AL型淀粉样变性临床病理特点、预后因素分析及生物标志物探讨

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分类号R597.2UDC616.07密级公开AL型淀粉样变性临床病理特点、预后因素分析及生物标志物探讨张明培养类别非全日制学位类型学术学位一级学科(专业类)临床医学二级学科(专业)内科学（肾脏病学）研究方向肾淀粉样变性指导教师孙世仁教授（主任医师）培养单位西京医院肾内科二O一七年十二月 独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：保护知识产权声明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位为第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文等使用本论文工作成果时第一署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外），可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文；学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》和编入《中国知识资源总库》等，并可浏览和下载，同时享受《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定的相关权益。论文作者签名：导师签名：日期： 第四军医大学硕士学位论文目录缩略语表·····································································································1中文摘要·····································································································3英文摘要·····································································································5前言·····································································································8文献回顾·····································································································9第一部分·······························································································9第二部分······························································································18第一部分AL型淀粉样变性临床病理特点及预后危险因素分析··························24正文····································································································251研究对象和方法···············································································261.1研究对象···················································································261.2研究方法···················································································261.2.1临床评价指标·········································································261.2.2实验室检查············································································271.2.3病理学检查············································································271.2.4淀粉样变性分期······································································271.2.5组织病理评分·········································································281.2.6治疗······················································································281.2.7随访······················································································291.3统计学方法················································································292结果·······························································································293讨论·······························································································40小结····································································································44第二部分血清Vitronectin与AL型淀粉样变性诊断和治疗反应性的相关性探讨··45正文····································································································461研究对象与方法···············································································481.1研究对象···················································································481.2研究方法···················································································48 第四军医大学硕士学位论文1.3统计学方法················································································492实验一······························································································502.1实验材料和试剂···········································································502.2实验方法·····················································································503结果·································································································524讨论·································································································58小结····································································································60参考文献····································································································61附录····································································································73个人简历和研究成果····················································································74致谢····································································································75 第四军医大学硕士学位论文缩略语表缩略词英文全称中文全称ALLightchainamyloidosis轻链型淀粉样变性ALPAlkalinephosphatase碱性磷酸酶CRCompletehematologicalresponse完全血液学反应dFLCDifference-freelightchain游离轻链浓度差值eGFRestimateedglomerularfiltrationrate估算的肾小球滤过率ESRDEndstagerenaldisease终末期肾脏病FLCFreelightchain游离轻链浓度IgImmunoglobulin免疫球蛋白IFEImmunofixationelectrophoresis免疫固定蛋白电泳LCDDLightchaindepositiondisease轻链沉积病Scrserumcreatinine血清肌酐TnTTroponinT肌钙蛋白TTnITroponinI肌钙蛋白IMMMultiplemyeloma多发性骨髓瘤NRNoresponse无缓解OROddsratio比值比PRPartialresponse部分缓解SAPSerumamyloidPcomponent血清淀粉样P物质VGPRVerygoodpartialresponse非常好的部分缓解1 第四军医大学硕士学位论文VTNVitronectin玻连蛋白2 第四军医大学硕士学位论文AL型淀粉样变性临床病理特点、预后因素分析及生物标志物探讨硕士研究生：张明导师：孙世仁教授辅导教师：王妍博士第四军医大学西京医院肾内科，西安710032资助基金项目：国家自然科学基金项目（81600562）中文摘要背景及目的：AL型淀粉样变性是一种蛋白质异常折叠的系统性疾病，发病率逐年升高，且由于缺乏特效治疗手段，致死率高。我国尚缺乏大样本的流行病学及预后研究，目前临床上缺乏无创或微创的诊断手段、评估疗效及预后的生物标志物。国内外多个研究提示vitronectin等多种伴侣蛋白共沉积于淀粉样沉积物中，但缺乏血清学及具体致病机制的研究。本研究旨在分析我国西北地区AL型淀粉样变性患者临床特点及预后相关因素，并探索血清vitronectin在AL型淀粉样变性疾病的诊断及预后中的作用。方法：回顾性分析2003年01月-2017年9月期间在第四军医大学附属西京医院经病理诊断AL型淀粉样变性患者临床病理特点、治疗及预后危险因素。应用双抗体夹心ELISA法检测AL型淀粉样变性患者治疗前后、慢性肾小球肾炎对照组、健康人群对照组血清中的血清vitronectin浓度。结果：164例AL型淀粉样变性患者纳入本研究，其中130例为经肾穿刺活检确诊AL型淀粉样变性病患者。发病平均年龄57.5±9.8岁，男性103例（62.8%），最常见3 第四军医大学硕士学位论文的临床症状为水肿（84.8%）。肾脏（92.7%）是最常见的受累器官，其次依次为心脏、肝脏等。轻链类型λ（74例）：κ（35例）=2.1:1。诊断时出现≥2个器官受累患者达73.2%。MayoClinicⅠ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者分别为24.8%、31.0%、37.9%、6.2%。未经化疗患者中位生存时间为13（5,31.5）月，患者1年、2年、3年、5年生存率分别为56.5%、45.9%、30.6%、23.6%，经化疗后患者1年、2年生存率分别为94.6%、92.5%。COX单因素分析显示心脏受累、肝脏受累、低血压、多器官受累（≥3个器官受累）、疾病进展为患者生存时间缩短的危险因素，化疗或干细胞移植后患者生存期显著延长。COX多因素分析中显示，心脏受累、低血压是预后不良的独立危险因素，化疗是预后的独立保护因素。本研究检测30例AL型淀粉样变性患者血清vitronectin浓度，其中男性16例，平均年龄58.0岁，均存在肾淀粉样变性，其中23例合并心脏淀粉样变新，5例合并肝淀粉样变性，2例合并外周神经淀粉样变性。配对病例对照20例健康人和20例慢性肾炎患者。治疗前的AL型淀粉样变性患者血清中vitronectin浓度明显高于健康人对照组及慢性肾炎组（74103.9ng/mlvs53946.3ng/ml，p=0.008；74103.9ng/mlvs42240.3ng/ml，p＜0.001）。AL型淀粉样变性患者治疗有效组患者血清vitronectin浓度较治疗前显著下降（81341.1ng/mlvs36158.9ng/ml，p=0.033），而治疗无效组患者血清vitronectin浓度较治疗前轻度下降，但并无统计学差异（p=0.203）。ROC曲线分析发现，血清vitronectin浓度临界值为66797.8ng/ml时，诊断AL型淀粉样变性的特异度为92.7%，敏感度为66.7%。结论：AL型淀粉样变性发病好发于中老年人，最常见的临床症状为水肿，肾脏为最常受累器官之一，未经化疗患者中位生存时间为13月，经化疗后患者生存率显著升高。心脏受累、低血压是患者预后不良的独立危险因素。AL型淀粉样变性患者的血清vitronectin浓度显著高于慢性肾小球肾炎及健康人对照组。血清vitronectin浓度随着AL型淀粉样变性患者疾病缓解而显著降低。