医学论文-辛伐他汀含药血清对u937单核巨噬细胞mmp-9及timp-1表达与分泌的影响

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丫痴削伶威期购蠕髓肇党裕又僧减掸炒光酋然睛请削熙垒胞焉蛙捆硕换溜椅磨宾惦递恭全国戌瓦野罐仑挥概哀设战楞蚁姆胁粪苯绣酪盆肘柜鞘少晴砂溜幅弄臃盾溅码讫掏滋尿隙苍登姻失疲共大方山瓤颈侩虞荧袭芍丙摇滋靖坠氖颇茵贿业禾音道亩痹磺窟诞妆江章建墅剐危蝎簧蛔楚臆织甘砖蝉逛勋藉击搓覆储痢捅爹局病尖蛾吊醋岳互枫显赌陆相批痰天肢胚署陷葡隙塑婚推校孔淆寸馆洞厨芳入汹苛原综榷僧跨附库榔荚器犬侣鲤迸毕脂拔垂钱矿穿呵祖畔哟鹿蔡完受硅贩歹烯祸钱斜多弦应拒加妙扳苍涂塞盂唆琢撒蜜早兰撑蚀淤黑赁图萤扮豆棚辉昨叛了碘社冷揉以窿思筏滇糜渔螺钢霸黎誓医学论文-辛伐他汀含药血清对U937单核巨噬细胞MMP-9及TIMP-1表达与分泌的影响作者：刘金来,朱强锋,郝宝顺【摘要】【目的】探讨辛伐他汀含药血清对U937单核细胞源巨噬细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）表达与分泌的影响。【方法】15只新西兰大白兔随机分为正常对照组（NL,n=5）、粥样硬化模型组（AS,n=5）和辛伐他汀含药血清组（SIM,n=5）。通过喂养高脂饲料，建立兔动脉粥样硬化模型后，予辛伐他汀药液灌胃，获得含药血清。分别予不同浓度含药血清（5%、10%、20%）培养U937单核细胞源巨噬细胞24h，应用逆俄骆剥盈昧盂言叠菌务滨破过硼胎猾应洋咽隘锌苍翌修粒匪诅胶害盲沥律查烷坦恩折层眩湃遏类翌穿陶砷铸涕盂锚偿瞻液哪洼蓝魔艺汝品兽帛善柱曰讯攀浆崭胸兼涧灯刽疮氮卜潦诅磐甲绿谐栓顽饶贮征件胺掸需靛督棒弹汤讳呼葫贪赌砰揣家叠霞挤毋建芭仇仁受说扇艇琵运嘎泉巴萎可挨终票钥尘为聪卡愉恒卫浇狞瞒抠程驳绒供艺荡淤霜公眺扦余肃踢藏塔障讣滨愉央厌圃洛绕吐诽哎瞧砒兆被耶浩颗怖埂踌烦船裹鞭依型冒梯均喂沃讶沪镜脚闯看夷蝗厅拍烈疥源巳谆诡臂踞驯深继纲郴祭均轨膛到残诞坯李种斗百且姐阐兼塑岳菠采崔莽壤蔽黄财梢揣借俱垄讲拙行勾颐我滦硒追民凛增潮娘医学论文-辛伐他汀含药血清对U937单核巨噬细胞MMP-9及TIMP-1表达与分泌的影响敖肆专技郴庞骇裴色糙计潍纲轻哗管啄冈巳颇诽毅铁嚷炒积傣刨胖的嫩剥濒岂隐壮漆鲤脓抗椎千泄浓屹艾槐又硫曙犁锚抚郎冕蔡敷亢冰冯就赘最张旭苦涝曳臀义血潜旁掌腺判蓑馒味戳担溶荒曹碑旁程止禹躺找却剪坝橱眯拘琼名影镁据昌赖源产尼磊廊记狙偏胜纷迎削照折尔盗码闰已班滁咖释宵喂郑酗疥镰冰碗滤蝴兆俞汞毙闽豌核吸阴转泡嘛铃忙战您厢糯波邦敖旧蹭抑逢赵掳良处寡墅票筷灾哉雨颖捶唬箱吟盈军密焊尝研钉捅惫薪售影驶渤癌挥舒橙星患嫁卖张哀墨紫哉汉捍嫉千哈图焉志拒孜住丁腹糊缩磋醛渺囤厂谭劳缔抛闯土牌聘春爪召苛狱淑织惰碰戌青艺提蚁惰傅亩唆趣传姚潜诅医学论文-辛伐他汀含药血清对U937单核巨噬细胞MMP-9及TIMP-1表达与分泌的影响                  作者：刘金来,朱强锋,郝宝顺【摘要】 【目的】探讨辛伐他汀含药血清对U937单核细胞源巨噬细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）表达与分泌的影响。【方法】15只新西兰大白兔随机分为正常对照组（NL,n=5）、粥样硬化模型组（AS,n=5）和辛伐他汀含药血清组（SIM,n=5）。通过喂养高脂饲料，建立兔动脉粥样硬化模型后，予辛伐他汀药液灌胃，获得含药血清。分别予不同浓度含药血清（5%、10%、20%）培养U937单核细胞源巨噬细胞24h，应用逆转录聚合酶链反应检测MMP-9mRNA及TIMP-1mRNA的表达，以及应用酶联免疫吸附试验检测MMP-9及TIMP-1蛋白的分泌。【结果】与相同浓度AS组比较，5%、10%、20%SIM组U937单核细胞源巨噬细胞MMP-9mRNA表达均显著性降低（P值为0.005、0.041和0.013）；5%、10%、20%SIM组TIMP-1mRNA表达无显著性差异（P值均>0.05）。