西藏阿里地区乙型肝炎病毒携带率和分子流行病学研究

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分类号：学号：Ｔ２０１７０１４泰ＡＨｆ毽硕士学位论文？论文题目：西藏阿里地区乙型肝炎奸爾葡獅究？作者姓名：李耀妮学科、专业：病原生物学学位类型：科学学位研究方向：乙肝病毒分子流行病学指导教师：史卫峰教授王玉副教授入学时间：２０１４年９月论文工作起止时间？２０１７３月：２０１５年１０月年 目录中文摘要················································································································1英文摘要················································································································3符号说明················································································································5前言····················································································································6第一部分··············································································································10材料与方法·································································································10结果·········································································································16讨论·········································································································19结论·········································································································21第二部分··············································································································22材料与方法·································································································22结果·········································································································34讨论·········································································································39结论·········································································································41参考文献··············································································································42综述··················································································································47致谢··················································································································54 攻读学位期间发表的学术论文········································································55原创性声明·········································································································56 泰山医学院硕士学位论文西藏自治区阿里地区乙型肝病毒携带率和分子流行病学研究研究生：李耀妮专业：病原生物学导师：史卫峰教授王玉副教授中文摘要目的乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝病毒属、双股环状DNA，是导致乙型病毒性肝炎的病原体。乙型病毒性肝炎作为一种传染性极强的疾病，在中国乃至全球仍旧是一个严重的全球性公共卫生问题。西藏阿里地区地理位置比较特殊，地处祖国西南边陲，地广人稀交通不太便利，是一个相对比较封闭的地理环境，同时该地区又和尼泊尔、印度等国家相邻，落后的生活条件和较差的就医环境使得西藏阿里地区的乙肝感染率明显高于其他省市地区，截止目前关于西藏阿里地区HBV的报道较少。当今分子生物学的飞速发展，HBV基因型的研究越来越多，乙型肝炎感染的急慢性化、流行病学特点、感染的病情转归和治疗及预后效果都与其感染的HBV基因型有着一定的关系。本次研究中我们通过采集西藏阿里地区世居藏族居民血液，检测HBV携带率和感染率等，结合病毒分离和生物信息学，分析HBV基因分型特点，为西藏阿里地区乙型肝炎防控提供科学依据。方法对西藏自治区阿里地区2749名世居藏族居民（城镇居民929例，其中男性469例，女性460例；农牧民1820例，其中男性1078例，女性742例）。采集早晨空腹静脉血5mL，取适量血清用酶联免疫吸附试验方法(ELISA)分别检测HBV血清学标志物：乙型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)、乙型肝炎病毒表面抗体(HbsAb)、乙型肝炎病毒e抗原(HbeAg)、乙型肝炎病毒e抗体(HbeAb)、乙型肝炎病的核心抗体(HbcAb)。利用统计学软件SPSS19.0统计分析其HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb检测结果。随后将乙型肝炎标志物阳性的患者血清标本，进行HBV的DNA提取，分f1(1400bp)f2(1800bp)两个片段PCR特异性扩增HBV基因组。对特定乙型肝炎病1 泰山医学院硕士学位论文毒f1、f2片段进行回收、连接、转化、送菌液样本测定乙型肝炎病毒基因组序列。利用DNAMAN、DNAStar、MEGA、Figtree等生物信息学软件，进行全基因组序列拼接、比对并构建进化树，分析病毒基因的分型情况。结果西藏阿里地区藏族人群的HBV携带率高达20.33%，有免疫力的人群只有23.43%，感染率为26.12%，易感人群为50.45%。其中城镇居民和农牧民间HBV携带率、免疫力、感染率和易感率差异显著。城镇居民男性与女性的HBV携带率、感染率和易感率无统计学差异，但男性免疫水平显著低于女性。农牧民男性的HBV携带率、免疫力、感染率均显著高于女性，而易感率无统计学差异。测序共获得53株乙肝病毒全基因组序列，其中1株属于HBVD型的D3亚型占2%（1/53株）。其余52个毒株（98%）属于C型，1株属于C2亚型，其余均为HBVC/D重组型，其中66%（35/53株）属于CD1亚型，30%（16/53株）为CD2亚型。结论1、西藏阿里地区藏族人群HBV的携带率20.33%，明显高于全国其它地区平均水平，而免疫率却低于全国其它地区水平，是乙型肝炎高度流行区域。2、农牧民男性的HBV携带率、免疫率、感染率均显著高于女性，城镇居民HBV携带率、感染率和易感率不存在性别差异，但免疫水平差异较显著。3、西藏阿里地区乙肝患者的HBV毒株以C型为主，占98%，并且存在少量D型，占2%。4、西藏阿里地区HBV基因组存在广泛的C/D重组，包括CD1亚型35株（占69%）和CD2亚型16株（占31%）。关键词：乙型肝炎病毒；流行病学；病毒分离；遗传进化；基因分型2 泰山医学院硕士学位论文CARRYINGRATEANDMOLECULAREPIDEMIOLOGYOFHEPATITISBVIRUSINTHEALIREGION,TIBETPostgraduate:YaoniLiMajor:PathogenicBiologyTutor:Prof.WeifengShiA.P.YuWangAbstractObjectiveHepatitisBvirus(HBV)belongstothefamilyHepadnaviridae,withacircular,partiallydouble-strandedDNAgenome,whichisthecausativeagentofhepatitisBvirusinfection.WorldwideinfectionwithHBVposesaseriousthreattopublichealth.ThegeographicalpositionofAliRegion,TibetisveryspecialwhichislocatedinthesouthwestborderofChinaandadjacenttoNepal,Indiaandotherneighboringcountries.Inaddition,theAliregionisarelativelyclosedgeographicalenvironment,withmuchland,fewpeople,andinconvenienttraffic.PoorlivingandmedicalconditionsmaketheHBVinfectionrateoftheAliRegionsignificantlyhigherthanthatofotherregions.Sofar,onlyfewstudiesaboutHBVintheAliareahavebeenreported.Withthedevelopmentofmolecularbiology,therehavebeenmoreandmorestudiesdescribingHBVgenotypes.Theepidemiology,diseaseprognosis,andtreatmentandprognosiseffectofHBVinfectionsareassociatedwithHBVgenotypes.Inthisstudy,wecollectedthebloodsamplesofofthetTibetanresidentsintheAliarea,detectedofHBVcarryingrateandtheinfectionrate,andperformedvirusisola-tionandbioinformaticsanalysisoftheHBVgenomes.OurstudywillprovideanimportantscientificbasisforthepreventionandcontrolofHBVinfectionsintheAliregion,Tibet.Method5mLvenousbloodsamplesof2749Tibetanresidents(929urbanresidents,including469male,460female;1820farmersandherdsmen,including1078male,742female)livingintheAliareawerecollectedanddetectedusingenzyme-linkedimmunosorbentassaymethod(ELISA).FiveserologicalmarkersofHBVweremeasured,theserologicalmarkersofhepatitisBvirussurfaceantigen(HBsAg),hepatitisBvirussurfaceantibody(HBsAb)andhepatitisBviruseantigen(HBeAg),hepatitisBviruseantibody(HBeAb)andhepatitisBcoreantibody(HBcAb),respectively.SPSS19.0wasusedforstatisticalanalysis.Then,totalDNAofserumsamplesofthepatientswithHBVpositivemarkers3 