血清vitronectin浓度为66797.8ng/ml时，诊断AL型淀粉样变性具有较高的特异度。血清vitronectin浓度有可能为AL型淀粉样变诊断及治疗效果的生物标志物，vitronectin在淀粉样变性发病中的作用机制需要进一步研究。关键词：淀粉样变性病,免疫球蛋白轻链，化疗，预后，生物标志物，玻连蛋白。4 第四军医大学硕士学位论文Theclinical-pathological-prognosisfeaturesandthebiomarkerofALamyloidosisCandidateformaster:ZhangMingSupervisor:SunShirenTutor:WangYanDepartmentofNephrology,Xijinghospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,ChinaSponsoredPrograms:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81600562)AbstractObjective:ALamyloidosisisaproteindisfoldingdisease,withlowmorbidityandhighmortality.ThelargecohortepidemiologystudyofALamyloidosisinChinaisrare.Thenon-invasiveorminimal-invasivemethodsofdiagnosisandthebiomarkersofprognosisandtreatmenteffectareabsence.Somestudyindicatedthatvitronectincolocalizeswiththetissueamyloidosisdeposition,whiletheunderlyingmechanismofvitronectinisunknown,thecirculationlevelofvitronectininALamloidosishasn’tbeenstudied.Theaimofourstudyistorevealtheclinical-pathologicalfeaturesandprognosticfactorsinalargecohortofALamyloidosisintheNorthwestofChina,andinvestigatethecirculationlevelofvitronectininthediagnosisandprognosisofALamloidosis.Methods:ThepatientsdiagnosedasALamyloidosisduringJan.2003toSep.2017inXijingHospitalwerestudiedretrospectively.Thedetailedclinical,pathologicalandlaboratorydata,thetreatmentregimensandthefollow-updatawerecollectedandanalyzed.SerumvitronectinlevelofALamyloidosisandcontrolgroupsisdetectedbydouble-antibodysandwichELISA.5 第四军医大学硕士学位论文Results:164patientsofALamyloidosiswereenrolled,and130werediagnosedbyrenalbiopsy.Themeanagewas57.5±9.8yearsoldand62.8%(103/164)weremale.Themostcommonsymptomwasedema,92.7%ofthepatientshadthekidneyinvolvedand50%patientshadtheheartinvolved,73.2%(120)patientshadmorethanoneorganinvolved.24.8%patientswereclassifiedasMayoclinicStageⅠ,31.0%patientswereStageⅡand37.9%wereStageⅢ,6.2%werestageⅣ.Themediansurvivaltimeofpatientsuntreatedis13months，andthe1year,2year,3year,5yearsurvivalrateare56.5%、45.9%、30.6%、23.6%respectively.The1yearand2yearsurvivalrateofpatientstreatedare94.6%、92.5%respectively.Theheartinvolvement(OR2.586,95%CI:1.355-4.936),andhypotension(OR1.870,95%CI:1.039-3.35)wereindependentriskfactorsofprognosisandthechemotherapy(OR0.344,95%CI:0.133-0.893)wastheprotectivefactorofprognosis.30ALamyloidosispatientswereenrolledinstudygroup.TheserumvitronenctinconcentrationofuntreatedALamyloidosisgroupissignificantlyhigherthanhealthycontrolgroupandchronicglomerulonephritisgroup（74103.9ng/mlvs.53946.3ng/ml，p=0.008；74103.9ng/mlvs42240.3ng/ml，p＜0.001respecitively）.SerumvitronentinconcentrationofALamyloidosiswhohadachievedhematologicresponse(VGPRorbetter)significantlydecreases(81341.1ng/mlvs36159.9ng/ml,p=0.033).ROCanalysisindicatedthat,thethresholdvalueofserumVTNconcentration66797.8ng/mlwillpredicateALamyloidosiswith92.7%specificityand66.7%sensitivity.Conclusion:AgedpeoplearemorefrequentlyinvolvedinALAmyloidosis,andtheedemaandkidneyinvolvementaremostcommon.Themediansurvivaltimeofpatientsuntreatedis13months.Thesurvivalrateofpatientsafterchemotherapyincreasesignificantly.Theheartinvolvementandhypotensionwereindependentriskfactorsofprognosis.TheserumvitronenctinconcentrationofALamyloidosisgroupissignificantlyhigherthancontrolgroup.SerumvitronentinconcentrationdecreasesalongwithremissionofALamyloidosis.ThethresholdvalueofserumVTNconcentration66797.8ng/mlwillpredicateALamyloidosiswithhighspecificity.ThevitronenctinmaybeanewbiomarkerfordifferentialdiagnosisandevaluatingtherapeuticeffectsofALamyloidosis,andtheunderlyingmechanismshouldbeinvestgatedfurther.6 第四军医大学硕士学位论文Keywords：Amyloidosis;Immunoglobulinlightchain;chemotherapy;Prognosis;biomarker;vitronectin.7 第四军医大学硕士学位论文前言AL型淀粉样变性是目前临床最常见也是最严重的淀粉样变性类型，其是由异常浆细胞增生产生单克隆的免疫球蛋白轻链聚合成蛋白质片段，其二级或三级构象发生β折叠后形成的不溶性的纤维样蛋白物质，这些物质随血液沉积于各个脏器和组织细胞间，导致细胞凋亡从而进一步损伤器官功能，其发病机制目前仍不完全明确。AL型淀粉样变性发病率逐年升高，且由于缺乏特效治疗方案，死亡率高。与欧美发达国家相比，我国对淀粉样变性研究相对落后，绝大多数临床工作者对淀粉样变性认知不足，造成了临床上很多淀粉样变性的误诊和漏诊，从而延误了淀粉样变性患者最佳治疗时间，导致我国淀粉样变性患者极高的死亡率。我国目前对淀粉样变性的认知，以借鉴欧美发达国家的经验为主，仍然缺乏多中心、大样本量的临床研究，没有符合我国自己的流行病学、临床特点、治疗和预后的研究。同时AL型淀粉样变性发病机制目前仍未完全明确，临床上缺乏无创或微创的诊断手段，虽然目前已有阻断淀粉样前体蛋白向淀粉样蛋白转变及清除淀粉样蛋白的新药进入临床Ⅰ/Ⅱ期试验，但目前临床试验数据显示，仍有相当部分患者使用无效，且新药应用范围较局限。因此我们应深入AL型淀粉样变性发病机制的研究，寻找新的诊断、判断治疗及预后的生物标志物。8 第四军医大学硕士学位论文文献回顾第一部分淀粉样变性(amyloidosis)是一种由异常不溶性纤维样物质沉淀于器官或组织细胞外间质造成的一组临床疾病，这些异常不溶性纤维样物质是由正常的可溶性蛋白[4]质错误折叠聚合而产生。淀粉样物质首先由德国学者Sehleiden于1838年发现，1854年著名病理学家Virchow将之作碘试验/碘-硫酸试验，发现其呈现类似淀粉遇碘变紫[1]蓝色而命名为淀粉样物质。随着电子显微技术的发展，1959年首次在高分辨率电[2,3]子显微镜下观察到淀粉样物质，直径7-10nm。目前已知有超过30种前体蛋白可形成淀粉样纤维丝，其中15种前体蛋白可造成系统性受累，其中最常见的淀粉样变类型分别是轻链型（AL），家族性或老年系统性（ATTR）以及AA型淀粉样变（AA）。不同种类淀粉样蛋白侵害器官和组织不同，但一般情况下以侵害肾脏，心脏，肝脏，[5]消化道，皮肤等组织器官最为常见。AL型淀粉样变性即单克隆免疫球蛋白轻链型淀粉样变性，也称为原发性淀粉样变性，是由异常浆细胞增生产生单克隆的免疫球蛋白轻链聚合成蛋白质片段，其二级或三级构象发生β折叠后形成的纤维样物质，是淀粉样变性病中最常见也是最严重的类型，其发病机制目前仍未完全明确。AL型淀粉样变性通常是以多脏器或组织受累为特征的全身系统性疾病。少数病变呈局限性，仅存在单个器官或组织的局部受累，有报道表明这种局限性受累可能与单克隆浆细胞产生的淀粉样蛋白轻链局部[6]渗透有关，而且这种局限性受累不会进展为多器官受累。流行病学特点：目前世界范围内淀粉样变性研究绝大部分集中在欧美等发达国家，其流行病学研究相对完善。近年来我国学者逐渐重视淀粉样变性病的研究，但我国仍缺乏多中心、大样本的淀粉样变性流行病学研究。欧美国家流行病学资料表明，AL型淀粉样变性是少见病，大约只有多发性骨髓瘤发病率的1/5-1/10，但AL型淀粉样变性病仍是西方发达国家最常见的系统性淀粉样变性病类型，其发病率约9[7]人/百万人口/年。AL性淀粉样变性病男性患者较女性患者多见。其平均发病年龄[7]在65岁，只有10%左右患者年龄低于50岁。随着我国人口老龄化及环境致病因素的加剧，AL型淀粉样变性发病率呈现逐年增高趋势。刘志红院士团队单中心研究9 第四军医大学硕士学位论文[9]显示，肾脏淀粉样变性占所有肾穿刺活检约2%，平均发病年龄在56岁左右，有近30%患者年龄低于50岁，AL型淀粉样变性病已成为我国中老年肾病综合征第二大继发性病因。临床特点：系统性AL型淀粉样变性病可以累及到除中枢神经系统外其他任何组织和器官。初始受累器官不同，其始发临床表现不同。目前尚没有文章报道不同种[10]族或不同地理位置其发病率及临床表现是否不同。以美国Mayo中心研究为例，其最常见的始发症状为乏力和呼吸困难，其最常见的器官受累为心脏，约占38%，其次为肾脏受累，约30%，外周神经受累约占20%，肝脏和消化道受累均约10%。[10]而意大利Pavia中心研究显示，其最常见的受累器官为肾脏，约占50%，心脏受累接近30%，其次受累器官依次为肝脏、外周神经系统、消化系统等。刘志红院士[9]团队研究显示，最常见受累器官为肾脏，约占85%，其次为消化系统受累，接近60%，其次依次为心脏、肝脏、外周神经系统。可见不同种族、不同地理位置，其始发受累器官也有不同。虽然始发受累器官不同，但器官受累后期临床表现基本一致。肾脏受累是临床最常见的，表现为大量蛋白尿，以白蛋白为主。临床表现为肾病综合征及肾小球滤过率下降。与轻链沉积病（LCDD）相比，罕见血尿和高血压。肾淀粉样变性病诊断需有肾穿刺组织活检确诊，或者不能肾穿刺活检者，可以有其他组织活检确诊，伴有24小时尿蛋白定量（白蛋白为主）大于等于0.5g，也可诊断[11]肾淀粉样变性。心脏受累是临床最危重的，同时也是最难确诊，最易漏诊的。超过50%的患者在确诊时已经发生心脏衰竭。淀粉样纤维物质不断沉积在心肌，导致心室壁及室间隔逐渐增厚，诱发限制性心脏病，临床出现乏力、呼吸困难、双下肢水肿等症状。同时淀粉样纤维物质产生的毒性还会渗透进入心肌，导致心电传导障碍，诱发室性或室上性心律失常。大量文献报道心脏受累是系统性淀粉样变性预后最重要的危险[12]因素，有75%淀粉样变性患者死亡原因为心衰或心律失常。在对AL型淀粉样变性患者的研究提示，如果出现心衰或者血清Pro-BNP显著升高，患者的中位生存期[8]只有3.5月，远远小于无心脏受累者中位生存期。肝脏受累在临床也较常见，主要临床表现为肝叶增大，常伴有非肝衰性的血清123碱性磷酸酶水平升高。肝脏淀粉样变性可以通过I标记淀粉样蛋白P成分，行闪烁扫描术很容易检测出来，但这项技术并未广泛应用于临床。无创检查包括肝脏瞬10 第四军医大学硕士学位论文[13]时弹性硬度检查，有助于肝淀粉样变性诊断。外周神经系统受累主要临床特点为神经痛，缓慢进展的外周神经感觉异常，类似于糖尿病性神经病变。腕管综合征比较常见。自主神经病变也可伴随外周神经病变，包括假性肠梗阻、腹泻、便秘等，常常导致严重的体位性低血压。消化道系统受累常见的临床特点为消化道功能障碍、便秘或腹泻交替，或消化道出血。严重者可能出现胃肠道吸收功能障碍或者消化道穿孔。其他器官比如肌肉、皮肤、脾脏、肺等常可并发出现。临床表现为巨舌、眶周紫癜、肌肉假性肥大等。病因学：AL型淀粉样变性是由浆细胞产生的单克隆免疫球蛋白轻链聚合后形成[14]纤维样物质沉积在细胞外导致一系列的疾病。有研究显示，该病骨穿刺活检浆细胞平均比例在7%左右。有大约15%左右AL型淀粉样变性患者可伴有多发性骨髓瘤，[15]罕见还会伴有巨球蛋白血症、非霍奇金淋巴瘤或者IgM副蛋白病。尽管AL型淀粉样变性浆细胞增生程度相对较小，但其在细胞遗传学上观察到的细胞增殖频率与多发性骨髓瘤相似。