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分类号：S852.65单位代码：10193密级：公开学号：20150512硕士学位论文新疆啮齿动物病毒组研究及其温州砂粒病毒的分离鉴定ViromeProfilingofRodentsinXinjiang,China:IsolationandCharacterizationofaNewWenzhouMammarenavirusVariant作者姓名：谈之舟学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：分子病毒学指导教师：涂长春研究员所在学院：动物科学技术学院2018年3月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日 摘要啮齿动物（啮齿目，Rodentia）是全球分布最广泛，种类最多的哺乳动物，同时也是多种人兽共患病原的自然宿主。但是我们对啮齿动物尤其是中国啮齿动物携带病毒的多样性并未充分研究，其携带的病原对人类社会具有潜在威胁。新疆维吾尔自治区位于中国西北部，与中亚多国接壤，属于温带大陆性气候，大部分区域为沙漠和草原，不仅是我国连接中亚乃至欧洲的重要路上通道，更是一个巨大的农牧业产业基地。该地区生活了多达86种啮齿动物，农牧业及商业的发展增加了其从业人员与野生啮齿动物接触的机会，对该地区的公共卫生安全产生了潜在的威胁。本课题首次对新疆啮齿动物病毒组及其携带的新型重要人兽共患病病原进行了研究。对采集于新疆西北部的7种共314只啮齿动物种进行了病毒宏基因组检测，共得到了7067条病毒序列（占全部序列的0.14%）。这些病毒注释到了24个病毒科，其中包括一些对人类及动物公共卫生安全具有潜在威胁的病毒，比如砂粒病毒，副粘病毒，双顺反子病毒，细小病毒和布尼亚病毒。我们对脊椎动物及节肢动物来源的病毒序列进行了拼接及系统进化分析，并进一步对其中检测到的砂粒病毒进行了系统的病毒学分离与鉴定研究。在采集于伊犁哈萨克自治州察布查尔锡伯自治县的一只褐家鼠（Rattusnorvegicus）中分离到了一株新型的哺乳动物砂粒病毒，并扩增得到其全序列。多序列比较及系统进化分析显示该株病毒是温州砂粒病毒（Wenzhoumammarenavirus）的一个新型变异株并且形成了一个新的进化分支，命名为温州病毒察布查尔株（QARn1）。动物实验表明该病毒感染白化大鼠后无明显的临床症状，但产生了病毒血症和病毒特异的体液免疫反应，且其肺脏和胸腺能观察到轻度的出血以及炎性细胞浸润。本研究为该地区啮齿动物的病原生态学研究提供了基础数据，并首次在亚洲腹地发现温州砂粒病毒，极大的扩展了该病毒的地理分布范围，同时证明了褐家鼠是该病毒的自然宿主。由于对人类公共卫生安全具有潜在威胁，该病毒需要长期监测。关键词：啮齿动物，新疆，病毒组，温州砂粒病毒，致病性评估 AbstractRodents(orderRodentia),asthemostdiverseandwidestdistributedmammals,areanaturalreservoirofmanyzoonoticviruses.However,littleisknownabouttheviraldiversityharboredbyrodentsinChina.TheXinjiangUygurautonomousregion,locatedinnorthwesternChina,providesanimportantterrestrialcorridoroftheSilkRoadconnectingChinaandcentralAsiaandEurope.Thisvastregion,withatemperatecontinentalclimate,consistsmostlyofdesertandgrassland,thelattersupportingwelldevelopedanimalhusbandryandagriculturalindustriesaswellasanecosystemof86knownrodentspecies.Consequently,virusescarriedbyrodentsinthisvastregionhavebeenpoorlyinvestigated,althoughtheypotentiallyposeamajorrisktopublichealth,particularlytoagriculturalworkersindirectorindirectcontactwithinfectedanimals.Hereweperformedviralmetagenomicanalysesof314wildrodentscovering7species,sampledinnorthwestChina,withresultsrevealing7,067reads(0.14%)beingannotatedtovirusesof24familiesincludingsomepotentiallypathogenictohumansandotheranimalssuchasarenaviruses,paramyxoviruses,dicistroviruses,parvovirusesandbunyaviruses.Thevirus-likereadsofmammal-orarthropod-infectingwereselectedandassembledintocontigsandsubsequentlyemployedforphylogeneticanalyses.Wefurtherconductedasystematicvirologicalcharacterizationofanovelmammarenavirus,QARn1,identifiedafterisolationfromabrownrat(Rattusnorvegicus).FullgenomicandphylogeneticanalysesshowedthatQARn1wasavariantofWenzhoumammarenavirus(WENV)andformedanewbranchwithintheWENVclade.ExperimentalinfectionofSprague-DawleyratswithQARn1didnotpresentovertpathology,butspecifichumoralimmuneresponsesdeveloped,andmildhemorrhageandimmunocyteinfiltrationofthelungsandthymuswereobserved.TheseobservationshaveexpandedthegeographicdistributionofWENVtoCentralAsia,andhavesuggestedthatR.norvegicusratsarenaturalhostsofthisvirus,althoughitspublicthreattohumansandotheranimalsrequiresfurtherinvestigation.ThisstudyprovidedthebasicdataforthePatho-ecologystudiesabouttherodent-bornevirusesinXinjiang.Keywords：Rodents,Xinjiang,virome,Wenzhoumammarenavirus,pathogenicassessment 目录前言.....................................................................................................................................1第一篇文献综述...............................................................................................................3第一章砂粒病毒的流行病学研究现状...........................................................................31.1砂粒病毒的发现历史及其对于公共卫生安全的威胁...........................................31.2砂粒病毒的基因结构，分类现状及进化历史.......................................................41.3砂粒病毒的自然宿主...............................................................................................61.4砂粒病毒的研究展望...............................................................................................8第二篇研究内容...............................................................................................................9第一章新疆啮齿动物病毒的宏基因组学研究...............................................................91.1材料...........................................................................................................................91.2方法.........................................................................................................................111.3结果.........................................................................................................................151.4讨论.........................................................................................................................231.5小结.........................................................................................................................24第二章新型温州砂粒病毒的检测扩增与基因分析.....................................................252.1材料.........................................................................................................................252.2方法.........................................................................................................................272.3结果.........................................................................................................................322.4讨论.........................................................................................................................402.5小结.........................................................................................................................42第三章新型温州砂粒病毒的分离与致病性研究.........................................................433.1材料.........................................................................................................................433.2方法.........................................................................................................................463.3结果.........................................................................................................................523.4讨论.........................................................................................................................593.5小结.........................................................................................................................60结论...............................................................................................................................61参考文献...............................................................................................................................62附录A..........................................................................................................................68附录B..........................................................................................................................70附录C..........................................................................................................................72附录D..........................................................................................................................78作者简介...............................................................................................................................82致谢...............................................................................................................................83 前言新发传染病在全球范围内对人类公共卫生健康及经济发展有着很大的威胁，据估计其中70%以上的新发或再发传染病都是来源于野生动物的人兽共患病[1]。作为数量最庞大、种类最多样化、地理分布最广泛的哺乳动物，啮齿目动物（Rodentia）是多种重要人兽共患病病原的自然宿主，例如汉坦病毒（Hantavirus）和砂粒病毒（Arenavirus）[2,3]。新疆维吾尔自治区位于我国西北部，通过丝绸之路连接了我国与中亚、西亚乃至欧洲之间的贸易及文化。这一占全国陆地面积近六分之一的巨大区域，主要为温带大陆性气候，大部分区域为沙漠及草原，是我国最重要的农牧业生产基地，同时是为多达86种啮齿动物的栖息地[4]。新疆也是多种人兽共患病的自然疫源地，比如新疆出血热（Xinjianghemorrhagicfever）[5-8]和鼠疫（plague）[9]，其中前者又被称为克里米亚刚果出血热（Crimean-Congohemorrhagicfever），为蜱传病原，；后者的病原为鼠疫耶尔森杆菌（Yersiniapestis）。由于这些人兽共患病会造成间歇性的暴发，控制这些疾病的传播往往要耗费巨大的人力物力[10]。随着新疆农牧业的高速发展，其从业人员与野生啮齿动物接触的机会大大增加，而新疆啮齿动物携带的病毒性病原等方面的数据却是空白，急需开展相关研究。砂粒病毒属于砂粒病毒科（Arenaviridae），具有囊膜，基因组为分两个节段的双义（ambisense）单链（single-stranded）RNA。沙粒病毒科目前分为两个属：哺乳动物砂粒病毒（Mammarenavirus）和爬行动物砂粒病毒（Reptarenavirus）[11]，前者有33个种被国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV）收录，而后者目前只有3个种。啮齿动物是哺乳动物砂粒病毒的主要自然宿主，感染病毒后往往表现为无临床症状的持续性感染状态。随着啮齿动物的生活活动，病毒会通过啮齿动物的排泄物及分泌物传播到环境中，当人类接触到这些带毒物质后，可能会造成严重的疾病（如出血热症状）甚至死亡。例如在西非地区广泛流行的的拉沙热（Lassafever），能够造成感染者严重的出血热症状，以及高达30%的死亡率，其病原为拉沙砂粒病毒（Lassamammarenavirus，LASV）[12]；在南美洲地区季节性爆发的阿根延出血热（Argentinehemorrhagicfever）由胡宁砂粒病毒（Juninmammarenavirus，JUNV）造成，每年在该地区造成超过一千人的死亡[13]。根据血清学、地理分布及基因分型特性，哺乳动物砂粒病毒可以分为两个群（complex），即新大陆（NewWorld）群或者叫塔卡里伯（Tacaribe）群和旧大陆（OldWorld）群或者叫拉沙-淋巴脉络丛脑膜炎（Lassa-lymphocyticchoriomeningitis）群[11,14]。顾名思义，新大陆群分布于美洲，以胡宁砂粒病毒（JUNV）、马丘坡砂粒病毒（Machupomammarenavirus，MACV）及瓜纳里托砂粒病毒（Guanaritomammarenavirus，GTOV）为代表，目前可以再1 进一步细分为4个进化分支（lineage）。而旧大陆群只有一个进化分支，包括了15种已知的病毒，主要分布于非洲及亚欧大陆[15]。从地理分布来看，大多数的哺乳动物砂粒病毒都是在非洲及美洲发现的，由于研究不够,亚洲数据很少。目前亚洲只报道了3种哺乳动物砂粒病毒：全球广泛分布的淋巴脉络丛脑膜炎砂粒病毒（lymphocyticchoriomeningitismammarenavirus，LCMV）[16]、在我国浙江省及东南亚的柬埔寨发现的温州砂粒病毒（Wenzhoumammarenavirus，WENV）[17,18]，以及最近在泰国新发现的洛伊河砂粒病毒（LoieRivermammarenavirus，LORV）[18]。其中WENV已经在多种啮齿动物和一种鼩鼱（Suncusmurinus）中被检测到；而LORV是在板齿鼠（(Bandicotasp）中检测到的[17,18]。除此之外，无其他报道。为了探究新疆啮齿动物携带病毒的多样性及评估其携带病毒对公共卫生安全的影响，本研究聚焦于新疆，对在该地区采集的野生啮齿动物样品进行了病毒宏基因组学分析。结果显示检测到了多达24个科的病毒，其中包括一些哺乳动物或节肢动物的已知病原，如细小病毒（parvovirus）、双顺反子病毒（dicistrovirus）、布尼亚病毒（bunyavirus）、副粘病毒（paramyxovirus）及砂粒病毒（arenavirus）。进一步，我们对其中检测到的温州砂粒病毒察布查尔株（WENV-QARn1）进行了系统的病毒学鉴定与分离。本研究极大的扩展了该病毒的地理分布范围。实验动物致病性试验及跨宿主传播评估显示褐家鼠（Rattusnorvegicus）是该病毒的自然宿主。2 第一篇文献综述第一章砂粒病毒的流行病学研究现状1.1砂粒病毒的发现历史及其对于公共卫生安全的威胁砂粒病毒是指属于砂粒病毒科（Arenaviridae）的病毒，中文文献中有时也将其称为沙粒病毒或者砂状病毒。由于该病毒在电镜下可以看到病毒囊膜上存在有砂粒状的宿主核糖体，所以使用Arena这个表示砂粒含义的拉丁语词汇对这个病毒进行了命名。砂粒病毒的发现历史最早可以追溯到1933年。