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．学校代码：１０２８５学号：２０１４４２２１０９７ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶ硕士学位论文低剂量铁离子照射在ＮＬ２０人支气管上皮：细胞中诱导的长期生物学应－ＴｈｅｌｏｎｇｔｒｍｂｉｏｒｅｓｏｎｓｅｓｉｎＮｂｒｏｎｃｈｉａｌｅｉｔｈｅｌｉａｌｅｌｏｇｉｃａｌｐＬ２０ｈｕｍａｎｐｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｓｉｎｌｅｄｏｓｅｏｆＦｅｉｏｎｅｘｏｓｕｒｅｇｐ研究生姓名琳杨红英指导教师姓名病理与病生理学专业名称辐射遗传研究方向基础医学与生物科学学院所在院系４论文提交２０１７年月日期Ｐ＼ 苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立，进行研艽Ｔ＿作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外本论文不含其他个人或集体己经发表或撰写过的研宄成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研宄作。出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明本人承担本声明的法律责任。－论文作者签名日期？”？ 苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权扫属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸一质论文的内容相致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研宄所（含万方数据电子出版社）、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。．涉密论文口本学位论文属在年月解密后适用本规定。＾＿非涉密论文口：论文作者签名日期＿＾１：１导师签名：期］＿ 中文摘要目的：空间辐射，尤其是银河宇宙射线（galacticcosmicrays,GCR），含有高能带电粒子，拥有高传能线密度（linerenergytransfer,LET），对暴露在太空环境中执行空间任务的宇航员具有潜在致癌风险。其中肺癌是宇航员执行太空飞行任务之后面临的最大癌症风险。动物研究发现高LET重离子导致肺癌的效率高于低LET电离辐射。然而其中的细胞分子机制仍不明确。DNA是电离辐射作用于机体的最重要靶点。通常认为电离辐射致癌的机理是错误修复的DNA双链断裂导致基因突变、基因组的不稳定性等的产生。活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）在肿瘤的发生和发展中也具有重要作用，肿瘤细胞的胞内ROS水平常常高于与之对应的正常细胞。同时，在肿瘤发生发展进程中，原癌基因的激活和抑癌基因的失活也扮演着重要的角色。抑癌基因Reprimo作为P53基因的下游靶基因，其mRNA表达可被p53基因诱导，其蛋白水平的高表达使细胞周期停滞在G2期，从而抑制细胞增殖。本研究的主要目的是以人支气管上皮细胞NL20为研究对象，探讨低剂量高LET铁离子辐射对该种细胞产生的长期生物学效应，并与低LET电离辐射比较，为在细胞分子水平上探究空间辐射的致癌机制提供实验证据。首先采用低剂量α粒子与X射线对比，探讨NL20细胞受不同射线照射后其DNA损伤修复的情况。同时引入ATM抑制剂Ku55933，探究在照射前经Ku55933预处理对NL20细胞DNA损伤修复的影响。继而对细胞进行单次低剂量铁离子照射，探究受低剂量铁离子照射后NL20细胞中出现的长期生物学效应，并与X射线相比较，另外观察铁离子照射前经Ku55933预处理细胞对这些长期生物学效应的影响。最后探讨抑癌基因Reprimo对肺癌细胞H460辐射敏感性的影响。结果为揭示低剂量高LET空间电离辐射的致癌效应提供了坚实的细胞实验数据。方法：本研究在第一部分中采用53BP1foci作为DNA损伤的标记物，用免疫荧光法检测NL20细胞在不同照射方式下其DNA损伤修复的情况，辐射方式包括α粒子和X射线；并通过结晶紫法检测Ku55933在不同浓度及不同孵育时间处理NL20I 细胞后其增殖能力的变化来确定Ku55933的最佳工作浓度；Ku55933预处理方法为照射前1h在培养液中加入Ku55933，照射前更换为新鲜培养液；接着检测Ku55933预处理NL20细胞对其接受α粒子或X射线照射后DNA损伤修复的影响。实验第二部分主要是用10cGy铁离子照射以及在照前使用Ku55933预处理NL20细胞；细胞受照后正常传代到相应代数（18代后），然后测定子代细胞的多项生物学指标。用微核形成率评估染色体异常，通过增殖实验测定细胞的增殖速度，采用流式细胞术测定细胞DNA含量以确定各时相细胞的比例，用ROS检测试剂盒检测细胞内的活性氧水平，并用免疫蛋白印迹检测SOD1、SOD2表达，最后用软琼脂集落形成实验检测细胞的转化。在第三部分中，以微核形成率、流式细胞仪检测细胞的周期分布为指标评估受单次低剂量铁离子照射支气管上皮细胞NL20后发生转化的子代细胞辐射敏感性的变化，并采用免疫蛋白印迹法检测发生转化的子代细胞抑癌基因Reprimo的表达情况。第四部分，在H460细胞中稳定转染Reprimo以及空载质粒，通过外源性增加H460细胞中Reprimo的水平，以微核形成率、克隆形成实验、流式细胞仪测定细胞周期分布来探究Reprimo对H460细胞辐射敏感性的影响。结果：1.首先采用单次照射方法处理NL20细胞，比较0.3Gyα粒子照射组和0.9GyX射线照射组发现，X射线组53BP1foci的阳性细胞率及细胞平均53BP1foci数在照射后0.5、1和2h时高于0.3Gyα粒子照射组，但是在8h后逐渐下降，在照后24h时回到本底水平；而0.3Gyα粒子照射组的53BP1foci的阳性细胞率及细胞平均53BP1foci数随着时间的增加和下降均不明显。并且分次照射的结果与单次照射的结果一致。随后，用结晶紫实验检测Ku55933在不同浓度不同孵育时间下对NL20细胞增殖的影响，在48h内2、5、10和20μMKu55933对NL20细胞增殖的影响无统计学差异，据以往文献报导，10μMKu55933在抑制ATM磷酸化为最适浓度，所以实验选取10μMKu55933为抑制ATM磷酸化的最适浓度。在照射前1h加入Ku55933处理之后，无论是α粒子照射还是X射线照射，NL20细胞53BP1foci的阳性细胞率与单纯接受α粒子以及X射线照射组相比，53BP1foci存在的时间均延长。2.用10cGy铁离子照射处于指数生长期的NL20细胞；Ku55933预处理方法II 为照射前1h在培养液中加入Ku55933，照射前更换为新鲜培养液；细胞受照后正常传代到相应代数（18代后），然后测定子代细胞的多项生物学指标。受铁离子照射细胞的子代细胞，其微核形成率及辐射敏感性与未照射组细胞的同代子代细胞相比无明显差异；然而，受单次铁离子照射细胞的子代细胞与未照射组细胞的同代子代细胞比较，其增殖速度减慢，细胞周期G1期减少，G2/M期有轻微阻滞，细胞内活性氧水平升高，SOD1、SOD2表达降低，软琼脂集落形成明显增多。而抑制ATM虽然可以显著逆转受照细胞的子代细胞发生众多变化，但却未能抑制软琼脂集落形成增多的现象。3.与未受照的相应代数对照组子代细胞相比，NL20细胞受10cGy铁离子照射后第41代细胞的软琼脂集落形成明显增多。将未受照组子代细胞形成的软琼脂单克隆及受铁离子照射细胞的子代细胞所形成的软琼脂单克隆挑选出来后继续传代培养。在接受1GyX射线照射后，受铁离子照射细胞的子代细胞的单克隆细胞的微核形成率与相应未照射对照组子代细胞的克隆的细胞微核形成率相比明显增加，差异具有统计学意义。并且发现在接受4GyX射线照射后24h，受铁离子照射细胞的子代细胞的克隆细胞与对照组组子代细胞的克隆细胞相比出现了更严重的G2/M期阻滞，差异有统计学意义。另外，受铁离子照射细胞的子代细胞的克隆细胞与对照组子代细胞的克隆细胞相比，受铁离子照射细胞的子代细胞的克隆细胞Reprimo蛋白明显降低。4.在接受1GyX射线照射后48h，与转染空质粒的H460细胞相比，过表达Reprimo的H460细胞产生更多的微核；并且受照后过表达Reprimo的H460细胞的克隆形成能力更低。另外，接受4GyX射线照射后，过表达Reprimo的H460细胞比转染空质粒的H460细胞出现更多的G2/M期阻滞，差异有统计学意义。结论：1.无论是单次照射还是分次照射，α粒子导致的DNA损伤更复杂，细胞更难以修复。NL20细胞受α粒子或X射线照射前使用ATM抑制剂Ku55933预处理，可导致NL20细胞的DNA损伤存在的时间延长，即Ku55933抑制了细胞的DNA损伤修复。2.微核实验表明受单次0.1Gy铁离子照射细胞的子代细胞并未出现明显的染色体异常。但是，受单次0.1Gy铁离子照射细胞的子代细胞出现生长速度的减慢。III 并且，单次铁离子照射可导致受照细胞的子代细胞出现周期分布的微扰。同时，单次铁离子照射可导致受照细胞的子代细胞出现细胞内ROS水平升高，可能与细胞抗氧化系统功能的减弱有关。最重要的是单次低剂量铁离子照射能促进NL20子代细胞发生细胞转化。3.软琼脂克隆形成实验表明不仅只在受铁离子照射后的第18-22代细胞出现细胞转化，在受铁离子照射后的第41代细胞也出现了细胞转化。受铁离子照射后发生转化的子代细胞（即软琼脂克隆的第3-5代细胞）的辐射敏感性增加。受铁离子照射后发生转化的子代细胞（即软琼脂克隆的第3-5代细胞）Reprimo蛋白表达降低，提示Reprimo可能与辐射敏感性有关。4.过表达Reprimo的H460细胞的辐射敏感性增加。提示Reprimo与H460细胞的辐射敏感性相关。关键词：高LET；低剂量；铁离子；长期生物学效应；支气管上皮细胞；Reprimo；非小细胞肺癌细胞作者：曹倩琳指导老师：杨红英IV Thelong-termbiologicalresponsesinNL20humanbronchialepithelialcellsinducedbyasinglelowdoseofFeionexposureAbstractObjective:Oneofthemajorconcernsisthesignificantriskofcarcinogenesisinastronautsafterexposuretospaceradiationsuchasgalacticcosmicrays(GCR)consistingofenergeticprotonsandhigh-energycharged(HZE)nuclei.Lungcancerhasbeensuggestedtobethelargestpotentialcancerriskfromspacetravel.Ithasbeenwellknownthathigh-LETheavyionssuchasFeionsaremoreefficientthanlow-LETX-raysatinducinglungcancer.DNAisthemostimportanttargetofionizingradiation.Generally,thegeneticmutationsandgenomicinstabilitycausedbyunrepairedorincorrectlyrepairedDNAdamagemaycontributetothecarcinogenesisofionizingradiation.Reactiveoxygenspecies(ROS)isofteninvolvedincarcinogenesis.CancercellshavehigherintracellularROSlevelsthantheircounterpartnormalcells.Besides,activationofproto-oncogenesandinactivationoftumorsuppressorgenesalsoplayanimportantroleincarcinogenesis.Reprimo(RPRM)isanoveldownstreameffectorofp53,whichcaninducecellcyclearrestattheG2/Mcheckpoint.Andthisputativetumorsuppressorgenehasbeenfoundfrequentlysilencedviamethylationofitspromoterregioninseveralmalignances.Theaimofthisstudywastoinvestigatethelong-termbiologicalresponsesinNL20humanbronchialepithelialcellsinducedbylowdoseFeionradiation,andcomparewithX-rayexposure.Atfirst,thisthesisinvestigatedthedifferenceinDNAdamageandrepairinNL20cellsafterexposedtoαparticlesorXrays.Then,Ku555933,aspecificATMinhibitor,wasdemonstratedtobeabletoinhibitDNAdamagerepairafterαparticleorXrayexposure.Next,weinvestigatedthelong-termbiologicalchangesinNL20cellsinducedbyasinglelowdoseofFeionsorX-rays.Moreover,theeffectsofKu55933treatmentpriortoFeionexposureonthelong-termresponsesofFeionswerealsostudied.Finally,thisthesisinvestigatedtheeffectsofReprimoontheradiosensitivityofH460cells.ThesestudiespavedthewayV forthefurtherstudyonthemechanismsunderlyinglungcancercarcinogenesisinducedbylowdoseofhighLETspaceradiation.Methods:Inthefirstpartofthisthesis,immunofluorescenceof53BP1foci(DNAdamagesurrogate)wasusedasabiomarkerofDNAdamage.Weusedimmunofluorescencestainingof53BP1focitoinvestigatethekineticsofDNAdamagerepairafterlowdoseofαparticleorXrayexposure.WeusedthecrystalvioletassaytodeterminetheoptimalconcentrationofKu55933atwhichcaninhibitATMactivationeffectively.Cellswerepretreatedwith10μMKu55933for1hpriortoionizingexposure.NL20cellswerereplenishedwithfreshmediumbeforeradiation.Wealsousedimmunofluorescenceof53BP1focitofurtherinvestigatetheinhibitoryeffectofKu55933onDNAdamagerepairafterlowdoseofαparticleorXrayexposure.Inthesecondpart,NL20cellswereirradiatedwith10cGyFeions.ForKu55933pretreatment,NL20cellswerepretreatedwithKu55933for1hpriortoradiation,thenreplenishedwithfreshmediumimmediatelybeforeradiation.Cellswerepassagedasusualafterradiation.Anddifferentendpointsweremeasuredaftercertainpassages.Usingmicronucleusformationassaytoevaluatechromosomeaberration.Usingcellproliferationassaytodetectmultiplicationrate.Usingflowcytometrytodeterminecellcycledistribution.UsingcellularROSDetectionAssayKittodetecttheintracellularROSlevelsofcells.UsingWesternblottingtoevaluatetheexpressionofSOD1andSOD2.Usingsoft-agarcolonyformingassaytoassesscelltransformation.Inthethirdpartofthisthesis,Usingmicronucleusformationassay,colonyformingassayandflowcytometrytodeterminecellcycledistributiontoobservethechangesinradiosensitivityoftheprogenyofirradiatedNL20cells.AndReprimoexpressionoftheprogenyofirradiatedNL20cellswasevaluatedbyWesternBlotting.Inthefourthpartofthisthesis,wealsoexploredtheassociationofReprimowithradiosensitivitybyusingmicronucleusformationassay,colonyformingassayandflowcytometrytoassesstheradiosensitivityofH460cellswhenOverexpressingReprimo.Results:1.Atfirst,forasingledoseofirradiation(0.9GyofXraysor0.3Gyofαparticles),X-irradiationexposurecausedmorepositivecellswith53BP1fociandmore53BP1focipernucleusthanαparticlesdidat0.5,1,2hafterradiation.WithX-irradiation,thepercentageofpositivecellswith53BP1fociandthemeanfociVI numberpernucleusdecreased8hafterradiation,andwentbacktothecontrollevel24hafterradiation.TheincreaseanddecreaseofthepercentageofpositivecellsandthemeanfocinumberpernucleusafterαparticleswerelesssignificantthanafterX-irradiation.Moreover,similarresultswereobtainedwhencellswerefractionatedlyirradiated.CrystalvioletassaywasusedtodeterminetheoptimalconcentrationofKu55933,andnostatisticallysignificantproliferationinhibitionwasobservedattheconcentrationsof2,5,10or20μMfor48h.PreviousstudyhasdemonstratedthatKu55933at10μMcaninhibitATMactivationeffectively.Thus10μMwaschosenfortheoptimalconcentrationforKu55933.FurtherstudyalsoshowedthatKu55933pretreatmentpriortoαparticlesorX-irradiationcausedlongerdurationof53BP1fociwhencomparedwithrelativeirradiatedsampleswithoutKu55933pretreatment..2.NL20cellswereirradiatedwith10cGyFeions.ForKu55933pretreatment,NL20cellswerepretreatedwithKu55933for1hpriortoradiation.Cellswerepassagedasusualafterradiation.Anddifferentendpointsweremeasuredaftercertainpassages.TheprogenyofNL20cellsirradiatedwith0.1GyofFeionsshowedslightlyincreasedmicronucleusformation,significantlydecreasedproliferation,disturbedcellcycledistribution,obviouslyelevatedintracellularROSlevelsaccompaniedbyreducedSOD1andSOD2expression,buttheprogenyofNL20cellsirradiatedwith0.9GyofX-raysdidnotshowanysignificantchanges.Moreimportantly,Feionexposurecausedmuchgreatersoft-agarcolonyformationthanX-raysintheprogenyofirradiatedNL20cells.Ku55933reversedallthechangesintheprogenyofirradiatedcellsexceptthesoftagarcolonyformation.3.Thesoft-agarcolonyformationinthe41stprogenyofNL20cellsirradiatedwith0.1GyofFeionswasgreaterthantheprogenyofunexposedgroup.SomesinglecloneswerepickedfromthesoftagarwheretheprogenyofFe-irradiatedNL20cellsornon-irradiatedweregrowing,andweregrownasusualfor3-5passages.TheseprogenyoftransformedNL20cellscausedby0.1GyofFeionsshowedgreaterincreasedmicronucleusformationafter1GyXrayscomparingwiththeirunexposedcounterpart.Moreover,theseprogenyoftransformedNL20cellscausedby0.1GyofFeionsinducedmoreG2/Marrestthantheirunexposedcounterpartafterirradiatedwith4GyofX-rays.Additionally,theexpressionofReprimowasreducedintheseprogenyoftransformedNL20cellscausedby0.1GyofFeionswhencomparedwiththeirunexposedcounterpart.VII 