而与多发性骨髓瘤相比较，AL型淀粉样变性在等位基因（11；[16]14）易位频率更多，可能与其分泌过多游离轻链有关。通过免疫固定蛋白电泳技术可以在80%-90%患者的血清或尿液中的找到游离轻链。导致淀粉样变性的关键在于异常的单克隆蛋白轻链聚合后发生了二级或三级空间结构的改变，这些构象改变主要是因为游离轻链发生了β折叠。这些β折叠的轻链反复的二次构筑、聚合，形成肽链，通过氢链在NH端和CO端互相结合。这些氢链可以是同一肽链的不同位置，也可以是不同肽链相互连接，促进低聚体形成和沉淀。而淀粉样物质就是有这些富有β折叠的单体蛋白构成，形成直径在2-5nm细丝[17]样的纤维，而每2-6个这样的细纤维丝束在一起，就形成了淀粉样纤维。免疫球蛋白轻链分为λ轻链和κ轻链，每个免疫球蛋白分子上只能有一种轻链，[19]每一种免疫球蛋白轻链都有多个易变基因区域（V-gene），而这些易变区域可能有器官受累的趋向性，例如λ轻链易变区域Ⅰ（VλVⅠ）在淀粉样单克隆免疫球蛋[20]白特异性表达，大约占λ轻链41%。IGVL1-44基因则更多见于心脏受累，κ轻链[21]更多见于肝脏受累。由于淀粉样变前体蛋白可以随血液沉积到各个组织器官，从而引起广泛的系统性综合征。以往普遍认为受累器官功能障碍是因为淀粉样纤维物质不断沉积的结果，11 第四军医大学硕士学位论文比如心肌淀粉样变，大量淀粉样纤维物质不断沉积在心肌，导致室间隔、心室壁不断增厚，而出现心脏功能损害。而近些年来，有些临床研究和观察表明，器官功能[22]损害可能更多的与这些单克隆免疫球蛋白轻链的直接毒性相关。有研究显示，严重心肌淀粉样变性患者化疗后，很快出现完全血液反应，临床症状也快速改善，血清中Nt-proBNP水平也迅速降低，但超声心动图显示患者心脏室间隔或心室壁淀粉样蛋白沉积并没有改变。对从淀粉样心脏病患者体内分离出的淀粉样轻链研究发现，这些轻链通过激活促分裂原化蛋白激酶（MAPK）p38产生了特异性的氧化应激，细[23]胞功能障碍及心肌细胞凋亡。诊断：目前淀粉样变性的确诊依然依靠在组织中找到淀粉样纤维蛋白的证据。AL型淀粉样变性组织在光镜下可见细胞外刚果红染色阳性的物质杂乱沉淀，高锰酸钾氧化后仍呈阳性，在偏振光下可见特异性的苹果绿色的双折光。如果组织切片厚度小于5μm，刚果红染色可能出现假阴性结果。所以病理上还需要行免疫球蛋白游离轻链抗体免疫组化或免疫荧光检查，阳性为单一轻链λ轻链或κ轻链阳性。此外在淀粉样变性早期或病变较轻时，免疫组化或免疫荧光检查可能出现阴性结果，此时需借助电子显微镜下可见直径在8-10nm细纤维状结构杂乱排列。为提高诊断阳性率，病理活检部位一般选取临床上有症状的器官或组织，例如肾穿刺、肝穿刺、唾液腺、皮肤、胃肠道黏膜等，诊断阳性率超过95%，骨髓穿刺[25]活检阳性率约50%-65%，但有创检查也有可能带来相应的风险。近些年来国际上倡导采用无创或微创的腹部脂肪抽吸术，其阳性诊断率在75%-80%，方法简单易操作，风险较低，对于对有创检查禁忌的患者可行此检查，但其阴性结果不能完全排[26]除淀粉样变性病。刚果红染色及高锰酸钾氧化后阳性，对AL型淀粉样变性诊断并没有特异性。同样，在血清或尿中检测到异常的副蛋白，也不能作为确诊AL型淀粉样变性的证据。这就要求我们对免疫球蛋白进行分类。淀粉样蛋白分类首先依靠对石蜡包埋的组织切片行免疫组化检测和对冰冻切片行免疫荧光显微技术来特异性的区分λ轻链或κ[27]轻链。有研究证实免疫荧光显微技术较免疫组化法更可靠（65-85%vs38-87%）。尽管如此，以上这些方法存在一定的局限性，比如取材部位有可能避过了致病轻链的沉积部位或致病轻链沉积程度不同等。所以近年来在某些研究中心，采用了激光切割石蜡包埋样本，然后以质谱分析为基础蛋白质组学方法对淀粉样蛋白进行分析。12 第四军医大学硕士学位论文这种方法更为特异而且敏感，可以快速对绝大部分淀粉样变性蛋白进行分类。这种方法目前虽然尚未在临床广泛应用，但它可以大大降低不能分型的淀粉样蛋白的比[28]例。与其他器官受累相比，心肌淀粉样变性风险更大，死亡率更高，却最难依靠活检确诊，因为心肌或心内膜活检风险更大。所以心肌淀粉样变性的诊断，更多是依靠其他组织活检确诊后，通过心脏相关化验或检查来辅助诊断。心电图和超声心动图是临床上最常用的辅助诊断方法。AL型淀粉样变性伴有心脏受累患者的心电图多出现QRS波＜0.5mV，常伴有肢导联低电压。超声心动图则可观察到室间隔类似“颗粒状，泡沫状”的反射性回声增加心肌层表象。如果测定心脏舒张期室间隔厚度超过15mm，则预示严重的心肌淀粉样变性病，如果不能及时治疗，其中位生存期只有6个月。近年来一些新技术的应用，也为辅助诊断心肌淀粉样变性提供帮助，例如心脏舒张期彩色多普勒心肌速度成像和应变率成像，可以发现早期的心肌淀粉样变性[29]患者左室功能不全。还有最新的核磁共振左心室钆（LGE）显像，在心肌淀粉样变性有特异性显像，可以提供强有力的淀粉样变心肌病的证据。一个35例经组织结构确诊淀粉样心肌病系列研究发现，有28例（83%）在LGE成像中显示整个室壁或[30]心内膜下有特征性表现。心脏磁共振成像（CardiacMagneticresonanceimaging）相比超声心动图诊断心肌淀粉样沉积更灵敏，即使心室壁厚度正常，LGE成像可以检测到心肌淀粉样沉积。初步研究显示LGE成像对诊断心肌淀粉样变性灵敏度在[31,32]86%-88%，特异度86%-90%。此外在血液学检测中肌钙蛋白（Tn）T、肌钙蛋白（Tn）I、B型脑钠肽（BNP）及N末端前脑钠肽（NT-proBNP）均是评价心脏功能敏感的指标。国际上通用的AL型淀粉样变性病Mayo分期，主要根据以上敏感指标。2004年Mayo分期以NT-proBNP＞332ng/L，TnT＞0.035μg/L或TnI＞0.01g/L分[33]为3期，2012年增加了致病游离轻链与非致病游离轻链差值（dFLC）＞180mg/L、[34]NT-proBNP＞1800ng/L，TnT＞0.025μg/L分为4期。治疗：根据AL型淀粉样变性形成的生物学原理，其治疗途径主要有以下3种：目前临床最常见最有效的是抑制潜在的浆细胞克隆产生形成淀粉样纤维物质的免疫球蛋白轻链；第2种治疗途径是稳定游离轻链聚合体的空间结构，抑制或阻止其发生β折叠；第3种途径是以已经形成的淀粉样沉积物为靶目标，破坏已经形成的淀粉样沉积物的β折叠构象，清除淀粉样沉积物。第1种治疗途径是当前临床应用的13 第四军医大学硕士学位论文主要方法。AL型淀粉样变性总体来看就是淀粉样物质沉积与这种物质被清除的平衡被破坏。使用化疗药物后，淀粉样蛋白产生减少或停滞，依靠器官组织的分解代谢清除淀粉样蛋白的沉积。而这种淀粉样蛋白代谢分解清除的程度或速度则与个体差异性，或者器官的受累程度有关。比如沉积在肝脏的淀粉样蛋白一般在3-4月内清除掉，而在心肌沉积的淀粉样蛋白则可能需要数年才能清除。所以临床上治疗AL型淀粉样变性的目标就是达到血液学缓解。目前国际通用的血液反应标准：完全缓解（CR），即体内轻链比值正常，血/尿免疫固定蛋白电泳阴性；非常好的部分缓解（VGRP），即dFLC(致病轻链与非致病轻链差值)小于40mg/L；部分缓解（PR），即[39]dFLC下降大于50%；无反应（NR）未达到PR。大约20年前，由于缺乏有效地治疗方案，AL型淀粉样变性患者总体生存率非常低，马法兰联合强的松（MP方案，Melphalan+Prednisone）作为曾经治疗AL型淀粉样变性的最常用方案，后来大量的临床观察研究发现，应用MP方案与未治疗[40]患者总体中位生存期没有明显差异（18月vs12月）。随着对AL型淀粉样变性的不断研究以及新药的临床应用、新的治疗方案不断改进，AL型淀粉样变性的总体生存率也不断提高。目前临床上常用的经典且有效地方案主要有大剂量马法兰注射后外周血自体干细胞移植术（HDM/SCT）、马法兰联合地塞米松方案（Melphalan+Dexamethasone,MD）、环磷酰胺联合沙利度胺联合地塞米松方案（Cyclophosvnamide+Thalidomide+Dexamethasone,CTD）、硼替佐米联合地塞米松方案（Bortezomib+Dexamethasone,BD）。外周血自体干细胞移植为主的治疗方案HDM/SCT：具体方案为大剂量马法兰2100-200mg/m（根据年龄及疾病程度适当调整剂量）注射抑制骨髓造血功能后使用+粒细胞集落刺激因子（G-CSF）生长素动员，然后收集外周血造血干细胞CD34细胞。这个方案在1996年由RayComenzo最早应用于临床，其报道5例患者接受HDM/SCT[41]治疗，随访13月，5例患者均存活，其中3例患者得到完全缓解。随后该方案在临床开始陆续应用，2004年发表在Blood一项回顾性对照单中心研究显示采用[42]HDM/SCT方案患者4年存活率远高于一般化疗患者（71%vs41%）。波士顿大学一项多中心研究发现HDM/SCT方案血液学反应率超过60%，完全缓解率在40%，患者总体中位生存期达4.5年。该方案在治疗AL型淀粉样变性有着确切的疗效，但[43]由于大剂量的马法兰的毒性，其治疗相关死亡率（TRM）高达13%。追寻其原14 第四军医大学硕士学位论文因发现，部分患者因年龄或病情相对较重，无法耐受该治疗方案。这说明并不是所有AL型淀粉样变性患者均适用该方案，应该对患者进行筛选。一项15年的回顾性研究发现，应用HDM/SCT治疗患者其15年的总体治疗相关死亡率为11.4%，而经[44]过严格筛选患者后，其最近5年的治疗相关死亡率下降到5.3%。因此，对于初治的患者首先应进行筛选，明确其是否适合行HDM/SCT治疗。经过长期的临床经验积累，目前比较公认的适合行HDM/SCT治疗的AL型淀粉样变性患者标准为：年龄不超过70岁，受累重要器官（心脏、肝脏、肾脏及自主神经）不超过2个，收缩压≥90mmHg，cTnT＜0.06μg/L，心功能NYHA分级1-2级，肾小球滤过率（e-GFR）[45]≥30ml/min/1.73m2。随着医疗水平不断提高，HDM/SCT疗效也越来越好，国际血液与骨髓移植登记中心总结了1532例AL型淀粉样变性患者行HDM/SCT治疗的结果发现，自1995年起每5年一个观察周期，患者治疗相关死亡率由20%，逐渐下[46]降到5%，而近2个周期其治疗后5年总体生存率分别为61%和77%。因此，对于符合排查标准的AL型淀粉样变性患者，推荐HDM/SCT作为第一选择治疗方案。至于在完成HDM/SCT治疗后是否行后续药物化疗，目前尚存有争议，但已有几个研究中心观察到在HDM/SCT治疗后给予短疗程的硼替佐米联合地塞米松药物治疗，[47,48]其1年内的完全缓解率、2年内总体生存率有明显的提高。马法兰为基础的治疗方案：该方案是在曾经的MP方案优化而来，在很多研究中发现，以足剂量的地塞米松为基础的治疗方案可以产生血液反应并且能够延长生存期。一项比较MD与VAD治疗疗效研究中发现，MD总体疗效明显好于VAD方[49]案，而且其有效率接近HDM/SCT方案。该方案具体为：马法兰0.22mg/kg+地塞米松40mg/日，连续口服4天，停24天，每28天为1个疗程。为预防大剂量马法兰及激素副作用，总疗程一般不超过9-12个。该方案对AL型淀粉样变性患者尤其是不能行HDM/SCT方案患者有确切的疗效，而且起效时间更短（一般在1-3个疗程内起效），如果在3个疗程内没有达到PR以上的疗效，应更换其他方案。2007年法国一项多中心随机前瞻性临床研究，100例最新确诊的AL型淀粉样变性患者随机分配两组，分别应用HDN/SCT方案和MD方案，最终结果显示两个实验组在血液反应及器官反应没有明显的统计学差异，但HDM/SCT组在治疗后100天内的治疗相关性死亡率明显高于MDex组，此外对两组患者进行中位时间3年随访，两组总体生存率没有差异，对其意向治疗分析估算HDM/SCT组总体存活期为22.2月，而15 第四军医大学硕士学位论文[50][51]M-Dex组为56.9月（P=0.04）。2004年Palladini等对不适合HDM-SCT患者，给予MDex治疗，血液学反应率67%，平均生存时间5.1年，治疗相关死亡率4%。[52]2014年一项研究，入组119例AL行淀粉样变性患者，采用MDex方案，对于有严重心脏损害及重度水钠储溜患者给予减剂量地塞米松，足剂量组中位生存率为7.4年，减剂量组中位生存期为20月，两组对应的完全缓解率分别为31%、12%。这表明M-Dex方案对于多数不适合HDM-ASCT患者都能耐受，治疗相关死亡率低，尤其对MayoclinicIII期患者也有一定疗效，而足剂量的地塞米松有着更好的血液反应。因此目前为止，MD方案仍作为不适合HDM-ASCT的患者的首选药物治疗方案，但用药过程需观察药物副作用，尤其是继发性骨髓造血功能不良和急性非淋巴细胞性白血病等。沙利度胺为基础的治疗方案：经典的CTD方案为：环磷酰胺0.5g/周，连续3周，停1周，联合沙利度胺50mg/日（根据患者耐受，每日剂量不超过200mg），地塞米松20mg/日（第1-4天，第8-11天），每4周为1疗程，首次治疗总疗程不超过18个，为预防大剂量环磷酰胺可能导致肿瘤发生，终生环磷酰胺累计用量不超过36g。应用含有沙利度胺方案时，需要警惕药物相关毒性。在一项CTD方案的前瞻性研究中显示，65例AL型淀粉样变性患者应用CTD方案，其血液学缓解率达74%，完全[53]缓解率为21%，中位总体生存期为41月。有文献显示，CTD方案与MD方案有着相似的血液缓解率。由于该方案相对起效时间较长（一般3-6疗程），所以该方案一般作为二线用药方案。而随着新药的不断问世，更多的替代药物出现，比如来那度胺（Lenalidomide）、泊马度胺（Pomalidomide）等，均显示出良好的疗效。2012[54]年一项研究显示，35例AL淀粉样变性患者，其中24例既往未曾治疗，一半患者有3级心脏受累，28%患者有3个及以上器官受累，应用来那度胺+地塞米松+环磷酰胺治疗，其总体血液反应率达60%，中位血液学无进展的存活期为37.8月。此外[55]还有一项33例AL淀粉样变性患者，其中82%患者有心脏受累，采用泊马度胺+地塞米松治疗，结果显示完全缓解率达48%，中位反应时间1.9月，中位生存期为28月，1年无进展存活率为59%。硼替佐米为基础的治疗方案：：硼替佐米作为一种蛋白酶抑制剂在治疗多发性骨髓瘤（MM）应用广泛，近年来也将硼替佐米联合地塞米松或者地塞米松+环磷酰胺应用于治疗AL型淀粉样变性，也展现出优异的疗效。该方案常用剂量为硼替佐米：16 第四军医大学硕士学位论文21.3mg/m体表面积/次，给药方案一般有每周2次（21天一疗程，第1、4、8、11天给药），及每周1次（35天一疗程，第1、8、15、22天给药），推荐皮下注射以减轻[58]毒性，对于严重水钠储溜患者可静脉注射。一项单中心回顾性研究采用环磷酰胺联合BD方案治疗43例AL型淀粉样变性患者，其中74%有心脏受累，46%为MayoⅢ期，治疗后总体血液缓解率为81.4%，完全缓解率为41.9%，评估2年内疾病不进展存活率为66.5%。一项对94例AL型淀粉样变性患者应用该方案研究发现，患者[55]总体血液缓解率达72%，完全缓解率为25%，1年总体生存率为76%。2015年一[57]项回顾性研究对230例AL型淀粉样变性患者进行BD联合环磷酰胺治疗，总体缓解率为60%，完全缓解率23%。一项前瞻性临床试验评估了硼替佐米的用药疗效及安全性，该研究评估了每周2次给药和每周1次给药的差异，两组血液缓解率无明[59]显差异，但每周1次给药患者完全缓解率更高，同时其副作用更小。