淋巴脉络丛脑膜炎砂粒病毒（LCMV），是第一个被发现的砂粒病毒，该病毒是在一次针对圣路易斯脑炎病（SaintLouisencephalitis）的流行病学研究中发现的。最初发现该病毒可以造成人的无菌性脑膜炎，接着发现小家鼠是该病毒的自然宿主。在1956年，在加勒比海地区的塔卡里伯岛上发现了一个由果蝠携带的新的砂粒病毒TCRV，这是第一个发现的新大陆砂粒病毒，但是到目前为止，该病毒还没有发现可以感染人类。在1959年，阿根廷爆发了一种出血热疾病（即阿根廷出血热），JUNV被认定为是造成该疾病的病原，JUNV是第一个发现的能造成人类出血热症状的砂粒病毒。无独有偶，在1963年，同在南美洲的玻利维亚，也出现了由另一种砂粒病毒MACV造成的出血热疾病（玻利维亚出血热）。紧接着，1970年，远在大洋彼岸的非洲大陆，也发现了造成出血热疾病的砂粒病毒LASV，该病毒造成的拉沙热，是目前感染及死亡人数最多的砂粒病毒。同时从上个世纪七十年代起，陆陆续续还有一些砂粒病毒在美洲和非洲发现[11]。目前发现的大部分砂粒病毒都是在非洲和美洲大陆发现的，欧亚大陆砂粒病毒的研究十分有限，目前除了在全球范围内广泛分布的LCMV之外，亚洲在2015年分别在我国和泰国各发现了一个新型的砂粒病毒，即温州砂粒病毒（WENV）和洛伊河砂粒病毒（LORV）。温州砂粒病毒在2015年首次发现于浙江省温州市，次年又被其他团队在柬甫寨分离到，并且已经有核酸和血清学证据证明该病毒已经在东南亚人群中流行，但是该病的症状和危害性还不是很清楚。大鼠属（Rattus）很有可能是该种病毒的自然宿主，其中包括褐家鼠（Rattusnorvegicus）和波利尼西亚鼠（Rattusexulans）。这两种啮齿动物鼠在全球广泛分布，数量巨大，与人类关系密切。从2012年起，在美洲和欧洲的蛇类中也检测并分离到了砂粒病毒，打破了砂粒病毒只能感染哺乳动物的观念。所以从2012年开始，砂粒病毒科分为了两个属，即哺乳动物砂粒病毒（Mammarenavirus）和爬行动物砂粒病毒（Reptarenavirus）。原则上经过新的病3 毒属的划分之后，之前发现的砂粒病毒应该重新命名，如拉沙砂粒病毒（Lassaarenavirus）被重新命名为了拉沙哺乳动物砂粒病毒（Lassamammarenavirus）。但是由于长期的使用习惯，在最近的文献中，之前的病毒名称仍然在广泛使用。除了LCMV以疾病症状来命名之外，其余的哺乳动物砂粒病毒都以发现的地点来进行命名，比如拉沙砂粒病毒以病毒的发现地尼日利亚的拉沙镇进行了命名。哺乳动物砂粒病毒是一种重要的人兽共患病病原。啮齿动物是该病毒的自然宿主。感染该病毒后的啮齿动物可以通过粪便尿液等排泄物传播病毒，当人类接触到这些带毒的排泄物之后，病毒会通过消化道，呼吸道，或者破损的皮肤及粘膜进行感染。目前已知有多种砂粒病毒可以感染人类。该属病毒对人类有着极大的危害性，能够造成人类和动物的出血热疾病。其中一些病毒已经被证实能造成人类感染，如淋巴脉络丛脑膜炎砂粒病毒（LCMV），卢约砂粒病毒（Lujomammarenavirus，LUJV）,拉沙砂粒病毒（LASV），瓜纳里托砂粒病毒（Guanaritomammarenavirus，GTOV）,胡宁砂粒病毒（Juninmammarenavirus，JUNV），马丘坡砂粒病毒（Machupomammarenavirus，MACV），萨比亚砂粒病毒（Sabiamammarenavirus，SABV）和查帕雷砂粒病毒（Chaparemammarenavirus，CHPV）其中LCMV，LASV，JUNV是研究最多的三种病毒。不同的砂粒病毒感染人类的症状不同，拉沙砂粒病毒（LASV）造成出血性拉萨热，在西非每年造成10万到30万人的感染，5千人的死亡。以JUNV为代表的南美出血热，包括GTOV，MACV，SABV在南美洲及中美洲地区会造成季节性流行的美洲砂粒病毒出血热，JUNV每年造成200-2000人死亡；而淋巴脉络丛脑膜炎砂粒病毒（LCMV）能引起人类的无菌性淋巴脉络丛脑膜炎，全球不同地区的血清学研究显示，人类感染该病毒的血清阳性率高达5%。虽然大多数人类感染该病毒都是无症状的，但是有报道孕妇感染该病毒会造成孕婴的死亡，同时器官移植病人感染该病毒也会造成死亡。在LCMV全世界范围内流行，据估计，全球有5%的人感染该病毒，LCMV死亡率很低，感染LCMV大多都是感冒症状或者无症状，但是如果是孕妇感染，可能会造成死亡。卢约砂粒病毒，拉沙砂粒病毒，瓜纳里托砂粒病毒，胡宁砂粒病毒和马丘坡砂粒病毒等为烈性病原需要在BSL4级实验室操作。1.2砂粒病毒的基因结构，分类现状及进化历史砂粒病毒是具有囊膜结构的RNA病毒，其基因组结构非常特殊，为两个节段（L和S）的双译（ambisense）单股（single-stranded）线状RNA。在L和S节段都有着相似的基因结构，即3’末端和5’末端都有一段非编码区（UTR），中间编码两个基因，两个基因由一段基因间序列（intergenicnoncodingregion，IGR)）间隔开来。L节段编码RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）和基质蛋白（Z），S节段编码核蛋白（NP）和糖蛋白前体（GPC）。但是每个节段的两个基因的方向是完全相反的。在病毒囊膜中，L和S两个节段的病毒RNA比例大约为1：2。并且在病毒粒子中，还会存在一些极低含量的L和S片段的互补4 RNA链。虽然说砂粒病毒的基因组是双译的，但是病毒RNA并不能直接作为mRNA翻译蛋白产物，必须先合成互补链，使用互补链翻译翻译RdRp和NP，接着需要再部分合成互补链的互补链，进行Z蛋白和GPC的翻译。核蛋白（NP）是砂粒病毒的主要结构蛋白，核蛋白会组装成核衣壳并和病毒RNA结合生成念珠状的结构（bead-likestructures），同时核蛋白也是病毒转录和翻译所必须的组成部分，起重要的调节作用。RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）在RNA病毒中很常见，在RNA病毒中，转录和复制都由该酶进行。而Z蛋白是种小的基质蛋白，具有一个锌结合区域（zinc-bindingRINGmotif），Z蛋白在病毒的出芽过程中起到了决定性的作用。Z蛋白同时也具有抑制RNA合成的作用。糖蛋白前体（GPC）翻译后会由一段信号肽引导，使得其进一步在细胞内被水解成G1和G2两个成熟的糖蛋白，而信号肽蛋白在水解过程中被分解掉。G1和G2蛋白会与宿主细胞的细胞膜融合形成砂粒病毒的囊膜结构，并在其表白形成纤突结构（spike），该纤突结构是病毒黏附及进入细胞的结构基础。砂粒病毒科目前分为两个属，即哺乳动物砂粒病毒（Mammarenavirus）和爬行动物砂粒病毒（Reptarenavirus）。前者被国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV）收录的有33个种，而后者目前只有3个种。哺乳动物砂粒病毒根据其血清学、地理分布及基因分型特性，可以被分为两个群（complex），即新大陆（NewWorld）群或者叫塔卡里伯（Tacaribe）群和旧大陆（OldWorld）群或者叫拉沙-淋巴脉络丛脑膜炎（Lassa-lymphocyticchoriomeningitis）群。最新的ICTV对于砂粒病毒种的分类标准为；1）是否与其他砂粒病毒的的抗原性及免疫原性有明显的差异；2）能否造成一定的人类疾病；3）是否仅在一定的地理范围内存在，其自然宿主是否为某一种或多种生物；4）其基因是否于已知的砂粒病毒有着明显的差异。砂粒病毒由于其独特的基因结构，目前被ICTV认定为一个独立的科—砂粒病毒科（Arenaviridae）。但是由于最近新病毒的发现呈现了爆发式的增长，发现砂粒病毒与布尼亚病毒目有这相关的进化关系，说明砂粒病毒可能与布尼亚有着共同的祖先起源[19]。如果使用RdRp基因进行系统进化分析的话布尼亚病毒目和砂粒病毒科目前合起来可以大致分为三个超家族：1）布尼亚病毒样超家族（bunya-likevirussupergroup），2）白蛉病毒样超家族（phlebo-likevirussupergroup）以及砂粒-内罗毕病毒样超家族（Arena-Nairo-likesupergroup）。所以砂粒病毒科与布尼亚病毒目的内罗毕病毒科在基因进化上高度相关，比如克里米亚刚过出血热病毒（CrimeanCongohemorrhagicfevervirus）的L节段的RdRp基因和S节段的N基因分别于与LASV的RdRp基因及N基因有很明显的进化相关性[20]。然而砂粒病毒的进化历史比这个更加复杂，自2012年起，在蛇类动物中发现了一类新的砂粒病毒，这些病毒的N和RdRp基因与哺乳动物砂粒病毒的具有较高同源性，GPC基因却与丝状病毒的GP基因具有较高同源性，而Z基因与细胞泛素基因（ubiquitin）具有相关性[21-23]。进一步，在蛇源的砂粒病毒还观察到了的重组、重排及L/S基因型组成差5 异的现象[24]。综合以上结果来看，哺乳动物砂粒病毒属，爬行动物砂粒病毒属、丝状病毒科以及布尼亚病毒目（内罗毕病毒科）具有进化相关性，病毒基因的重组在砂粒病毒的进化历史中无疑起到了非常关键的作用。RNA病毒有着复杂的进化历史，但是根据目前已经发现的RNA病毒的RdRp基因推算的RNA病毒的碱基替换速率大约为1×10-4-5个替换/每个位点/每年，如果RNA病毒进化如此之快的话，那么所有RNA病毒的共同祖先出现的时间仅为10000~100000年前，这推算结果显然是不符合常理的[25]。目前很多证据都表明RNA病毒产生的时间可以追溯到千万年前，RNA病毒的碱基替换速率并不能对RNA病毒的进化历史时间长度进行有效的推算，RNA病毒的碱基替换速率是一个动态变化的数据，可能受到了RNA病毒的序列长度限制及其宿主的选择压力[26-30]，而且目前已经发现除了逆转录病毒之外的RNA病毒也可以整合在宿主基因组中[31]，这些直接和间接的证据都表明RNA病毒的进化历史悠久，对RNA病毒进化研究应该格外注意。砂粒病毒目前虽然没有证据证明为宿主共进化，但是爬行动物的砂粒病毒的发现，以及更重要的，最近在辐鳍鱼（Ray-finnedfish）中也发现了新型的砂粒病毒序列，提示了砂粒病毒在脊椎动物中跟随着宿主一起进化了很久，目前哺乳动物砂粒病毒于其宿主的非共进化现象是由于宿主转化产生的。砂粒病毒的出现历史可以最早追溯到脊椎动物的共同祖先出现的时间[32]。1.3砂粒病毒的自然宿主虽然砂粒病毒目前没有发现病毒-宿主共进化的现象，但是有一点毋庸置疑，那就是砂粒病毒具有很强的宿主特异性[33,34]。新大陆哺乳动物砂粒病毒大多由棉鼠亚科（Sigmodontinae）和林鼠亚科（Neotominae）的啮齿动物携带，根据其基因特点可以分为4个亚群；而旧大陆哺乳动物砂粒病毒大多由真鼠亚科（Murinae）的啮齿动物携带，只有一个进化群，说明旧大陆哺乳动物砂粒病毒在进化过程中有宿主转换（host-switching）的现象出现[11]。对于爬行动物砂粒病毒，其进化历史更为复杂，基因的重组和重排现象均有发生[21-24]。表1哺乳动物砂粒病毒的地理分布及自然宿主Table1GeographicdistributionandnaturalhostreservoirofMammarenaviruses病毒名称（缩写）*病毒分布地点自然宿主（拉丁名）新大陆（NewWorld）哺乳动物砂粒病毒ALLV秘鲁Oecomysparicola;OecomysbicolorAMAV巴西NeacomysguianaeBCNV美国加利福尼亚州Neotomamacrotis;PeromyscuscalifornicusCHPV玻利维亚unknownCPXV巴西Oryzomysmegacephalus6 FLEV巴西Oryzomyinispp.GTOV委内瑞拉Zygodontomysbrevicauda;SigmodonalstoniJUNV阿根廷Calomysmusculinus;Akodonazarae;CalomyslauchaLATV玻利维亚CalomyscallosusMACV玻利维亚CalomyscallosusMEWV南非MyotomysunisulcatusOLVV阿根廷NecromysbenefactusPARV巴拉圭OryzomysangouyaPICV哥伦比亚OryzomysalbigularisPIRV委内瑞拉Sigmodonalstoni;ZygodontomysbrevicaudaSABV巴西unknownTCRV特立尼达ArtibeusjamaicensistrinitatisTAMV美国佛罗里达州Sigmodonalstoni;OryzomyspalustrisWWAV美国西南部Neotomaalbigula旧大陆（OldWorld）哺乳动物砂粒病毒MOBV中非共和国Praomysspp.MOPV莫桑比克，津巴布韦MastomysnatalensisOKAV纳米比亚MicaelamysnamaquensisMRLV纳米比亚MicaelamysnamaquensisLUJV赞比亚unknownLUNV南非，赞比亚MastomysnatalensisLUKV赞比亚MusminutoidesLCMV全球Musmusculus;ApodemussylvaticusLASV西非地区MastomysnatalensisIPPYV中非共和国Arvicanthisspp.;Praomysspp.GAIV坦桑尼亚MastomysnatalensisWENV中国浙江省，柬埔寨Rattusnorvegicus;RattusexulansLORV泰国Bandicotasp.SOLV赞比亚Grammomyssp.*表中的所有的病毒名称与附录C相同对于野生动物来源的疾病的病原生态学研究来说，核酸和血清学检测是最重要的两个手段，为了对得到的数据进行解读，首先需要知道的就是病原感染野生动物宿主的动力曲7 线，及宿主感染病毒后的病毒及抗体水平的变化量。而砂粒病毒与其啮齿动物宿主相关研究却不多。有趣的是，砂粒病毒感染其啮齿动物的实验显示，大多数动物个体显示为急性感染，只有很少的个体呈现为持续性感染[35-40]。砂粒病毒与其自然宿主的相互作用对于疾病的预防控制具有重要意义。1.4砂粒病毒的研究展望砂粒病毒是一类能造成人类出血热症状的重要人兽共患病病原，其自然宿主主要为啮齿动物，而啮齿动物与人类关系密切，接触频繁，这些特性都极大的增加了该病原对于公共卫生安全的威胁；同时该病毒也是一类潜在的生物武器，而目前我们对于砂粒病毒的防治措施很却十分有限，急需进行进一步研究。目前砂粒病毒出血热的主要疫源地为非洲及美洲，我国目前没有砂粒病毒出血热的病例报道，但是随着我国于其他国家的贸易日益频繁，极大的增加了输入性病例进入我国的可能性，对我国的公共卫生安全带来一定的挑战。另一方面，针对我国啮齿动物携带的砂粒病毒也少有研究，而人类传染病的“人病兽防，关口前移”已经是学界的一个共识，我们应当从病原生态学的角度入手，对我国的病原自然宿主及传播宿主进行系统性的调查，为今后新发及再发传染病的防控及溯源提供基础数据。8 第二篇研究内容第一章新疆啮齿动物病毒的宏基因组学研究啮齿动物是众多人兽共患病原微生物的自然宿主，它们极大的利用了人类对于自然环境的改造，和人类一起，几乎占据了地球除了南极洲之外的每一块土地。随着人类社会的发展，人类与啮齿动物接触机会的增多，啮齿动物所携带的传染性病原一直以来都是人类社会的巨大威胁。因此对于啮齿动物的病原监测工作是必不可少的。啮齿动物是重要的病原宿主，同时也是种类数量最丰富的一类哺乳动物。种类繁多，生存能力强，并且有些物种（如小家鼠、褐家鼠）与人类分享栖息地，对人类及动物公共卫生健康有着极大地威胁。新疆是我国最大的省级行政区域，占我国陆地总面积的六分之一，与俄罗斯、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦，塔吉克斯坦，巴基斯坦，蒙古，印度和阿富汗八个国家接壤。而该地区的病原生态学研究却很有限。为了了解新疆的啮齿动物携带什么样的病毒，对公共卫生有什么危害，我们利用病毒宏基因组学技术对新疆边境地区的啮齿动物进行了病毒筛查。同时，为了比较啮齿动物与蝙蝠的病毒组学差异，我们对广西壮族自治区采集到的一个蝙蝠群体进行了同步的宏基因组学处理和高通量测序。1.1材料1.1.1样品采集信息为了对我国新疆边境地区啮齿动物携带病原进行本底调查，本实验室及合作单位在新疆进行了系统性、大规模的野生啮齿动物样品采集工作。在2012年到2016年期间，在新疆5个地区（精河县、察布查尔锡伯自治县，伊宁市，阿拉山口市及阿克苏市），共采集了314只小型啮齿动物。这些采集到的啮齿动物首先经过随行动物学家的形态学鉴定，随后对其肌肉组织提取DNA，扩增其部分细胞色素b基因，以对其物种进行准确鉴定。详细样品采集信息见图1.1。2015年3月，我们在广西壮族自治区（下文简称广西）百色市的一个山洞中采集了95只蝙蝠，经过形态学及进一步的线粒体细胞色素b的基因鉴定，确定蝙蝠种类。蝙蝠样品在采集之后在当地的实验室进行了解剖，每只蝙蝠进行了标号（标记为1~95号），然后分布采集了肺脏、肝脏、肠道及脑组织样品，使用干冰运送回实验室之后在-80冰箱进行保存。9 1.1.2实验试剂与耗材实验步骤试剂名称生产厂商肌肉组织DNA提取组织基因组DNA提取试剂盒天根物种鉴定2×PCRMasterMix天根琼脂糖Biowest琼脂糖凝胶电泳DNAMarkerDL2,000TaKaRa核酸染料GelRedBiotium1×PBSCorning样品的宏基因组学处理0.22μm针头滤器MilliporeDNaseITaKaRa核酸消化RNaseA工作液TaKaRaRNA提取RNeasyMiniKitQIAGENRRITaKaRasscDNA合成M-MLVRTaseTaKaRadscDNA合成KlenowfragmentTaKaRa单引物扩增2×MasterMix天根AxyPrepDNAGelExtractionKitAxygen核酸纯化3MNaAc碧云天1.1.3实验仪器仪器名称生产厂商型号全自动PCR仪美国ABI2720琼脂糖凝胶电泳仪北京TanonEPS300微量移液器德国Sartorius2/10/100/200/1000μL核酸自动提取工作站德国QiagenQiacube台式低温高速离心机德国Eppendorf5804R医用冷藏箱（4°C）中科美菱YC-968L超低温冰箱（-40°C）日本SANYOMDF-U541210 超低温冰箱（-80°C）美国Thermo902-ΜLTS全自动快速研磨仪上海净信Tissuelyser-FEIII核酸蛋白检测仪美国ThermoFisherNanodrop1000振荡器哈尔滨东联HZQ-R超速冷冻离心机美国BECKMANOPtimaTML-80XP紫外凝胶成像系统美国UVtecFireReader蓝光切胶仪北京天根Tiangreen高压锅日本SANYOZY0302恒温水浴锅上海一恒BWS-0510制冰机日本SANYOSIM-F140AY65液氮罐美国CBSCVA-6002磁力搅拌器北京金紫光SH-5恒温摇床哈尔滨东联HZQ-160电子天平德国SartoriusBP121S1.1.4生物信息学软件软件功能软件名称软件网址或版本序列比对搜索BLASThttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi序列拼接，多序列比较，DNASTARVersion6.71基因图绘制等综合功能1.1.5系统进化使用的GenBank参考序列系统进化分析使用的参考序列的详细信息见附录C。1.2方法1.2.1伦理声明本论文中涉及的动物样品采集及动物实验经过了军事医学研究院军事兽医研究所动物福利管理委员会的监管与审批，符合实验动物看护及使用委员会授权书（授权编号：JSY-DW-2016-02）的要求。所有与动物相关的实验和操作严格遵守了中华人民共和国科技部2006年发布的实验动物医学原理与指南。11 1.2.2野生啮齿动物样品的采集处理及物种鉴定野生啮齿动物的采集是一项十分困难的工作。啮齿动物活动范围大，感官灵敏，警惕性高，很不好采集。在本实验中，我主要采用了两种策略使用捕鼠夹来进行样品采集。1）针对性策略。首先在野外找到疑似啮齿动物的洞穴，小心地观察洞口，查看有没有最近动物活动的痕迹。对有新鲜活动痕迹的洞口，小心地放置捕鼠夹，确保完全覆盖洞口。一般啮齿动物洞穴都有多个出入口，我们会仔细观察，最大可能的覆盖每个洞口。同时对不好放置捕鼠夹的洞口进行掩埋处理。2）随机性策略。围绕疑似啮齿动物的活动区域进行巡查，巡查路线为一个或多个闭合曲线。在巡查过程中每隔2至3米放置一个带有诱饵的捕鼠夹。两种方法的所有的捕鼠夹都在早晨放置完毕，每次放置400个左右捕鼠夹。第二天早上进行样品收集。对捕鼠夹采集到的啮齿动物，在符合生物安全要求的安全柜中进行解剖，每只啮齿动物均采集肺脏、肠道、肝脏、肾脏及脑组织样品，并详细标注样品信息。样品经由低温条件带回实验室进行后续实验。啮齿动物的物种鉴定首先由合作单位的动物学专家进行了形态学鉴定，对每种啮齿动物取肌肉样品进行基因水平的种类鉴定。每份肌肉组织取出约25mg，加400μL1×PBS进行充分研磨，剩余的样品备份冻存。12,000×g离心5min后取上清，使用天根的组织基因组DNA提取试剂盒，参考说明书中的组织DNA提取步骤进行DNA的提取，最后用50μL洗脱缓冲液洗脱得到DNA产物。扩增了大约500bp的线粒体细胞色素b片段进行了再次的确认[41]。使用天根的2×PCRMasterMix，配制25μLPCR体系如下：表1-1啮齿动物种类鉴定PCR扩增体系Table1-1ThePCRcompositionofrodentsspeciesidentification组分用量/μLDNA12×PCRMasterMix12.5PrimerS(10μM)1PrimerA(10μM)1ddH2O9.5PCR过程设置为：94°C预变性3min，然后进行35个循环（Cycle）的（94°C30s，56°C30s，72°C40s）扩增过程，最后72°C延伸7min。取5μLPCR产物，加入配制好的1%琼脂糖凝胶上样孔，置于水平电泳仪中120V跑胶30min，在紫外凝胶成像仪下照胶鉴定。然后将含有目的条带的PCR产物直接送样至吉林库美生物公司进行Sanger测序。测序后得到的序列进行BLAST比对，注释种类中得分12 （Maxscore）最高的对应啮齿动物的种类。1.2.3蝙蝠样品的采集与种类鉴定经蝙蝠分类学家初步地形态学鉴定，此山洞中采集到的95只蝙蝠属于同一种，故进一步随机采集2只蝙蝠的肌肉组织进行种类鉴定，步骤同前。