZPTumorNontumor0.03580.0215SNHG32.850.0043**（0.0208～0.0860）（0.0140～0.0330）**representedP<0.01.66 表2-2lncRNASNHG3表达水平与胃腺癌临床病理资料关系Table2-2RelationshipsbetweenlncRNASNHG3expressionwithclinicopthologicfeatures(N=42)LncRNASNHG3CharacteristicCasesχ2P-Value≥2倍<2倍Age(Year)0.3490.554<601910（43.5%）13(56.5%)≥602310（52.6%）9(47.4%)Gender0.3050.581Male3216（50.0%）16（50.0%）Female104（40.0%）6（60.0%）Tumorsiz0.0010.976<5cm2311（47.8%）12（52.2%）≥5cm199（47.4%）10（52.6%）Differentiation0.1550.925poorly189（50.0%）9（50.0%）poorly-moderately167（43.8%）9（56.2%）moderately84（50.0%）4（50.0%）Tstage8.12520.0044**T1+T290（0.0%）9（100.0%）T3+T43320（60.6%）13（39.4%）Lymphnode4.3990.0359*metastasispositive3319（57.6%）14（42.4%）negative91（11.1%）8（88.9%）TNM10.3950.0013**I+II121（8.33%）11（91.67%）III+IV3019（63.33%）11（36.67%）Tumorlocation0.9890.611cardia137（53.9%）6（46.1%）gastricbody93（33.3%）6（66.7%）gastricantrum2010（50.0%）10（50.0%）Vascularinvasion0.3240.569positive179（52.9%）8（47.1%）negative2511（44.0%）14（56.0%）Nerveinvasion0.1050.746positive2211（50.0%）11（50.0%）negative209（45.0%）11（55.0%）*indicatedP<0.05,**indicatedP<0.0167 讨论在人类基因组序列中,仅有1.5%的核酸序列用于蛋白质编码,而占据人类基因组98.5%的是非蛋白编码序列,非编码RNA是一大类不具有蛋白[8]编码潜能的RNA转录本,不具有开放阅读框，无蛋白翻译功能。这些转录体包括小分子非编码RNA以及长链非编码RNA。小分子非编码RNA主要分为以下几类：microRNA、snoRNA(smallnucleolarRNA)、siRNA(smallinterferingRNA)、piwi-associatedRNA、scaRNA以及snRNA[9]（smallnuclearRNAs）。研究发现核仁小分子RNA（snoRNAs）以及snoRNAs的失调在癌症的发生与发展过程中发挥重要作用。核仁小分子RNA宿主基因3(SNHG3)是一种lncRNA，也称为核仁小分子RNAU17的宿主基因(U17HG)，位于1p35.3。基因内的U17核仁小分子RNA宿主基因最初由PelczarP发现。这位学者将人类和老鼠的U17HG进行对比，发现在[10]两个物种间核仁小分子RNA仅编码内含子，并且没有蛋白编码特性。[11]程威发现，在鼠纤维原细胞L929中，SNHG3对RCCl具有负调控的作用。[12]Lin等发现，在胃癌中，RCCl经常在低分化的胃癌细胞株和胃癌组织中缺失，并且与胃癌的浸润深度相关，有可能起到了抑癌因子的作用。Huang等发现，在结直肠癌中，SNHG3作为内源性竞争性RNA(ceRNA)与miR-182-5p相互竞争，导致c-Myc过表达并作用于c-Myc的目的基因，从而促进了结直肠癌进展。这些将研究结果提示，SNHG3有可能在肿瘤的发生、发展中起到了重要作用。本实验中，应用qRT-PCR方法，检测了42例胃腺癌组织样本和癌旁组织中的lncRNASNHG3的表达情况，发现胃腺癌组织中lncRNASNHG3△CT值为4.87±1.38,癌旁组织中lncRNASNHG3△CT值为5.66±1.22,具有显著性差异(t=4.01,P=0.0002)。胃腺癌组织、癌旁组织的-△CTlncRNASNHG3相对表达量（2）分别是0.0358（0.0208～0.0860）、0.0215（0.0140～0.0330），具有显著性差异(Z=2.85,P=0.0043)。我们前期的高通量测序及qRT–PCR验证的结果提示lncRNASNHG3在胃腺癌组织中高表达，二者结果一致。42对样本中，有30对（71.4%，30/42）的胃腺癌组织的lncRNASNHG3表达量高于癌旁组织，其中20对（47.6%，20/42）的胃腺癌组织中lncRNASNHG3表达量是癌旁组织的2倍及2倍68 以上。这些结果说明，胃腺癌组织中lncRNASNHG3明显表达上调，提示了SNHG3可能在胃腺癌的发生发展中发挥着类似癌基因的作用。将lncRNASNHG3的表达水平与胃腺癌患者临床病理资料进行χ2检验统计分析发现，60.6%的胃腺癌T3、T4期患者lncRNASNHG3的表达≥2倍，而在T1、T2期胃腺癌患者无一例lncRNASNHG3的表达≥2倍的，具有显著性差异(χ2=8.1252，P=0.0044)。淋巴结转移组中有57.6%的患者lncRNASNHG3的表达≥2倍，在无淋巴结转移组有11.1%患者lncRNASNHG3的表达≥2倍，具有显著性差异(χ2=4.399，P=0.039)。TNM分期III+IV期患者63.33%的lncRNASNHG3的表达≥2倍，显著高于I+II期患者的8.33％(χ2=10.395，P=0.0013)。这说明胃腺癌组织中lncRNASNHG3的表达水平与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关，提示lncRNASNHG3在胃腺癌的发生、发展、侵袭、转移的过程中发挥了重要作用，但其具体的功能以及lncRNASNHG3调控胃癌进展、转移的具体机制需要进一步的体外实验去证实和明确。小结1.与癌旁组织相比，LncRNASNHG3在胃腺癌组织中的表达水平显著上调。2.胃腺癌组织中lncRNASNHG3的表达水平与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关，提示lncRNASNHG3在胃腺癌的发生、发展、侵袭、转移的过程中发挥了重要作用。3.LncRNASNHG3的表达水平与胃腺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、分化程度、血管侵犯、神经侵犯无关。参考文献1.SiegelR,MaJ,ZouZ,etal.Cancerstatistics,2014.CACancerJClin,2014,64(1):9-29.2.ChenW，ZhengR，BaadePD，etal．CancerstatisticsinChina，2015[J].CAcancerJClin,2016,66(2):115-132.69 3.IlsonDH.Adjuvanttreatmentforgastriccancer:toomuchisnotenough[J].LancetOncol,2014,15(8):788-789．4.BagcchiS.Radiotherapyfortesticularcancerincreasesgastriccancerrisk[J].LancetOncol,2014,15(13):e593．．5.ZhangT，CaoC，WuD，etal.SNHG3correlateswithmalignantstatusandpoorprognosisinhepatocellularcarcinoma[J].TumourBiol,2016,37(2):2379-2385.6.HuangW,TianY,DongS,etal.Thelongnon-codingRNASNHG3functionsasacompetingendogenousRNAtopromotemalignantdevelopmentofcolorectalcancer[J].OncolRep,2017,38(3):1402-1410.7.ZhaoL,GuoH,ZhouB,etal.Longnon-codingRNASNHG5suppressesgastriccancerprogressionbytrappingMTA2inthecytosol[J].Oncogene,2016,35(44):5770-5780.8.YangF,YiF,ZhengZG,etal.Characterizationofacarcinogenesis-associatedlongnon-codingRNA.RNABiol,2012,9(1):110-116.9.MattickJS,MakuninIV.Non-codingRNA[J].HumMolGenet,2006,15SpecNo1:R17-29.10.PelczarP.ThehostgeneforintronicU17smallnucleolarRNAsinmammalshasnoprotein-codingpotentialandisamemberofthe5′-terminaloligopyrimidinegenefamily.MolCellBiol,1998,18(8):4509-4518.11.程威.L929细胞中U17HG对RCC1的负调控及其对TNF引起的细胞死亡的影响[D].厦门：厦门大学，2008,3-77.12.Yi-LingLin,Hsiao-LingChen,Shao-BinCheng，etal.Methylation-silencingRCC1expressionisassociatedwithtumorigenesisanddepthofinvasioningastriccancer[J].IntJClinExpPathol,2015,8(11):14257-14269.70 第三部分LncRNASNHG3对胃癌细胞株生物学功能的影响及初步机制研究前言近年来大量正在进行的研究已表明lncRNA参加了多种不同的生物[1][2][3][4-6]学过程，诸如发育、细胞分化、包括癌症在内的多种疾病，其几乎能参与整个生命周期基因调控的每一步：包括染色体剂量补偿，印迹，[7]表观遗传调控，转录，mRNA剪接和翻译等。按照lncRNA分子功能的不同,研究人员将长链非编码RNA分为4种：(1)信号分子;(2)诱饵分子;[8](3)引导分子;(4)支架分子，它们在基因表观遗传调控、转录调控及转录后调控等层面起到重要调节作用,起到促进或者抑制肿瘤发生发展的作用[9-11]。随着新一代测序等技术发现的大量的新的lncRNA，其功能尚未明确，这需要行进一步的功能试验明确lncRNA在肿瘤发生进展中的作用及机制，为肿瘤的治疗提供新的思路。前期我们在胃腺癌组织及癌旁组织中通过高通量测序及qRT-PCR的方法，发现长链非编码RNASNHG3在胃腺癌组织中异常高表达，通过结合临床病理分析发现，60.6%的胃腺癌T3、T4期患者lncRNASNHG3的表达≥2倍，而在T1、T2期胃腺癌患者无一例lncRNASNHG3的表达≥2倍的，具有显著性差异(χ2=8.1252，P=0.0044)。淋巴结转移组中有57.6%的患者lncRNASNHG3的表达≥2倍，在无淋巴结转移组有11.1%患者lncRNASNHG3的表达≥2倍，具有显著性差异(χ2=4.399，P=0.039)。TNM分期III+IV期患者63.33%的lncRNASNHG3的表达≥2倍，显著高于I+II期患者的8.33％(χ2=10.395，P=0.0013)。