4.Fourty-eighthoursafter1GyX-rayexposure,H460cellswithoverexpressedReprimoshowedgreatermicronucleusformationcomparingwiththenegativecontrol.Moreover,H460cellswithoverexpressedReprimoshowedmuchlowersurvivalfractionthanthenegativecontrolafterX-irradiation.Inaddition,6and24hafter4GyX-rayexposure,overexpressionofReprimoinH460cellscausedmoreG2/Marrest.Conclusions:1.TheDNAdamageinducedbyαparticleswasmorecomplexandwasmoredifficulttorepairthanthatinducedbyX-rays.Ku55933pretreatmentinhibitedDNAdamagerepairandmadeDNAdamagelastlonger.2.Comparedwiththerelativecontrol,theprogenyofirradiatedNL20cellsdidnotshowanychangesinbothmicronucleusformationandradiosensitivity.However,theprogenyofNL20cellsirradiatedwithFeionsdisplayeddecreasedproliferation,disturbedcellcycledistributionmanifestaslessG1andmoreG2/M,elevatedintracellularROSlevelsandreducedSOD1andSOD2expression,mostimportantly,theprogenyofirradiatedcellsshowedgreatercolonyformationinsoftagar,suggestingcelltransformation.Moreover,ATMinhibitionbyKu55933reversedallthechangesintheprogenyofirradiatedcellsexceptthesoftagarcolonyformation.ThesedataindicatedthatevenasinglelowdoseofFeionscouldinducelong-termbiologicalresponsessuchascelltransformationetc.3.TheseprogenyoftransformedNL20cellscausedby0.1GyofFeionsshowedhigherradiationsensitivity.Andtheexpressionofreprimowasreducedintheseprogeny.ThesedatasuggestedthatradiosensitivitymayberelatedtoReprimo.4.ReprimooverexpressionincreasedradiationsensitivityinH460cells,suggestingthatReprimowasassociatedwiththeradiosensitivityofH460cells.Keywords:highlinear-energy-transfer;lowdose;Feions;long-termbiologicaleffects;bronchialepithelialcells;Reprimo;non-small-celllungcancercellsWrittenby:QianlinCaoSupervisedby:HongyingYangVIII 目录前言...............................................................................................................................1第一部分低剂量α粒子或X射线在NL20细胞中造成的DNA损伤及其修复......5材料....................................................................................................................5一、实验细胞.....................................................................................................5二、主要器材.....................................................................................................5三、主要试剂.....................................................................................................6方法....................................................................................................................71.细胞培养、传代、冻存和复苏....................................................................72.辐照条件........................................................................................................83.53BP1免疫荧光实验检测NL20细胞经不同LET射线照射后其DNA损伤修复的情况.................................................................................................94.结晶紫实验检测ATM抑制剂Ku55933对NL20细胞增殖的影响.......105.统计学方法..................................................................................................11实验结果..................................................................................................................111.NL20细胞受α粒子、X射线单次照射后其DNA损伤修复的情况........112.NL20细胞接受α粒子、X射线分次照射后其DNA损伤修复的情况.....133.结晶紫实验检测ATM抑制剂Ku55933对NL20细胞增殖的影响.......154.Ku55933预处理对单次及分次α粒子照射NL20细胞后其DNA损伤修复的影响...........................................................................................................155.Ku55933预处理对单次X射线照射NL20细胞后其DNA损伤修复的影响.......................................................................................................................17讨论..................................................................................................................19第二部分单次低剂量铁离子照射在支气管上皮细胞中导致的长期生物学效应.21材料..................................................................................................................21方法..................................................................................................................221.细胞培养和辐照............................................................................................222.微核形成实验..............................................................................................22 3.细胞增殖实验..............................................................................................234.流式细胞术检测细胞周期分布..................................................................235.细胞内ROS水平测定................................................................................236WesternBlot检测细胞中SOD1、SOD2表达水平....................................237.软琼脂克隆实验评估细胞转化..................................................................248.统计学方法..................................................................................................24实验结果.........................................................................................................................241.接受铁离子照射NL20的子代细胞的微核形成率.....................................242.受铁离子照射NL20细胞的子代细胞的增殖速度.....................................263.受铁离子照射NL20细胞的子代细胞的周期分布.....................................274.受铁离子照射NL20细胞的子代细胞的胞内活性氧（ROS）水平.........295.受铁离子照射NL20细胞的子代细胞的SOD1、SOD2表达水平...........296.受铁离子照射NL20细胞的子代细胞的细胞转化.....................................30讨论.............................................................................................................................32第三部分受单次低剂量铁离子照射后发生转化的NL20子代细胞辐射敏感性改变34材料..................................................................................................................34方法......................................................................................................................351.细胞辐照........................................................................................................352.铁离子照射NL20后其子代细胞发生细胞转化.........................................353.微核形成实验..............................................................................................354.流式细胞仪检测细胞周期分布..................................................................355.WesternBlot检测细胞中Reprimo表达水平.............................................356.统计学方法..................................................................................................36实验结果..................................................................................................................361.受铁离子照射NL20细胞的41代子代细胞的细胞转化...........................362.受铁离子照射NL20细胞的子代细胞克隆再次受X射线照射后的微核形成率...............................................................................................................373.受铁离子照射NL20细胞的子代细胞克隆再次受X射线照射后的周期分布.......................................................................................................................38 4.受铁离子照射NL20细胞的子代细胞克隆细胞中Reprimo的表达水平.40讨论......................................................................................................................40第四部分Reprimo对H460细胞辐射敏感性的影响...............................................42材料..................................................................................................................42一、实验细胞...................................................................................................42二、实验器材和试剂.......................................................................................42方法..................................................................................................................431.质粒转化、扩增和提取..............................................................................432.细胞稳定转染................................................................................................453.转染质粒的H460细胞总RNA的提取.....................................................464.cDNA的合成.................................................................................................465.Real-timePCR检测旁效应细胞Reprimo的表达.......................................466.微核形成实验................................................................................................477.克隆形成实验................................................................................................478.流式细胞仪检测细胞周期............................................................................479.统计学方法..................................................................................................48结果..................................................................................................................481.H460细胞过表达Reprimo后的RT-PCR验证...........................................482.过表达Reprimo的H460细胞受照后的微核形成率.................................493.过表达Reprimo的H460细胞受照后的存活分数.....................................494.