PCR扩增蝙蝠线粒体细胞色素b基因，扩增片段为553bp，PCR体系同前。PCR条件为：94°C预变性3min，然后进行35个循环（Cycle）的（94°C30s，56°C30s，72°C40s）扩增过程，最后72°C延伸7min。同样经电泳鉴定，阳性PCR产物送至公司测序，获得的序列经BLAST比对，注释种类中得分（Maxscore）最高的对应该蝙蝠种类。1.2.4病毒宏基因组学分析将采集到的啮齿动物和蝙蝠分别进行解剖，取肺脏及肠道样品，进行病毒宏基因组学分析。该方法已经在本实验室成功分析了大量样品[42]。本研究进行的病毒宏基因组学处理和分析主要分为以下几个步奏：1）样品处理。首先将数量巨大的原始样品分组。啮齿类样品一共分了3个组：AJ组:表示为采集于阿拉山口市（Alashankou）和精河县（Jinghe）的样品；YQ组:表示为采集于伊宁市（Yining）和察布查尔县（Qapqal）的样品；AK组:表示为采集于阿克苏市（Aksu）的样品。95只蝙蝠的样品分为2个组：按标号顺序1~50号的组织混为一个组，51~95号的混为了另一个组。每个组的样品使用了一种Barcode标签进行标记。我们同时选取了肠道及肺脏样品进行样品混合，目的兼顾呼吸系统病毒及消化系统病毒。取混样时在冰上操作，每个动物的组织样品取火柴头大小（大约50mg），分组收集在EP管中待用。2）样品研磨及核酸提取。在混样中加入适量1×PBS并使用均浆机进行研磨。研磨完成后10,000×g离心10min取上清，接着使用0.22μm滤器进行过滤，进行外源核酸消化，反应体系见表1-2。然后使用RNA提取试剂盒进行RNA提取，虽然只提取了RNA，但是依然会有DNA残留，这样也会兼顾检测到一些DNA病毒。表1-2外源核酸消化体系Table1-2Reagentsforeliminatingfreenucleicacids组份用量（150μL体系）过滤后的组织研磨液130μLDNaseI4μLRNaseA工作液1μL10×DNaseIbuffer15μL13 3）测序样品制备。将提取的RNA首先进行反转录，引物为连接不同Barcode序列的随机引物（RandomPrimerforRT），通过反转录将不同分组样品的RNA加上Barcode标签，合成单链cDNA（sscDNA）。表1-3反转录体系（合成sscDNA）Table1-3Reagentsforreversetranscription组分用量（20μL体系）RNA13μLRandomPrimerforRT(40μM)1μL5×M-MLVBuffer4μLdNTPs(10mM)1μLRRI(40U/μL)0.5μLM-MLV(200U/μL)0.5μL然后利用相同的引物，进行第二链的合成，得到双链cDNA（dscDNA），合成体系如下表：表1-4双链cDNA（dscDNA）合成体系Table1-4ReagentsfordoublestrandedcDNA(dscDNA)synthesis组分用量（30μL体系）sscDNA20μLRadomPrimerforRT(40uM)0.1μL10×KlenowBuffer3μLdNTPs(10mM)0.2μLKlenowfragment1μLRNase-freeH2O5.7μL利用对应的PCR引物进行单引物扩增，将模板量进行扩大，扩增体系如表1-5。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果，理想的扩增条带应为弥散的抹带。PCR扩增产物进行纯化回收，纯化产物进行电泳条带鉴定，并使用Nanodrop1000核酸蛋白检测仪进行质量检测，达到测序要求的产物即为测序样品。14 表1-5单引物扩增体系Table1-5Reagentsforsingleprimeramplification组分用量（50μL体系）Template（dscDNA）7.5μLAnchoredPrimerforPCR(50μM)2μL2×MasterMix25μLDNase/RNase-freeH2O15.5μL4）测序文库的制备。此部分由华大基因（深圳）测序公司完成，目的是将所有DNA片段打断为300bp左右大小的片段，然后为其添加测序标签及测序接头。5）测序。使用第二代IlluminaHiSeq2500测序，所有测序工作由华大基因（深圳）完成。6）初步测序分析。目的是将测序结果（峰图）转化为核苷酸序列后使用BLASTn与BLASTx在GenBank数据库（版本号：20151121）进行匹配，对测序结果进行注释。注释完成后我们选出了我们关注的脊椎动物病毒进行后续分析。1.2.5病毒宏基因组学数据的后处理及分析完成注释后的宏基因组分析结果会以fasta文件的形式给出。但是由于分析方法精度的限制，分析结果中会有一些非病毒序列（不是病毒序列，却被注释为病毒），所以首先选取不同病毒属的部分序列进行BLASTx搜索，验证序列的真实性，筛除非病毒序列。对筛查过的序列，还需进行后续分析：1）序列拼接。根据reads的注释信息，使用Seqman软件进行序列拼接。2）对拼接完成的contigs进行BLASTn搜索比对，确认得到的contigs的真实性以及其在病毒基因组中的位置，为接下来的引物设计做准备。随后将得到的所有片段使用DNASTAR软件包中的SeqBuilder软件进行基因组mapping。对每种病毒选取了一条contig与相关的参考序列一起使用MEGA7.0软件中的ClustalW方法进行了比对，并使用该软件种的最大似然法及GTR+G+I模型在自展1,000次的条件下，进行了系统进化分析。1.3结果1.3.1样品采集结果如图1.1所示，在2012-2016年，我们在新疆西部边境地区5个地点，阿拉山口市（AL），精河县（JH），伊宁市（YN）和察布查尔县（QA）以及阿克苏市（AK）一共采集了分属于7个科7个属共7种314只啮齿动物。其中乌拉尔田鼠（Apodemusuralensis）16只，褐家鼠（Rattusnorvegicus）51只，大沙鼠（Rhombomysopimus），46只，红尾沙鼠15 （Merioneslibycus）50只，小家鼠（Musmusculus）1只，长尾黄鼠（Urocitellusundulates）100只，普通田鼠（Microtusarvalis）50只。图1.1样品采集信息及其地理分布A为样品采集地点；B为样品采集物种组成FIG1.1Samplinginformationinthisstudy.A:samplinglocations;B:samplecomposition.XJ:XinjiangUyghurAutonomousRegion;AL:AlashankouCity;JH:JingheCounty;YN:YiningCity;QA:QapqalXibeAutonomousCounty;AK:AksuCity.经过形态学及进一步的线粒体细胞色素b的基因鉴定，广西百色的这个山洞中采集到所有蝙蝠都是黑髯墓蝠（Taphozousmelanopogon），是该山洞中这一黑髯墓蝠群落（Colony）的代表。1.3.2啮齿动物病毒宏基因组结果1.3.2.1高通量测序结果314只啮齿动物高通量测序结果显示，去除宿主相关序列后，共得到5,156,956条reads，平均长度为170核苷酸（nucleotide,nt）。其中有7,067条reads（占全部序列的0.14%）直接注释到了病毒序列，分属于24个已知的病毒科和未分类的病毒，包括双链DNA（dsDNA）病毒，双链RNA（dsRNA）病毒，单链DNA（ssDNA）病毒以及单链RNA（ssRNA）病毒。按病毒宿主分，可以分为哺乳动物病毒、节肢动物病毒及噬菌体。测序结果上传了NCBI的短序列文库（ShortReadsArchives，SRA），登陆号为SRP126625。16 图1.2按病毒科划分的啮齿动物病毒宏基因组分析统计结果FIG1.2.Numbersofreadsannotatedtovirusesinrodentclassifiedbyviralgenus,familyandnucleicacidgroup.如图1.2，高通量测序结果显示，注释到双链DNA病毒的序列大多数都比对到噬菌体，如肌尾噬菌体科（Myoviridae）、短尾噬菌体科（Podoviridae）和长尾噬菌体科（Siphoviridae）；及一个植物病毒科，分体病毒科（Partitivirus）。注释到单链DNA病毒的序列比对到两个感染哺乳动物的病毒科：指环病毒科（Anelloviridae）与细小病毒科（Parvoviridae），其中指环病毒只注释到了一个属，甲型细环病毒属（Alphatorquevirus）；17 而细小病毒种类多样，注释到了博卡细小病毒属（Bocaparvovirus）、腺依赖细小病毒属（Dependoparvovirus）以及翼手目细小病毒属（Chapparvovirus）。单链RNA病毒可进一步分为单股正链RNA病毒[(+)ssRNA]、单股负链RNA[(-)ssRNA]病毒及逆转录单链RNA病毒。其中单股正链RNA病毒注释到６个科的节肢动物病毒，比如双顺反子病毒科（Dicistroviridae）及软腐病毒科（Iflaviridae）。而单股负链RNA病毒注释到了４个科病毒，包含两个科的脊椎动物病毒——副粘病毒（Paramyxoviridae）及砂粒病毒（Arenaviridae），以及两个科的节肢动物病毒——总布尼亚病毒科（Peribunyaviridae）和内罗毕病毒科（Nairoviridae）。逆转录单链RNA病毒序列注释到的全部都属于逆转录病毒科（Retroviridae），但是不能确定这些序列是真实的病毒序列还是插入到宿主基因组中的内源性逆转录病毒（Endogenousretrovirus）序列[43]。1.3.2.2病毒序列的拼接及分析为了进一步解析得到的病毒序列，我们选取了节肢动物病毒及脊椎动物病毒：单股负链DNA病毒细小病毒（parvovirus），单股正链DNA病毒双顺反子病毒（dicistrovirus）以及单股负链RNA病毒副粘病毒（paramyxovirus），内罗毕病毒（nairovirus）和总布尼亚病毒（peribunyavirus），对reads进行了序列拼接，将拼接得到的contigs进行序列比对及基因组注释。如图1.3，以GenBank中与这些contigs相似性最高的序列作为参考序列，标注出contigs在基因组中的具体位置（contigs和参考序列的相似度标注在contigs的下面）。进一步选取了最长（>200nt）或者最保守的contigs与参考序列一起，进行了系统进化分析。这些contigs全部上传了GenBank，登录号为MG679360~MG679365和MG685618~MG685655，详细信息见附录A。18 图1.3病毒宏基因组分析得到的重叠群（contigs）在参考序列的分布位置及其与参考序列的系统进化分析FIG1.3.Distributionandtheidentitiesofcontigsagainstreferencesequencesandtheir(filledcircles)preliminarilyphylogeneticrelationshipwithotherrepresentatives.19 细小病毒是宿主范围最广泛及地理分布最广的病毒之一，目前有62种能够感染节肢动物或者脊椎动物的病毒，其中一些细小病毒是重要的兽医临床病原，如猪细小病毒[44]，及犬细小病毒[45,46]。在此次的啮齿动物宏基因组结果中，一共有382条reads注释到了博卡细小病毒，腺依赖细小病毒及翼手目细小病毒。博卡细小病毒样reads来自于AJ组，这些reads拼接成了5条contigs，命名为啮齿动物相关博卡细小病毒[rodent-associatedbocaparvoviruscontigs1-5(RBoVC1-5)]，这些contigs的长度为117-531nt，与分离于水貂粪便的博卡细小病毒isolateZJ08（GenBankaccessionnumber:MF085373）的NS1基因，NP基因及VP1/2基因有76%-82%的核苷酸相似度（图1.3A）。利用一条注释到NS1基因的contig（RBoVC2，长度为332nt）与其他细小病毒代表毒株一起进行了系统进化分析，结果显示RBoVC2与细小病毒isolateZJ08的属于同一进化分支，但是与ICTV认定的偶蹄目博卡细小病毒1型及偶蹄目博卡细小病毒2型[47]均有明显不同的进化关系(图1.3.A)。翼手目细小病毒样序列来自于YQ组，这些reads可以被拼接成一条长度为1,165bp的contig，命名为啮齿动物相关翼手目细小病毒[rodent-associatedchapparvoviruscontig1(RChVC1)];该contig与假吸血蝙蝠细小病毒[Desmodusrotundusparvovirus(DsPV)]的NS基因有着72%的相似度[48]，系统进化显示这两个病毒也在同一进化分支（图1.3.B）。双顺反子病毒是单股正链的RNA病毒，可以感染节肢动物[49]，也有证据表明可能感染啮齿动物[50]。双顺反子病毒样reads来自于YQ组，进一步可以细分为急性麻痹病毒（aparavirus）样序列及蟋蟀麻痹病毒（cripavirus）样序列。急性麻痹病毒样序列拼接后得到了12条contigs，长度为186-2,026nt，命名为啮齿动物相关急性麻痹病毒[rodent-associatedaparaviruscontigs1-12(RApVC1-12)]。序列比对显示这些contigs几乎覆盖了蚂蚁双顺反子病毒1型[Formicaexsectavirus1(FexV)]的全序列[51]，并且与该病毒有87%-94%的相似度（图1.3.C）。基于contig11（RApVC11）进行系统进化分析，显示其与FexV有紧密的进化关系。而蟋蟀麻痹病毒样序列拼接成了一条1,085bp长度序列，与双顺反子病毒的非结构多聚蛋白同源关系较近，命名为啮齿动物相关蟋蟀麻痹病毒[rodent-associateddicistroviruscontigs1(RDVC1)]。系统进化显示该序列与湖北小RNA病毒[Hubeipicorna-likevirus24(HBPV)]有67%的相似度[52]，与蝙蝠蟋蟀麻痹病毒（Batcripavirus,BtCrV,GenBankaccessionnumber:KX644942）及武汉节肢动物病毒2型（Wuhanarthropodvirus,WHAV,GenBankaccessionnumber:KX884287）有着比较紧密的进化关系（图1.3.D）[52]。有31条来自于YQ组的reads注释到了布尼亚病毒目（Bunyavirales），其中15条reads注释到内罗毕病毒科（Nairoviridae），另外16条reads注释到总布尼亚病毒科（Peribunyaviridae）。许多内罗毕病毒为蜱传病毒，如克里米亚刚过出血热病毒（Crimean-Congohemorrhagicfevervirus）[8]和内罗毕绵羊病毒（Nairobisheepdiseasevirus）[53]。如图1.3E这些内罗毕病毒样reads可以被拼接成4条contigs，命名为啮齿动物相关内罗毕病毒[rodent-associatednairoviruscontigs1-4(RNaVC1-4)]。其中RNaVC1-3的长度为158-222nt，20 与Tamdyvirus（TaV）的L片段相似度为95-96%[54]；而RNaVC4与TaV的S片段具有96%的相似度，系统进化也显示RNaV与TaV有着很近的进化关系。总布尼亚病毒目前分为两个属Herbevirus和Orthobunyavirus，感染节肢动物，也可能感染哺乳动物[55,56]。我们得到的总布尼亚病毒样序列拼接得到了两条contigs（如图1.3F），长度分别为158bp和533bp，命名为啮齿动物相关总布尼亚病毒[rodent-associatedperibunyaviruscontigs1-2(RPeVC1-2)]，两条contigs分别与狐狸粪便布尼亚病毒[Foxfecalbunyavirus(FfeV)]的M片段具有75%和67%的相似度[57]。系统进化显示RPeV与FfeV和武汉苍蝇病毒[Wuhanflyvirus(WHFV)]一起形成了一个独立的进化分支[58]，而与其他总布尼亚病毒的成员同源关系较远。副粘病毒中有许多成员可以造成严重的人类或动物疾病，如亨尼帕病毒（henipavirus）和腮腺炎病毒（rubulavirus）[59-61]。如图1.3.F，高通量测序结果显示45条reads注释到北隆病毒[Beilongvirus(BeV)][62,63]，皆来自于AK组，经过拼接后得到了19条长度为83-372bp的contigs，命名为啮齿动物相关基隆病毒[rodent-associatedJeilongviruscontigs1-19(RJVC1-19)]。同源性分析发现这些contigs可以分为两类，一类为RJVC7（324nt），与BeV的M基因有77%的相似度；其余的contigs与BeV的其他基因有97%-100%的相似度，说明可能有重组的现象发生，或者存在两种不同的基隆病毒。使用RJVC7进行系统进化分析，结果显示这条序列与基隆病毒属（Jeilongvirus）的病毒聚集在一起，而与其他属的副粘病毒同源关系较远。1.3.3蝙蝠病毒宏基因组结果广西百色市95只黑髯墓蝠肺脏和肠道样品的高通量测序数据显示，在去除宿主来源序列之后共得了到平均长度为131bp的4,153,763条reads，其中病毒相关的reads为29,129条（约占reads总数的0.7%），共注释到了17个病毒科和一些未分类的病毒，包括脊椎动物、非脊椎动物、真菌和植物来源的双链DNA（dsDNA）病毒、单链DNA（ssDNA）病毒、单链RNA（ssRNA）病毒和双链RNA（dsRNA）病毒。如表所示，其中的dsDNA病毒种类复杂，有哺乳动物来源的腺病毒（Adenoviridae），非脊椎动物来源的虹彩病毒（Iridoviridae）多去氧核糖核酸病毒（Polydnaviridae）和棒状病毒（Baculoviridae），感染原生生物的巨型病毒（Mimiviridae）及感染水藻的藻类去氧核糖核酸病毒（Phycodnaviridae）。ssDNA病毒绝大部分为哺乳动物来源的细小病毒（Parvoviridae），同时也包括少量的哺乳动物来源的指环病毒（Anelloviridae）和圆环病毒（Circoviridae）。ssRNA病毒可以分为三类：单股正链RNA病毒[ssRNA(+)]，单股负链RNA病毒[ssRNA(-)]以及逆转录RNA病毒[ssRNA(RT)]。ssRNA(+)病毒包括哺乳动物来源的黄病毒（Flaviviridae）、杯状病毒（Caliciviridae）和微小核糖核酸病毒（Picornaviridae），以及节肢动物来源的Carmotetraviridae。ssRNA(-)病毒只检测到了单股负链目的副粘病毒21 （Paramyxoviridae）。而检测到的ssRNA(RT)病毒都属于逆转录病毒（Retroviridae）。dsRNA病毒以感染哺乳动物的呼肠孤病毒（Reoviridae）为主，也发现了少量的真菌来源的金色病毒（Chrysoviridae）。表1-6蝙蝠病毒宏基因组分析结果FIG1.2.Resultsofmetanenomicanalysisofbat-bornevirusesGroupViralFamilyViralGenusreadsdsDNAAdenoviridaeMastadenovirus77IridoviridaeIridovirus2Lymphocystivirus14MimiviridaeCafeteriavirus31Mimivirus72PhycodnaviridaeChlorovirus34Prasinovirus30unclassified60PolydnaviridaeBracovirus59BaculoviridaeGammabaculovirus3ssDNAParvoviridaeBocaparvovirus18,241Dependoparvovirus1,887Protoparvovirus2,318Anelloviridaeunclassified38Circoviridaeunclassified5(+)ssRNAFlaviviridaePegivirus44CaliciviridaeNorovirus68Sapovirus4PicornaviridaeEnterovirus26Sapelovirus43Parechovirus57Rosavirus6unclassified69CarmotetraviridaeAlphacarmotetravirus55(-)ssRNAParamyxoviridaeunclassified4dsRNAReoviridaeOrbivirus2,246Rotavirus1,728Orthoreovirus207unclassified132ChrysoviridaeChrysovirus4ssRNA(RT)RetroviridaeAlpharetrovirus48Betaretrovirus591Gammaretrovirus757unclassified55unclassified11422 1.4讨论啮齿动物是全球分布最广泛、数量最多、种类最丰富的哺乳动物，占哺乳动物种类的40%[3]，同时也是许多重要人兽共患病病原的宿主。啮齿动物经常与人类共存于同一栖息地，与人类接触频繁，这极大的增加了将病原传染给人类的可能性。根据2013年的统计数据，已经发现啮齿动物携带有170余种病毒，其中包括对人致命的病毒，比如多种哺乳动物砂粒病毒及汉坦病毒[64]。但是目前针对啮齿动物病毒组的研究还很匮乏，目前只有三篇文献报道了啮齿动物病毒组的研究。Phan等人在2013年开创性的进行了首个啮齿动物病毒组研究，他们在美国共采集了104只家鼠（rat）和田鼠（vole），对其粪便样品进行病毒宏基因组研究，发现了24个科的病毒，圆环病毒（circovirus）丰度最高[50]。随后2014年，Sachenroder等人在德国柏林采集了24只褐家鼠，使用宏基因组学技术筛查了其肠道样品，发现3.1%的序列注释到了34个病毒科的75个病毒属，其中丰度最高的为细小病毒和小双节RNA病毒（picobirnavirus）[65]。