不同方法诱导去分化脂肪细胞心肌样细胞分化的实验分析

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-------NRHCL组(P<0.05)。结论：①天花板贴壁培养法可成功的使成熟脂肪细胞去分化为DFAT细胞，DFAT细胞经乳鼠心脏组织裂解液、维生素C体外诱导分化后可再分化为心肌样细胞，是心肌细胞再生较为理想的种子细胞来源。②维生素C可以提高乳鼠心脏组织裂解液体外诱导DFAT细胞向心肌分化的效率。③与对照组相比，DFAT细胞经维生素C、乳鼠心脏组织裂解液诱导后心肌特异性标志物的mRNA和蛋白质表达水平均升高。本实验尚不能证实二者诱导能力有差异，二者联合应用可使诱导能力可增强(P<0.05)。但均未观察到有自发跳动的细胞。故本实验只诱导出心肌样心肌前体细胞，离诱导出功能心肌细胞还有较大的距离。【关键词】去分化脂肪细胞维生素C心脏组织裂解液诱导分化III---- -------EffectsofDifferentInductionConditionsonDifferentiationofDedifferentiatedFatCellsintoCardiomyocyte-likeCellsMajor:MedicinecardiovascularPostgraduate:FuhaiLiSupervisor:ChenyunZhang[Abstract]Objective：Tostudytheabilityofdifferentmethodsininducingdifferentiatedfatcells(dedifferentiatedfatcells,DFAT)todifferentiatetowardscardiomyocytesinvitroandthedifferencesofmyocardialtumor-specificmarkersexpression,andtooptimizeconditionsininducingdifferentiationofDFATcellsintocardiomyocytes,inordertoprovideexperimentalfoundationtoimproveseedcellsforacutemyocardialinfarctionincelltherapy.Method：Extractmaturefatcellsfromadiposetissueofadultrats(matureadipocytes,MA)anddedifferentiatethemintoDFATcellsbyceilingadherentculturemethod,thenculturethethird-generationDFATcellswithmediumcontainingthevitaminC(GroupI),orneonatalratheartcelllysate(GroupII),orbothvitaminCandneonatalratheartcelllysate(GroupIII),orordinarycompletelymedium(GroupIV,controlgroup)forthreeweeksinductiontraining,thenobservethechangesofcellmorphology.CarryoutcTnTimmunofluorescencetoidentifyDFATcellofthreeweeksinduction,andreal-timePCRandwesternblottingtodetecttheexpressionofmyocardialspecificmarkerscTnT,GATA-4andNKx2.5ofeachgroupinmRNAandproteinlevels.Results：Aftertheceilingadherentculturing,MAdifferentiatedintoDFATcellswithfibroblastsmorphologyinvitro.AftervitaminCinduction,neonatalratheartcelllysateinductionorthejointinduction,DFATcellswasobservedtostretchthecellbodyintospindleshape,enlargetheirsizeandprotrudebranchingprocesses,andconnectwithothercellstoformcellclusters,myotube-likestructurewasobservedandcellmorphologywassimilartomyocardialcells,butnospontaneousbeatingcellswereobserved.ImmunofluorescencetestsofDFATcellafter3weeksinductionrevealedmyocardialspecificmarkerscTnTpositivecellsinthethreeexperimentalgroups.Comparedwiththecellsinthecontrolgroup,theexpressionofmyocardialspecificmarkerscTnT,GATA-4andNKx2.5ofDFATcellswiththreeweeksIV---- -------inductioninexperimentalgroupswereelevatedinmRNAandproteinlevels(P<0.5)andtheexpressionlevelinGroupⅢwerehigherthanGroupⅠandGroupⅡ(P<0.05).Conclusion：(1)TheceilingadherentculturemethodcansuccessfullydedifferentiatematurefatcellsintoDFATcells,andtheadvantagesofDFATcellsderivingfromfattissuesuchasrichsourcesandpossibleautologoussource,highpurityandstrongcellproliferationability,lowimmunogenicitymakethemtheidealsourcesofseedcellsinmyocardialcellregeneration.(2)VitaminCenhancedtheeffectionofNRHCLdifferentiateDFATcellsintocardiomyocyte-likecells.(3)Comparedwithcontrolgroup,theexpressionofmyocardialspecificmarkerscTnT,GATA-4andNKx2.5ofDFATcellswiththreeweeksinductionwereelevatedinmRNAandproteinlevels.Thisexperimentcannotconfirmdifferenceofthetwosubstancesininductionability,andtheirjointapplicationcanenhancetheinductionability(P<0.05),butnospontaneousbeatingcellswereobserved.Thisexperimentmerelyinducedmyocardial-likemyocardialprecursorcells,andwasfarfrominducingfunctionalmyocardialcells.[KeyWords]dedifferentiatedfatcells,vitaminC,neonatalratheartcelllysate,induceddifferentiationV---- -------目录原创性声明和版权使用授权书„„„„„„„„„„„„„„„Ⅰ中文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„Ⅱ英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„Ⅳ目录„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„VI略缩词表„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„VII引言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„01材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„03结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„18讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„23结论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„25参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„26综述„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„30作者简历„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„41致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„43学位论文数据集„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„44附：临床能力考核相关材料VI---- -------英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称AAascorbicacid抗坏血酸BMSCsbonemarrowmesenchymalstemcells骨髓间充质干细胞CABGCoronaryarterybypassgraft冠状动脉旁路移植手术治疗CHDCoronaryatheroscleroticheartdiease冠状动脉粥样硬化性心脏病CHFcongestiveheartfailure充血性心力衰竭CSCscardiacstemcells心脏干细胞DFATdedifferentiatedfat去分化脂肪细胞ESCsembryonicstemcells胚胎干细胞iPSCinducedpluripotentstemcells诱导多能干细胞MAmatureadipocytes成熟脂肪细胞NRHCLneonatalratheartcelllysate乳鼠心脏组织裂解液PCIpercutaneouscoronaryintervention经皮冠状动脉介入治疗PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应VII---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文0引言随着我国国民经济水平的持续迅速发展、现代生活节奏的加快、人民物质生活水平的不断提高、就医条件的日益改善、人均寿命的逐渐延长以及人口老龄化的加速，冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronaryatheroscleroticheartdiease，CHD)的发病率和死亡率呈明显的逐年上升趋势。