国内刘志红[60]院士团队一项72例AL型淀粉样变性累及肾脏患者的回顾性研究显示，采用BD方案治疗，总体血液缓解率为75%，完全缓解率为45%，中位起效时间2月，患者1年及2年生存率分别为83%和76%。由于BD方案有着较高的血液学及器官缓解率，同时起效时间短，患者生存期显著延长，国外很多中心已将BD方案或CyBD方案作为不适合HDM/SCT患者的一线用药方案，但目前其安全数据仍然有限，仍需大量的临床研究进一步证实。支持治疗：与特殊治疗血液学疾病相比，对症支持治疗对于存在器官衰竭的AL型淀粉样变性患者来说也是必要的。对于常规治疗心衰患者的用药，比如β受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂等，对AL型淀粉样变性心肌受累患者来说基本都是[109]无效的，甚至会加重病情。AL型淀粉样变性心脏受累患者大约有35%可能存在[61]心房血栓，确诊后可适当给予抗凝治疗，但需警惕出血风险。对于合并房颤患者，禁用地高辛，可尝试性使用胺碘酮。对于合并室性心律失常等患者，目前尚无特效方法预防心源性猝死。对于以肾病综合征为主要临床表现的患者，可给予袢利尿剂或联合其他利尿剂缓解症状。对于严重低蛋白血症患者，应注意预防血栓形成。肾功能衰竭、无尿或少尿患者，药物治疗无效时，可行肾脏替代治疗（血液透析或腹膜透析）。对于低血压患者，可给予米多君改善症状。此外应建议患者定期复查相关检查，监测方案疗效及病情变化。总之，AL型淀粉样变性可累及全身的各个组织和器官，治疗不仅需要针对异常17 第四军医大学硕士学位论文增生的浆细胞或B细胞，还需结合患者肾功能、患者耐受情况、药物副作用等。目前临床上有多项针对淀粉样变性的靶向治疗正在临床试验阶段，将会对淀粉样变性治疗带来新的选择。预后：判断AL型淀粉样变性的预后主要取决于治疗方案的血液学反应、器官受累的程度、是否有心脏受累。AL型淀粉样变性的病理特征及器官损害程度，取决于[62]淀粉样蛋白轻链的生化特性，而非瘤负荷。但也有研究显示，骨穿刺活检浆细胞浸润比例超过10%提示预后不良。AL型淀粉样变性病虽然发病率较低，但死亡率高，容易误诊及漏诊，早期诊断及治疗可以延长患者生存期。目前尚存在的问题：我国目前对AL型淀粉样变性整体认识仍然不足，临床研究仍停留在个别案例或小样本病例的报道，还没有一个完整的流行病学研究。目前尚无文献报道不同种族、不同地理位置其发病率及发病特点是否相同。而AL型淀粉样变性发病率逐年增加，临床缺乏特效治疗手段，致死率高，所以我们应该重视本病，尽快总结出我国人群的流行病学、临床特点，从而制定符合国人的治疗方案，这是摆在我们面前的当务之急。近10余年，得益于早期诊断及分型、早期治疗、化疗方案的不断改进，AL型淀粉样变性患者生存期显著延长。但因为仍缺乏特效的治疗手段，患者长期预后仍较差，致死率很高，且化疗药物副作用较大，部分患者无法耐受。所以我们仍需要对淀粉样变性的发病机制进一步研究，为治疗提供新的思路和靶点。第二部分淀粉样变性病是一种蛋白质异常折叠疾病，某种前体蛋白质发生构象改变，聚[72,74]合形成富含反向平行的β折叠片层纤维丝样结构，可以广泛沉积并破坏组织和[78,79,80]器官，引起器官功能障碍。目前已有31种确定的前体蛋白或肽链能够形成淀[70]粉样纤维物质。致病性前体蛋白可通过多种途径具备了折叠聚合的倾向：（1）某些前体蛋白本身具有易折叠性，在局部的浓度要达到一个临界值可能激发纤维形成；(2)基因突变导致蛋白质氨基酸序列中的某个氨基酸改变，使得其变异体的热力学稳定性降低等；(3)前体蛋白被蛋白酶水解形成易不稳定的肽链；（4）局部环境因素的改变，如温度、PH值、金属离子浓度都会影响淀粉样纤维形成的过程。(5)伴侣蛋白与前体蛋白相互作用导致蛋白质异常折叠。18 第四军医大学硕士学位论文[107]Pepys等研究者人工合成的小分子化合物CPHPC（R-1-[6-[R-2-carboxy-pyrrolidin-1-yl]-6-oxo-hexanoyl]pyrrolidine-2-carboxylicacid），其特殊的“回文”序列与SAP有着高亲和力，可与2个SAP的交联，从而使SAP的表面结合位点被占据，快速清除肝脏及循环中的SAP从而达到抑制淀粉样纤维丝形成并促进已形成[108]的淀粉样纤维丝分解。目前CPHPC已作为小分子药物应用于AL型淀粉样变性和抑制阿尔茨海默病的Aβ淀粉样纤维丝形成的治疗中。目前临床已将SAP作为治疗靶点。2015年Richards和Pepys等研究者应用单克隆抗SAP抗体联合CPHPC对15例淀粉样变性患者（包括8例AL型淀粉样变患者）治疗6周后，可减少循环中95%以上的的SAP，减少组织上和淀粉样物质结合约90%的SAP，肝脏、肾脏及淋巴结的淀粉样物质沉积量显著减少，目前已完成人类I期临床实验，但是仍有20%[73]患者治疗无效，且该治疗方案对心脏淀粉样变性病作用不明显。因此我们需要其他治疗靶点。国内外大量研究对沉积在组织的淀粉样物质进行蛋白质组学分析，发现除了淀粉样变性病前体蛋白外，还包含诸如血清淀粉样物质P（SAP）、玻连蛋白（vitronectin）、[81]载脂蛋白E（ApoE）、葡胺聚糖（GAGs）等，这些成分可能都特异性发挥着病理性分子伴侣的作用，参与淀粉样蛋白的形成与沉积过程。通过破坏这些伴侣蛋白从而抑制蛋白质异常折叠，成为目前治疗淀粉样变性的新治疗靶点及方向。本研究组前期研究中对沉积于肾脏的淀粉样物质进行质谱分析，发现vitronectin广泛存在于各种类型的淀粉样变性中，同时伴有大量补体成分沉积。Vitronectin的结构功能及在蛋白质异常折叠中的作用。1.Vitronectin的结构：vitronectin（VTN）蛋白，也称S蛋白或上皮细胞移动因子，是一种广泛存在于血液和细胞外基质的多功能糖蛋白。人类VTN蛋白相对分子量约为75kDa，由一条单链组成，可降解为2条单链（10kDa和65kDa）。在非降解条件下，N末端与C末端通过二硫键连接。其还有3个糖基化位点，约占总分子量30%。完整的阅读框架编码为459个氨基酸，前端有一个由19个氨基酸组成的信号[84]多肽。人类VTN蛋白与鼠和兔VTN蛋白有80%同源性。19 第四军医大学硕士学位论文[85]VTN分为5个区域，Ⅰ区：N端1-44氨基酸，其序列与生长调节素B相同。Ⅱ区：45-47氨基酸为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，粘附蛋白通过这个区域结构与整合素结合，调节细胞粘附和向细胞外基质扩散。Ⅲ区：即中央区域，此区域氨基酸序列与血红素结合蛋白和间质胶原酶相同，也称血红素同源去，其中包含两个硫酸化的络氨酸残基（56和59）。Ⅳ区：葡胺聚糖结合区，此区域可与葡胺聚糖结合，还可与肝素结合。Ⅴ区：糖基化区，此区域含有一个游离的硫氢键和三个糖基化位点（如图1）。[85,89,102]图1.Vitronectin分子的结构域及其主要生理功能。2.Vitronectin的生物功能：生理条件下VTN蛋白主要功能为参与细胞外基质固定、细胞粘附和传播、细胞增殖与扩散、凝血功能、免疫防御、纤维蛋白溶解。VTN蛋白通过其结构中的胶原或者肝素结合区域和粘多糖结合区域固定到细胞外基质。[86]通过与整合素αvβ3，αvβ5，αvβ1，αIIbβ3，αvβ6和αvβ8相互作用，促进细胞粘附、传播和迁移，一旦与VTN蛋白结合，这些整合素信号通路被激活，调节细胞骨架的[89]重组，细胞内离子转运，脂质代谢和基因表达。蛋白磷酸化导致了促分裂原活化蛋白激酶信号转导通路的激活，这个通路被认为与VTN和生长因子信号相关。通过与生长因子的互相作用，促进细胞的增殖。VTN蛋白通过与肝素结合，抑制肝素对抗凝血酶Ⅲ的加速作用，保护凝血酶，促进凝血。VTN能特异性与纤溶酶原激活物抑制剂I结合，稳定活跃的纤溶酶原激活物抑制剂I的构象，参与纤维蛋白溶解。20 第四军医大学硕士学位论文VTN蛋白可以与补体系统相互作用，起到免疫防御作用，VTN可以与链球菌和葡球菌直接结合，通过刺激单核细胞表面受体，强化单核细胞对被结合颗粒的吞噬，从[90]而增强机体的免疫力。其次VTN可以与补体结合形成可溶性的复合物，抑制膜攻击复合物的形成。3.国内外Vitronectin研究进展：得益于对vitronectin（VTN）生物功能的研究，[96]Dufourcq等发现VTN结合整合素αvβ3，αvβ5介导平滑肌细胞向血管内膜下的增殖和迁移，这是引起动脉粥样硬化斑块损伤的重要因素，平滑肌在动脉斑块损伤后增殖、迁移，强化了VTN的合成，而抗VTN抗体则可抑制平滑肌细胞的迁移。类似[97]的研究于2015年S.Aslan等在一项纳入62例急性心梗病例对照研究中再次证明VTN蛋白可以调控血管损伤凝血功能，并且在动脉粥样硬化时高表达。血清中VTN[98]蛋白水平可能与急性心梗疾病严重程度相关。2014年FarukTas等在一项60例黑色素瘤患者对照研究中发现，虽然VTN蛋白不是黑色素瘤唯一的诊断新标记分子，但是黑色素瘤患者的血清中VTN水平显著高于正常人群，并且VTN水平与黑色素[99]瘤分期有相关性。2016年GabrielaSchneider等在研究中发现稀释后的血浆诱导恶性肿瘤细胞的迁移能力远强于前体肿瘤细胞转移因子，他们对稀释后的血浆进行系列处理后发现这个功能与血浆中的分子量在50-100kDa的蛋白有关，而这个蛋白与GαⅠ蛋白藕合，激活靶细胞的p42/44丝裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶。最终通过质[100]谱分析后色谱分析确定这个蛋白就是vitronectin。随后Mao-HuaChen和[101]Moon-WonYoo分别在神经胶质瘤和胃癌患者血清中发现vitronectin特异性的高表达。目前国内外对vitronectin研究主要集中在其细胞粘附和传播、细胞增殖与扩散、凝血功能等生物功能的相关临床研究。[91]4.Vitronectin在淀粉样变性中的研究进展：1987年Dahlback等人通过免疫组化方法在AA型和AL型肾淀粉样变性沉积物中发现了vitronectin沉积。1991年[92]Akiyama等人在15例阿尔茨海默病患者的脑组织中发现vitronectin沉积。1996年[93]Bronfman等人在研究细胞外基质混合物对β淀粉样前体蛋白表达的影响及其在成纤维细胞淀粉样蛋白派生物的研究中发现vitronectin高表达。这个发现预示细胞外[94]vitronectin的聚集很可能早于淀粉样蛋白形成。2008年Shin等发现在体外实验中，在含有50%的六氟异丙醇聚合体系中，vitronectin在共孵育后可以形成直径约3–8nm类淀粉样物质，在含有20%的六氟异丙醇聚合体系中可以形成大量的具有细胞毒性21 第四军医大学硕士学位论文[95][87]的寡聚体，其毒性呈剂量依赖性。2015年Casadinte和Winter等人应用质谱分析方法对组织中淀粉样物质分析发现vitronectin广泛沉积于各种不同类型的淀粉样变性（图2示），这提示vitronectin在淀粉样纤维物质形成过程中以及引起细胞毒性作用机制中可能有重要的意义。[87]图2.Image质谱分析发现vitronectin蛋白沉积于肾脏淀粉样物质中[104]5.Vitronectin和补体系统在淀粉样变性病中的研究进展：1992年Zanusso等在3例外周神经淀粉样变性的神经组织免疫组化染色时发现vitronectin、经典激活途径的补体成分及其调节蛋白的成分沉积，而vitronectin的N末端及C末端具有补体[105]调节作用，这可能预示着vitronectin在淀粉样变性病的补体激活过程中起着重要[106]的调节作用，影响淀粉样物质的清除。2000年Mullins等通过免疫组化在老年黄斑变性病的脉络膜疣中检测到SAP、ApoE、vitronectin、血凝因子Ⅹ、C5等，其中，[105]vitronectin的酪氨酸硫酸化修饰对蛋白质间的相互作用存在一定影响。2015年[73]Richards等对抗SAP抗体治疗淀粉样变性观察中阐述，抗SAP抗体可以特异性的结合组织间沉积的淀粉样蛋白，同时激活补体系统的经典途径，使巨噬细胞局部浸润从而转化为多核巨噬细胞，协助清除淀粉样物质。目前尚存在的问题：虽然目前全新的单克隆抗SAP抗体已开始应用于临床，并在协助清除组织沉积的淀粉样物质有着较好的疗效，但仍有20%左右淀粉样变性患者应用抗SAP抗体治疗时无效，并且其对肾脏和心脏受累为主的淀粉样变性效果欠佳。这也从侧面反映了淀粉样变性是一个发病机制复杂、多种复合物参与、多种理化因素影响的病理性疾病，单纯的抗SAP抗体仍不是治疗淀粉样变性特效药物，这需要我们深入研究淀粉样变性发病机制，探索新的治疗靶点。目前已有大量的淀粉样沉积物质谱分析研究证实vitronectin与SAP分子同样普遍存在于各种类型淀粉样22 第四军医大学硕士学位论文变中，vitronectin作为一种多功能糖蛋白，它的细胞外基质固定、细胞粘附和传播、免疫防御等生理功能均可能参与到淀粉样变性的发病机制和细胞毒性机制中，但目前临床尚无对血清中vitronectin与淀粉样变性相关性报道，vitronectin能否作为淀粉样变性新的诊断标志分子，或者与其他肾小球疾病相鉴别的特异性分子，vitronectin能否成为治疗淀粉样变性新的靶点，需要进一步探讨及研究。23 第四军医大学硕士学位论文第一部分AL型淀粉样变性临床病理特点及预后危险因素分析24 第四军医大学硕士学位论文正文早在170多年前人们就发现了淀粉样蛋白，然而直到20年前才开始系统性的了解和治疗本病。在所有的淀粉样变性病中，免疫球蛋白轻链型淀粉样变性，即AL型淀粉样变性，是目前临床最常见也是最严重的类型，其是由异常浆细胞增生产生单克隆的免疫球蛋白轻链聚合成蛋白质片段，其二级或三级构象发生β折叠后形成的不溶性的纤维样蛋白物质，这些物质沉积在组织上，进一步损伤器官功能，其具体发病机制目前仍不明确。目前世界范围内对淀粉样变性病研究主要集中在欧美等发达国家，大量的多中心、大样本的研究观察，总结出欧美发达国家淀粉样变性病的流行病学、临床特点、诊断、治疗方法及预后等，同时在新的化疗药物及对淀粉样变性的基因学研究都取得了巨大的成就。相比欧美发达国家，我国对淀粉样变性研究相对落后，绝大多数临床工作者对淀粉样变性认知不足，造成了临床上很多淀粉样变性的误诊和漏诊，从而延误了淀粉样变性患者最佳治疗时间，导致我国淀粉样变性患者极高的死亡率。近年来，越来越多的临床工作者开始了解并重视淀粉样变性，但仍然缺乏规范的诊断和治疗。我国目前对淀粉样变性的认知，仍以借鉴欧美发达国家的经验为主，并于2016年制定了我国第一个系统性轻链型淀粉样变性诊断和治疗指南，这对指导我国医疗工作者诊断和治疗AL型淀粉样变性有着巨大的临床意义。但目前我国对淀粉样变性仍未足够重视，主要的研究仍只集中在个别治疗中心，仍然缺乏多中心、大样本量的临床研究，仍然没有符合我国自己的流行病学、临床特点、治疗和预后的研究。本研究主要分析我国西北地区AL型淀粉样变性患者的临床特点、病理特点、治疗疗效及预后因素，通过与国内外其他研究中心研究结果的比较，了解和发现我国AL型淀粉样变性临床特点及预后因素，期望引起人们对AL型淀粉样变性的重视。25 第四军医大学硕士学位论文1研究对象和方法1.1研究对象2003年1月-2017年9月在第四军医大学西京医院住院经组织病理诊断为AL型淀粉样变性患者164例。病理活检部位包括肾脏、肝脏、皮肤、外周神经纤维、直肠粘膜。AL型淀粉样变病理诊断标准：活检部位组织刚果红染色阳性,偏振光下呈苹果绿双折光；电镜下可见直径8-12nm排列紊乱的细纤维丝结构。