在2016年，Hansen等人从马来西亚、中国香港和丹麦采集了26只褐家鼠，对其粪便样品进行了宏病毒组检测，发现大约1.7%RNA和0.015%DNA来源的病毒序列，属于40个科，帚状病毒（virgavirus）和细小病毒的丰度最高[66]。综上，目前针对啮齿动物病毒组的研究有限，物种仅覆盖了3种啮齿动物，且研究对象主要针对褐家鼠，都仅对肠道或粪便样品进行了宏基因组检测。我们的病毒宏基因组研究覆盖了7种野生啮齿动物，除了带有粪便内容物的肠道之外，我们还对实质性组织器官（肺脏、肠道）进行了宏基因组检测。从总体来看，本研究发现了的一些病毒在之前的文献中已有报道，如细小病毒、双顺反子病毒、传染性软腐病毒（iflavirus）和虹彩病毒（iridovirus），但与已知病毒具有出较远的同源关系，提示这些病毒在啮齿动物中的广泛分布与流行；同时在新疆的啮齿动物中新发现了细环病毒、哺乳动物砂粒病毒、正内罗毕病毒和总布尼亚病毒均被认为是节肢动物病毒，这也是正内罗毕病毒和总布尼亚病毒在啮齿动物样品中的首次发现；而另一些病毒则体现出了物种及地区特异性，比如圆环病毒、星状病毒（astrovirus）和腺病毒（adenovirus）在这3篇文献中均存在，但是本研究却未检测到。对片段序列的组装拼接后，我们重点分析了啮齿动物病毒组中的7种哺乳动物或者节肢动物来源的病毒。总体来看，我们检测到的急性麻痹病毒和正内罗毕病毒与已知病毒的相似性大于87%，因此这些病毒可能属于已知病毒的变异株或亚种；而我们发现的博卡细小病毒、翼手目细小病毒、蟋蟀麻痹病毒和总布尼亚病毒与已知病毒的相似性小于82%，应该都属于新的病毒种；另外，我们检测到的副粘病毒与北隆病毒的相似度最高，除了M基因的一条contig只有77%之外，其他绝大多数contigs都为97%~100%，提示可能有两种不同的基隆病毒存在，或者仅有一种病毒，但是M基因发生了重组，虽然副粘病毒的重组在自然界中并不常见[67]。23 从本研究的高通量测序结果来看，对比新疆啮齿动物和广西黑髯墓蝠的病毒宏基因组结果，前者获得的reads总量更多（5,156,956条>4,153,763条），但病毒相关reads的比例（啮齿动物0.14%）低于后者（蝙蝠0.7%）。啮齿动物病毒组获得的病毒科数目（24个科）多于蝙蝠的（17个病毒科），但二者存在共有的病毒科，包括：dsDNA病毒科中的杆状病毒科（Baculoviridae）、虹彩病毒科（Iridoviridae）、Mimiviridae、藻类去氧核糖核酸病毒科（Phycodnaviridae）和Polydnaviridae；ssDNA病毒科中的细小病毒科（Parvoviridae）和细环病毒科（Anelloviridae）；ssRNA(-)病毒科中的副黏病毒科（Paramyxoviridae）；ssRNA(RT)病毒科中的逆转录病毒科（Retroviridae）；且都包含大量未分类的病毒序列。同时，结合已有的研究发现，二者还表现出各自的特有的病毒科，如此批啮齿动物的病毒组中表现出啮齿动物中常有的沙粒病毒科（Arenaviridae）和野田村病毒科（Nodaviridae），而腺病毒科（Adenoviridae）和圆环病毒科（Circoviridae）则是蝙蝠病毒组中经常见到的[42]。另外，二者都包含了大量节肢动物病毒，鉴于我们的宏基因组研究采集了肠道样品，啮齿动物摄食时可能会有节肢动物混入，而黑髯墓蝠则直接以昆虫等为食，因此，极有可能是它们摄入的节肢动物本身所携带的病毒，当然，也有可能这些病毒是来自啮齿动物或蝙蝠本身，二者在这些病毒的传播中的作用未知，需要未来的继续研究。1.5小结1.新疆啮齿动物病毒组共获得5,156,956条reads，其中7,067条病毒reads，占总数的0.14%。其结果注释为24个病毒科，包括dsDNA、dsRNA、ssDNA、ssRNA(-)、ssRNA(+)、ssRNA(RT)，病毒宿主包括哺乳动物、昆虫、植物和细菌；2.新疆啮齿动物携带有副粘病毒、沙粒病毒等对公共卫生具有潜在威胁的病毒；3.新疆啮齿动物携带有多个属的细小病毒且具有丰富的遗传多样性；4.携带有来源与节肢动物相关的病毒，啮齿动物在这些病毒的传播中的作用未知，需要继续研究；5.啮齿动物和蝙蝠的病毒组具有共性与差异性，都是病毒的巨大储存库。24 第二章新型温州砂粒病毒的检测扩增与基因分析高通量测序结果中有沙粒病毒的序列，注释到了WENV。目前亚洲共有3种哺乳动物砂粒病毒的报道：全球广泛分布的LCMV、在我国浙江省及东南亚的柬埔寨发现的WENV以及最近在泰国新发现的LORV。因此，我们首次在亚洲腹地发现了沙粒病毒的存在。为了分析其阳性率、基因组特征及遗传多样性等，在本章的研究中，我们设计了特异性引物对所有啮齿动物样品进行了RT-PCR检测，然后对其全基因组进行了PCR全基因组扩增，并进一步建立了针对该病毒的特异性qRT-PCR检测方法，测定其在阳性褐家鼠各器官中的滴度水平。同时为了跟其他已经发现的哺乳动物砂粒病毒比较发现异同及进化关系，我们对扩增得到的新型温州砂粒病毒的全基因组进行了基因结构注释、PairwiseSequenceComparison（PASC）分析，多序列比较分析和系统进化分析。本研究发现我们扩增的病毒为温州砂粒病毒的一个变种，我们将其命名为温州砂粒病毒察布查尔株（WENV-QARn1）。系统进化分析显示，该病毒形成了一个独立的进化分支。通过多序列比较及系统进化分析我们发现WENV-QARn1与其他温州病毒有着较大的序列差异并且形成了一个独立的进化分支。为了研究旧大陆哺乳动物砂粒病毒特别是亚洲哺乳动物砂粒病毒的进化历史及估算病毒的进化速率，我们选择了核基因，对包括WENV-QARn1在内的目前已经发现的所有旧大陆哺乳动物砂粒病毒进行了贝叶斯系统进化分析。2.1材料2.1.1野生啮齿动物样品RT-PCR检测：所有314只啮齿动物的肺脏及肠道样品。qRT-PCR检测及全基因组扩增：采集于伊犁哈萨克自治州察布查尔锡伯自治县的一只褐家鼠的肺脏、肠道、肝脏及肾脏样品，这些样品经过了RT-PCR检测为新型WENV阳性。2.1.2.病毒检测扩增的实验试剂25 实验步骤试剂名称生产厂商RNA提取RNeasyMiniKitQIAGENRRITaKaRa反转录M-MLVRTaseTaKaRa检测PCR2×MasterMixTIANGEN基因组扩增PhusionMastermix,HFbufferNEBPCR产物胶回收Axygen检测片段连接载体pMD18-TvectorTaKaRa高保真酶片段连接载体LethalBasedFastCloningKitTIANGEN转化E.coliDH5αcompetentcellTIANGENqRT-PCRExTaqhotstartversionTaKaRa2.1.3实验仪器仪器名称生产厂商型号核酸自动提取工作站德国QiagenQiacube台式低温高速离心机德国Eppendorf5804R全自动快速研磨仪上海净信Tissuelyser-FEIII核酸蛋白检测仪美国ThermoFisherNanodrop1000全自动PCR仪美国ABI2720荧光定量PCR仪StratageneMx3000P琼脂糖凝胶电泳仪北京TanonEPS300紫外凝胶成像系统美国UVtecFireReader蓝光切胶仪北京天根Tiangreen恒温摇床哈尔滨东联HZQ-1602.1.4生物信息学数据PASC分析、多序列比较及最大似然法系统进化分析：测序得到的温州砂粒病毒变异株WENV-QARn1的全基因组序列，L片段的GenBank登陆号为KY662262，S片段的基因登陆号为KY662263。GenBank中下载的参考序列的详细信息见附录C。26 旧大陆哺乳动物砂粒病毒的进化历史分析：测序得到的温州砂粒病毒变异株WENV-QARn1的核基因所在的S片段，登陆号为KY662263，采集时间为2016年。GenBank中下载的参考序列登录号，采集时间等详细信息见附录D。2.1.5生物信息学软件软件功能软件名称软件网址或版本序列比对搜索BLASThttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi查找序列的开放阅读ORFfinderhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder框多序列比较，基因图DNASTARVersion6.71绘制等综合功能全基因组水平多序列PASChttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/pasc/viridty.cgi比较多序列比较，最大似MEGAVersion7.0然法系统进化分析RNA二级结构预测Mfoldhttp://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold贝叶斯系统进化分析BEAST2Version2.0贝叶斯系统进化分析BEAUtiBEAST2软件包前处理碱基替代模型的计算bModelTestBEAST3软件包分子钟及群体模型的PathSamplerBEAST4软件包计算贝叶斯系统进化数据TracerVersion1.5查看与总结贝叶斯系统进化分析LogCombinerBEAST4软件包后处理进化树的总结与注释TreeAnnotatorBEAST5软件包进化树的可视化FigTreeVersion1.3.12.2方法2.2.1新型砂粒病毒的RT-PCR检测引物设计：根据病毒宏基因组分析得到的砂粒病毒的contigs序列，本研究设计了针对其L（RdRp）基因的特异性套式PCR引物，目标片段为318nt（引物序列见附录B）。样品的PCR检测：取适量啮齿动物样品进行研磨，12,000rpm进行离心，使用RNeasyMinikit试剂盒分别提取上清液的RNA，并使用1stcDNAsynthesiskit试剂盒进行了反转录（体系见表2-1）。然后使用PCRmastermix进行了PCR检测，详细体系见表2-2。PCR27 的扩增条件为：94°C预变性3min；（94°C变性30s，51°C（外套）或者48°C（内套）退火30s，72°C延伸40s），进行30个循环（外套）或者35个循环（内套）之后72°C延伸7min。每批检测都对内外套PCR分别设置了一个以ddH2O代替模板的阴性对照。表2-1反转录体系Table2-1ReagentsforqRT-PCRreversetranscription组分用量（50μL体系）RNA31μLRadomPrimerforRT(40uM)3μLOligodT1μL5×M-MLVBuffer10μLdNTPs(10mM)3μLRRI(40U/μL)1μLM-MLV(200U/μL)1μL表2-2RT-PCR检测体系Table2-2ReagentsforRT-PCRviralscreening组分用量（25μL体系）PCRmastermix12.5μL模板cDNA100ng上游引物1μL（10mM）下游引物1μL（10mM）ddH2O补足至25μL扩增片段的克隆与测序鉴定：得到的阳性扩增产物进行切胶回收和纯化，然后连接到pMD18-T载体，之后转染E.coliDH5α感受态细胞，涂布平板后37°C培养约12h。待细菌生长至合适大小即每一个扩增样品挑取6个克隆，37°C摇菌培养。约8~12h后，对菌液进行PCR鉴定，阳性PCR产物送至测序公司进行Sanger测序。2.2.2新型砂粒病毒的全基因组扩增根据拼接完成的contigs及其他哺乳动物砂粒病毒的基因组序列，本研究设计了多对特异性引物，使用高保真酶对全基因组进行了分段扩增，扩增体系见表2-3。所有扩增片段都连接到了pLB载体上进行克隆，之后再测序，以确保得到高质量的测序结果。28 表2-3基因组PCR扩增体系Table2-3Reagentsforgenomesequencing组分用量（25μL体系）PhusionMastermix,HFbuffer12.5μL模板cDNA100ng上游引物1μL（10mM）下游引物1μL（10mM）ddH2O补足至25μL2.2.3新型砂粒病毒的两步法TaqmanqRT-PCR检测方法的建立检测引物的设计：砂粒病毒有L和S两个RNA节段，但是在病毒粒子中，两个节段的比例不是一个定值，L：S的比值大约为1：2。并且在病毒粒子中，还会存在一些极低含量的L和S片段的互补RNA链[14,68]。L片段主要编码的L（RdRp）基因，编码病毒复制所必须的RNA聚合酶，是砂粒病毒最保守的基因，容易区分不同砂粒病毒种；而且不同的WENV毒株在L基因上又有一定的变异差异，可用来进一步区分不同毒株。综合考虑了检测的实用性和可行性，我们选定了L片段上的L基因作为qRT-PCR的目标片段。将WENV目前已知的WENV温州株、柬埔寨株及检测得到毒株的L片段使用MEGA7.0种进行多序列比对，发现2,500~3,000bp区域最为保守。在这个区域内，我们使用PrimerPremier5软件设计了多对引物，综合考虑了退火温度，Taqman探针引物的位置及BLASTn特异性搜索结果等多种因素，最终选择了一对扩增引物及一个Taqman探针引物的序列，目标片段大小为190bp（引物序列见附录B）。标准模板制备：以阳性样品的cDNA为模板，使用引物L2278-Qapqal-R和L2504-Qapqal-F（引物序列见附录B）在高保真酶体系下（Mastermix,HFbuffer,NEB）扩增302bp的L基因片段。然后将该片段连接到pLB载体，新进行转化挑菌并测序确认，随后提取质粒并测得其浓度，梯度10倍倍比稀释作为qRT-PCR的标准模板，以实现定量检测。两步法TaqmanqRT-PCR的条件优化：基于本实验室已经建立起来的qRT-PCR体系，对引物及探针的使用量进行了优化。首先固定了探针的使用量，对引物（10mM）的使用量进行了三个体积（0.3μL、0.5μL及1μL）的实验对比最终确定的引物使用量为0.5μL，详细体系见表2-4。2.2.4野生啮齿动物样品的qRT-PCR检测每份组织样品剪取并准确称量50mg，用500μL1×PBS研磨，10,000g离心10min，取100μL研磨液上清进行总RNA提取洗脱31μL，洗脱得到RNA全部用来进行反转29 录，得到50μLcDNA（反转录体系见表1-1），然后进行qPCR检测（体系见表2-4）。表2-4qPCR体系Table2-4ReagentsforqPCR组分用量（25μL体系）cDNA2μLExTaqhotstartversion1.25μL10×ExTaqbuffer2.5μLdNTP（2.5mM）2μLddH2O15.85μL上游引物1μL（10mM）下游引物1μL（10mM）Probe0.5μL（5mM）2.2.5基因组结构注释温州砂粒病毒变异株的基因组结构预测使用了ORFfinder软件预测所有可能的ORF。为更准确的预测其ORF，进一步与已知的哺乳动物砂粒病毒的代表物种进行了比对比较，对预测得到的ORF进行二次比对。RNA的二级结构预测使用了Mfold软件。2.2.6PASC分析PairwiseSequenceComparison（PASC）是一个基于GenBank病毒数据库的一种全基因组水平的在线多序列比较软件。该软件是ICTV砂粒病毒工作小组推荐的对砂粒病毒进行物种划分的重要参考数据。使用该软件只需要将L和S两个节段的全基因组上传至云端，使用默认参数进行比较，得到的结果也可直接在线查看。2.2.7多序列比较新型温州砂粒病毒的多序列比较使用了目前已经发现的33种哺乳动物砂粒病毒以及所有的WENV的变异株的L和S节段全基因组，以及RdRp、Z、NP以及GPC四个基因的核苷酸及氨基酸序列使用DNASTAR软件包中集成的MegAlign软件的ClustalW算法进行序列比对和多序列比较。2.2.8最大似然法系统进化分析新型温州砂粒病毒的最大似然法系统进化分析同样使用了目前已经发现的33种哺乳动物砂粒病毒以及所有的WENV的变异株的序列。由于砂粒病毒存在基因重组的现象。30 多个病毒物种之间并不能使用全基因组进行系统进化分析。所以只使用了RdRp，Z，NP以及GPC四个基因的开放阅读框的核苷酸序列进行了系统进化分析。每种基因使用了MEGA7.0软件，首先使用ClustalW算法进行序列比对，然后使用GTR+G+I（generaltimereversiblemodelwithgammadistributionandinvariantsites）模型，在1,000自展值的条件下，使用最大似然法进行了系统进化分析。2.2.9贝叶斯系统进化数据的搜集整理为了研究旧大陆哺乳动物砂粒病毒的碱基替换速率及分化时间，本研究在GenBank上查找并下载了61个旧大陆哺乳动物砂粒病毒的核基因（NP）的序列，覆盖了全部旧大陆砂粒病毒的代表物种。同时通过GenBank及文献查找，将这些病毒的原始样品的采集时间进行了整理，时间跨度从1933年到2016年共83年（详细见附录D）。首先使用MEGA7.0软件的MUSCLE（codons）算法进行了多序列比较，重新命名为能被BEAUti软件识别的名称，包括毒株名称、发现时间及发现地点的，接着导出为FASTA格式。2.2.10贝叶斯系统进化模型的选择与比较贝叶斯系统进化使用了基于马尔科夫蒙特卡洛（MarkovchainMonteCarlo,MCMC）算法的BEAST2软件包。BEAST2集成多种软件，总的来看，BEAST2软件包主要包括四类软件：1）贝叶斯系统进化分析前处理软件。即BEAUti软件，该软件的功能为识别FASTA文件，选择进化模型及其他参数，最终生成能被BEAST软件识别的XML文件；2）贝叶斯系统进化分析软件。即BEAST软件，是BEAST2软件包的核心软件。该软件只能识别BEAUti软件生成的XML文件并使用MCMC算法进行计算输出记录（Log）文件和进化树（Trees）文件；3）贝叶斯系统进化分析后处理软件。Log文件和Trees文件是计算得到的原始数据，需要进一步总结整理并可视化。这一步骤有多个软件，如Tracer，LogCombiner、TreeAnnotator以及FigTree。4）模型选择软件。这一部分用的到软件在BEAST2软件包中并不直接集成，需要下载扩展包进行安装。这部分软件得到的数据是填写BEAUti参数的重要依据。用到的软件有bModelTest和PathSampler这两个软件。首先我们将第一步得到的FASTA文件导入BEAUti，使用bModelTest进行碱基替代模型的选择。在计算得到的最佳的碱基替代模型确定的情况下，BEAUti生成多种分子钟模型和群体模型的组合，生成XML文件，使用PathSampler对每种组合进行独立的估计似然值（estimatedlikelihood）计算，估计似然值可以用来比较不同模型组合与导入数据的契合程度，从而选择出最适合的分子钟模型和群体模型的组合。接着在使用最优的碱基替代模型、分子钟模型和群体模型的组合的条件下，使用BEAUti重新生成XML文件。由于MCMC的算法的特点及计算机的运算速度的限制原因，我们生成XML文件的计算链长为100万次，取样频率为每10,000次MCMC计算取一次31 样。同时为了得到最佳的数据，我们对该XML文件进行了8个重复的MCMC计算。2.2.11贝叶斯系统进化结果的总结及可视化八次独立运算得到的所有Log文件和Trees使用LogCombiner去除了前15%的MCMC运算数据，并且以每20,000次重新进行了取样。重新生成的Log文件使用Tracer查看其有效样本量（ESS），以保证所有参数的ESS值都大于200，具有统计学意义。而重新得到的Trees文件则使用了TreeAnnotator软件，在舍弃前10%的MCMC计算数据后，总结生成了一个最大的分支的可信度（Maximumcladecredibility,MCC）系统进化树。该MCC树最后使用FigTree进行了可视化及美化处理。2.3结果2.3.1野生啮齿动物新型哺乳动物砂粒病毒的检测结果病毒宏基因组结果中一共有29条reads注释到了哺乳动物砂粒病毒，并且全部来自于YQ组。将这些reads进一步拼接成了6条长度为119~398nt的contigs，其中有4条与WENV的L（RdRp）基因具有75%~85%的核苷酸相似度，另外两条与WENV的N基因具有79%~83%的核苷酸相似度（见图2.3）。根据这些病毒宏基因组检测到的序列，本研究设计了一套套式PCR引物对所有样品进行了检测筛查，外套目标片段为544nt，内套目标片段为318nt。最终在采集于伊犁哈萨克自治州察布查尔锡伯族自治县的一只褐家鼠中检测到了沙粒病毒，其肺脏、肠道、肝脏及肾脏样品使均为阳性（如图2.1A）。将四个脏器的阳性片段连接载体并测序后发现所有的544nt扩增产物都相同，故将该株病毒命名为温州哺乳动物砂粒病毒察布查尔褐家鼠分离株1（WenzhoumammarenavirusisolateQapqalRattusnorvegicus1，WENV-QARn1）。图2.1新型哺乳动物砂粒病毒的检测（A）为RT-PCR检测结果，片段大小为544bp；（B）为qRT-PCR检测结果FIG2.1ViralscreeningwithRT-PCRandqRT-PCR(A):RT-PCR;(B):qRT-PCR32 2.3.2温州砂粒病毒察布查尔株的全基因组扩增为了得到温州砂粒病毒察布查尔株WENV-QARn1的全基因组序列，我们使用了阳性肺脏的cDNA作为模板，设计了多对特异性引物进行了分段PCR扩增。最终成功得到了该病毒的全序列并上传至GenBank数据库，WENV-QARn1的全基因组序列的L片段的GenBank登陆号为KY662262，S片段的为KY662263。2.3.3温州砂粒病毒察布查尔株两步法TaqmanqRT-PCR的条件优化结果我们对qRT-PCR的引物使用量进行了比较及优化（图2.2C），最终使用的体系见表2-4，扩增曲线及标准曲线见图2.2A。图2.2qRT-PCR的方法建立AqRT-PCR扩增曲线；B：qRT-PCR标准曲线；C：三种不同体积引物的qRT-PCR结果FIG2.2DevelopmentqRT-PCRmethods(A):Amplicationplot;(B):Standardcurve;(C):Primerswithdifferentvolumes2.3.4温州砂粒病毒察布查尔株野生啮齿动物样品的qRT-PCR检测结果采集于察布查尔县的这只野生褐家鼠的肺脏，肠道，肝脏及肾脏均有相同的高达每毫33 克105病毒cDNA拷贝数的病毒滴度，见图2.1B。