我国每年新发心肌梗死达50万人，现有心肌梗死患者近200万人[1]。心肌梗死已成为危害我国中老年人身体健康的头号杀手,其高发病率及高死亡率给患者、家庭和社会带来严重的损害。心肌梗死后的病理性损害主要为功能性心肌细胞的丢失及心室重构[2]。缺血致梗死区的心肌细胞坏死或凋亡，梗死区由无电传导和弹性收缩功能的纤维斑痕组织填充。虽然近年的分析已经颠覆了―心肌细胞是终末分化细胞，及成熟心肌细胞不可自我更新‖这一传统观念,Olivetti[3]等的分析显示心肌梗死后在梗死的边缘区约有4%心肌细胞可发生分裂增殖。Beltrami[4]等发现心脏干细胞(cardiacstemcells，CSCs)及来源于循环中的干细胞归巢后可以分化增殖补充已死亡和凋亡的心肌，但相对于整体心脏而言，这些细胞数量很少,远远没有形成功能水平上的心肌组织，尚不足以作为损伤后的防御机制。另一方面，心肌梗死后存活的心肌细胞快速生长以代偿下降的心功能，表现为心肌细胞肥大，再加上细胞外基质成分的过度生成或异常降解[5]。心肌细胞的大量丧失和心室重构使心功能进行性恶化，最终发展为终末期心力衰竭。尽管近年预防医学、溶栓治疗(thrombolysis)、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneouscoronaryintervention，PCI)、冠状动脉旁路移植手术治疗（Coronaryarterybypassgraft，CABG）等现代医疗技术的快速发展及在临床上的广泛运用，使急性心肌梗死患者的临床预后得到明显改善、病死率较前有所降低、患者的生活质量得到提高，众多患者已从中受益。但这些临床治疗措施仅仅是使闭塞的血管再通、再灌注梗死区周围缺血缺氧的心肌、改善心肌缺血的症状、延缓了充血性心衰的发生，并没有使丢失的心肌得到补充，亦不能逆转已受损的心功能。故目前急性心肌梗死的临床治疗并没有解决持续性心肌损失与新生心肌细胞补充不足之间这一导致心功不全的根本性矛盾，相当一部分急性心梗患者不可避免的发展为充血性心力衰竭（congestiveheartfailure，CHF)，终至死亡。寻找能使心肌细胞的数量增加或使心肌间质改变逆转心室重构并能促进心功能恢复的新的1---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文治疗手段已经成为临床的要求。20世纪80年代后期，组织学工程概念的提出，为心肌梗死的治疗提供了新的思路，心肌梗死后心肌细胞的再生迅速成为心脏病学领域基础与临床的分析热点。多种干细胞已被用于梗死心肌再生的分析，如胚胎干细胞(ESCs)[6]、骨骼成肌细胞[7]、诱导多能干细胞(iPSC)[8]、心脏干细胞(CSc)[9]、骨髓间充质干细胞（MSCs）[10]等，胚胎干细胞目前只能进行异体移植，且存在免疫排斥、形成畸胎瘤风险[11]及伦理学等诸多难题尚未克服，故目前很难用于临床。诱导多能干细胞虽然可以避免伦理学问题和移植免疫排斥问题，但通过病毒转染外源性基因的诱导方法显著的增加了细胞变异的潜在危险和致瘤的可能性[12]。骨骼成肌细胞不能和心肌细胞之间形成很好的电—机械耦联，故不太可能存在有效的收缩功能，且有潜在的致心律失常风险[13]，故不适用于临床治疗。间充质干细胞是目前最有可能成为―万能供体‖的理想的种子细胞之一，但间充质干细胞需要在体外扩增以达到足够大的数量后再移植入体内[14]。但心肌梗死患者多为中老年人，骨髓中间充质干细胞的数量少、增殖分化能力弱，培养需要较长时间，会贻误移植时机。在加上体外分离培养过程会不可避免地带来一些难以预测的生物安全性问题，可能会对人体造成不良影响，目前还不适宜用于临床。故现有的种子细胞均因存在或多或少的缺陷及相应的诸多技术难题尚未解决，无法应用于临床。在此背景下，源于成熟脂肪细胞、经历了分化和去分化过程后才获得多向分化潜能的去分化脂肪(dedifferentiatedfat，DFAT)细胞，具有来源广泛、取材方便、增殖能力强、免疫原性低、表型稳定等优良特性引起国内外众多分析学者的注意。成熟脂肪细胞作为人体内体积差异最大的一类细胞，通常呈球形，中央有脂滴聚集，密度低于水，使其具有漂浮的特性，不易贴壁，导致成熟脂肪细胞难于体外培养。再加上脂肪组织中有成熟脂肪细胞、前脂肪细胞、脂肪来源的间充质干细胞、血细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、周细胞等多种细胞混合存在[15,16]，使脂肪细胞难于提纯。这些均限制了学者们对脂肪细胞的分析。故长期以来，分析者们普遍认为脂肪细胞一旦分化为含有由三酰甘油聚集而成的大单房脂滴的成熟脂肪细胞后，即不可再发生去分化和增殖,是处于分化终末期的细胞。1975年，Adebonojo[17]首次在对来自于婴儿及10岁以下儿童的腹壁下脂肪细胞进行体外培养时发现：成熟脂肪细胞在体外培养过程中可逐渐吐出脂滴2---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文由变为成纤维细胞样形态。1976年，Van等人[17][18]对来自40至60岁的成人成熟脂肪细胞体外培养时观察到了相同的现象，1986年，HajimeSugihara等人[19]首次用天花板培养法对人和鼠的单房脂肪细胞进行体外培养，并发现单房脂肪细胞在发生形态学改变的同时也进行了分裂增殖并获得了一定的干细胞表型。于是将生理学上发生这种变化后的脂肪细胞命名为―去分化脂肪细胞‖(Dedifferentiatedfat)。这些分析结果均对―脂肪细胞是处在分化终末期的细胞‖这一传统概念产生了巨大的冲击。近年来，大量的实验分析均表明DFAT细胞是一种多能干细胞、具有多向分化潜能，经体外诱导培养后不仅可以分化为同胚层来源的平滑肌细胞[20]、骨骼肌细胞[21]、成骨细胞[22]、心肌细胞[23,24]、起搏细胞[24][25]、脂肪细胞[26]、软骨细胞[27],而且跨越胚层分化为外胚层来源的神经细胞[28]及内胚层来源的内皮细胞[29]。维生素C又名L—抗坏血酸（AA），是一种水溶性的维生素，是人体必需的营养物质。其分子式为C6H806，化学结构与葡萄糖等6碳糖相似。具有抗氧化、清除氧自由基、双向影响细胞的增殖及凋亡[30,31]、参与氨基酸的代谢、诱导相应基因的表达[32]等众多的生物学功能。Takahashi[33]等对可以应用于人体且具有诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞可能性的880种化合物进行筛查后发现维生素C可以显著提高胚胎干细胞向心肌细胞分化的分化率。又有实验分析证实维生素C可诱导iPSCs[34,35]、羊水干细胞[36]分化为心肌样细胞。维生素C是否可以诱导DFAT细胞分化为心肌样细胞目前国内外均无报道。本实验选用DFAT为种子细胞，探讨DFAT细胞在维生素C、乳鼠心脏组织裂解液体外模拟心肌微环境及二者联合诱导等诱导条件下分化为心肌样细胞的可能性，并观察在不同诱导条件下DFAT细胞的分化效率，寻求DFAT细胞分化为心肌细胞的最佳诱导条件。旨在为急性心肌梗死的细胞治疗提供更为优秀的种子细胞、奠定实验理论基础。1材料与方法0.5材料1.1.1实验动物本实验的实验动物用4～6周龄的雄性SpragueDawley大鼠及出生24小时内的SD乳鼠(贵阳医学院实验动物中心)，清洁级标准。3---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文0.5主要实验试剂胎牛血清（Hyclone公司，美国）DMEM培养基（Hyclone公司，美国）1.1.1%胰蛋白酶液（Hyclone公司，美国）青霉素-链霉素混合液（Hyclone公司，美国）PBS结晶粉（使用时按说明稀释并高压灭菌）（鼎国公司，北京）胶原酶I型（sigma公司，美国）维生素C粉剂（biosharp公司，安徽）小鼠抗大鼠cTnT单克隆抗体（Abcam公司，英国）小鼠抗大鼠GATA4单克隆抗体（Abcam公司，英国）小鼠抗大鼠NKx2.5单克隆抗体（Santacruz公司，美国）小鼠抗β-actin单克隆抗体（Santacruz公司，美国）辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG二抗（武汉博士德）FITC标记羊抗小鼠IgG二抗（武汉博士德）4%多聚甲醛（武汉博士德）Tritonx-100（Amresco公司）DAPI（4’6-联眯-2-苯基吲哚）（碧云天C1002）动物组织/细胞RNA提取试剂盒（康为世纪CW0584）逆转录试剂盒（Invitrogen公司）SYBRGreen染料（Roche公司，美国）SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（P0012A碧云天）BCA蛋白测定试剂盒（康为世纪CW0014）5xSDS蛋白上样缓冲液（鼎国公司，北京）Western一抗二抗去除液（碧云天P0025）Western一抗稀释液（碧云天P0023A）Western二抗稀释液（碧云天P0023D）Western封闭液（碧云天P0023B）全蛋白提取试剂盒（上海生工BSP003）聚乙烯二氟(PVDF)膜（Amersham公司）ECL-Plus发光试剂（Millipore公司）；---- -------4---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文高效显影胶片（Kodak公司）显影定影试剂盒（P0019碧云天）Western中分子量蛋白Marker（康为世纪CW0021）Tris碱（Solarbio公司）甘氨酸（Solarbio公司）SDS（Sigma公司）β-actin、NKx2.5、Gata4、Tnnt2四种的引物均由上海生工设计并合成。