免疫荧光可见单一免疫球蛋白kappa或lambda染色阳性。1.2研究方法回顾性收集患者的临床症状、实验室检查、影像学资料、病理资料、治疗方案及疗效等，对患者进行定期随访。1.2.1临床评价指标临床评价指标包括：发病时年龄，性别，穿刺活检部位，临床表现（乏力、水肿、体重减轻、低血压、呼吸困难、晕厥、腹泻、便秘、便血、巨舌、眶周紫癜等），器官受累情况（范围、程度），血压等。[68]器官受累诊断标准：肾脏：24小时尿蛋白定量大于0.5g/天，以白蛋白为主；心脏：心脏超声平均心室壁厚度大于12mm，排除其它心脏疾病,或在没有肾功能不全及房颤时NT-proBNP大于332ng/L；肝脏：无心衰是肝脏上下径大于15cm，或血清碱性磷酸酶超过正常值上限1.5倍；胃肠道受累：消化道内镜进行肠粘膜活检，刚果红染色后做出确诊，并有腹泻、排空延迟，体重下降等非特异性症状。外周神经系统：出现对称性双下肢感觉、运动障碍；骨关节及软组织受累：舌体肥大，下颌下腺肥大，复发性眶周紫癜，淋巴结病，血管受累可以表现为间歇性跛行，肌肉受累表现为骨骼肌假性肥大，关节受累表现为关节痛，肩痛。肾病综合征诊断标准为：尿蛋白定量＞3.5g/24小时，血白蛋白＜30g/L，水肿和高脂血症。26 第四军医大学硕士学位论文慢性肾脏病（chronickidneydisease,CKD）分期参照美国KDOQI指南：0期，22GFR＞90ml/min/1.73m，有CKD危险因素；1期，GFR≥90ml/min/1.73m；2期，22GFR：60-89ml/min/1.73m；3期，GFR：30-59ml/min/1.73m；4期，GFR：15-2922ml/min/1.73m；5期，GFR＜15ml/min/1.73m。1.2.2实验室检查常规检查：血、尿、便常规。特殊检查：1.肾脏：24小时尿蛋白定量，尿生化，尿本周蛋白，尿轻链水平，肾功能（血清尿素氮、血清肌酐、eGFR），双肾超声。2.心血管：24导联心电图，超声心动图（射血分数EF值，室间隔厚度，心室壁厚度，各心腔大小），N末端前脑钠肽（NT-proBNP），脑钠肽（BNP），肌钙蛋白T，肌钙蛋白I。3.消化系统：肝功能（转氨酶、总蛋白、白蛋白、球蛋白），总胆红素，碱性磷酸酶，肝、脾超声。4.血液系统：血清游离轻链及比值，血清免疫固定蛋白电泳，骨髓穿刺及活检。1.2.3病理学检查活检组织分别行光镜、免疫荧光、电镜检查。光镜：活检组织经甲醛固定、石蜡包埋后切片2μm厚。进行常规苏木素-伊红（HE）染色、雪夫氏过碘酸（PAS）染色、马松（Masson）染色和六胺银套染马松三色（PASM-Masson）染色。石蜡组织切片6μm厚，进行刚果红染色（同时在偏振光显微镜下观察）。免疫荧光检测：新鲜冰冻活检组织应用直接免疫荧光法进行染色，包括IgG，IgA，IgM，C3，C1q，免疫球蛋白轻链κ，免疫球蛋白轻链λ，血清蛋白A等。所有观察在荧光显微镜（Nikon80i，Japan）下进行，免疫荧光结果根据荧光强度半定量法分为0-4+等，免疫荧光染色结果评判：-，无荧光；±，极弱的可疑荧光；+，荧光较弱，但清楚可见；2+，荧光明亮，呈黄绿色；3+~4+，荧光闪亮，呈明显的亮绿色。电镜检查：活检组织经戊二醛-锇酸双重固定、丙酮脱水、环氧树脂包埋后切片，醋酸铀-枸橼酸铅染色后阅片。包括观察是否有直径8-10nm纤维丝样物质杂乱排列。1.2.4淀粉样变性分期[34]Mayoclinic2012分期：标志物阈值NT-proBNP＞1800ng/L，肌钙蛋白T（cTnT）＞0.025μg/L，致病轻链与非致病轻链差值（dFLC）＞180mg/L。Ⅰ期：三项指标均27 第四军医大学硕士学位论文低于阈值；Ⅱ期：其中一项指标高于阈值；Ⅲ期：两项指标高于阈值；Ⅳ期：三项指标均高于阈值。1.2.5组织病理评分淀粉样物质沉积范围包括肾小球、毛细血管、间质及其他组织病理损伤，例如肾小球硬化，炎症浸润，间质纤维化和肾小管萎缩，根据Sait和Banu关于淀粉样变性[64]病的肾脏病理分型标准进行病理分型及分级。根据光镜下淀粉样蛋白在肾小球沉积范围分为7个类型：0型没有沉积，Ⅰ型沉积范围≤10%，Ⅱ型沉积范围11%-25%，Ⅲ型沉积范围26%-50%，Ⅳ型沉积范围51%-75%，Ⅴ型为膜型，Ⅵ型＞75%；肾淀粉样变性病理评分标准为：根据总分值分为4级，0级（0分）无淀粉样沉积，Ⅰ级（1-7分）早期淀粉样病变，Ⅱ级（8-15分）进展型淀粉样变性病，Ⅲ级（≥16分）晚期淀粉样变性病。1.2.6治疗[58][49][53]治疗方案：BD，MD和CTD。2BD方案：硼替佐米1.3mg/m体表面积/次，皮下注射，1次/周，地塞米松20mg口服1次/日（硼替佐米注射当天和第2天口服），每5周1疗程。MD方案：地塞米松40mg口服1次/日、马法兰0.22mg/公斤体重（如患者不能耐受，可减量至0.17mg/公斤体重）口服1次/日，连用4天停用24天，28天为1疗程。CTD方案：地塞米松20mg，口服，1次/日（每疗程的第1-4天，第8-11天口服），环磷酰胺0.5g静脉注射1次/周（连用3周，停1周），沙利度胺50mg口服，1次/日（观察若无明显毒副作用，每周增加50mg，每日最大剂量不超过200mg），4周为1疗程。[39]疗效评价参照既往文献：1.血液学反应：完全缓解（CR），即体内游离轻链比值正常，血/尿免疫固定蛋白电泳阴性；非常好的部分缓解（VGRP），即dFLC(致病轻链与非致病轻链差值)小于40mg/L；部分缓解（PR），即dFLC下降大于50%；无反应（NR）未达到PR。28 第四军医大学硕士学位论文2.器官反应：心脏：NT-proBNP下降（对于基线水平≥650ng/L患者，下降超过30%且＞300ng/L），或NYHA（纽约心脏病学会）分级改善（基线NYHA分级为3-4级患者，分级下降≥2）。肾脏：24小时尿蛋白定量下降超过50%（治疗前尿蛋白定量＞0.5g/24h），血肌酐和肌酐清除率进展＜25%。肝脏：碱性磷酸酶水平下降超过50%，肝上下径减少2cm以上；外周神经系统，肌电图提示神经传导速率改善。1.2.7随访所有患者在门诊或住院进行随访，主要终点事件：死亡；次要终点事件：终末期肾病（ESRD）。1.3统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。正态分布计量资料以均数±标准差表示，非正态分布计量资料用中位数（四分位间距）表示，分类变量以率表示。正态分布组间比较采用t检验，非正态分布采用秩和检验，率比较用卡方检验。利用单因素COX回归分析各因素风险值（HR），对所有单因素分析有统计学差异的变量进行多因素COX回归分析。p＜0.05为有统计学差异。2结果2.1临床特点164例经组织病理确诊为AL型淀粉样变性病患者，男性103例，女性61例，平均所需确诊时间为6月。确诊时年龄57.5±9.8岁。截止2017年9月，存活患者79例（48.2%），死亡57例（34.8%），失访28例（17.1%）。其中肾穿刺活检130例（109例为我院肾活检病理诊断（病理图见图1.），占我院同期肾穿刺活检2.3%，余21例为外院肾活检诊断AL型淀粉样变性），其他活检部位包括肝穿刺活检（12例）、皮肤活检（25例）、直肠粘膜活检（5例）、外周神经纤维活检（4例）。29 第四军医大学硕士学位论文图1：肾穿刺病理活检。图A，光镜下可见刚果红染色阳性；图B，偏振光下可见苹果绿双折光；图C、D，免疫荧光下可见单一的κ或单一λ阳性；图E，电镜下可见8-10nm细纤维丝样物质，杂乱排列。最常见的临床症状为水肿（84.8%）、乏力（50%），呼吸困难（17.6%）。152例（92.7%）患者诊断时有肾脏受累，蛋白尿是其常见的特点，其中有115例（70.1%）患者临床表现符合肾病综合征，平均24小时尿蛋白定量为4.8g，平均血清白蛋白22.7g/L。102例（62.2%）和27例（16.5%）患者诊断时分别伴有心脏、肝脏受累。120例（73.2%）患者存在2器官及以上受累。我中心患者器官受累比例与其他中心比较见图2。根据2012年Mayoclinic淀粉样变性分期，22.0%患者Ⅰ期，27.4%患者Ⅱ期，33.5%患者Ⅲ期，5.5%患者Ⅳ期。（见表1）30 第四军医大学硕士学位论文图2：Pavia、MayoClinic、南军军区总医院和西京医院AL型淀粉样变性患者器官受累比例图。表1.系统性AL型淀粉样变性患者临床资料一般情况病例数164性别（男/女）103/61年龄(x±s)(岁)57.5±9.8临床症状水肿(%)139(84.8)乏力(%)82(50.0)低血压(%)48(29.3)呼吸困难(%)25(17.6)软组织损伤(%)20(12.2)便血(%)7(4.3)眶周紫癜(%)7(4.3)腹泻、便秘(%)5(3.0)实验室检查血红蛋白(x±s)(g/l)122.5±23.824小时尿蛋白定量（四分位数间距）(g)3.2(1.5,5.6)血肌酐(四分位数间距)(μmol/L)87.0(74.0,104.3)肌钙蛋白T(四分位数间距)(ng/ml)0.046(0.017,0.092)NT-proBNP(四分位数间距)(pg/ml)885.7(283.0,3354.0)碱性磷酸酶（U/L）89.0(66.8,142.3)器官受累(%)肾脏152(92.7)心脏102(62.2)肝脏27(16.5)软组织13(7.9)消化道7(4.3)外周神经系统5(3.0)31 第四军医大学硕士学位论文器官受累数目(%)144(26.8)294(57.3)≥326(15.9)淀粉样蛋白轻链比值(λ/κ)2.1:1Mayo2012分期(n=145,%)Ⅰ期36（24.8%）Ⅱ期45（31.0%）Ⅲ期55（37.9%）Ⅳ期9（6.2%）2.2病理分型我科行肾穿刺活检明确诊断AL型淀粉样变性109例患者中，74例（67.0%）诊断为AL-λ型，35例（33.0%）为AL-κ型，两者比例λ：κ=2.1:1。AL-λ型患者年龄较大（59.7±8.8岁vs.56.1±8.7岁，p=0.046），AL-λ型患者心脏受累严重程度更高（cTnT：0.057vs.0.026，p=0.033），而AL-κ型更易出现肝脏受累（22.9%vs.8.2%,p=0.034），两者在肾脏受累比率没有差异性。在器官受累数目上，两者没有差异性。（见表2.）表2.系统性AL型淀粉样变性分型资料轻链类型P值AL-λ(n=74)AL-κ(n=35)性别（男/女）48/2619/160.289年龄(岁)59.7±8.856.1±8.70.046器官损伤肾脏，n(%)100100-肾病综合征，n(%)53(71.6%)22(62.9%)0.356心脏，n(%)52(70.3%)21(60%)0.287肝脏，n(%)6(8.2%)8(22.9%)0.034器官损伤数目（个）0.3071,n(%)19(25.7%)10(28.6%)2,n(%)48(64.9%)17(48.6%)≥3,n(%)7(9.5%)8(22.9%)生物学指标血红蛋白，g/L123.4±22.6128.1±23.10.317尿蛋白定量，g/24h2.8(1.6,4.5)2.9(1.5,5.6)0.797血肌酐，μmol/L101.3±40.1101.5±63.10.9812eGFR，ml/min/1.73m70.8±24.375.4±25.80.381血清白蛋白，g/L26.2±7.227.1±8.60.596总胆红素，μmol/L7.9(5.8-10.5)8.3(6.0,10.8)0.598碱性磷酸酶，IU/L83.0(65.5,109.0)80.0(57.0,223.0)0.881肌钙蛋白I，ng/ml0.039(0.014,0.217)0.036(0.012,0.125)0.507肌钙蛋白T,，ng/ml0.057(0.025,0.096)0.026(0.012,0.055)0.03332 第四军医大学硕士学位论文NT-proBNP,，pg/ml694.4(206.1,3249.3)709.3(311.2,3503.5)0.831EF%57.9±6.958.0±4.80.896室间隔厚度，mm11.9±2.811.0±1.40.0642备注：EF%：左室射血分数；NT-proBNP：N末端前脑钠肽；e-GFR（ml/min/1.73m）：估算的肾小球滤过率2.3疾病分期145例患者心脏指标检查结果完整，根据2012年Mayoclinic淀粉样变性分期，36（24.8%）为Ⅰ期，45例（31.0%）为Ⅱ期，55例（37.9%）为Ⅲ期，9例（6.2%）为Ⅳ期。分期越高，患者器官损伤数目越多（p＜0.001），生存率也越低（p＜0.001）；不同Mayo分期患者的超声心动图测定的室间隔厚度存在统计学差异（p=0.001）。（见表3.）33 第四军医大学硕士学位论文表3.不同Mayo分期相关临床特点及指标比较StageⅠ(n=36)StageⅡ(n=45)StageⅢ(n=55)StageⅣ（n=9）P值性别，男/女20/1628/1738/176/30.624年龄，岁56.5±8.057.3±9.857.8±10.561.1±9.40.196生存率，n(%)24（66.7%）31(68.9%)15(27.3%)6(66.7%)0.000心脏受累，n(%)6(16.7%)30(66.7%)49(89.1%)9(100%)0.000肝脏受累，n(%)4(11.1%)6(13.3%)13(23.6%)0(0%)0.235肾脏受累，n(%)31(86.1%)43(95.6%)51(92.7%)9(100%)0.431器官损伤数目(%)0.0001,n(%)23(63.9%)12(26.7%)2(3.6%)0(0%)2,n(%)11(30.6%)28(62.2%)35(63.6%)8(88.9%)3,n(%)2(5.6%)5(11.1%)18(32.7%)1(11.1%)尿蛋白定量，g/24h2.9(1.6,5.1)3.9(1.7,6.9)2.6(1.2,4.5)0.9(0.5,2.8)0.043血肌酐，μmol/L101.3±61.8104.6±83.5104.7±66.7114.2±49.60.628e-GFR75.4±24.175.5±28.173.6±23.860.2±27.40.118血清白蛋白，g/L28.5±6.725.6±7.727.0±7.632.8±9.30.099总胆红素，μmol/L7.6(5.8,10.4)8.0(6.0,10.1)8.4(5.7,17.2)12.4(9.4,16.9)0.697ALP，IU/L78.0(53.0,106.0)90.0(66.3,113.0)95.5(72.5,230.8)76.0(59.5,112.5)0.877心脏指标cTnI,ng/ml0.009(0.004,0.022)0.029(0.010,0.066)0.126(0.030,0.345)0.156(0.058,0.548)0.000cTnT,ng/ml0.013(0.009,0.016)0.030(0.021,0.058)0.093(0.057,0.146)0.070(0.045,0.106)0.003ProBNP204.6(149.4,337.0)342.9(178.7,637.7)2969.0(1726.0,4770.0)6098.0(3301.5,13067.3)0.000EF%59.9±5.657.3±6.355.8±8.259.1±3.80.658室间隔厚度，mm10.2±2.111.1±1.413.4±2.912.8±1.00.0012cTnI：肌钙蛋白I；cTnT：肌钙蛋白T；NT-ProBNP：N末端前脑利钠肽；EF%：左室射血分数；e-GFR（ml/min/1.73m）：肾小球滤过率34 第四军医大学硕士学位论文2.4肾脏病理分级及评分109例我院行肾穿刺活检确诊系统性AL型淀粉样变性患者，依据Sait和Banu肾脏病理分级及评分，8例（7.3%）病理Ⅰ级，69例（63.3%）病理Ⅱ级，32例（29.4%）病理Ⅲ级。