泰山医学院硕士学位论文wasextracted.Thetwoprimers,f1(1400bp)andf2(1800bp),wereusedtoamplifyHBVDNAusingPCR.ThePCRproductswereusedforsequencing.Bioinformaticssoftwares,DNAMAN,DNAStar,MEGA,andFigtree,weretoconstructthephylogenetictreesforgenotyping.ResultThecarryingrateofHBVinTibetanpopulationintheAliareaofTibetisashighas20.33%,whereasonlyapproximately23.43%ofthepeoplewithimmunity.Theinfectionrateisapproximately26.12%,andthesusceptiblepopulationisapproximately50.45%.Amongthem,thereweresignificantdifferencesinHBVcarryingrate,immunity,infectionrateandsusceptibilityratebetweenurbanresidentsandfarmers.However,therewasnosignificantdifferenceinHBVcarryingrate,infectionrateandsusceptibilityratebetweenmaleandfemaleresidentsinurbanareas,butthelevelofmaleimmunitywassignificantlylowerthanthatoffemale.TheHBVcarryingrate,immunityandinfectionrateofmaleandfemalefarmersweresignificantlyhigherthanthoseoffemale,buttherewasnosignificantdifferenceinsusceptibility.53wholegenomesequenceswereobtained,amongwhichone(2%)belongstogenotypeD(sub-genotypeD3),52(98%)belongtogenotypeC.AllofthegenotypeCstrainswereHBVC/Drecombinants,with35strains(66%)belongingtoCD1recombinanttypeand16strains(30%)belongingtotheCD2recombinanttype.Conclusion1.ThecarryingrateofHBVinTibetanpopulationintheAliarea,Tibetwas20.33%,whichwassignificantlyhigherthanthatoftheaveragelevelofChina,whereastheimmu-nizationratewaslowerthanthenationallevel.2.TheHBVcarryingrate,immunityandinfectionratesofmaleandfemalefarmersweresignificantlyhigherthanthoseoffemales,andtherewasnogenderdifferenceinHBVcarryingrate,infectionrateandsusceptibilityrateamongurbanresidents.3.ThegreatmajorityofHBVstrainsfromtheAliregionbelongedtogenotypeC(98%),onlyfewstrainsbelongedtogenotypeD(2%).4.ThereareextensivegeneticrecombinationsbetweengenotypesCandFintheHBVgenomesisolatedfromtheAliregion.AllofthestrainsbelongingtogenotypeCwereC/Drecombinants,includingtworecombinationtypes:CD1(69%)andCD2(31%).Keywords:HepatitisBvirus;Epidemiology;Virusisolation;Geneticevolution;Genotyping4 泰山医学院硕士学位论文符号说明英文缩写英文全称中文全称CHBChronichepatitisB慢性乙型肝炎EPEppendorf塑料离心管HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶HBVHepatitisBvirus乙型肝炎病毒ulMicroliter微升minMinute分钟sSecond秒dNTPDeoxyribonueleosidetriphosphate脱氧核苷三磷酸DNADeoxyribnucleicacid脱氧核糖核酸AmpAmpicilin氨苄青霉素ELISAEnzymeLinkedImmunosorbentAssay酶联免疫吸附反应ddH2ODouble-distilledwater双蒸水LBLuria-BertanimediumLB培养基ORFOpenreadingframe开放阅读框PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应rpmRoundsperminute每分钟转数SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠AGEAgaroseGelElectrophoresis琼脂糖凝胶电泳ugMicrogramme微克hHour小时mlMilliliter毫升HBsAb、Hepatitisbsurfaceantibody乙型肝炎表面抗原HBsAgHepatitisbsurfaceantigen乙型肝炎表面抗体HBeAgHepatitisbeantigen乙型肝炎e抗原、HBeAbHepatitisbeantibody乙型肝炎e抗体、HBcAbHepatitisbcoreantibody乙型肝炎核心抗体5 泰山医学院硕士学位论文bpBasepair碱基对前言乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)是导致肝脏疾病的主要病毒性病原体,其[1]中慢性肝炎、肝硬化、肝癌发生的最主要原因即为HBV感染。乙型病毒性肝炎的主要通过血液及血液制品、母婴垂直传播、性传播等途径传播，是一种传染性极强的[2]疾病。乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行。虽然各个国家都在使用乙肝疫苗和母婴阻断等措施进行乙肝的预防控制，乙型肝炎仍是是威胁人类健康最重要的传染病之一，HBV感染仍是一个危害公众健康的主要问题。据世界卫生组织(WHO)公布的[3]数据显示,全世界大概有20亿人感染HBV，其中约有3.5-4亿人为慢性HBV携带者。[4]亚洲地区是乙肝病毒感染的高发生区,中国大约有9300万感染者，且每年有近50万人死于因HBV感染而导致的肝硬化、肝癌、肝脏衰竭及并发症。在现阶段的医疗水平背景下，HBV感染已成为重要的社会及公共卫生问题之一。有报道称，西藏边[5]疆地区的乙肝表面抗原携带者在人群中占26.2％，远高于全国水平。乙型肝炎病毒感染细胞类型多样，但主要感染肝细胞。感染后可引起急、慢性病毒性肝炎,合并其他不良诱因如酗酒、吸烟、脂肪肝等可发展为肝硬化、甚至原发性肝细胞癌(HCC)。除了肝细胞之外，HBV还可以感染免疫细胞、胰腺、肾上腺、骨髓、甚至中枢神经系统。HBV属于嗜肝DNA病毒，大量存在于感染阳性患者的血液及肝脏组织，并经多种含HBV的体液向外界散播。HBV遗传物质为双股环状DNA。研究发现乙肝病毒DNA的Dane颗粒DNA由固定长度的负链和不固定长度的正链（约3200个核苷酸）组成，病毒蛋白质并不是由HBV正链开放读码区所编码。DNA多聚酶作用于短链3′端使其不断延长以修补断裂的缺口，而HBV的DNA在感染细胞内的整合往往与3′端的缺口有关。短链长度不定，为正链。长链包含了DNA分子的全部遗传信息，其基因组有4个开放编码区，可编码病毒蛋白，分别为S（S基因、前S基因）、C（前C基因、C基因）、P、X区。根据其基因组的不同，可对其进行分型。S基因区可分为：S基因、前S1（Pre-S1）和前S2（Pre-S2）。S基因（核苷酸155～833）主要编码构成表面抗原的蛋白质。S基因之前是一个能编码163个氨基酸（2，848-154）的前S基因，其编码产物为PreS1和PreS2蛋白。C区基因（核苷酸1901-2450）包括两个基因：编码HBeAg的前C基因和编码HBcAg的C基因。P区基因较长（核苷酸1621-2357），具有最长的编码区，编码病毒体主要需要依赖DNA的DNA聚合酶、依6 泰山医学院硕士学位论文赖RNA的DNA聚合酶、反转录酶和核糖核酸酶H（RNaseH），而且具有逆转录活性。X区基因（核苷酸1374～1835），可编码长度为154个氨基酸的碱性多肽，此区含有DNA长链的缺口，可编码X蛋白，具有抗原性。根据HBV基因组各区域的不同，可对其进行分型。HBVDNA的复制特征是必须经复制中间体RNA的反转录，这也是导致其突变发生率较高的原因。由于HBVDNA包含的4个基因区域均可以发生突变，乙肝病毒基因组序列之间则产生了差异。文献中报道按照HBV全基因组序列差别>8%这一依据，[6,7]可将HBV分为8种基因型（A-H）。不同基因型的分布表现出非常明显的地域性差异。全球各地均有A基因型的分布，而B、C基因型主要散布于亚洲以和大洋洲；D基因型在地中海地区、中东、北欧广泛分布，印度的D基因型最多；E型集中于非洲，[8,9]多见于西非；F基因型主要发现于南美、中美；G型见于美国、法国、H型在中美[10]洲及南美洲发现。现代多基因分析方法得出HBV基因型B／C重组型在亚洲东部大[11]量的存在，A／D重组型存在于意大利。HBV基因重组现象普遍存在，越来越多的[12,13]亚型被发现，并被正式命名（见图1-1）目前，中国检出的乙型肝炎最多的主要是基因型B和基因型C，也发现有一些重[14,15]组基因型的存在（见图1-2）。在我国，HBV基因型呈地域性分布，长江江以南的南方HBV基因型多为B型,基因型C多分布在长江以北的北方，基因D型仅见于[16,17]一些少数民族聚集地如：西藏、新疆等地区，A和F型偶尔可见,没有查见E、[18-22]G和H型的报道（见表1-1）。分子生物学飞速发展过程中，学者对HBV的基因型有更加明确深入研究。乙型肝炎的感染急慢性化、感染者病情演变、诊治方案和[23]预后效果都与HBV基因型有着密不可分的关联。HBV基因型的各型之间基因突变位点是不同的，发生的突变类型也是不同的。如基因型B和基因型C的变异位点分别以YVDD变异和以YIDD变异为主。研究发现乙肝基因型与感染者病情的转归之间也存在有一定关联。基因型A与慢性肝脏炎症相关，基因型B与轻度的肝脏病变相关，基因型C与较重的肝脏疾病发病机制相关，可作为肝癌高危指标之一，大部[24]分急性自限性肝炎都属于基因型D。