0.5.3主要试剂的配制①TBS(pH7.6)：Tris碱2.42g，NaCl8g，溶于800mLddH2O后用1mol/LHCl调节pH至7.6，加ddH2O定容至1000mL②TBS-T(pH7.6)：前述TBS加Tween-20使其浓度为0.1%即可③1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris碱3.0g，甘氨酸14.4g，SDS1g溶于700mLddH2O，溶解后定容至1000mL，4℃保存④1×转移缓冲液：Tris碱3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200mL溶于600mLddH2O，溶解后定容至1000mL，4℃保存⑤10%过硫酸铵(APS)：过硫酸铵0.1g溶于1mLddH2O，4℃保存1.1.1主要实验仪器MCO-18AIC电热恒温培养箱（日本Sanyo电机）Beckman21R型冷冻离心机（美国Beckman公司）XD-101型倒置显微镜（江南公司）AF100制冰机（美国Scotsman公司）TX51型荧光显微镜（日本Olympus公司）HARRIS-80℃冰箱（美国）StepOnePlusReal-timePCRSystem(美国AppliedBiosystem公司)ELX800UV酶标仪（美国Bio-Teck公司）；TGL–16G台式低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；DU640核酸定量仪（美国Beckman公司）；Exceed-AC-08型超纯水仪（成都艾科有限公司）；HVE-50高压灭菌器（日本）；5---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文超净工作台（苏净集团安泰公司）；BG-verMINI垂直电泳仪（北京百晶生物）；DYY-Ⅲ-5型稳流电泳仪及电泳槽（北京六一仪器厂）；电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）；AX-Ⅱ型X射线摄影暗匣（广东粤华）；各型细胞培养板（美国Costar公司）；2720ThermalcyclerPCR仪（美国AppliedBiosystem公司）；SB-50D超声波清洗机（宁波新芝生物科技）；0.5引物序列表格名称引物序列（53）NKx2.5Former：gagcctggtagggaaagagcReverse：ggtgggtgtgaaatctgaggGATA-4Former：tgtctgggaacaactcctgaReverse：ccaaggtgggcttctctgtaTnnt2Former：gctgatttccctcaaagacagReverse：tgttctcctcctcctcacgβ-actinFormer：tttaatgtcacgcacgatttcReverse：actcctatgtaggtgacgaggc1.1.1方法图1DFAT细胞培养示意图1.2.1原代细胞培养1.2.1.1成熟脂肪细胞的分离及去分化培养①将6周龄的SD大鼠用10%水合氯醛按0.35ml/100g腹腔麻醉后颈椎脱臼处---- -------6---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文死，仰卧位固定于无菌板上，移至超净工作台中，用碘伏消毒大鼠胸腹部皮肤，稍干后酒精脱碘，如此重复消毒胸腹部皮肤4～5次后，无菌条件下完整取出大鼠腹股沟处皮下脂肪组织。②用PBS液清洗3次，并用眼科剔除脂肪组织中的毛细血管、筋膜、淋巴结，再用PBS液冲洗3次去除组织上的血液，以得到较为纯净的脂肪组织。③将脂肪组织剪碎成糊状后转移至15ml离心管中，再加入等体积的0.1%I型胶原酶，置于37℃恒温水浴箱中消化45min，消化期间需不停的震荡离心管。④消化完毕后，加入2倍体积的完全培养基（高糖DMEM+20％胎牛血清+1％双抗）终止消化，用100目细胞滤筛过滤，并反复冲洗滤筛。⑤将滤液移入15ml离心管中，1000r/min离心5min。离心后移出悬浮于最上层的成熟脂肪细胞至新的离心管,再用完全培养基清洗3次，以尽量去除其他细胞的污染。⑥收集清洗后的成熟脂肪细胞接种于25cm2培养瓶中，用完全培养基将培养瓶装满，小心拧紧瓶盖，尽量使瓶内不出现气泡。将培养瓶翻转倒置于37℃、5%CO2的培养箱中开始天花板培养，使悬浮于最上层的成熟脂肪细胞贴于培养瓶的底壁。⑦倒置显微镜下动态观察细胞形态变化，约7～10天，细胞脱去脂滴，由圆形变为长梭形后，翻正培养瓶并换液，按常规培养，每2天更换一次培养基，直至细胞融合。0.5乳鼠心肌成纤维细胞培养取1～2d的新生SD乳鼠，乙醇消毒后开胸挤出心脏，去除心底结缔组织后将心室剪成大小约1mm×1mm×1mm的小块，PBS液洗3次并剪碎。剪碎的组织块中加入0.1%胰酶和0.1%I型胶原酶混合液2ml，孵育10min，弃上清液,加入混合消化液2ml，将组织块移入离心管中，置于37℃水浴震荡10min，再轻柔吹打1～2min，自然沉淀1min，将上清液移入到另一离心管中，加入等体积DMEM培养液(含15%胎牛血清)，重复消化5-6次至组织块已基本消化成单细胞。用400目金属滤网将收集的上清液过滤，之后1000r/min离心5min，弃上清液，加入完全培养基，将细胞团吹打散为单细胞悬液接种于培养瓶中。并将培养瓶置于37℃的5%CO2孵箱中培养贴壁90min后，收集贴壁细胞并加入含血清培养基继续培7---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文养，待细胞融合后传代用于实验。0.5细胞的传代培养选取生长融合至70%～80%的细胞进行传代培养。吸弃原培养液，用温热的PBS液清洗3次，以去除血清，加入足够覆盖培养瓶底的0.25％胰蛋白酶液(含0．02％EDTA)放入消化37℃培养箱孵育1～2min后将培养瓶置于倒置相差显微镜下观察胞形态变化，当见到细胞变圆、胞质突起回缩、细胞间隙变大时，迅速加入5ml完全培养基终止消化，按1:2的比例接种到新的培养瓶，补足培养液至4ml/瓶，置入培养箱继续培养。当传代细胞生长至铺满瓶底70%～80%时，可继续传代。0.6诱导DFAT细胞向心肌细胞方向分化1.1.1乳鼠心脏组织裂解液（neonatalratheartcelllysate,NRHCL）的制备在袁岩[37]等的方法上加以改进，取出生24h内的SD乳鼠，断颈处死，75%酒精浸泡数分钟，从最下端肋骨处横向剪开胸腔，迅速取出心脏，置于预先置于冰上的PBS液中，去除心房、血管及结缔组织，用PBS液清洗3次后，将心室肌移入玻璃小瓶中，用眼科剪将其充分剪碎。将剪碎的心室组织转移入15ml离心管内，加入0.1%胰酶和0.1%I型胶原酶1:1混合消化液2ml，放入37℃培养箱孵育10min，弃上清液。再加入混合消化液2ml，37℃水浴消化10min，用吸管轻柔吹打1～2min，静置自然沉淀1min，吸取上清液加入盛有5ml完全培养基的离心管中吹打混匀。如此重复消化5-6次直至组织块消化完全。收集的上清液用100目细胞滤筛过滤，滤液以1000r/min离心10min，弃上清液，用完全培养基重悬沉淀细胞制成单细胞悬液，并调整细胞浓度为2*106个/ml。将该细胞悬液迅速置于—70℃冰箱中，4～5小时后取出，于4℃冰箱中融化，EP管分装，-20℃保存备用。1.1.2维生素C诱导剂的配制大量的实验分析[33,34,38]均显示10—4mol/L的维生素C为诱导种子细胞向心肌细胞方向分化的最佳浓度。故本实验亦宜采用10—4mol/L的维生素C为诱导剂。称取0.176g维生素C粉剂溶于100ml的完全培养基中，0.22μm的滤过器过滤，配成10—2mol/L的母液—20℃避光保存。用时将母液稀释100倍，于4℃避光保存备用。8---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文0.5维生素C+乳鼠心脏组织裂解液组联合诱导剂的制备将10—2mol/L维生素C诱导剂母液用完全培养基稀释50倍后，按体积比1:1与乳鼠心脏组织裂解液混合，4℃避光保存备用。0.6分组诱导处理图2分组诱导简图取生长良好的第三代DFAT细胞，0.25％胰蛋白酶(含0．02％EDTA)进行消化后用完全培养基重悬，吹打混匀制成单细胞悬液，取细胞计数板进行计数，并将细胞密度调整为5×105个/ml接种于六孔板中。将培养板置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内，让细胞在完全培养基的条件下培养48～72h,待细胞牢固贴壁后，更换为心肌样细胞诱导剂行分组诱导处理。维生素C组（VitaminC组）：弃原培养液，加入预先制备好的浓度为10—4mol/L的维生素C诱导剂。因维生素C易被氧化分解，故需每天换液一次，直至第21天收获细胞。乳鼠心脏组织裂解液组（NRHCL组）：将培养液更换成预先制备好的乳鼠心脏组织裂解液。根据每孔中接种细胞的数量，加入4倍于DFAT细胞数量的心脏组织裂解液。每天更换培养液一次，每次换液时加入相同量的裂解液，直至第21天收获细胞。维生素C+乳鼠心脏组织裂解液组联合诱导组（VitaminCplusNRHCL组）：9---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文弃原培养液,加入4倍于DFAT细胞数量联合诱导剂。每天更换培养液一次，直至第21天收获细胞。完全培养基培养组（thecontrolgroup）：用完全培养基继续培养，每天更换培养液，直至第21天收获细胞。0.5诱导后DFAT细胞心肌特异性标志物cTnT的免疫荧光鉴定1.1.1制备细胞爬片（以乳鼠心肌成纤维细胞和未经诱导处理的DFAT细胞为阴性对照组）①取诱导3周后的细胞，0.25％胰蛋白酶消化后用完全培养基重悬，吹打混匀制成单细胞悬液，并将细胞浓度调整为3×105个/ml。②在六孔板每个孔中预备放盖玻片的位置滴少量完全培养基后，将多聚赖氨酸处理并经高压消毒的盖玻片放入6孔板中。③吸取①中混匀的细胞悬液30ul缓慢滴加在盖玻片上，尽量使细胞均匀分别在盖玻片上。