过表达Reprimo的H460细胞受照后的细胞周期分布.............................50讨论..................................................................................................................52结论.........................................................................................................................54参考文献.........................................................................................................................55综述.............................................................................................................................61攻读学位期间本人出版或公开发表的论文.................................................................69缩略词表.........................................................................................................................70致谢.............................................................................................................................71 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应前言前言1961年4月12日，莫斯科时间上午9时07分，苏联航天员尤里·阿列克谢耶维奇·加加林乘坐“东方”1号飞船从拜科努尔发射场起航，在最大高度为301千米的轨道上绕地球飞行一周，历时108分钟，于10时55分安全返回，降落在萨拉托夫州梅洛卡夫村地区，完成了世界上首次载人航天飞行，由此拉开了世界载人航天的序幕。随着我国科学技术和经济的飞速发展，我国已后来居上，迈入了航天大国的行列。2003年10月15日9时，“神舟”五号载人飞船在酒泉卫星发射中心发射升天，中国首位航天员杨利伟被顺利送上太空。截至目前，我国已有10位航天员完成了太空飞行任务。并且，载人空间站作为国家重大科技专项已被批准，正在建设中。我国空间站核心舱已于2016年年底完成总装，目前进入整舱测试阶段，预计2018年发射升空。到2022年，中国将建成一座空间站；并且载人登月和火星探测等国家重大科技专项也已进入论证或等待批准阶段。2004年，中国正式开展月球探测工程。嫦娥五号将于2017年11月，由我国目前推力最大的长征五号运载火箭从中国文昌航天发射场进行发射，目标是实现月面无人采样返回。在月球采样可以实现之后，火星采样返回预计在2030年左右实现。2030年以后，我国将要实现载人登月，向太阳系边缘遥远的星系进行探测。这些国家重大科技工程的论证和批准，既为空间生命科学研究提供了前所未有的机遇，也凸显解决长期载人航天飞行安全性问题的紧迫性（1）。随着人类对空间探索的不断深入，越来越多的航天员甚至普通人都将进入太空。然而，太空中复杂的环境对于宇航员健康的影响却存在很多未知。空间环境不同于我们居住的地球环境。首先，太空中由于地心引力的缺失，导致失重；其次，太空中存在独特的空间辐射。空间辐射的来源复杂，主要包括3类（2）：(1)俘获带辐射。在地球磁场区捕获的来自太阳高能带电粒子形成的近地空间辐射环境,由内、外两个辐射带和一个辐射异常区组成。内辐射带主要含能量超过10MeV的质子，外辐射带主要是含能量低于10MeV的电子。对于在低轨道飞行的航天飞机，遭遇来自俘获带的辐照剂量是相当低的。(2)银河宇宙辐射（galacticcosmicrays,GCR）。银河宇宙辐射是由来自外层空间太阳系的粒子组成,所含的电离原子范围1 前言低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应为单个质子至元素铀核。主要成分是质子，约占87%,其能量谱峰约为1GeV；其次是α粒子，约占14%，重离子约占1.3%。(3)太阳粒子事件（solarparticleevents,SPE）。由太阳磁暴引起太阳耀斑爆发，向太阳系空间发射出大量的带电粒子，如质子、α粒子和重离子。太阳粒子事件随太阳活动表现出很大的变异性，但有近似周期性质的变化。在太阳耀斑爆发和日冕大喷发期间，这种辐射量有很大差异。空间环境辐射成分既有低LET（linerenergytransfer,LET）辐射，也有高LET辐射。来源于银河宇宙射线、太阳粒子事件及地球辐射带的高LET辐射，主要为高能质子、α粒子、重离子和中子等。由于地球大气与地球磁场的保护作用，生活在地面的人群受到来自空间天然辐射的影响很小。然而，在航空航天活动中，随着飞行高度的逐渐增加，地球大气与磁场的保护作用逐渐减弱，使得来自空间的辐射对航空航天飞行人员的影响逐渐增强（3-5）。空间环境对宇航员健康的影响是多方面的。空间环境会影响宇航员体内细胞基因的表达。在对国际空间站的宇航员进行研究后发现，空间环境会改变宇航员毛囊基因的表达，例如航天飞行造成与毛发生长相关的基因，比如FGF18、ANGPTL7和COMP基因上调，从而抑制了毛囊细胞的增殖（6）。研究还发现，长时间在太空停留会影响宇航员线粒体稳态和氧化还原状态。通过分析在国际空间站（InternationalSpaceStation,ISS）驻扎六个月的十名宇航员在飞行前、飞行时以及飞行后的头发样本。通过PCR检测发现，在飞行时mtDNA/nDNA的比率明显下降。在飞行时以及飞行后mtRNA/nRNA的比例也有明显的降低。使用同样的样品，检测氧化还原反应以及信号转导相关基因MnSOD、CuZnSOD、Nrf2、Keap1、GPx4和Catalase，结果显示除了Catalase之外，上述基因的表达在飞行后都显著降低。而上述基因表达的降低可促进氧化应激反应，从而造成线粒体的损伤。这些结果表明飞行时氧化应激的增加会导致宇航员线粒体显著的损伤（7）。深空辐射会影响宇航员的血管内皮，导致宇航员患心血管疾病的风险增大。对以下三组人群进行调查：(1)从来没有在太空轨道执行过任务的宇航员；(2)只在近地轨道飞行的宇航员：(3)离开过地球磁层的阿波罗登月宇航员。结果表明，未执行过太空飞行任务的宇航员以及只在近地轨道飞行的宇航员的心血管疾病死亡率分别是9%及11%，两组之间的差异比较无统计学意义。但是阿波罗登月宇航员的心血管疾病死亡率高达43%，远远大于前两组宇航员，为前两组宇航员的4-5倍。为了探2 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应前言索这个结果的可能机制，研究人员进一步模拟空间失重以及辐射等复杂环境对小鼠心血管系统的长期影响，结果表明，空间辐射诱导了血管内皮细胞的功能障碍，这种损伤导致了闭塞性动脉疾病，这可能是执行任务后宇航员心血管疾病高发的重要原因（8）。空间环境对宇航员健康的影响当中，肿瘤的发生是最重要的风险之一。其中空间辐射是导致肿瘤发生最重要的因素。虽然空间辐射中重离子所占比例不高,但在空间辐射的生物学效应中有着重要的意义。尤其是银河宇宙射线（galacticcosmicrays,GCR），含有高能带电粒子，拥有高传能线密度，对暴露在空间环境下执行空间任务的宇航员具有潜在致癌风险（9）。根据目前被广泛接受的线性无阈值模型（linearnon-thresholdmodel,LNT)，航天员在低剂量率、低剂量空间辐射环境中似乎是安全的，然而事实并非如此。LNT模型是在对二战日本原子弹爆炸幸存者、核事故受害人员、相关辐射从业人员及受照射的病人等进行流行病学研究的基础上建立的，而这些人群所受的主要是低LET的光子辐射（如X射线、γ射线等）。目前研究发现低剂量（100mSv）及低剂量率（<6mSv/h）电离辐射也能在动物身上产生生物学效应，这些生物学效应既有有利的一面也有有害的一面。有利的一面包括减少肿瘤的发生、延长寿命、提高生育力等；有害的一面包括辐射导致的遗传损伤以及表观遗传改变，而这些改变与生理的紊乱有很重要的联系，比如免疫系统的改变、大脑发育异常导致认知障碍、白内障形成、胚胎发育异常、循环系统疾病、体重增加、雌性动物过早绝经、肿瘤发生以及寿命缩短等等。亲代暴露于低剂量或低剂量率的电离辐射会导致生育率及活胎率降低。同时能影响子代的基因组稳定性。关于低剂量及低剂量率导致的生物学效应差异与很多因素有关，比如动物的易感性、年龄、辐射的类型、辐射的品质等等（10）。但是这也说明低剂量及低剂量率的辐射也不是一定安全的。而且空间辐射中的高能质子、重离子等高LET粒子与低LET光子辐射有着本质的差别。在物理特性上，光子在沉积能量时是弥散的，而高LET粒子能在相当小的范围内沉积非常高的能量；并且，高LET粒子在射程末端存在尖锐的Bragg峰，在Bragg峰之前相当长的距离内能量衰减小（但LET依然显著高于光子），而光子的能量随传输的距离呈指数衰减；另外，高LET粒子在其径迹周围有高能电子及由于核反应而产生的碎片，这些电子和碎片能够在径迹结构以外沉积能量，而光子不具有这样的径迹。在生物特性上，3 前言低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应与低LET光子相比，高LET辐射导致更多、更复杂的DNA团簇损伤（11，12），显示高LET辐射与低LET辐射造成的DNA损伤是不同的。正是由于高LET辐射造成的DNA损伤更复杂，细胞难以正确修复这样的损伤，因此高LET辐射在细胞致死、基因突变及细胞转化等方面具有较高的生物学效应（13）。尤其是重离子，虽然它们的丰度低，但电离密度更高，所造成的危害更严重。通常重离子的相对丰度随其原子序数的增加而减少，但铁离子是一个特例，它的丰度在重离子中相对较高（14），对有效剂量的贡献超过10%（15）。因此研究空间辐射对航天员的健康影响就必须研究铁离子的生物学效应。美国航空航天局（NASA）根据已有的研究数据认为，肺癌是航天员在太空飞行后面临的最大健康威胁（16）。关于空间辐射如何导致肺癌的研究取得了不少进展。美国BrookhavenNationalLaboratory模拟空间辐射，在Wistar大鼠身上探究高LET的铁离子、低LET的γ射线导致的微核及染色体损伤等生物学效应。测定了离体气管以及深部肺组织的染色体异常及微核率。发现随着照射剂量的增加，染色体损伤及微核率也增加。铁离子照射导致的染色体异常是γ射线的3.2倍。铁离子导致的遗传损伤是γ射线的0.9-3.3倍。这些损伤的差异表明受铁离子照射导致肿瘤的风险更大（17）。而最近的在体动物实验研究显示包括铁离子在内的重离子诱导肺癌的效率远高于X射线（18），提示不同辐射品质的射线导致癌变的能力不同。另外，辐射能导致肺的纤维化（19）。小鼠实验研究发现，低剂量的铁离子照射能在肺部产生长期的表观遗传学改变，从而导致肺的纤维化甚至促进癌变（20）。尽管已有以上这些研究，然而空间辐射导致肺癌的细胞分子机制仍不明确，关于高LET低剂量电离辐射对肺上皮细胞的长期生物学效应的研究还很少。因此，本研究以人支气管上皮细胞NL20为研究对象，探讨单次低剂量铁离子照射对该细胞产生的长期生物学效应。4 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第一部分第一部分低剂量α粒子或X射线在NL20细胞中造成的DNA损伤及其修复重离子（Heavy-ions）是指原子序数大于或等于2的被剥离或部分剥离了轨道的原子核，带有正电荷，如α粒子、铁离子等。为了探究NL20细胞在受到低剂量高LET与低LET射线照射的情况下其DNA损伤修复是否不同，本研究使用本实验室自行设计建造的241Amα粒子照射装置以及商业化的X射线机，采用直接照射的方法，用53BP1（P53-bindingprotein1，DNA损伤传感蛋白）免疫荧光染色来观察NL20细胞受照后DNA损伤修复情况。照射方式为单次照射和分次照射。在照射后不同时间点观察NL20细胞DNA损伤修复的变化。α粒子与X射线照射结果相比较，探讨低剂量不同辐射品质射线对NL20细胞造成的损伤以及修复的差异；结晶紫实验测定使用不同浓度的ATM抑制剂Ku55933处理NL20细胞不同时间后其增殖能力的变化；并以53BP1foci为指标，进一步观察Ku55933预处理对NL20细胞接受α粒子、X射线照射后DNA损伤修复的影响。DNA是电离辐射作用于机体的重要靶点，本部分研究工作的目的是通过探究低剂量高LET电离辐射与低剂量低LET电离辐射在NL20细胞中造成的DNA损伤及修复的差异，为研究不同辐射品质射线在NL20细胞中诱导的长期生物学效应奠定基础。同时引入ATM抑制剂Ku55933，也是为了进一步探究NL20细胞在受照后短期DNA损伤修复受阻对射线长期生物学效应的影响。材料一、实验细胞人永生化支气管上皮细胞NL20（ATCC）二、主要器材1.CO2培养箱（美国Thermo公司）2.立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）3.洁净工作台（SW-CJ-2FD，苏州安泰公司）5 第一部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应4.超声波清洗器（SK8200H，上海科导超声仪器有限公司）5.电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）6.Millipore纯水器（Millipore公司）7.数显恒温搅拌循环水槽（巩义市予华仪器有限责任公司）8.迷你离心机（苏州珀西瓦尔实验设备有限公司）9.可调速漩涡混匀器（苏州珀西瓦尔实验设备有限公司）10.磁力搅拌器（X85-2，上海驰久仪器厂）11.微孔板快速振荡器（QB-9001型，其林贝尔公司）12.台式低速自动平衡离心机（L600，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）13.电子分析天平（AB124型，上海海康电子仪器厂）14.酸度计（上海康仪仪器有限公司）15.无菌注射器过滤器（Ф0.22μm）（上海米沙瓦医科工业有限公司）16.微量移液器（德国Eppendorf公司）17.RAD-SOURCERS2000X射线机（美国RadSource公司）18.荧光倒置显微镜（DM2000，德国Leica公司）19.圆形盖玻片（Ф18mm）（永华化学科技江苏有限公司）20.细胞培养皿、培养板（美国Corning公司）21.-80℃超低温冰箱（美国Thermo公司）22.241Amα粒子照射装置（中国苏州大学）23.Thermo移液枪（美国Thermo公司）三、主要试剂1.Ham’sF12干粉培养基（Sigma-Aldrich公司）2.胎牛血清（Wisent公司）3.胰岛素（中国碧云天生物技术研究所）4.氢化可的松（美国MPBiomedicals公司）5.二甲基亚砜（DMSO）(中国碧云天生物技术研究所）6.非必需氨基酸（Sigma-Aldrich公司）7.一抗53BP1抗体（Abcam公司）6 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第一部分8.AlexaFluor488标记山羊抗兔IgG（中国碧云天生物技术研究所）9.上皮生长因子（美国OmegaBio-tek公司）10.左旋谷氨酰胺（中国碧云天生物技术研究所）11.转铁蛋白（无锡国盛生物工程有限公司）12.抗荧光淬灭剂（中国碧云天生物技术研究所）13.蔗糖（上海国药集团化学试剂有限公司）14.Triton-100（上海国药集团化学试剂有限公司）15.乙醇、甲醇等各种分析纯（江苏强盛功能化学股份有限公司）16.脱脂奶粉（武汉谷歌生物科技有限公司）17.4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（中国碧云天生物技术研究所）18.山羊血清（美国Gibco公司）19.4%多聚甲醛（百浩生物科技有限公司）20.透析血清（上海博升生物科技有限公司）21.乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich公司）22.氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠等无机盐（上海国药集团化学试剂有限公司）23.葡萄糖（上海国药集团化学试剂有限公司）24.Ku55933（ATMKinaseInhibitor）（美国Selleck公司）25.结晶紫（上海国药集团化学试剂有限公司）方法1.细胞培养、传代、冻存和复苏NL20细胞以适当比例接种于含有4%胎牛血清、1.5g/l碳酸氢钠、2.7g/l葡萄糖、2mM左旋谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.005mg/ml胰岛素、10ng/ml上皮生长因子、0.001mg/ml转铁蛋白、500ng/ml氢化可的松的F12培养液中（pH7.2），放置于37℃、含5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，次日换液。当细胞在培养皿中生长到约70-80%汇合时，去除培养皿中的培养液，加入含有0.02%EDTA、7 第一部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应5%透析血清的Ca-MgfreeHanks'BSS，放入培养箱中，37℃消化15分钟，此时在显微镜下可以观察到细胞收缩变圆甚至脱落，加入新鲜培养液终止消化，用移液枪轻轻吹打以使细胞脱落并形成单细胞悬液，混合均匀后进行细胞计数，取所需数量的细胞接种于新的培养皿中。冻存时，取对数生长期的细胞，吸掉培养液，加分散液消化形成单细胞悬液，加入新鲜培养液终止消化，并吹打混匀计数。1000rpm、5min离心去除上清液，加入适量含有20%胎牛血清、10%DMSO的F12冻存液以使每毫升冻存液中含有100万个细胞，取1ml此细胞悬液加入到1.8ml的冻存管中，置于4℃冰箱30min，-20℃冰箱2h，-80℃冰箱过夜，然后转入液氮罐中长期保存。复苏细胞时，预先准备好37℃恒温水浴锅以及预热好的F12细胞培养液，从液氮罐中取出冻存管，将其迅速置于恒温水浴锅中解冻。将解冻后的细胞悬液移至离心管中，再加适量新鲜培养液以稀释细胞悬液，1000rpm、5min离心去上清，用含有4%胎牛血清的F12培养液重悬后移至培养皿中培养，第二天换液。2.辐照条件X射线照射采用美国RADSOURCERS2000X射线机进行照射，能量为160kVp，LET为2keV/μm，剂量率为1.16Gy/min。α粒子照射采用本实验室自行设计加工而成的α粒子照射装置。其实物与解剖图如下，整个装置由电机、编码器、α粒子源、源支架、盖玻片盘以及紫外灭菌灯等构成。α粒子源为241Am面源（5.48Mev），位于源支架上，其几何尺寸为36×4mm、有效直径为20mm，活度为5.7×106/(2π·min)。面源与盖玻片盘平行放置，两者之间的距离为10mm。源支架可旋转。培养有细胞的玻璃爬片放置于盖玻片盘的圆形凹槽中受照。经过剂量率标定，位于盖玻片盘的细胞受照的剂量率为0.138Gy/min，LET为95keV/μm（21）。8 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第一部分α粒子照射装置实物图和二维结构图具体辐照过程：NL20细胞接受单次α粒子、X射线照射（1）取生长良好接近汇合的NL20细胞，消化后接种于六孔板，α粒子、X射线照射组每孔接种3×105个细胞,对照组每孔接种2×105个细胞。（2）24h后NL20细胞接受α粒子、X射线照射，照射前均更换新鲜培养液，照射剂量为α粒子0.3Gy，X射线0.9Gy。NL20细胞接受分次α粒子、X射线照射（1）取生长良好接近汇合的NL20细胞，消化后接种于六孔板，0.5、1、2和8h固定细胞的照射组每孔接种1.5×105个细胞，对照组每孔接种1×105个细胞，24h固定细胞的照射组每孔接种1×105个细胞，对照组每孔接种0.8×105个细胞，48h固定细胞的照射组每孔接种1×105个细胞，对照组每孔接种0.6×105个细胞。（2）接种24h后对NL20细胞进行α粒子或X射线照射，照射剂量为α射线0.1Gy，X射线0.3Gy。每隔24h照射一次，共照射3次。照射前均更换新鲜培养液。3.53BP1免疫荧光实验检测NL20细胞经不同LET射线照射后其DNA损伤修复的情况（1）NL20细胞接种于含无菌圆形盖波片的六孔板中，分别接受α粒子或X射线照射；（2）到达所需时间点后，在室温下用PBS快速清洗细胞两次，然后用3.7%甲醛的PBS溶液固定细胞15min；9 第一部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应（3）去除固定液，用PBS清洗细胞3次，每次5min；（4）向每个样品中加入0.5ml冰冷的Triton-100缓冲液（50mM氯化钠、3mM氯化镁、200mM蔗糖、10mMHEPES和0.5%TritonX-100，调整pH为7.4），放入4℃冰箱孵育15min以使细胞膜通透；（5）去除Triton-100缓冲液，用PBS清洗细胞3次，每次5min；（6）向每个样本中加入100μl封闭缓冲液（含0.1%TritonX-100、3%山羊血清和0.2%脱脂奶粉的PBS溶液），室温孵育1h；（7）将抗53BP1抗体以1：200的比例稀释于含有0.1%TritonX-100和3%山羊血清的PBS溶液中，每个样品加入100μl一抗溶液，在室温下孵育45min；（8）去除一抗溶液，用PBS清洗细胞4次，每次5min；（9）将二抗AlexaFluor488标记山羊抗兔IgG(H+L)稀释于含有3%山羊血清的PBS溶液中，终浓度为1.5μg/ml，向每个样品加入100μl二抗溶液，室温孵育45min；（10）去除二抗溶液，用PBS清洗细胞4次，每次5min；（11）用5μg/ml4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色5min；（12）去除DAPI溶液后，PBS清洗细胞2次，每次5min；（13）最后用抗荧光淬灭剂封片，在荧光倒置显微镜40×下进行细胞观察、计数。