年龄不同，也会存在基因型的差异，基因C型在高年龄段的肝细胞癌患者中较其它型比例稍高，基因型B则在35岁以下肝细胞[25]癌患者中占较高比例。不同的基因型对同种抗病毒药物的应答效果是不一样的，因此乙肝病毒基因型的深入了解对临床用药有一定的指导意义。如基因型C用普通的IFN-α治疗时明显低于基因型B的应答率，A型高于D型，A型和D型均高于B型7 泰山医学院硕士学位论文[24,26]。拉米夫定抗病毒治疗时基因型B比基因型C有更好的应答。此外，不同基因型有不同的流行特征及致病性，不同基因型对乙肝疫苗的接种反应也有显著不同[27,28]。所以HBV基因型的研究对临床治疗等具有重要意义。流行病学研究HBV基因分型也是意义非同的。了解HBV基因型的地区分布及各基因型致病性的特点，亦有助于了解HBV在人群中基因变异和进化趋势。对防治由不同HBV基因型和变异株引发的疾病，HBV基因分型研究是越来越迫切的。以及评估针对慢性感染的乙肝疫苗接种计划，将是至关重要的，同时也将为寻找有效的乙肝防治新措施提供重要线索。[5]西藏地区乙肝高发，人群乙肝表面抗原阳性率为26.2％，约为我国平均乙肝表面抗原阳性率的2.5倍。有学者通过少量样本（n=990）研究了阿里地区低年龄段（<19[29]岁）人群HBV携带率，但并不能全面反映阿里地区人群HBV携带情况。之前有[30-32]研究对西藏拉萨地区分离的乙肝病毒全基因组进行了报道。西藏地区流行的乙肝[33]病毒与我国东部地区差异较大，以C/D重组型为主。阿里地区位于西藏西部，该地区远离祖国内陆，且西面比邻中亚异国，处于相对封闭的地理位置,地区面积广大（34.5万平方公里），其HBV基因型的分布特点具有一定的独特性，值得研究。但是，目前尚未见有关该地区具体感染HBV型别的系统报道，不同基因型别在该地区HBV高感染率中是否起着重要的作用亦未可知。本研究通过对这一地区世居藏族居民进行大数据的体检统计，分析其乙肝携带率、免疫率及易感率等情况；抽取乙型肝炎病毒血清学阳性的标本进行HBV的DNA分子检测，对病毒全基因组进行高通量测序，并经多基因分析研究西藏阿里地区的乙肝病毒基因型别分布特点。对于提高我国西藏阿里地区人群的乙肝防治率及提升居民健康水平具有非常重要的意义。为西藏阿里地区开展控制乙型肝炎防控、疫苗设计等工作提供重要的科学依据。也希望通过我们的努力，尽快将乙肝病毒性肝炎在全国乃至全世界彻底消除起到一定的帮助作用。[18]-[22]表1-1中国HBV基因型地域分布主要情况HBV基因型主要分布地域A、F基因型仅见于少数地区（广西壮族自治区）B基因型长江以南C基因型长江以北D基因型少数民族较多的地区（宁夏、西藏、新疆等）8 泰山医学院硕士学位论文E、G和H基因型未见图1-1世界各地乙型肝炎病毒基因型的地理分布[12,13]（根据美国疾病预防控制中心数据改编）[14,15]图1-2中国乙型肝炎病毒基因型分布图9 泰山医学院硕士学位论文第一章西藏自治区阿里地区乙型病毒肝炎携带率调查研究乙型肝炎为具有世界流行趋势的重要传染病，我国大约有9300万感染者，为乙肝感染大国。九十年代至今，对于乙肝预防疫苗的推广和应用均在持续进行，一些发达国家以及中国大部分地区疫苗接种率几乎达到全覆盖，近年来母婴阻断等技术的发展使乙肝感染率呈下降趋势。然而，由于地理环境或者人群生活环境等因素，一些落后地区的传染病防治工作并不到位，人群的传染病预防保健知识相对匮乏，所以传染病的传播未得到有效控制。西藏自治区阿里地区地处祖国西南边陲，地广人稀，占地约30万平方公里，人口却只有10万左右，交通不便，其地理环境相对比较封闭，但又和尼泊尔、印度等国家相邻，加之牧民大都以游牧为生，居住地点不固定，且存在孕妇无定期孕检，产妇在家生产等情况，所以防疫工作很难做到人人宣讲，人人知晓。本次研究采取随机抽样的方法，完成阿里地区世居藏族居民进行乙肝病毒携带率、免疫率和感染情况的调查报道，以此提醒广大藏族同胞加强传染病的预防保健，提高人群健康意识。1、研究对象22根据流行病学现况调查样本估计样本量计算公式N=Zα×P×(1－P)/d，预期现患率用1993年有关报道藏族人群乙型肝炎携带率为26.2%，P为预期现患率；d为容许误差，d＝P×10%；α=0.05，Zα=1.96，计算得到理论样本人数应为1128人。西藏阿里地区的地理环境和农牧民以游牧为生的生活习惯，标本采集困难，最终采集2014年9月至2015年12月阿里地区城镇居民和阿里地区各县农牧民样本，均为藏族世居人群，共2749人，样本有代表性。男性1547例，女性1202例；城镇居民929例，其中男性469例，女性460例；农牧民1820例，其中男性1078例，女性742例。年龄2-87岁。标本采集：西藏阿里地区属于高海拔地区，选用专用的适合其海拔的真空采血管。采用真空负压采血管定量采集采血者清晨空腹的静脉血，选取肘部正中静脉为穿刺点。嘱采血者端坐于采血凳上，前臂裸露放于采血桌上的垫枕上，在前臂上端系上止血带并嘱咐采血者拳头握紧，以使血管充分暴露，选好穿刺血管的部位，解开止血带，依照《医疗机构消毒技术规范》（WS/T2012-367）的要求，用无菌棉签沾取安尔碘以抽血进针点为中心消毒两遍，由内向外缓慢逐步涂擦消毒，待干，消毒面积的直径应大于等于5cm，重复上述操作步骤一次。再次在进针上方约6cm处系紧止血10 泰山医学院硕士学位论文带，然后右手持采血针，左手固定血管下方将采血针平稳、快速刺入皮肤至静脉血管内，看见针头处有回血后，将采血针另一头插入真空采血管内。血液流至采血管后立即解开止血带。同时告知采血者松开拳头，待血液采集完成后，用棉签按压血管穿刺[34]点，然后拔出针头，嘱采血者按压5-10min。每人抽取3-4ml全血，标记好信息。待血液凝固后分离血清，放置-20℃冰箱内待检。2、仪器与试剂（1）主要仪器仪器名称仪器厂家及型号全自动洗板机RaytoRT-3100酶标分析仪RaytoRT-610037℃恒温箱上海新苗医疗器械制造有限公司（Cimo）低速常温离心机赛默飞世尔科技公司ThermoFisherScientific纯水机力康生物医疗科技控股有限公司(Healforce)移液枪赛默飞世尔（上海）仪器有限公司（2）试剂试剂名称试剂厂家及批号乙型肝炎表面抗原(HBsAg)英科新创（厦门）科技有限公司的酶联免疫吸附试剂（批号：2015115140）乙型肝炎表面抗体(HBsAb)英科新创（厦门）科技有限公司的酶联免疫吸附试剂（批号：2015015203）乙型肝炎e抗原(HBeAg)英科新创（厦门）科技有限公司的酶联免疫吸附试剂（批号：2015015301）乙型肝炎e抗体(HBeAb)英科新创（厦门）科技有限公司的酶联免疫吸附试剂（批号：2015015401）乙型肝炎核心抗体(HBcAb)英科新创（厦门）科技有限公司的酶联免疫吸附试剂（批号：2015015501）3、实验方法乙型肝炎病毒血清学标志物采用ELISA的方法进行检测。HBsAg和HBeAg采用双抗体夹心法测定；HBsAb采用双抗原夹心法检测；HBcAb、HBeAb两项依据竞争抑制法的原理来检测。实验过程应保证合适的生物安全，处理样本及试剂时应戴手套、口罩和帽子。所有样本、试剂和各种废弃物应按照医疗感染性废弃物高压灭菌后11 泰山医学院硕士学位论文再处理，整个实验操作要严格防止交叉感染并严格按照英科新创（厦门）科技有限公司的酶联免疫吸附试剂说明书操作执行。判定阳性结果参照GB17010-1997。（1）实验步骤：1）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）检测:采用购于英科新创（厦门）科技有限公司的酶联免疫吸附试剂进行实验。HBsAg检测试剂盒的微孔板预包被纯化的乙肝表面抗体（HBsAb），酶标试剂配有辣根过氧化物酶标记的抗体（HBsAb-HRP）及TMB和显色剂终止液等试剂；HBeAg检测试剂盒的微孔板预包被鼠抗-HBe单克隆抗体（HBeAb），配以辣根过氧化物标记鼠抗-HBe单克隆抗体（HBeAb-HRP）及TMB和其它试剂。HBsAg和HBeAg采用的是双抗体夹心法原理检测。①平衡：从试剂盒里取出HBsAg和HBeAg检测相应的包被微孔板，室温（18-25℃）放置在微孔板架上，开封后将剩余微孔板放到自封袋里封存。②配置洗液：将浓缩洗涤液从试剂盒里取出，摇匀（如有晶体应充分溶解），按照1:20的比例加入自制纯净蒸馏水摇匀备用。③编号：将架子上室温孵育过的微孔板按顺序进行编号。④稀释：加20ul样本稀释液至HBsAg检测的每个微孔板中，HBeAg检测微孔板中不用加入稀释液。⑤加样：在HBsAg检测的微孔板A1、A2位置各加入100ul的阳性对照品，在A3、A4位置的微孔里加入100ul阴对照品，再顺A5、6、7、8，B1-B8的顺序加入病人100ul血清；HBeAg检测的微孔板A1、A2位置加入50ul的阳性对照品，在A3、A4位置的微孔里加入50ul阴对照品，再顺A5、6、7、8，B1-B8的顺序加入病人50ul血清，封条封板并标记好检测项目。⑥温育：加好样本后的检测HBsAg微孔板放37℃温育60min，检测HBeAg不需要温育。⑦加酶：取出微孔板，在各自的检测微孔板上加入对应的酶标记抗体50ul。⑧温育：置37℃恒温箱温育30分钟。⑨洗涤：设置好全自动洗板机的程序：洗涤次数为5次，洗液停留时间为30-60sec。洗涤后在卫生纸彻底拍干。⑩显色：每孔分别加入底物A和底物B各50ul，轻轻混匀，封板放置37℃暗孵育30分钟。12 泰山医学院硕士学位论文终止：每孔加入终止液50ul混匀。测定：用酶标仪读取在双波长450nm/630nm下测定的各孔OD值，保存好测定结果。结果判定：样本OD值S/C.O.≥1者为HBsAg阳性；样本OD值S/C.O.＜1者为HBsAg阴性。2）乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）检测试剂盒在微孔条上预包被基因重组乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg），配以辣根过氧化物酶标记基因重组乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg-HRP）及TMB、底物和显色剂等试剂，其采用双抗原夹心法原理检测血清中的乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）。①平衡：从试剂盒里取出HBsAb检测的包被微孔板，室温（18-25℃）放置在微孔板架上平衡30分钟，剩下的微孔板放到自封袋里封存。②配液：从试剂盒中取出浓缩洗涤液摇匀，加入1：20的自制蒸馏水稀释，轻轻摇匀后备用（如有晶体应充分溶解）。③编号：将室温过的微孔板放在架子上按顺序进行编号。④加样：检测的微孔板A1、A2位置各加入50ul的阳性对照品，在A3、A4位置的微孔里加入50ul阴对照品，再顺A5-8，B1-B8的顺序加入病人50ul血清。⑤加酶：分别在每孔中加入酶标记抗原试剂50ul，切不可漏加，然后轻轻混匀封板。⑥温育：置37℃恒温箱温育25分钟后取出放置室温再平衡5分钟。⑦洗涤：提前设置好全自动洗板机的程序：洗涤次数为5次，洗液停留时间为30-60sec。洗涤后在卫生纸彻底拍干。⑧显色：每孔加底物A50ul然后再加入底物B50ul，轻轻混匀，封条封板37℃暗置15分钟。⑨终止：每孔加入终止液50ul混匀。⑩测定：用酶标仪读取在双波长450nm/630nm下测定的各孔OD值，保存好测定结果。结果判定：样本OD值S/C.O.≥1者为HBsAb阳性；样本OD值S/C.O.＜1者为HBsAb阴性。3）乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）检测、乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）检测13 泰山医学院硕士学位论文采用英科新创（厦门）科技有限公司的酶联免疫吸附试剂，HBeAb检测试剂盒在微孔条上预包被鼠抗-HBe单克隆抗体（HBeAb），配以辣根过氧化物标记鼠抗-HBe单克隆抗体（HBeAb-HRP）、中和抗原（基因重组抗原HBeAg）及TMB等试剂；HBcAb检测试剂盒在微孔条上预包被基因重组乙肝核心抗原（HBcAg）配以辣根过氧化物标记鼠抗-HBc单克隆抗体（HBcAb-HRP）及TMB等其它试剂，采用竞争抑制法原理检测血清（或血浆）中对应的乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）、乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）。