2.3.5温州砂粒病毒察布查尔株的基因组结构注释新获得的WENV-QARn1与WENV的其他毒株相比较（如浙江的Rn242株及柬埔寨的CardamonesvirusC649株），基因结构比较类似。QARn1株的全基因组由7,164nt的L节段与3,343nt的S节段组成。如图2.3A，两条节段的5’末端分别有一段长度为57nt和52nt的非编码区（UTR），同时在3’末端分别有一段长度为33nt和47nt的UTR。5’和3’末端的UTR反向互补，为RNA聚合酶的启动子位点。L和S节段分别编码两个基因，在两个基因之间各有一段基因间非编码区域（noncodingintergenicregion，IGR），根据RNA二级结构的预测两个IGR均能形成稳定的发卡结构，这一结构能帮助RNA聚合酶脱离病毒RNA。QARn1的L节段的IGR长度为109nt，比其他WENV的IGR都长（~98nt）。该IGR将L节段分割成了两个开放阅读框（ORF），即编码小基质蛋白的276nt长的锌指蛋白（RINGfingerprotein，Zprotein）基因，以及编码RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRp）的长度为6,686nt的L基因。S节段的IGR的长度为62nt，连接了编码核蛋白的长度为1,703nt的N（nucleoprotein）基因，以及编码糖蛋白前体的长度为1,478nt的GPC（glycoproteinprecursor）基因。34 图2.3温州病毒察布查尔株（QARn1）的基因组结构（A）及其ORF系统进化分析，（B）为Z基因，（C）为RdRp基因，（D）为GPC基因，（E）为NP基因35 FIG2.3Genomicstructure(A)andphylogeneticrelationshipsofWENV-QARn1basedonORFsZ(B),RdRp(C),GPC(D)andNP(E).QARn1isidentifiedbyacircleandboldfont,andtheexclusivelyAsianstrainsareindicatedwithingrayboxes.2.3.6温州砂粒病毒察布查尔株的PASC分析及多序列比较从基因组水平来看，PASC分析得出数据见表2-5。可以看到QARn1的L节段与温州病毒温州株有着最高84.1%的相似度，而其S节段与温州病毒柬埔寨株具有最高86.3%的相似度。表2-5WENV-QARn1的PASC分析总结Table2-5SummaryofPASCanalysisofWENV-QARn1QARn1排名相似度（nt）登录号病毒种或毒株名称184.10%KM386661WenzhoumammarenavirusL节段(7,164nt)283.96%KC669691Cardamonesvirus383.92%KC669690Cardamonesvirus186.34%KC669694CardamonesvirusS节段(3,343nt)285.88%KC669696Cardamonesvirus385.77%NC_026018Wenzhoumammarenavirus从基因水平来看，QARn1与WENV其他变种的最高相似度为80.8%，与LORV的相似度为64.8%到76.9%的相似度，与其他旧大陆哺乳动物砂粒病毒，如LASV和LCMV的相似度见表2-6。2.3.7温州砂粒病毒察布查尔株的系统进化分析我们为了确定WENV-QARn1的与其他砂粒病毒的系统进化关系，基于RdRp，Z，N和GPC这4个基因的完整的ORF使用最大似然法做了系统进化分析。如图2.3B、C、D、E，总的来看，这4个基因的系统进化树都形成了相似的拓扑结构：都形成了两个大的进化分支，即旧大陆群和新大陆群；QARn1和温州病毒温州株（WENVvariantsRn242）、温州病毒柬埔寨株（WENVvariantsC649）月以及LORV形成了亚洲独特型分支（Asia-exclusivecluster），我们将其命名为亚洲进化支（Asianlineage）。在这个亚洲进化支之中，QARn1与其他WENV一起形成了一个进化支，且该株病毒相对独立。36 表2-6WENV-QARn1与其他哺乳动物砂粒并的核苷酸和氨基酸相似度（%）比较*Table2-6Nucleotideandaminoacidsequenceidentities(%)betweenQARn1andotherselectedmammarenavirusesSegment/ORFnt/aaWENVCardamonesLORVLASVIPPYVLUNVMOPVMOBVMRLVOKAVLUJVLCMVLsegmentnt84.284.465.556.265.557.65756.355.356.352.453.6RdRpORFnt84.484.264.856.957.157.25757.353.455.151.651.6aa89.789.866.953.455.4545454.149.151.84547.5ZORFnt80.886.970.459.955.657.551.559.75567.456.243.8aa94.292.375.563.659.660.852.655.958.365.752.620.2Ssegmentnt86.186.871.666.56867.666.367.166.464.158.762.3NPORFnt86.186.97067.868.868.969.867.667.365.759.962.6aa95.195.179.772.473.974.175.17474.370.36165.4GPCORFnt86.385.970.568.564.366.765.566.165.462.75460.3aa92.593.479.675.368.773.370.47469.665.347.657.5*所有使用的参考序列的病毒名称及登录号见附录C37 2.3.8旧大陆哺乳动物砂粒病毒的进化历史研究为了研究旧大陆哺乳动物砂粒病毒的碱基替换速率及病毒分化时间，本研究使用了包括WENV-QARn1在内的61条N基因的完整ORF进行了贝叶斯推断系统进化分析（Bayesianinferenceinphylogeny）。我们计算比对了6种不同的模型组合，最终计算得出最适合的碱基替代模型为GTR+G+I模型，最佳的分子钟模型及群体模型组合为指数分布松弛分子钟（Relaxedclockexponential）与指数分布合祖群体模型（Coalescentexponentialpopulation）。该组合的估计似然值为-44,207。其他模型组合估计似然值见表2-7。表2-7使用Pathsampler软件计算得出的不同分子钟和群体模型的估计似然值Table2-7MarginallikelihoodestimatesbetweendifferentclockandpopulationmodelsbyPathsampler.Marginallikelihood分子钟模型群体模型estimaterelaxedclocklognormalcoalescentexponentialpopulation-44220relaxedclocklognormalcoalescentBayesianSkyline-44221relaxedclockexponentialcoalescentexponentialpopulation-44207relaxedclockexponentialcoalescentBayesianSkyline-44207Strictclockcoalescentexponentialpopulation-44235StrictclockcoalescentBayesianSkyline-44235如图2.4，我们使用了tip-age（即病毒发现的时间）为基础的进化分析。通过该计算估计的旧大陆哺乳动物砂粒病毒的平均进化速率是1.493×10-3个替换/每个位点/每年，这个计算结果的95%最高后验密度（Highestposteriordensity,HPD）是0.49×10-3到2.54×10-3。值得注意的是我们使用的是非相关性的指数分布松弛分子钟（Uncorrelatedexponentialrelaxedmolecularclock），所以实际每个分支具不同的进化速率，而且这些进化速率还符合某个参数下的指数分布。本研究得出的进化速率比比其他研究得出的旧大陆哺乳动物砂粒病毒的进化速率（5.1×10-4）要稍快，比计算得出的LCMV的进化速率（L节段为3.7×10-4，S节段为3.3×10-4）也稍快一些。以此碱基替换速率结合系统发生树显示所有旧大陆哺乳动物砂粒病毒的最近共同祖先（themostrecentcommonancestor，tMRCA）出现在1,190年前（yearsbeforepresent，ybp），其95%HPD为337~2,406ybp，该节点的后验概率（Posteriorprobability,PP）为100%。亚洲独特型分支的最近共同祖先出现在737年前，该节点的后验概率为48%。所有温州砂粒病毒的最近共同祖先出现在123年前，其95%HPD为23~282ybp，该节点的后验概率为100%。QARn1与温州病毒温州株的最近共同祖先出现在103年前，95%HPD为16~188ybp，该节点的后验概率为51%.38 图2.4旧大陆哺乳动物砂粒病毒核基因的贝叶斯系统进化分析FIG2.4BayesiananalysisofcompleteCDSofNPgenesuggeststhatWENVQARn1(inbold)divergedin103yearsbeforepresent(ybp).Asia-exclusivestrainsareindicatedingrayboxes.Numbersattachedtothebranchesshowthemeaninferreddivergencetime,theposteriorprobabilityofthebranch(inparentheses)andthe95%HPD(inbrackets).LCMV(woldwilde)WENVQARn1WENVWenzhouisolateWENV-likesequencesWENVCardemonesisolateLORVLASVLPPYVGAIVMOPVLUKVLUNVLUJVSOLVMOBVMRLVOKAVMEWV图2.5旧大陆哺乳动物砂粒病毒代表株的地理分布FIG2.5Representationmapofoldworldmammarenaviruses39 2.4讨论2.4.1新型温州砂粒病毒的检测与全基因组的扩增本研究成功扩增得到了温州砂粒病毒察布查尔株的全基因组序列，为之后的基因分析及病毒分离提供了基础数据。同时我们针对该病毒建立了有效的特异性的RT-PCR及qRT-PCR检测方法。这些检测方法一方面是之后针对该株毒进行病毒学研究的重要工具，同时另一方面，该检测方法可以今后用作该病毒的诊断检测工具。RT-PCR和qRT-PCR对于野生大鼠检测结果显示该大鼠的肺脏、肠道、肝脏和肾脏有每毫克大约105个病毒拷贝数，说明野生大鼠感染该病毒是全身性、系统性的。2.4.2新型温州砂粒病毒的多序列比较及系统进化分析目前共发现的33种哺乳动物砂粒病毒之中，许多种都可以感染人类，引发出血热症状甚至引起死亡，这些病毒大多发现于非洲和美洲，而鲜有亚洲相关的报道。根据最新的ICTV分类标准，不同种砂粒病毒的核苷酸相似度的cut-off值分别为80%（S节段）和76%（L节段）[11]，而且QARn1与其他温州砂粒病毒的宿主都为褐家鼠，因此本研究检测并发现的QARn1病毒是温州砂粒病毒的一个新型变异株。QARn1的发现增加了温州砂粒病毒的多样性，目前温州砂粒病毒不同变异株之间的L片段的核苷酸差异度达到了15%，S片段达到了13%。而同样的基因差异也在LASV[69]和LCMV[70]上存在。QARn1的发现极大的扩展了温州砂粒病毒的分布范围。而总体来看，除了LCMV之外，由于自然宿主地理分布范围的限制，其他旧大陆哺乳动物砂粒病毒都集中在有限的地理空间内。而一种哺乳动物砂粒病毒只能被一种甚至某一亚种的啮齿动物携带[71]。这些特性都决定了哺乳动物砂粒病毒并不能进行广泛的传播。LCMV的自然宿主为小家鼠，因为小家鼠为全球分布，所以LCMV也随之遍布全球[15]；而温州病毒的自然宿主是褐家鼠，是比小家鼠分布更广泛的啮齿动物物种，而且群体数量巨大，因此我们推测温州砂粒病毒也是一种全球分布、或者能够全球分布的砂粒病毒。更重要的是，已经有核酸和血清学证据显示温州砂粒病毒在东南亚可以造成人类的感染[18]，该病毒急需深入研究。2.4.3旧大陆哺乳动物砂粒病毒的进化历史研究虽然砂粒病毒目前没有发现病毒-宿主共进化的现象，但是有一点毋庸置疑，那就是砂粒病毒具有很强的宿主特异性[33,34]。新大陆哺乳动物砂粒病毒大多由棉鼠亚科（Sigmodontinae）的啮齿动物携带，根据其基因特点可以分为4个亚群；而旧大陆哺乳动物砂粒病毒大多由真鼠亚科（Murinae）的啮齿动物携带，只有一个进化群，说明旧大陆哺乳动物砂粒病毒在进化过程中有宿主转换（host-switching）的现象出现[11]。对于爬行动物砂粒病毒，其进化历史更为复杂，基因的重组和重排现象均有发生[21-24]。我们使用N基因来进行进化速率计算的原因主要有两个原因：1）虽然有研究发现砂40 粒病毒有重组的现象存在，但是除了GPC基因之外，这些重组都是发生在基因之间的，没有发生在基因内部，所以我们确定N基因之间没有重组现象发生，适合进行系统进化分析。2）N基因位于S片段，而S片段也是相比L片段来说更容易扩增，所以GenBank之中的S片段的序列数量是最多的。我们下载了GenBank之中的所有的旧大陆哺乳动物砂粒病毒的S片段，一共有295条，其中LASV有216条，LCMV有37条，MOPV有32条。虽然LASV有大量的序列片段，但是大部分片段都是不完整的或者是高度相似的片段。同样的情况也出现在其他病毒序列上。我们进过筛查和文献查找，选出了61条具有80年时间跨度的具有代表性的序列，使用该序列进行了系统进化分析。我们的贝叶斯推断系统进化分析有几个问题需要解释：1)我们只计算了N基因的进化速率，并没有使用其他基因，所以我们得出的进化速率严格来说只是针对N基因的，不能代表病毒的进化速率。砂粒病毒一共有4个基因，除了Z基因序列太短，N基因、GPC基因和RdRp基因都可以用来进行进化速率估算。但是旧大陆哺乳动物砂粒病毒的N基因、GPC基因和RdRp基因的拓扑结构有着明显的差异（图2.3），表明这三个基因具有不一样的进化历史，本研究中我们只选取了N基因进行深入分析。2)我们的计算出的砂粒病毒的进化速率较之前研究的速率稍快。因为我们使用了合祖指数分布群体动态模型（Coalescentexponentialpopulation）。这个模型表示在一定时间尺度之内，该基因的复制增值是呈指数分布的。如果选用了这个模型，估算的进化速率就会比普通的非指数增值模型计算出的进化速率要快。3)同时我们也发现我们的估算形成的MCC树的个别节点的后验值不高（约0.5），表示该节点的拓扑结构的可信度不高。这个并不是我们的计算错误，而是因为我们选择了参数更多更复杂的模型，模型越复杂参数越多，想通过计算得到比较高的后验值的可能性就越小。我们也使用最大似然法（MEGA7.0）和贝叶斯推断法（MrBayes3.2）对该数据进了系统进化树的重建，不同方法对这几个低后验值的节点可信度的支持是不同的，同时不同方法得到的系统进化树的拓扑结构也有一定差异。这些结果表明针对这些序列构建的系统进化树的拓扑结构是有争议的。最终我们还是选择了BEAST软件构建的使用了最佳模型的MCC树。我们认为这个MCC树是对该组数据构建的最好的树。4)通过计算，我们选取目前这个复杂的多参数的模型，这个模型组合的似然值是最低的，即这个组合是最符合我们序列数据的组合。5)目前计算病毒进化速率的方法有两种。第一种是使用tip-age的方法，选取的是不同时间点采集到的有着明显差异的病毒序列。这个方法一般只针对RNA病毒，或者是在复制阶段需要RNA参与的DNA病毒（逆转录病毒），因为RNA聚合酶容错率比较高，容易产生突变。而DNA病毒由于使用宿主的DNA复制酶，变异速率比较低，在有限的时间内并不能观测到有效的基因变异，并不能使用这种方法。第二种方法就是使用node-age的方法。使用这个方法的前提就是病毒必须具有宿主共进化的现象，即病毒不跨物种传播[72]。砂粒病毒的进化历史比较复杂，目前的研究来看砂粒病毒并没有宿主共进化的现象，所有我们使用方法一是最好的选择。但是值得注意的是，41 如果今后发现了砂粒病毒与其宿主共进化的证据，那我们这个计算结果需要在理论层面重新评估。6)虽然tip-age的方法是目前研究RNA病毒进化速率的主流方法，但是也有研究指出这个方法有这一定的理论缺陷。一个著名的例子就是将目前发现的RNA病毒的RdRp基因计算进化速率，会发现这个进化速率会是大约10-3个替换/每个位点/每年，所有RNA病毒的最近共同祖先出现的时间大约是5万年前左右。这个估算结果是不符合我们的常识的[25]。虽然我们使用了目前最佳的方法，对我们旧大陆哺乳动物砂粒病毒进化速率的估算应该持一个怀疑的眼光。哺乳动物砂粒病毒有可能跟其他RNA病毒比如汉坦病毒和冠状病毒一样，具有一个时间跨度更长的进化历史[73,74]。2.5小结1.成功扩增得到了温州砂粒病毒察布查尔株的全基因组序列；2.成功建立起了针对温州砂粒病毒察布查尔株的RT-PCR及qRT-PCR的检测方法；3.阳性野生大鼠系统性感染了温州砂粒病毒察布查尔株；4.首次在亚洲腹地发现沙粒病毒，并极大的扩展了温州砂粒病毒的分布范围：不仅在华南地区（亚热带）和东南亚（热带）也在中亚（温带大陆性）分布。提示温州病毒具有广泛的地理分布；5.全基因组分析发现QARn1是WENV的变异株，系统进化分析显示WENV具有地区特异性，不同地区的毒株能形成独立的进化分支；6.进过计算旧大陆哺乳动物砂粒病毒的核基因平均进化速率为1.493×10-3个替换/每个位点/每年；所有旧大陆沙粒病毒的最近共同祖先出现在1,190年前左右；亚洲沙粒病毒的最近共同祖先出现在737年前左右；温州砂粒病毒的最近共同祖先出现在123年前左右；7.分子钟分析显示QARn1与其他WENV在123（23-282）年前分化，提示WENV有一定的地域进化特性。42 第三章新型温州砂粒病毒的分离与致病性研究为了进一步了解察布查尔温州病毒变异株的生物学特性，我们使用了实验动物进行病毒分离。由于察布查尔株是在褐家鼠（Rattusnorvegicus）上发现的，所以我们使用了SD大鼠（褐家鼠的白化种）进行病毒分离。分离砂粒病毒最常用的的方法是使用细胞系进行分离，Vero-E6和MDCK是本实验室常用的细胞系。而BHK-21（仓鼠肾细胞）是最常用的啮齿动物来源的细胞系。WENV首次分离是使用的DH82（犬巨噬细胞）进行分离。所以我们选用了Vero-E6、MDCK、BHK-21及DH82四种细胞系进行病毒分离。由于在实验大鼠分离QARn1的过程中发现了该病毒感染实验大鼠能造成大鼠系统性的感染及一定的肺脏病理变化，于是更进一步的使用SD大鼠进行了系统性的新型温州砂粒病毒的啮齿动物致病性实验，对大鼠产生的病理变化进行详细的观察和分析。同时为了对啮齿动物感染病毒的规律进行研究，我们原核表达了QARn1的核蛋白，建立了以此为基础的特异性检测QARn1的IgG抗体的ELISA和WB方法。哺乳动物砂粒病毒有着较严格的宿主嗜性，一种砂粒病毒一般只有一种啮齿动物作为自然宿主。这些宿主与人类接触后，将病毒跨物种传播给人类。一些哺乳动物砂粒病毒也可以发生除了人以外的跨宿主传播事件。如LCMV，小家鼠是其自然宿主，但是也有报道LCMV可以感染仓鼠，感染后的仓鼠又作为中间宿主将病毒传播给人类，造成人类感染。为了鉴定QARn1的跨宿主感染能力，我们选取了三种常用的实验动物：小家鼠、仓鼠及豚鼠进行接毒实验。3.1材料3.1.1待分离病毒样品所有特异性RT-PCR检测为阳性，并对扩增产物进行测序确认的原始样品都可以作为病毒分离的原始样品。阳性组织样品有肺脏、肠道、肝脏、肾脏四种组织。我们首先对四种组织分别研磨，过滤除菌，提取RNA后进行了qRT-PCR检测，经过检测后发现其中的病毒含量没有明显差别，都为105个病毒拷贝数每毫克。接着又对RNA反转录之后的cDNA样品使用LA-taq体系进行PCR病毒长链扩增（目标片段L，片段大小2,000bp），只有肺脏来源的cDNA样品可以成功扩增出长链片段。所以病毒动物分离中，我们只使用了肺脏原始样品。而使用细胞分离时，考虑到肠道样品的生物学复杂性，我们使用了肺脏，肝脏和肾脏三种组织进行病毒细胞分离。3.1.2新型温州砂粒病毒的致病性实验及跨宿主传播评估实验接毒组织样品43 病毒样品为第一代实验大鼠接毒后第7天采集的肺脏样品。肺脏样品每50mg用500μLMEM在低温条件（使用Onmi研磨仪，液氮降温）下进行研磨。待组织块被完全碾碎后收集研磨液。研磨液在低温离心机中4℃条件下10,000×g离心10min。使用一次性注射器小心吸取上清液，然后用0.22μL滤器进行过滤，使用新的EP管收集并分装过滤液，每管分装300μL、200μL或者100μL在-80℃冰箱进行保存待用。选取一份200μL分装样品进行qRT-PCR检测，确定其中的病毒拷贝数为105个每微升研磨液。