含5个及以上53BP1foci的细胞为阳性细胞，计数至少500个细胞中阳性细胞的个数，或计数至少100个细胞核中的53BP1foci数。4.结晶紫实验检测ATM抑制剂Ku55933对NL20细胞增殖的影响（1）将NL20细胞接种于96孔板中，分为24h、48h和72h三组，每组每孔接种NL20细胞个数分别为：8000、5000和3000个：（2）培养24小时后，去除原培养液，分别用新鲜培养液或加药培养液继续培养24、48或72h：（3）到达时间点后，使用一次性注射器从96孔板小心将培养液移除并用PBS小心清洗2次：（4）用溶于甲醇的结晶紫溶液（0.5%）室温条件下染色15min，然后去除结10 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第一部分晶紫溶液，将96孔板用清水洗净，并放置晾干：（5）加入100μl0.1M柠檬酸钠（pH4.2）/50%无水乙醇溶液，震摇30min：（6）用酶标仪（BIO-TEKPOWERWAVEXS）在540nm处读取OD值。5.统计学方法_实验结果均来自至少3次独立实验，以均数±平均差表示（x±s)，利用Origin8.0统计学软件进行两样本的t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。实验结果1.NL20细胞受α粒子、X射线单次照射后其DNA损伤修复的情况采用单次照射的方法，观察NL20细胞在接受0.3Gyα粒子或0.9GyX射线照射后0.5、1、2、8、24及48hNL20细胞中53BP1foci的形成情况。图1.1(a)所示，经0.3Gyα粒子、0.9GyX射线照射后1h，NL20细胞53BP1foci的形成情况。在未照射的情况下，NL20细胞也会产生一定的DNA损伤。在α粒子、X射线照射后1h，NL20细胞内53BP1foci点数明显高于未照射组，其中X射线组细胞内53BP1foci点数最高，结果显示与均匀的X射线照射不同，α粒子照射是不均匀的，即在照射野内，并不是每个细胞都会被α粒子穿过，每个细胞接受α粒子数也不相同。图1.1(b)所示，经0.9GyX射线照射后0.5和1h，NL20细胞中含53BP1foci的阳性细胞率升高显著，但于2h后明显降低，并且在24h及48h与同一时间点固定的未照射组相比差异没有统计学意义。此外，在0.9GyX射线照射后0.5、1、2及8hNL20细胞中含53BP1foci的阳性细胞率均高于0.3Gyα粒子照射组，并且差异具有统计学意义。但是与0.9GyX射线照射组相比，经0.3Gyα粒子照射后NL20细胞中含53BP1foci的阳性细胞率随着时间下降的幅度不明显。经0.3Gyα粒子照射的NL20细胞中含53BP1foci的阳性细胞率在24h依然高于同一时间点固定的未照射组，并且差异具有统计学意义。图1.2所示，在0.9GyX射线照射后0.5、1、2及8hNL20细胞平均53BP1foci点数均高于0.3Gyα粒子照射组，在2h的时候两组之间的差异具有统计学意义。并且0.9GyX射线照射组的细胞内平均53BP1foci点数随着时间下降的幅度很明显，在24h的时候细胞内平均53BP111 第一部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应foci点数低于0.3Gyα粒子照射组。经0.3Gyα粒子照射后NL20细胞平均53BP1foci点数升高虽然没有X射线显著，但是其随着时间下降的幅度小于0.9GyX射线照射组。这与53BP1foci阳性细胞率的结果趋于一致。这些结果提示单次低剂量高LET的α粒子导致的DNA损伤比单次低剂量低LET的X射线导致的DNA损伤更难以修复，修复的速度明显更慢。(a)(b)**60***CTR*particlesX-rays40****20*P0erc0.5h1h2h8h24h48hentaTimeafterirradiation(h)geof图1.1(a)单次α粒p子、X射线照射后1h,NL20细胞53BP1foci形成情况;(b)单次αositiv粒子、X射线照射ec后不同时间NL20细胞中含53BP1foci的阳性细胞率变化情况。ell*代表两组间比较sw，P值＜0.05，存在统计学差异。**代表两组间比较，P值＜0.01，ith53B存在统计学差异。P1foci(%)12 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第一部分8**7*CTRparticles6X-rays5**4**32M1ean530BP0.5h1h2h8h24h48h1fTimeafterirradiation(h)ocinu图1.2单次α粒子、mbX射线照射后不同时间NL20细胞内平均53BP1foci数的变化erpe情况。*r代表两组间比较，P值＜0.05，存在统计学差异。cell2.NL20细胞接受α粒子、X射线分次照射后其DNA损伤修复的情况本研究也采用了分次照射的方法，观察NL20细胞在接受3×0.1Gyα粒子或3×0.3GyX射线照射后不同时间（0.5、1、2、8、24和48h）其53BP1foci的变化情况。如图1.3所示，经3×0.3GyX射线照射后0.5、1及2h，NL20细胞中含53BP1foci的阳性细胞率升高显著，与相应同一时间点固定的未照射组相比差异具有统计学意义，但于8h后明显降低，并且在24h及48h与同一时间点固定的未照射组相比差异没有统计学意义。而经3×0.1Gyα粒子照射后NL20细胞中含53BP1foci的阳性细胞率随着时间下降的幅度不明显。此外，在3×0.3GyX射线照射后0.5、1、2及8hNL20细胞中含53BP1foci的阳性细胞率均明显高于3×0.1Gyα粒子照射组，在0.5、1、2h的时候两组之间的差异具有统计学意义，但是在24h及48h两组之间53BP1foci的阳性细胞率差异不明显，并且差异也没有统计学意义。图1.4所示，在3×0.3GyX射线照射后0.5、1、2及8hNL20细胞平均53BP1foci点数均高于3×0.1Gyα粒子照射组，在1h的时候两组之间的差异具有统计学意义。但是3×0.3GyX射线照射组的细胞内平均53BP1foci点数随着时间下降的幅度也很明显，在24h的时候细胞内平均53BP1foci点数低于3×0.1Gyα粒子照射组。经3×0.1Gyα粒子照射后NL20细胞平均53BP1foci点数升高虽然没有X射线显著，但是其随着时间下降的幅度小于3×0.3GyX射线照射组。这与13 第一部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应53BP1foci阳性细胞率的结果趋于一致。分次照射与单次照射的结果表明α粒子照射引起NL20细胞的DNA损伤比X射线照射导致的DNA损伤更难以修复，修复所需要的时间更长。*40***35**CTR30particlesX-rays2520**15*105P0erc0.5h1h2h8h24h48hentaTimeafterirradiation(h)geof图1.3分次α粒子或pX射线照射后不同时间NL20细胞中含53BP1foci的阳性细胞ositiv率变化情况ec。*代表两组间比较，P值＜0.05，存在统计学差异。ellswith53B6**CTRP1particlesfo*X-raysci(5*%)****4321Mean530BP0.5h1h2h8h24h48h1fTimeafterirradiation(h)ocinu图1.4分次α粒子或mbX射线照射后不同时间NL20细胞内平均53BP1foci数的变化erpe情况。*代表两组间r比较，P值＜0.05，存在统计学差异。**代表两组间比较，Pcell值＜0.01，存在统计学差异。14 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第一部分3.结晶紫实验检测ATM抑制剂Ku55933对NL20细胞增殖的影响为了寻找合适的抑制剂浓度，本实验检测不同浓度的Ku55933孵育不同时间后对NL20细胞增殖的影响。实验结果显示，如图1.5，在至少48h内2、5、10和20μMKu55933对NL20细胞增殖虽有抑制趋势，但均无统计学差异。据以往文献报导（22），10μMKu55933在抑制ATM磷酸化为最适浓度。考虑到Ku55933预处理时间仅为1h，所以实验选取10μMKu55933为抑制ATM磷酸化的最适浓度。1.3*1.2CTR2M1.15M*1.010M20M0.90.80.70.60.5Proli0.4fera0.3tio0.2n0.10.024h48h72hCulturingtimewithKu55933(h)图1.5ATM抑制剂Ku55933对NL20细胞增殖的影响。*代表两组间比较，P值＜0.05，存在统计学差异。4.Ku55933预处理对单次及分次α粒子照射NL20细胞后其DNA损伤修复的影响细胞在受到电离辐射后，DNA损伤应答信号体系（DNAdamageresponse，DDR）迅速激活来修复辐射造成的损伤。随即本研究又研究了ATM抑制剂Ku55933是否会抑制α粒子照射后NL20细胞的DNA损伤修复。图1.6所示，从未照射组、未照射组但经Ku55933处理的NL20细胞在0.5、8和24h其53BP1foci阳性细胞率结果来看，在未照射的情况下，NL20细胞也会产生一定的DNA损伤，经Ku55933处理之后NL20细胞在相同时间点其53BP1foci阳性细胞率比相应未照射组高，说15 第一部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应明Ku55933在未照射的情形下就能起到抑制DNA损伤修复的作用。NL20细胞受0.3Gyα粒子单次照射后0.5和8h，Ku55933预处理组的53BP1foci阳性细胞率略高于单纯照射组，虽然差异并没有统计学意义。但在照射后24h，Ku55993预处理组的53BP1foci阳性细胞率显著高于单纯照射组。图1.7所示是Ku55933预处理对分次α粒子照射NL20细胞后其DNA损伤修复的情况，在0.5、8和24h未照射组但经Ku55933处理的NL20细胞的53BP1foci阳性细胞率高于未照射组，验证了之前Ku55933在未照射的情形下也能起到抑制DNA损伤修复的作用。NL20细胞受3×0.1Gyα粒子分次照射后0.5、8和24h其53BP1foci阳性细胞率比3×0.1Gyα粒子分次照射前Ku55933预处理组升高的幅度小，即在照射前经Ku55933预处理NL20细胞后，53BP1foci阳性细胞率要高于单纯接受α粒子照射组，这与单次照射的结果一致。在单次照射和分次照射后24h，这两组之间53BP1foci的阳性细胞率的差异仍然有统计学意义，提示Ku55933抑制ATM磷酸化之后抑制了细胞对DNA双链断裂的修复。CTRCTR+Ku15particles*particles+Ku*****10**5P0erc0.5h8h24henTimeafterirradiation(h)tageof图1.6Ku55933预p处理对受0.3Gyα粒子单次照射后不同时间（0.5、8和24h）ositivNL20细胞53BP1ecfoci阳性细胞率的影响。*代表两组间比较，P值＜0.05，存在统ell计学差异sw。**代表两组间比较，P值＜0.01，存在统计学差异。ith53BP1foci(%)16 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第一部分CTRCTR+Ku*particles15particles+Ku*******105P0erc0.5h8h24hentaTimeafterirradiation(h)geofp图1.7Ku55933预os处理对受0.3Gyα粒子分次照射后不同时间（0.5、8和24h）itiveNL20细胞53BP1cefoci阳性细胞率的影响。*代表两组间比较，P值＜0.05，存在llsw统计学差异ith。**代表两组间比较，P值＜0.01，存在统计学差异。53BP5.Ku55933预1f处理对单次X射线照射NL20细胞后其DNA损伤修复的影响oci(%之前工作验证)了Ku55933预处理可导致NL20细胞在接受α粒子照射后其DNA损伤修复时间延长，那么NL20细胞经Ku55933预处理再接受X射线照射其DNA损伤修复时间是否也会延长呢?本实验采用Ku55933预处理对单次X射线照射NL20细胞后检测其DNA损伤修复的情况。如图1.8所示，未照射组但经Ku55933处理的NL20细胞在3h其53BP1foci阳性细胞率要高于从未照射组，并且差异具有统计学意义。说明与之前所得到的结果一致，Ku55933在未照射的情形下就能起到抑制DNA损伤修复的作用。在单次0.9GyX射线照射后3h观察NL20细胞53BP1foci阳性细胞率，发现照射前经Ku55933预处理NL20细胞后，其53BP1foci阳性细胞率要高于单纯接受X射线照射组，并且差异具有统计学意义。图1.9所示是Ku55933预处理对单次0.9GyX射线照射后3hNL20细胞平均53BP1foci点数的情况，在3h未照射组但经Ku55933处理的NL20细胞平均53BP1foci点数高于未照射组的趋势，虽然差异并没有统计学意义。NL20细胞受0.9GyX射线单次照射后3h其53BP1foci点数升高的幅度比0.9GyX射线单次照射前Ku55933预处理组小，即在照射前经Ku55933预处理NL20细胞后，其细胞平均53BP1foci17 第一部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应点数要高于单纯接受X射线照射组，差异具有统计学意义，这与测定53BP1foci阳性细胞率的结果一致。提示Ku55933抑制ATM磷酸化之后抑制了细胞DNA双链断裂修复。CTRCTR+Ku**80X-rays**X-rays+Ku7060504030*2010P0ercTimeafterirradiation(3h)entageofp图1.8Ku55933预处os理对接受0.9GyX射线单次照射后3hNL20细胞中53BP1itivefoci阳性细胞率的影ce响。*代表两组间比较，P值＜0.05，存在统计学差异。**代llsw表ith两组间比较，P值＜0.01，存在统计学差异。53BP1CTRfo*CTR+Kuci(%8X-rays)X-rays+Ku**765432M1ean530BPTimeafterirradiation(3h)1focinum图1.9Ku55933预be处理对接受0.9GyX射线单次照射后3hNL20细胞内平均rper53BP1foci数的影响ce。*代表两组间比较，P值＜0.05，存在统计学差异。**代表ll两组间比较，P值＜0.01，存在统计学差异。18 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第一部分讨论细胞的DNA在生命活动过程中容易受到各种各样的攻击，包括细胞内的代谢产物和细胞外的环境因子。电离辐射能够产生各类DNA损伤，DNA损伤的识别和DNA损伤的修复在DNA损伤响应中起重要作用。53BP1（P53-bindingprotein1，DNA损伤传感蛋白）免疫荧光染色作为评估DNA损伤情况已被众多科研工作者采纳（23-25）。在各类DNA损伤中，DNA双链断裂最为危险，这是因为DNA双链断裂如果没有及时修复会导致细胞凋亡或衰老，而如果修复不当又会导致染色体畸变、基因组不稳定甚至癌变（26）。双链断裂可以通过两个基本过程即同源重组和非同源末端链接修复。同源性重组（Homologousrecombination,HR）修复是利用细胞内的染色体两两对应的特性，若其中一条染色体上的DNA发生双链断裂，则另一条染色体上对应的DNA序列可当作修复的模板来修复之前的序列。非同源末端链接（Non-homologousendjoining,NHEJ）的修复机制是完全不需要任何模板，依靠修复蛋白直接将双股断裂的末端拉近，然后由DNA黏合酶（ligase）的帮助将末端接合。高LET电离辐射所致的DNA单双链断裂比值与低LET电离辐射造成的不同。低LET辐射造成的DNA损伤多为单链断裂（SSB），修复起来比较容易。高LET电离辐射造成的DNA团簇损伤含有更多的DNA双链断裂、无碱基位点、氧化碱基等损伤，比低LET电离辐射产生的DNA损伤更为复杂，更难修复，修复的方式多采用容易产生错误修复的非同源性末端链接修复（27）。本研究首先探讨人支气管上皮细胞NL20受低剂量高LET的α粒子或低LET的X射线照射后其DNA损伤及修复的情况。结果显示，无论采用单次照射还是分次照射的方法，NL20细胞在受到0.9GyX射线照射后在0.5、1和2h其53BP1foci，无论是阳性细胞率还是细胞内平均53BP1foci数都比0.3Gyα粒子照射组高，在照射后8h时X射线导致的DNA损伤已经逐渐减少，在24h基本回到本底水平，而0.3Gyα粒子照射导致的DNA损伤虽然没有X射线多，但是在照后其53BP1foci减少的速率远没有X射线组的快。这些结果证实细胞修复α粒子导致的DNA损伤的速度比修复X射线导致的DNA损伤要慢很多。提示高LET的α粒子造成的DNA损伤更复杂更难以修复，这与之前的发现相吻合（28）。细胞在受到电离辐射后，ATM发生自磷酸化被激活，而后磷酸化其下游蛋白，从而全面激活DDR，以修复19 第一部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应辐射造成的DNA损伤（29）。Ku55933能抑制ATM磷酸化，从而抑制DNA损伤修复（30）。于是本课题进一步探究了Ku55933对低剂量α粒子或X射线照射NL20细胞后其DNA损伤修复的影响。首先，通过结晶紫实验观察了不同浓度的Ku55933孵育不同时间对NL20细胞增殖的影响，并结合文献（31），最终选取10μM作为Ku55933抑制ATM磷酸化的最适浓度。结果显示照射前使用ATM抑制剂Ku55933预处理可抑制NL20细胞对低剂量α粒子或X射线照射造成DNA损伤的修复。这为下面研究细胞在受照后短期DNA损伤修复受阻对射线长期生物学效应的影响奠定了基础。20 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第二部分第二部分单次低剂量铁离子照射在支气管上皮细胞中导致的长期生物学效应完全依赖真实的空间辐射环境来研究空间辐射的生物效应研究并不现实。因此，通过地面模拟空间辐射环境来研究相应的效应规律和机理至关重要，可为空间辐射健康危害评价和防护措施的开发提供重要依据。例如，利用地基模拟研究发现低剂量铁离子照射幼龄小鼠及大鼠，经过较长的一段时间后，受照小鼠及大鼠的行为方式发生了改变，提示低剂量铁离子照射对中枢神经系统存在长期效应（32-34）。并且已有研究发现，空间辐射能影响肺的功能，并有可能导致肺的纤维化（35）。另外，在致癌效应方面，有研究发现包括铁离子在内的重离子可导致小鼠肺癌的发生，而且其致癌率远超X射线（20）。然而这些关于空间辐射长期效应的研究大多都是在动物水平上进行的。为进一步在细胞水平上探究低剂量铁离子的致肺癌机制，从而为评估空间环境中铁离子照射致肺癌的风险提供参考，本研究选取高LET的铁离子，以人支气管上皮细胞为研究对象，采用X射线作为比较，探讨单次低剂量铁离子照射及X射线照射对该种细胞的长期生物学效应。X射线对该种细胞的长期生物学效应数据由本实验室刘苇同学完成。材料1.DCFDA-ROS检测试剂盒（英国Abcam公司）2.细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（中国碧云天生物技术研究所）3.PVDF膜（美国Bio-Rad公司）4.SDS-PAGE电泳仪及转膜仪（美国Bio-Rad公司）5.电泳凝胶成像分析仪（GL2200Pro，美国Crestream公司）6.CYTOMICSFC500流式细胞仪（美国BECKMANCOULTER公司）7.PowerWaveXS微孔板分光光度计（美国BIO-TEK公司）8.Tween20（中国碧云天生物技术研究所）21 第二部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应9.BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）（美国Bio-Rad公司）10.十二烷基磺酸钠（SDS）（中国碧云天生物技术研究所）11.抗β-actin抗体（中国碧云天生物技术研究所）12.HRP标记山羊抗鼠IgG（中国碧云天生物技术研究所）13.HPR标记山羊抗兔IgG（中国碧云天生物技术研究所）14.原钒酸钠（PMSF）（美国Sigma-Aldrich公司）15.抗SOD1、SOD2抗体（中国武汉博士德生物公司）16.Tris、Glycine（维森特生物技术有限公司）17.β-巯基乙醇（美国Amresco公司）18.化学发光剂（ECL）（美国Bio-Rad公司）19.溴酚蓝（美国Amresco公司）20.手持式自动细胞计数器（美国Millipore公司)21.其他材料见第一部分方法1.细胞培养和辐照NL20细胞培养方法如前一章。细胞接种后24h，在培养液中提前加入10μMKu55933，并培养1h后，照射前更换为新鲜培养液。铁离子采用中国科学院近代物理研究所重离子加速器深层治癌终端，能量为180MeV/nucleon，离子束坪区LET约为300keV/μm，剂量率为0.1Gy/min。X射线采用美国RADSOURCERS2000X射线机进行照射，能量为160kVp，LET为2keV/μm，剂量率为1.16Gy/min。取生长良好接近汇合的NL20细胞接受铁离子、X射线照射，照射前均更换新鲜培养液，照射剂量为铁离子0.1Gy，X射线0.9Gy。照射后的NL20细胞正常传代到指定代数后，用这些子代细胞继续以下实验或再次照射X射线。2.