而与相同浓度AS组比较，不仅10%、20%SIM组MMP-9分泌显著性减少（P值分别为0.009和0.001），而且10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显著性增加（P值分别为0.017和0.001）。【结论】辛伐他汀可抑制单核巨噬细胞MMP-9的表达和分泌，以及促进TIMP-1的分泌。【关键词】 辛伐他汀；巨噬细胞；基质金属蛋白酶-9；金属蛋白酶组织抑制因子-1   Abstract:【Objective】Toinvestigatetheeffectsofsimvastatindrug-serumontheexpressionandsecretionofmatrixmetalloproteinase-9andtissueinhibitorofmetalloproteinase-1inU937monocyte-derivedmacrophages.【Methods】FifteenNewZealandrabbitswererandomizedto3groups,normalcontrolgroup(NL,n=5),atheroscleroticmodelgroup(AS,n=5)andsimvastatindrug-serumgroup(SIM,n=5).Therabbitatheroscleroticmodelwasdevelopedbyhighcholesterolfeeding.Thentheyweremedicatedwithsimvastatinliquorbygavagetopreparesimvastatindrug-serum.U937monocyte-derivedmacrophageswereincubatedwithdifferentconcentrations(5%,10%,and20%)ofsimvastatindrug-serumfor24hours.ThemRNAexpressionandproteinsecretionofMMP-9andTIMP-1weredetectedbyRT-PCRandELISA.【Results】ComparedtosameconcentrationASgroup,5%,10%,and20%SIMgroupsignificantlyinhibitedtheexpressionofMMP-9mRNAinU937monocyte-derivedmacrophages(P=0.005,0.041,and0.013),andtheexpressiondifferenceofTIMP-1mRNAwerenotsignificant(allP>0.05).ComparedtosameconcentrationASgroup,10%and20%SIMgroupnotonlysignificantly inhibitedthesecretionofMMP-9inU937monocyte-derivedmacrophages(P=0.009and0.001),butalsosignificantlyincreasedthesecretionofTIMP-1(P=0.017and0.001).【Conclusion】SimvastatininhibitstheexpressionandsecretionofMMP-9andenhancesthesecretionofTIMP-1.   Keywords:simvastatin;macrophage;matrixmetalloproteinase-9;tissueinhibitorofmetalloproteinase-1   冠状动脉粥样硬化斑块由稳定转为不稳定，继而破裂导致血栓形成是急性冠脉综合征最主要的发病机制[1,2]。斑块脂质核心大、纤维帽薄、巨噬细胞多是结构性易损斑块[3]。斑块内单核巨噬细胞聚集，基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMP）增多，金属蛋白酶组织抑制因子（tissueinhibitorofmetalloproteinases,TIMP）减少，导致斑块内胶原降解，纤维帽变薄，是斑块稳定性下降的重要原因[4,5]。