①平衡：从试剂盒里取出包被微孔板，放于微孔板架上，室温（18-25℃）放置，剩余的微孔板开封后放到自封袋里封存。②配液：将浓缩洗涤液从试剂盒里取出，摇匀（如有晶体应充分溶解），加入19倍的纯净水摇匀备用。③编号：将架子上室温过的微孔板按顺序进行编号。④加样：检测的微孔板在A1、A2位置各加入对应的50ul的阳性对照品，在A3、A4位置的微孔里加入对应的50ul阴对照品，再顺A5-8，B1-B8的顺序加入病人50ul血清。⑤加酶：分别在每孔中加入相应的酶标记抗体50ul，轻拍混匀。⑥中和：在检测HBcAb对应的微孔板中分别在每孔中加入中和抗原（HBeAg）50ul，轻拍混匀。HBcAb检测不用加入中和剂可省略此步骤。⑦温育：置37℃温育25分钟，室温平衡5分钟。⑧洗涤：用全自动洗板机设好程序洗涤5次，每次要保持30-60秒的浸泡时间。洗涤后吸水纸上扣干。⑨显色：每孔加底物A、B各50ul，轻拍混匀，37℃暗置15分钟。⑩终止：每孔加入终止液50ul，混匀。测定：用酶标仪读取在双波长450nm/630nm下测定的各孔OD值，保存好测定结果。结果判定：样本OD值S/C.O.≤1者为HBeAb、HBcAb阳性；样本OD值S/C.O.＞1者为HBeAb、HBcAb阴性。（2）判断标准乙型肝炎病毒携带者为乙型肝炎病毒表面抗原阳性者，其余四项不限；乙型肝炎病毒表面抗体阳性，其余四项乙型肝炎病毒血清学标志物均为阴性为乙型肝炎病毒免14 泰山医学院硕士学位论文疫者；乙型肝炎病毒表面抗原阳性和（或）乙型肝炎病毒e抗原阳性和（或）乙型肝炎病毒核心抗体阳性者为乙型肝炎病毒感染者；乙型肝炎病毒五项血清学指标全阴性[35]者为易感人群。（3）统计学方法2采用SPSS19.0统计学软件对检测结果进行分析，利用x检验进行计数组间比较分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。15 泰山医学院硕士学位论文结果1西藏阿里地区藏族城镇和农牧民的乙型肝炎病毒表面抗原携带率等情况西藏阿里地区藏族人群的乙型肝炎病毒表面抗原携带率高达20.33%，有免疫率的人群只占23.43%，感染率为26.12%，易感人群占50.45%。城镇居民的HBV携带率、感染率均低于农牧民，而城镇居民的免疫率和易感率均高于农牧民，上述差异均具有统计学意义（P＜0.05）（见表1-2）。表1-2西藏自治区阿里地区藏族人群的HBV携带率、免疫率、感染率和易感率比较[n（%）]人群分类HBV携带率免疫率感染率易感率城镇居民（n=929）127（13.67）269（28.96）160（17.22）500（53.82）农牧民（n=1820）432（23.74）375（20.60）558（30.66）887（48.74）总计（n=2749）559（20.33）644（23.43）718（26.12）1387（50.45）2x38.4723.9257.546.36p＜0.05＜0.05＜0.05＜0.052西藏阿里地区城镇居民男性和女性HBV携带率等情况西藏自治区阿里地区城镇居民男性的HBV携带率、免疫率、感染率和易感率分别为15.14%、25.16%、19.40%、55.44%；城镇居民女性的HBV携带率、免疫率、感染率和易感率分别为12.17%、32.83%、16.74%、50.43%；城镇居民男性和女性HBV携带率、感染率和易感率差异均无统计学意义（P＞0.05）（见表1-3）。表1-3西藏自治区阿里地区城镇居民男性和女性的HBV携带率、免疫率、感染率和易感率比较[n（%）]性别HBV携带率免疫率感染率易感率男性（n=469）71（15.14）118（25.16）91（19.40）260（55.44）女性（n=460）56（12.17）151（32.83）77（16.74）232（50.43）2x1.736.631.112.33p＞0.05＜0.05＞0.05＞0.0516 泰山医学院硕士学位论文3西藏阿里地区农牧民男性和女性的HBV携带率、免疫率、感染率和易感率比较西藏阿里地区农牧民男性的HBV携带率、免疫率、感染率和易感率分别为25.79%、18.55%、33.77%、47.68%；阿里地区农牧民女性的HBV携带率、免疫率、感染率和易感率分别为20.75%、23.58%、26.15%、50.27%。阿里地区农牧民男性的HBsAg携带率和感染率均高于女性，差异均具有统计学意义（P＜0.05），男性免疫率低于女性，该差异均具有统计学意义（P＜0.05），阿里地区农牧民男性和女性易感率比较差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1-4）。表1-4西藏自治区阿里地区农牧民男性和女性的HBV携带率、免疫率、感染率和易感率比较[n（%）]性别HBV携带率免疫率感染率易感率男性（n=1078）278（25.79）200（18.55）364（33.77）514（47.68）女性（n=742）154（20.75）175（23.58）194（26.15）373（50.27）2x6.156.8012.011.18p＜0.05＜0.05＜0.05＞0.054西藏阿里地区藏族男性城镇居民和男性农牧民HBV携带率、免疫率、感染率和易感率比较情况西藏阿里地区男性城镇居民的HBV携带率、免疫率、感染率和易感率分别为15.14%、25.16%、19.40%、55.44%；西藏阿里地区男性农牧民的HBV携带率、免疫率、感染率和易感率分别为25.79%、18.55%、33.77%、47.68%。西藏阿里地区藏族男性城镇居民和男性农牧民HBV携带率、免疫率、感染率和易感率比较均具有统计学意义（P＜0.05）（见表1-5）。表1-5西藏阿里地区藏族男性城镇居民和男性农牧民HBV携带率、免疫率、感染率和易感率比较[n（%）]人群分类HBV携带率免疫率感染率易感率城镇居民（n=469）71（15.14）118（25.16）91（19.40）260（55.44）农牧民（n=1078）278（25.79）200（18.55）364（33.77）514（47.68）2x21.228.7432.487.86p＜0.05＜0.05＜0.05＜0.0517 泰山医学院硕士学位论文5阿里地区女性城镇居民和女性农牧民HBV携带率、免疫率、感染率和易感率比较阿里地区女性城镇居民的HBV携带率、免疫率、感染率和易感率分别为12.17%、32.83%、16.74%、50.43%；女性农牧民HBV携带率、免疫率、感染率和易感率分别为20.75%、23.58%、26.15%、50.27%。除易感率比较无统计学意义外，阿里地区女性城镇居民的HBV携带率、感染率均显著低于女性农牧民（P＜0.05），女性城镇居民免疫力高于女性农牧民（P＜0.05）（见表1-6）。表1-6西藏阿里地区藏族女性城镇居民和女性农牧民HBV携带率、免疫率、感染率和易感率比较[n（%）]人群分类HBV携带率免疫率感染率易感率城镇居民（n=460）56（12.17）151（32.83）77（16.74）232（50.43）农牧民（n=742）154（20.75）175（23.58）194（26.15）373（50.27）2x14.5012.2714.390.03p＜0.05＜0.05＜0.05＞0.0518 泰山医学院硕士学位论文讨论乙型肝炎是一种传染性强，发病率较高的，严重危害人体康健，全球重点防治的二类传染病之一。而我国也是乙型肝炎流行的大国，慢性乙肝病毒携带者大约为1.2[36]-[37][38]亿。1996年有关报道中国乙型肝炎携带率为9.75%。本次研究西藏阿里地区[5]乙肝表面抗原携带率为20.33%比23年前报道的西藏地区乙肝表面抗原阳性26.2％低。但是本次结果明显高于1996年中国乙型肝炎携带率，全国人口乙型肝炎携带者已由[39-41]1992年的9.8%下降至2006年齐小秋等报道的7.18%。本次调查研究结果显示西藏阿里地区藏族人群的乙型肝炎病毒携带率高达20.33%，有免疫力的人群只有23.43%，感染率为26.12%，易感人群为50.45%。乙肝肝炎病毒携带率远高于近年来近年来[42-43]王泽明、孟秀春等（9.3%）报道的（3.20%）。与卫生部要求的2005-2015年乙型[44]肝炎防治目标乙型肝炎携带率控制在7%以内还有很大的差距。免疫力人群只有[45-46]23.43%远低于国内陈兰兰，刘义庆，许丽等报道的。易感人群高达50.45%，说明该地区的疫苗接种没有有效的普及或者疫苗效果不好，而现今在我国其它地区乙肝疫苗接种，从新生儿出生要做到百分之百的接种，成人的乙肝疫苗接种也是逐年递增的。阿里地区城镇居民乙肝携带率（13.67%）远低于农牧民（23.74%）；免疫力城镇居民（28.93%）高于农牧民（20.60%）；感染率城镇居民（17.22%）低于农牧民（30.66%）。这些结果都与阿里地区的特殊地理环境和人口分布，以及他们的生活方式和习惯有着密不可分的关系。西藏阿里地区位于中国的西南角，在西藏自治区的西北部，平均海拔4300米以上。据统计2012年,阿里地区共包括措勤县，噶尔县，札达县，日土县、革吉县，普兰县改则县7个县，7个乡镇，37个乡、141个村(居)委会。截至2010年底，阿里总人口约为10万人，汉族人口只有7367人，占7.72%；藏族人口为87493人，占91.65%；其他少数民族人口为605人，占0.63%。城镇居民约两万人，农牧区约为八万人。平均每三公里约一个人，是我国人口密度最底的地区之一。城镇居民相对稳定，农牧民主要以游牧生活方式为主，由于特殊的生活居住方式和地理环境、文化和遗传背景等多种因素的影响下，乙型肝炎疫苗的普及很难做到及时有效，致使西藏阿里地区乙型肝炎携带率至今都高达20.33%。虽然我国传染病报告系统早于1959年就建立了，网络直报传染病系统于2003年建立了，但由于西藏阿里地区特殊的地理环境和人群分布特点工作很难开展，至现在为止西藏阿里地区参与此项工作不能全面到位，对全国的传染病统计工作有所影响。19 泰山医学院硕士学位论文本研究显示城镇居民男性和女性就免疫力差异有统计学意义（P＜0.05），乙肝携带率、感染率和易感率统计结果差异无统计学意义（P＞0.05）。然农牧民男性和[47-50]女性各结果之间比较差异均具有统计学意义，这与国内一些报道是一致的。城镇居民男性、女性和农牧民男性、女性之间的结果差异比较大具有统计学意义（P＜0.05）。这些可能与阿里地区的特殊地理环境、人口分布以及独特的生活方式和习惯有着密不可分的关系，如城镇居民相对集中，医疗卫生条件相对优越，农牧民婚配情况存在一妻多夫制，男性经常酗酒，饮食单一以牛羊肉为主有关。我国是乙肝的高流行国家，预防乙型肝炎病毒感染最安全最有效的措施是接种乙肝疫苗和母婴阻断。乙肝疫苗于1992年国家卫计委已将其纳入儿童计划免疫管理里，所有新生儿都要接种乙型肝炎疫苗。由于阿里地区人口疏散，交通不便，乙肝携带者较多，孕产妇产检率很低，在家生产者多，乙肝防治难度较大。阿里地区的人群有不同的生活方式，社会经济，文化背景，防治乙型病毒性肝炎难上加难。因此，需要防疫部门和医院以及各县乡镇行政领导等多部门相互配合，加大力度提高阿里地区人群对乙型肝炎病毒的认知度和预防知识的普及，共同做好阿里地区的乙型肝炎的防治工作，提高藏族同胞的健康水平，服务阿里地区的经济社会发展。20 泰山医学院硕士学位论文结论1、西藏阿里地区藏族人群HBV的携带率20.33%，易感率50.45%明显高于全国其它地区平均水平，而免疫率23.43%却低于全国其它地区水平，是乙型肝炎高度流行区域。2、因农牧民主要以游牧为主，接种疫苗和预防保健意识普遍比城镇居民低，疫苗接种和预防保健知识传播执行较困难，致使农牧民HBV携带率、感染率和易感率显著高于城镇居民。3、农牧民男性的HBV携带率、感染率均显著高于女性，而免疫率男性低于女性，差异均具有统计学意义（P＜0.05），易感率男性和女性差异无统计学意义（P＞0.05）。4、城镇居民HBV携带率、感染率和易感率不存在性别差异，但免疫率水平差异较显著。21 泰山医学院硕士学位论文第二章西藏自治区阿里地区乙型肝炎病毒分子流行病学研究在全球不同国家、不同地区和不同民族，因地理环境、人种、遗传基因、传染源和传播条件等的不同，HBV基因型分布差异较为显著。在美国、非洲中部、北欧、[51,52]西欧等地以A型为主，亚洲、太平洋地区、日本主要以B型和C型为主，南欧、[53]中东及印度主要以D型为主，基因型E主要见于非洲，基因型F发现于印地安和[54][9]波利尼西亚地区，而基因型G则主要在美国和欧洲。在我国，HBV基因型主要以B型和C型为主，其中B型多分布在南方，而C型多分布在北方。2002年有分析[55]发现拉萨地区乙肝病毒基因型主要为C/D重组型，对于其他西藏地区HBV的基因型研究相对较少。