这说明胃腺癌组织中lncRNASNHG3的表达水平与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关，提示lncRNASNHG3在胃腺癌的发生、发展、侵袭、转移的过程中发挥了重要作用，在本部分实验中，通过体外实验干扰胃癌细胞系中lncRNASNHG3的表达，观察lncRNASNHG3表达改变后胃癌细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的变化，明确lncRNASNHG3对胃癌细胞增殖、侵袭71 等的影响;并收集lncRNASNHG3不同处理组胃癌细胞系的总蛋白，检测lncRNASNHG3表达变化后，STAT3、MMP2、P-STAT3蛋白表达的变化，明确lncRNASNHG3表达变化对STAT3、MMP2基因表达的影响，初步探讨lncRNASNHG3调控胃癌发生进展的机制。材料与方法1研究对象人胃癌细胞株SGC-7901、正常胃黏膜上皮GES1，均为河北医科大学第四医院科研中心提供；人胃癌细胞MGC-803：购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心；人胃腺癌细胞BGC-823：购于赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。2实验仪器和试剂2.1主要仪器低温离心机美国Thermo公司高速冷冻离心机德国Eppendorf公司超低温冰箱Millus公司倒置荧光显微镜（NikonCi-S）日本Nikon公司凝胶成像及分析系统美国Bio-Rad电泳仪美国Bio-Rad分光光度计美国GEBDAccuriC6流式细胞仪美国BD公司Transwell小室美国Corning公司MultiskanMirco-platereader美国Thermo公司VE180Mini-protean3Dodeca中国TanonVE186TBC中国TanonPowerPacHCPowerSupply美国BioRadPHmeter德国SartoriusshakerKylin-Bellhomogenizer德国Fluko无酶200μl吸头美国SSI公司72 无酶10μl吸头美国SSI公司无酶1.5mLEP管美国SSI公司PCR管美国SSI公司细胞培养瓶美国Corning公司6孔板美国Corning公司24孔板美国Corning公司96孔板美国Corning公司2.2主要试剂1640培养基美国Gibco公司胎牛血清美国Gibco公司胰酶溶液美国Gibco公司DMEM培养液美国HycloneLipofectamin2000试剂美国Invitrogen公司青霉素/链霉素双抗溶液美国Gibco公司氯仿上海化学试剂有限公司异丙醇上海化学试剂有限公司无水乙醇上海化学试剂有限公司焦碳酸二乙醋(DEPC)上海化学试剂有限公司总RNA极速抽提试剂盒RNAfast200中国飞捷生物公司M-MLV反转录试剂盒美国promega公司SYBRGreenPCRMasterMix试剂全式金公司盒β-actin引物上海生工公司PVDF膜美国Millipore公司Acrylamide美国AmrescoBis-Acrylamide美国AmrescoGlycine美国SigmaSDS美国SigmaAPS美国AmrescoTEMED美国Amresco73 Tween-20美国AmrescoBromphenolBlue美国AmrescoDTT美国AmrescoTrizmabase美国SigmaProteaseinhibitorcocktail瑞士RocheNon-fatmilkErieECL美国Millipore公司Methanol(dried)SinopharmNaClSinopharmgoatantirabbitIgG（H+L），HRP美国JacksongoatantimousIgG（H+L），HRP美国Jackson3研究方法3.1细胞培养3.1.1细胞复苏将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15mL离心管中混合均匀。在1000rpm条件下离心4min，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5mL培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液，倒置显微镜下观察细胞形态，确保细胞状态良好。3.1.2细胞传代当细胞密度达80%-90%，即进行传代培养。操作步骤如下：1)弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次；2)加2mL胰酶于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3mL此细胞的含有10%胎牛血清及双抗RPMI1640培养基终止消化；3)轻轻吹打后吸出，移入15mL离心管中，在1000rpm条件下离心4min，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀；4)移入到事先准备好的含有5mL培养基的T-25培养瓶中或含有14mL培养基的T-75培养瓶中培养。3.1.3细胞冻存74 待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法的细胞传代步骤进行，最后的重悬液使用血清。悬浮细胞直接计数后离心，用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1mL的数66量分配到冻存管中。每个冻存管细胞数目大于1×10个细胞，通常为5×10个细胞冻存。3.2qRT-PCR3.2.1RNA提取1)悬浮培养细胞离心收集，留下细胞团块和适量上清，使细胞浓度7<2×10/mL，充分震荡直至没有细胞团块，取100μL细胞悬液放入1.5mLeppendorf中；2)在处理好的样本管中，加入RA2液500μL，充分颠倒混匀5-10次，静置1min;3)将样本裂解物全部吸入或倒入内套管，12000rpm离心1min；4)取出内套管，吸去外套管中液体后放回内套管，加入500μL洗液，12000rpm离心1min；5)重复步骤四再洗一次；6)取出内套管，吸去外套管中液体后放回内套管，不加洗液，12000rpm离心1min；7)将内套管移入新的1.5mLeppendorf管，在膜中央加入1‰DEPC水25μL；8)室温静置1min后，离心1min，获得总RNA；9)取2µLRNA用Nanodrop测浓度；10)取2µLRNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳质检。3.2.2反转录1)每个样品取1μgRNA作为模板RNA，30μmmol/LoligodT1ug放入PCR管中。2)70℃加热5分钟，冰上放置2分钟。3)5×逆转录缓冲液5uL，10mmol/LdNTP5uL，200U/μLM-MLVRT200U，加入DEPC水至25uL。4)混匀PCR管，37℃反应60分钟。85℃5分钟75 3.2.3在NCBI网站检索到基因的序列，使用primerprimer5软件设计引物，将设计好的引物交由上海生工公司合成。PrimersetnamePrimer(5＇to3＇)SNHG3-FAGACAGATTCGCAGTGGTCGSNHG3-RGTCTCCATGGCCCACTTCTGβ-Actin–FCACCCCAGCCATGTACGTTGβ-Actin–RAATGTCACGCACGATTTCCCPCR反应体系：同第一部分。PCR程序：同第一部分。3.2.4以β-Actin作为内参，计算细胞中lncRNASNHG3表达量，△△CT－△△CT=（CTlncRNA－CTβ-Actin）实验组－（CTlncRNA－CTβ-Actin）对照组，2表示胃癌细胞lncRNASNHG3相对表达量。3.3转染3.3.1SNHG3-siRNA合成有上海吉玛制药技术有限公司设计合成SNHG3三条特异性小干扰RNA（SNHG3-siRNA）序列，序列为：SNHG3-siRNA1F:5’-GCAUUUAGCUAGGAAUGCATT-3’R:5’-UGCAUUCCUAGCUAAAUGCTT-3’SNHG3-siRNA2F:5’-CUAGCAUGAUAGCUUCAGUTT-3’R:5’-ACUGAAGCUAUCAUGCUAGTT-3’SNHG3-siRNA3F:5’-GGGAUCAUCUAGAAGGUAATT-3’R:5’-UUACCUUCUAGAUGAUCCCTT-3’NC-siRNAF:5’-ACUGCGACUGCUUCACUUGTT-3’R:5’-CAAGUGAAGCAGUCGCAGUTT-3’3.3.2转染步骤76 1)将细胞转接到6孔板中，待细胞汇合至70～80%进行转染。2)制备siRNA-Lipofectamine2000复合物。a、用250uLOpti-MEM培养基稀释siRNA，轻轻混匀；b、Lipofectamine2000使用前，轻轻混匀，用250uLOpti-MEM培养基稀释相应体积的Lipofectamine2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20min，使siRNA-Lipofectamine2000复合物形成；同时，将6孔板中的培养基换成Opti-MEM培养基。3)20min后，将500uLsiRNA-Lipofectamine2000复合物加入含细胞的6孔板中，轻轻8字摇匀；4)放入37度孵箱中培养4-6小时后，换液。5)培养24小时后收取细胞，加入1mLTrizol，-80冻存待用。3.3.3转染条件筛选转染前将合成的siRNA溶解为浓度为20μmol/L的溶液。按照下表进行三条siRNA的筛选。实验分组：BC：未经转染的MGC-803和BGC-823细胞；NC：转染非特异性siRNA的MGC-803和BGC-823细胞；siRNA：转染lncRNASNHG3-siRNA的MGC-803和BGC-823细胞。组别siRNALip2000培养器皿培养液体积BCH2O6uL5uL6孔板2mLNC100pmol5uL6孔板2mLsiRNA1100pmol5uL6孔板2mLsiRNA2100pmol5uL6孔板2mLsiRNA3100pmol5uL6孔板2mLMGC-803和BGC-823细胞在转染后提取细胞总RNA，反转录成cDNA后，qRT-PCR检测lncRNASNHG3的表达水平变化，β-Actin为内－△△CT参，步骤均同3.2.。抑制效率=(1-2)X100%。挑选抑制效率最大且大于70%的一条序列siRNA1siRNA1用于下一步研究。按照下表进行siRNA1量的筛选。组别siRNA1Lip2000培养器皿培养液体积BCH2O6ul5ul6孔板2ml77 NC100pmol5uL6孔板2mLsiRNA25pmol25pmol5uL6孔板2mLsiRNA50pmol50pmol5uL6孔板2mLsiRNA100pmol100pmol5uL6孔板2mL3.4实验分组BC(Blankcontrol)组：未经转染的MGC-803和BGC-823细胞NC(Negativecontrol)组：转染非特异性siRNA的MGC-803和BGC-823细胞siRNA1组：转染lncRNASNHG3-siRNA1的MGC-803和BGC-823细胞3.5CCK-8检测敲低lncRNASNHG3对胃癌细胞株增殖能力的影响41)将不同组的细胞悬液分别以5×10个/mL，100μL/孔接种在96孔板中。每组设3复孔，在培养箱培养24h（37℃，5%CO2）；2)将细胞培养板在培养箱孵育48h；3)在相应的时间点，向每孔加入10μLCCK-8溶液（注意不在孔中生成气泡，否则会影响读数）；4)将培养板在培养箱内孵育1h；5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。