3.1.3主要试剂实验步骤试剂名称生产厂商RNA提取RNeasyMiniKitQIAGEN反转录RRITaKaRaM-MLVRTaseTaKaRa检测PCR2×MasterMixTIANGEN基因组扩增Mastermix,HFbufferNEB检测片段连接载体pMD18-TvectorTaKaRaqRT-PCRExTaqhotstartversionTaKaRaMinimumessentialmediumCorningDulbecco'sModifiedEagleMediumCorning细胞培养胎牛血清CorningL-谷氨酰胺GibcoPenicillin-StreptomycinSolutionGibco动物实验速眠灵（盐酸赛拉嗪注射液）吉林华牧动保限制性内切酶BamHI/XhoINEBT4DNA连接酶TaKaRapET28a（+）质粒Invitrogen丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）SolarBio蛋白的原核表达与纯化卡那霉素（Kanamycin,Kan）SolarBio尿素（Urea）PromegaNi-NTAHis-BindResinsMilliporeE.coliBL-21(DE3)感受态细胞TIANGEN脱脂奶粉PromegaNa2CO3北京化工厂NaHCO3北京化工厂Na2HPO4·12H2O北京化工厂ELISA双氧水（H2O2）北京化工厂浓硫酸北京化工厂盐酸北京化工厂NaOH北京化工厂邻苯二胺（OPD）Sigma柠檬酸Sigma44 预染彩虹245kDa蛋白MarkerNEB蛋白上样缓冲液（5×Loadingbuffer）NEB十二烷基硫酸钠（SDS）SolarBio30%丙烯酰胺北京鼎国昌盛考马斯亮蓝R-250SigmaSDS-PAGE与WB过硫酸铵SigmaTEMEDSigma丙烯酰胺Sigma甘氨酸Sigma加厚型滤纸BIO-RAD硝酸纤维素膜（NC膜）德国GE鼠源抗His-Tag抗体（Anti-6XHistagSantaCruzantibody,Mousemonoclonal）红外标记的驴抗小鼠IgG（Alexafluor680ThermoFisher特异性二抗scientificdonkeyanti-mouseIgG）HRP标记的蛋白A和蛋白G北京博奥森HRP标记的山羊抗大鼠IgGperoxidase-Beyotimelabeledgoatanti-ratIgG(H+L)3.1.4使用仪器仪器名称生产厂商型号振荡器哈尔滨东联HZQ-R荧光定量PCR仪StratageneMx3000P摇摆平台摇床美国BIO-RADUltraRocker透射电子显微镜日本HitachiH-7650台式低温高速离心机德国Eppendorf5804R双色红外激光成像系统美国LI-COROdyssey手压式薄膜封口机浙江永康喜尚SF200/300/400生物安全柜美国Thermo1287-A2全自动快速研磨仪上海净信Tissuelyser-FEIII全自动PCR仪美国ABI2720核酸自动提取工作站德国QiagenQiacube核酸蛋白检测仪美国ThermoFisherNanodrop1000高端凝胶成像系统日本FujifilmLAS-4000多功能酶标仪日本TecanINFINITEM200独立通风鼠笼系统Tecniplast2ISO36定轨摇床海门其林贝尔TS-1000蛋白电泳系统美国BIO-RADUPS超声裂解仪美国MisonixS-4000CO2培养箱美国Thermo311145 3.1.5实验动物及细胞系名称供应商Vero-E6实验室保存MDCK实验室保存BHK-21实验室保存DH82中国疾病预防中心李鲲老师赠送SPF青年雌性大鼠吉林大学实验动物中心SPF青年雌性豚鼠吉林大学实验动物中心SPF青年雌性金黄地鼠吉林大学实验动物中心SPF青年雌性小鼠吉林大学实验动物中心3.2方法3.2.1病毒分离样品的准备与检测将检测为QARn1阳性的肺脏、肾脏及肝脏样品，每个样品剪取大约500mg样品用5mLMEM研磨，研磨液在冰上预冷。12,000×g离心5分钟，取上清用0.22μm滤器过滤除菌。分装每管600μL，并留200μL左右滤液用作之后提核酸检测。样品滤液使用之前建立的qRT-PCR进行检测定量。3.2.2病毒的细胞分离图3.1病毒分离的实验设计（A）细胞系分离；（B）实验大鼠分离FIG3.1Experimentdesignforvirusisolation(A)invitro;(B)invivo(rats)46 由于砂粒病毒对人有着潜在的致病性，病毒分离使用了Vero-E6、MDCK、BHK-21及DH82四种细胞系，所有细胞都培养在37℃的CO2培养箱中。病毒分离时细胞系皆使用高浓度胎牛血清（8%~10%）的培养基进行传代，接毒后用低浓度胎牛血清（2%）的培养基进行维持。由于实验室细胞株的特性，每种细胞的培养基有稍有不同：Vero-E6和MDCK的培养基基础液为DMEM，胎牛血清浓度8%（维持培养基为2%），双抗浓度1%；BHK-21的培养基基础液为MEM，胎牛血清浓度8%（维持培养基为2%），双抗浓度1%，另加了2%的谷氨酰胺溶液；DH82的培养基基础液为DMEM，胎牛血清浓度10%（维持培养基为2%），双抗浓度1%。如图3.1A，接毒时每种细胞按照合理密度铺一个六孔板，每个六孔板铺四个孔，12到24小时后观察细胞密度，在细胞密度为75%~85%时进行病毒接种，分别接种肺脏、肝脏、肾脏三种滤液。在接种病毒之前使用双无MEM清洗细胞两遍，分别接入病毒滤液600μL，同时留有一个阴性对照（研磨液）。接毒后在37℃温箱孵育，每半小时稍微摇晃一下细胞板，1.5h孵育结束。之后吸出病毒液后收集在离心管中，标记后存于-80℃冰箱保存备用。然后细胞用双无MEM清洗两遍，之后加入维持液继续放37℃温箱培养14天。培养期间，每天早晚各在光学显微镜下观察一次细胞，看是否有细胞病变（CPE）或其他异常产生，同时观察细胞培养液颜色判断其pH的变化，适时使用低浓度氢氧化钠溶液进行微调，保持其中性状态。若观察到CPE产生，则进行拍照记录，并收毒；若无CPE产生，则在14天之后收六孔板。反复冻融三次后收取细胞液，离心取上清液传下一轮。无CPE则进行五轮盲传。3.2.3病毒的实验大鼠分离如图3.1B，本研究在具有独立通风系统的饲养笼中，使用了8只SPF雌性SD大鼠（包括2只阴性对照）用来进行QARn1的实验动物病毒分离。每只大鼠腹腔注射了300μL组织滤液（阴性对照注射300μLMEM）。大鼠接毒一共进行了28天，每天固定观察两次，在接毒后7、14、21、28天（d.p.i.）分批对大鼠进行处死，详细分组见图3.1B。处死前使用了速眠灵（军事兽医研究所研制）将其进行麻醉，以减少痛苦，注射量1ml/只。腹主动脉采血，血液在37℃放置1h后于4℃静止过夜，低速离心后取血清。另取肺脏、肝脏、肠道、脾脏，肾脏和脑组织，接着对血清和组织使用第二章建立的qRT-PCR方法进行QARn1病毒的定量检测3.2.4病毒的第二次细胞分离由于在第一次的细胞系病毒分离没有成功，我们使用了实验大鼠的带毒血清（病毒滴度为106个病毒拷贝数每微升）为接毒样品，使用Vero-E6、MDCK、BHK-21及DH82四种细胞系进行了又一轮的病毒分离，方法同前。47 3.2.5病毒的电镜观察为了确认病毒的分离及观察病毒粒子，我们对实验大鼠的血清样品（病毒滴度为106个病毒拷贝数每微升）直接进行了负染透射电镜观察：取5mL血清在4℃条件下12,000*g离心30min，对得到的沉淀使用100μLPBS进行重悬，然后将将铜网覆盖在样本液滴上，孵育1min，用滤纸吸干后使用磷钨酸染色液对铜网上的样品进行染色，孵育30s，接着用滤纸吸干待检铜网，透射电镜下进行观察。另外对实验大鼠肺脏样品（病毒滴度为105个病毒拷贝数每毫克）制作了组织超薄切片，然后染色进行透射电镜观察：新鲜的肺脏组织样品在采集之后，使用刀片切出多个直径为2毫mm左右的立方体，立即使用2.5%戊二醛固定液4℃固定2h；然后用PBS清洗样本两次，加入1%锇酸固定液，4℃固定2小时；之后再用PBS清洗样本两次，然后依次使用50%、70%、90%及100%的丙酮在4℃条件下脱水，接着进行树脂室温浸透过夜及高温聚合。切片制作时使用莱卡切片机切片，切片厚度为100nm。最后使用醋酸双氧铀染色15min，柠檬酸铅染色10min，干燥后使用透射电镜进行观察。3.2.6新型温州砂粒病毒重组核蛋白的表达与纯化为了对QARn1感染的实验动物进行血清学的研究，我们原核表达并纯化了QARn1的核蛋白，目的以此为基础建立特异性检测QARn1的IgG抗体的ELISA和WB方法。首先我们使用了原始的大鼠肺脏样品的cDNA作为模板，扩增QARn1核衣壳蛋白（Nucleocapsideprotein,NP）基因完整开放阅读框，引物的5’端添加BamHⅠ酶切位点，3’端添加XhoⅠ的酶切位点。引物序列及酶切位点见附录B。利用高保真PCR酶扩增得到带酶切位点的NP基因序列，连接到pLB平末端载体上，然后使用BamHⅠ和XhoⅠ两种限制性内切酶对其进行双酶切，得到带有酶切粘性末端的NP基因片段。将同样经过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的pET28a(+)质粒（图3.6A）与该片段一起使用T4连接酶连接为重组质粒。测序确认序列无突变。然后将该质粒转换进入BL-21(DE3)大肠杆菌进行蛋白表达，由于插入的核基因片段的C端具有His标签，所以最终得到的重组核蛋白带有His标签。表3-1双酶切体系Table3-1Reagentsforrestrictionenzymedigestion组分用量/μLDNA1μgBamHⅠ(2,000U/μL)1XhoⅠ(2,000U/μL)1CutSmartbuffer(10×)3ddH2O2448 表3-2rNP酶连体系Table3-2ReagentsforrNPligation组分用量/μLpET-28a(+)1DNAx*T4Ligase(1000U/μL)1LigaseBuffer(10×)1ddH2O补足到10μL*载体和目的片段的质量比一般取1:3，目的片段的最佳用量需根据公式进行计算：目的片段的用量m=3×载体长度/目的片段长度×载体质量，然后除以目的片段胶回收产物的浓度，即可得到其最佳用量。重组核衣壳蛋白（Recombinantnucleocapsideprotein,rNP）基因的原核表达首先使用了1mM的IPTG浓度诱导表达8h，每2h取一次样。菌液在超声裂解之后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE鉴定。在确定了最佳的诱导时间后，我们梯度稀释了IPTG，进行最佳IPTG诱导浓度的摸索，进行摸索的IPTG浓度为0、0.1、0.25、0.5和1mM。最终得到最优的IPTG诱导浓度和诱导时间。大规模摇菌后使用镍树脂（Ni-NTAHis-BindResins）进行蛋白纯化。Ni-NTAHis-BindResins是一种金属螯合层析柱，可以对含有His标签的蛋白质实现一步法纯化。填料使用次氮基三乙酸（Nitriloaceticacid,NTA）作为螯合剂，该螯合剂具有4个金属离子结合位点。具有His标签的蛋白在与含有Ni2+阳离子的填料共同孵育后，可以与之结合并固定在填料上。在洗去不与Ni2+结合的蛋白后，带His标签的蛋白又可以使用洗脱液洗脱出来，从而实现了His标签蛋白的纯化。该镍树脂不仅能对大肠杆菌表达的可溶性重组蛋白进行纯化，还可以对包涵体形式表达的重组蛋白进行纯化。因为大部分包涵体形式表达的蛋白都可以溶于去垢剂或者变性剂里（如8M尿素），而His标签并不依赖于蛋白质的三级结构而存在，所以即使在变性条件下，His标签可以被正常识别。蛋白的纯化按照说明书进行，使用了A、B、C、D、E、F、G和H共8种洗涤液，及I洗脱液依次进行洗涤或洗脱，为了更多的得到洗脱产物，最后一步的I洗脱进行了6次，分别标记为I1~I6。洗脱得到的纯化rNP在SDS-PAGE及His抗体WB检测后进行下一步的实验。小鼠抗His标签的一抗稀释倍数为500，远红外680标记的山羊抗小鼠的二抗的稀释倍数为1,000。3.2.7新型温州砂粒病毒特异性IgG-WB及IgG-ELISA检测方法的建立由于目标检测的血清样品都来自于SPF实验动物，IgG检测的有效性是该方法建立的重点。实验使用的阳性对照为病毒分离时21d.p.i.的一只大鼠血清，阴性对照为一只阴性49 大鼠的血清。IgG-WB和IgG-ELISA需要摸索的主要为蛋白上样量/包被量，一抗浓度及二抗浓度。IgG-WB为定性实验，蛋白上样量综合了纯化后rNP的浓度因素及经验上样量。一抗浓度及二抗浓度也使用了经验值。经验值经实验验证后确定为最终的实验条件。IgG-WB方法为1）170ng纯化后的rNP与蛋白缓冲液一起混合均匀后在沸水浴中加热2min使得蛋白变性；2）将变性蛋白（上样量为10μL）使用10%的SDS-PAGE分离；3）将分离胶上的蛋白转移到NC膜上；4）使用5%的脱脂奶粉进行封闭；6）一抗孵育，一抗（需检测的血清）的稀释倍数为200倍，使用5%脱脂奶粉进行稀释；7）二抗孵育，根据一抗的物种来源，使用的二抗有三种，HRP标记的山羊抗大鼠二抗（用来检测大鼠血清），HRP标记的SPA/SPG（用来检测豚鼠与仓鼠血清），远红外680标记的山羊抗小鼠二抗（用来检测小鼠血清），这些二抗的稀释倍数都为1,000倍；8）WB扫描使用了两种仪器，一种为检测化学发光的凝胶成像系统，在加入底物之后，我们使用该仪器扫描HRP标记的二抗，另一种为双色红外激光成像系统，我们使用此系统直接扫描远红外680标记的二抗。IgG-ELISA为定量实验，我们使用了棋盘法对蛋白包被量，一抗浓度及二抗浓度进行了系统性的优化。如图3.6A，进行摸索的rNP的包被量为30、60、120及240ng/孔；进行摸索的一抗稀释倍数为50、100及200倍；进行摸索的二抗稀释倍数为500倍及1,000倍。IgG-ELISA的方法为：1）使用包被液将rNP以60ng/孔的量包被在96孔板上；2）使用5%的脱脂奶粉在37℃封闭1h；3）一抗37℃孵育1h，一抗的稀释倍数为1:100；4）使用0.05%吐温浓度的PBS（PBST）进行洗涤3次；5）二抗37℃孵育50min，二抗的稀释倍数为1:1000，使用的二抗为HRP标记的山羊抗大鼠二抗；6）加入显色底物OPD进行显色，接着使用2M的硫酸溶液终止显色；7）使用酶标仪在492nm和630nm进行双波长检测，检测值的计算公式为OD样品=OD492-OD630。3.2.8新型温州砂粒病毒的致病性实验及跨宿主传播评估实验病毒样品的准备F1代阳性的实验大鼠肺脏组织研磨液在过滤除菌，提取RNA后进行了qRT-PCR检测，病毒拷贝数为105个每毫克。该研磨液进行分装后在-80冰箱保存3.2.9新型温州砂粒病毒实验大鼠致病性实验如图3.2A，实验大鼠致病性实验使用了12只青年SD大鼠进行接毒实验，每只大鼠腹腔注射F1代肺脏研磨液300μL，另有2只SD大鼠腹腔注射300μLMEM作为阴性对照。接毒的12只大鼠被每组3只分为4组，每一组接毒大鼠分别在7、14、21和28d.p.i.进行处死。每只大鼠在处死之前使用腹腔静脉采血，解剖后的大鼠进行了仔细的检查，对有肉眼可见病变的大鼠组织进行了拍照，取样制作了组织切片。同时也采集了每只大鼠的50 肺脏、肠道、肝脏、肾脏、脾脏、脑组织及血清样品进行qRT-PCR的检测。其中第四组3只大鼠（计划在28d.p.i.处死）使用尾静脉采血的方法在接毒后0、3、5、7、9、11、13、15、17、20、24和28天共12个时间点采集血液，并对析出的血清进行了qRT-PCR病原学检测，同时也对血清样品使用IgG-WB和IgG-ELISA进行了血清学的检测。组织切片制作前，先将组织切成了2mm左右厚度的薄片，然后使用10%福尔马林固定。固定一周之后使用石蜡包埋然后切片，使用苏木精和伊红（Hematoxylinandeosin，HE）进行染色。得到的切片样品进行显微镜观察，并使用了尼康电子成像系统（DS-FI2system）进行了拍照。图3.2QARn1的啮齿动物致病性实验（A）及跨宿主传播评估（B）的实验设计FIG3.2Experimentdesignfor(A)andpathogenesisstudiesand(B)interspeciesinfectionassessment3.2.10豚鼠，金黄地鼠及小鼠的跨宿主传播实验如图2.2B，QARn1啮齿动物跨宿主传播实验使用了SPF等级的青年豚鼠4只，金黄地鼠8只，小家鼠（昆明鼠）8只。由于实验动物的体积差异，不同的啮齿动物注射了不同量的F1代研磨液，豚鼠600μL/只，金黄地鼠200μL/只，小鼠100μL/只。同时阴性对照注射同样体积的MEM。接毒后的啮齿动物每天两次进行仔细的观察。接毒后的啮齿动物分为三批分别在7、14和21d.p.i.进行处死。在处死之前使用心脏穿刺的方法进行血液采集，解剖后对组织器官进行仔细的检查，并采集每啮齿动物的肺脏、肠道、肝脏、肾脏、脾脏、脑组织。采集的组织样品与析出的血清都进行了qRT-PCR的检测。血清样品使用了IgG-WB进行了特异性抗体检测。51 3.3结果3.3.1病毒的细胞分离BHK-21、Vero-E6、MDCK及DH82细胞在接毒后均无明显变化，无明显CPE产生。四种接毒细胞的五代接毒样品均使用了特异性的qRT-PCR进行了QARn1病毒检测，所有样品均为阴性，无病毒检出，病毒的细胞分离失败。3.3.2病毒的实验动物分离接毒后的大鼠在为期28天的观察期内无明显临床症状产生。接毒后第7天处死了两只接种阳性样品的大鼠，观察到肺脏有白色斑块，其他脏器未观察到明显变化。接毒后第14天处死两只接种阳性样品的大鼠，两只肺部均有点状出血，肺部整体发白，局部有血块；同时观察到脾脏肿大。接毒后第21天处死一只接种阳性样品的大鼠，肺部均有点状出血，肺部整体发白，局部有血块；脾脏大小正常，无明显外观变化；盲肠布满血丝，出现肿大的现象。接毒后第28天处死了最后一只接毒大鼠，肺部存在颜色较深的出血点；左侧卵巢出现水泡。我们对所有采集的血清及大鼠样品进行了qRT-PCR的检测，发现所有接毒后的大鼠至少都有一个组织器官为阳性（图3.4）。按时间上来看，接毒后第七天的大鼠呈全身系统性的感染状态，同时有病毒血症出现（图3.3），其中有一只接毒后第7天的大鼠的血清样品的病毒滴度为106个病毒拷贝数每微升，肺脏的病毒滴度为105个病毒拷贝数每毫克。这一结果表明我们使用实验大鼠成功分离到了病毒。图3.3实验大鼠血清样品的qRT-PCR检测结果FIG3.3qRT-PCRresultsforseraofinfectedexperimentrats52 图3.4实验大鼠组织样品的qRT-PCR检测结果FIG3.4qRT-PCRresultsfororgansofinfectedexperimentrats53 3.3.3病毒的透射电镜观察如图3.5A，在大鼠血清样品中，使用透射电镜成功观察到了QARn1的病毒粒子：直径大约为120nm，具有明显的囊膜结构，囊膜表面看到长度大约5nm的纤突。如图3.5B，而大鼠肺脏的超薄切片中，看到了疑似的砂粒病毒粒子存在于肺脏细胞间隙之中，能看到这些疑似的病毒粒子表面具有一些小黑点样的砂粒状物质。图3.5QARn1的病毒粒子观察（箭头）（A）血清样品，标尺为200nm；（B）肺脏超薄切片，标尺为1μmFIG3.5MorphologicalobservationofWENV-QARn1virions(arrowed).(A)Serum;(B)ultrathinsectionoflung3.3.4重组QARn1核衣壳蛋白的表达，纯化及ELISA和WB方法建立结果54 图3.6rNP的原核表达及蛋白纯化的（A）技术路线，（B）双酶切结果，（C）诱导时间摸索的蛋白SDS-PAGE，（D）IPTG浓度摸索的蛋白SDS-PAGE，（E）镍树脂纯化蛋白的洗脱液的SDS-PAGE及（F）纯化后蛋白的His特异性抗体WB检测结果FIG3.6ProkaryoticexpressionandpurificationofrNP(A)technologicalroute;(B)resultsforrestrictionenzymedigestion;(C)SDS-PAGEforrNPexpressingwithdifferenttimes;(D)SDS-PAGEforrNPexpressingwithdifferentIPTGvolume;(E)SDS-PAGEforrNPpurification;(F)WBforHis-taggedrNP55 如图3.6C，在6小时和8小时的沉淀中存在大约66kDa的差异条带，该蛋白即为rNP，为包涵体形式表达。为了进一步优化rNP的表达，我们在8h的诱导条件下摸索了蛋白表达的IPTG浓度，如图3.6D，在IPTG浓度为0.25mM的条件下，rNP表达量最高，蛋白依旧以包涵体形式存在于菌液沉淀中。最终以0.25mM的IPTG浓度，8h的诱导时间进行了rNP的大量表达，裂解后收集沉淀，使用镍树脂（Ni-NTAHis-BindResins）进行rNP的纯化。如图3.6E所示，在I1、I2和I3洗脱液中，洗脱得到了比较纯净的rNP。我们将三个洗脱液进行混合，得到了最终的纯化蛋白，经检测浓度为0.02mg/μL。将得到的蛋白使用His标签抗体进行了WB检测，如图，纯化过的rNP在His的WB中大小为66kDa，无非特异性条带，蛋白纯化成功（图3.6F）。使用该纯化蛋白可以进行IgG-WB及IgG-ELISA检测方法的建立。图3.7(A)IgG-ELISA的棋盘法检测结果;(B)IgG-ELISA的实验设计FIG3.7(A)ResultsforpunnettsquareofIgG-ELISA;(B)ExperimentdesigningforIgG-ELISAIgG-WB最终确定使用的rNP上样量为170ng/孔，一抗稀释倍数为200，二抗稀释倍数为1,000。IgG-ELISA使用了棋盘法来确定最佳的试剂比例。如图3.7A，经过棋盘法实验计算得出P/N值之后进行对比，发现在60ng包被量，一抗稀释倍数100，二抗稀释倍数为1,000的条件下，P/N值最大。以此为依据，IgG-ELISA最终确定的rNP的包被量为60ng，一抗稀释倍数100，二抗稀释倍数为1,000。为了更准确的进行检测，进行ELISA时的孔的分布设计如图3.7B，每个样品有3个技术重复，每个板有三个阳性对照孔及三个阴性对照孔。为了避免污染，所有96孔板的最外侧一圈作为空白对照不进行样品检测。56 3.3.5新型温州砂粒病毒实验大鼠致病性实验结果图3.8QARn1感染大鼠的大体解剖及病理切片图，大鼠在接毒后第7、14、21和28天进行解剖，具有病变的肺脏和胸腺样品进行了拍照和病理切片制作（200倍显示）；红色箭头指示出血点；黄色箭头指示炎性细胞浸润FIG3.8MacroscopicandhistologicalfindingsinWENV-QARn1-infectedratsat7d.p.i.,14d.p.i.,21d.p.i.and28d.p.i.aswellasPBS-inoculatedmockcontrol.Grossexaminationofthorax,lungandthymustissuesarerespectivelyshown.Inparallel,sectionsoflungandthymustissuesareshownwithhaematoxylin–eosinstainingafterfixationin10%formalin,andobservedby200×bydigitalsight.redarrow:bleedingregionbyhistopathologicalexamination;yellowarrow:inflammatorycellinfiltration.