西藏阿里地区位于祖国的西南边陲，占地面积大，人口密度较小，相对环境封闭，但又与尼泊尔和印度各国相邻，中国其他地区多以B、C基因型为主，而印度等国主要以D基因型为主，西藏阿里这一特殊的地理位置尚无乙型肝炎病毒基因型的相关报道。考虑到2014年9月至2015年12月在西藏阿里地区已检测具有高于全国平均水平的乙肝携带率，开展针对该地区世居藏族患者乙肝病毒基因型特点的研究将具有十分重要的意义。本研究利用采集到的HBV阳性血样，通过对西藏阿里地区乙型肝炎患者HBV的分离鉴定及多基因测序分析，阐明了该地区HBV的流行基因型。1、研究对象采用随机抽样的方法，分两次在西藏阿里地区选取95例世居藏族乙型肝炎病毒感染者，男性46例，女性49例，年龄在5个月至73岁，排除其他肝炎病毒的感染，在其知情同意情况下，收集95例乙肝感染者的静脉血液，离心分离出血请，分装1.5ml离心管里-80℃保存，冷链运送回泰山医学院病原学实验室待检。2、实验材料2.1购买试剂试剂及厂家:试剂名称试剂厂家琼脂糖（agarose）上海玉博生物科技有限公司病毒基因组DNA提取试剂盒天根生化科技（北京）有限公司（TIANampVirusBloodDNAKit）pLB零背景快速克隆试剂盒天根生化科技（北京）有限公司22 泰山医学院硕士学位论文（LethalBasedFastCloningKit）琼脂糖凝胶/PCR产物纯化试剂盒Biomiga公司（DC3511/DC3514）2×TapMasterMix（含染料）康为世纪公司细菌细菌培养用胰化蛋白胨英国Oxoid公司氨苄青霉素（AMP）北京索莱宝科技有限公司（solarbio）细菌培养用酵母提取物英国Oxoid公司NaCl广州友联化学试剂厂琼脂粉天津市志远化学试剂有限公司无水乙醇天津凯通化学试剂有限公司2.2实验仪器主要仪器设备及厂家:仪器名称仪器厂家PCDNAR扩增仪ROCHE罗氏公司凝胶成像分析系统GelDoc2000BIORAD公司恒温培养箱天津市中环实验电炉公司IF紫外透射分析仪上海康华生化仪器制造厂赛默飞世尔科技公司超净工作台(ThermoFisherScientific)低温高速离心机BECKMANCOULTER赛默飞世尔科技公司普通离心机(ThermoFisherScientific)-80℃低温冰箱日本松下Panasonic-20℃低温冰柜澳柯玛4℃冰箱海尔琼脂糖凝胶电泳仪上海培清科技有限公司高温高压灭菌锅日本松下Panasonic力康生物医疗科技控股有限公司(Heal纯水机force)微波炉格兰仕电器有限公司水浴锅上海新苗医疗器械制造有限公司(Cimo)精密电子天平上海马头牌23 泰山医学院硕士学位论文电泳紫外分析仪北京五洲东方科技有限公司37℃震荡培养箱上海善志仪器设备有限公司赛默飞世尔科技公司CO2孵育箱(ThermoFisherScientific)烘干箱上海三腾仪器有限公司2.3自配试剂1）LB培养液（1000mL溶液）：称取细菌培养用胰化蛋白胨10g、细菌培养用酵母提取物5g和NaCl10g溶于950mL自制的蒸馏水中，摇至完全溶解后，再加水至1L，用树脂塞封口，放高压锅高压灭菌后放4℃冰箱保存。2）1×TAE电泳缓冲液（1000mL）：50×TAE稀释成1×TAE，取20mL50×TAE溶液加980mLddH2O，并充分混匀，室温放置保存。3）EB工作液：取1mL10mg/mLEB母液，加入1999mL的蒸馏水，稀释成5ug/mL终浓度备用。4）引物：根据引物浓度加入相应计算量的ddH2O，最终将引物稀释成25uM工作浓度。5）Amp(使用浓度：100ug/mL)：取灭菌过的容器，准确称取1g氨苄青霉素粉剂，加入10mL无菌蒸馏水中，轻轻摇晃至充分溶解，用过滤器过滤除菌，无菌操作将过滤后的Amp分装成1mL每支，放置-20℃备用。6）LB琼脂板（2000mL体积）：首先注意无菌操作，准确称取20g细菌培养用胰化蛋白胨、10g细菌培养用酵母提取物、20gNaCl、3g琼脂粉溶放入干净的耐高压的容器中，再加入1000mL蒸馏水，充分混匀，待溶解后，加水至2000mL，用树脂塞封好后，放高压锅高压灭菌。高压灭菌结束后，从高压锅取出，待降温至60℃左右，加入相应量的Amp备用液，充分混匀，用无菌吸管吸取20-25mL加入直径9cm的培养皿内，盖好平皿放置水平位置，待其冷却凝固后，倒置放入4℃冰箱备用。7）0.1mol/mLCaCL2：先预先配制1mol/mLCaCl2储存液，即量取11.1gCaCl2溶于100mLddH2O中，过滤除菌，分装待用，-20℃备用。8）1%琼脂糖凝胶：①取洁净的锥形瓶，称取1g琼脂糖加入其中，用100mL的1xTAE溶液溶解混匀，用微波炉加热1-2min，中间取出摇匀，至完全溶解成清亮状，冷却至60℃左右，加入8μl的染料充分混匀，②1%琼脂糖凝胶：首先将制备凝胶用的模板槽放到水平台面上，再放入树脂的内槽，然后在固定的位置上放上梳子，再将24 泰山医学院硕士学位论文冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒入模板槽内，如果有气泡，可用枪头将其弄破或者将气泡摇向周边，室温冷却1小时左右待其完全凝固后，轻轻拔出梳子，取出模板中的凝胶，于密封袋中放4℃中备用。2.4耗材主要实验耗材及厂家耗材名称厂家EP离心管美国康宁公司(CORNING)一次性吸管美国康宁公司(CORNING)PCR96孔板美国伯乐BIO-RAD一次性加样枪头美国康宁公司(CORNING)一次性90mm培养皿上海晶安生物科技有限公司3实验方法3.1无菌操作制作LB培养皿、DNA转化、挑菌、摇菌时，为防止培养皿、DH5α感受态细胞被细菌污染，试验过程中所用物品必须事先消毒好备用，整个试验过程应始终保持无菌操作。1）实验开始前，先用75%酒精棉球擦拭三遍超净工作台台面，然后关上前玻璃门，打开超净工作台的紫外灯设置成照射30分钟，紫外线消毒完成后再打开通风开关10分钟除去紫外线消毒产生的臭氧。实验前用肥皂按照七步洗手法洗净双手，再用75%酒精消毒皮肤，戴好帽子、口罩和一次性灭菌橡胶手套。2）酒精灯、试管架等物品用75%酒精擦拭然后再放入操作台内，工作台面上的用品可按操作者个人习惯合理摆放，但酒精灯要放在工作台面的最中央。所有操作应尽量在酒精灯火焰15厘米周围的中央无菌区内进行，切勿在超净工作台边缘等远离酒精灯的地方操作。实验用品用完后要及时清理，有利于实验操作和超净工作台的气体流通，使无菌操作工作区域保持清洁与宽敞，预防交叉污染。3）进行实验时，不要咳嗽或大声吵闹，防止口腔中的细菌喷向工作台。先点燃酒精灯，所有操作都在火焰15cm附近进行。培养皿不要过早打开，以防止空气中的细菌病毒等病原体的污染。打开培养皿等容器时，锥形瓶口、玻棒等接触无菌物品的地方都要在酒精灯火焰上烧灼以达到灭菌效果。为防止细菌等病原体下落污染，应尽量避免在打开的容器上方操作，更不要碰触吸管、枪头等灭菌物品的内侧，若已碰触，25 泰山医学院硕士学位论文应立即在火焰上烧灼或丢弃；安装时吸管时先在火焰上烧灼数秒，避免管口向上放置，以防液体倒流而污染胶头，所用吸管要专管专用，不可交替使用。图2-1乙型肝炎病毒DNA测序实验步骤示意图图2-2pLBVector示意图谱3.2标本采集2015年10月和2016年6月分两次共采集西藏自治区阿里地区乙肝患者血液标本95例，2015年10月第一次采集阿里地区乙肝患者血样56例，男性21例，女性35例；2016年6月份采集39份，男性23例，女性16例。年龄为5月~73岁。采血者早晨空腹用真空负压采血管定量采集静脉血液3-4mL，放置水浴箱待凝固后，用普通离心机分离出血清，分装在1.5mL的离心管里放置-80℃保存待检。3.3血清中HBVDNA提取选用病毒基因组（离心柱型）DNA提取试剂盒，该试剂盒采取可以特异性结合DNA的吸附柱和独特的缓冲体系，可提取血液中的基因组DNA，离心吸附柱中采用高效、专一的硅基质材料以吸附DNA，将标本中的杂质蛋白及细胞中的其他有机化26 泰山医学院硕士学位论文合物，可以最大限度的去除。提取基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。操作前要将适量体积的无水乙醇加入到缓冲液GD和漂洗液PW中，并做好标记备用。1）取出干净的1.5mL离心管于架子上，按顺序标号，加入样本血清200μl向标记好的1.5mL离心管中，若样品小于200μl时，可加配好的缓冲液GS补足体积至200μl。2）在样品中加入200-500μl的细胞裂解液CL，充分颠倒混匀数次，放入离心机10000rpm（~11500×g）离心1min，取出后将上清液倒掉，留取沉淀，在沉淀中加入200μlGS缓冲液，振荡至彻底混匀（裂解如果不彻底，可重复以上操作一次）。3）加入20μl蛋白酶K（ProteinaseK）溶液，混匀。4）再加入配好的GB缓冲液200μl于1.5mL离心管中，充分颠倒混匀数次，置56℃温浴3~4小时，温育中间再颠倒混匀数次，使溶液应变透亮，如果3-4小时溶液未彻底变透亮，要再延长时间使溶液裂解至透亮为止。5）在透亮的溶液中加入上述体系1/3体积的无水乙醇，然后充分颠倒混匀，如果期间出现絮状沉淀属于正常情况。6）取CB3吸附柱对应先编号，再插入到干净的收集管中，将上一步所得溶液或絮状沉淀全部都对应好号加入到相应的CB3吸附柱中，盖好盖子放于离心机12000rpm（~13400×g）离心30s，取出后将收集管中的废液倒掉甩干，把CB3吸附柱再重新插入到收集管中。7）向CB3吸附柱中加入500μl已加好无水乙醇的GD缓冲液，放入离心机，设置12000rpm（~13400×g）离心30s，离心完后取出CB3吸附柱，倒掉收集管中的废液甩干，然后再将CB3吸附柱插入到收集管中。8）向CB3吸附柱中加入600μl已加好无水乙醇的PW漂洗液，放入离心机设置12000rpm（~13400×g）离心30s，取出CB3吸附柱倒掉收集管中的废液，然后再将CB3吸附柱插入到收集管中。9）再次向CB3吸附柱中加入600μl已加好无水乙醇的PW漂洗液，放入离心机，设置12000rpm（~13400×g）离心30s，取出CB3吸附柱，倒掉收集管中的废液，然后再将CB3吸附柱插入到收集管中。10）将CB3吸附柱开盖置于离心机12000rpm（~13400×g）离心2min，倒掉废液，将CB3吸附柱开盖于室温放置数分钟，为保证DNA的洗脱要将CB3吸附柱彻底晾干，去除残留乙醇和残余的漂洗液。27 泰山医学院硕士学位论文11）将吸附柱CB3放入新的1.5mL或2mL标记好号的离心管中，小心的将70μl已预热（65℃）的TB洗脱缓冲液悬空滴加入到CB3吸附柱中间膜位置。室温放置5min，离心机设置12000rpm（~13400×g）离心2分钟，洗脱DNA将溶液通过离心收集到离心管内。12）将离心所得溶液再加入到吸附柱CB3中间位置再次洗脱DNA，室温放置5min，离心机设置12000rpm（~13400×g）离心2分钟，收集残留DNA，从而使HBVgDNA收集完全，将DNA产物保存至-20℃，以防止DNA降解。3.4聚合酶链反应（PCR）扩增HBV核酸及胶回收3.4.1引物设计据已发表全基因组序列（AccessionNo.:FN545834、GU563555、HQ684848、GU563561、AB583679、JF754625、AF405706、AB375160等）来设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供合成，引物序列分别如下：表2-1HBVf1片段、f2片段扩增引物预期片段的大小简写引物序列（bp）f1-F5`-CTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTR-3`1400f1-R5`-GGTGAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3`5`-GCACCAGCACCATGTAACTTTTTCACC-3`f2-F5`-CCAGAAGAACCAACAAGAAGATGAGGC-31800f2-R`3.4.2PCR扩增PCR方法扩增HBVDNAf1（1400bp）、f2（1800bp）片段以提取的HBVDNA产物为模板，PCR扩增HBVf1（1400bp）、f2（1800bp）片段基因，扩增体系和条件如下：ddH2O7μlHBVDNA产物1μl2×TapMasterMix10μl上游引物（25uM）f1/f21下游引物（25uM）f1/f21总体积20μl28 泰山医学院硕士学位论文PCR反应条件：①℃95预变性5分钟，②循环体：95℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸120s，设置35个循环。