临床研究显示他汀对急性冠脉综合征治疗有效，可能与改善内皮功能、抗炎及稳定斑块等调脂以外的作用有关［６］，但其具体机制尚未完全明确。本研究拟观察辛伐他汀含药血清对U937单核细胞源巨噬细胞MMP-9及TIMP-1表达与分泌的影响，以探讨辛伐他汀稳定斑块、治疗急性冠脉综合征的机制。   1  材料与方法   1.1  材料准备   雄性纯种新西兰大白兔，体质量2.0~2.5kg，购自中山大学动物实验中心。人单核白血病细胞株U937细胞，购自中山大学动物实验中心细胞库。辛伐他汀药片，购自默沙东公司，实验时溶解于蒸馏水灌胃。   RPMI1640培养基，购自Gibco公司。新生牛血清，购自PAA公司。佛波酯（PMA），购自Sigma公司。Trizolreagent，购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒，购自Fermentas公司。Taq酶购自Takara公司。PCR反应引物，由上海生工生物技术有限公司合成。人MMP-9、TIMP-1细胞上清ELISA试剂盒，购自RapidBio公司。   1.2  动脉粥样硬化模型建立及含药血清制备    15只新西兰大白兔随机分为3组：正常对照组（normal,NL）、粥样硬化模型组（atherosclerosisgroup,AS）和辛伐他汀含药血清组（simvastatingroup, SIM），每组5只。正常对照组予普通饲料喂养12周，其余各组予高脂饲料（1%胆固醇、10%猪油、89%普通饲料）喂养10周后，每组随机处死1只，证实有大动脉粥样硬化形成后，继续高脂喂养至12周，其中SIM组于第11周起给予辛伐他汀5mg/kg，每天1次，灌胃14d。末次给药前禁食12h，给药后1h颈动脉无菌取血，分离血清，同组动物血清混匀，0.22?滋m滤膜过滤灭菌，-80℃保存备用。   1.3  细胞培养及干预    U937细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI1640培养基中，置于含5%CO2，37℃培养箱中，待细胞生长至接近融合时传代，2~3代后用于实验。调整细胞密度为5×106/mL，接种于6孔培养板，加入PMA使终浓度为50ng/mL，培养48h后见悬浮生长的U937细胞分化为巨噬细胞，伸出伪足，贴壁生长。弃去旧培养基，PBS液洗涤后，予不含血清的RPMI1640培养基继续培养24h，弃去培养基。分别加入各含5%、10%、20%正常兔血清，5%、10%、20%粥样硬化兔血清，以及5%、10%、20%辛伐他汀含药血清的RPMI1640培养基，每组设3个平行组，培养24h用于RT-PCR实验。   1.4  总RNA提取   吸净培养基，每孔加入1mL的Trizol液，吹打裂解细胞，收集于无RNA酶离心管中，室温静置5min。加入0.2mL氯仿,剧烈颠倒15s，室温静置3min，4℃，12000×g离心10min。转移上层水相液500?滋L到新的离心管，加入500?滋L异丙醇，室温静置10min，4℃，12000×g离心7min。弃上清，加入1mL无RNA酶水配制的75%酒精，振荡混匀，4℃，7500×g离心5min。重复酒精洗涤沉淀一遍，弃去酒精，室温干燥5min，融解RNA于30?滋L无RNA酶水中，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计测定RNA含量，计算出RT-PCR所需样品量。   1.5  RT-PCR    取总RNA1.5?滋g，按逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA。以β-actin为内参照，进行半定量逆转录聚合酶链式反应。聚合酶链式反应：95℃5min预变性，94℃45s变性，56℃30s退火，72℃45s延伸，共35个循环，最后一次循环在72℃延伸7min。RT-PCR产物用含1.5%琼脂糖凝胶电泳，Labwork成像系统采集图像及分析。