④放入37℃恒温培养箱中，4h后追加少量完全培养基，待细胞贴壁生长48小时后，取出爬片行免疫荧光染色。1.1.2免疫荧光鉴定①小心取出生长48h的细胞爬片，移入一新的6孔板中，PBS浸洗玻片2次，每次3min。吸水纸吸干PBS②0.5%TritonX-100（PBS配制）室温透膜20min，PBS浸洗3次，每次3min。③10%正常封闭血清室温湿盒中封闭30min。④吸水纸吸掉封闭液，每张玻片滴加足够量的稀释好的小鼠抗大鼠cTnT单克隆一抗（稀释度为1∶200）并放入湿盒，4℃孵育过夜；⑤吸水纸吸干爬片上多余液体，避光处滴加稀释好的FITC标记羊抗小鼠IgG荧光二抗（稀释度为1∶100），使其均匀覆盖于玻片上，平放37℃避光孵育一小时。⑥避光晾干爬片，荧光显微镜下观察采集图像。0.6RT-qPCR法检测mRNA表达各组细胞于诱导3周收集RNA用RT-PCR检测心肌特异性标记基因的表10---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文达。0.5提取细胞总RNA：使用RNApureTissueKit动物组织/细胞RNA提取试剂盒（康为世纪CW0584）提取细胞总RNA。①取诱导3周后的细胞，0.25％胰蛋白酶消化后用完全培养基重悬，吹打混匀制成单细胞悬液，用细胞计数板计数细胞总量。②12000r/min离心1min弃上清，得到细胞沉淀，向其中加入600μlBufferRL，反复吹打几次，使其充分裂解。③样品充分裂解后，室温放置5min,使蛋白核酸复合物充分分离。④12000r/min离心2-5min,取上清液进行下步操作。⑤加入1倍体积无RNase水配制的70%乙醇，混匀。⑥将步骤⑤所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，12000r/min离心1min，弃去收集管中的废液，将吸附柱再放回收集管中。⑦将700μlbufferRW1加入吸附柱中,12000r/min离心1min，弃去收集 zkq20160118管中的废液，将吸附柱再放回收集管中。⑧向吸附柱中加入500μlBufferRW2(使用前检查是否加入无水乙醇)。⑨重复步骤⑧。⑩将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入30-50μRNase-FreeWater，室温放置1min,12000r/min离心1min,收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。0.6RNA样品的纯度、浓度鉴定：用DEPC水调零DU640核酸定量分析仪，取经DEPC水处理过的0.2mLEPP管，加48mLDEPC水，再加2mL已提取的总RNA原液，对总RNA进行纯度和浓度分析。测得A260/A280的比值表示总RNA纯度，系统自动计算出核酸浓度，得出此浓度再乘以稀释倍数即为总RNA溶液的终浓度，单位为ug/ml。0.7逆转录合成cDNA以总RNA为模板根据定量结果取2mg进行逆转录合成cDNA：---- -------11---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文①按下表配制逆转录所需体系：Oligo（Dt）20(50mM)1.0mL50ng/ul随机引物2.0mL总RNA2.0mg10mMdNTP混合物1.0μLUpto12.OmL灭菌蒸馏水②混匀后于65℃加热5min后，迅速取出转置冰上冷却，短暂离心后，按下表加样。5´第一链合成缓冲液4.0mL0.5MDTT2.0mLRNA酶抑制剂(20U/mL)1.0mL③25℃孵育10分钟、37℃孵育50分钟、70℃加热15分钟以终止反应。4℃保存。将逆转录合成的cDNA模版稀释5倍后待用。1.1.1RealtimePCRzkq20160118运用SYBRGreen染料试剂盒在StepOnePlusTMReal-timePCRSystem中以cDNA为模版扩增待测基因和β-actin基因。按下表加待测基因PCR反应体系：SYBRGreen染料10.0ml1.2.1ml上游引物1.2.1.1ml下游引物cDNA模板2.0mlddH2O7.0ml总体积20.0ml按下表加β-actinPCR反应体系：SYBRGreen染料10.0ml0.5ml上游引物0.5ml下游引物cDNA模板2.0ml---- -------12---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文ddH2O7.0ml总体积20.0ml 瞬时离心，上机循环，反应条件如下： 50℃2min95℃10min95℃15s40cycles60℃60sDissociation（溶解曲线）zkq20160118图3PCR反应条件反应结束后确认RealTimeRT-PCR的扩增曲线和溶解曲线。ABIStepOnePlus型实时荧光定量PCR仪采集待测基因及内参β-actin扩增各循环荧光信号，以SDS1.4软件(AppliedBiosystems)进行荧光收集和资料分析。SDS1.4软件分析其△△Ct值及RQ(relativequantity)值，RQ=2-△△Ct。分析实验结果时以β-actin为内对照，计算各种基因的相对表达水平。0.5WesternBlotting法检测蛋白表达1.1.1总蛋白提取取出诱导3周后的细胞6孔板，吸弃培养基，加冰预冷的PBS洗涤两遍，将6孔板置于冰上，每孔细胞加入含1mmol/LPMSF的细胞裂解液180μL，用移液器反复吹打孔内细胞，直至显微镜下细胞消失，然后收集裂解液于冰预冷30min的1.5mLEpp管内，冰上静止1h，待细胞充分裂解后，4℃12000r/min离心40min；小心吸取上清液至另一EPP管中；对上述制备的上清液进行蛋白定量后分装，-70℃保存备用。13---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文0.5蛋白样品定量按BCA蛋白测定试剂盒（康为世纪CW0014）说明，根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。将BSA标准品(2mg/mL)用PBS稀释成2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0(空白)加到96孔板的标准品孔中，每孔加25μL，每个浓度值做3个复孔。将待测样品原液及稀释2倍、5倍、10倍后的稀释液加到96孔板中，每孔加25μL，每个浓度值做3个复孔。再向各孔加入200μLBCA工作液,置于37℃培养箱孵育30min。测定570nm下的吸光值，用Excel软件根据标准品吸光值绘制标准曲线。根据标准曲线计算出待测样品蛋白浓度。0.6制备变性聚丙烯酰胺凝胶：清净、烤干、装配好制胶玻璃板。按SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天P0012A）试剂盒说明书配制SDS-PAGE分离凝胶和浓缩胶。按下列配方配制10%的分离胶10%的分离胶溶液成分体积蒸馏水4.0mLzkq2016011830%Acr-Bis(29:1)5.0mL1.1.1mol/LTris(pH8.8)5.7mL10%十二烷基硫酸钠(SDS)0.15mL10%过硫酸胺(APS)0.15mLTEMED0.006mL总体积15.0mL将表中的前四项组分充分混匀后，再加入APS和TEMED。缓慢沿玻璃板灌胶，避免产生气泡，待胶面上升到制胶玻璃板梳齿下1cm处，在液面上小心注满ddH2O，以阻止氧气进入凝胶溶液中，室温静置约30min¯按下列配方配制5%的聚集胶5%的聚集胶溶液成分体积ddH2O2.7mL---- -------14---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文30%Acr-Bis(29:1)0.67mL0.5moL/LTris(pH6.8)0.5mL10%SDS0.04mL10%APS0.04mLTEMED0.004mL总体积4.0mL将表中的前四项组分混匀后，再加入APS和TEMED。¯注入聚集胶前，倾倒分离胶上的ddH2O并用滤纸吸干，然后缓慢注入聚集胶，小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制90分钟以上以保证完全聚合。¯用电泳缓冲液清洗梳孔，放入电泳槽备用。1.1.1蛋白样品处理根据蛋白定量结果计算30mg蛋白所需上样体积，并按下表加上样体系5×蛋白上样缓冲液4.0mLzkq20160118蛋白30.0mgddH2O补足体积至20.0mL总体积20.0mL¯瞬时离心后95℃加热变性5min再次瞬时离心待其冷却至室温后上样1.1.2上样及电泳：将电泳槽内槽注满1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，拔去上样梳，用注射器冲洗点样孔，彻底除去点样孔中和胶底部的气泡。¯将样品全部加入上样孔内（确保上样量一致），在边缘孔道内加入Marker5mL¯向电泳外槽内注入注入约1/2电泳槽容积的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，盖好电泳槽的盖子，电泳聚集胶的电压为80V，恒压，当溴酚兰达到分离胶时改为---- -------15---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文120V，恒压，直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。0.5转膜PVDF膜的处理：用铅笔标记膜正面，甲醇浸泡10秒钟，去离子水洗10分钟，转移缓冲液浸泡至少10分钟。¯将滤纸及高分子材料预先在转移缓冲液中浸泡数分钟，除去气泡。¯电泳完毕后取出凝胶，小心将胶剥离将凝胶，滤纸及高分子材料在冰预冷的转移缓冲液中浸泡10min，让其充分湿润，以除去气泡¯将PVDF膜平放在凝胶上，去除气泡，夹紧电转夹。放置过程应避免产生气泡，以免增加电阻。¯将电转夹放入电转仪中，凝胶侧放在夹板的黑色面（负极侧），注入冰预冷的转移缓冲液，由于湿转过程产生大量的热，将电转槽放入大冰盒中，充分降温zkq20160118避免烧胶¯200mA稳流，转移2h0.6封闭PVDF膜：转膜结束后，取出PVDF膜，室温1×TBS漂洗5min×3次，以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。