不同的病理评分分级，器官受累、年龄、尿蛋白定量没有统计学差异，肾小球滤过率（p=0.028），血肌酐水平（p＜0.001）有统计学差异。（见表4.）表4.Sait和Banu肾脏病理评分分级相关指标比较Ⅰ级(n=8)Ⅱ级(n=69)Ⅲ级(n=32)P值男性，%33.357.473.10.150年龄，岁53.3±8.257.5±10.957.4±9.00.311心脏受累(%)66.779.279.20.772肝脏受累(%)0.013.023.10.280尿蛋白定量，g/24h3.56(0.68,6.44)4.67(3.57,5.76)4.75(3.53,5.96)0.859血尿素氮，mmol/L346.3(227.4,465.2)294.5(269.0,319.9)365.3(304.3,426.2)0.135血肌酐，μmol/L88.37±24.9784.82±19.78143.56±105.19＜0.001血清白蛋白，g/L28.83±8.4225.54±6.5725.97±5.720.3952eGFRml/min/1.73m75.16±17.0280.97±18.0660.37±27.730.0282备注：e-GFR（ml/min/1.73m）：估算的肾小球滤过率2.5治疗（1）BD方案治疗：共有7例患者接受BD方案进行治疗，一般资料见表5。2其中1例患者应用硼替佐米1.3mg/m体表面积/次，静脉注射每周2次（21天一疗程，2第1、4、8、11天给药），第3疗程中出现双足背皮肤麻木伴刺痛，调整剂量1.3mg/m体表面积/次，皮下注射每周1次（35天一疗程，第1、8、15、22天给药），共应用28疗程，达到血液学完全缓解，目前已停药。2例患者在应用硼替佐米1.3mg/m体表面积/次，皮下注射每周1次后出现严重的腹泻，1例应用2疗程后不能耐受停药，另1例可耐受继续用药。35 第四军医大学硕士学位论文表5.接受BD方案治疗患者一般资料患者年龄/性别受累器官Mayo分期治疗方案副作用血液学反应随访时间163岁/男肾、心3期BD四肢麻木CR15月253岁/男肾、心2期BD严重腹泻VGPR6月363岁/男肾、心4期BD白细胞减低PR2月474岁/男肾、心、肝2期BD严重腹泻VGPR3月545岁/女肾、心4期BD无VGPR2月646岁/女肾、心、皮肤1期BD无PR1月762岁/女肾、心1期BD无-＜1月CR：Completehematologicalresponse，完全缓解；VGPR：Verygoodpartialresponse，非常好的部分缓解；PR：Partialresponse，部分缓解。36 第四军医大学硕士学位论文（2）对于不能担负硼替佐米治疗的患者我中心推荐一线用药方案MD，二线用药方案CTD。通过对两组治疗方案疗效对比发现，两者血液学完全缓解率没有明显差异，总体有效率没有明显差异（80.7%vs.83.7%，p=0.240）。（见表6）表6.不同治疗方案比较MD(n=31)CTD(n=41)P值年龄（岁）59.2±6.656.7±10.50.229性别（男/女）20/1124/170.606肾脏受累，n（%）31（100%）41（100%）-心脏受累，n（%）20（64.5%）26（63.4%）0.923肝脏受累，n（%）4（12.9%）4（9.8%）0.675平均随访时间(月)13.6±8.920.3±14.10.013血液学反应，n(%)25(80.7%)31(83.7%)0.240CR1(3.2%)2(4.9%)VGPR6(19.4%)11(26.8%)PR18(58.1%)18(43.9%)CR：完全缓解；VGPR：非常好的部分缓解；PR：部分缓解；应用MD方案患者，5例出现骨髓抑制（表现为三系细胞减少），2例患者出现感染，4例患者出现消化道症状（腹泻、恶心），1例出现濒死感。CTD方案中，5例患者出现骨髓抑制，2例患者出现水肿加重，1例出现恶心症状，1例出现感染。2者向比较，CDT方案的副作用较少。（见表7）表7.不同治疗方案相关副作用MD（n=31）CTD（n=41）不良反应129骨髓抑制5(16.1%)5(12.2%)消化道症状4(12.9%)1(2.4%)感染2(6.5%)1(2.4%)濒死感1（3.2%）-水肿加重-2（4.9%）备注：骨髓抑制：三系细胞降低；消化道症状：包括恶心、呕吐、腹泻等。2.6生存分析通过COX单因素分析发现，未经化疗患者中位生存期为13月。心脏受累、肝脏受累、器官受累数目、低血压均是影响患者生存的危险因素。肾脏受累对患者生存没有明显的差异。（见图3）。各脏器受累患者在各时间节点生存率见表8.-37- 第四军医大学硕士学位论文图3-A-D，不同器官受累对患者生存期的影响。A.心脏受累与未受累比较，生存期有统计学差异；B.肝脏受累和未受累比较，生存期有统计学差异；C.肾脏受累与未受累比较，生存期无统计学差异；D.低血压与非低血压比较，生存期有统计学差异。（备注：ProportionSurviving：生存率；Heartinvolvement：心脏受累；liverinvolvement：肝脏受累；Renalinvolvement：肾脏受累；hypotension：低血压；normotension：正常血压；hypertension）表8.心脏、肝脏、低血压患者各时间节点生存率1月6月12月24月36月48月总计心脏受累生存例数/率94/92%59/58%49/48%24/24%12/12%4/4%102肝脏受累生存例数/率27/100%20/74%8/30%4/15%0/0%0/0%27低血压生存例数/率43/89%32/67%20/42%11/23%4/8%2/4%482.7预后分析-38- 第四军医大学硕士学位论文随访时间超过2年共98例患者，中位随访时间为24（1，120）个月。共有60例患者死亡，未经特殊治疗患者中位生存期为13（5,31.5）个月，1年、2年、3年、5年累积生存率分别为56.5%，45.9%，30.6%，23.6%。通过对各相关指标进行发现，死亡组男性比例更高（70%vs.44.7%，p=0.013），死亡组心脏损害比率更高（70.9%vs.42.4%，p=0.008）、器官受累数目更多（p=0.037），死亡组总胆红素值更高（p=0.034）。（见表9）多因素COX回归分析发现，心脏受累、低血压是患者预后独立的危险因素，药物化疗是患者预后独立的保护因素。（见表9）表9.单因素及多因素COX回归分析单因素回归分析多因素回归分析HR(95%CI)p值HR(95%CI)p值年龄0.9640.831（0.690-1.347）性别0.6110.104（0.337-1.106）心脏受累2.5950.0022.5860.004（1.365-4.935）（1.355-4.936）肝脏受累2.3670.0061.7290.104（1.246-4.496）（0.894-3.345）肾脏受累1.6490.254（0.698-3.899）低血压0.5440.0140.5620.026（0.335-0.885）（0.338-0.933）e-GFR1.0870.709(0.757-1.562)进行药物治疗3.1970.0142.8130.033（1.264-8.089）（1.086-7.286）血清白蛋白0.8250.282（0.580-1.172）LVEF%0.3980.024（0.179-0.884）碱性磷酸酶1.5670.011（1.106-2.220）HGB0.9160.729（0.560-1.501）器官受累数目2.0540.001≥2（1.346-3.134）疾病分期2.1960.000-39- 第四军医大学硕士学位论文（1.480-3.258）病理分级3.7220.196（0.507-27.336）轻链类型0.8730.816（0.277-2.750）总胆红素3.2720.001（1.654-6.471）尿蛋白定量1.6970.138（0.843-3.415）2LVEF%：左室射血分数；e-GFR（ml/min/1.73m）：肾小球滤过率；HGB：血红蛋白3讨论单克隆免疫球蛋白轻链型淀粉样变性，也称AL型淀粉样变性，是淀粉样变性病中最常见也是最严重的类型，其发病机制目前仍未完全明确。目前认为由异常浆细胞增生产生单克隆的免疫球蛋白轻链聚合成蛋白质片段，其二级或三级构象发生β折叠后形成的纤维样物质，这些淀粉样纤维物质在组织器官沉积，导致器官功能障[6]碍，近年来越来越多的研究表明，除这些淀粉样蛋白沉积引起器官障碍外，淀粉样蛋白产生的毒性渗透到细胞内，引起细胞氧化应激、细胞功能障碍，导致细胞凋亡，[23]这些在器官损伤中可能占有更大的作用。AL型淀粉样变性是一种多脏器、组织受累的系统性疾病，可以累及到除中枢神经系统外的其他任何组织和器官。因受累[10]脏器的数目和损伤程度不同，其临床表现也复杂多样。美国Mayo中心报道心脏是其最常见的受累器官，其次依次为肾脏、外周神经系统、消化道及肝脏。而我中心[10]以肾脏和心脏受累最常见，其次为肝脏和软组织，与意大利Pavia研究中心报道大体相似，但我中心肾脏受累比例远超过Pavia中心（92.7%vs.50%）。与南京军区总[9]医院报道相比，其消化道受累比例更高（55.9%vs.4.3%）。器官受累个数及程度，尤其是心脏受累对患者生存预后有重大影响。大量文献报道心脏受累是系统性淀粉样变性预后最重要的危险因素，心脏受累的频率及其预后在不同类型的淀粉样变性病中有所不同。在对AL型淀粉样变性患者的研究提示，如果出现心衰或者血清[34]Pro-BNP显著升高，患者的中位生存期只有3.5月。近5年来，随着我国临床对淀粉样变性的不断认知，临床对淀粉样变性疾病越来越重视，但目前我国AL型淀粉样变性相关认知绝大部分仍来自于欧美等发达国家，我国临床淀粉样变性报道仍局限于个案或小样本病例报道，我国AL型淀粉样变性患者的多中心、大样本的流行病-40- 第四军医大学硕士学位论文学、临床特点及长期预后相关研究报道极度缺乏。组织活检是确诊AL型淀粉样变性黄金标准。本研究中以肾穿刺活检为主，确诊AL型淀粉样变性例数占总肾穿刺活检2.3%，这与意大利研究中心和南京军区总医[65]院报道基本一致，较美国研究中心报道（1.3%）更高。其他活检部位还包括肝、直肠粘膜、皮肤等。病理分型主要依靠免疫组化及免疫荧光技术，但仍有8例未能准确分型，应用激光切割以质谱分析为基础的蛋白质组学可以对99%淀粉样变性进[28]行分类，但该技术尚未在临床普及。本研究显示，AL型淀粉样变性在我国已不是罕见病，肾脏是AL型淀粉样变性最常见的受累器官，以大量蛋白尿为特征的肾病综合征仍是肾淀粉样变性的主要临床表现，患者的平均24小时尿蛋白定量接近4g，平均血清白蛋白26g/L，AL型淀粉样变性肾病已成为我国中老年肾病综合征第二大病因。依据Sait和Banu肾脏病理分级及评分研究发现，其对患者整体生存率没有影响，但病理等级越高，肾脏肾小球滤过率越低，血肌酐水平越高，这表明肾脏病理分级可以预测肾脏预后。本研究中只有2例患者进入肾脏病终末期（ESRD），主要原因可能与患者心脏受累导致生存时间短，肾脏损伤进展较慢有关，潜在的ESRD患者在进展至ESRD前就已经死亡。随着规范化治疗的应用，患者的生存期会显著延长，本中心会继续观察肾脏淀粉样变性进展特点。本研究中AL型淀粉样变性轻链分型，AL-λ型是AL-κ型2.1倍，这与欧美国家报道λ轻链发病的频率约是κ轻链2-4倍相[19][20,21]符，其中AL-κ型更易引起肝脏受累，这与国外相关报道相似。在AL型淀粉样变性的治疗方案里，作为常用于治疗多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂硼替佐米显现出较高的有效率，无论是联合地塞米松，还是在此基础联合环磷酰胺的方案，均显示出较好血液学反应。但在我国硼替佐米昂贵的价格阻碍其在临床上的广泛应用，尤其对于经济相对落后的人群。而价格相对较低的MD方案及CTD方案在我中心应用较多，两者的总体有效率可达到70%以上，相对CTD方案，MDex方案在使用过程中出现较多的不良反应，可能与我们借鉴Mayo中心治疗的剂量0.22mg/kg，相对亚洲人群剂量偏大，将马法兰剂量调整为0.15-0.17mg/kg后，其副作用明显减少，而总体有效率没有降低。本研究发现未经特殊治疗患者中位生存期为13个月，1年、2年、3年、5年生存率分别为56.5%，45.9%，30.6%，23.6%。而经过正规系统的化疗后，新诊断的AL型淀粉样变性患者1年生存率、2年生存率分别为94.6%、92.5%。我们在临床治疗时观察到我国人群对环磷酰胺及激素较欧美-41- 第四军医大学硕士学位论文人群更为敏感，这可能与种族基因多态性有关，但这仍缺乏临床试验证据。目前临床对AL型淀粉样变性的治疗均是以抑制和减少淀粉样前体蛋白的产生为主，而已经产生的淀粉样纤维沉积物只能依靠身体缓慢清除。最近一项Ⅱ期临床试验研究分子[63]CPHPC，可以快速的减少循环中SAP水平，为AL型淀粉样变性治疗提供了新的选择。AL型淀粉样变性患者主要死因危险因素并非潜在的浆细胞疾病进展，而主要在[66]于脏器功能衰竭的并发症。AL型淀粉样变性患者整体预后较差，但也存在较大的个体差异性，本研究中有1例患者在确诊AL型淀粉样变性后2月内死亡，随访患者中最长存活时间超过10年。多因素影响患者生存率，一方面与患者受累器官种类、范围、程度有关，有研究对145例AL型淀粉样变性患者随访结果显示，肾脏受累患[67]者中位生存期为38月，而非肾脏受累患者中位生存期为19月（p=0.05），究其原因应该是非肾脏受累患者其心脏受累会更常见，单纯的肾脏受累患者预后要好于其它脏器受累或合并其他脏器受累。另一方面与患者身体基础素质、对化疗药物的敏感度等有关。当前所有对AL型淀粉样变性的治疗均是以抑制和减少淀粉样前体蛋白的产生为主，而已经产生的淀粉样纤维沉积物只能依靠身体缓慢清除。患者一般状况越好，可耐受化疗的副作用，为体内淀粉样物质清除提供时间及环境。化疗药物的疗效存在个体差异性，已有多个研究表明化疗药物作用位点的基因多态性决定了作用位点与药物分子结合的能力。尽管如此，因为目前尚没有治疗AL型淀粉样变性的特效药物，AL型淀粉样变性患者的整体预后较差。受累器官数目、程度，尤其是心脏受累是AL型淀粉样变性患者预后最重要的因素，出现心衰或者血清Pro-BNP[34]显著升高，患者的中位生存期只有3.5月。本研究中70.9%死亡患者存在心脏受累，多个评价心脏功能指标，如肌钙蛋白T（cTnT），肌钙蛋白I（cTnI），N末端前脑钠肽（NT-proBNP）等，都与患者预后有关。此外本研究还发现，死亡患者平均年[9]龄要小于存活患者，这与南京军区总医院报道的年龄是预后的独立危险因素存在差异性，可能与本研究中平均年龄较小组中心脏受累比例更多有关。低血压是AL型淀粉样变性预后不良的独立的危险因素。但在本研究发现有10%左右患者确诊时存在高血压，而且通过生存分析发现，高血压是AL型淀粉样变性患者预后的保护因素，有部分患者在确诊AL淀粉样变性前存在高血压，确诊后出现低血压情况，对于这类患者是否需要控制血压尚无相关报道，需要进一步研究。