③补齐延伸72℃10分钟，④低温保存：4℃保存。PCR产物有1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。3.4.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳取PCR扩增产物，参照文献《分子克隆实验指南》中琼脂糖凝胶电泳步骤进行，具体方法简述如下：将配制好的1%琼脂糖凝胶放入到电泳槽内，加1×TAE电泳缓冲液覆没琼脂糖凝胶，用微量移液器按序号各孔加入对应的5uLPCR产物与电泳染液混合物，加入3μl的10×Loadingbuffer，对应序号加入到以1%琼脂糖凝胶制备好的凝胶样品孔中，同时加入5uLDL2000DNAMarker。接通电极调至电压100V、时间30min，跑样完毕后电泳仪自动报警。取出琼脂糖凝胶放于紫外光凝胶成像分析系统中，观察结果并照相纪录。3.4.4PCR产物纯化回收1）实验前准备：刚打开新试剂盒，将DNAWashBuffer试剂按瓶子上的标签加入60mL无水乙醇，且做上记号“√”表示已加入无水乙醇；100mg琼脂糖凝胶加入BufferGC100μl；BufferGC在运低温运输过程中可能会有沉淀，请在37℃溶解后使用；洗脱前ElutionBuffer试剂在55-60℃水浴中预热。2）琼脂糖凝胶产物回收：在紫外线照射下，以最快的速度从琼脂糖凝胶电泳产物上割下含有HBVDNA的目的条带，将其装入到干净的1.5mL或者2mL的干净离心管中，用天平称其重量、编号放入架子中，向装HBVDNA的目的条带的离心管中加入1倍体积BufferGC溶胶液，将离心管放入55℃~60℃水浴锅8~10min，为确保胶块充分溶解，温育其间应不断温和地颠倒混匀离心管。如果胶块溶解不完全，可以再补加一些BufferGC溶胶液或继续多放置一些时间，让胶块震荡混匀完全溶解，拿出离心管插到试管架中室温备用。3）取吸附柱编号后插入到收集管中，将上一步骤的溶胶溶液加入到编号的吸附柱中（每次不能超过700μl），室温放置2min，13000×g离心1min，将收集管中的废液倒掉甩干，再将吸附柱插入到收集管中。重复步骤（3）把全部的溶胶溶液回收完为止。29 泰山医学院硕士学位论文4）向吸附柱中加入650μl使用前已加入无水乙醇的DNAWashBuffer漂洗液，室温下离心机13000×g离心30s，取出后将收集管中的废液倒掉甩干，再将吸附柱插入到收集管中。5）向吸附柱中加入650μlDNAWashBuffer漂洗液，设置离心机13000×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱插入到收集管中。6）将吸附柱开盖，设置离心机13000×g离心2min，从离心机中取出开盖放于室温几分钟目的为尽量除尽漂洗液，防止漂洗液对后续试验的影响，保证实验的准确性。7）将吸附柱放到一个新的干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μl~50μl55~60℃水浴中预热的洗脱缓冲液ElutionBuffer（10mMTris-HCL，pH8.5），室温下放置1min。13000×g离心1min，收集DNA溶液。8）将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重新重复上述步骤洗脱一次以提高DNA的回收量。9）回收的产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，置-20℃保存待用。3.5载体构建及菌落PCR酶切鉴定3.5.1f1、f2片段的PCR产物与克隆载体连接pLB零背景快速克隆试剂盒是一种无需蓝白斑删选的阳性选择克隆系统试剂，最大限度的缩短了克隆筛选的时间。对任何平末端或粘性末端的PCRDNA产物的片段都可以高效的克隆，不管DNA片段是磷酸化还是非磷酸化都是有效的。只需5min即可得出超过95%的阳性选择载体和插入片段连接的阳性重组克隆物。平末端PCR产物可由具有校正活性的聚合酶（如：PfuPolymerase）扩增直接连入克隆载体。粘性末端PCR产物由无校正活性的聚合酶（如：TaqPolymerase）或聚合酶混合物扩增，但在连接前需用试剂盒提供的热稳定DNA平端化酶进行末端平端化（7min）即可。连接产物可直接转化常用的感受态菌体菌株。pLB载体是一个新颖的即用型阳性选择克隆载体，多克隆位点插入外源片段时其含有的致死基因（内含多克隆位点）会引起基因失活，因此只有转化了重组质粒的感受态细胞才能存活，形成克隆菌落。当无外源性片断插入时自身环化的pLBVector表达致死的毒性蛋白转化后就可杀死感受态细胞。经PCR扩增出的f1片段、f2片段与载体pLBVector连接：连接体系和步骤如下：①粘性末端连接方法，取高压灭菌过的离心管按样本编号。30 泰山医学院硕士学位论文②在编号的无菌离心管中加入下列的各种组分，来进行平末端化反应。目的片段f1或f21μl2×ReactionSolution5μlBluntingEnzyme0.5μlddH2O1.5ul总体积8μl轻轻震荡离心管以混匀反应液，短暂离心3-5分钟使管壁上的液体全部下沉到官底。③将混合反应液在PCR扩增仪上，设置20℃反应2min一个循环，然后设置70℃反应5min一个循环，停止后立刻放置于冰上短暂冷却后备用。④向平端化的反应体系中加入下列成分pLBVector（35ng/ul）1μlT4DNALigase(3U/ul)1μl⑤将上述混合反应液置于16℃反应2小时。反应结束后将反应液放4℃保存，以进行后续的转化反应。3.5.2感受态菌体的制备（简易制备法)将菌液从-20℃冰箱中取出，放置在冰水混合物中冰浴至溶解后，准备一个无菌试管加入5mLLB培养液，取出菌液200μl加入到LB培养液中，置37℃摇床培养7~8个小时，从复苏的菌液中取出200μl菌液，加入到5mLLB培养液中，将试管放在37℃摇床上，培养4个小时左右，菌液出现轻度浑浊但仍有一定的透明度停止摇床。将扩增的菌种分装至5个2ml无菌离心管中，每管1ml菌液，于离心机中13000rpm离心1分钟，然后每管加入预冷的0.1molCaCl2溶液200μl使菌液悬浮沉淀，然后置于冰水混合物中冰浴30分钟备用3.5.3连接产物的转化将上述f1、f2片段的PCR产物与克隆载体连接后的DNA产物进行转化，连接产物转化步骤简述如下：1）制备含有氨苄青霉素终浓度100ug/ml的LB琼脂糖平板。将平板放置在37℃，至少预热30min。2）转化31 泰山医学院硕士学位论文a.将DH5α感受态细胞从-80℃冰箱取出放于冰浴上解冻，然后编号，待其刚刚解冻时取5μl连接产物加入100μlDH5α感受态细胞中，为了达到最好的转化效果连接产物的加入量不应超过感受态细胞体积的十分之一，轻轻混匀感受态细胞，放在冰水混合物上冰浴30min。b.立刻将离心管放入提前设置好的42℃水浴锅中，热激90sec，取出离心管后立刻快速的转移到冰水混合物中冰浴，使之冷却2~3min，过程中不要摇动离心管。c.将37℃预热的LB（不含抗生素）向感受态细胞的离心管中加入500μl，在37℃震荡培养箱里150rpm培养45min，使细菌复苏，并表达质粒编码的相关抗生素基因。d.将离心管于离心机中以8000rpm离心1min。倒掉LB培养液，剩余一部分用微量移液器充分吹打混匀。吸取50μl菌液加到含有100ug/μl氨苄青霉素的LB固体琼脂平板（提前37℃预热）上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻的将细菌均匀涂开，将平板正置于37℃温箱中培养0.5h后，待平板表面干燥后，将平板倒置过来，继续培养10-14小时。3.5.4挑菌培养严格无菌操作，首先在培养皿上标记好要挑取的单个菌落，取高压灭菌的7ml离心管编号，取高压灭菌好的含有终浓度氨苄青霉素浓度为100ug/ml的LB培养液，每个离心管加入3ml，用无菌枪头挑取平板上标记好的单个白色菌落放入3ml的LB液体培养基中，盖好盖子于37℃摇床上振荡培养6-8小时。然后取1μl菌液作为DNA模板，按照步骤3实验体系进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳验证菌液。3.5.5菌液PCR鉴定挑取平皿中的单个菌落的部分菌体作为DNA模板进行PCR鉴定，反应体系如下：ddH2O7μl菌液1μl2×TapMasterMix10μl上游引物（25uM）1下游引物（25uM）1总体积20μlPCR反应条件：①℃95预变性5分钟，②循环体：95℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸120s，设置35个循环。③补齐延伸72℃10分钟，④低温保存：4℃保存。PCR产物有1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。32 泰山医学院硕士学位论文菌落PCR鉴定阳性的转化菌的培养：挑取单个阳性菌落接种到3mlLB培养液（含有Amp）中，设置37℃震荡培养箱300rpm，将装有菌液的试管放在培养箱中10-14h。取菌液进行PCR鉴定，对鉴定结果阳性的菌液留1ml待测序，菌落PCR鉴定正确样品菌液，送上海生工生物工程有限公司进行测序。3.6基因测序分析把菌落PCR鉴定阳性样品的菌液测序结果利用生物学软件进行分析，首先对测出的HBV基因组中f1片段和相应号的f2片段的基因序列拼接成HBV全基因序列，然后进行序列比对和进化分析，具体的步骤如下：用DNAstar软件进行进行拼接，校正。在Genbank中下载HBV的全基因组序列做参考，运用Bioedit软件进行序列的相似性分析，运用RAxML软件构建遗传进化树。33 泰山医学院硕士学位论文结果1、HBV的PCR扩增结果从95例世居西藏阿里地区的藏族乙型肝炎患者血清利用病毒基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以筛选出的DNA样本为模板，PCR扩增f1片段，f2片段，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行验证，有60例提取乙肝病毒DNA阳性，结果如图2-3显示，f1片段在1400bp处显示出目的条带，图2-4显示f2片段在1800bp处显示目的条带，与预期结果一致。2、T-f1/T-f2转化菌的菌落PCR鉴定目的DNA转化DH5α感受态细胞，以氨苄青霉素筛选的菌落做为模板，进行PCR鉴定。1%的琼脂糖凝胶电泳将PCR产物进行验证。结果显示，在1400bp和1800bp左右各出现相互对应的目的条带，分别为f1片段和f2片段，说明转化成功。60例DNA阳性标本中f1片段转化成功为60例，f2片段转化成功为60例。转化菌落如图2-5所示，转化PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳如图2-6所示。3、T-f1/T-f2片段测序结果对转化鉴定正确的转化菌液T-f1、T-f2进行测序。经上海生工生物工程有限公司测序获得53例全基因组，见表2-2。表2-2西藏阿里地区HBV测序结果采集时间毒株数量RT-PCR阳性全基因组数量2015.105626202016.63934334、基因序列分析结果对测序成功的53例基因数据结果用DNAstar软件中的EditSeq拼接，MegAlign方法对测序结果进行比对，采用RAxML系统绘制进化树，选用GTRCAT模型作为核苷酸替换模型，用AI(Adobeillustrator)软件勾画出HBVDNA进化树，并同标准序列比较。参考序列为Genebank上发表的HBVpol区的RT编码的序列差异进行基因分型（GenBank：AY862862、DQ478898、EU678470、AY817510、AB042284、FJ562263、AP011108、AB033557、AB270538等）。53株HBV全基因序列分析得出，HBVD型1例占2%，该D型属于D3亚型；HBVC型1例为C2亚型占2%，HBVC/D重34 泰山医学院硕士学位论文组型51例占96%。其中CD1型36例占C/D重组型的69%，CD2型占C/D重组型的31%。表2-3西藏阿里地区HBV基因型采集时间全基因组数量C2型CD1型CD2型D3型2015.1020115312016.633020130合计531351615、遗传进化树分析[56]我们采用RAxML法进行系统进化树的分析。