¯用Western封闭液（碧云天P0023B）封闭PVDF膜，室温振摇1h（PVDF膜正面向上）¯以1×TBS-T洗膜10min×3次，室温回旋振摇。0.7一抗结合用Western一抗稀释液（碧云天P0023A）按1:500稀释一抗¯16---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文室温振摇15min后，4℃过夜（PVDF膜正面向上）¯以1×TBS-T洗膜10min×3次0.5二抗结合用Western二抗稀释液（碧云天P0023D）按1:2000稀释HRP标记的二抗¯室温振摇孵育1h¯以1×TBS-T洗膜10min×4次后，再用1×TBS洗膜10min×1次，用镊子夹持微晾干PVDF膜，以免残留液体稀释ECL0.6曝光及胶片冲洗：取出ECL试剂盒，待其温度达到室温，将发光剂和稳定剂按体积1:1的比例等体积混合，配制成化学发光检测底物工作液（最终体积约为0.05--0.1ml试剂/cm2膜）。¯在PVDF膜上加入工作液，使工作液均匀覆盖整张PVDF膜，室温孵育5min。¯用吸水纸吸去多的余发光底物工作液¯用保鲜膜包将PVDF膜好，除去气泡。放入曝光夹¯暗室中胶片曝光1min。¯暗室中冲洗：显影液4min→清水15s→定影液6min→水洗1min→干燥。0.7抗体剥离与膜的重复利用将PVDF膜从保鲜膜中取出¯以1×TBS-T洗膜10min×3次¯---- -------17---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文用Western一抗二抗去除液（碧云天P0025）洗膜10min×1次¯以1×TBS-T洗膜10min×3次¯重复2.6.7封闭PVDF膜步骤¯重复2.6.8步骤，将抗体改为抗β-actin（按1:1000配制）¯重复2.6.9二抗结合步骤（二抗按1:2000配制）¯重复2.6.10曝光及胶片冲洗步骤0.5结果分析用扫描仪扫描曝光胶片，Bandscan4.3软件分析结果时以β-actin蛋白条带作为内参照，计算各组待测目标蛋白条带与β-actin蛋白条带总灰度的百分比值作为待测目标蛋白表达的相对水平比。1.1.1统计学分析：数据采用均数±标准差（x±s）表示，结果用SPSS17.0统计软件的单因素方差分析进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。2结果1.2.1成熟脂肪细胞去分化为DFAT细胞天花板培养2天后，成熟大鼠脂肪细胞内含折光性高的单个圆形脂滴，漂浮于培养瓶顶壁，（图4A）。3-4天后可见胞质中的单个圆形脂滴分裂成多个小脂滴，胞质向周围伸展，细胞由圆形变成椭圆形，胞质外可见细小的脂滴颗粒聚集，细胞突起延长，形成类似触角样结构（图4B、C）。脂滴继续裂解变小，5-6天后可见细胞逐渐脱去脂滴，形态变为不含脂滴或仅含少量脂滴的长梭形，并可观察到细胞分裂增殖（图4D、E）。10天后细胞已完全脱去脂滴,生长融合，去分化为成纤维样的DFAT细胞（图4F）。细胞增殖第3-6代后细胞形态无明显变化。---- -------18---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文Figure4MorphologytransformationoftheadultratadipocytestoDFATcellsduringceilingadherentculture.RepresentativeimagesoftheDFATcellswereshownonthe(A)2ndday(200×),(B)3rdday(400×),(C)4thday(400×),(D)5thday(400×)and(E)6thday(400×).Adultratadipocytescontainedsingleroundlipiddroplet.Theydedifferentiatedintofibroblast-likeDFATcellsafter6daysofceilingadherentculture.(F)Onthe10thday(200×),theDFATcellsgrewinto90%confluenceandwerethenpassaged.图4大鼠脂肪细胞经天花板培养去分化为DFAT细胞的形态变化0.5DFAT细胞经诱导分化后的形态变化诱导1周后，细胞胞体伸展，呈长梭形，体积增大、形态变长。诱导2周后细胞生长旺盛，增殖明显，细胞排列多趋于一致、平行生长，多数细胞伸出分支状突起，并相互连接，呈聚集生长，上述现象在含维生素C的NRHCL组比单独维生素C和NRHCL组更明显。诱导3周后胞体更加饱满，立体感增强，细胞间相互连接增多形成细胞簇，可观察到肌管样结构，细胞形态近似于心肌，但均未观察到有自发跳动的细胞（图5）。---- -------19---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文Figure5MorphologytransformationoftheDFATcellsafterinducedmyocardialdifferentiation.RepresentativeimagesoftheDFATcellswereshownafter(A-C)1week(200×),(D-F)2weeks(200×)and(G-I)3weeks(200×).TheDFATcellsbecamecardiomyocyte-likecellsthatwithbiggersize,longershapeandmyotubule-structureafter3weekswitheitherVitaminCorNRHCL.However,VitaminCplusNRHCLseemedtohadthemostsignificantmorphologytransformationofDFATcells.图5DFAT细胞经诱导分化后的形态变化0.5诱导3周后DFAT细胞的cTnT免疫荧光检测细胞免疫荧光检测显示：诱导3周后，维生素C组、NRHCL组和含维生素C的NRHCL组均可观察到心肌特异性标志物cTnT阳性细胞；这些细胞轮廓清楚，cTnT定位于细胞质，经荧光色素FITC标记后在荧光显微镜下显绿色荧光（图6C、D、E）。对照组（心肌成纤维细胞和未经诱导处理的DFAT细胞）仅见非特异性着色（图6A、B）。---- -------20---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文ABratmyocardicalfibroblastsnegativecontrolDFATcellscontrolCD EVitaminNRHCLVitaminC+NRHCLFigure6ThecTnTexpressioninDFATcellsafter3weeksofinducedmyocardialdifferentiation.图6诱导3周后DFAT细胞cTnT的表达0.5诱导3周后DFAT细胞中心肌特异性标志物的表达图7.real-timePCR扩增曲线和熔解曲线1.1.1诱导3周后DFAT细胞中cTnTmRNA和蛋白质表达水平与对照组相比，经诱导处理3周后维生素C组、NRHCL组和含维生素C的NRHCL组细胞中cTnTmRNA（图8A）和蛋白（图8B、C）表达水平均升高（P<0.05），且含维生素C的NRHCL组细胞中cTnTmRNA和蛋白表达水平均高于维生素C组、NRHCL组（P<0.05）。NRHCL组cTnTmRNA表达水平高于维生素C组（P<0.05），但维生素C组、NRHCL组间cTnT蛋白表达水平的差异无统计学意义。21---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文Figure8TheexpressionofcTnTinDFATcellsafter3weeksofinducedmyocardialdifferentiat-ion.(A)RelativecTnTmRNAleveldeterminedbyreal-timePCR.(B)RepresentativewesternblotsshowedcTnTexpression.(C)QuantificationofcTnTdetectedbywesternblots.Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrolgroup.#P<0.05vsVitaminCgroup.△P<0.05vsNRHCLgroup.图8诱导3周后DFAT细胞中cTnTmRNA和蛋白质相对表达水平0.5诱导3周后DFAT细胞中GATA-4mRNA和蛋白质表达水平与对照组相比，维生素C组、NRHCL组和含维生素C的NRHCL组细胞中GATA-4mRNA（图9A）和蛋白（图9B、C）表达水平均升高（P<0.05），含维生素C的NRHCL组中GATA-4mRNA和蛋白表达水平均高于维生素C组、NRHCL组（P<0.05）。且NRHCL组GATA-4mRNA和蛋白表达水平高于维生素C组（P<0.05）。Figure9TheexpressionofGATA-4inDFATcellsafter3weeksofinducedmyocardialdifferentiation.(A)RelativeGATA-4mRNAleveldeterminedbyreal-timePCR.(B)RepresentativewesternblotsshowedGATA-4expression.(C)QuantificationofGATA-4detectedbywesternblots.Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrolgroup.#P<0.05vsVitaminCgroup.△P<0.05vsNRHCLgroup.图9诱导3周后DFAT细胞中GATA-4mRNA和蛋白质相对表达水平0.6诱导3周后DFAT细胞中NKx2.5mRNA和蛋白质表达水平与对照组相比，维生素C组、NRHCL组和含维生素C的NRHCL组细胞中22---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文NKx2.5mRNA（图10A）和蛋白（图10B、C）表达水平均升高（P<0.05），含维生素C的NRHCL组中NKx2.5mRNA和蛋白表达水平均高于维生素C组、NRHCL组（P<0.05）。维生素C组、NRHCL组间NKx2.5mRNA和蛋白表达水平的差异均无统计学意义。