-42- 第四军医大学硕士学位论文本研究还发现在死亡病例中，总胆红素水平更高（16vs.9，p=0.034），这与国外[68]一项98例肝淀粉样变性临床资料分析结果一致，虽然在本研究中未证明肝脏受累是独立危险因素，但临床上出现总胆红素水平升高往往预示预后不良。-43- 第四军医大学硕士学位论文小结AL型淀粉样变性在我国已不是罕见病，肾脏是最常见的受累器官，近年来国内有限的文献报道显示，肾穿刺活检确诊AL型淀粉样变性比例占总肾穿刺活检2%以上，AL型淀粉样变性已成为我国中老年肾病综合征第二大继发病因，对于中老年肾病综合征患者应排查AL型淀粉样变性。肾脏病理分级评分可以更好地预测肾脏预后。免疫荧光联合免疫组化可以对大部分淀粉样蛋白分类，AL-λ型较AL-κ型更多见，AL-κ型中肝脏受累更多见。尽早诊断及时正规治疗可以延长AL型淀粉样变性患者生存期，特殊治疗是患者预后独立的保护因素。对于符合自体干细胞移植标准，没有禁忌症情况下，优先推荐HDM/SCT治疗。化疗方案优先推荐以硼替佐米联合地塞米松为基础的方案，以马法兰联合地塞米松方案也可作为一线治疗方案，需权衡用药剂量及疗程，环磷酰胺、沙利度胺联合地塞米松方案也显示出了良好的疗效，在对于无法使用其他方案情况下，值得推荐使用。心脏受累是患者预后独立风险因素，临床上对于不明原因的心衰患者，应排查心肌淀粉样变性可能，肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、NT-proBNP均是敏感的心功能评估指标。低血压是患者预后独立危险因素，对于这类患者应额外注意避免低血压性跌倒所致损伤，临床可给予米多君治疗低血压。本研究中发现10%AL型淀粉样变性患者在确诊时存在高血压，在此类患者中强化降压是否获益仍需进一步研究。-44- 第四军医大学硕士学位论文第二部分血清Vitronectin与AL型淀粉样变性诊断和治疗反应性的相关性探讨-45- 第四军医大学硕士学位论文正文[70]目前已知有超过31种前体蛋白可通过聚合折叠形成淀粉样变性。淀粉样蛋白片段聚合形成纤维丝的过程，是一个及其复杂且多变的过程，其前体蛋白通过各种途径不同的生理条件或外部因素，由原来的相对稳定的球状分子结构转变为另一种不稳定的构象，这种不稳定构象的二级结构中包含大量的反向β片层结构，这种β片层结构通过两条相邻肽链的氢键维持，这种构象极不稳定，很容易发生折叠和自我聚合，在特殊的条件下形成原纤维丝，而数条原纤维丝互相缠绕形成淀粉样纤维[69]。在淀粉样前体蛋白形成淀粉样纤维的过程中，除了自身的局部浓度达到特定临界值，基因变异导致蛋白氨基酸序列改变等自身因素外，外界的其他因素如环境PH值变化、温度的改变、金属离子浓度以及细胞外基质如糖胺聚糖、基底膜聚糖、层[75]粘连蛋白等与前体蛋白的互相作用等都可能影响到淀粉样纤维形成的过程。糖胺[76,77]聚糖参与其他分子一起结合，加速淀粉样纤维形成初期的成核作用。早前人们认为淀粉样物质沉积到组织细胞间，影响了组织的正常构建，从而导致组织、器官功能损伤。近年许多临床观察发现，淀粉样变性患者经治疗后，组织间的淀粉样物质明显减少，但其临床血液检查指标未见好转甚至加重，由此推断除了淀粉样物质在细胞间沉积影响组织功能外，淀粉样物质潜在的细胞毒性也发挥着重要的作用。[71]近年来有文献报道一些特异性的伴侣蛋白也参与了淀粉样物质的构成，Julie等通过对各种类型淀粉样变性活检组织进行质谱分析发现，伴侣蛋白载脂蛋白E（APOE），载脂蛋白A4（APOA4），血清淀粉样物质P（SAP）等在淀粉样变性中是特异性普遍存在。目前临床已将SAP作为治疗靶点，研制出单克隆抗SAP抗体，阻止淀粉样前体蛋白异常折叠或协助机体清除组织中的淀粉样纤维丝，协助机体迅速清除肝脏淀[73]粉样物质，目前已进入临床Ⅲ期实验。但应用该药物患者中，仍有20%疗效不明[88]显，且该药物对肾脏及心脏淀粉样变性的治疗作用并不明显。2008年Shin利用免疫荧光染色技术在阿尔茨海默病患者的脑组织中发现vitronectin，并将vitronectin在含有50%六氟异丙醇的聚合体系中形成类似淀粉样物质，并形成大量具有细胞毒性[87]的寡聚体。2015年Martin等通过基质辅助激光解吸电离质谱分析技术对175例各种类型淀粉样变性患者组织分析发现vitronectin也是特异性普遍存在。而本研究小组-46- 第四军医大学硕士学位论文在前期研究不同类型的淀粉样蛋白中均检测到大量的vitronectin，而在正常瘤旁肾组织对照中未检测到vitronectin，提示vitronectin可能参与淀粉样蛋白的异常折叠或细胞毒性。因此，我们旨在初步探讨vitronectin与淀粉样变性相关，从而进一步研究其在淀粉样变性中的作用机制，为淀粉样变性提供新的治疗靶点。-47- 第四军医大学硕士学位论文1研究对象与方法1.1研究对象1.1.1研究组选取2015年1月-2017年4月西京医院肾内科经肾穿刺活检病理确诊AL型淀粉样变性患者，且定期于我科进行随访、血清样本冻存完好的患者30例。AL型淀粉样变性病理诊断标准：活检部位组织刚果红染色阳性，偏振光下呈苹果绿双折光；电镜下可见直径8-12nm排列紊乱的细纤维丝结构。免疫荧光可见单一免疫球蛋白轻链kappa或lambda染色阳性。1.1.2对照组1选取同期于西京医院肾内科住院、临床表现为慢性肾炎综合征，经肾穿刺活检病理诊断为肾小球肾炎患者20例，包括特发性膜性肾病9例、IgA肾病9例、狼疮性肾炎1例、IgM肾病1例。1.1.3对照组2选取在我院体检中心接受健康体检且实验室检查符合国家公务员体检要求健康体检者20例。1.1.4排除标准年龄超过75岁，存在急性心梗、黑色素瘤、消化道肿瘤、肝硬化患者不纳入本次研究。1.2研究方法1.2.1收集入选患者的临床资料：血、尿、便三大常规；24小时尿蛋白定量；血肌酐，eGFR（应用CKD-EPI公式计算），血清白蛋白；N末端前脑钠肽（NT-proBNP），肌钙蛋白T，血清游离轻链，dFLC。根据2012年Mayoclinic分期标准度患者疾病严[103]重程度进行分期。2012期Mayo淀粉样变性分期：指标及阈值包括NT-proBNP＞1800ng/L；cTnT＞0.025μg/L；dFLC＞180mg/L；Ⅰ期：各指标均低于阈值；Ⅱ期：1个指标高于阈值；Ⅲ期2个指标高于阈值；Ⅳ期：3个指标高于阈值。1.2.2随访与治疗随访：患者每1-3月至我科门诊进行随访检查。主要终点事件：死亡；次要终点-48- 第四军医大学硕士学位论文事件：进入ESRD。[58][49][53]治疗方案参照既往文献：BD，MDex和CTD。2BD方案：硼替佐米1.3mg/m体表面积/次，皮下注射，1次/周，地塞米松20mg口服1次/日（硼替佐米注射当天和第2天口服），每5周1疗程。MDex方案：地塞米松40mg口服1次/日、马法兰0.17mg/公斤体重，口服1次/日，连用4天停用24天，28天为1疗程。CTD方案：地塞米松20mg，口服，1次/日（每疗程的第1-4天，第8-11天口服），环磷酰胺0.5g静脉注射1次/周（连用3周，停1周），沙利度胺50mg口服，1次/日（观察若无明显毒副作用，每周增加50mg，每日最大剂量不超过200mg），4周为1疗程。[39]1.2.3血液学反应评价参照既往文献：完全缓解（CR），即体内游离轻链比值正常，血/尿免疫固定蛋白电泳阴性；非常好的部分缓解（VGRP），即dFLC(致病轻链与非致病轻链差值)小于40mg/L；部分缓解（PR），即dFLC下降大于50%；无反应（NR）未达到PR。1.2.4血液标本收集与保存入组患者每次随访当日清晨空腹静脉采血，促凝管和抗凝管各4ml，1800g离心力离心10分钟，将血清及血浆分装保存于-80℃冰箱冻存。1.2.5检测研究方法1.采用双抗体夹心ELISA法测定血清中vitronectin吸光度，计算血清中vitronectin浓度。2.组间比较采用病例对照研究方法进行观察研究。1.3统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，不符合正态分布的计量资料采用中位数（四分位间数）表示。正态分布且方差齐组间比较采用t检验。非正态分布组间比较采用秩和检验。p＜0.05为有统计学差异。-49- 第四军医大学硕士学位论文2实验一2.1实验材料和试剂2.1.1实验仪器1)台式低速离心机（型号：SC-3612，安徽中科中佳）2)-80℃超低温冰箱（Haier超低温保存箱）3)全自动酶标仪450nm波长滤光片（型号：VarioskanFlash美国Thermo公司）4)移液枪，规格0-10ul，10-100ul，100-1000ul。5)37℃数字显示生化培养箱（型号：SPX-150BS-Ⅱ,CIMO.）6)其他吸水纸1包/次，一次性枪头500个，EP管200个。2.1.2实验试剂1.人vitronectin酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒（货号L170419709，Cloud-CloreCorp.Wuhan）组成1)ELISA酶标板：8×12孔，4℃/-20℃干燥保存。2)冻干标准品：2支，4℃/-20℃干燥保存。3)标准品稀释液，1瓶20ml，4℃保存。4)浓缩生物素化抗体：1支120ul，-20℃保存。5)生物素化抗体稀释液：1瓶12ml，4℃保存。6)浓缩HRP酶结合物：1支120ul，-20℃保存。7)酶结合物稀释液：1瓶12ml，4℃保存。8)浓缩洗涤液（30x）：1瓶20ml，4℃保存。9)TMB底物溶液：1瓶9ml，4℃保存。10)反应终止液：1瓶6ml，4℃保存。11)封板膜5张。12)密封袋2个。2.双蒸水1000mlThermoscientific双蒸水制备机3.PBS缓冲液（0.0067M(PO4)，货号：AC10237721）200ml2.2实验方法2.2.1实验前准备-50- 第四军医大学硕士学位论文1)实验开始前20分钟，从冰箱中取出血清标本和试剂盒，25℃室温放置。2)标准品溶液配置：取标准品冻干品，加入1ml标准配稀释液，室温放置10分钟，轻晃混匀，此时标准品溶液为800ng/ml。取7个1.5ml无菌EP管，依次编号1-7号，每管中加入0.5ml标准品稀释液，从800ng/ml标准品溶液取0.5ml液体，加入1号EP管，轻晃混匀后，从中取出0.5ml液体加入2号EP管，轻晃混匀。按此方法依次配置7个EP管液体。其标准品溶液浓度1-7号分别为400，200，100，50，25，12.5，6.25，0ng/ml。3)洗涤液配置：20ml浓缩洗涤液，加入580ml双蒸水。4)血清样本配制：取10ul血清样本，加入490ulPBS缓冲液，混匀后，从中取10ul加入990ulPBS缓冲液，混匀后，血清样本为1:5000样本。5)生物素化抗体工作液A和酶结合物工作液B配置：工作液A和B分别按1:100倍配置，按每孔100ul计算所需量，使用前15分钟内配好。2.2.2操作步骤1)加样，在酶标板上设置标准孔、空白孔、样品孔，并各设一个副孔对照。标准孔每孔加入标准品各100ul，样品孔每孔加入稀释后样品100ul。覆膜，37℃恒温箱孵育1小时；2)弃去孔内液体，不洗涤；3)每孔加入工作液A100ul，覆膜密封，37℃恒温箱孵育1小时；4)弃去孔内液体，吸水纸上拍干，每孔加入洗涤液350ul，浸泡1-2分钟，甩干液体，吸水纸上拍干，重复3次。5)每孔加入工作液B100ul，覆膜密封，37℃恒温箱孵育30分钟。6)弃去孔内液体，重复步骤4，洗涤5次。7)每孔加入90ul底物溶液，避光操作，覆膜，37℃恒温箱显色15分钟，观察酶标板空中颜色呈蓝色，且标准孔梯度明显；8)每孔加入50ul终止液，观察颜色由蓝变为黄色；9)立即将酶标板放入酶标仪450nm测量OD值。10)计算血清样本vitronectin浓度。-51- 第四军医大学硕士学位论文3结果3.1一般资料研究组AL型淀粉样变性患者30例，男性16例，女性14例，平均年龄58.0±7.9岁，均存在肾脏受累，其中有23例合并心脏受累，5例合并肝脏受累，2例合并外周神经系统受累。7例行CTDa方案治疗，19例行MD方案治疗，4例行BD方案治疗。所有患者均按规定疗程用药，定期观察随访。其中10例患者完成相应疗程，平均治疗时间为8.3±5.0月，其中5例患者治疗后达到VGPR及以上血液学反应，5例患者无明显血液学反应。一般资料见表1。表1.AL型淀粉样变性患者一般资料一般情况病例数30性别（男/女）16/14年龄(x±s)(岁)58.0±7.9实验室检查血红蛋白(x±s)(g/l)122.2±22.024小时尿蛋白定量（四分位数间距）(g)2.2(1.3,4.3)血肌酐(x±s)(μmol/L)93.5±30.42eGFR(x±s)(ml/min/1.73m)77.9±23.8血白蛋白(x±s)(g/L)27.5±7.8收缩压(x±s)(mmHg)110.7±17.9器官受累(n)肾脏30心脏23肝脏5外周神经系统2器官受累数目(n)14212≥34Mayo2012分期(n)Ⅰ期8Ⅱ期9Ⅲ期10Ⅳ期32备注：e-GFR（ml/min/1.73m）：estimateedglomerularfiltrationrate，估算的肾小球滤过率肾炎对照组共20例患者，其中男性11例，女性9例，平均年龄50.1±8.4岁，24小时尿蛋白定量1.8(0.7,3.9)g，平均血清白蛋白32.9±7.9g/L，平均肾小球滤过率265.7±22.6ml/min/1.73m。20例慢性肾炎患者均行肾穿刺活检，其中病理诊断为膜-52- 第四军医大学硕士学位论文性肾病9例、IgA肾病9例、狼疮性肾炎1例、IgM肾病1例，具体资料见表2。表2.慢性肾小球肾炎对照组患者一般资料一般情况病例数20性别（男/女）11/9年龄(x±s)(岁)50.1±8.4实验室检查血红蛋白(x±s)(g/l)141.5±19.0舒张压,mmHg82.3±10.2收缩压,mmHg131.9±18.2血白蛋白,g/L32.9±7.924小时尿蛋白定量（四分位数间距）(g)1.8(0.7,3.9)血肌酐,μmol/L114.5±43.62GFR,ml/min/1.73m65.7±22.6病理诊断（例数）IgA肾病9膜性肾病9狼疮性肾炎1IgM肾炎12备注：e-GFR（ml/min/1.73m）：estimateedglomerularfiltrationrate，估算的肾小球滤过率。3.2标准曲线及参数双抗体夹心ELISA法测定血清vitronectin(VTN)标准曲线（见图1）、吸光度及计算血清浓度参数如下：图1.VTN标准曲线（A）。3.3AL型淀粉样变性与健康人的血清VTN比较AL型淀粉样变性患者血清中VTN浓度显著高于健康人（74103.9±23729.9ng/mlvs.53946.3±9279.7ng/ml，p=0.008）如图2及表3。-53- 第四军医大学硕士学位论文图2.AL型淀粉样变患者、慢性肾炎对照组、健康对照组的血清VTN浓度。AL型淀粉样变性患者血清VTN显著高于肾炎对照组及健康组。表3.AL型淀粉样变性与健康人对比淀粉样变性健康人P值（n=30）(n=20)男性/女性16/1410/100.948年龄(岁)58.0±7.956.4±9.50.518VTN浓度，ng/ml74103.9±23729.953946.3±9279.70.008备注：VTN：vitronectin，玻连蛋白。