以上实验重复3次。3.6克隆形成实验检测敲低lncRNASNHG3对胃癌细胞株体外克隆形成能力的影响3.6.1样品制备1)取已转染的对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮相应的培养液中备用。2)分别将细胞悬液倍数稀释后接种到含2mL37℃预温培养液的6孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。37℃5%CO2及饱和湿度培养1～2周。3.6.2细胞固定、染色及计数1)经常观察细胞状态，当6孔板中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞2mL固定15分钟。然后去固定液，加适量0.1%结晶紫染色液染色10分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。78 2)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，倒置显微镜下观察5个视野，计数细胞克隆数，计算克隆形成率。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%.3.7流式细胞术检测敲低lncRNASNHG3对胃癌细胞株细胞周期及凋亡情况的影响3.7.1样品制备51)将细胞悬液以2×10个/mL，2mL/孔接种在6孔板中。在培养箱培养24h（37℃，5%CO2）；2)去除培养基，PBS洗2遍，按照实验方案加入2mL/孔含不同浓度药物的培养基，并在培养箱中孵育相应时间；3)弃去培养基，用PBS洗2次，吸去PBS，加入0.25%无EDTA胰蛋白酶，置于37℃培养箱中消化，镜检细胞脱落；4)加入新鲜的含血清培养液终止胰酶消化，将细胞轻轻吹打分散，收集细胞至1.5mLEP管中，2000rpm离心3min，弃上清，准备进行细胞周期检测和凋亡检测。3.7.2细胞周期检测1)按照细胞周期检测试剂盒说明书操作：a)用4℃预冷的PBS洗细胞两次，吸去上清；b)每管加入500μLPI染液和5μL破膜剂；c)室温避光孵育30min；d)将含有PI的细胞悬液用滤网过滤至新管中，准备上机。2)上机检测：在FSC-SSC散点图中圈出活细胞群的门，每个样品收集门内1～2万个细胞。3)数据分析：用Modfit软件对细胞周期数据进行分析。3.7.3凋亡检测样本准备按照细胞凋亡检测试剂盒说明书操作：1)用去离子水按照1:10的比例稀释结合缓冲液；2)用4℃预冷的PBS洗细胞两次，用100μL结合缓冲液重新悬浮细胞；3)每管加入5μLAnnexinV-FITC和10μL20μg/mL碘化丙啶溶液，室温避光孵育15min；79 4)在每个反应管中补加400μL结合缓冲液，准备上机。3.7.4流式细胞仪检测1)上机检测：a)在FSC-SSC散点图中圈出活细胞群的门；b)每个样品收集门内10000个细胞。2)数据分析：a)在FL1-FL2散点图中对细胞进行四象限划分，调整补偿参数至细胞团分别落入不同象限：死细胞团在第一象限（右上），活细胞团在第三象限（左下），凋亡细胞团在第四象限（右下）。b)获取凋亡比例数据。3.8Transwell小室实验检测敲低lncRNASNHG3对胃癌细胞株体外迁移及侵袭力的影响3.8.1Transwell迁移实验方法1)MGC-803/BGC-823细胞分别按照给药条件进行转染，48h后收集细胞；2)分别向transwell板的上室和下室各加入200μL和600μL无血清DMEM培养液，37℃平衡1h；3)消化、收集各组转染后的细胞，无血清培养液清洗2次，细胞计数，5加无血清培养液悬浮细胞至2.5×10个/mL；4)吸去孔中平衡培养液，下室用PBS清洗2次；5)向上室中加入200μL含0.5%BSA的悬浮细胞液，下室加入750μL含10%血清的DMEM培养液，37℃，5%CO2，培养48h；6)弃去上、下室培养液，用PBS轻吹侧壁，清洗2次；7)加入4%多聚甲醛（上室加满，下室适量，约850μL）固定20min；8)吸去固定液，PBS清洗细胞2次；9)将500μL0.1%(g/mLPBS)结晶紫染色液加入相应的空白孔，将清洗后的小室放入染色液中，染色20min;10)弃去染色液，用棉球小心擦去小室上表面细胞，用PBS清洗上室细胞2次；11)将小室放在载玻片上或洁净24孔板孔中，随机选取5个视野，200×倒置显微镜下观察并采集图像。80 3.8.2侵袭实验1)将Matrigel基质在4℃下溶解，预冷无菌枪头和无血清DMEM培养基；2)Transwell小室用无血清DMEM培养基平衡；3)将Matrigel基质和无血清DMEM置于冰上，用预冷无菌枪头将Matrigel和DMEM按1:5体积混合后，以50μL/well加入transwell小室中；4)在37℃中放置3~5小时，胶凝固后方可使用。5)MGC-803/BGC-823细胞分别按照给药条件进行转染，48h后收集细胞；6)分别向transwell板的上室和下室各加入200μL和600μL无血清DMEM培养液，37℃平衡1h；7)消化、收集各组转染后的细胞，无血清培养液清洗2次，细胞计数，5加无血清培养液悬浮细胞至2.5×10个/mL；8)吸去孔中平衡培养液，下室用PBS清洗2次；9)向上室中加入200μL含0.5%BSA的悬浮细胞液，下室加入750μL含10%血清的DMEM培养液，37℃，5%CO2，培养48h；10)弃去上、下室培养液，用PBS轻吹侧壁，清洗2次；11)加入4%多聚甲醛（上室加满，下室适量，约850μL）固定20min；12)吸去固定液，PBS清洗细胞2次；13)将500μL0.1%(g/mLPBS)结晶紫染色液加入相应的空白孔，将清洗后的小室放入染色液中，染色20min;14)弃去染色液，用棉球小心擦去小室上表面细胞，用PBS清洗上室细胞2次；15)将小室放在载玻片上或洁净24孔板孔中，随机选取5个视野，200×倒置显微镜下观察并采集图像。3.9Westernblot检测敲低lncRNASNHG3后各组细胞相关蛋白表达的变化3.9.1溶液配制1.0mol/LTris·HClTris(MW121.14)30.29g81 蒸馏水200mL溶解后，用浓盐酸调pH至所需点，最后用蒸馏水定容至250mL，高温灭菌后室温下保存。PH调节：PHHCl6.8约18mL8.0约6mL1.74mg/mL(10mmol/L)PMSFPMSF0.174g异丙醇100mL溶解后，分装于1.5mL离心管中，-20℃保存。10％SDSSDS10g蒸馏水至100mL50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10％过硫酸胺（APS）过硫酸胺0.1g超纯水1.0mL溶解后，4℃保存，保存时间为1周。1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）Tris(MW121.14)45.43g超纯水200mL溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250mL，室温下保存。0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）Tris(MW121.14)15.14g超纯水200mL溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250mL，室温下保存。30％Acr/Bic丙稀酰胺（Acr）29g82 甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g超纯水100mL溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。还原型5XSDS上样缓冲液0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）2.5mL二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）0.39gSDS0.5g溴酚蓝0.025g甘油2.5mL混匀后，分装于1.5mL离心管中，4℃保存。电泳液缓冲液Tris（MW121.14）3.03g甘氨酸（MW75.07）18.77gSDS1g蒸馏水至1000mL溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。转移缓冲液甘氨酸（MW75.07）2.9gTris（MW121.14）5.8gSDS0.37g甲醇200mL蒸馏水至1000mL溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。10X丽春红染液丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g蒸馏水至100mL使用时将其稀释10倍。TBS缓冲液、TBST缓冲液TBS缓冲液1mol/LTris·HCl（pH7.5）10mL83 NaCl8.8g蒸馏水至1000mL（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）TBST缓冲液20％Tween201.65mLTBS700mL混匀后即可使用，最好现用现配。封闭液脱脂奶粉/BSA5g/3gTBST100mL12％分离胶和5％浓缩胶：试剂12％分离胶（10mL）5％浓缩胶（5mL）双蒸水3.3mL3.4mL30%Acrylamide4.0mL0.83mL1.5mol/LTrisHCl(pH8.8)2.5mL―0.5mol/LTrisHCl(pH6.8)―0.63mL10%SDS100μL50μL过硫酸铵（AP）100μL50μLTEMED4μL5μL加入TEMED后要快速混匀制胶，否则将很快凝固。3.9.2蛋白抽提预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂Proteaseinhibitorcocktail（Roche）（磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂），细胞沉淀样本加入RIPA裂解液，冰上孵育30min，13000rpm（4℃）离心30min。取上清，分装-80℃保存，待测。3.9.3BCA法蛋白定量按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明操作，测定蛋白浓度。1)根据样品数量，试剂A：B=50:1配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。2)完全溶解蛋白标准品，取10μL稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL。3)将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加至96孔板的标准品孔中，84 并用标准品稀释液补足20μL。4)将待测样品滴加至样品孔中，用标准品稀释液补足20μL。5)各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置30min。6)测定A562nm，绘制标准曲线图并计算蛋白浓度。7)以RIPA调整蛋白浓度，样品终浓度为8ug/uL，加入5×蛋白样品缓冲液，95℃10min。3.9.4Westernblot实验1)根据目的蛋白的分子量，配制12%分离胶，浓缩胶浓度为5%。2)待检测蛋白样品上样量：根据目的基因表达不同，选择40～120μg/孔。3)电泳条件：浓缩胶恒压80V，约20min；分离胶恒压120V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。4)湿转法，转膜条件：300mA恒流；0.22μm孔径PVDF膜，转膜时间90min。