Figure10TheexpressionofNkx2.5inDFATcellsafter3weeksofinducedmyocardialdifferentiation.(A)RelativeNkx2.5mRNAleveldeterminedbyreal-timePCR..(B)RepresentativewesternblotsshowedNkx2.5expression.(C)QuantificationofNkx2.5detectedbywesternblots.Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrolgroup.#P<0.05vsVitaminCgroup.△P<0.05vsNRHCLgroup.图10诱导3周后DFAT细胞中NKx2.5mRNA和蛋白质相对表达水平3、讨论我们分离并培养大鼠成熟脂肪细胞，用天花板贴壁培养法使其去分化为DFAT细胞，通过心脏细胞裂解液模拟心肌微环境DFAT细胞可再分化为心肌样细胞，表达cTnT、GATA-4和Nkx2.5心肌细胞特异标志，并且维生素C可进一步促进DFAT细胞的心肌分化。DFAT细胞缺乏特异性标志物，其鉴定基于培养初期脂肪细胞的形态学变化及后期心肌特异性标志物的检测[23,27,39]。我们参照Sugihara[40]的天花板贴壁培养法，使圆形透亮的大鼠成熟脂肪细胞去分化为类似成纤维细胞形态的DFAT细胞（图4），在维生素C或（和）心脏细胞裂解液作用下形态进一步发生转变，并表达心肌特异性标志物（图6）。我们的实验结果支持TaroMatsumoto[27]等的分析，充分说明细胞不仅可以自我增殖，还具有心肌分化潜能。干细胞移植治疗心肌梗死的临床实验均采用自体干细胞移植策略[41]，其中骨髓间充质干细胞已经广泛分析[42,43]。骨髓成分复杂，间充质干细胞仅占所有骨髓细胞的0.01%[44]，为获取足量骨髓常需多点骨髓穿刺，创伤较大，且骨髓间充23---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文质干细胞增殖能力较弱，扩增时间较长，体外心肌分化效率不高。相比之下，DFAT细胞具有特殊的优势：1、来源丰富，100mg的脂肪组织至少可获得3×106个原代细胞[20]，且脂肪组织经微创抽脂技术反复取材，患者更容易接受；2、细胞纯度高，原代细胞的纯度高达99.9%[39]，体外培养时即呈现较强的心肌分化能力[45]。3、对供者年龄要求较低，据报道4-81岁供者的成熟脂肪细胞均可在体外培养中去分化为细胞[20]。根据DFAT细胞上述优势，可预先在体外定向分化为心肌前体细胞或心肌细胞，再移植修复梗死心肌，可有效克服骨髓间充质干细胞存在的问题。干细胞的心肌分化由BMP、Wnt、Ras-Raf-MPAK、FGF等信号通路共同形成的复杂的三维多重生物网络系统所调控[46]。乳鼠心脏细胞裂解液可以模拟体外模拟心肌生长微环境[47,48]，最大限度的重现了心肌定向分化生长的生物调控网络环境，促使细胞心肌分化，但究竟是哪些成分有效目前尚无相关报道。心脏细胞裂解液的制备需反复冻融，我们推测可能是其中比较稳定的小分子物质，如miRNA。但miRNA家族庞大，调控机制复杂，我们尚未进行该方向的分析。除心脏细胞裂解液外，诱导干细胞心肌分化的方法还有：1、化学试剂、细胞因子；2、物理因素诱导；3、基因工程技术干扰基因表达。其中化学试剂如5-氮胞苷、DMSO等诱导效率低，且有细胞毒性，同样对人体有害，限制了临床应用；而细胞因子常需多种细胞因子组合多个时间点联合诱导[49]，且价格过于昂贵；物理因素诱导分化虽然效果确切，但设备技术要求高；基因工程技术存在潜在生物安全问题。维生素C是Takahashi[33]等从可应用于人体且具有诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的880种分化诱导化合物中筛选而出，经大量实验分析证实可诱导胚胎干细胞[33]、诱导多能干细胞[34,35]、羊水干细胞[36]分化为心肌样细胞。我们的实验首次证明了维生素C同样可诱导DFAT细胞心肌分化，维生素C的应用避免了化学诱导的细胞毒性及基因工程技术潜在的生物安全隐患，同时，具有更好的经济效益，其机制可能与维生素C激活MEK-ERK1/2有关[35]。我们体外诱导心肌分化的细胞可表达心肌特异性标志物，但均未观察到自发的收缩活动，我们称这种转分化的具有部分心肌细胞表型的细胞为心肌样细胞，与Jumabay等[39]的报道的有自发收缩的类心肌细胞不完全一致。我们推测心肌样细胞的心肌分化程度较低，与细胞种属来源、培养诱导分化条件等有关。24---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文我们的实验分析在国内率先分离培养出DFAT细胞，尽管分化程度不高，我们首次证明了维生素C可诱导细胞心肌分化，并且在心脏细胞裂解液体外模拟心肌微环境的条件下，可进一步提高细胞的心肌分化效率。细胞来源广泛、细胞纯度高、增殖能力强、体外心肌分化效率高，是心肌再生治疗中理想的自体移植的种子细胞。我们的实验分析为细胞的自体移植策略奠定理论和实践基础，如何进一步提高细胞的心肌分化效率和分化程度是今后细胞临床应用的重要分析方4、结论：①天花板贴壁培养法可成功的使成熟脂肪细胞去分化为DFAT细胞，DFAT细胞经乳鼠心脏组织裂解液、维生素C体外诱导分化后可再分化为心肌样细胞，是心肌细胞再生较为理想的种子细胞来源。②维生素C可以提高乳鼠心脏组织裂解液体外诱导DFAT细胞向心肌分化的效率。③DFAT细胞经维生素C、乳鼠心脏组织裂解液及二者联合诱导法诱导心肌特异性标志物的mRNA和蛋白质表达水平均升高。但均未观察到有自发跳动的细胞。故本实验只诱导出心肌样心肌前体细胞，离诱导出功能心肌细胞还有较大的距离。本实验的创新性①本实验应用维生素C为诱导剂诱导DFAT细胞向心肌细胞方向分化。②本实验应该乳鼠心脏组织裂解液模拟心肌生长微环境诱导DFAT细胞向心肌细胞方向分化。并首次证明乳鼠心脏细胞裂解液体外模拟心肌微环境的诱导条件下，维生素C对细胞心肌分化效率的作用。本实验的局限性①本实验主要对成熟脂肪细胞的去分化及DFAT细胞向心肌再分化进行形态学观察，未对细胞进行功能方面分析；②本实验重点关注诱导方法及诱导后效果的比较，未涉及诱导具体机制的及乳鼠心脏细胞裂解液诱导心肌分化有效成分的分析；③本实验仅从细胞形态、个别基因和蛋白表达来证明这种细胞具有心肌细胞性质是不够的。尚需从其功能及电生理方面加以分析。---- -------25---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文参考文献[1]卫生部心血管病防治分析中心.中国心血管病报告2011[M].北京:中国大百科全书出版社,2011.72-75.[2]SuttonMG,SharpeN.Leftventricularremodelingaftermyocardialinfarction:pathophysiologyandtherapy[J].Circulation,2000,101(25):2981-2988.[3]OlivettiG,CapassoJM,SonnenblickEH,etal.Side-to-sideslippageofmyocytesparticipatesinventricularwallremodelingacutelyaftermyocardialinfarctioninrats[J].CircRes,1990,67(1):23-34.[4]BeltramiAP,BarlucchiL,TorellaD,etal.Adultcardiacstemcellsaremultipotentandsupportmyocardialregeneration[J].Cell,2003,114(6):763-776.[5]CelikT,IyisoyA,KardesogluE,etal.Matrixmetalloproteinasesinacutecoronarysyndromes:anewtherapeutictarget?[J].IntJCardiol,2009,134(3):402-404.[6]Itskovitz-EldorJ,SchuldinerM,KarsentiD,etal.Differentiationofhumanembryonicstemcellsintoembryoidbodiescompromisingthethreeembryonicgermlayers[J].MolMed,2000,6(2):88-95.[7]TaylorDA,AtkinsBZ,HungspreugsP,etal.Regeneratingfunctionalmyocardium:improvedperformanceafterskeletalmyoblasttransplantation[J].NatMed,1998,4(8):929-933.[8]FujiwaraM,YanP,OtsujiTG,etal.Inductionandenhancementofcardiaccelldifferentiationfrommouseandhumaninducedpluripotentstemcellswithcyclosporin-A[J].PLoSOne,2011,6(2):e16734.[9]deBoerTP,vanVeenTA,JonssonMK,etal.Humancardiomyocyteprogenitorcell-derivedcardiomyocytesdisplayamaturatedelectricalphenotype[J].JMolCellCardiol,2010,48(1):254-260.[10]HofmannM,WollertKC,MeyerGP,etal.Monitoringofbonemarrowcellhomingintotheinfarctedhumanmyocardium[J].Circulation,2005,111(17):2198-2202.[11]FongCY,GauthamanK,BongsoA.Teratomasfrompluripotentstemcells:Aclinicalhurdle[J].JCellBiochem,2010,111(4):769-781.[12]黄穗花，伍卫.干细胞治疗心肌梗死的分析进展[J].岭南心血管病杂志,2012(01):90-93.