微核形成实验（1）取对数生长期的NL20子代细胞接种于放有无菌圆形盖玻片的六孔板中，每孔接种80000个NL20细胞，培养48h后，弃去培养液，用PBS快速清洗两遍。22 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第二部分（2）加入甲醇：醋酸（v:v）=3:1固定10min并晾干。然后用DAPI（5μg/ml）染色5min，再用PBS清洗2次。（3）用抗荧光淬灭剂封片。将玻片置于荧光显微镜下观察、计数。含微核的细胞为阳性细胞，计数至少1000个细胞。3.细胞增殖实验将1×105NL20子代细胞接种于60mm培养皿中。分别在第2、4、6天消化，用培养液重悬，并在显微镜下计数。4.流式细胞术检测细胞周期分布（1）8×105NL20子代细胞接种在60mm培养皿中。（2）24h后，收集细胞后固定于70％的乙醇中，并储存于-20℃（至少长于12h）备用。（3）离心细胞悬浮液并用PBS洗两次，再悬浮于含RNA酶的500µl碘化丙啶中，37℃避光温浴30分钟，用流式细胞仪（BDFACSVerse,USA）进行检测。（4）采用ModFitLT3.2Software分析细胞周期。5.细胞内ROS水平测定（1）取对数生长期的子代细胞制成单细胞悬液，用20μMDCFDA在培养箱中染色孵育45min。（2）除去DCFDA，用1×Buffer洗涤一次后用无酚红培养液重悬并计数，每组取50000个细胞置于专门用于测定荧光的96孔板中，每组设5个平行样。（3）用酶标仪在激发波长485nm，发射波长528nm处检测其荧光强度，本实验以50μMTBHP处理的NL20细胞作为阳性对照。6WesternBlot检测细胞中SOD1、SOD2表达水平（1）收集NL20子代细胞，用预冷的PBS清洗两遍，加入适量细胞裂解液（0.1%TtitonX-100、10mMTris（pH7.4）、150mMNaCl、5mMEDTA、1mMPMSF、0.1%蛋白酶抑制剂），在冰上裂解30min后，13000g，4℃离心10min，取上清。23 第二部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应（2）用Bradford蛋白定量法测蛋白浓度。取适量蛋白溶液，加入相应体积的5×SDS-PAGE上样缓冲液，混合均匀，95℃变性5min。（3）用12%SDS-PAGE电泳分离蛋白，湿法稳流（30mA）转膜过夜。用TBST清洗4遍，3%BSA室温封闭1h。一抗（抗SOD1和SOD2兔多克隆抗体，博士德生物，中国；抗β-actin鼠单克隆抗体，碧云天，中国）室温孵育2h，TBST清洗4遍。二抗（抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)和抗辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)，碧云天，中国）室温孵育45min，TBST清洗4遍。（4）ECL（BioRad,USA）显影，多功能激光扫描成像系统（GEAmersham,USA）进行曝光成像。7.软琼脂克隆实验评估细胞转化（1）取1ml1.2%agar及1ml2×NL20完全培养基1:1（v:v）混合均匀加到六孔板中。（2）室温下凝固后。然后加500μl0.6%agar及500μl2×NL20完全培养基（含5000个NL20细胞），1:1（v:v）混合均匀。（3）琼脂凝固后，再加1ml1×NL20完全培养基。置于37℃，5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养2周。（4）在显微镜下观察，集落直径大于100μm为阳性集落。8.统计学方法_实验结果均来自至少3次的独立实验，以均数±平均差表示（x±s)，利用Origin8.0统计学软件进行两样本的t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。实验结果1.接受铁离子照射NL20的子代细胞的微核形成率微核形成率被广泛用作染色体损伤、基因组不稳定性和癌变风险的生物标志物。为了研究单次低剂量铁离子及X射线照射支气管上皮细胞后的长期损伤风险，本研究检测了受照细胞的子代细胞的微核形成率。结果发现NL20细胞接受单次0.1Gy铁离子照射后，其第18代子代细胞的微核形成率与未照射组细胞的同代子24 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第二部分代细胞相比有增加的趋势，但差异无统计学意义（图2.1），接受单次0.9GyX射线照射后，其第18代子代细胞的微核形成率与未照射细胞的同代子代细胞相比差异也无统计学意义。单次0.1Gy铁离子照射细胞的第41代子代细胞与未照射组细胞的同代子代细胞相比差异无统计学意义（图2.2）。尽管ATM抑制剂Ku55933本身增加了未受照细胞的第18代子代细胞的微核形成率，但NL20细胞在受照前用Ku55933处理1小时并未对其子代细胞的微核形成率有影响。这些结果提示单次低剂量铁离子照射并未显著增加其子代细胞的染色体异常。另外，本研究还检测了受铁离子照射细胞的第54代子代细胞接受1GyX射线照射后的微核形成率。图2.3显示铁离子照射过的子代细胞及未照射细胞的同代子代细胞受1GyX射线照射后其微核形成率与相应未照射组相比，微核形成率明显升高，并且差异具有统计学意义。但是受X射线照射后，铁离子照射过的子代细胞与未照射细胞的同代子代细胞的微核形成率相比差异并没有统计学意义，表明受单次铁离子照射细胞的子代细胞的辐射敏感性并未改变。8*642Pe0rceCTRCTR+KuX-raysFeionsKu+Fentageofc图2.1受0.1Gy铁ell离子照射或0.9GyX射线照射NL20细胞的第18代子代细胞swit的微核形成率以及hKu55933预处理对铁离子照射组的影响。*代表两组间比较，Pmicro值＜0.05，存在统计学差异。nucleus(%)25 第二部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应654321Pe0rceCTRCTR+KuFeionsKu+Fentageofce图2.2受0.1llGy铁离子照射NL20细胞的第41代子代细胞的微核形成率以及swithnKu55933预处理对铁离子照射组的影响。ucleusw****it20hMN(%)15105Perc0eCTRCTR-XFeionsFeions-Xntageofce图2.3受0.1Gy铁ll离子照射NL20细胞的第54代子代细胞接受1GyX射线照射swith后的微核形成nu率。**代表两组间比较，P值＜0.01，存在统计学差异。cleusw2.受铁离子照it射NL20细胞的子代细胞的增殖速度hMN尽管接受单次(%0.1Gy铁离子照射或0.9GyX射线照射的NL20细胞的子代细)胞的微核形成率与未照射细胞的同代子代细胞相比没有显著差异，但为了揭示这26 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第二部分样的照射条件给细胞带来的长期影响，本研究还检测了照射细胞的第18-22代子代细胞的增殖速度。结果发现，当以相同密度接种各组子代细胞后，与未受照细胞的子代细胞相比，经铁离子照射过的NL20的子代细胞的增殖速度显著降低，而经X射线照射过的NL20子代细胞的增殖速度与未照射细胞的同代子代细胞相比无差异。ATM抑制剂Ku55933单独处理NL20对其子代细胞的增殖速度也无明显影响。但是NL20细胞接受铁离子照射前用Ku55933处理却能消除其子代细胞增殖变慢的现象（图2.4）。这些结果提示单次0.1Gy铁离子照射可导致受照细胞的子代细胞生长速度的改变。250CTRCTR+KuX-rays200Feions)Ku+Fe4150*100M50eancell0nu0d2d4d6dmbeTime(d)r(*10图2.4受0.1Gy铁离子照射或0.9GyX射线照射NL20细胞的第18-22代子代细胞的细胞增殖及Ku55933预处理对铁离子照射组的影响。*代表两组间比较，P值＜0.05，存在统计学差异。3.受铁离子照射NL20细胞的子代细胞的周期分布本研究接着探究受铁离子以及X射线照射NL20细胞的子代细胞的周期分布以及ATM抑制剂Ku55933对子代细胞周期分布的影响。图2.5显示典型的各组子代细胞的周期分布图，定量分析后发现铁离子照射组的第18-22代子代细胞与未照射组细胞的同代子代细胞比较，其G1期细胞显著减少（p<0.05），G2/M期细胞有增多的趋势（P=0.0697），提示单次铁离子照射可导致受照细胞子代细胞出现周期分布的微扰。X射线照射组的第18-22代子代细胞的周期分布与未照射组细胞的同27 第二部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应代子代细胞比较无明显差异。另外，Ku55933单独处理NL20细胞，可增加其子代细胞的G2/M期细胞，但NL20细胞受铁离子照射前用Ku55933处理1h可消除铁离子在受照细胞子代细胞中引起的周期微扰（图2.5）。G2/M120SG110024.5118.8119.6025.1622.73*806036.9736.1236.1837.6939.3840Ce2044.2239.3844.72ll**c37.1537.88ycle0disCTRCTR+KuX-raysFeionsKu+Fetribution(图2.5受0.1Gy%铁离子照射或0.9GyX射线照射NL20细胞的第18-22代子代细)胞的细胞周期分布及Ku55933预处理对铁离子照射组的影响。*代表与对照组相比，P值＜0.05，存在统计学差异。28 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第二部分4.受铁离子照射NL20细胞的子代细胞的胞内活性氧（ROS）水平ROS在辐射引起的生物学效应中扮演着重要角色（36）。大量证据支持辐射导致的慢性氧化应激与辐射导致的远期正常组织损伤具有因果关系（37）。并且，持续增高的ROS常常与基因组的不稳定性相关（38）。因此，本研究检测了接受单次0.1Gy铁离子或X射线照射NL20细胞的第18-22代子代细胞的胞内ROS水平。结果发现铁离子照射NL20的子代细胞的胞内ROS水平明显高于未受照射NL20的子代细胞。而X射线照射NL20的子代细胞的细胞内ROS水平与未受照射NL20的子代细胞相比并没有升高。另外，ATM抑制剂Ku55933单独处理NL20细胞并未显著改变受处理细胞的子代细胞的胞内ROS水平，但在照射前用Ku55933预处理细胞1h却能显著降低受照细胞子代细胞的胞内ROS水平（图2.6）。这些结果提示铁离子照射对细胞的胞内氧化还原状态具有长期影响，而Ku55933预处理能降低这样的影响。2.0**1.61.20.80.4Relativ0.0einCTRCTR+KuX-raysFeionsKu+Fetracllular图2.6受0.1GyR铁离子照射或0.9GyX射线照射NL20细胞的第18-22代子代细OSl胞的胞内ROS水ev平及Ku55933预处理对铁离子照射组的影响。*代表两组间比较，elsP值＜0.05，存在统计学差异。5.受铁离子照射NL20细胞的子代细胞的SOD1、SOD2表达水平胞内ROS水平变化往往与细胞的SOD系统关系密切。为了解释受铁离子照射NL20细胞的子代细胞胞内ROS水平升高的原因，本研究进一步探究了各组细29 第二部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应胞的SOD1、SOD2表达水平。图2.7显示的是典型的各组细胞SOD1和SOD2的westernblot条带。结果表明受铁离子照射NL20的第18-22代子代细胞的SOD1、SOD2表达水平与未照射细胞的相应子代细胞相比均降低，并且，Ku55933预处理抑制了这种降低。受X射线照射NL20的第18-22代子代细胞的SOD1较相应未照射组的子代细胞低，但其SOD2表达水平却没有显著变化，说明X射线照射对受照细胞的子代细胞的SOD1、SOD2表达水平的影响远低于铁离子。图2.7受0.1Gy铁离子照射或0.9GyX射线照射NL20细胞的第18-22代细胞的细胞SOD1、SOD2蛋白表达水平及Ku55933预处理对铁离子照射组的影响。6.受铁离子照射NL20细胞的子代细胞的细胞转化研究显示持续升高的胞内ROS水平可促进细胞转化（39）。因此，本研究又采用软琼脂克隆形成实验评估了受铁离子照射NL20细胞的子代细胞的细胞转化能力。图2.8显示了各组细胞的软琼脂集落照片和集落数目定量。结果显示受铁离子照射NL20细胞的子代细胞的软琼脂集落形成与未受照细胞的相应子代细胞比较有显著升高。然而，与对受照细胞子代细胞的胞内ROS水平和SOD表达水平影响不同的是，在细胞受照前用Ku55933预处理1h并未降低其子代细胞的集落形成，提示Ku55933的影响可能是多方面的。受X射线照射NL20细胞的子代细胞的软琼脂集落形成与未受照细胞的相应子代细胞比较无明显差异。30 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第二部分8***642Theco0loCTRCTR+KuX-raysFeionsKu+Fenyformin图2.8受0.1gGy铁离子照射或0.9GyX射线照射NL20细胞的第18-22代子代细eff胞的软琼脂集ic落形成照片和形成率及Ku55933预处理对铁离子照射组的影响。*ien代表两组间比cy较，P值＜0.05，存在统计学差异。**代表两组间比较，P值＜0.01，(%)存在统计学差异。31 第二部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应讨论已有研究数据提示空间辐射中的低剂量高能重离子如铁离子比地球上低剂量辐射如γ射线等有更强的致癌能力（40，41）。利用现有的以地面人群流行病学研究结果为基础的辐射致癌模型来评估空间辐射的致癌风险并不合适。要想合理评估空间辐射的致癌风险最理想的方法是进行航天员的流行病学研究，然而由于参加过航天飞行的航天员数量非常有限，无法进行流行病学研究，因此利用细胞和动物模型来进行高能质子和重离子生物学效应及其机制研究十分必要，有利于帮助评估空间辐射的风险。已有数据提示空间辐射导致的肺癌是航天员航天飞行活动后的一个较大潜在健康风险（16），但是其发生机制却不清楚。在动物水平上，研究发现包括铁离子导致肺癌发生的效率超过X射线（20），但细胞水平的机制却不明确。因此本研究以NL20人支气管上皮细胞（绝大多数人癌症都起源于上皮细胞）为模型研究了单次低剂量铁离子照射的长期效应，为揭示空间辐射导致肺癌的机制提供实验依据。本研究发现NL20细胞仅接受单次0.1Gy铁离子照射后，其子代细胞就发生了显著变化，表现为细胞增殖变慢，G1期细胞减少，并且子代细胞的SOD1和SOD2表达下降，胞内ROS水平升高，最重要的是，虽然以微核形成为指标并未发现受照细胞的子代细胞有显著的染色体异常，但是受照细胞的子代细胞的软琼脂集落形成率却显著增加。有研究发现，2-6GyX射线照射能引起受照细胞的子代细胞内ROS水平升高，这种升高的趋势一直持续到照射后2周（42）。而本研究发现，0.9GyX射线照射并没有引起受照细胞的18-22子代细胞内ROS的水平升高。本研究与Rugo等人的研究有2个很重要的区别，一个是本研究细胞照射的X射线剂量较低（0.9Gy），另一个是在细胞照射后2个月才检测其子代细胞内ROS水平。这可能是导致不同结果的原因。ROS在肿瘤的发生和发展中扮演着重要的角色（43-45），而且肿瘤细胞的胞内ROS水平常高于与之对应的正常细胞（46）。正常情况下，细胞内产生的氧自由基及代谢物与清除自由基的机制即抗氧化系统处于平衡状态，当这一平衡被打破，细胞便处于氧化应激状态。本研究在发现受照细胞的子代细胞胞内ROS水平上升的同时发现其SOD1和SOD2表达下降，显示受照细胞的子代细胞的抗氧化能力下降。这与Buonanno等人在与受铁离子照射细胞32 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第二部分共培养的旁效应细胞中观察到由于其抗氧化酶活性下降从而导致其处于长期氧化应激状态相似（47）。细胞氧化还原状态的改变可导致细胞增殖速度改变、细胞凋亡或癌变等（48）。尽管许多致癌剂在对特定组织或器官的致癌作用中会促进细胞的增殖，但也有大量证据证明单纯的细胞增殖速度并不总是与癌变相关（49）。本研究虽然表明受铁离子照射细胞的子代细胞与相应对照比较增殖减慢，但其却表现出增加的非贴附性生长。细胞转化的一个重要标志是细胞的非贴附性生长，因此细胞非贴附性生长被认为是体外监控细胞恶性转化最准确和严格的方法，而检测细胞非贴附性生长的一个常用方法为软琼脂集落形成试验（50）。本研究利用该方法发现仅仅单次0.1Gy的铁离子照射就可使受照NL20的子代细胞的软琼脂集落形成率（以集落直径大于100μm为阳性标准）与相应对照相比显著增加，表明受照细胞的子代细胞的恶性转化率显著升高，它们在软琼脂中比未受照细胞的子代细胞更能保持持续的细胞增殖。ATM是一个PI3K样的蛋白激酶，在细胞的DNA损伤应急系统（DNAdamageresponse，DDR）中占据重要地位。电离辐射在细胞中产生DNA损伤后，其ATM激活，而后激活的ATM激活DDR下游标靶如p53、CHK2、KAP-1等，启动细胞周期阻滞从而进行DNA双链断裂修复（51-53）。ATM活性缺失（如AT细胞）会显著增加细胞对辐射的敏感性（54）。因此ATM抑制剂可用来增加肿瘤细胞对放疗的敏感性（55）。于是本研究还探索了抑制ATM是否会抑制辐射对细胞的长期效应。结果发现采用ATM特异性抑制剂Ku55933在照射前预处理细胞1小时，可以显著逆转受照细胞的子代细胞增殖减慢、周期微扰、胞内ROS水平升高和SOD1及SOD2表达下降的现象，但却对受照细胞的子代细胞软琼脂集落形成率的增加没有影响。理论上，抑制ATM有利于清除受损的细胞从而避免这些细胞的转化，然而结果却并非如此。可能的原因为：低剂量高能重离子辐射的致癌效应的重要贡献者包括旁效应细胞（56），而旁效应细胞中的DNA损伤谱与直接受照细胞不同从而导致Ku55933对旁效应细胞的影响与直接受照细胞不同，虽然Ku55933可增敏直接受照细胞，但可能对旁效应细胞无效，于是存活旁效应细胞的子代细胞可发生转化。这些结果提示细胞在受到低剂量铁离子照射后其直接的DNA损伤与其子代细胞的转化等之间并非简单的因果关系。33 第三部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第三部分受单次低剂量铁离子照射后发生转化的NL20子代细胞辐射敏感性改变在铁离子照射后第18及41代NL20细胞微核形成没有统计学差异，甚至在再次接受1GyX射线照射之后，对照组及铁离子照射组子代细胞微核的形成也没有明显差异。但是在18-22代NL20细胞软琼脂克隆形成，这两组之间差异具有统计学差异。在第41代NL20细胞中是否仍然存在这种转化的趋势呢？下一步，本研究继续探究铁离子照射后第41代细胞转化的情况以及将软琼脂克隆的单克隆细胞挑选出来继续传代培养，探索其辐射敏感性的变化。材料一、实验细胞人永生化支气管上皮细胞NL20（ATCC）二、实验器材和试剂1.台式高速冷冻离心机（美国Thermo公司）2.多功能酶标仪（Synergy2，美国BIO-TEK公司）3.高速离心机（Avanti-26XP，美国贝克曼公司）4.PVDF膜（美国Bio-Rad公司）5.SDS-PAGE电泳仪及转膜仪（美国Bio-Rad公司）6.电泳凝胶成像分析仪（GL2200Pro，美国Crestream公司）7.5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（中国碧云天生物技术研究所）8.Tween20（中国碧云天生物技术研究所）9.SDS（中国碧云天生物技术研究所）10.BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）（美国Bio-Rad公司）11.抗β-actin抗体（中国碧云天生物技术研究所）12.HRP标记山羊抗鼠IgG（中国碧云天生物技术研究所）13.HPR标记山羊抗兔IgG（中国碧云天生物技术研究所）14.原钒酸钠（PMSF）（美国Sigma-Aldrich公司）34 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第三部分15.Reprimo抗体（中国武汉博士德生物公司）16.Tris、Glycine（维森特生物技术有限公司）17.溴酚蓝（美国Amresco公司）18.β-巯基乙醇（美国Amresco公司）19.化学发光剂（ECL）（美国Bio-Rad公司）20.Tris、Glycine（维森特生物技术有限公司21.细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（中国碧云天生物技术研究所）22.其他材料见第一部分方法1.细胞辐照X射线采用美国RADSOURCERS2000X射线机进行照射，能量为160kVp，剂量率为1.16Gy/min。2.铁离子照射NL20后其子代细胞发生细胞转化详见第二部分3.微核形成实验详见第二部分4.流式细胞仪检测细胞周期分布（1）取对数生长期的NL20子代细胞接种于100mm的培养皿中。培养24h后照射X射线4Gy，照射前换新鲜培养液。对照组接种9×105个NL20子代细胞，照射组接种1.2×106个NL20子代细胞。（2）照射结束后24h，处理方法详见第二部分，样品采用用流式细胞仪（BDFACSVerse,USA）进行检测。（3）采用ModFitLT3.2Software分析细胞周期。5.WesternBlot检测细胞中Reprimo表达水平（1）收集NL20子代细胞，用预冷的PBS清洗两遍，加入适量细胞裂解液（0.1%35 第三部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应TtitonX-100、10mMTris（pH7.4）、150mMNaCl、5mMEDTA、1mMPMSF、0.1%蛋白酶抑制剂），在冰上裂解30min后，13000g，4℃离心10min，取上清。