5)封闭：将膜完全浸没于5%脱脂牛奶-TBST中，水平摇床孵育1h（RT）。6)一抗孵育：5%脱脂牛奶-TBST稀释一抗，4℃水平摇床孵育过夜。7)次日，洗膜：TBST洗3次，每次15min。8)二抗孵育：5%脱脂牛奶-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG（H+L）HRP或山羊抗鼠IgG（H+L）HRP1:5000，室温孵育1h。洗膜：TBST洗膜3次，每次15min。9)ECL发光液化学发光显色法曝光，曝光时间为2~30min不等。采用Bio-RadImageLab5.2.1软件，对WB条带做灰度扫描并计算每个条带的总灰度值。以目的条带灰度值除以actin条带灰度值，作为目的条带的相对表达量。3.10统计学处理:应用SAS9.1软件进行统计学分析，计量资料采用平均数士标准差表示，计量资料满足正态分布且方差齐同，采用两组独立样本的t检验，方差不齐时应用t’检验，P<0.05差异有统计学意义。85 结果1.qRT-PCR检测不同胃癌细胞株中lncRNASNHG3表达情况qRT-PCR结果显示，与胃正常粘膜上皮细胞GES1相比，lncRNASNHG3的相对表达量由低到高依次为：人胃癌细胞株SGC-7901（1.3937±0.3699）、人胃癌细胞株MGC-803（1.992±0.0985）、人胃癌细胞株BGC-823（2.354±0.5019），见Fig.3-1。与胃正常粘膜上皮细胞GES1相比，人胃癌细胞株MGC-803、BGC-823的lncRNASNHG3的相对表达量显著增高（MGC-803：t=17.44,P=0.0033;BGC-823：t=4.67,P=0.0429）。依据胃癌细胞株中lncRNASNHG3的相对表达量，我们选择人胃癌细胞MGC-803、人胃癌细胞BGC-823进行下一步的细胞功能试验。2.转染条件的筛选将构建的3个小干扰RNA序列(siRNA1,siRNA2,siRNA3)转染MGC-803和BGC-823细胞,提取细胞的总RNA,反转录成cDNA后，qRT-PCR检验其抑制效率。结果见Fig.3-2A、B所示:siRNA1,siRNA2均可有效抑制MGC-803和BGC-823细胞的lncRNASNHG3的表达水平，但siRNA1抑制效率最高，达85.4%（MGC-803，P<0.01）和89.9%(BGC-823，P<0.05)，故将其用于后续试验。应用siRNA1不同的量进行转染MGC-803和BGC-823细胞,提取细胞的总RNA,反转录成cDNA后，qRT-PCR检验其抑制效率。结果见Fig.3-2C、D所示:siRNA1应用25pmol、50pmol、100pmol均可有效敲低BGC-823细胞lncRNASNHG3的表达水平，siRNA1应用100pmol可有效敲低MGC-803细胞lncRNASNHG3的表达水平。siRNA1100pmol时抑制效率最高，在MGC-803和BGC-823细胞分别达73.0%（MGC-803，P<0.05）和68.9%(BGC-823，P<0.01)，故在后续试验siRNA1用量选为100pmol。3.CCK-8检测敲低lncRNASNHG3对胃癌细胞株MGC-803和BGC-823增殖能力的影响为了观察敲低lncRNASNHG3之后胃癌细胞MGC-803和BGC-823增殖能力的影响增殖能力是否受到影响，我们进行了CCK-8实验。其结果显示见Fig.3-3:敲低lncRNASNHG3的表达后，MGC-803和BGC-82386 细胞siRNA1组的增殖能力均显著低于BC组（MGC-803，P<0.01；BGC-823，P<0.01），而BC组和NC组均无显著差异（P＞0.05），这提示敲低lncRNASNHG3的表达后，MGC-803和BGC-823细胞增殖能力均受到显著抑制。4.敲低lncRNASNHG3对胃癌细胞MGC-803和BGC-823克隆形成能力的影响克隆形成实验作为CCK-8实验的补充和佐证，从另一个角度反映了细胞的增殖能力。克隆形成实验结果显示见Fig.3-4:siRNA1组的MGC-803和BGC-823细胞所形成的细胞集落数量显著低于BC组(MGC-803:P＜0.01,BGC-823:P＜0.01)，而BC组和NC组间则无显著性差异。上述结果表明，敲低lncRNASNHG3后，胃癌细胞株MGC-803和BGC-823的克隆形成能力减弱，提示lncRNASNHG3在胃癌发生发展及克隆性增殖过程中发挥了一定作用。5.流式细胞术检测敲低lncRNASNHG3对胃癌细胞MGC-803和BGC-823周期和凋亡情况的影响细胞周期的改变和凋亡均可能是影响细胞增殖能力的原因。因此，我们流式细胞术检测了胃癌细胞MGC-803和BGC-823在lncRNASNHG3敲低之后细胞周期以及凋亡比例的变化。细胞周期结果如Fig.3-5所示，MGC-803细胞转染siRNA124h后，G0/G１期细胞百分比上升至62.89％±5.25％，但与BC组（55.15%±0.78%）无显著性差异（P＞0.05）,BC组（55.15%±0.78%）和NC组（55.49%±1.77%）相比无显著性差异（P＞0.05）；S期细胞比例无显著变化；细胞G2/M期比例下降至7.15%±1.08%，与BC组（15.04%±1.74%）具有显著性差异（P<0.01）,BC组（15.04%±1.74%）和NC组（13.69%±0.65%）相比无显著性差异（P＞0.05），见Table3-1，提示siRNA1可通过干扰lncRNASNHG3的表达，抑制胃癌细胞MGC-803进入G2/M期，从而抑制MGC-803细胞的分裂增殖。同样地，利用siRNA1干扰BGC-823细胞内SNHG3表达24h后，G0/G１期细胞百分比上升至51.23％±0.95％，与BC组（46.74%±1.05%）具有显著性差异（P＜0.01）,BC组（46.74%±1.05%）和NC组（46.27%±1.83%）相比无显著性差异（P＞0.05）；S期细胞比例无显著变化；细87 胞G2/M期比例下降至7.33%±1.63%，与BC组（16.15%±2.35%）具有显著性差异（P<0.01），BC组（16.15%±2.35%）和NC组（13.87%±0.78%）无显著性差异（P＞0.05），见Table3-2，提示siRNA1同样可通过干扰lncRNASNHG3的表达，使细胞周期阻滞于G0/G１期，抑制胃癌细胞BGC-823进入G2/M期，从而抑制胃癌细胞BGC-823的分裂增殖。凋亡比例的变化见Fig.3-6，MGC-803细胞通过siRNA1干扰lncRNASNHG3的表达后，细胞凋亡率上升至10.73%±0.77%，与BC组（1.54%±0.57%）具有显著性差异（P<0.001），NC组（2.34%±0.84%）和BC组（1.54%±0.57%）无显著性差异（P＞0.05），提示siRNA1可通过干扰lncRNASNHG3的表达从而诱导胃癌细胞MGC-803的凋亡。同样地，利用siRNA1干扰BGC-823细胞内SNHG3表达24h后，细胞凋亡率上升至15.33%±0.68%，与BC组（1.59%±0.31%）具有显著性差异（P<0.001），NC组（3.19%±1.73%）和BC组（1.59%±0.31%）无显著性差异（P＞0.05），提示siRNA1同样可通过干扰lncRNASNHG3的表达从而诱导胃癌细胞BGC-823的凋亡。这表明lncRNASNHG3是胃癌细胞抗凋亡的必要条件之一。6.敲低lncRNASNHG3对胃癌细胞MGC-803和BGC-823迁移和侵袭的影响肿瘤细胞运动能力是影响其转移能力的因素之一，而不预铺基质胶Transwell迁移实验是目前最常用的检测细胞体外运动能力的方法之一[12]。实验结果发现:siRNA1组迁移到滤膜下表面的MGC-803和BGC-823细胞显著少于BC组(MGC-803:P<0.01;BGC-823:P<0.01)，NC组和BC组无显著性差异（P＞0.05），见图Fig.3-7，提示siRNA1组细胞的运动迁移能力显著弱于NC组和BC组。Transwell侵袭实验是模拟肿瘤细胞穿透基底膜的过程，侵袭到膜下表面的细胞数越多则说明细胞的侵袭能力越强。这个过程主要与肿瘤细胞分泌金属蛋白酶(MMP)等降解基质胶才能顺利侵袭到膜下层相关。胃癌细胞MGC-803和BGC-823分别转染siRNA1，敲低lncRNASNHG3表达后，侵袭能力均明显降低，与BC组(MGC-803:P<0.01;BGC-823:P<0.01)，NC组和BC组无显著性差异（P＞0.05），见图Fig.3-8，提示lncRNASNHG3的表达与MGC-803和BGC-823的侵袭能力相关，降低lncRNASNHG388 的表达则可以有效抑制MGC-803和BGC-823的侵袭能力。7.Westernblot检测敲低lncRNASNHG3后胃癌细胞增殖、转移相关蛋白表达水平的变化siRNA1转染MGC-803和BGC-823细胞培养48小时后，提取总蛋白，检测STAT3、P-STAT3、MMP2的表达水平，actin作为加样内参。结果如Fig.3-9所示:相比较BC组和NC组，siRNA1组的STAT3、MMP2蛋白的表达水平显著下降(MGC-803:P<0.05;BGC-823:P<0.05)，P-STAT3/STAT3的比值显著降低(MGC-803:P<0.05;BGC-823:P<0.05)，BC组和NC组无显著差异（P＞0.05），actin在三组之间无明显差别。说明lncRNASNHG3被敲低后，可能是通过下调MMP-2的表达，抑制了MGC-803和BGC-823细胞的侵袭过程；同时可能是通过下调STAT3的表达和STAT3的磷酸化水平，抑制了MGC-803和BGC-823细胞的增殖。89 附图图3-1qRT-PCR检测lncRNASNHG3在胃癌细胞MGC-803、BGC-823、SGC7901和胃正常粘膜细胞GES1中的表达Fig.3-1TheexpressionleveloflncRNASNHG3inMGC-803、BGC-823andSGC7901celllinescomparedwithGES1celllinewasdetectedthroughqRT-PCRmethods.TheexpressionlevelofSNHG3inMGC-803、BGC-823significantincrease.*indicatedP<0.05and**indicatedP<0.01,comparedwithGES1cellline.90 ABC91 D图3-2siRNA转染MGC-803和BGC-823后对lncRNASNHG3抑制效果Fig.3-2siRNAdecreasedtheexpressionoflncRNASNHG3intheMGC-803andBGC-823cells.A:SiRNAwasscreenedinMGC-803cells,theefficiencyofsiRNA1inhibitionwasthebest.B:SiRNAwasscreenedinBGC-823cells,theefficiencyofsiRNA1inhibitionwasthebest.C:TheselectionofsiRNAdosageinMGC-803cellswasthebestin100pmol.D:TheselectionofsiRNAdosageinBGC-823cellswasthebestin100pmol.BC:Blankcontrol,NC:Negativecontrol.*indicatedP<0.05and**indicatedP<0.01,comparedwithBCgroup.92 AB图3-3CCK-8检测敲低lncRNASNHG3后对MGC-803和BGC-823的增殖能力的影响Fig.3-3ProliferationintheMGC-803andBGC-823cellsweremeasuredbyCCK-8.A:TheproliferationofMGC-803cellsafterlncRNASNHG3wasknockeddown.B:TheproliferationofBGC-823cellsafterlncRNASNHG3wasknockeddown.