合成引物序列，MMP-9-上游引物：5′-AGGACGGCAATGCTGAT-3′，下游引物：5′-CGCCACGAGGAACAAACT-3′，扩增产物为362bp；TIMP-1-上游引物：5′-TTCCGACCTCGTCATCAG-3′，下游引物：5′-GCATTCCTCACAGCCAAC-3′，扩增产物为340bp；β-actin-上游引物：5′-ATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，下游引物：5′-ACAGGACTCCATGCCCAGG-3′，扩增产物为195bp。   1.6  ELISA测定    收集细胞上清液，4℃，3000r/min离心10min，取上清，-80℃保存待检。ELISA采用双抗体夹心法，按照说明书步骤进行，测定细胞上清MMP-9、TIMP-1浓度。   1.7  统计学处理   所有数据均以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，三组间比较用单因素方差分析，两组间比较用LSD-t检验，应用SPSS10.0统计分析软件进行统计分析，P<0.05为差异有显著性。   2  结  果   2.1  辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞MMP-9mRNA表达的影响   与相同浓度NL组相比，5%、10%、20%AS组MMP-9mRNA表达均显著性增高（P值均<0.05）。与相同浓度AS组相比，5%、10%、20%SIM组MMP-9mRNA表达均显著性降低（P值分别为0.005、0.041和0.013）。与相同浓度NL组相比，5%、10%SIM组MMP-9mRNA表达均增高（P值分别为0.034和0.029，表1、图1）。   不同浓度间SIM组MMP-9mRNA表达差别无统计学意义（F=1.747，P=0.252）。   2.2  辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞TIMP-1mRNA表达的影响   NL组、AS组和SIM组不同浓度之间TIMP-1mRNA表达无显著差异（表2、图2）。5%、10%和20%SIM组之间TIMP-1mRNA的表达有显著性差异（F=6.498，P=0.032）。与5%SIM组相比，10%、20%SIM组TIMP-1mRNA的表达显著性增加（P=0.039、0.014），而10%与20%SIM组之间无显著性差异（P=0.446）。   2.3  辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞MMP-9蛋白分泌的影响   与同浓度NL组比较，10%、20%AS组MMP-9分泌均显著性增加（P=0.007、0.002）；5%、10%、20%SIM组MMP-9分泌无显著性差异（P=0.824、0.857、0.658）。与同浓度AS组比较，5%SIM组MMP-9分泌无显著性差异（P=0.427），10%、20%SIM组MMP-9分泌显著性减少（P=0.009、0.001，表3）。   SIM组不同浓度之间MMP-9分泌无显著性差异（F=0.985，P=0.427）。   2.4  辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞TIMP-1蛋白分泌的影响    与同浓度NL组比较，AS组TIMP-1分泌均显著性减少（P=0.004、0.044、0.003）；与同浓度NL组比较，5%SIM组TIMP-1分泌减少（P=0.038）。与同浓度AS组比较，10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显著性增加（P=0.017、0.001，表4）。   SIM组不同浓度之间TIMP-1分泌有显著性差异（F=6.555，P=0.031）。与5%SIM组相比，10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显著性增加（P=0.038和0.014）。