该GTRGAMMA模型被用来作为核苷酸替换模型，并进行2000次的重复。根据分离株的全基因组，我们分别构建了HBVC基因型和D基因型的遗传进化树。分析显示52株HBVC基因型分为多个亚型分支，C2亚型分支和C/D重组分支，C/D重组分支被划分为2个分组，即C2、CD1和CD2亚型（见图2-7，红色为西藏阿里地区HBV基因型毒株）。1株HBVD基因型被划分为D3亚型（见图2-8，橘黄色为西藏阿里地区HBV基因型毒株）。分析显示，西藏自治区阿里地区53株HBV基因型中男性有19株CD1型，7株CD2型，1株D3型；女性有16株CD1型，9株CD2型。表2-4西藏自治区阿里地区HBV基因型在男女性别中的分布情况性别C2基因型CD1基因型CD2基因型D3亚型男性019(36%)7(13%)1（2%）女性1（2%）16(30%)9(17%)0西藏自治区阿里地区HBV基因型在各年龄段分布20岁以下CD1型20株，11株CD2型；20岁以上年龄段有1株C2型、15株CD1型、5株CD2型、1株D3型。表2-5西藏自治区阿里地区HBV基因型在各年龄组中的分布情况年龄C2基因型CD1基因型CD2基因型D3亚型0-20岁020(38%)11(19%)0≥21岁1（2%）15(28%)5(11%)1（2%）35 泰山医学院硕士学位论文图2-3PCR扩增f1（1400bp）片段结果1：2000bpDNAMarker；2：空白对照；3-27：f1片段提取DNA阳性标本（标本编号：1.1ab、1.3ab、1.4ab、1.6ab、1.7ab、1.8ab、1.9ab、1.10ab、1.13ab、1.15ab、1.19ab、1.20ab、1.24ab、1.25ab、1.26ab、1.32ab、1.35ab、1.44ab、1.45ab、2.1AB、2.2AB、2.3AB、2.5AB、2.7AB、2.8AB、）图2-4PCR扩增f2（1800bp）片段结果1.DL2000DNAMarker；2：空白对照；3-19：f2片段提取DNA阳性标本（标本编号：1.1ab、1.3ab、1.4ab、1.6ab、1.7ab、1.8ab、1.9ab、1.10ab、1.13ab、1.15ab、1.19ab、1.20ab、1.24ab、1.25ab、1.26ab、1.32ab、1.35ab）36 泰山医学院硕士学位论文图2-5转化阳性菌落(1.1ab、1.2ab)图2-6T-f1（1400bp）、T-f2（1800bp）菌落PCR鉴定结果1：DL2000DNAMarker；2：空白对照3-7：f2片段（标本编号：1.1ab、1.3ab、1.4ab、1.6ab、1.7ab）8-12：f1片段（标本编号：2.1AB、2.2AB、2.3AB、2.5AB、2.7AB）37 泰山医学院硕士学位论文图2-7西藏阿里地区HBVC基因型序列进化树图2-8西藏阿里地区HBVD基因型序列进化树38 泰山医学院硕士学位论文讨论乙型肝炎病毒基因型具有明显的地区分布特征，且相对稳定。目前乙肝基因型根据其全基因组核苷酸序列异源性≥8%或者S区基因核苷酸序列异源性≥4%划分为A、[57]B、C、D、E、F、G、H8个基因型。不同地区有不同的基因型分布，且不同的基因型有不同的变异特点、临床表现和药物敏感性。本次研究显示95例西藏阿里地区世居乙型肝炎藏族居民，通过聚合酶链反应扩增出60例阳性DNA，HBVDNA阳性率为63%，西藏阿里地区距离山东泰安几千公里，没有直达交通工具，只能在陕西或其他机场转机，标本采集保存运输可能受到影响，核酸阴性样本的出现或与DNA降解有关。提取出的HBVDNA样本经1%琼脂糖凝胶电泳、胶回收、连接、转化、挑取单菌落、摇菌，通过菌液测序，获得53株HBV全基因组序列，用基因分析软件DNAstar等进行拼接，参考已发布标准基因序列进行比对分析，并建立HBV进化树，得出西藏阿里地区乙肝病毒的基因型。在53株中有1株属于HBVD型占2%，根据进化树及同源性分析该HBVD基因型属于D3亚型；有1株为C2亚型，51株为HBVC/D重组型占96%。51株C/D重组型中有35株属于CD1型（占C/D重组型69%），16株属于CD2型（占C/D重组型31%），由此看出西藏阿里地区乙肝病毒基因型分布多为C/D重组型，且以CD1亚型为主。本次研究数据表明阿里地区的HBV普遍存在基因型重组事件，96%的C/D重组型，且该地区HBV基因谱较窄，只有C/D重组[19,21]型和极少量的D型，无其他型别的检出。而在我国主要的HBV基因型为B、C型，[25]而在与西藏阿里地区交界的印度等国的HBV基因型主要为D型，所以说基因重组事件较多和基因普较窄可能与该地区占地面积较大，达三十多万平方公里，人口密度小，仅约十万左右居民，地大人稀，交通不便，人员流动较小，和尼泊尔、印度等国相邻等因素有关。西藏阿里地区藏族城镇和农牧区居民乙型肝炎病毒高携带率的检出和其感染的乙型肝炎病毒基因型的检出，为本地区的乙肝防治工作提供有利的依据，同时也强调了加强本地区乙肝防治工作已迫在眉睫。关于降低乙肝携带率阻断乙肝的传播，国内[58-60]外的研究均显示疫苗接种是首要的手段，尤其在当前新生儿接种乙肝疫苗阻断乙[61-63]肝传播的效果已走向成熟且已得到充分的肯定的背景下，在不断加强农牧民的传染病防治知识和防治意识的前提下，应针对西藏阿里地区地理环境和生活习惯建立一套适合本地区的乙肝防治工作方案，降低该地区乙肝感染率。乙肝病毒基因分型的确39 泰山医学院硕士学位论文定，为当地乙型肝炎患者病情估计，药物治疗和预后判断提供可靠依据。对于不同基因型的致病性、致病机制、基因型与疫苗的开发研制及临床治疗等方面还需深入研究，而通过研究乙型肝炎患者基因型寻找乙肝防治的有效手段，将成为一个造福西藏阿里地区乃至全球的乙肝患者重大研究课题，还需我们更加努力思考和研究。40 泰山医学院硕士学位论文结论1、西藏阿里地区乙肝患者53株HBV全基因组中，51株（96%）病毒序列为C/D重组型，1株（2%）为C2型，仅1株（2%）为D型，西藏阿里地区1例HBVD型属于D3亚型，表现出较窄的HBV基因型谱。2、西藏阿里地区C/D重组型HBV分离株的全基因序列位于CD1和CD2亚型，其中35株（69%）为CD1亚型，16株为（31%）CD2亚型。显示西藏阿里地区乙肝患者HBV分离株的全集因序列中普遍存在基因重组事件。41 泰山医学院硕士学位论文参考文献[1]张勇扬,王爱平,潘金顺等.乙肝病毒基因型及基因变异与原发性肝癌的相关性[J].江苏医药.2011(11):1279-1281.[2]张建生,刘骏,盛吉芳.广泛接种乙肝疫苗后不同年龄人群急性乙型肝炎危险因素的对应分析[J].中国微生态学杂志.2007(2):193-196.[3]OttJJ,StevensGA,GroegerJ,etal.GlobalepidemiologyofhepatitisBvirusinfection:Newestimatesofage-specificHBsAgseroprevalenceandendemicity[J].Vaccine.2012,Vol.30(No.12):2212-2219.[4]LuFM;ZhuangH.ManagementofhepatitisBinChina[J].ChinMedJ(Engl).2009,Vol.122(No.1)：3-4[5]LuoK.SeroepidemiologicalinvestigationsonhepatitisBvirusinfectioninthepopulationsofHan,Tibetan,Dai,Yao,Uygur,MongolandLinationalities[J].ZhongHuaLiuXingBingXueZaZhi.1993;14(N5)266-336.[6]MahoneyFJ.Updateondiagnosis,management,andpreventionofhepatitisBvirusInfection[J].ClinicalMicrobiologyReviews.1999,Vol.12(No.2):351-366[7]Arauz-RuizP,NorderH,RobertsonBH,etal.GenotypeH:anewAmerindiangenotypeofhepatitisBvirusrevealedinCentralAmerica[J].TheJournalofGeneralVirology.2002:2059-2073.[8]ZengG,WangZ,WenS,etal.Geographicdistribution,virologicandclinicalcharacteristicsofhepatitisBvirusgenotypesinChina[J].ViralHepat2005;12:609-617[9]FungJ,YuenMF,YuenJC,etal.LowserumHBVDNAlevelsanddevelopmentofhepatocellularcarcinomainpatientswithchronichepatitisB:acase-controlstudy[J].AlimentaryPharmacology&Therapeutics.2007,Vol.26(No.3):377-382.[10]WongDK,YuenMF,PoonRT,etal.QuantificationofhepatitisBviruscovalentlyclosedcircularDNAinpatientswithhepatocellularcarcinoma[J].JournalofHepatology.2006,Vol.45(No.4):553-559.[11]WeifengShi,MichaelJ.Carr,LindaDunford,etal.Identificationofnovelinter-genotypicrecombinantsofhumanhepatitisBvirusesbylarge-scalephylogeneticanalysis[J].Virology.2012,Vol.427(No.1):51-59.[12]Shi,Weifeng,Zhang,Zhong,Ling,Cheng,etal.HepatitisBvirussubgenotyping:History,effectsofrecombination,misclassifications,andcorrections[J].Infection,GeneticsandEvolution.2013:355-361.42 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泰山医学院硕士学位论文[57]OkamotoH;TsudaF;SakugawaH;etal.TypinghepatitisBvirusbyhomologyinnucleotidesequence:comparisonofsurfaceantigensubtypes[J].JOURNALOFGENERALVIROLOGY.1988,69(10):2575-2583.[58]刘桂芬,焦春秀.新生儿乙型肝炎病毒母婴传播早期干预研究[J].中国现代医生.2016(3):56-59.[59]杨思佳,刘瑾红,佟雪莲,等.乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白联合接种对母亲HBsAg阳性的新生儿感染情况的影响[J].海南医学院学报.2016(7):698-700.[60]倪正平,陈陶阳,陆玲玲,等.江苏省启东市1987-2005年出生人群的HBsAg携带状况及变化趋势分析[J].国际病毒学杂志.2016(1):47-49.[61]余滨,王夏,韩荣华,等.武汉市近10年1-3岁儿童乙型肝炎疫苗接种率和乙型肝炎病毒表面抗原携带率调查及发病率分析[J].中国计划免疫杂志.2005(2):117-119.[62]吕建新,樊绮诗编.临床分子生物学检验供医学检验专业用[M].北京:人民卫生出版社.2012:143-146.[63]庄辉.加强对新生儿以外人群乙型肝炎疫苗免疫[J].中华流行病学杂志.2004(5):376-376.46 泰山医学院硕士学位论文综述乙型肝炎病毒分型检测和流行病学研究进展李耀妮综述史卫峰王玉审校乙型肝炎是一种世界范围内普遍流行的传染病，对人类健康造成很大的威胁。据相关报道统计，全世界大约有20亿人已经感染了乙型肝炎病毒（HBV），其中慢性乙肝病毒携带者约3.5~4亿人。每年约有100万人死于HBV相关的疾病。