**indicatedP<0.01,comparedwithBCgroup.93 BCNCsiRNA1MGC803BGC823AB图3-4敲低lncRNASNHG3后对MGC-803和BGC-823的克隆形成能力的影响Fig.3-4LncRNASNHG3knockdownimpairsthecolonyformationofMGC-803andBGC-823.A:ThenumberofclonesinthegroupsofsiRNA1wassignificantlyreduced.B:thedifferencewasstatisticallysignificant，**P<0.01,comparedwithBCgroup.94 BC图3-5敲低lncRNASNHG3后对MGC-803和BGC-823细胞周期的影响Fig.3-5LncRNASNHG3knockdownaffectcellcycleofMGC-803andBGC-823byFlowCytometry.A:Cellcyclediagram.B:MGC-803cellratiostatistics.C:BGC-823cellratiostatistics.**P<0.01,comparedwithBCgroup.95 BCNCsiRNA1MGC803BGC823AB图3-6敲低lncRNASNHG3后对MGC-803和BGC-823细胞凋亡情况的影响Fig.3-6LncRNASNHG3knockdowninducedapoptosisofMGC-803andBGC-823byFlowCytometry.A:Flowcytometry;B:ColumndiagramoftheproportionofMGC-803andBGC-823cellapoptoticcells.***P＜0.001,comparedwithBCgroup.96 BCNCsiRNA1MGC803BGC823AB图3-7Transwell迁移实验检测敲低lncRNASNHG3后对MGC-803和BGC-823细胞体外运动能力的影响Fig.3-7LncRNASNHG3knockdownreducesmigrationofMGC-803andBGC-823invitrobytranswellmigrationassayA:Migrationofgastriccancercellmap;B:Columndiagramofthenumberofmigratedgastriccancercells.**P＜0.01,comparedwithBCgroup.97 BCNCsiRNAMGC803BGC823AB图3-8Transwell侵袭实验检测敲低lncRNASNHG3后对MGC-803和BGC-823细胞体外侵袭能力的影响Fig.3-8LncRNASNHG3knockdownreducesinvasionofMGC-803andBGC-823invitro.A:Invasivegastriccancercellmap;B:Columndiagramofthenumberofinvasivecells.InMGC-803andBGC-823.**P＜0.01,comparedwithBCgroup.98 MGC803BGC823BCNCsiRNA1BCNCsiRNA1P-STAT3STAT3MMP2β-actinABC图3-9敲低lncRNASNHG3后对MGC-803和BGC-823细胞STAT3、P-STAT3、MMP2蛋白表达水平的影响Fig.3-9TheexpressionlevelsofSTAT3,P-STAT3andMMP2inMGC-803andBGC-823cellsbyknockdowninglncRNASNHG3.A:TheexpressionlevelofSTAT3,P-STAT3andMMP2inMGC-803andBGC-823cellsdecreasedsignificantlyafterknockingdownlncRNASNHG3.B：ColumndiagramofrelativeexpressionlevelofSTAT3,P-STAT3/STAT3andMMP2proteininMGC-803cells.C：ColumndiagramofrelativeexpressionlevelofSTAT3,P-STAT3/STAT3andMMP2proteininBGC-823cells.*P＜0.05.99 附表表3-1敲低lncRNASNHG3后对MGC-803细胞周期的影响Table3-1LncRNASNHG3knockdownaffectcellcycleofMGC-803byFlowCytometry.MGC803StagePvalueBCNCsiRNA1G0/G1(%)55.15±0.7855.49±1.7762.89±5.250.1225S(%)29.81±1.0230.82±1.5129.96±5.350.9653G2/M(%)15.04±1.7413.69±0.657.15±1.080.0026****P＜0.01,comparedwithBCgroup.表3-2敲低lncRNASNHG3后对BGC-823细胞周期的影响Table3-2LncRNASNHG3knockdownaffectcellcycleofBGC-823byFlowCytometry.BGC823StagePvalueBCNCsiRNA1G0/G1(%)46.74±1.0546.27±1.8351.23±0.950.0054**S(%)37.1±1.4939.85±1.1841.44±2.430.057G2/M(%)16.15±2.3513.87±0.787.33±1.630.0058****P＜0.01,comparedwithBCgroup.100 讨论目前大量研究表明，lncRNA在肿瘤的发生发展中起到重要的调控[13]作用。而近期研究发现，lncRNASNHG3在肝细胞肝癌中、结直肠癌[14-15]中均表达增高，是肝细胞肝癌、结直肠癌不良预后的指标。在前述的实验中，我们通过高通量转录本测序及qRT-PCR的方法证实了lncRNASNHG3在胃腺癌组织中高表达，并且胃腺癌组织中lncRNASNHG3的表达水平与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关，提示lncRNASNHG3在胃腺癌的发生、发展、侵袭、转移的过程中发挥重要作用。为了明确lncRNASNHG3对胃癌细胞生物学行为的影响，在本部分实验中我们通过体外实验敲低胃癌细胞系中lncRNASNHG3的表达水平，通过CCK-8增殖实验检测敲低lncRNASNHG3对胃癌细胞系体外增殖的影响；敲低lncRNASNHG3对胃癌细胞MGC-803和BGC-823克隆形成能力的影响；敲低lncRNASNHG3对胃癌细胞MGC-803和BGC-823周期和凋亡情况的影响，并通过transwell迁移和侵袭实验检测检测敲低lncRNASNHG3对胃癌细胞迁移侵袭能力的影响。通过检测胃癌细胞MGC-803、BGC-823、SGC-7901，我们发现在三株细胞中lncRNASNHG3的表达水平均高于胃正常粘膜上皮细胞，这与前期的高通量测序及胃腺癌组织中qRT-PCR验证的结果一致。但在胃癌细胞MGC-803、BGC-823中lncRNASNHG3的表达水平显著增高，因此我们选用了胃癌细胞MGC-803和BGC-823进行下一步的细胞功能试验。构建的3个小干扰RNA序列(siRNA1,siRNA2,siRNA3)转染MGC-803和BGC-823细胞后，siRNA1抑制效率最高，达85.4%和89.9%，进一步筛选，发现siRNA1应用100pmol抑制MGC-803、BGC-823细胞lncRNASNHG3的表达水平效率最高，故将siRNA1100pmol应其用于后续的细胞功能试验。通过CCK-8实验和平板克隆实验，提示敲低lncRNASNHG3的表达后，MGC-803和BGC-823细胞增殖能力、克隆形成能力均受到显著抑制，提示lncRNASNHG3在胃癌发生发展及克隆性增殖过程中发挥了一定作用。为了研究lncRNASNHG3敲低之后胃癌增殖能力减弱的原因，我们进行了一系列关于细胞周期、凋亡相关的的实验研究，结果发现，lncRNA101 SNHG3敲低之后，抑制胃癌细胞MGC-803、BGC-823进入G2/M期，从而抑制MGC-803、BGC-823细胞的分裂增殖，并且凋亡比例显著增加，这些结果提示，lncRNASNHG3敲低所引起的分裂增殖抑制、凋亡增加可能是胃癌细胞增殖能力显著下降的主要原因。同时，我们通过transwell迁移、侵袭实验检测了lncRNASNHG3敲低后胃癌细胞MGC-803和BGC-823迁移、侵袭能力的变化，结果表明，胃癌细胞MGC-803和BGC-823在lncRNASNHG3敲低后的迁移及侵袭能力均得到了显著削弱，说明lncRNASNHG3参与了胃癌细胞增殖与抗凋亡的同时，在侵袭和转移的过程中可能也扮演了重要的角色。信号传导与活化转录因子（signaltransducerandactivatoroftranscription，STATs）家族是一种存在于胞浆、激活后转入细胞核内结合[16]DNA的蛋白家族。其成员具有信号转导和转录调控双重功能。STAT3是STAT家族中的重要一员，其与肿瘤的关系密切，过度表达与肿瘤的增殖、细胞凋亡抑制、侵袭和转移、新血管生成等密切相关，被认为是一种[17-19]原癌基因。当细胞接受细胞因子或生长因子刺激，导致受体发生二聚化，从而激活受体自身的酪氨酸激酶活性或者激活与受体偶联的非受体型酪氨酸激酶的活性，705位点的酪氨酸残基发生磷酸化形成有活性的P-[17-19]STAT3，P-STAT3形式的二聚体进入细胞核内调控相关基因的转录。[20]Judd等发现抑制STAT3磷酸化可以阻碍胃癌细胞增殖、减少炎症和诱导凋亡，STAT3可以调节许多细胞因子和生长因子促胃肿瘤生长，提示STAT3蛋白与胃癌的发生及发展存在相关性。基质金属蛋白酶家族（MatrixmetalloproteinasesMMPs）是Ca2+、Zn2+依赖的内源性基质金属蛋白酶家族，目前研究发现其其家族成员有20多个，MMP2是基质金属蛋白酶系列MMPs家族中的重要一员，能够降解细胞基底膜及细胞外基质成分Ⅳ型胶原，从而促进肿瘤侵袭和转移。我们通过Westernblot检测敲低lncRNASNHG3后胃癌细胞MGC-803和BGC-823的STAT3、P-STAT3、MMP2蛋白表达水平的变化，结果显示STAT3、MMP2的表达水平显著下降，P-STAT3/STAT3的比值显著降低，说明lncRNASNHG3被敲低后，抑制了STAT3的表达和STAT3的磷酸化水平，可能与抑制MGC-803和BGC-823细胞增殖有关；抑制了MMP-2的表达，可能与抑制MGC-803和BGC-823细胞的侵袭有关。这在一定程度上解释了敲低102 lncRNASNHG3后细胞增殖、平板克隆及Transwell侵袭实验的结果,抑制lncRNASNHG3基因有望应用于胃癌的靶向治疗。综上所述，通过本部分的实验，我们发现lncRNASNHG3在胃癌细胞中高表达，同时其是胃癌细胞增殖、抗凋亡、侵袭以及转移的必要因素，对其进行干扰可以有效破坏胃癌细胞的这些生物学行为。我们本部分研究也为将来以lncRNASNHG3作为靶点进行胃癌诊断及治疗的进一步研究提供了基础。但是lncRNASNHG3敲低后引起胃癌细胞一系列生物学行为改变的具体机制，还有待于我们进一步的深入研究。小结1.通过敲低胃癌细胞中lncRNASNHG3的表达，发现胃癌细胞的增殖能力、克隆形成能力均受到显著抑制，抑制胃癌细胞进入G2/M期，胃癌细胞凋亡比例显著增加，迁移及侵袭能力均得到了显著削弱，说明lncRNASNHG3参与了胃癌细胞增殖与抗凋亡的同时，在侵袭和转移的过程中可能也扮演了重要的角色。