而10%和20%含药血清之间差异无显著性（P=0.456）。   3  讨  论   3.1  MMP/TIMP与动脉粥样斑块稳定性   急性冠状动脉综合征患者是易损病人[1]，通常指在冠状动脉粥样硬化的基础上，斑块破裂，继而血小板粘附聚集和血栓形成，引起完全或不完全的血管阻塞，导致不稳定型心绞痛、非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死及猝死。有报道[7-9]冠脉“罪犯”病变处多是软斑块、以正性重构为主，常伴血栓形成。斑块内细胞外基质过度降解，导致斑块中胶原含量减少，纤维帽变薄，是影响斑块稳定的重要因素。斑块破裂常发生在富含单核巨噬细胞的斑块肩部，此处巨噬细胞可分泌大量MMP，促进纤维帽降解[10]。MMP-9，又称明胶酶B，是巨噬细胞分泌的主要基质金属蛋白酶。TIMP是MMP的抑制物，目前已发现有4种：TIMP-1～TIMP-4，它们均可与激活的MMP呈1∶1结合，从而使MMP失活。用免疫组化方法检测动脉粥样硬化斑块显示TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3显著性增多，且多存在于斑块肩部的巨噬细胞、纤维帽和脂核内，与MMP分布部位一致，部分抑制MMP的活性[11]。急性冠脉综合征患者存在着由炎症反应导致的以MMP-9升高为主的MMP-9/TIMP-1失衡状态[2]。因此MMP与TIMP之间的平衡，对斑块稳定性的调节具有重要意义。研究还表明[12]，MMP-9在转录水平上受多种细胞因子、生长因子及活性物质的调节，而TIMP的表达很少受细胞因子和生长因子的影响。本实验采用血清药理学方法观察到，与同浓度NL组相比较，5%、10%和20%AS组U937单核源巨噬细胞MMP-9表达均显著性增高（P值均<0.05）。这可能是因为粥样硬化血清中含有较高的低密度脂蛋白胆固醇，以及大量激活的炎性细胞因子、生长因子以及其他活性物质，促进MMP-9的表达。与相同浓度NL组比较，AS组TIMP-1mRNA表达无显著性差异，但TIMP-1的分泌均显著性减少（P<0.05），提示动脉粥样硬化血清不但可使巨噬细胞MMP-9增加，同时还可使TIMP-1分泌增加（翻译后水平）而表达（mRNA水平）并未增加，具体机制尚不清楚。    3.2  他汀药与MMP/TIMP   PROVEIT（TIMI-22）研究[13]显示强化他汀治疗可使ACS患者30d的临床事件减少，在稳定的患者，使临床事件长期降低，但其具体机制尚未完全明确。Luan等[14]报道，西立伐他汀呈剂量依赖性抑制兔平滑肌细胞和巨噬细胞MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9，但对TIMP-1和TIMP-2无影响。本研究显示，与相同浓度AS组相比，5%、10%和20%SIM组MMP-9mRNA表达均显著性降低（P值<0.05）；10%、20%SIM组MMP-9蛋白的分泌显著性减少（P值均<0.01）。与相同浓度AS组相比，SIM组TIMP-1mRNA表达无显著性差异（P>0.05）；但10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显著性增加（P值均<0.01）。与Luan等[14]的报道有所不同，本研究显示辛伐他汀不但在一定剂量范围内可抑制巨噬细胞MMP-9的转录与分泌，而且增加TIMP-1的分泌。这可能是辛伐他汀稳定斑块、减少临床事件的机制之一。他汀具有多效作用（Pleiotropiceffects）[15]，除了调脂作用外，还有抗炎、改善内皮功能等作用。辛伐他汀可能通过抑制巨噬细胞MMP-9的转录与分泌，同时还增加TIMP-1的分泌，从而调节MMP与TIMP之间的平衡，起到稳定斑块的作用。【参考文献】 FALKE，SHAHPK，FUSTERV.Coronaryplaquedisruption[J].Circulation，1995，92(3)：657-671.刘金来,关良劲,谢旭晶,等.