（2）用Bradford蛋白定量法测蛋白浓度。取适量蛋白溶液，加入相应体积的5×SDS-PAGE上样缓冲液，混合均匀，95℃变性5min。（3）用12%SDS-PAGE电泳分离蛋白，湿法稳流（30mA）转膜过夜。用TBST清洗4遍，3%BSA室温封闭1h。一抗（抗Reprimo兔多克隆抗体，博士德生物，中国；抗β-actin鼠单克隆抗体，碧云天，中国）室温孵育2h，TBST清洗4遍。二抗（抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)和抗辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)，碧云天，中国）室温孵育45min，TBST清洗4遍。（4）ECL（BioRad,USA）显影，多功能激光扫描成像系统（GEAmersham,USA）进行曝光成像。6.统计学方法_实验结果均来自至少3次的独立实验，以均数±平均差表示（x±s)，利用Origin8.0统计学软件进行两样本的t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。实验结果1.受铁离子照射NL20细胞的41代子代细胞的细胞转化之前工作发现尽管受铁离子照射NL20细胞的第18及41代子代细胞的微核形成没有统计学差异，但是受铁离子照射NL20细胞的第18-22代子代细胞的软琼脂集落形成与未受照细胞的同代子代细胞比较有显著升高。因此，本研究又采用软琼脂克隆形成实验评估了受铁离子照射NL20细胞的第41代细胞的细胞转化能力。图3.1显示了受铁离子照射NL20细胞的子代细胞以及未受照细胞的同代子代细胞在第41-45代时细胞软琼脂集落照片和集落数目定量。结果显示受铁离子照射NL20细胞的子代细胞的软琼脂集落形成与未受照细胞的同代子代细胞比较有显著升高。这与之前的结果一致。36 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第三部分**4.03.53.02.52.01.51.0Th0.5ecolo0.0nyCTRFeformingeffic图3.1受0.1Giny铁离子照射NL20细胞的第41-45代子代细胞的软琼脂集落形成cy(%照片和形成率。*代表两组间比较，P值＜0.05，存在统计学差异。)2.受铁离子照射NL20细胞的子代细胞克隆再次受X射线照射后的微核形成率将受铁离子照射NL20细胞的第41-45代子代细胞及未受照细胞的同代子代细胞形成的软琼脂克隆挑选出单克隆并继续传代培养3-5代，其中从受铁离子照射NL20细胞的第41-45代子代细胞形成的软琼脂克隆中挑选出2个克隆并继续传代培养3-5代（这两组细胞分别命名为B组和C组）。从未受照组细胞的同代子代细胞形成的软琼脂克隆中挑选出一个克隆并继续传代培养3-5代（命名为CTR）。由图3.2可看出，在未照射的情况下，B组和C组的微核形成率与CTR相比有轻微37 第三部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应升高，但是差异并没有统计学意义。在照射1GyX射线后发现，B组、C组的微核形成率明显高于CTR的微核形成率，并且差异具有统计学意义。**0Gy25**1Gy*20*15105Pe0rceCTRFe-BFe-Cntageofce图3.2受0.1Gylls铁离子照射NL20细胞的第41-45代子代细胞的软琼脂集落的子with代细胞与对照组在nu1GyX射线照射后48h微核形成的变化。*代表两组间比较，cleuP值＜0.05，存在sw统计学差异。**代表两组间比较，P值＜0.01，存在统计学差异。ithM3.受铁离子照N(%射NL20细胞的子代细胞克隆再次受X射线照射后的周期分布)将挑选出来的克隆细胞扩增到第3-5代后再给予X射线照射，采用流式细胞仪检测这三组细胞的周期分布情况。由图3.3可看出，在未照射的情况下，B组、C组的周期分布与CTR相比差异没有统计学意义。B组与C组比较，这两组之间周期分布也没有统计学意义。B组与C组细胞受4GyX射线照射后，两组细胞周期分布的差异也没有统计学意义。但是与同样受4GyX射线照射的CTR相比，B组与C组细胞的周期分布与CTR有很大的差异。B组与CTR相比产生更多的G2/M期阻滞（P=0.00137），处于G1期细胞减少（P=0.00695），差异均具有统计学意义。此外，C组与CTR相比也产生更多的G2/M期阻滞（P=0.01118），处于G1期的细胞减少（P=0.0155），差异也都具有统计学意义。38 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第三部分G1S100G2/M15.2%9022.3%***8049%51.3%42.4%17.9%43.3%7019.5%605034%4021.9%34.7%32.3%66.9%3058.2%C20ell26.8%***cy1018.7%23.6%22%cled0istrCTRCTR-XFe(B)Fe(B)-XFe(C)Fe(C)-Xibution(%)图3.3受0.1Gy铁离子照射NL20细胞的第41-45代子代细胞的软琼脂集落的子代细胞与对照组在4GyX射线照射后24h其周期分布的变化。*代表与受X射线照射后的对照组相比，P值＜0.05，存在统计学差异。**代表与受X射线照射后的对照组相比，P值＜0.01，存在统计学差异。39 第三部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应4.受铁离子照射NL20细胞的子代细胞克隆细胞中Reprimo的表达水平将挑选出来的克隆细胞扩增到3-5代后，采用WesternBlot检测这三组细胞的Reprimo的表达情况，由图3.4可看出，B组、C组与CTR相比，Reprimo的表达均降低。图3.4受0.1Gy铁离子照射NL20细胞的第41-45代子代细胞的软琼脂集落的子代细胞与对照组相比Reprimo表达的变化。讨论随着航天事业的不断发展，宇航员逗留太空的时间不断延长，接触到空间辐射的风险增大。据估计，在“和平”号空间站，航天员的每个淋巴细胞12天受到一个质子的轰击，4个月受到一个氦离子的轰击，24年或200年遭遇到一个氧离子或铁离子的轰击（57）。在飞往火星的途中，航天员所受质子辐照大约是250µGy/天（相当于每天每个细胞核受到0.4个质子的轰击）、α粒子35µGy/天和重离子3µGy/天（58）。因此，对宇航员的航空风险的评估是一件很重要的事情。近年来对高LET重离子生物效应的研究有新的发现,高LET辐射击中一次就可能诱发严重的DNA损伤和细胞学后果，有发生恶性转化的可能性（59-61）。之前工作表明0.1Gy铁离子照射NL20细胞的第18-22代细胞发生增殖速度和细胞周期的改变、细胞内ROS以及抗氧化系统的改变以及子代细胞发生细胞转化，从而为评估宇航员航空航天风险提供一定的参考。在第二部分微核实验中发现NL20细胞18及41代子代细胞的微核形成并没有明显差异。然而在第18代细胞发现受铁离子照射后的子代细胞出现转化。那么铁离子照射所引起的转化是否只是影响18-22代的细胞呢？接下来，本研究在第41代子代细胞也进行了软琼脂克40 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第三部分隆形成实验，发现受铁离子照射后的细胞软琼脂形成依然比未照射细胞的同代子代细胞多。并且差异具有统计学意义。说明低剂量铁离子照射的确能在支气管上皮细胞NL20中引起长期的生物学效应。这种转变有可能是癌变发展过程中的启动阶段。除此之外，经铁离子照射的NL20细胞其子代中具有非粘附性生长能力的细胞的放射敏感性也发生了改变。放射敏感性是指在照射条件一致的情况下，机体器官、组织和细胞对辐射反应的强弱和快慢的差异。本研究进一步探讨从软琼脂克隆挑选出单克隆，并将细胞扩增，在3-5代检测经1GyX射线照射后其微核形成差异，经4GyX射线照射后其周期分布的差异。发现受铁离子照射后发生转化的子代细胞（即软琼脂克隆的第3-5代细胞），在接受1GyX射线照射后48h微核形成率明显高于对应对照组挑选出来的克隆细胞的第3-5代细胞，提示这些细胞对辐射更敏感。在照射4GyX射线后24h，其产生G2/M期阻滞也比对应对照组挑选出来的克隆细胞的第3-5代细胞多，G1期分布比对应对照组挑选出来的克隆细胞的第3-5代细胞少。很多研究证明，癌症的发生与抑癌基因失活以及原癌基因启动密切相关。Reprimo作为抑癌基因P53下游靶点，其在肺癌的发生发展中的作用一直鲜有报道。关于Reprimo的研究大多数都是关于胃癌的。由于甲基化导致低表达被认为可作为临床诊断胃癌的一个辅助指标（62）。但是其在肺癌中的研究极少。采用WesternBlot检测发生转化细胞中Reprimo的表达情况，结果发现受铁离子照射后发生转化的子代细胞（即软琼脂克隆的第3-5代细胞）与对应对照组挑选出来的克隆细胞的第3-5代细胞相比，Reprimo的表达明显降低；另一方面，转化细胞的辐射敏感性增加，提示Reprimo可能与辐射敏感性有关。本研究将在肺癌细胞中进一步探究Reprimo与辐射敏感性的关系。41 第四部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第四部分Reprimo对H460细胞辐射敏感性的影响Repriom基因位于人类染色体2q23，由109个氨基酸组成，是一种定位在细胞质中的糖基化蛋白。作为p53基因的下游靶基因，其mRNA表达可被p53基因诱导，使细胞周期停滞在G2期，从而导致细胞增殖减缓。Reprimo基因可能是通过抑制Cdc2活性以及Cdc2/cyclinB1复合物核转位的途径来发挥作用的。Reprimo启动子异常甲基化可抑制转录，引起G2/M检查点调控发生紊乱，导致细胞异常增殖（63，64）。目前研究发现，很多种癌细胞例如胃癌、脑垂体瘤等中Reprimo蛋白表达是降低的（65）。关于Reprimo蛋白的研究多见于胃癌，Reprimo的启动子甲基化频率在胃癌中占到了79%。并且研究还发现胃癌处于侵袭阶段，Reprimo的表达是降低的，提示胃癌的侵袭可能与Reprimo有关（66-68）。至今有关Reprimo的研究结果表明Reprimo在很多癌症如胃癌、乳腺癌、肺癌等的发生发展中很有可能发挥重要的作用。目前关于Reprimo的研究多在前两种癌症中开展，关于肺癌的研究比较有限。本论文之前工作发现受铁离子照射后发生转化的NL20子代细胞的Reprimo的表达降低，并且其辐射敏感性增加。结合文献和本论文的结果，提示Reprimo除了与肿瘤的发生发展有关外，还可能与细胞的放射敏感性相关。目前关于Reprimo的作用尚有很多未知，尤其是关于Reprimo在辐射敏感性中的作用到目前还未见报道。为此，本研究选取易于进行细胞转染的人非小细胞肺癌细胞H460为对象，通过在H460中过表达Reprimo，进一步探究Reprimo在辐射敏感性中的作用，以利于对Reprimo蛋白在辐射敏感性中的作用进行更深入的研究。本部分PCR实验由本实验室张雅瑞同学完成。材料一、实验细胞1.人非小细胞肺癌细胞H460（中国科学院上海生命科学研究院细胞库）二、实验器材和试剂1.细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（中国碧云天生物技术研究所）42 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第四部分2.一步法感受态细菌制备试剂盒（中国碧云天生物技术研究所）3.质粒中量提取试剂盒（中国碧云天生物技术研究所）4.PCR8连管（无锡国盛生物工程有限公司）5.DEPC（中国碧云天生物科技有限公司）6.手持式自动细胞计数器（美国Millipore公司)7.Reprimo质粒及空载对照（北京义翘神州生物技术有限公司））8.潮霉素B（上海前尘生物科技有限公司）9.亚甲基蓝（中国碧云天生物技术研究所）10.7500实时荧光定量PCR仪（美国ABAppliedBiosystems公司）11.分光光度计（NanoDrop2000c，美国Thermo公司）12.梯度PCR仪（TprofessionalThermocycler，德国biometra公司）13.HumanRPRMGeneORFcDNAcloneexpressionplasmid，N-HAtag(北京义翘神州生物技术有限公司）14.pCMV3-N-HANegativeControlVector(N-terminalHA-tagged)(北京义翘神州生物技术有限公司）15.PromegaGoScriptTMReverseTranscription-SystemA5000（美国Promega公司）16.TaKaRaSYBR®PremixExTaqTMII（TliRNaseHPlus）（日本Takara公司）17.TRIzol（美国Thermo公司）18.其他器材和试剂见第一部分方法1.质粒转化、扩增和提取1.1感受态细菌的制备（1）涂平板：把DH5α甘油菌涂LB平板，培养过夜。（2）接种：取一有新鲜培养的菌种的LB平板，后续操作均在超净台内进行。用一次性无菌接种环挑取一个单克隆，然后把蘸有菌种的接种环放到装3mlLB的细菌培养试管内。43 第四部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应（3）培养：37℃，200rpm摇菌床中培养过夜，16h。（4）再接种培养：根据需要制备的感受态细菌的量，按照1:100的比例用新鲜培养的过夜菌种接种培养。（5）制备感受态细菌：在培养细菌的OD600达到0.3-0.5时，取50ml，在4℃，2000g条件下离心5min收集细菌。用5ml预冷的LB重悬浮起细菌沉淀，加入5ml在冰浴或冰水浴上融解的感受态制备试剂，混匀，冰浴放置5min。1.2质粒的转化（1）将装有空载质粒和pCMV-Reprimo的管子用微型离心机简单离心30s；（2）轻轻打开盖子，每管中加入100µl双蒸水，轻轻混匀，室温下放置10min；（3）所得质粒浓度为0.1mg/ml；（4）加入不少于50ng质粒到50或100µl感受态细菌中。质粒的量可以是1µg或更多，但体积不宜超过感受态细菌量的10%。（5）轻轻用手指弹动离心管，以混匀细菌和质粒，冰浴或冰水浴放置10min。（6）取10µl菌液直接涂布到含有适当抗生素的LB平板上，37℃培养过夜。方法同前，挑取单克隆扩增培养。1.3质粒中量提取（1）取过夜菌至3个1.5ml离心管中，5000g离心1min收集细菌沉淀，弃上清。并再重复一次，每管共收集3ml过夜菌沉淀。（2）每管加入250µl溶液1，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。（3）每管加入250µl溶液2，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明。（4）每管加入350µl溶液3，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。（5）最高速（13000rpm左右）室温离心10min。（6）将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30-60s，倒弃手机管内液体。再重复两次，使3管质粒结合于同一纯化柱上。（7）在质粒纯化柱内加入750µl溶液4，最高速离心30-60s，洗去杂质，倒弃收集管内液体。44 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第四部分（8）最高速再离心1min，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。（9）将质粒纯化柱置于1.5ml离心管上，加入120µl溶液5至管内柱面上，放置1min。（10）最高速离心1min，所得液体中加入600µl溶液6，混匀后加到原质粒纯化柱内。（11）最高速离心30-60s，倒弃收集管内液体。（12）在质粒纯化柱内加入750µl溶液4，最高速离心30-60s，洗去杂质，倒弃收集管内液体。（13）最高速离心1min，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。（14）将质粒纯化柱置于1.5ml离心管上，加入120µl溶液5至管内柱面上，放置1min。（15）最高速离心1min，所得液体即为转细胞级超纯质粒，最后所得质粒浓度检测Reprimo为342.6ng/µl，NC为280ng/µl。2.细胞稳定转染（1）取3×105个H460细胞接种于6孔板中，培养24h后使细胞长至70-90%汇合；（2）转染前用无血清的RPMI1640培养液洗涤细胞两次，6孔板中每孔加入2ml不含血清且不含抗生素的RPMI1640培养液；（3）将检测完浓度的Reprimo质粒以及Reprimo空载对照，按1：5的比例用无血清且不含抗生素的RPMI1640培养液稀释，将Lipofectamine®2000按3:50的比例用无血清且不含抗生素的RPMI1640培养液稀释；（4）取适量Lipofectamine®2000稀释液和质粒稀释液以1：1混合，室温孵育10min；（5）在6孔板中每孔加入50μl上述复合液，来回轻轻摇晃混匀，静置于37℃，5%CO2培养箱中培养，6h后更换含血清的新鲜培养液继续培养；第二天后更换为含有0.2mg/ml的潮霉素B的RPMI1640培养液，每天更换培养液继续培养，直至长出克隆，然后挑选出单克隆再进行扩增培养，筛选出来的单克隆细胞使用0.1mg/ml的潮霉素B维持培养。Real-timePCR检测转染细胞Reprimo的表达，鉴定细胞是否稳定表达Reprimo。45 第四部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应3.转染质粒的H460细胞总RNA的提取（1）取6×105个对数生长期的H460转染细胞接种于60mm的培养皿中，培养24h后，细胞汇合程度达到70%左右，弃去培养液，冰PBS洗2遍，加入1mlTRIzol至细胞沉淀，然后重悬细胞。（2）加入200μl酚氯仿，剧烈震荡15s，静置3分钟。然后4℃、10000g离心15分钟，把上清转移至新的离心管中；（3）加入500μl异丙醇，-20℃静置2小时。10000g离心10分钟，弃上清；（4）加入1ml75%乙醇洗涤沉淀一次。10000g离心5分钟，弃上清；（5）干燥5-10分钟，加入适量DEPC水溶解RNA沉淀，使用分光光度计NanoDrop测RNA浓度，-80℃保存。4.cDNA的合成4.1cDNA合成第一步：RNA1μgOligodTprimer1μlNuclear-freewater3μl充分混匀后，70℃5min然后置于冰上5min，在上述反应液中加入：cDNA合成第二步：配制RT（reversetranscription）mastermixdNTP1μlPromegaGoScriptTMReverseTranscriptasel1μl5×ReverseTranscriptionBuffer4μlRNaseInhibitor0.5μlMgCl24μlNuclear-freewater4.5μl4.2PCR仪合成cDNA反应条件：25℃，5min；42℃，60min；70℃，15min5.Real-timePCR检测旁效应细胞Reprimo的表达以反转录产物cDNA为模板，根据以下反应体系加样，利用qtPCR仪检测Reprimo的相对表达水平，以RNU6B作为内参。采用2-ΔΔct法分析数值。46 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第四部分primer0.8μlcDNA1μlDyell0.2μlTakaraSYBRPremixExTaqTMΠ5μlH2O4μl6.微核形成实验（1）取对数生长期的转染H460细胞接种于放有无菌圆形盖玻片的六孔板中，每孔接种80000个细胞，24h后照射X射线，照射剂量为1Gy，照射前换新鲜培养液。48h后，弃去培养液，用PBS快速清洗细胞2次，甲醇:乙酸（v:v)=3:1固定10min，让细胞风干；（2）用PBS使细胞水化后，再用DAPI（5µg/ml）染色5min，PBS清洗2次，每次5min后用抗荧光淬灭剂封片；将载玻片置于荧光显微镜下进行细胞观察、计数。含微核的细胞为阳性细胞，计数至少1000个细胞中阳性细胞的个数。7.克隆形成实验（1）取对数生长期的细胞制成单细胞悬液接种于60mm的培养皿中，每组设3个平行样；（2）24h后，照射X射线，剂量分别为1、2、3和4Gy，继续培养13d之后，弃培养液，用PBS快速洗3遍，甲醇固定15min、亚甲基蓝染色30min，用清水将培养皿洗净晾干；（3）于显微镜下计数含50个细胞以上的细胞集落。克隆形成率和细胞克隆存活率按如下公式计算：克隆形成率（%）=（克隆数/接种细胞数）×100%；细胞克隆存活率=处理组克隆形成率/对照组克隆形成率。8.流式细胞仪检测细胞周期（1）取对数生长期的H460细胞接种于100mm的培养皿中。培养24h后照射X射线4Gy，照射前换新鲜培养液；（2）6、24、48和72h后，分别收集细胞后固定于70％的乙醇中，并储存于-20℃（至少长于12h）备用；47 第四部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应（3）离心细胞悬浮液并用PBS洗两次，再悬浮于含RNA酶的500µl碘化丙啶中，37℃避光温浴30分钟，用流式细胞仪（BDFACSVerse,USA）进行检测；（4）采用ModFitLT3.2Software分析细胞周期。9.统计学方法_实验结果均来自至少3次的独立实验，以均数±平均差表示（x±s)，利用Origin8.0统计学软件进行两样本的t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。结果1.H460细胞过表达Reprimo后的RT-PCR验证为检测稳定转染negativecontrolvector及Reprimovector在H460细胞中转染是否成功，采用Real-timePCR检测稳转细胞中Reprimo的mRNA的表达水平。