近年来，HBV发病率显著增高。中国作为HBV高发地区，大约有9300万人为HBV携带者，[1]约2000万人为慢性乙型肝炎患者。1、HBV的分子结构及分型HBV是一种DNA病毒，属嗜肝DNA病毒科。其在血清中的存在形式有三种：大球形颗粒、小球形颗粒、管状颗粒。目前认为，大球形颗粒，即完整的HBV颗粒，是最具代表性的HBV颗粒形态。1970年由丹娜发现，也被称为Dane颗粒，直径约42nm，为不完全环形双链DNA分子，由包膜和核心组成。双链长短不同，长链长度固定约3200个核苷酸，为负链；短链长度不定，为正链。长链含DNA分子的全部遗传信息，其基因组有4个开放编码区，依次为S区（S基因、前S基因）、C区（前[2，3]C基因、C基因）、P区、X区，可编码不同病毒蛋白。可根据其基因组的不同，进行HBV病毒分型。1.1HBV分型-血清型乙型肝炎表面抗原(HBsAg)S基因区编码是乙肝病毒包膜的主要蛋白，其不同的抗原性取决于最常见的抗原决定簇和两个互斥的决定簇w/r、d/y。由Lebouvier于1972年根据不同的表面抗原决定簇，提出乙型肝炎血清中有四个主要的亚型：adw、[4]ayw、adr、ayr。随后研究发现w型存在w1-w4四种变化，并发现新型决定簇q，因此HBsAg又进一步被分为adrq+、adrq-、ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、[5，6]adw4这九个亚型。1.2HBV分型-基因型关于HBV基因分型的学说最早可追溯到1988年，来自日本的研究者Okamoto等人首先建立此种分型体系。他首先根据自日本和印度尼西亚收集到的3株相同血清型HBV样本进行DNA分析，发现差异在3.9%~5.6%之间，再比较于美国同种血清型的2株HBVDNA全序列，发现差异性达8.3~9.3%，由此说明，血清类型并不能反映HBVDNA基因组之间的区别。在18个不同的乙肝病毒血清型菌株序列分析结果显示，两47 泰山医学院硕士学位论文个全基因序列的差异性为8.0%或更高的分类标准时可将基因型划分为A型、B型、C[7]型、D型。1992年，Norder等人经过对32例患者的HBVDNA基因测序比较，根据S基因序列差异>4.0%标准划分HBV基因型，研究中不仅证实了Okamoto分型的结论，[8]还发现E和F两个新基因，并建立了进化树系统。Stuyver等人于2000年，发现A-F[9]型新基因型的不同，将其命名为G基因型。在2002年有关的报道中，由Arauz-Ruriz[10]等人又从尼加拉瓜中分离出H基因型并被命名。由此，HBV病毒共8中基因型，分别为A-H型。此种分型方法在后续研究中得到广泛应用。虽然乙肝病毒血清型并不能反映基因组之间的差异，但基因型之间仍存在一定的相关性，也就是说即使血清型和基因型不一定是一一对应的关系，可不同的血清亚型[11,12]也会属于相同的基因型，不同的基因型也可以包含相同的血清型。由Norder发现血清型adw2ayw这两种都存在基因A型当中；adw2、ayw1存在于基因型B中；C型中有血清型adrq+、adrq-、ayr和adw2；D型中有血清型ayw2和ayw3；E型中[3,有ayw4、F型中有adw4、adw2、ayw4；G型、H型中分别为血清型adw2、adw4)8,11]。2、HBV基因分型的方法当前，国内外乙型肝炎基因分型普遍使用的方法主要包：括聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)法、核苷酸序列测定方法，类型特定的引物PCR单克隆抗体酶联免疫分析法的分类方法，以及PCR微板核酸杂交-ELISA法等方法。2.1核苷酸序列测定法从已有基因分型的研究过程可以看到基因的核苷酸序列分析法是HBV基因分型的经典方法，包括S基因测序分型、全基因组测序这两种方法。已报道，Okamoto[7]等人采用全基因组测序分型法根据序列间差异性是否>8%测出A-D基因型。Norder根据S基因测序序列间差异性是否>4%测出A-F基因型，并绘制出进化树，这种分析[8]方法和全基因组测序的方法分类结果一致。核苷酸序列分析是HBV黄金标准的分型方法，结果准确、可靠，但这种方法工作量大、高成本，实际的操作复杂。2.2聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）PCR-RFLP是目前最为常用的HBV基因分型方法。操作方法为对待测基因片段通过PCR技术扩增，再用特定的限制性内切酶切割，使PCR产物产生不同的酶切片段，通过凝胶电泳分辨图谱进行分型。PCR-RFLP首先由Lindh等人使用，并成功分48 泰山医学院硕士学位论文[13]型A-F基因型。此种方法操作简便，分型时间短，适用于大样本量测定，但也体现出一定的限制性。2.3型特异性引物-PCR分型法[14]Idress等人于2004年建立此种方法对A-H8中基因型分型方法。利用型特异性引物对待测标本进行扩增，得到不同长度的基因型产物，通过琼脂糖凝胶电泳分别测出不同的型别。此种方法操作简便，特异性高，为临床最常用的分型方法，但容易出现非特异性扩增，影响结果的判断。2.4单克隆抗体酶联免疫法Vsuda等发现，在不同基因型中，前S2区7种抗原决定簇有特异性组合，利用[14]辣根过氧化物酶标记过的单克隆抗体对其进行检测，从而鉴定出不同基因型。该方法适用于大规模调查，操作简捷，但仅适用于HBsAg阳性标本，对混合感染、阴性标本，此法不适用。2.5PCR微板核酸杂交-ELISA法该方法过程为待测核酸片段用PCR技术扩增，而后与各型酶标记的基因型特异性探针同时杂交，通过酶联反应测定结果。可用于混合基因型感染的标本检测，方法便捷。2013年，李明等人通过PCR反向斑点杂交技术成功测出乌鲁木齐及少数地区[15]HBV感染人群的基因分型。2.6基因芯片技术基因芯片，也称为基因矩阵，它的原理就是大量的特定基因或寡核苷酸片段作为探针以有序的方式，和高密度排列固定在玻璃或硅载体的上面，然后用荧光标记样本测试下，基于核酸的碱基配对原则杂交，检测杂交信号强度通过共焦激光系统，由计算机数据分析和处理样品分子的数量和序列信息，可以大规模、高通量的研究核酸序[15]列。采用PCR技术扩增HBV-DNA，并标记荧光，将PCR产物与点样过的探针杂交，漂洗后通过荧光扫描判定结果。目前还未报道应用此种方法对基因分型的案例。3、HBV流行病学研究根据乙肝病毒携带率，乙型肝炎在全世界被分为高、中、低流行地区，目前乙肝病毒只有在哺乳动物和人与人之间传播。其传播的途径是通过母婴传播、输液和输血传播，医源性传播等。母婴传播为高流行区最重要的传播途径，我国约有40%-50%的患者为母婴传播所致。母婴传播包括垂直传播和水平传播。垂直传播即宫内传播，此种传播途径传播比率小，约占10%左右。母婴传播最重要的传播途径为围产传播，49 泰山医学院硕士学位论文大三阳母亲传播给孩子的比率约为80%，其传播的本质为血源性传播，分娩时通过母[1]亲体液传播给婴儿。产后母乳喂养、接触等传播方式非母婴传播主要方式。血液、精液、淋巴液、羊水等均称体液。母婴传播也为体液传播的一种。输入受HBV感染的血制品、不正当的注射、手术、采血等医疗行为均有可能感染。输血传播在贫穷地区为感染的重要途径，在发达国家已比较少见。医源性传播也为重要途径，医疗单位中接触血液、其他体液的工作人员感染HBV的可能性较高。若阴道分泌物、精液中含有HBV，会经过性传播，但传播作用远不及血制品、注射等传播率高，在[1][17]低流行区，性传播和药瘾者共用污染针头为主要的感染途径。日常生活中接触密切，共用牙刷、剃须刀等行为会增加感染率。这种传播方式中，母亲HBsAg阳性者[1]危险度高于父亲。但共用餐具、咳嗽、水等并不会引起感染。就全球范围说，HBV基因型A-H分布有一定地理区域规律性，多篇报道均显示，基因型A流行于欧洲北部、欧洲西部、非洲北部及北美。B、C基因型主要分布于亚洲、大洋洲；D基因型分布较广泛，地中海地区、中东、北欧都存在；E型集中于非[18-21]洲，多见于西非；F基因型主要发现于南美、中美；G型见于美国、法国、H型[20]在中美洲及南美洲发现。除此之外，尚有一些基因亚型被鉴定并命名，基因亚型也存在地域规律。Sugauchi等报道称B型可再细分为日本亚型Bj(B1)和亚洲亚型Ba(B2)，j代表Japan，a代表Asia，两者区别在于在前C区和C区与C型病毒发[19,22]生重组的现象不同。Kramvis等报道A型包含非洲亚型Ａａ亚型与欧洲亚型Ａｅ[19,23]亚型，a代表Africa、Asia，e代表Europaea。[19]在我们国家，流行的基因型是A-D类型，以B型和C型为主。在中国北方为[18,19,24][18-19]主的是C型，南部地区为主的是B型，D型在少数民族地区，如西藏、[18]新疆和其他地方。混合感染的病人更多是以乙型肝炎基因型B+C。许多研究表明，HBV基因型在临床呈现的特点，如在老年患者中，C基因型的比例较高，在儿童和[19,20,24]青少年中，基因型B占主导地位。基因的改变和疾病的发生有着密切的联系，科研工作者对此有不同的结论。例如李朝霞在研究中发现C基因型的比例在重度慢[25]性乙型肝炎高于轻度和中度慢性乙型肝炎。刘桂艳研究B基因型比C基因型较轻，在慢性乙型肝炎预后较稳定，C基因型携带者发展为肝硬化和肝癌的的患者频率更[18]高，并假设肝硬化和肝癌的形成和可能鱼基因的分型有关。闫丽等在研究中也得出重要结论，C基因型与肝硬化和肝癌的发生密切相关，但35岁以下的肝癌相关基因[26]型为B型。一项研究显示，在香港感染C基因型的自然反应率可能低于B基因型50 泰山医学院硕士学位论文[24]。由刘俊人等人研究发现，在肝硬化患者和50岁以上的人群中，C基因型感染的肝细胞癌是相对罕见的，在不到35岁、非肝硬化患者肝细胞癌中主要以B型为主。在患者跟踪实验中，他们得出结论：C基因型和高病毒载量呈正相关，与肝细胞癌的[27]发病率之间有协同效应。鼎鑫等人的研究中还发现，在上海地区C基因型乙型肝炎病毒感染肝细胞癌是最相关的独立的因素，严重肝病或肝癌的发生与C基因型相[28]关。但雷延昌、刘映霞的研究中都得出的结论是，基因型B在重型肝炎患者以及[29~30]肝硬化患者中所占比例较高。不仅是疾病的发展，在治疗药物的反应效果中，乙型肝炎病毒基因型的不同也与药物治疗效果不同有关。目前，临床用药治疗乙型肝炎病毒感染时主要用胸腺素、干扰素，核苷类的药物。2005年，Erhardt报道在干扰素的治疗过程中，A基因型的应[31]答率高于B基因型和C基因型。同时期，Moskovitz等人通过乙肝病毒感染等人在多伦多地区五年的随访发现，基因-A基因型D对药物拉米夫定耐药性治疗上无显著[32]差异。目前，临床在治疗乙型肝炎病毒感染时主要用胸腺素、干扰素，核苷类药物。关于HBV基因型和药物之间的应答关系还在进一步的研究中。4、总结乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒引起的具有传染性的严重疾病。中国为乙型肝炎病毒感染的高流行区，传染途径广，预防并不能完全阻止其流行，因此在中国，乙型病毒性肝炎的预防治疗一直是众多医药学者想攻克的难题。近年来，乙型肝炎病毒的基因型与疾病关系，及其与药物治疗、预后等的研究日益增多，各种检验技术的发展也为人们的研究提供帮助。随着人们对HBV的认识越来越全面，其发病机理、病情的后续发展方向、治疗方案的选择等都有了可靠的理论依据。然而，针对HBV基因型的研究还不够透彻，仍需要我们的继续努力，才能实现从基因水平去判断疾病、选择合适的方案及药物进行治疗。尤其对于基因型与药物应答之间关系，尚需研究者进行进一步探索。参考文献[1]许强.乙型肝炎病毒基因型分型及流行病学研究[D].吉林大学,2006.[2]戴晨阳.乙型肝炎病毒S基因直接测序分型方法的建立及临床应用[D].天津医大学,2004.[3]LeBouvierGL..TheheterogeneityofAustraliaantigen[J].TheJournalofInfectiousDiseases.1971,Vol.123(No.6):671-675.51 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泰山医学院硕士学位论文攻读学位期间发表论文情况[1]李耀妮,王玉,董兆鹏,青松,刘小星,史卫峰.西藏阿里地区藏族人群乙型肝炎病毒携带率调查研究[J].中国卫生检验杂志,2017,(07):1032-1034.[2]李耀妮,王玉,董兆鹏,李娟,史卫峰.西藏阿里地区藏族人群乙型肝炎病毒的分子流行病学分析[J].中国病原生物学杂志,待投稿.55 1