2.敲低胃癌细胞中lncRNASNHG3的表达，可能是通过下调STAT3、MMP2的表达和STAT3的磷酸化水平，抑制了MGC-803和BGC-823细胞的增殖、侵袭过程，抑制lncRNASNHG3基因有望应用于胃癌的靶向治疗。参考文献1.ClarkMB,MattickJS.LongnoncodingRNAsincellbiology.SeminCellDevBiol,2011,22:366-376.2.MercerTR,QureshiIA,GokhanS,etal.LongnoncodingRNAsinneuronal-glialfatespecificationandoligodendrocytelineagematuration.BMCNeurosci,2010,11:14.3.KretzM,SiprashviliZ,ChuC,etal.Controlofsomatictissuedifferentiationbythelongnon-codingRNAtincr.Nature,2013,493:231-235.4.FaticaA,BozzoniI.Longnon-codingRNAs:newplayersincell103 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结论本研究中，应用高通量测序技术对胃腺癌和癌旁组织样本中的lncRNA进行筛选，选择差异性高表达的lncRNASNHG3作为研究对象；分析1ncRNASNHG3与胃腺癌临床病理资料的关系，利用siRNA下调其表达，观察其对胃癌细胞的增殖、凋亡、转移等生物学行为的影响，并初步研究其可能机制。得出以下结论：1.高通量测序结果显示，与癌旁组织相比，在胃腺癌组织中存在差异表达的lncRNA和mRNA，其中74条表达异常的lncRNA，上调的有43条，下调的有31条；449条差异表达的mRNA，上调的有238条，下调的有211条。选取的差异表达的lncRNA通过qRT-PCR检测对测序结果进行验证，检测结果与高通量测序结果相一致，高通量测序结果是可靠的。2.LncRNASNHG3在胃腺癌组织中的表达水平显著上调，并与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关，而与胃腺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、分化程度、血管侵犯、神经侵犯无关。提示lncRNASNHG3在胃腺癌的发生、发展、侵袭、转移的过程中发挥了重要作用。3.敲低胃癌细胞中lncRNASNHG3的表达，胃癌细胞的增殖能力、克隆形成能力均受到显著抑制，抑制胃癌细胞进入G2/M期，胃癌细胞凋亡比例显著增加，迁移及侵袭能力均得到了显著削弱，说明lncRNASNHG3参与了胃癌细胞增殖与抗凋亡的同时，在侵袭和转移的过程中可能也扮演了重要的角色。这可能是通过下调STAT3、MMP2的表达和STAT3的磷酸化水平，抑制了胃癌细胞的增殖、侵袭过程，抑制lncRNASNHG3基因有望应用于胃癌的靶向治疗。106 综述长链非编码RNA在胃癌中的研究进展胃癌在世界范围内是第五位最常见的癌症，致死率排名第三，成为了一个重要的公共卫生问题。每年大约新诊断胃癌100万人，大约70万人死[1]于该病，占了世界癌症相关死亡的10%。胃癌的高死亡率与疾病早期缺[2,3]乏确切的筛查和典型症状相关，因此，大多数胃癌患者诊断时中晚期，[4,5]手术、化疗效果差，预后不良。胃癌的高死亡率和不良预后迫切需要一级预防、早期诊断和精准的随访。目前在临床上应用的常规胃癌标志物检测的敏感度和特异度有待提高。因此，探寻新的胃癌诊断、预后标志物和治疗靶点成为胃癌研究领域的当务之急。基因检测作为研究热点，其在肿瘤的发生、发展、转移及预后等判断方面具有一定的优势。众多研究发现长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)可作为新型的肿瘤标志物，用于肿瘤的辅助诊断和预后判断，其在胃癌发生、发展、诊断、治疗中的重要作用也被广泛报道。本文对近年来lncRNA在肿瘤发生发展中的作用及机制特别是胃癌中lncRNA的研究现状进行总结，探讨lncRNA作为新的胃癌诊疗标志物以及治疗靶点的可行性。1LncRNA概述基因组测序工程显示,在人类基因组序列中,仅有1.5%的核酸序列用于蛋白质编码,而占据人类基因组98.5%的是非蛋白编码序列,非编码RNA[6]是一大类不具有蛋白编码潜能的RNA转录本,不具有开放阅读框，无蛋白翻译功能。NcRNAs可系统地分为(1)根据生物学功能分为管家[7]ncRNAs(housekeepingncRNAs)和调节ncRNAs(regulatoryncRNAs)：管家非编码RNA主要包括核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、小核[8]RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、引导RNA(gRNA)和端粒酶RNA;调控性非编码RNA主要包括小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、与Piwi蛋白相互作用的piRNA和长链非编码RNA(lncRNAs)。(2)根据亚细胞定位可将非编码RNA分为细胞核非编码RNA与细胞质非编码RNA。(3)根据是否具有polyA尾结构可将非编码RNA分为具有polyA尾的非编码RNA(polyA-plusncRNAs)和不具有polyA尾的非编码107 RNA(polyA-minusncRNAs)。(4)根据转录本的长度可将非编码RNA分为短链非编码RNA(smallncRNAs，sncRNAs)、小核仁RNA(smallnucleolarRNAs，snoRNAs)以及长链非编码RNA(longncRNAs，lncRNAs)。microRNA属于短链RNA，近年来的研究证实microRNA几乎在人体内的所[9-17]有生理、病理过程包括肿瘤的发生均起到了重要的作用，而随着lncRNAs研究的不断深入，其意义日益引起人们的重视，相关研究报道数量也与日俱增。[18,19]据GENCODE数据库分析(GRch3823版，2015年3月)，在人类的27817转录本中，大约有15931基因被注释为lncNRA，大部分lncRNA显示了不同的组织特异性。LncRNA可出现在不同的亚细胞结构中,其中定位于细胞核中的长链非编码RNA所占的比例最大。在不同的细胞定位中lncRNA起不同的作用，根据他们在基因组上相对于蛋白编码基因的位置和特征，可将lncRNA分为五大类：(1)正义lncRNA(senselncRNA)．与同一条链上蛋白编码基因转录方向相同；(2)反义lncRNA(antisenselncRNA)：与同一条链上蛋白编码基因转录方向相反；(3)双向lncRNA(bidirectionallncRNA)：可同时向同一条链上蛋白编码基因转录方向相同或相反的方向转录；(4)基因内lncRNA(introniclncRNA)：转录本位于蛋白编码基因的内含子中，不与蛋白编码基因的外显子区存在任何重叠。(5)基因间lncRNA(intergeniclncRNA)：转录本处于基因间区，即[20]lincRNA，与蛋白编码基因相聚5kb以上，转录本与mRNA无重叠，占lncRNA40%以上。Fig.1CategoriesoflncRNAs.lncRNAsareusuallyclassifiedintofivecategories:(1)sense;or(2)antisense,whenoverlappingoneormoreexonsofanothertranscriptonthesame,oroppositestrand;(3)bidirectional,whenthe108 expressionoflncRNAandaneighboringcodingtranscriptontheoppositestrandisinitiatedinclosegenomicproximity;(4)intronic,whenlncRNAisderivedwhollyfromwithinanintron;and(5)intergenic,whenlncRNAlieswithinthegenomicintervalbetweentwogenes.2LncRNA的分子功能尽管到目前lncRNA的功能只有一少部分被证实，但大量正在进行的研[21][22]究已表明lncRNA参加了多种不同的生物学过程，诸如发育、细胞分[23][24-26]化、包括癌症在内的多种疾病。其几乎能参与整个生命周期基因调控的每一步：包括染色体剂量补偿，印迹，表观遗传调控，转录，mRNA[27]剪接和翻译等。按照lncRNA分子功能的不同,研究人员将长链非编码[28]RNA分为4种：(1)信号分子;(2)诱饵分子;(3)引导分子;(4)支架分子。2.1信号分子LncRNA可由基因组的任何部位转录，通常由RNA聚合酶II或聚合[29]酶III催化合成，具有复杂的二级结构甚至三级结构，组织表达特异性高，说明其转录受到严格的调控。长链非编码RNA的转录一般发生在生物体发育过程中特定的时间和特定的组织中,其转录本有可能作为信号[30]分子,可与转录因子或信号通路在空间或时间上作用进行基因调控。这类基因转录本中通常包含一些具有调控功能的核酸序列,在这种情况下,[31]人们可以根据lncRNA的表达情况来推测染色质的状态。Huarte等发现，lincRNA-p21可以作为p53依赖的转录调控的抑制因子并引起细胞凋亡。作为对DNA损伤的反应，p53直接作用于lincRNA-p21，通过直接诱导其表达对lincRNA-p21进行调控。p53通过结合和调控异质核核糖核酸蛋白K(hnrnp-K)定位而对lincRNA-p21起到抑制作用。2.2诱饵分子LncRNA可以以诱饵的方式诱导蛋白质和小调控RNA离开其作用位点。例如，lncRNAGas5(Growtharrest-specific5)，利用其自身颈环结构的一个RNA基序,模拟结合在糖皮质激素效应基因启动子区域的激素效应元件,抑制糖皮质激素受体的功能。Gas5可以竞争性地结合糖皮质激素受体的DNA结合区域,作为诱饵分子有效地抑制受体和染色体的相互作[32-33]用。LncRNAs还可以作为miRNA的模拟靶标，这些类型的lncRNAs可以作为“诱饵”竞争性地结合miRNA，从而调控某些miRNA靶基因的表109 [34]达。如1ncRNAs-At4和IPS(InducedbyPhosphateStarvationl)。具备该作用的lncRNA也被称为ceRNA(CompetingendogenousRNA),即竞争性内[35]源的RNA。2.3引导分子引导1ncRNA可以结合蛋白质和DNA的特定区域，并且可以引导蛋白质-RNA复合物定位到特定靶位点，作用于特定的靶标并调控基因的表达。可以通过顺式方式(对于位置相临的基因而言，例如，Xist，Air，HOTTIP)),[36]也可以通过反式方式(对于远距离的基因而言，例如HOTAIR，[28,37-38]lincrna-p21，Jpx)调节目标基因的表达。这种调控作用通常是利用lncRNA特定的空间构象,而非特定序列来实现的。例如，近来发现的lncRNAHOTTIP可以跨越HOXA直接结合衔接蛋白WDR5和WDR5/MLL[28]复合物，使得MLLH3K4（histone3lysine4)三甲基化。HOTAIR是第一个被发现具有反式调控作用的lncRNA.目前发现HOTAIR在多种肿瘤中表达上调,且HOTAIR的高表达与不良预后密切相关.