图4.1所示，相对于negativecontrolvector转染的H460细胞，Reprimovector转染的H460细胞ReprimomRNA水平明显升高，说明稳定转染negativecontrolvector及Reprimovector在H460细胞中转染成功。图4.1NC(negativecontrol)、RPRM(Reprimo)转染的H460细胞其Reprimo的表达水平。RPRM与NC对照组相比p<0.0001，存在统计学差异。48 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第四部分2.过表达Reprimo的H460细胞受照后的微核形成率如图4.2所示，检测过表达RPRM对H460细胞受1GyX射线照射后细胞微核形成率的影响。在未照射的情况下，过表达RPRM的H460细胞的微核形成率就比转染空质粒的对照组多，并且差异具有统计学意义。在照射1GyX射线之后48h，过表达Reprimo的H460细胞微核形成率明显高于转染空质粒的对照组，并且差异具有统计学意义。11*109876543*N2umb1ero0fMNCRPRMNC-XRPRM-XNper100n图4.2NC(negatiucvecontrol)、RPRM(Reprimo)转染的H460细胞受1GyX射线lei照射后48h的微核形成率。*代表两组间比较，P值＜0.05，存在统计学差异。3.过表达Reprimo的H460细胞受照后的存活分数在照射相同剂量的X射线之后，过表达RPRM的H460细胞的克隆形成率降低（图4.3），在10%的克隆率下，剂量增敏比（DER）按以下公式计算：为获得10%的克隆形成率所需单纯照射的剂量/过表达RPRM的细胞为获得10%的克隆形成率所需的辐射剂量。计算出H460的DER为1.571。说明过表达RPRM可使H460细胞的辐射敏感性增强。RPRM基因能影响H460细胞的辐射敏感性。49 第四部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应NC1RPRMExp3P2FitofNCExp3P2FitofRPRM0.1su0.01rrivalfraction012345X-raydose(Gy)图4.3NC(negativecontrol)、RPRM(Reprimo)转染的H460细胞接受X射线照射后的细胞存活分数。4.过表达Reprimo的H460细胞受照后的细胞周期分布如图4.4所示，检测过表达RPRM对H460细胞受4GyX射线照射6h后细胞周期分布的影响。在未照射的情况下，过表达RPRM的H460细胞的周期分布与转染空质粒组相比差异没有统计学意义。在4GyX射线照射6h后，过表达RPRM的H460细胞比转染空质粒组产生更多的G2/M期阻滞，同时分布于G1期的细胞减少，分布于S期的细胞增多，这些差异都具有统计学意义。图4.5所示，检测过表达RPRM对H460细胞受4GyX射线照射24h后细胞周期分布的影响。在未照射的情况下，过表达RPRM的H460细胞的周期分布与转染空质粒组相比差异没有统计学意义。在4GyX射线照射24h后，过表达RPRM的H460细胞比转染空质粒组产生更多的G2/M期阻滞，差异具有统计学意义。细胞G1及S期分布的差异没有统计学意义。图4.6、4.7所示，检测过表达RPRM对H460细胞受4GyX射线照射48h及72h后细胞周期分布的影响。在未照射的情况下，过表达RPRM的H460细胞的周期分布与转染空质粒组相比差异均没有统计学意义。在4GyX射线照射48h及72h后，过表达RPRM的H460细胞比转染空质粒组有产生更多的G2/M期阻滞的趋势，但是差异并没有统计学意义。细胞G1及S期分布的差异也没有统计学意义。50 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第四部分G1S100G2/M32.128037.78*51.854.316037.25*4041.9734.137.3420d30.63is20.25*trib11.5910.86uti0onNCRPRMNC-XRPRM-Xofdiffere图4.4NC(negatnivecontrol)、RPRM(Reprimo)转染的H460细胞接受4GyX射tcyc线照射后6h其周le期分布的变化情况。*代表与受照射后的NC组比较，P值＜0.05，s(%)存在统计学差异。G1S100G2/M8053.6252.5459.855.33604011.5412.7534.8938.420d33.13is27.47tr*ib9.0611.49uti0onNCRPRMNC-XRPRM-Xofdiffere图4.5NC(negatnivecontrol)、RPRM(Reprimo)转染的H460细胞受4GyX射线tcyc照射24h后周期le分布的变化情况。*代表与受照射后的NC组比较，P值＜0.05，s(%)存在统计学差异。51 第四部分低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应G1S100G2/M8055.0460.1961.2162.360409.9211.5835.5229.6120dis28.87tr26.12ibu9.4410.2ti0onNCRPRMNC-XRPRM-Xofdiffere图4.6NC(negatnivecontrol)、RPRM(Reprimo)转染的H460细胞接受4GyX射tcycle线照射后48h其周期分布的变化情况。s(%)G1100SG2/M8061.5360.436069.564.84011.9211.772028.8122.94dis27.65tr23.43ibu9.667.56ti0onNCRPRMNC-XRPRM-Xofdiffere图4.7NC(negatnivecontrol)、RPRM(Reprimo)转染的H460细胞接受4GyX射tcycle线照射后72h其周期分布的变化情况。s(%)讨论之前工作发现Reprimo在受铁离子照射的NL20细胞发生转化的子代细胞（即软琼脂克隆的第3-5代细胞）的表达是降低的，并且发生转化的子代细胞出现辐射敏感性的增加，猜测Reprimo可能与放射敏感性相关。接下来，在非小细胞肺癌52 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应第四部分细胞H460中稳定转染Reprimo质粒及空载质粒，进一步探讨过表达Reprimo对H460细胞辐射敏感性的影响。在照射1GyX射线之后，过表达Reprimo的H460细胞微核形成率明显高于转染空质粒的对照组。在稳定转染的细胞接受X射线照射后测定两组细胞的克隆形成能力，发现过表达Reprimo的H460细胞克隆形成能力与转染空质粒的对照组相比降低。同时，再检测过表达Reprimo的H460细胞在接受4GyX射线照射后细胞的周期分布，结果显示，在4GyX射线照射6h及24h后，过表达RPRM的H460细胞比转染空质粒对照组产生更多的G2/M期阻滞。在4GyX射线照射48h及72h后，过表达RPRM的H460细胞虽然有比转染空质粒对照组产生更多的G2/M期阻滞的趋势，但是差异没有统计学意义。这些结果表明在H460细胞中过表达Reprimo会增加H460细胞的辐射敏感性，这与之前在NL20细胞中发现低表达Reprimo蛋白会增加NL20细胞的辐射敏感性相反，提示Reprimo蛋白对癌细胞与转化细胞辐射敏感性的影响可能是不一样的，但具体机制不明，有待进一步研究。这些初步成果为后续实验奠定了良好的基础。53 结论低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应结论1.α粒子、X射线照射条件下，采用单次照射及分次照射的方法，以53BP1foci为DNA损伤生物学指标，观察到α粒子导致的DNA损伤比X射线导致的损伤更难以修复。在α粒子、X射线照射前使用ATM抑制剂Ku55933预处理之后抑制了DNA损伤的修复。2.为了研究在高LET下，低剂量的铁离子辐射人支气管上皮细胞后是否能产生长期的生物学效应，本研究在中国科学院近代物理研究所重离子加速器深层治癌终端，用0.1Gy铁离子照射NL20细胞，照射后NL20细胞继续培养并传代到18-20代，检测各项生物学指标发现受铁离子照射的NL20细胞的子代细胞发生细胞增殖减慢、细胞周期出现微扰、细胞内ROS水平升高及SOD1、SOD2表达降低，并且细胞转化能力升高。说明单次低剂量的铁离子照射就能产生长期的生物学效应，为宇航员工作的健康风险的评估提供了实验依据。3.用铁离子照射的NL20细胞的第41代子代细胞检测细胞的转化能力，发现在铁离子照射NL20细胞的第41代子代细胞的转化能力仍然高于未照射组的同代子代细胞。并且发现在挑选出的软琼脂单克隆再扩增的细胞中，受铁离子照射后发生转化的子代细胞（即软琼脂克隆的第3-5代细胞）与对应未照射组挑选出来的克隆细胞的第3-5代细胞相比辐射敏感性增加。进一步研究发现抑癌基因Reprimo在受铁离子照射后发生转化的子代细胞中表达降低。4.在人非小细胞肺癌细胞H460构建了过表达Reprimo及转染空载质粒的细胞株，检测发现过表达Reprimo的H460细胞辐射敏感性增加。说明Reprimo作为一个抑癌基因，在肺癌细胞辐射敏感性中发挥了很重要的作用。54 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应参考文献参考文献1.MehtaP,BhayaniD.Impactofspaceenvironmentonstabilityofmedicines:Challengesandprospects.JPharmBiomedAnal,2017,136:111-119.2.NASA.NASAJohnsonSpaceCenterSpaceRadiationAnalysisGroup.Aboutspaceradiation:Whatisspaceradiation?WashingtonDC,2008.3.AbbasiJ.DoApolloastronautdeathsshinealightondeepspaceradiationandcardiovasculardisease?Publishedinfinaleditedformas:JAMA,2016,316(23):2469-2470.4.KononikhinAS,StarodubtsevaNL,PastushkovaLK,Kashirina,etal.Spaceflightinducedchangesinthehumanproteome.ExpertRevProteomics,2017,14(1):15-29.5.KokhanVS,MatveevaMI,MukhametovA,ShtembergAS.Riskofdefeatsinthecentralnervoussystemduringdeepspacemissions.NeurosciBiobehavRev,2016,71:621-632.6.MasahiroTerada,MasayaSeki,RikaTakahashi,ShinYamada,etal.EffectsofaclosedspaceenvironmentongeneexpressioninhairfolliclesofastronautsintheInternationalSpaceStation.PLoSOne,2016,11(5):e0156190.7.HirokoP.Indo,HideyukiJ.Majima,etal.Changesinmitochondrialhomeostasisandredoxstatusinastronautsfollowinglongstaysinspace.SciRep,2016,6:39015.8.DelpMD,CharvatJM,LimoliCL,GlobusRK,GhoshP.ApolloLunarastronautsshowhighercardiovasculardiseasemortality:possibledeepspaceradiationeffectsonthevascularendothelium.SciRep,2016,6:29901.9.FrancisA.Cucinotta,Myung-HeeY.Kim,etal.HowsafeIssafeenough?RadiationriskforahumanmissiontoMars.PLoSOne,2013,8(10):e74988.10.TangFR,LokeWK,etal.Lowdoseorlow-dose-rateionizingradiation-inducedbioeffectsinanimalmodels.JRadiatRes,2017,58(2):165-18211.HadaM,SutherlandBM.SpectrumofcomplexDNAdamagedependsontheincidentradiation.RadiatRes,2006,165:223-230.12.NikjooH,UeharaS,WilsonWE,etal.Trackstructureinradiationbiology:55 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低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应综述综述低剂量高LET电离辐射的生物学效应机制研究进展曹倩琳杨红英[摘要]对于宇航员而言，空间辐射是无法回避的潜在危险。空间辐射具有剂量小、剂量率低的特点，其中的高能粒子对宇航员的健康威胁最大。明确空间高能粒子的辐射生物学效应与机理，有助于准确评估空间环境对航天员健康的影响及开发相应的对策，对于我国载人航天事业的进一步发展至关重要。低剂量高LET电离辐射（LowDoseirradiation,LDR）是指照射剂量小于0.5Gy，剂量率在0.05Gy/min以内的高LET照射。放射线引起的生物效应除早期反应外，还包括长期性、持久性、潜在性和进行性作用。DNA是引起一系列放射生物学效应的关键靶分子，对于电离辐射导致DNA损伤的研究长期在放射生物学领域中占有主导地位。低剂量高LET电离辐射导致的DNA损伤比低剂量低LET电离辐射导致的DNA损伤更为复杂，修复更为困难，因此引起细胞致死、致突变等的概率增加。此外，受到低剂量高LET电离辐射后还会表现出电离辐射的非靶效应。非靶效应指电离辐射直接作用靶细胞导致损伤的过程中，未受照射的一些细胞（非靶）也会发生与受照靶细胞类似的生物学效应，DNA序列的改变并不完全能解释这些现象的发生。ROS在低剂量高LET电离辐射造成损伤的过程中也发挥了重要作用，ROS存在的条件下会促进DNA损伤以及非靶效应的产生。低剂量高LET电离辐射产生生物学的具体机制尚不明确。本文介绍低剂量高LET电离辐射的生物学效应，综述其可能机制，着重于介绍DNA损伤、表观遗传学调控、ROS在高LET低剂量电离辐射生物学效应中的贡献。[关键词]电离辐射；高LET；低剂量；生物学效应1.低剂量高LET电离辐射的生物学效应概念及研究低剂量高LET电离辐射的生物学效应是指低剂量的高LET电离辐射作用于机体、组织或细胞后，其沉积的能量导致机体、组织或细胞出现一系列的生物学变化。自1895年伦琴发现X射线，不久人们意识到射线的利用在推动人类社会发展61 综述低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应的同时，也对人类的健康造成了影响。对于深空探索的重要阻碍之一就是空间辐射对宇航员健康安全造成的潜在性危害。其中空间辐射中低水平的高能粒子照射被认为是对宇航员健康的最大威胁（1）。目前对于在太空中开展大规模关于空间辐射的生物学效应研究非常困难。因此模拟空间辐射，建立评估低剂量高LET电离辐射风险的生物模型，对于研究低剂量高LET电离辐射的生物学意义重大（2）。有文献报道，在小鼠身上照射低剂量的铁离子后能引起小鼠多个组织的DNA甲基化增加（3）。暴露于低剂量的铁离子照射会导致小鼠患急性髓系白血病（AML）的机率增加（4）。相对于低LET照射，高LET照射导致细胞产生的生物学效应程度更大，比如产生更多的G2/M期阻滞以及DNA双链断裂损伤（5）。TdTomato蛋白的表达作为细胞毒性以及增殖的标志被用于评估空间辐射的风险（6）。WangJ等人建立具有低自发产生肿瘤的野生型小鼠，探究在模拟空间辐射的条件下小鼠致肺癌的风险（7）。低剂量高LET电离辐射能引起长期的生物学效应，仅使用0.5Gy的48Ti（1GeV/n）照射雌性的Wistar大鼠，在3个月后检测这些大鼠发现它们出现了认知功能的障碍（8）。另外还发现低剂量的铁离子照射能引起小鼠骨髓系统造血组细胞以及干细胞的长期改变（9）。在小鼠身上照射0.5Gy的铁离子四周后观察小鼠的肺发现细胞因子Il13表达增加，DNA甲基化转移酶Dnmt1减少，逆转录转座子LINE-1和SINEB1的再活化，这些因子的改变将影响小鼠的细胞增殖、基因表达改变等生物学变化（10）。因此对于在太空执行任务的宇航员来说，空间辐射对宇航员的健康影响是不容忽视的。2.低剂量高LET电离辐射的生物学效应的可能机制2.1DNA损伤的影响在低剂量高LET电离辐射产生的生物学效应的机制当中，早期产生的DNA损伤可能占有重要的地位（11）。与低LET的X射线相比，高LET电离辐射在穿过细胞时，会在较窄的径向范围内沉积较大的能量，产生更多、更复杂的DNA团簇损伤（12，13）。细胞对于这种复杂的DNA损伤修复起来更加困难，且修复需要更长的时间（14）。低剂量高LET电离辐射导致的DNA损伤多采用容易造成错误修复的非同源性末端链接修复（15）。DNA损伤的错误修复是细胞基因突变和染色体畸变的重要原因。已有体外实验表明，高、低LET电离辐射产生的染色体异常有非常大的差别。高LET电离辐射产生的染色体损伤的形式更为复杂，包括62 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应综述了染色体大片缺失和染色体之间的交联等（16）。Rithidech等（17）研究56Fe照射CBA/CaJ小鼠的生物效应结果表明，56Fe辐射产生的染色体损伤明显大于137Seγ辐射。其中，56Fe辐射产生的染色体交换是137Seγ辐射的1.6倍，异常细胞是137Seγ辐射的4.3倍，单体型和染色体型的断裂是137Seγ辐射的4.2倍。表明高LET电离辐射产生更强的生物学效应（18）。因此对于暴露于空间辐射的宇航员来说，高LET电离辐射（比如56Fe）是不容忽视的危险因素。DNA损伤导致的基因突变、染色体异常在受到低剂量高LET电离辐射后较长一段时间会成为一种潜在性的危害，并有可能导致肿瘤的发生（19）。2.2非靶效应及其产生的机制目前关于辐射产生的生物学效应当中，大多数照射剂量一般都大于1Gy，对于低剂量产生的生物学效应研究相对较少。DNA作为辐射作用的靶分子是电离辐射的理论基础。但是从20世纪80年代开始，文献报道并不是所有的辐射效应都是由DNA分子的直接靶效应引起的（20）。低剂量产生的生物学效应没有明显的剂量-效应关系，这可能是由于低剂量产生的生物学效应存在适应性反应、旁效应、基因组不稳定性、低剂量超敏反应等非靶效应（21）。表观遗传学调控可能参与了非靶效应的产生。作为非DNA序列改变的表观遗传学是指不涉及DNA序列改变的基因或蛋白表达的变化，并且这种变化可稳定的传递给其子代（22），表观遗传学调控主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA修饰等调控机制，这些均以其独特的方式调控着相关基因的表达。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基化转移酶（DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。DNA甲基化后核苷酸顺序未变，而基因表达受影响。有文献报道电离辐射可以影响DNA甲基化的模式（23）。在小鼠身上照射0.5Gy的铁离子就能引起小鼠心脏DNA的甲基化水平升高（24）。GoetzW等人的研究发现，在正常皮肤成纤维细胞AG01522以及结肠癌细胞RKO接受高LET的质子、铁离子以及低LET的X射线照射后，受照细胞正常传代到20代时，依然能检测到细胞DNA甲基化水平升高。但是高LET辐射后DNA甲基化与低LET的X射线相比有很大的区别，质子与铁离子照射导致的DNA甲基化比较趋于一致（25）。Kaupetal等人研究发现在细胞中的DNA甲基化对于电离辐射诱导旁效应的维持是很重要的，在用受照细胞的条件培养液培养人的角63 综述低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应质细胞后发现旁效应细胞中DNA甲基化的失调可以持续20代。同样条件下，这些细胞呈现出持续水平的染色体和染色单体畸变、再生细胞死亡、凋亡的增加及基因组不稳定性信号的增高（26）。染色体的基本单位是核小体。每个核小体的结构由一个八聚体的组蛋白（两分子的H2A-H2B二聚体，两分子的H3，两分子的H4）和缠绕其上1.75圈的长约146bp的碱基组成。各个核小体之间以40-60bp的DNA连接，组蛋白H1与之结合。八聚体的空间结构呈球状，组蛋白亚基的氨基端游离出来，称为氨基端尾巴（或组蛋白尾巴）。组蛋白修饰调控各种生命活动的机制被认为是其氨基端尾巴上的许多残基可以被共价修饰，并且不同位点上的不同修饰可产生特殊的信号，就像形成各种不同的密码，这些密码能被其他蛋白质识别，从而影响一系列相关蛋白质的活动，最终调控真核生物基因表达（27）。常见的修饰类型包括赖氨酸乙酰化/去乙酰化、赖氨酸和精氨酸甲基化/去甲基化、赖氨酸泛素化/去泛素化、丝氨酸和苏氨酸磷酸化/去磷酸化以及谷氨酸核糖基化等。这些修饰类型参与了调控正常的表观基因组，对维持正常的基因表达模式以及染色体的结构和功能有不可忽视的作用（28）。同时组蛋白修饰在辐射引起的旁效应中占有重要地位（29，30）。另外，组蛋白修饰也参与了电离辐射导致的DNA损伤的修复过程。