[13]MenascheP,AlfieriO,JanssensS,etal.TheMyoblastAutologousGraftinginIschemicCardiomyopathy(MAGIC)trial:firstrandomizedplacebo-controlledstudyofmyoblast---- -------26---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文transplantation[J].Circulation,2008,117(9):1189-1200.[14]张浩，胡盛寿，郑哲，等.高龄和青年大鼠骨髓间质细胞移植对缺血心脏心功能的影响[J].中华心血管病杂志,2004,32(4):359-361.[15]GriescheN,LuttmannW,LuttmannA,etal.Asimplemodificationoftheseparationmethodreducesheterogeneityofadipose-derivedstemcells[J].CellsTissuesOrgans,2010,192(2):106-115.[16]NobusueH,EndoT,KanoK.EstablishmentofapreadipocytecelllinederivedfrommatureadipocytesofGFPtransgenicmiceandformationofadiposetissue[J].CellTissueRes,2008,332(3):435-446.[17]AdebonojoFO.Studiesonhumanadiposecellsinculture:relationofcellsizeandmultiplicationtodonorage[J].YaleJBiolMed,1975,48(1):9-16.[18]VanRL,BaylissCE,RoncariDA.Cytologicalandenzymologicalcharacterizationofadulthumanadipocyteprecursorsinculture[J].JClinInvest,1976,58(3):699-704.[19]SugiharaH,YonemitsuN,MiyabaraS,etal.Primaryculturesofunilocularfatcells:characteristicsofgrowthinvitroandchangesindifferentiationproperties[J].Differentiation,1986,31(1):42-49.[20]SakumaT,MatsumotoT,KanoK,etal.Mature,adipocytederived,dedifferentiatedfatcellscandifferentiateintosmoothmuscle-likecellsandcontributetobladdertissueregeneration[J].JUrol,2009,182(1):355-365.[21]KazamaT,FujieM,EndoT,etal.Matureadipocyte-deriveddedifferentiatedfatcellscantransdifferentiateintoskeletalmyocytesinvitro[J].BiochemBiophysResCommun,2008,377(3):780-785.[22]OkiY,WatanabeS,EndoT,etal.Matureadipocyte-deriveddedifferentiatedfatcellscantrans-differentiateintoosteoblastsinvitroandinvivoonlybyall-transretinoicacid[J].CellStructFunct,2008,33(2):211-222.[23]JumabayM,MatsumotoT,YokoyamaS,etal.Dedifferentiatedfatcellsconverttocardiomyocytephenotypeandrepairinfarctedcardiactissueinrats[J].JMolCellCardiol,2009,47(5):565-575.[24]杨华，陈连凤，沈珠军.催产素诱导去分化脂肪细胞向心肌细胞方向分化(英文)[J].心脏杂志,2011(06):705-710.---- -------27---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文[25]JumabayM,ZhangR,YaoY,etal.Spontaneouslybeatingcardiomyocytesderivedfromwhitematureadipocytes[J].CardiovascRes,2010,85(1):17-27.[26]YagiK,KondoD,OkazakiY,etal.Anovelpreadipocytecelllineestablishedfrommouseadultmatureadipocytes[J].BiochemBiophysResCommun,2004,321(4):967-974.[27]MatsumotoT,KanoK,KondoD,etal.Matureadipocyte-deriveddedifferentiatedfatcellsexhibitmultilineagepotential[J].JCellPhysiol,2008,215(1):210-222.[28]OkiY,WatanabeS,EndoT,etal.Matureadipocyte-deriveddedifferentiatedfatcellscantrans-differentiateintoosteoblastsinvitroandinvivoonlybyall-transretinoicacid[J].CellStructFunct,2008,33(2):211-222.[29]JumabayM,AbdmaulenR,UrsS,etal.Endothelialdifferentiationinmultipotentcellsderivedfrommouseandhumanwhitematureadipocytes[J].JMolCellCardiol,2012,53(6):790-800.[30]LiottiFS,BodoM,TalesaV.Stimulatingeffectofascorbicacidonascitestumorcellmultiplicationinvitro[J].JCancerResClinOncol,1983,106(1):69-70.[31]SaikaS.Ascorbicacidandproliferationofculturedrabbitkeratocytes[J].Cornea,1993,12(3):191-198.[32]ArrigoniO,DeTullioMC.Ascorbicacid:muchmorethanjustanantioxidant[J].BiochimBiophysActa,2002,1569(1-3):1-9.[33]TakahashiT,LordB,SchulzePC,etal.Ascorbicacidenhancesdifferentiationofembryonicstemcellsintocardiacmyocytes[J].Circulation,2003,107(14):1912-1916.[34]KensahG,RoaLA,DahlmannJ,etal.Murineandhumanpluripotentstemcell-derivedcardiacbodiesformcontractilemyocardialtissueinvitro[J].EurHeartJ,2013,34(15):1134-1146.[35]CaoN,LiuZ,ChenZ,etal.Ascorbicacidenhancesthecardiacdifferentiationofinducedpluripotentstemcellsthroughpromotingtheproliferationofcardiacprogenitorcells[J].CellRes,2012,22(1):219-236.[36]陈家欢，魏育蕾，彭莎，等.猪羊水干细胞特异向跳动心肌细胞诱导分化[J].生物工程学报,2011,27(8):1206-1214.[37]袁岩，陈连凤，张抒扬，等.心肌细胞裂解液对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化诱导作用的分析[J].中华心血管病杂志,2005,33(2):170-173.[38]杨梁，张晓刚，魏新伟.维生素C体外诱导多能干细胞向心肌细胞的分化[J].中国组织---- -------28---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文工程分析与临床康复,2011,15(23):4229-4232.[39]JumabayM,ZhangR,YaoY,etal.Spontaneouslybeatingcardiomyocytesderivedfromwhitematureadipocytes[J].CardiovascRes,2010,85(1):17-27.[40]RingeJ,KapsC,BurmesterGR,etal.Stemcellsforregenerativemedicine:advancesintheengineeringoftissuesandorgans[J].Naturwissenschaften,2002,89(8):338-351.[41]CaoF,SunD,LiC,etal.Long-termmyocardialfunctionalimprovementafterautologousbonemarrowmononuclearcellstransplantationinpatientswithST-segmentelevationmyocardialinfarction:4yearsfollow-up[J].EurHeartJ,2009,30(16):1986-1994.[42]HerbotsL,D'HoogeJ,ErogluE,etal.Improvedregionalfunctionafterautologousbonemarrow-derivedstemcelltransferinpatientswithacutemyocardialinfarction:arandomized,double-blindstrainrateimagingstudy[J].EurHeartJ,2009,30(6):662-670.