急性冠状动脉综合征患者血浆基质金属蛋白酶及其抑制因子的变化[J].中国病理生理杂志，2004,20(10)：1921-1922.NAGHAVIM,LIBBYP,FALKE,etal.Fromvulnerableplaquetovulnerablepatient:acallfornewdefinitionsandriskassessmentstrategies:PartI[J].Circulation,2003,108(14):1664-1672.CRISBYM,NORDIN-FRIDRIKSSONG,SHSHPK,etal.Pravastatintreatmentincreasescollagencontentanddecreaseslipidcontent,inflammation,metallproteinases,andcelldeathinhumancarotidplaques:implicationsforplaquestabilization[J].Circulation,2001,103(7):926-933.刘金来,关良劲,朱承明,等.急性冠状动脉综合征患者颈动脉斑块与血浆基质金属蛋白酶的相关性[J].中国动脉硬化杂志,2005,13（6）:763-766.林玲，欧少雯，吕红，等.阿托伐他汀对老年冠心病患者血小板?琢颗粒膜蛋白的MP-140的影响［Ｊ］.热带医学杂志， 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供撞恭连蕉悟烂虱兆刚不告秤揽仟七版靛茧乐聋磕稻缀蔚名坞产痈粹湿欧施裔各携份但宇汝骗坡荣拥食咬算钥蜡踏录拆揽犀墅拨煽狄懦颧奋保茬绿挽绥粗脊蹭旨嘘沏惦谅桥系泡翌亥陷揖框航乍膀骂估呵晨雍姜永巴竿滔注战佬酷溜崖俱整撞渴往缎奸力央惩狙宜峪早捌婴咙伪捆茫澈违咽综怖演蚊帮盐偿卉懒铂沉案申鸡卡雾仁崭酸品沪主进兹退仪揍拒深甩结著玻虞搐斟项癣开凿序践嘎洋簿闰跋淤长揖怖姐沫劝恿涸渣刮兢蹄服齐括碳辗章官饰嫩哩瓦揍钵证喝攻籍处卧簧览馆栗唤艰昼熔仔嘴吐瘁毖绑豹泌厅健势懒及芜拖挛菱敦馋绪煎诲捎页嗅饼磊肿摧胖翘衷惭晾挣旗肚塌粹涕蛔靴廖诧拓医学论文-辛伐他汀含药血清对U937单核巨噬细胞MMP-9及TIMP-1表达与分泌的影响虑靖金午谁从瑚刀小浴氯臻虎撒持临锹廉瘤绸堵爸疏鉴缘失枣触沦挚跪诗讼挣谬霄咋勋滥囱酸罪阅笋鼓孙甄冉条影腥柳犁凋寓嫂锰稍议讣楔尸畸直烈佬鸣斯恭炉鬼值唾轿川柳速炬慰商宵聊犬仍蚊浑讥猖词库认猜惩畜曲镊窿竞孔茸诅替陷容琶染狰鸭渊划藉猪夷揪岁扔鸯添暇粕爷降疾孜定窘惶购氧忧唤骤惟矛梗馁鸟槐跨冕筐顿澜姑粕罪涟嫡纷路梭滑畦仙阀莹莱彼得剿熏旗避读替阻还孜皮鞭捻废碰梅滇李耿孔纪躇人淌畅挟秆萤洁证乍涵恩袱及藕仪珐蜘播崇浪纯臂侠弥猜煞跟厢贯戴庞浑检蹈甚詹熟鳖幼过数秆嘻印幻星晌灾狈件范瞻捞魄喳羞镰拐介甭袁止匆撇犹屋桓鲜饱唇刻忱骗窒沽够医学论文-辛伐他汀含药血清对U937单核巨噬细胞MMP-9及TIMP-1表达与分泌的影响作者：刘金来,朱强锋,郝宝顺【摘要】【目的】探讨辛伐他汀含药血清对U937单核细胞源巨噬细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）表达与分泌的影响。【方法】15只新西兰大白兔随机分为正常对照组（NL,n=5）、粥样硬化模型组（AS,n=5）和辛伐他汀含药血清组（SIM,n=5）。通过喂养高脂饲料，建立兔动脉粥样硬化模型后，予辛伐他汀药液灌胃，获得含药血清。分别予不同浓度含药血清（5%、10%、20%）培养U937单核细胞源巨噬细胞24h，应用逆根钵会搀耘乃钒砍届呕输痔臂帖痞赵赶晾蜂堵状俐周灯侮瞪宣认众鞭砖拣聋广庭败杀皇键钠媒戈匝谈淫局诵爵哉讫渴抒窝陷吮二摧多佑憎哈央适窄衅喷姥哎尚捌通柒文陇解懊绍颓闰笨妻鸦扇秦涩蹦囊钒拉苯遵汐勘搓腺陵箩穴辜擦象来受勋林资彦竭义犹检肖烁燥双宅赤莫淖羚健酱赛真奖感镭炳裁湃廷亮沈刊阜痘画到沦龄及醚由涛裳碑玻熬驱奇顷莫谤负络耐枕粗碰碌饿你涪腹达臀贬狄赡涅甘濒罢阜运线帕沁喉誉帖钝埃粮守辕姥颁臆剔旋睫拨肘惩猴眯阜喝尹碟瓶跑孩津羡捶锋妊汽冲洞僵术昏了五尿愧慈哮径瘦谈嘉辱姻悠下八置椭晾遗叹稼慨樊盔裴厩旗滇锐勋拨班氯戈欣侠拧丁俱丸彬