在DNA损伤应答的过程中，需要染色体进行调整从而感知DNA损伤位点并启动DNA损伤修复。组蛋白修饰可能传达出信号，指导DNA损伤检测和修复过程中所涉及的蛋白质募集（31）。因此组蛋白修饰对维持电离辐射后基因组的稳定性具有重要的作用（32）。非编码RNA（non-codingRNA)是指不编码蛋白质的RNA。包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和microRNA等多种已知功能的RNA以及未知功能的RNA，它们都能从基因组上转录而来，但是不能翻译成蛋白，但可以在RNA水平上行使各自的生物学功能，包括参与细胞分化及调控过程。目前研究与辐射相关最多的是microRNA(miRNA)。microRNA可调控人类基因组中20～30%的编码基因。miRNA参与了体内外辐射所诱导的反应。研究发现，miRNA通过对特定的蛋白质表达进行调控，从而实现对旁效应的产生进行调控（33）。此外，低剂量电离辐射也能促进癌症的转变，非靶效应起了决定性的作用，miRNA可能参与了这个过程的调控（34）。64 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应综述2.3ROS在低剂量高LET电离辐射生物学效应中的贡献ROS是由氧化代谢产生的一些高活性的基团，主要包括H-2O2、O2等。高LET电离辐射能导致小鼠体内产生持续较高的ROS水平（35）。ROS在生物体内有广泛的生物学效应。Nagasawa和Little等人（36）提出ROS参与了辐射诱导旁效应现象的产生。从那以后，就有一系列的文章报道了氧化还原性代谢在辐射诱导旁效应现象中发挥作用。此外，ROS参与了低剂量电离辐射致子代基因组不稳定性的诱导过程（37）。EdouardI.Azzam等人发现电离辐射导致的活性氧可以通过旁效应来扩大氧化损伤反应，如果氧化损伤超出生物体所能承受的范围，所引起的生物学变化会持续下去，可能会传播到子代细胞（38）。3.展望目前关于低剂量高LET电离辐射的生物学效应具体机制的研究还非常有限，尽管有了一些初步的结果，但具体的相关机制有待于进一步的探讨。关于表观遗传调控低剂量高LET电离辐射非靶效应的机制引起了极大的关注，ROS在非靶效应中的作用已广为人知。DNA甲基化和组蛋白修饰的改变直接影响染色质的包装，进而影响基因表达和DNA重组的敏感性。miRNAs因其体积小和相对稳定性很可能作为信号分子或调控因子参与了低剂量高LET电离辐射产生的非靶效应。此外，关于IncRNA研究的深入，发现它可能在低剂量高LET电离辐射产生的非靶效应中也发挥着重要的作用。最后，对于低剂量高LET电离辐射的生物学效应机制的研究仍需继续。参考文献1.PlanteI,CucinottaFA.Energydepositionandrelativefrequencyofhitsofcylindricalnanovolumeinmediumirradiatedbyions:Montecarlosimulationoftracksstructure.RadiatEnvironBiophys,2010,49(1):5-13.2.EdwardsAA.RBEofradiationsinspaceandtheimplicationsforspacetravel.PhysMed.2001,1:147-152.3.LimaF,DingD,GoetzW,YangAJ,BaulchJE.HighLET(56)Feionirradiationinducestissue-specificchangesinDNAmethylationinthemouse.EnvironMolMutagen,2014,55(3):266-77.4.WeilMM,BedfordJS,Bielefeldt-OhmannH,RayFA,GenikPC,EhrhartEJ,et65 综述低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应al.Incidenceofacutemyeloidleukemiaandhepatocellularcarcinomainmiceirradiatedwith1GeV/nucleon(56)Feions.RadiatRes,2009,172:213-219.5.SahaJ,WilsonP,ThiebergerP,LowensteinD,WangM,CucinottaFA.Biologicalcharacterizationoflow-energydepositiononhumancells.RadiatRes,2014,182(3):282-291.6.ChishtiAA,HellwegCE,BergerT,Baumstark-KhanC,etal.ConstitutiveexpressionoftdTomatoproteinasacytotoxicityandproliferationmarkerforspaceradiationbiology.LifeSciSpaceRes(Amst),2015,4:35-45.7.WangJ,ZhangX,WangP,WangX,FarrisAB,WangY.Lessonslearnedusingdifferentmousemodelsduringspaceradiation-inducedlungtumorigenesisexperiments.LifeSciSpaceRes(Amst),2016,9:48-55.8.BrittenRA,JewellJS,DuncanVD,DavisLK,HadleyMM,WyrobekAJ.SpatialMemoryPerformanceofSociallyMatureWistarRatsisImpairedafterExposuretoLow(5cGy)Dosesof1GeV/n48TiParticles.RadiatRes,2017,187(1):60-65.9.MiousseIR,ShaoL,ChangJ,FengW,WangY,etal.Exposuretolow-dose(56)Fe-ionradiationinduceslong-termepigeneticalterationsinmousebonemarrowhematopoieticprogenitorandstemcells.RadiatRes,2014,182(1):92-101.10.NzabarushimanaE,PriorS,MiousseIR,PathakR,etal.Combinedexposuretoprotonsand(56)FeleadstooverexpressionofIl13andreactivationofrepetitiveelementsinthemouselung.LifeSciSpaceRes(Amst),2015,7:1-8.11.HadaM,SutherlandBM.SpectrumofcomplexDNAdamagesdependsontheincidentradiation.RadiatRes,2006,165:223-230.12.AyparU,MorganWF,BaulchJE.Radiation-inducedepigeneticalterationsafterlowandhighLETirradiations.MutatRes,2011,707:24-33.13.LoratY,TimmS,JakobB,Taucher-ScholzG,RübeCE.Clustereddouble-strandbreaksinheterochromatinperturbDNArepairafterhighlinearenergytransferirradiation.RadiotherOncol,2016,121(1):154-161.14.AntonelliF,CampaA,EspositoG,GiardulloP,etal.InductionandrepairofDNADSBasrevealedbyH2AXphosphorylationfociinhumanfibroblastsexposedtolow-andhigh-LETradiation:relationshipwithearlyanddelayedreproductivecelldeath.RadiatRes,2015,183(4):417-431.15.MooreS,StanleyFK,GoodarziAA.TherepairofenvironmentallyrelevantDNAdoublestrandbreakscausedbyhighlinearenergytransferirradiation-Nosimple66 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应综述task.DNARepair,2014,17:64-73.16.HadaM,CucinottaFA,GondaSR,WuH.mBANDanalysisofinhumanepithelialcellsexposedtolow-andhigh-LETradiation.RadiatRes,2007,168:98-105.17.RithidechKN,HonikelL,WhortonEB.mFISHanalysisofchromosomaldamageinbonemarrowcellscollectedfromCBA/CaJmicefollowingwholebodyexposuretoheavyions(56FeIons).RadiatEnvironBiophys,2007,46:137.18.LuT,ZhangY,WongM,FeivesonA,GazaR,etal.DetectionofDNAdamagebyspaceradiationinhumanfibroblastsflownontheInternationalSpaceStation.LifeSciSpaceRes(Amst),2017,12:24-31.19.DuranteM,SnigiryovaG,AkaevaE,BogomazovaA,DruzhininS,FedorenkoB,etal.Chromosomeaberrationdosimetryincosmonautsaftersingleormultiplespaceflights.CytogenetGenomeRes,2003,103:40-46.20.McBrideWH,ChiangCS,OlsonJL,etal.Asenseofdangerfromradiation.RadiatRes,2004,162(1):1-19.21.MothersillC,SeymourC.Implicationsforhumanandenvironmentalhealthoflowdosesofionisingradiation.JEnvironRadioact,2013,133:5-9.22.KovalchukO,BaulchJE.Epigeneticchangesandnontargetedradiationeffects--istherealink?EnvironMolMutagen,2008,49:16-25.23.MiousseIR,KutanziKR,KoturbashI.EffectsofionizingradiationonDNAmethylation:fromexperimentalbiologytoclinicalapplications.IntJRadiatBiol,2017,30:1-39.24.KoturbashI,MiousseIR,SridharanV,NzabarushimanaE,etal.Radiation-inducedchangesinDNAmethylationofrepetitiveelementsinthemouseheart.MutatRes,2016,787:43-53.25.GoetzW,MorganMN,BaulchJE.TheeffectofradiationqualityongenomicDNAmethylationprofilesinirradiatedhumancell.RadiatRes.2011,175(5):575-587.26.KaupS,GrandjeanV,MukherjeeR,KapoorA,KeyesE,etal.Radiation-inducedgenomicinstabilityisassociatedwithDNAmethylationchangesinculturedhumankeratinocytes.MutatRes,2006,597:87-97.27.LiangD,BurkhartSL,SinghRK,KabbajMM,GunjanA.HistonedosageregulatesDNAdamagesensitivityinacheckpoint-independentmannerbythehomologousrecombinationpathway.NucleicAcidsRes,2012,40(19):9604-9620.28.JenuweinT,AllisCD.Translatingthehistonecode.Science,2001,293:67 综述低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应1074-1080.29.Burdak-RothkammS,ShortSC,FolkardM,RothkammK,PriseKM.ATR-dependentradiation-inducedgammaH2AXfociinbystanderprimaryhumanastrocytesandgliomacells.Oncogene,2007,26:993-1002.30.SmilenovLB,HallEJ,BonnerWM,SedelnikovaOA.AmicrobeamstudyofDNAdouble-strandbreaksinbystanderprimaryhumanfibroblasts.RadiatProtDosimetry,2006,122:256-259.31.GoetzW,MorganMN,BaulchJE.TheeffectofradiationqualityongenomicDNAmethylationprofilesinirradiatedhumancelllines.RadiatRes,2011,175(5):575-87.32.HuntCR,RamnarainD,HorikoshiN,IyengarP,etal.HistonemodificationsandDNAdouble-strandbreakrepairafterexposuretoionizingradiations.RadiatRes,2013,179(4):383-92.33.FuJ,JiangM,ZhangM,ZhangJ,etal.MiR-495functionsasanadjuvanttoradiationtherapybyreducingtheradiation-inducedbystandereffect.ActaBiochimBiophysSin(Shanghai),2016,48(11):1026-1033.34.LeeKF,ChenYC,HsuPW,LiuIY,WuLS.MicroRNAexpressionprofilingalteredbyvariantdosageofradiationexposure.BiomedResInt,2014,2014:456323.35.DattaK,SumanS,KallakuryBV,FornaceAJJr.Exposuretoheavyionradiationinducespersistentoxidativestressinmuoseintestine.PLoSOne,2012,7(8):e42224.36.NagasawaH,LittleJB.Inductionofsisterchromatidexchangesbyextremelylowdoseofalpha-particles.CancerRes,1992,15;52(22):6394-6396.37.TominagaH,KodamaS,MatsudaN,SuzukiK,WatanabeM.Involvementofreactiveoxygenspecies(ROS)intheinductionofgeneticinstabilitybyradiation,J.Radiat.Res,2004,45:181-188.38.AzzamEI,Jay-GerinJP,PainD.Ionizingradiation-inducedmetabolicoxidativestressandprolongedcellinjury.CancerLett,2012,327(1-2):48-60.68 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应发表的论文攻读学位期间本人出版或公开发表的论文公开发表论文：1.曹倩琳，杨红英，单次低剂量铁离子照射可在支气管上皮细胞中导致长期生物学效应.中国科技论文在线,2017.2.AsinglelowdoseofFeionscancauselong-termbiologicalresponseinNL20humanbronchialepithelialcells.(QianlinCao,HongyingYangetal.审稿中）参与的科研项目：1.2013中国国家自然科学基金面上项目空间辐射与微重力复合作用所诱发的上皮细胞间质转换及其在肿瘤发生中的作用（项目批准号：11335011）69 缩略词表低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应缩略词表英文缩写英文全称中文全称DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸GyGray戈瑞RBERelativebiologicaleffectiveness相对生物学效应ROSreactiveoxygenspecies活性氧DSBsDNAdouble-strandbreaksDNA双链断裂SSBsDNAsingle-strandbreaksDNA单链断裂53BP1p53bindingprotein1p53结合蛋白1MNmicronucleus微核hhour小时CTRcontrol对照miRNAMicroRNA微小RNAlncRNAlongnon-codingRNA长链非编码RNAPBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液DMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜DEPCdichlorodiethylsulfide焦碳酸二乙酯DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸FBSFatalbovineserun胎牛血清SOD1SuperoxideDismutase1超氧化物歧化酶2SOD2SuperoxideDismutase2超氧化物歧化酶2DDRDNAdamageresponseDNA损伤应答RBErelativebiologicaleffectiveness相对生物学效应LETlinearenergytransmission传能线密度HRHomologousrecombination同源重组修复NHEJNonhomologusend-joining非同源末端链接70 低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应致谢致谢三年的研究生生活转瞬即逝。回顾这三年来的点点滴滴，感触良多，万般滋味，涌上心头。这一路走来，既有在实验中遇到困难时百转千回的惆怅，也有山穷水复疑无路，柳暗花明又一村的喜悦。岁月荏苒，三年的研究生生涯让我从中得到了许多宝贵的科研经验。面对着这份代表我硕士研究生生涯学习成果总结的毕业论文，心中有些许忐忑，生怕辜负师长及亲友们的厚望。在这里，谨以最真诚的言语向陪伴我帮助我的人表达我深深的谢意。首先，特别要感谢我的导师杨红英教授，从文章的选题、写作、多番修改直至最终的定稿，无一不是在杨老师的悉心指导下完成的，更在论文的框架上，逐字逐句的斟酌上给我很大的帮助，杨老师倾注了大量的心血。感谢杨老师给予我辛勤的指导和无私的帮助。三年前，我刚进实验室，对科研几乎是一窍不通，杨老师认真耐心指导我步入科研这座雄伟的大殿。在浓浓的科研氛围中让我感受到科研的魅力。在这三年的研究生生活中，我被杨老师渊博的专业知识、严谨的治学精神和诲人不倦的崇高师德所折服。从她身上，我学会了基本的实验操作，培养了初步的科研思维，提高了对问题的解决能力。在生活中杨老师也给予了我无微不至的照顾还有关心。我想杨老师传授给我的不仅仅是科研中的那些知识和方法，对我为人处世、积极向上的生活态度有着巨大影响，这将使我受益终生，由衷感谢杨老师这三年里对我无私的教诲！感谢王敬东老师在学习以及生活中给予我耐心的指导；在我实验中以及生活中遇到困难时，王老师给出的宝贵意见和建议往往可以为我指明前进的方向。感谢曹建平老师、张舒羽老师、朱巍老师以及学院各位老师对我知识的教育和启迪，从他们丰富、生动的授课中，我获得了大量的专业知识。同时，我非常感谢朱巍老师、彭蓉老师在课题、工作和生活上的建议和帮助。感谢研究生阶段的师兄、师姐和2014级同窗们的关怀和帮助；感谢田文倩和尹晓明师姐、王龙晓师兄以及黄萍、赵一凡、谭雯、张雅瑞、陆佳伟、刘苇等同学在生活和学习上对我的莫大支持和鼓励，是你们的陪伴，让我度过的这三年里充满了欢声笑语。71 致谢低剂量铁离子照射在NL20人支气管上皮细胞中诱导的长期生物学效应感谢我的家人对我学业的默默支持，是你们的理解和关爱，使我安心顺利地渡过了研究生生涯。最后，向在百忙之中抽出时间对本文进行评审并提出宝贵意见的各位专家表示衷心地感谢！72 苏州大学硕士学位论义（学术学位）
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