研究发现HOTAIR可通过与甲基化酶复合体PRC2共同作用,调控组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲[39-40]基化(histoneH3tri-methylatedatlysine27,H3K27me3),进而影响WIF1、PTEN、p21等基因的表达,并通过这些基因调控Wnt、Akt及p53等信号通路,在肿瘤的细胞周期、凋亡、血管生成、侵袭与转移等过程中发挥重要功能。2.4支架分子以前我们认为很多复合物的支架是蛋白质。近来的研究表明，lncRNA可以作为一个中央平台将不同的效应分子聚集在一起，起到支架作用。这对分子间相互作用、生物信号的传递、以及对信号本身的特异性和动态性[41]的精确调控具有极其重要的意义。作为分子支架，HOTAIR就是其中之一，它的5′端可以结合多梳蛋白抑制复合体2(polycombrepressivecomplex2，PRC2)，使H3K27甲基化和H3K4去甲基化，调控基因的表达，同时它还可以利用其3′端的700个核苷酸组成的结构域与另一个包含赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1（lysine-specifichistonedemethylase1，LSD1）、Re-1元件辅助沉默转录因子（corepressorforRE1silencingtranscriptionfactor，CoREST）及REST等蛋白因子的去甲基化蛋白复合体结合，作为[39,42]PRC2和LSD1/CoREST/REST复合物的支架，共同发挥作用。110 Fig.2lncRNA作用机制3LncRNA的生物学功能和作用机制3.1LncRNA参与基因表达的表观遗传调控表观遗传学（epigenetics）是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致了表型的变化。表观遗传可由DNA修饰、组蛋白修饰、非编码RNA调控、染色质重塑等调控，非编码RNA调控是表观遗传调控的重要手段。如长链非编码RNA-XIST定位于X染色体失活中心Xic上,由细胞内将要失活的X染色体转录出来，XIST大量聚集并包裹在该X染色体上，进而阻止染色体与RNA聚合酶II的[43]结合，并诱导染色体与PRC2复合体相结合，快速介导染色体上H3K27[44,45]甲基化，引起X染色体失活。LncRNAANRIL作为致癌基因，通过激活两种PRCS，即PRC1和PRC2，产生了染色质重组使INK4A-ARF-INK4B[46]沉默，编码肿瘤抑制因子p15(INK4B)、p14(ARF)和p16(INK4A)。近来[47]的研究还表明，表观遗传调控不仅包含对mRNA的调控，还包含了对[48][49]多种miRNA的调控。张等发现，ANRIL可以通过结合PRC2沉默miR-99a/miR-449a，进而调控mTOR和CDK6/E2F1通路，部分导致ANRIL介导的对细胞生长的调控。ANRIL沉默miR-449a通过促进E2F1的表达，同时，上调的E2F1促进了ANRIL的表达，形成了一正反馈环，持续促进了胃癌细胞的增殖。这表明，ANRIL可以通过顺式方式调控p15(INK4B)andp16(INK4A)，也可以通过反式方式调控miR-99a/miR-449a的表达。111 3.2LncRNA参与转录调控LncRNA可以通过多种方式调节基因的转录，包括调节转录因子的结合与装配，竞争蛋白质编码基因的转录因子，与DNA形成三链复合物，调节RNA聚合酶II的活性和转录干扰等。LncRNA可激活沉默的表观遗传[49,50]的蛋白编码基因，而且可以作为增强子增加蛋白编码基因表达水平。在人类细胞中可看到以顺式方式调控特定的lncRNA可以抑制其附近的蛋白编码基因。而且，转录激活依赖于lncRNA表达，这通过不同经典的增[50]强子实验得到了同样结论。王等应用数据挖掘技术在基因组的蛋白编码[51]基因附近寻找增强子样lncRNA，成功的发现了八条具有潜在增强子样作用的lncRNA，其中一些lncRNA在调控编码肿瘤标记物基因的转录中起[52]到了重要作用。例如，组蛋白3.1是低风险等级的喉头癌的标记物，HCG11定位于编码组蛋白3.1的HIST1H3F基因上游270kb，在GCA组织中与非肿瘤组织相比有明显上调。另一些增强子距离所调控的启动子较远。在多重耐药的胃癌细胞株中，耐药相关基因ABCB1的基因位点距离[53]MRUL较远，MRUL作为ABCB1的增强子样lncRNA促进了其表达。这[54]可能与增强子与目标启动子通过3D的基因结构形成的染色质环有关。3.3LncRNA参与转录后调控转录后形成的原初转录物须经过一系列的加工，才能转变成具有功能的成熟mRNA，从而作为蛋白质翻译的模板。基因转录后水平的调控是指对转录产物进行的一系列加工和修饰，主要包括mRNAs前体的加工和剪接，mRNAs通过核孔和在细胞质内定位，RNAs编辑，mRNAs的稳定性等多个重要环节。LncRNAs介导的基因表达转录后调控主要是通过与基因转录后的mRNA结合形成互补双链，从而从而调节mRNAs的剪接、编辑、[55]翻译和降解等。MALAT1最初被发现的是在与早期非小细胞肺癌相关[56]的转录本中，其调控RNA的选择性剪接是通过与富含丝氨酸/精氨酸[57]（serine/arginine，SR）的细胞核磷酸化蛋白的相互作用，SF2/ASF是[58]一个精氨酸/精氨酸蛋白质家族的重要成员，它在癌症中的重要功能就[59]是可变剪接。在正常细胞中，MALAT-1能与SR蛋白相互作用，使其磷酸化水平增加，并影响其在核小点和核质中的分布，募集磷酸化SR蛋白至前体mRNA，调控其可变剪接；而在MALAT-1缺失的细胞中，SR蛋白增加（绝大多数以去磷酸化状态存在），去磷酸化SR蛋白剪接能力及112 [60]与前体mRNA的结合能力均下降，导致前体mRNA可变剪接的改变。在胃癌SGC-7901细胞中，分别下调SF2/ASF或MALAT1可引起细胞周期停滞在G0/G1期，显著的抑制了细胞增殖。MALAT1被敲除后，SF2/ASF在细胞核的分布和水平显著降低，但是过表达SF2/ASF并未解除MALAT1被敲除后的细胞增殖受抑制，这些研究表明MALAT1刺激了细胞的增殖部[61]分是通过SF2/ASF介导的。3.4LncRNA与miRNA的相互作用。LncRNA调控miRNA的作用机制主要有3个:①lncRNA可以与miRNA竞争性结合靶基因mRNA的3'-UTR，间接抑制miRNA对靶基因[62]的负向调控．②lncRNA可通过细胞内的剪切作用形成miRNA的前体，通过细胞核中的Drosha裂解、细胞质中Dicer切割，产生成熟的miRNA，调控靶基因的表达而发挥功能;③部分lncRNA能发挥内源性“miRNA海绵”的功能，与mRNA竞争性结合miRNA的反应原件(miRNAresponseelements，MREs)，进而达到抑制miRNA表达及其对靶基因的负向调控，[63]即竞争性内源性RNA(competingendogenousRNAs，ceRNAs)机制。研究发现，miR-1207-5p在胃癌组织中低表达，高表达的miR-1207-5p通过结合hTERT的3'-UTR抑制hTERT的表达，从而显著抑制了癌细胞的增殖和转移，而lncRNABC032469与hTERT的表达呈正相关并可促进胃癌细胞的增殖和转移，RIP和Northernblot显示lncRNABC032469可以直接结合miR-1207-5p，lncRNABC032469作为ceRNAs减少miR-1207-5p依赖的hTERT的表达的下调，lncRNABC032469有可能作为胃癌的一个预后不[64]良的指标。Liu等发现，胃癌中高表达的lncRNAHOTAIR与miR-331-3p的表达竞争，作为竞争性内源性RNA，lncRNAHOTAIR可促进HER2的表[65]达和胃癌的进展。LncRNAMEG3在胃癌中低表达，可以作为ceRNA与[66]miR-181相互竞争，并在荧光素酶报告实验和RNA免疫共沉淀实验中得到验证。上调的野生型MEG3增加了HGC-27细胞的BCL-2的转录和蛋白表达水平，而异位表达的miR-181a能过抑制这种效果。这表明MEG3作为[66]ceRNA竞争结合miR-181从而调控Bcl-2的表达。4lncRNA在胃癌中的研究进展近年的研究证实lncRNA广泛参与到肿瘤的发生及转移过程中。在胃癌的发生和发展的过程中，异常表达的lncRNA不断被发现，并证明其表113 达异常与肿瘤生长、转移以及患者预后等密切相关。现简述如下：4.1HOTAIRHOX转录反义RNA(HOXtranscriptantisenseRNA,HOTAIR)是第一个被发现具有反式转录调控作用的1ncRNA，定位于12q13.13,长度2.2kb，作为分子支架发挥作用。它的5’端结合多梳抑制复合体2(polycombxe-pressivecomplex2,PRC2)，3’端结合组蛋白赖氨酸去甲基化酶(lysinespecificdemethylasel,LSD1)，使组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化(histoneH3tri-methylatedatlysine27,H3K27me3)和组蛋白H3K4Me2的去甲基作用(histoneH3dimethylLys4,H3K4me2)，从而调控远距离基因沉[39,67]默。HOTAIR在胃癌淋巴结转移、腹膜播散的患者高表达，提示预后[68,69]不良。人类上皮生长因子受体2（HER2）编码一种与赫赛汀为基础在[70]肿瘤和抗药性方面治疗相关的蛋白，Liu等发现，HOTAIR表达受抑制会提高半胱氨酸天门冬氨酸酶3依赖的凋亡并增加早期凋亡；miR-331-3p通过作用于HER2的3’-UTR抑制其表达，而HOTAIR可作为ceRNA竞争性[71]结合miR-331-3p调控HER2的表达；还有研究结果表明HOTAIR与SUZ12基因相关并调控其表观遗传。因此，在胃癌肿瘤发生和转移过程中，HOTAIR可以作为通过HOTAIR/EMT和HOTAIR/SUZ12通路的一个治疗性的靶点，为胃癌转移的治疗提供了新的途径。4.2MALAT1肺腺癌转录相关性因子1(metastasis-associatedlungadenocarcinomatranscript1，MALAT1，也被称为nuclear-enrichedabundanttranscript2[56,72]NEAT2)，定位于染色体11q13.1，其编码的lncRNA小约8kb，MALAT1是在哺乳动物细胞核中含量最丰富的lncRNAs之一。XIA等研究发现，有远处转移的胃癌组织MALAT1表达水平高于无转移和正常的组织，在胃癌细胞系MKN45、CTC141和CTC105及患者的患者的血浆中均显著高表达，敲除MALAT1后，能够抑制N-cadherin,CyclinD1andBcl-xl的表达，进而抑制胃癌细胞增殖和细胞周期进程，促进细胞凋亡，并抑制胃癌细胞的迁移、侵袭；在BGC-823和SGC7901细胞中，miR-122与胰岛素样生长因子1受体(insulin-likegrowthfactor1receptor，IGF-1R)的表达成负相关，敲IGF-1R后能够显著抑制MALAT1的表达，表明miR-122-IGF-1R轴能够调控MALAT1的表达。COX分析表明血浆中114 [73]MALAT1的高表达是胃癌患者的不良预后独立相关因素。Li等发现，通过VE-cadherin/b-catenin复合物和ERK/MMP、FAK/paxillin信号通路，[74]MALAT1促进了血管生成，从而促进了胃癌的发生和转移。MALAT1有望成为胃癌诊疗中的生物标志物。4.3H19H19印迹基因位于人染色体11P15.5，属于单拷贝基因，母系等位基因表达，父系印迹，长度为2.7×103bp,是高度保守的集群印迹基因成员之[75][76,77]一。最初H19因为可抑制肿瘤发生而被认为是抑癌基因，但近来的研究认为H19是一个原癌基因，这表明人体内H19通过不同机制参与机体肿瘤的形成和进展。Song等通过基因芯片研究发现，胃癌在组织中H19的[78]表达是非癌组织的8.91倍。