腹腔接毒的12大鼠在处死前都无明显临床症状，如图3.8，处死后解剖观察到了每只接毒大鼠的肺脏和胸腺都有较明显的出血点，而其他器官均没有发现明显病变。经过HE染色切片可以看出出血病变从7d.p.i.开始出现，14和21d.p.i.的大鼠的肺脏病变相对来说更严重，能看到明显的淤血和炎性细胞浸润的现象。28d.p.i.的炎性细胞更多但是淤血有一定的减少现象。胸腺的出血虽然也肉眼可见，但是的出血相对肺脏来看较轻，病理切片检查可以看到淤血和炎性细胞浸润的情况。组织qRT-PCR的结果显示接毒大鼠至少有一个组织器官可以检出病毒。虽然病毒感染没有显示出明显的组织嗜性，组织器官的病毒量是逐渐减少的，病毒拷贝数最高的样品57 为7d.p.i.的肺脏样品，病毒拷贝数为每毫克106个。图3.9QARn1感染的三只大鼠（R10、R11和R12）的血清样品的（A）qRT-PCR检测；（B）IgG-ELISA检测和（C）IgG-WB检测结果FIG3.9IgGtestsandquantificationofviremiaofWENV-QARn1infectedrats.SDratswereintraperitoneallyinoculatedwithPBS(mockcontrol)orWENV-QARn1.Attheindicatedtimepoints,serawereharvestedfromthreeratindividuals(markedasR10,R11andR12).AllseraweretestedbyqRT-PCR(A),IgGenzyme-linkedimmunosorbentassay(B)andIgGWesternbolt(C).为了检测接毒大鼠的血清感染的动态曲线，如图3.9A，我们对3只接毒大鼠（分别标记为R10，R11，R12）的多时间点采集的血清进行了qRT-PCR、IgG-WB及IgG-ELISA检测。连续采集的血清qRT-PCR显示大鼠接毒后从3到5d.p.i.开始出现病毒血症，在5到7d.p.i.时候达到峰值，病毒拷贝数高达每微升103到105个。之后病毒血症消失。3.9B，对应的IgG-ELISA检测显示特异性的IgG在7d.p.i.开始出现（ELISA检测的58 P/N值大于2.1），在15d.p.i.左右达到了平台值，P/N值维持在10左右。同样图3.9C对应的gG-WB显示，最早从9d.p.i.的血清样品酒检测到了特异性的IgG，在此后的观察期内，都能持续检测到IgG。3.3.6新型温州砂粒病毒豚鼠，金黄地鼠及小鼠的跨宿主传播实验结果图3.10QARn1豚鼠，金黄地鼠及小鼠接毒后第21天的血清的IgG-WB检测结果FIG3.10resultsforIgG-WBof21d.p.i.suraofWENV-QARn1infectedguineapig,hamsterandmouse接毒的豚鼠，金黄地鼠及小鼠在21天的观察期内均无明显症状。所有的组织脏器均未检出病毒。如图3.10，抗体检测方面除了21d.p.i.的豚鼠有阳性反应，其余IgG-WB的检测均为阴性。3.4讨论3.4.1新型温州砂粒病毒的分离与鉴定本研究使用了四种细胞系和一种实验动物进行QARn1的病毒分离，但是细胞分离没有成功，而通过实验大鼠成功分离到了该病毒。值得注意的是，温州砂粒病毒温州株分离时使用的是DH82细胞系[18]，我们也使用了该细胞系，但是却没有分离成功。两轮的细胞分离证明这些细胞系都不能培养QARn1病毒，进一步说明QARn1可能在生物学特性上与温州病毒有一定的差异。但遗憾的是，实验材料的限制，我们没有使用大鼠和大鼠原代的细胞系进行病毒的分离。大鼠接毒后可以观察到明显的肺脏出血病变，我们在接下来的实验中重新进行了系统的分析。大鼠感染后在第7天出现了病毒血症，但是在其他天数的血清中没有检测到，但是组织脏器中却能持续地检出病毒，初步推测病毒感染该大鼠会出现一个短期的急性感染，然后病毒从血液中消失，转为慢性感染储存在组织器官中。同时，未发现QARn1的组织嗜性。59 从接毒大鼠血清中，我们成功的在电镜下观察到了QARn1的大小形态一致的病毒粒子，但是由于砂粒病毒为囊膜病毒，容易与细胞中的其他有膜组织进行混淆，肺脏的超薄切片并未很确定的看到病毒粒子。3.4.2新型温州砂粒病毒的致病性实验SD大鼠是褐家鼠的白化种。大多数哺乳动物砂粒病毒能够造成其宿主的持续感染（有时也能表现为长期的病毒血症）但是却同时又表现为无症状状态，说明这些病毒能与其宿主和平共处。但是同时，也有少部分哺乳动物砂粒病毒能造成宿主的体型减小、体重减轻甚至可以影响宿主的死亡率[75,76]。我们的流行病学研究及致病性实验显示褐家鼠（R.norvegicus）是温州砂粒病毒的自然宿主，主要体现为以下几个原因：1）QARn1在野生褐家鼠的不同脏器上都检测到了大约每毫克105个病毒的拷贝数，说明了该大鼠为自然的、全身性的感染了该病毒；2）QARn1感染实验大鼠仅造成了比较轻的感染症状；3）QARn1感染实验大鼠虽然只造成大约持续15天的病毒血症，但是病毒在28天的观察期内持续存在于组织器官内，说明病毒可以造成大鼠的持续性感染；4）QARn1特异性的IgG在接毒后15到20左右达到了平台值，同时IgG的上升伴随了病毒血症的下降，最终清除了血液中的病毒，但是组织器官中病毒却持续存在，在28天的观察期中并未清除掉器官中的病毒。提示该抗体并不能有效的清除病毒，造成了大鼠的持续性感染。3.4.3新型温州砂粒病毒的跨宿主传播评估虽然温州砂粒病毒已经在多种啮齿动物（R.norvegicus,R.exulans,R.flavipectus,R.rattus,R.loseaandNiviventerniviventer）和一种鼩鼱（Suncusmurinus）上检测到[17,18,77]，但是我们的啮齿动物跨宿主传播实验表明QARn1并不能感染豚鼠、金黄地鼠和小家鼠，提示该病毒有较强的宿主嗜性，同时我们的细胞分离实验也从侧面证明了这一点。同时我们的实验结果显示QARn1感染小鼠和金黄地鼠不能引发病毒的复制，甚至也不能引起宿主的特异性体液免疫反应。而QARn1的特异性抗体能在豚鼠上检测到，说明该病毒能引起豚鼠的体液免疫反应，但是不能造成豚鼠的系统性感染。3.5小结1.成功使用实验大鼠分离到了QARn1病毒，在透射电镜下具有典型的沙粒病毒形态，直径大约120nm，有囊膜，囊膜表面能看到长度大约5nm的纤突；2.褐家鼠是温州砂粒病毒的自然宿主，感染该病毒后虽然不表现明显临床症状，但对器官能造成不同程度的组织损伤；3.啮齿动物跨种传播实验表明该病毒不能感染小鼠，仓鼠、豚鼠，表明该病毒在啮齿动物中具有较强的宿主特异性。褐家鼠和人类生活有着密切的联系，温州砂粒病毒已经在东南亚病人体内检出。该病毒对人类的致病性尚不明确，但是由于其广泛的分布及宿主特性，具有重要的公共卫生学意义，需要长期监测。60 结论1.新疆啮齿动物携带病毒种类丰富，除了沙粒病毒，副粘病毒之外，还携带有多种细小病毒及节肢动物相关的RNA病毒，提示需要重新评估啮齿动物在病毒传播中的作用；2.成功使用实验大鼠分离到一株新的哺乳动物砂粒病毒QARn1，全基因分析发现该病毒是温州砂粒病毒的一个新型变异株，分子钟分析显示该病毒与其他温州砂粒病毒在123年前左右分化，提示温州砂粒病毒有一定的地域进化特性；3.温州病毒已经在亚洲广泛分布，褐家鼠感染该病毒症状较轻，且可以长时间带毒，证明了褐家鼠是其重要的自然宿主；4.褐家鼠和人类生活有着密切的联系，且温州病毒已经在病人体内检出。该病毒对人类的致病性尚不明确，但是由于其广泛的分布及宿主特性，具有重要的公共卫生学意义，需要长期监测。61 参考文献[1]JonesKE,PatelNG,LevyMA,etal.Globaltrendsinemerginginfectiousdiseases[J].Nature,2008,451(7181):990-3.[2]BordesF,BlasdellK,MorandS.Transmissionecologyofrodent-bornediseases:newfrontiers[J].IntegrZool,2015,10(5):424-35.[3]MillsJN.Biodiversitylossandemerginginfectiousdisease:anexamplefromtherodent-bornehemorrhagicfevers[J].Biodiversity,2006,7(1):9-17.[4]Guzalnur·Z,Mahmut·H,Omar·A,etal.ComparisonoftherodentspeciescompositionbetweenKyrgyzstanandXinjiang,China[J].GanHanQuZiYuanYuHuanJing,2014,28(6):94-8.[5]GuoR,ShenS,ZhangY,etal.AnewstrainofCrimean-CongohemorrhagicfevervirusisolatedfromXinjiang,China[J].VirolSin,2017,32(1):80-8.[6]SunS,DaiX,AishanM,etal.EpidemiologyandphylogeneticanalysisofCrimean-CongohemorrhagicfevervirusesinXinjiang,China[J].JClinMicrobiol,2009,47(8):2536-43.[7]ZhangYZ,XiaoDL,WangY,etal.TheepidemiccharacteristicsandpreventivemeasuresofhemorrhagicfeverwithsyndromesinChina[J].ZhonghuaLiuXingBingXueZaZhi,2004,25(6):466-9.[8]Yu-ChenY,Ling-XiongK,LingL,etal.CharacteristicsofCrimean-Congohemorrhagicfevervirus(Xinjiangstrain)inChina[J].AmJTropMedHyg,1985,34(6):1179-82.[9]LiY,CuiY,HauckY,etal.GenotypingandphylogeneticanalysisofYersiniapestisbyMLVA:insightsintotheworldwideexpansionofCentralAsiaplaguefoci[J].PLoSOne,2009,4(6):e6000.[10]WolfeND,DunavanCP,DiamondJ.Originsofmajorhumaninfectiousdiseases[J].Nature,2007,447(7142):279-83.[11]RadoshitzkySR,BàoY,BuchmeierMJ,etal.Past,present,andfutureofarenavirustaxonomy[J].ArchVirol,2015,160(7):1851-74.[12]McCormickJB,WebbPA,KrebsJW,etal.Aprospectivestudyoftheepidemiologyand62 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ParamyxoviridaeJeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig1RJV-C1216MG685636Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig2RJV-C2123MG685637Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig3RJV-C3285MG685638Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig4RJV-C4200MG685639Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig5RJV-C5176MG685640Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig6RJV-C6168MG685641Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig7RJV-C7309MG685642Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig8RJV-C8108MG685643Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig9RJV-C9162MG685644Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig10RJV-C10372MG685645Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig11RJV-C11153MG685646Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig12RJV-C12168MG685647Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig13RJV-C13137MG685648Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig14RJV-C14186MG685649Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig15RJV-C15149MG685650Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig16RJV-C16208MG685651Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig17RJV-C17108MG685652Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig18RJV-C18252MG685653Jeilongvirusrodent-associatedjeilongviruscontig19RJV-C19255MG68565469 附录B论文中使用到的寡核苷酸引物信息引物名称序列(5’-3’)目标片段/基因使用目的Qapqal-F1CACTCCTGCTAATCAATGL基因套式RT-PCR检测WENV-QARn1Qapqal-R1GTAAGGGATGAAAGGGTCL基因套式RT-PCR检测WENV-QARn1Qapqal-F2TAGTGATGCCTGATGTGAL基因套式RT-PCR检测WENV-QARn1Qapqal-R2AGGGTCCTTGAATACGATL基因套式RT-PCR检测WENV-QARn1YCB-2879-RAAGTGCAAAGAACCCCATCAL基因qRT-PCR检测WENV-QARn1YCB-2708-FCCATCAACCCAATCCTTAACATCL基因qRT-PCR检测WENV-QARn1YCB-2828-probeFAM–ACACCATTTGCTACAGACTGGTC-TAMRAL基因qRT-PCR检测WENV-QARn1L1-Qapqal-FCGCACCGGGGATCCTAGL片段WENV-QARn1全基因组的扩增L2278-Qapqal-RTGCGGTATGCAAAGTGCCL片段WENV-QARn1全基因组的扩增L2504-Qapqal-FTCAGTTAAAGGCTCTTTGTCTAL片段WENV-QARn1全基因组的扩增L3161-Qapqal-RTGGGTCTGTTGGGTCTTAL片段WENV-QARn1全基因组的扩增L4620-Qapqal-RGTAAGGGATGAAAGGGTCL片段WENV-QARn1全基因组的扩增L4605-Qapqal-FCCCTTTCATCCCTTACGAL片段WENV-QARn1全基因组的扩增L6737-Qapqal-RAGGCAGGTGTCCAACTCAL片段WENV-QARn1全基因组的扩增L6158-Qapqal-FATTAGAGTGTTTGCCCTGTCL片段WENV-QARn1全基因组的扩增L7163-Qapqal-RCGCACCGAGGATCCTAL片段WENV-QARn1全基因组的扩增S1-Qapqal-FACCGGGGATCCTAGGCS片段WENV-QARn1全基因组的扩增S1241-Qapqal-RCATTAAGATAAGAGCCGTTGCS片段WENV-QARn1全基因组的扩增S1220-Qapqal-FAGCAACGGCTCTTATCTTS片段WENV-QARn1全基因组的扩增S2820-Qapqal-RTCGAGTATGGGATGTGAAS片段WENV-QARn1全基因组的扩增70 S2619-Qapqal-FGCACCGGGTGGTCTTTGAS片段WENV-QARn1全基因组的扩增S3344-Qapqal-RGCACCGKGGATCCTAGGCS片段WENV-QARn1全基因组的扩增QapqalNP-F(BamHⅠ)cgGGATCCATGAGCAATTCTAAAGAGGT*N基因WENV-QARn1重组核蛋白的扩增QapqalNP-R(XhoⅠ)ccgCTCGAGTTACAGAGTGACTTTGGGTN基因WENV-QARn1重组核蛋白的扩增*限制性酶切位点以下划线标注，保护性碱基以英文小写字母显示71 附录C论文中进行系统进化分析使用的参考序列信息病毒科病毒属病毒种或变种名称名称缩写登录号ParvoviridaeAmdoparvovirusAleutianminkdiseasevirusAMDVJN040434AmdoparvovirusgrayfoxamdovirusGFAVJN202450AveparvoviruschickenparvovirusChPVGU214704BocaparvoviruscanineminutevirusCnMVFJ214110Bocaparvoviruscaninebocavirus1CBoVJN648103BocaparvovirusfelinebocavirusFBoVJQ692585BocaparvovirusCaliforniasealionbocavirus1CslBoV1JN420361BocaparvovirusCaliforniasealionbocavirus3CslBoV3JN420365Bocaparvovirushumanbocavirus1HBoV1JQ923422Bocaparvovirushumanbocavirus2aHBoV2aFJ973558BocaparvovirusbovineparvovirusBPVDQ335247Bocaparvovirusporcinebocavirus1PBoV1HM053693Bocaparvovirusporcinebocavirus2PBoV2HM053694Bocaparvovirusporcinebocavirus5PBoV5HQ223038Bocaparvovirusporcinebocavirus7PBoV7HQ291308Bocaparvovirusporcinebocavirus3PBoV3JF429834Copiparvovirusbovineparvovirus2BPV2AF406966Copiparvovirusporcineparvovirus4PPV4GQ387499Dependoparvovirusadeno-associatedvirus-1AAV1AF063497Dependoparvovirusadeno-associatedvirus-5AAV5AF085716DependoparvovirusduckparvovirusDPVU22967Dependoparvovirusavianadeno-associatedvirusAAAVAY18619872 Dependoparvovirusbatadeno-associatedvirusBtAAVGU226971DependoparvovirusCaliforniasealionadeno-associatedCslAAVJN420372virusDependoparvovirussnakeadeno-associatedvirusSAAVAY349010ErythroparvovirushumanparvovirusB19-AuB19V-AuM13178ErythroparvovirussimianparvovirusSPVU26342ErythroparvovirusrhesusmacaqueparvovirusRhMPVAF221122Erythroparvoviruspig-tailedmacaqueparvovirusPtMPVAF221123ErythroparvoviruschipmunkparvovirusChpPVGQ200736Erythroparvovirusbovineparvovirus3BPV3AF406967ProtoparvovirusfelineparvovirusFPVEU659111Protoparvovirusbufavirus1aBuPV1aJX027296ProtoparvovirusH-1parvovirusH1X01457Protoparvovirusratparvovirus1RPV1AF036710ProtoparvovirusporcineparvovirusKressePPV-KrU44978TetraparvovirusEidolonhelvum(bat)parvovirusBa-PARV4JQ037753Tetraparvovirushumanparvovirus4G1PARV4G1AY622943Tetraparvovirusbovinehokovirus1B-PARV4-1EU200669TetraparvovirusporcinehokovirusP-PARV4EU200677TetraparvovirusporcineCnvirusCnP-PARV4GU938300TetraparvovirusovinehokovirusO-PARV4JF504699ChapparvovirusEidolonhelvumparvovirus2EhPV-2JX885610ChapparvovirusDesmodusrotundusparvovirusDsPVKX907333DicistroviridaeAparavirusKashmirbeevirusKBVAY275710AparavirusIsraeliacuteparalysisvirusIAPVEF219380AparavirusAcutebeeparalysisvirusABPVAF150629AparavirusSolenopsisinvictavirus-1SINVAY634314AparavirusTaurasyndromevirusTSVAF277675AparavirusFormicaexsectavirus1FexVKF500001CripavirusCricketparalysisvirusCPVAF21803973 