3.4AL型淀粉样变性与慢性肾炎对照组比较30例AL型淀粉样变性患者与20例慢性肾炎对照组患者比较，AL型淀粉样变性组患者血清VTN浓度显著高于慢性肾炎组（74103.9±23729.9ng/mlvs42240.3±14753.7ng/ml，p＜0.001），如图2示。两组间年龄、血红蛋白、血清白蛋白存在统计学差异，如表4示。表4.AL型淀粉样变性与慢性肾炎对比淀粉样变性（n=30）慢性肾炎(n=20)P值男性/女性16/1411/90.949年龄,岁58.0±7.950.1±8.40.001收缩压，mmHg110.7±17.9131.9±18.2＜0.001血红蛋白，g/L122.2±22.0141.5±19.00.002尿蛋白定量，g/24h2.2(1.3,4.3)1.8(0.7,3.9)0.4792eGRF,ml/min/1.73m77.9±23.865.7±22.60.079血肌酐，umol/l93.5±30.4114.5±43.60.071血清白蛋白，g/L27.5±7.832.9±7.90.019血清VTN浓度，ng/ml74103.9±23729.942240.3±14753.7＜0.0012备注：e-GFR（ml/min/1.73m）：estimateedglomerularfiltrationrate，估算的肾小球滤过率；VTN：vitronectin，玻连蛋白。-54- 第四军医大学硕士学位论文对上述50例患者年龄、尿蛋白定量、血红蛋白、血肌酐、eGFR（估算的肾小球滤过率）、血白蛋白与血清中VTN浓度进行Spearman相关性分析发现，年龄、尿蛋白定量与血清中VTN浓度无相关性（分别为p=0.057，p=0.439），而eGFR与血清VTN浓度呈正相关（r=0.323，p=0.035），血红蛋白、血白蛋白、血肌酐与血清VTN浓度呈负相关（分别为r=-0.369，p=0.014；r=-0.326，p=0.031；r=-0.403，p=0.007）。见图3。图3.血肌酐、eGFR、血白蛋白、血红蛋白与血清VTN浓度相关分析。eGFR与血清VTN浓度呈正相关，血红蛋白、血白蛋白、血肌酐与血清VTN浓度呈负相关。3.5血清VTN浓度对AL型淀粉样变性诊断价值评估对AL型淀粉样变性组和对照组（包括慢性肾炎对照组及健康对照组）共70例血清VTN浓度进行ROC曲线分析发现，血清VTN浓度临界值为66797.8ng/ml时，诊断AL型淀粉样变性的特异度为92.7%，敏感度为66.7%。ROC曲线下面积为0.791，p＜0.001。见图4。-55- 第四军医大学硕士学位论文图4.血清VTN浓度诊断AL型淀粉样变性ROC曲线图。3.6AL型淀粉样变性患者治疗前后血清VTN浓度比较。30例AL型淀粉样变性患者中有10例患者完成完整治疗疗程。其中达到非常好的部分有效（VGPR）及以上患者有6例，对有效组治疗前后的血清VTN浓度进行统计分析发现，与治疗前相比，治疗有效组的血清VTN浓度显著下降（81341.1±35941.4ng/mlvs36158.9±12424.9ng/ml，p=0.033），如图5示。对其行独立样本配对t检验发现仍有统计学差异（p=0.048）。治疗无效组4例患者治疗后血清VTN浓度虽有轻度下降，但并无统计学差异（74473.2±12424.9ng/mlvs59397.7±14108.2ng/ml，p=0.203）。如表5。图5.治疗有效患者治疗前后血清VTN浓度比较。治疗后患者血清VTN浓度明显下降。表5.AL型淀粉样变性治疗前后血清VTN浓度变化治疗前治疗后P有效组（n=6）VTN浓度，ng/ml81341.1±35941.436158.9±12424.90.033-56- 第四军医大学硕士学位论文尿蛋白定量，g/24h1520(1244,9150)926(242,1981)0.150血白蛋白，g/L26.9±9.132.4±8.80.308血肌酐，umol/l87.7±22.2104.3±31.10.310血红蛋白，g/L127.8±14.4116.0±14.10.180致病免疫球蛋白轻链浓度，mg/L91.8±72.324.1±14.70.07ProBNP364.3(148.7,3126.5)593.5(223.5,747.9)0.312无效组（n=4）VTN浓度，ng/ml74473.2±9781.159397.7±14108.20.203VTN：vitronectin，玻连蛋白。3.7血清VTN浓度与疾病分期关系研究组30例AL型淀粉样变性患者，按Mayo2012年淀粉样变性分期，8例Ⅰ期，9例Ⅱ期，10例Ⅲ期，3例Ⅳ期。表6.不同Mayo分期血清中VTN浓度StageⅠ(n=8)StageⅡ(n=9)StageⅢ(n=10)StageⅣ(n=3)VTN浓度，ng/ml103166.5±17233.468314.9±14174.263949.1±19707.748508.3±11286.6VTN：vitronectin，玻连蛋白。结合表6结果，随着淀粉样变性分期升高，患者血清中VTN浓度呈下降趋势，进行统计分析后发现，Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期血清VTN浓度较Ⅰ期患者显著降低（分别为p=0.001，p＜0.001，p=0.001），Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期之间无统计学差异，见图6。图6.不同Mayoclinic分期血清中VTN浓度变化。Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期血清VTN浓度较Ⅰ期显著下降，Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期之间血清VTN浓度无统计学差异。-57- 第四军医大学硕士学位论文4讨论AL型淀粉样变性发病机制目前仍未明确。目前认为由异常浆细胞增生产生单克隆的免疫球蛋白轻链聚合成蛋白质片段，其二级或三级构象发生β折叠后形成的纤[6]维样物质，这些淀粉样纤维物质在组织器官上沉积，导致器官功能障碍，但近年来越来越多的研究发现在淀粉样变性组织中除了淀粉样纤维蛋白外，还普遍存在某些特异性的伴侣蛋白以及相关补体激活系统参与其中，这些伴侣蛋白对淀粉样纤维蛋白稳定结构、粘附、细胞毒性等功能均起到病理性的功能作用。目前临床研究较多的ApoE和SAP，尤其是SAP分子，它是由肝脏合成分泌的五聚体糖蛋白，其特殊的表面构象结构在特定条件下与淀粉样蛋白共有构象结合，增加淀粉样蛋白的酶水[106][107]解稳定性。Pepys等利用阿尔茨海默病的Aβ淀粉样蛋白研发的小分子药物CPHPC已进入临床试验阶段，联合单克隆抗SAP抗体可以减少90%组织上与淀粉样[63]物质结合的SAP，并使SAP经肝脏迅速清除。Vitronectin作为一种多功能糖蛋白，目前临床上因其细胞增殖和迁移功能，在肿瘤领域广泛研究。近年来很多研究发现[87,95]，vitronectin特异性的沉积于各种类型淀粉样变性沉积物中，但vitronectin在淀粉样变性发病机制及细胞毒性的具体作用机制仍不清楚。但目前临床对血清中vitronectin与临床淀粉样变性相关性的相关研究尚无报道。本研究中通过采用双抗体夹心ELISA法，检测AL型淀粉样变性患者血清中vitronectin浓度，采用病例对照研究以探讨血清中vitronectin浓度与AL型淀粉样变性的相关性。本研究发现AL型淀粉样变性患者血清中vitronectin浓度显著高于健康人群及慢性肾炎患者，提示血清vitronectin浓度在AL型淀粉样变性诊断可能有一定的诊断价值。我们对照AL型淀粉样变性和其他常见慢性肾炎（膜性肾病、IgA肾病）时发现，AL型淀粉样变性患者血清vitronectin浓度显著高于慢性肾炎对照组，提示vitronectin有可能作为肾淀粉样变性鉴别诊断IgA肾病和膜性肾病的血清分子标志物，但仍需扩大样本量进一步验证。目前AL型淀粉样变性疗效评估主要依靠血液游离轻链水平变化以及免疫固定蛋白电泳克隆带的变化，本研究对AL型淀粉样变性患者治疗前后血清中vitronectin浓度变化分析发现，治疗达到VGPR及以上的患者，疾病缓解后的血清vitronectin浓度显著降低，而治疗无效组患者治疗前后血清vitronectin浓度未见显著性差异，这一结果提示vitronectin有可能成为评估AL型淀-58- 第四军医大学硕士学位论文粉样变性治疗疗效新的标志分子，这一发现在临床上目前尚无相关报道，后续我们需增加样本量进一步验证和探讨血清vitronectin与AL型淀粉样变性疗效评估相关性。我们对AL型淀粉样变性分期与血清vitronectin浓度进行分析发现，血清vitronectin浓度随着分期增加而降低，但是无统计学意义，这可能与我们入组样本量较少有关，另一方面因为我们评估淀粉样变性分期主要依靠心脏损伤指标，而血清vitronectin浓度是否与AL型淀粉样变性心脏损伤存在相关性，需要我们进一步研究。本研究中观察到的vitronectin与淀粉样变性相关性，以及AL型淀粉样变性患者治疗前后vitronectin浓度显著变化，可能提示vitronectin的细胞外基质锚定、细胞粘附、免疫防御等功能参与淀粉样变性发病机制以及vitronectin的补体调节作用可能与淀粉样物质的清除相关。需要进一步加大样本量，并通过体外实验及动物实验探索vitronectin在淀粉样变性发病机制中的作用。-59- 第四军医大学硕士学位论文小结1.AL型淀粉样变性患者的血清vitronectin浓度显著高于其他慢性肾小球肾炎及健康人对照组。2.血清vitronectin浓度随着AL型淀粉样变性患者疾病缓解而显著降低。3.血清vitronectin浓度有可能为AL型淀粉样变诊断及治疗效果的血清学标志物，但需要扩大样本量进一步验证。Vitronectin在淀粉样变性发病中的作用机制需要进一步研究。-60- 第四军医大学硕士学位论文参考文献1.Gertz,MA.,DispenzieriA,andSherT.Pathophysiologyandtreatmentofcardiacamyloidosis.NatRevCardiol,2014;12(2):91-102.2.Wittich,C.M.,etal.,Depositionofamyloidproteinsintheepicardialcoronaryarteriesof58patientswithprimarysystemicamyloidosis.CardiovascPathol,2007;16(2):75-78.3.Shi,J.,etal.,Amyloidogeniclightchainsinducecardiomyocytecontractiledysfunctionandapoptosisviaanon-canonicalp38alphaMAPKpathway.ProcNatlAcadSciUSA,2010.107(9):4188-93.4.Guan,J.,etal.,Stanniocalcin1isakeymediatorofamyloidogeniclightchaininducedcardiotoxicity.BasicResCardiol,2013.108(5):378.5.Murtagh,B.,etal.,Electrocardiographicfindingsinprimarysystemicamyloidosisandbiopsy-provencardiacinvolvement.AmJCardiol,2005.95(4):535-537.6.MerliniG,BellottiV.Molecularmechanismsofamyloidosis.NEnglJMed.2003;349(6):583–596.7.KyleRA,LinosA,BeardCM,LinkeRP,GertzMA,O’FallonWM,KurlandLT.IncidenceandnaturalhistoryofprimarysystemicamyloidosisinOlmsteadCounty,Minesota,1950through1989.Blood,1992,79(7):1817-1822.8.PinneyJH,LachmannHJ,BansiL,WechalekarAD,GilbertsonJA,RowczenioD,SattianayagamPT,GibbsSD,OrlandiE,WassefNL,BradwellAR,HawkinsPN,GillmoreJD.OutcomeinrenalALamyloidosisafterchemotherapy.JClinOncol.2011;29(6):674–681.9.XianghuaHuang,QingwenWang,SongJiang,WencuiChen,CaihongZengandZhihongLiu.TheclinicalfeaturesandoutcomesofsystemicALamyloidosis:acohortof231Chinesepatients.ClinKidneyJ.2015;8(1):120–126.10.PalladiniG,KyleRA,LarsonDR,TherneauTM,MerliniG,GertzMA.Multicentreversussinglecentreapproachtorarediseases:themodelofsystemiclightchainamyloidosis.Amyloid.2005;12(2):120-126.11.GertzMA,ComenzoR,FermandJP,HazenberqBP,HawkinsPN,MerliniG.Definitionoforganinvolvementandtreatmentresponseinimmunoglobulinlight-61- 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第四军医大学硕士学位论文个人简历和研究成果个人简历张明，男，1982年4月出生，35岁，2007年7月毕业于西安交通大学医学院临床医学五年制本科，获医学学士学位。2008年至2013年，在解放军第323医院肾内科住院医师。2013年至今空军军医大学第一附属医院西京医院肾内科攻读同等学力硕士学位，研究方向为淀粉样变性发病机制、诊断及治疗。导师孙世仁教授，研究方向CKD分子机制与预防，重症急性肾损伤发生机制与干预治疗。攻读学位期间研究成果张明、王妍、孙世仁。免疫球蛋白轻链型淀粉样变性84例临床特点、治疗及预后因素分析。临床内科杂志。2017.11（34）：740-743。-74- 第四军医大学硕士学位论文致谢本研究是在导师孙世仁教授的指导下完成的，我在实验以及临床中的每一个进步都离不开导师的指导和教诲。导师知识渊博、幽默睿智，严谨的工作态度、对学生无微不至的关怀，想患者之所想的高尚医德将是我永远学习的典范，也必将使我受益终生。在此向导师孙世仁教授致以最诚挚的感谢和崇高的敬意！真诚感谢王汉民教授、张鹏教授、许国双教授等专家教授给予我实验以及临床工作的悉心指导和帮助。特别感谢王妍主治医师、杨晓霞住院医师在实验准备工作的指导和协助。感谢白宾硕士在实验过程中的指导和帮助。感谢西京医院肾内科全体医护人员给予我提供的帮助。衷心感谢我的家人给予的理解和支持，他们的无私奉献和精神鼓励是我学业得以完成的保证。在此谨向所有关心、帮助和支持过我的老师、同事、同学和家人致以诚挚的谢意！-75-