Li等研究发现敲除H19后细胞的增殖、侵袭[79]和迁移的能力受到抑制,给裸鼠注射转染H19的SGC7901细胞后，肿瘤生长的速度、肿瘤大小、重量、转移结节的数量增加。H19作为原癌基因是[80][81][82]通过调控抑癌基因P53和H9/miR-675基因轴发挥作用。Yang等发现将H19和p53应答报告质粒共转染人胃癌细胞系AGS后，p53的活性显[83]著降低。Zhuang等研究发现Ｈ１９基因通过miR-675调控抑癌基因肿瘤抑制基因矮子域转录因子1(runtdomaintranscriptionfactor1，RUNX1)来影响胃癌的发生发展，即通过LncRNAH19派生miR-675，miR-675靶向抑制其下游靶基因”的“H19/miR675/RUNX1信号轴”促进肿瘤的发生和发展。4.4MEG3母系表达基因3(maternallyexpressedgene3，MEG3)是位于人类染色体14q32.3上的印迹基因，长约1.6kb，只在母源性基因上表达，基因[84]组结构分析发现，MEG3/Gtl2由10个外显子组成，并在正常组织中普遍表达，属于lncRNA且以RNA形式发挥功能,具有抑制细胞增殖的功[85]能。Yan等运用实时定量PCR技术检测52例胃癌样本，发现在胃癌组织和细胞系中均为低表达，在SGC-7901和BGC-823胃癌细胞株中，MEG3与miR-148a的表达呈正相关，转染miR-148a于细胞株(SGC-7901和BGC-823)中过表达，DNA甲基转移酶1(DNMT-1)DNMT-1的表达受到抑制，表明miR-148a可以显著抑制下游靶基因对DNMT-1的表达，[86]从而抑制胃癌的发生。Sun等运用qRT-PCR也发现胃癌中的MEG3水平显著低于邻近的正常组织，并且和TNM分期、肿瘤大小及浸润深度密切115 相关，MEG3低表达水平组预后相对较差，应用siRNA敲除MEG3的表达可促进肿瘤细胞的增殖，而异常表达的MEG3抑制增殖，促进凋亡，调节P53在胃癌细胞系中的表达。利用5-aza-CdR处理细胞株(AGS和MGC-803)后，MEG3的差异性甲基化区域(differentiallymethylatedregions，DMRs)甲基化后MEG3表达明显降低。MEG3的低表[87]达被认为是胃癌不良预后的指标。Peng等也发现，MEG3在胃癌样本和HGC-27、MGC-803细胞系低表达，MEG3的表达水平与胃癌转移相关。在HGC-27、MGC-803细胞系中，异常表达的MEG3抑制增殖、迁移、侵袭，促进凋亡，MEG3可以与miR-181a相结合，作为ceRNA，通过竞争性结合miR-181a，从而在上调bcl-2的表达，起到抑癌作用。LncRNAMEG3有可能成为抗肿瘤药物作用的一个靶点。4.5Linc00152Linc00152位于人类染色体2q11.2，包含5个外显子，转录本长度828nt。已有报道在胃癌中Linc00152高表达，可使细胞周期阻滞在G1期，参与了[88]凋亡、上皮间质化、细胞迁移和侵袭。进一步的研究表明，与胃癌组织中的表达相一致，在进展期胃癌和早期胃癌患者的血浆中的Linc00152均明显增高，血浆Linc00152作为诊断指标(AUC0.675;特异性85.2%;敏感性48.1%)均优于传统的CEA、CA199。这说明Linc00152可以作为诊断胃[89]癌的循环生物标志物。在胃癌患者的胃液中，Linc00152的表达明显高[90、于正常人，因此，检测胃液中的Linc00152也可作为无创筛查胃癌的指标91][92]。Zhou等发现，在胃癌组织中Linc00152高表达，Linc00152可调控细胞的生长，并通过免疫共沉淀实验(RIP)实验证实Linc00152可以直接结合的细胞质中表皮生长因子受体（EGFR），从而激活PI3K/AKT信号通路促进胃癌细胞增殖。p15、p21是调控细胞周期的重要抑癌因子，Linc00152[93]作用于EZH2增强子，可抑制p15、p21蛋白表达，导致细胞周期失控。可见，Linc00152可通过调控细胞增殖和细胞周期相关信号通路，参与胃癌的发生、发展过程。4.6Linc00261[94]Linc00261定位于染色体20p11.21，范钰等通过实时荧光定量聚合酶链反应检测72对胃癌和相应的正常胃粘膜组织，发现胃癌组织中Linc00261低表达，并且其表达水平与TNM分期，浸润深度、淋巴结转移、116 脉管内癌栓、5年生存率相关，认为Linc00261可能是胃癌基因诊断和治疗[95]的重要作用靶点之一。Fan等发现Linc00261在胃癌组织和胃癌细胞株MGC-803、BGC-823、MKN28、MKN45、SGC7901均低表达，低表达的Linc00261与TNM分期，浸润深度、淋巴结转移相关，单变量和多变量分析表明Linc00261的低表达是胃癌的不良预后指标。过量表达的Linc00261可以损伤胃癌细胞的迁移、侵袭能力，在体内、体外实验中抑制了肿瘤的转移。Linc00261的过表达上调钙黏蛋白(E-cadherin)的表达，神经钙黏素(N-cadherin)、纤连蛋白1(Fibronectin1)和波形蛋白(Vimentin)[96]表达水平下降，从而通过上皮间质转化影响胃癌细胞的侵袭和迁移。Yu等通过RNA下拉实验和质谱分析确认Slug是与Linc00261结合的RNA结合蛋白，Slug蛋白可降低Linc00261的肿瘤抑制作用；Linc00261可通过增强GSK3b和Slug的相互作用促进Slug蛋白的降解，减弱Slug蛋白的稳定性而下调其表达并抑制上皮间质转化过程。5LncRNA在胃癌诊断治疗中的应用近年来，不同研究均发现一些上调或下调的LncRNA可以作为胃癌的诊断和预后的标记物。在检测胃癌或评估胃癌进展时可从组织、血液甚至是胃液中检测这些标志物。在胃癌组织中，长链非编码RNAH19,LINC00152,AI364715,HMlincRNA717,uc001lsz,SUMO1P3,HULC,AA174084,ABHD11-AS1,BC031243和RP11-356I2.2可以作为重要的诊断指标，而长链非编码RNAHOTAIR、LINC00152、MEG3、nuRuPAR,、PRNCR1,AC130710可以作为预后的标志物。由于检测循环中的lncRNA具有微创、取材方便、检测简易、易于动态观察病情等特点，越来越多科学[97][98]研究者青睐于循环中的lncRNA领域。Arita等反复冻溶血浆，发现[99][100]血浆中lncRNA仍能保持稳定，Tong和Ren等研究也证实，即使有核糖核酸酶(RNase)的存在，循环血浆中lncRNA也稳定存在。LINC00152、[101][102-103]HULC、HI9、AA174084、ABHD11-AS1、BC031243和RP11-356I2.2.都作为以血液为基础的标志物而应用于胃癌的诊断中。甚至[104][105]在胃液中，LINC00152、AA174084、ABHD11-AS1也可作为标志物对胃癌进行检测。与胃炎、胃溃疡的患者相比，胃癌患者的胃液中，AA174084显著高表达，AUC值达到了0.848，可能成为诊断早期胃癌的标志物。另外，LncRNAs调节胃癌过程所介导的信号通路可以为胃癌的药物117 靶向治疗提供新的靶点。6问题与展望目前胃癌仍是在全球病死率最高的癌症之一，发现潜在的用于胃癌预防、诊断和治疗的生物分子是当前的研究热点。近年来的研究表明，表达失调的lncRNA与胃癌的发生、发展、转移、预后密切相关，但大多数lncRNA异常表达的调控和潜在的作用机制仍未明确，胃癌中lncRNA的病理生理作用需要进一步的研究和阐明。目前，lncRNA在包括诊断、预后、治疗的临床应用方面仍有相当大的限制。尽管在血液循环中已经证实lncRNA表达，但循环lncRNA的稳定性仍尚不清楚，lncRNAs转录水平和[106]转录后修饰多样化不易于在胃癌的不同病程进行检测。而且，在癌症病人早期，影像学尚未发现肿瘤时，检测到循环lncRNA后如何判断其器官来源仍很困难。更为重要的是，需要建立简单的标准试验或通用的内部质量控制标准进行循环lncRNA的检测。在治疗应用上，尽管在动物试验上证实了lncRNA作为抗癌治疗方法的可行性，但仍存在一些挑战和问题。例如缺乏可靠的投递方式，有限的有效载体种类，缺乏理想的治疗剂量，[106,107]存在一定的副作用，造成了LncRNA在治疗应用上的障碍。而且，lncRNAs有着大量广泛的二级结构，在运用传统的RNA干扰技术如反义寡核苷酸、小干扰RNA影响其表达存在困难。在以lncRNA为基础的治疗上，有效稳定的基因编辑、有效地基因治疗投递系统需要进一步研究。尽管目前lncRNA在胃癌调控、作用机制以及诊断、预后和治疗等临床应用上存在一些困难，相信在不久的将来，lncRNA作为胃癌理想的分子标志物或治疗靶点将成为现实。参考文献1.SiegelR,NaishadhamD,JemalA.Cancerstatistics,2013.CACancerJClin,2013,63(1):11-30.2.MickeviciusA,IgnataviciusP,MarkelisR,etal.TrendsandresultsintreatmentofgastriccanceroverlasttwodecadesatsingleEastEuropeancentre:acohortstudy.BMCSurg,2014,14:98.3.RiquelmeI,LetelierP,Riffo-CamposA,etal.EmergingRoleof118 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致谢博士研究生阶段的学习时光即将过去，在这里我要对所有关心及帮助过我的人表示感谢。首先，衷心感谢导师李勇教授多年来对我的谆谆教诲，在课题上、工作中的精心指导和耐心帮助。导师渊博的知识、敏锐的科学洞察力、兢兢业业、不辞劳苦的敬业精神、实事求是的学术作风给了我巨大的启迪、鼓舞和鞭策，并将成为我人生道路上的楷模。在此谨向李老师致以诚挚的感谢和崇高的敬意!衷心的感谢河北医科大学第四医院外三科范立侨教授、赵群教授、檀碧波副教授、张志栋副教授、袁虎方副教授以及全体医护人员在课题上的竭诚帮助！衷心感谢华科雷博士、冀强博士和外三科全体研究生同学们的辛勤相助！衷心感谢河北医科大学研究生学院和第四临床医学院教务处各位老师的帮助和指导！衷心感谢我的博士班的老师和同学们给予的关心和帮助！衷心感谢给予关心和支持我的同行、同学、朋友！特别感谢我的父母、妻子和孩子，感谢他们对于我攻读博士期间全力的支持和鼓励，是他们让我没有后顾之忧，是他们让我拥有努力学习、克服困难的勇气和力量，顺利完成学业！特别感谢我的领导、同事，感谢他们在我攻读博士学位期间给予的支持和鼓励！是他们的无私的奉献才使我顺利完成学业!谢谢大家！129 个人简历一、一般情况姓名谷建斌性别男民族汉族出生日期1974年11月11日籍贯河北省石家庄市二、个人经历1993.9-1996.6河北医科大学1996.8-2000.8石家庄棉四医院2000.9-2003.6河北医科大学硕士研究生2003.8至今石家庄市第一医院医师、主治医师、副主任医师、主任医师2013.9至今河北医科大学攻读博士学位三、发表论文1.JianbinGu,YongLi,LiqiaoFan,etal.Identificationofaberrantlyexpressedlongnon-codingRNAsinstomachadenocarcinoma[J].Oncotarget.2017,8(30):49201-49216.影响因子:5.1682.HuaK,LiY,ZhaoQ,FanL,TanB,GuJ.DownregulationofAnnexinA11(ANXA11)InhibitsCellProliferation,Invasion,andMigrationviatheAKT/GSK-3βPathwayinGastricCancer[J].MedSciMonit,2018,24:149-160.影响因子1.58130