CripavirusDrosophilaCvirusDCVAF014388CripavirusAphidlethalparalysisvirusALPVAF536531CripavirusRhopalosiphumpadivirusRhPVAF022937CripavirusBatcripavirusBtCrVKX644942TriatovirusHomalodiscacoagulatavirus-1HoCVDQ288865TriatovirusBlackqueencellvirusBQCVAF183905TriatovirusHimetobiPvirusHIPVAB017037TriatovirusTriatomavirusTRVAF178440TriatovirusPlautiastaliintestinevirusPSIVAB006531UnclassifiedWuhanarthropodvirusWHAVKX884287UnclassifiedHubeipicorna-likevirusHBPVKX883736NairoviridaeOrthonairovirusHazarevirusHAZVKP406725aOrthonairovirusKeterahvirusKTRVKR537449OrthonairovirusNairobisheepdiseasevirusNSDVKM464724OrthonairovirusCrimean-CongohemorrhagicfevervirusCCHFVJN572088OrthonairovirusDeraGhaziKhanvirusDGKVKU925454OrthonairovirusDugbevirusDUGVNC004157OrthonairovirusHughesvirusHUGVKU925472OrthonairovirusQualyubvirusQYBVKU925478OrthonairovirusTillamookvirusTILLVKU925496OrthonairovirusThiaforavirusTFAVKR537452OrthonairovirusTamdyvirusTaVKP792728PeribunyaviridaeOrthobunyavirusAkabanevirusAKAVKR260715bOrthobunyavirusAlajuelavirusALJVKM272187OrthobunyavirusLeanyervirusLEAVHM627176OrthobunyavirusTrivittatusvirusTVTVKR149248OrthobunyavirusAbbeyLakevirusAb-BUNVKJ710423OrthobunyavirusČalovovirusCVOVKC608156OrthobunyavirusLaCrossevirusLACVGU591165OrthobunyavirusGamboavirusGAMVKT95027074 OrthobunyavirusBrazoranvirusBRAVNC022038OrthobunyavirusOropouchevirusOROVKP691607OrthobunyavirusOyavirusOYAVJX983193OrthobunyavirusTetevirusTETEVKP792680OrthobunyavirusKeystonevirusKEYVKT630289HerbevirusHerbertvirusHEBVKF590585HerbevirusTaïvirusTAIVKF590573HerbevirusKibalevirusKIBVKF590576UnclassifiedFoxfecalbunyavirusFfeVKF823819UnclassifiedWuhanFlyVirus1WHFVKM817722ParamyxoviridaeAvulavirusNewcastlediseasevirusNDVNC_002617AvulavirusAvianparamyxovirus6APMV-6NC_003043AquaparamyxovirusAtlanticsalmonparamyxovirusAsaPVNC_025360HenipavirusNipahvirusNiVNC_002728HenipavirusHendravirusHeVNC_001906MorbillivirusMeaslesvirusMeVNC_001498MorbillivirusFelinemorbillivirusFmoPVNC_025264RespirovirusPorcineparainfluenzavirus1PPIV-1NC_025402RespirovirusSendaivirusSeVNC_001552RubulavirusMumpsvirusMuVNC_002200RubulavirusTuhokovirus1ThkPV-1NC_025410JeilongvirusTailamvirusTlmPVNC_025355JeilongvirusJ-virusJPVNC_007454JeilongvirusBeilongvirusBeiPVcelllineNC_007803JeilongvirusBeilongvirusstrainHKIARN060309BeiPVstrainHKIARN060309KX940962JeilongvirusBeilongvirusstrainYLRR120908BeiPVstrainYLRR120908KX940964JeilongvirusBeilongvirusstrainERN081008BeiPVstrainERN081008KX940961UnclassifiedTupaiaparamyxovirusTupPVNC_002199UnclassifiedSalemvirusSalPVNC_025386UnclassifiedMossmanvirusMosPVNC_00533975 UnclassifiedFer-de-LanceparamyxovirusFdlPVNC_005084ArenaviridaeMammarenavirusAllpahuayomammarenavirusALLVNC_010253NC_010249cdMammarenavirusAmaparímammarenavirusAMAVNC_010247NC_010251MammarenavirusBearCanyonmammarenavirusBCNVNC_010256NC_010255MammarenavirusChaparemammarenavirusCHPVNC_010562NC_010563MammarenavirusCupiximammarenavirusCPXVNC_010254NC_010252MammarenavirusFlexalmammarenavirusFLEVNC_010757NC_010759MammarenavirusGairomammarenavirusGAIVNC_026246NC_026247MammarenavirusGuanaritomammarenavirusGTOVNC_005077NC_005082MammarenavirusIppymammarenavirusIPPYVNC_007905NC_007906MammarenavirusJunínmammarenavirusJUNVNC_005081NC_005080MammarenavirusLassamammarenavirusLASVNC_004296NC_004297MammarenavirusLatinomammarenavirusLATVNC_010758NC_010760MammarenavirusLujomammarenavirusLUJVNC_012776NC_012777MammarenavirusLunamammarenavirusLUNVNC_016152NC_016153MammarenavirusLunkmammarenavirusLUKVNC_018710NC_018711MammarenavirusLymphocyticchoriomeningitismammarenavirusLCMVNC_004294NC_004291MammarenavirusMachupomammarenavirusMACVNC_005078NC_005079MammarenavirusMarientalmammarenavirusMRLVNC_027134NC_027136MammarenavirusMerinoWalkmammarenavirusMEWVNC_023764NC_023763MammarenavirusMobalamammarenavirusMOBVNC_007903NC_007904MammarenavirusMopeiamammarenavirusMOPVNC_006575NC_006574MammarenavirusOkahandjamammarenavirusOKAVNC_027135NC_027137MammarenavirusOliverosmammarenavirusOLVVNC_010248NC_010250MammarenavirusParanámammarenavirusPARVNC_010756NC_010761MammarenavirusPichindémammarenavirusPICVNC_006447NC_006439MammarenavirusPiritalmammarenavirusPIRVNC_005894NC_005897MammarenavirusSabiámammarenavirusSABVNC_006317NC_006313MammarenavirusTacaribemammarenavirusTCRVNC_004293NC_004292MammarenavirusTamiamimammarenavirusTAMVNC_010701NC_01070276 MammarenavirusWhitewaterArroyomammarenavirusWWAVNC_010700NC_010703MammarenavirusWenzhoumammarenavirusWENVRn242NC_026018NC_026019MammarenavirusWenzhoumammarenavirusWENV2KM051423KM051421MammarenavirusWenzhoumammarenavirusWENVRn336KM386660KM386661MammarenavirusWenzhoumammarenavirusRn242WENV3KM051422KM051420MammarenavirusCardamonesvirusC649WENV-CardamonesvirusC649KC669696KC669690MammarenavirusCardamonesvirusC617WENV-CardamonesvirusC617KC669694KC669691MammarenavirusLoieRivervirusR5074LORV-R5074KC669698KC669693MammarenavirusLoieRivervirusR4937LORV-R4937KC669697KC669692MammarenavirusSolwezimammarenavirusSOLVAB972428AB972429a.表格中所有内罗毕病毒（Nairovirus）的登陆号为其S节段的登录号；b.表格中所有总布尼亚病毒（Peribunyavirus）的登陆号为其M节段的登录号；c.该列所有砂粒病毒（Arenavirus）的登录号为其L片段的登录号；d.该列所有砂粒病毒（Arenavirus）的登录号为其S片段的登录号。77 附录D进行贝叶斯系统进化分析进行进化速率计算时使用的旧大陆哺乳动物砂粒病毒的序列信息病毒或病毒变种名称*S节段的登录号采集时间[参考文献]WENV_QARn1KY6622632016[本论文][1]WENV_Rn336KM3866602013[1]WENV_Rn242NC_0260182013[2]WENV_Cardamones_virus_C649KC6696962009[2]WENV_Cardamones_virus_C617KC6696942009[1]WENV_3KM0514222013[1]WENV_2KM0514232013SOLVAB9724282013[3]OKAVNC_0271352012[3]MRLVNC_0271342012[4]MOPV_MozambiqueDQ3288741980[5]MOPV_Morogoro-3017EU9141032004[6]MOPV_AN21366M338791977[6]MOPV_AN20410AY7721701977[7]MOBVAY3423901981[8]MEWVGU0786601985[9]LUNVNC_0161522009LUCVNC_0187102010[10][2]LORV_R5074KC6696982008[2]LORV_R4937KC6696972008LCMV_WisconsinFJ6070381956[11]LCMV_WHI-5107FJ6070331984[11]LCMV_WE-UBC-A337FJ6070342005[11]LCMV_WE-UBC-57135FJ6070361935[11]LCMV_WEM221381934[11]LCMV_SN05FJ8958842004[11]LCMV_RhodeIslandFJ6070302005[11]LCMV_OhioFJ6070371935[11]LCMV_MichiganFJ6070322003[11]LCMV_MassachusettsFJ6070312003[11]LCMV_MarseilleDQ2869312004[11]LCMV_M1AB2619912005[11]LCMV_Lyles_810935_GeorgiaFJ6070292005[11]LCMV_LEEF1649232005[11]LCMV_GR01FJ8958832004[11]78 LCMV_GR01FJ8958832008[11]LCMV_Douglas-4707FJ6070351950[11]LCMV_DandenongEU1360382007[12]LCMV_CH-5871AF3252152000[13]LCMV_CH-5692AF3252141999[13]LCMV_CaliforniaFJ6070282005[11]LCMV_CABNFJ8958822004[14]LCMV_BulgariaGQ8629822005[11]LCMV_ArmstrongM208691933[15]LASV_NLAY1791732000[16]LASV_NIG_Weller_803787AY6282061981[17]LASV_NIG_LPAF1818531969[17]LASV_NIG_GA391X524001977[17]LASV_NIG_CSFAF3339692000[17]LASV_NIG_803213AF1818541974[17]LASV_NIG_08-A47GU4810782008[17]LASV_NIG_08-A41GU4810762008[17]LASV_NIG_08-A37GU4810742008[17]LASV_NIG_08-A19GU4810722008[17]LASV_NIG_08-A18GU4810702008[17]LASV_NIG_08-04GU4810682008[17]LASV_LIB_803793AY6282051980[17]LASV_JosiahJ043241976[18]LASV_GUI_BA366GU8308392003[19]LASV_806828AY6282011981[17]IPPYVDQ3288771970[20]Gbagroube_CIV608(GBAV)GU8308482005[21]*所有的病毒名称简写与附录A相同参考文献[1]LiK,LinX-D,WangW,etal.IsolationandcharacterizationofanovelarenavirusharboredbyRodentsandShrewsinZhejiangprovince,China[J].Virology,2015,476(37-42.[2]BlasdellKR,DuongV,EloitM,etal.EvidenceofhumaninfectionbyanewmammarenavirusendemictoSoutheasternAsia[J].eLife,2016,5(e13135.[3]WitkowskiPT,KalliesR,HovekaJ,etal.NovelArenavirusIsolatesfromNamaquaRockMice,Namibia,SouthernAfrica[J].EmergInfectDis,2015,21(7):1213-6.[4]JohnsonKM,TaylorP,ElliottLH,etal.RecoveryofaLassa-relatedarenavirusinZimbabwe[J].AmJTropMedHyg,1981,30(6):1291-3.79 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致谢三年的时间过的飞快，感觉昨天大学才毕业，现在又要硕士毕业了。感谢父母及家人对我继续读书的支持，三年时间一共只跟他们见了三次面。感谢涂长春老师及吉林农业大学给我提供这个继续深造机会，让我有机会能够进行系统的科研训练，初探科学研究的大门。感谢培养单位吉林农业大学动物科学技术学院和中国人民解放军军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所对我的科研及生活提供的保障和帮助。感谢涂长春研究员课题组的每一位成员，包括已经毕业的师兄师姐，人数太多，在此一并感谢。感谢涂长春老师对于我三年来的悉心指导。大到科研项目的整体规划，小到实验记录的细节审查，都亲力亲为，涂老师严谨的治学态度和对科学研究孜孜不倦的追求值得我终身学习。感谢郭焕成老师、冯烨老师、刘艳老师、龚文杰博士后、张岩博士后、李勇博士后、徐琳博士、涂忠忠博士、孟菲博士、贾俊杰硕士、张丽硕士、罗庆华硕士、张必凯硕士、刘东晓硕士、蔡建秋硕士、米士江硕士、朱爱薇硕士和王宇洋硕士对于我科研学习的手把手的指导帮助。感谢何彪老师对于我硕士课题的指导，从最初的实验设计到最后的论文撰写，他都付出了大量的心血。感谢徐琳博士对于我悉心指导和答疑解惑，让我从一个实验室小白成长为一个能进行独立实验的研究生。感谢徐琳博士和张培生硕士对我的硕士课题大力帮助，帮我做了大量的工作，没有他们的帮助，我不可能完成这么多的工作。感谢“净月谈”的每一位成员，让我每周三能够通过小型的组会报告的形式学习许多新东西，同时也提供一个机会让我进行汇报锻炼，使我受益无穷。感谢实验室的王素珍阿姨和信秀芹阿姨，她们默默的付出让我能够专注于实验。特别感谢王素珍阿姨，对我的科研及生活帮助很大。感谢吉林农业大学的张喜庆硕士及王成宇硕士，因为我不在学校做实验，他们帮我处理了很多我不能亲自去做的事。感谢在采样过程中结识的合作单位的老师，特别感谢广西兽医研究所的吴健敏研究员及宁夏大学的李勇老师，让我学到了许多在学校中接触不到的知识。83 感谢石河子大学的屈永刚、王远志、盛金良及哈孜老师帮助我们采集样品，没有他们提供的高质量的样品，我的课题就是无米之炊。感谢吉林农业大学的王龙涛老师对于课题中涉及的病理分析进行的指导与帮助，他专业的分析使我获益匪浅。感谢哈尔滨兽医研究所的王靖飞老师及军事兽医研究所的李楠老师对于透射电镜的指导和帮助，特别是王靖飞老师敬业的工作态度及渊博的知识积累让我印象深刻。感谢中国疾病预防控制中心的张永振老师及李鲲老师赠送细胞系及提供实验建议，让我能够有机会参观学习并最终考取这里的博士。感谢日本北海道大学的GabrielGonzalez博士和军事兽医研究所的王宇洋硕士对于贝叶斯系统进化的指导和帮助，在系统进化方面我还有太多需要学习的东西。感谢日本北海道大学的MichaelCarr教授、GabrielGonzalez博士、加拿大多伦多大学的Campell教授对于英文论文多次修改及建议，让我学到了许多英文写作的相关知识。特别感谢MichaelCarr教授对于我的科研的建议和鼓励，他的每一封邮件都充满了热情。感谢所里经常跟我一起跑步的战士，虽然我还不知道他的名字。感谢经常帮我订试剂的毕秋实老板、库美测序的刘磊和金维智的王雪源，祝你们生意兴隆。感谢各种外卖小哥、快递小哥及滴滴司机、让我不愁衣食住行。特别感谢一名不知名的顺丰小哥，服务态度一流。最后感谢某位我不知道的名字的食堂阿姨，每次总给我很多肉，祝她工作顺利，身体健康！84
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