[43]陈运贤，欧瑞明，钟雪云，等.自体骨髓干细胞原位移植治疗急性心肌梗死的临床分析[J].中国病理生理杂志,2003,19(4):452-454.[44]黄榕翀，钱菊英，葛均波.干细胞移植治疗心肌梗死后心力衰竭[J].中国医师进修杂志,2006,29(10):1-4.[45]JumabayM,MatsumotoT,YokoyamaS,etal.Dedifferentiatedfatcellsconverttocardiomyocytephenotypeandrepairinfarctedcardiactissueinrats[J].JMolCellCardiol,2009,47(5):565-575.[46]VermaV,PurnamawatiK,Manasi,etal.Steeringsignaltransductionpathwaytowardscardiaclineagefromhumanpluripotentstemcells:areview[J].CellSignal,2013,25(5):1096-1107.[47]袁岩，陈连凤，张抒扬，等.心肌细胞裂解液对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化诱导作用的分析[J].中华心血管病杂志,2005,33(2):170-173.[48]吕学祥，曾秋棠.心肌细胞裂解液诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化作用[J].临床心血管病杂志,2008,24(3):217-219.[49]KattmanSJ,WittyAD,GagliardiM,etal.Stage-specificoptimizationofactivin/nodalandBMPsignalingpromotescardiacdifferentiationofmouseandhumanpluripotentstemcelllines[J].CellStemCell,2011,8(2):228-240.---- -------29---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文综述：DFAT细胞体外分化诱导实验及体内生物学特性综述李福海综述张陈匀审校【摘要】去分化脂肪(dedifferentiatedfat，DFAT)细胞。由于来源广泛、取材方便、增殖能力强、免疫原性低、表型稳定，很大程度上符合再生医学对理想种子细胞的要求，现已成为各个领域的分析热点。通过查阅近几年文献，本文对体外诱导DFAT细胞向多个方向分化的诱导方法及DFAT细胞在动物模型体内的多向分化和组织修复特性进行了综述。目前对DFAT的分析仍滞留于寻求更高效的分化诱导因子的早期阶段，若欲将DFAT细胞作为再生医学的种子细胞投入临床应用，仍需大量的分析与探索。【关键词】去分化脂肪细胞；分化；诱导；生物学特性ReviewontheInducedDifferentiationExperimentinvitroandBiologicalCharacteristicsinvivoofDFATCellsFuhaiLi1，ZhiWang1，ChenjunZhang1,21GladstoneInstituteofCardiovascularDiseaseofGuizhouProvince,Guiyang,550002;2CardiologyDepartmentofPeople'sHospitalofGuizhou,Guiyang,550002【Abstract】Thededifferentiatedfat(DFAT)cell,whichmeetsthedemandsfortheidealseedcellsoftheregenerativemedicinetoalargeextentthankstoitsextensivesources,convenientdrawing,strongproliferationability,weakimmunogenicityandstablephenotype,hasbecomearesearchhotspotofmanyfields.Basedonconsultingtheliteratureinrecentyears,thisthesisconductsareviewontheinductionmethodsofthedifferentiationofinducedDFATcellsinvitrointomultipledirectionsandthemulti-directionaldifferentiationandthetissuerepairingfeaturesofDFATcells.Atpresent,thestudyonDFATcellsstillstagnatesattheearlystageofseekingformoreefficientinductiondifferentiationfactors,andamountofresearchandexplorationisremainstobedonebeforeDFATcellsareputintoclinicaluseastheseedcellsofheregenerativemedicine.30---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文【KeyWords】DFATcells,differentiation,induction,biologicalcharacteristics20世纪80年代后期，组织学工程概念的提出，把再生医学带入了一个充满机遇与挑战的新时期。寻找更优秀的种子细胞，已成为再生医学发展的瓶颈问题。尽管干细胞作为医学分析者们的宠儿，已广泛的应用于基础医学的分析和临床疾病的治疗，但仍无法满足现代医学对理想种子细胞的要求。源于成熟脂肪细胞、经历了分化和去分化过程后才获得多向分化潜能的去分化脂肪(dedifferentiatedfat，DFAT)细胞，具有来源广泛、取材方便、增殖能力强[1]、免疫原性低[2]、表型稳定[2]等优势，在很大程度上符合理想种子细胞的标准。大量分析均证实DFAT细胞具有多向分化潜能[3-5],在体外不仅可以分化为同胚层来源的起搏样细胞、平滑肌样细胞、成骨细胞[6]、[7]、心肌细胞、软骨细胞[8]、骨骼肌样细胞和脂肪细胞[9-11]，而且还可以跨越胚层分化为内胚层来源的内皮细胞等，是最具潜力的优秀种子细胞。但要将DFAT细胞投入临床应用还必须对其进行动物模型体内生物学特性等更为深入的分析。近十几年来，国内外学者对DFAT细胞体外分化诱导[12-15]及动物模型体内生物学特性进行了大量的探索，本文就这两方面作一综述。一、DFAT细胞的体外分化诱导实验1.1体外诱导DFAT细胞向平滑肌细胞方向分化TakahiroSakuma[16]等人在分析中发现约有0.07%的DFAT细胞中含有平滑肌细胞的特异性标记物α-SM-actin的mRNA，进而推断DFAT细胞具有向平滑肌细胞分化的潜能。通过实验成功地在体外将DFAT细胞诱导为平滑肌细胞，并筛选出能诱导DFAT细胞向平滑肌细胞特异性分化的诱导因子：胎牛血清（FCS）和TGF-β1。还通过试验证明了5%FCS和5ng/mlTGF-β1是诱导DFAT细胞分化为平滑肌细胞的最适宜浓度。经该浓度的诱导剂诱导培养1周后，PCR显示在DFAT细胞中SM22-α、α-SM-actin和平滑肌肌球蛋白重链等标记基因的表达开始增加。2周后，DFAT细胞α-SM-actin的表达率可高达70%。1.2体外诱导DFAT细胞向骨骼肌细胞方向分化TomohikoKazama[17]等通过分析发现小鼠来源DFAT细胞中的成肌细胞决定基因（MyoD）的核心增强子（CE）与小鼠成肌细胞相比呈现出高度的甲基化。以此推测DNA的甲基化使DFAT细胞MyoD的CE处于抑制状态，予DFAT细31---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文胞以去甲基化处理可能是诱导DFAT细胞向骨骼肌细胞分化的有效方法。TomohikoKazama[17]等用去甲基化剂20μmol／L去甲基-5-氮胞苷诱导DFAT细胞3天后，检测到DFAT细胞的MyoD和肌形成蛋白在mRNA水平和蛋白质水平的表达均增加。此次试验结果显示，由于DFAT细胞的CE的甲基化程度过高，MyoD和肌形成蛋的表达水平比相同诱导条件下的鼠胚胎细胞系细胞的表达水平低。也仅有一小部分DFAT细胞经去甲基-5-氮胞苷诱导后成功的分化为骨骼肌细胞。0.5体外诱导DFAT细胞向成骨细胞方向分化1.1.1YoshinaoOki[18]等通过对先前学者的分析结果进行分析、总结得出:全反式维甲酸（RA）通过选择性的结合维甲酸受体(ARA)后再与维甲酸X受体（RXR）形成RAR-RXR异源性二聚体，竞争性抑制PPARγ与RXR形成异源性二聚体PPARγ-RXR，使启动向脂肪细胞方向分化的决定性受体PPARγ2失活。RAR-RXR异源性二聚体同时亦可激活碱性磷酸酶(ALP)基因启动子区的维甲酸反应元件（RARE），使成骨细胞特异的mRNA编码的ALP表达增加。故RA有诱导DFAT细胞向成骨细胞方向分化，抑制其向脂肪细胞方向分化的特性。并在体外进行了RA诱导DFAT细胞向成骨细胞分化实验，经10μmolRA诱导后，细胞内ALP的活性迅速增加，并于诱导后第4天达到高峰。诱导第8天，可在显微镜下检测到细胞外基质微弱的矿化。诱导12天后可在胞外基质中观察到骨结节,与此同时，细胞外基质中骨钙素的总量也开始增加。这表明RA可在体外诱导DFAT细胞分化为成熟的成骨细胞。1.1.2TaroMatsumoto[2]等在DMEM培养基中加入10%FBS、100nM地塞米松、10mMβ磷酸甘油及50mML-抗坏血酸-2-磷酸酯等诱导剂对人来源的DFAT细胞体外诱导培养1周后，即可检测到DFAT细胞中ALP表达增加，3周后，可检测到细胞外基质矿化，且在基因和蛋白质水平均可检测到骨桥蛋白的表达。这种方法亦是体外诱导DFAT细胞向成骨细胞分化的有效方法。0.6体外诱导DFAT细胞向心肌方向分化1.2.1MedetJumabay[19]等分析发现DFAT细胞的细胞表面免疫标志物和骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）及脂肪来源干细胞（ASCs）非常相似。而BM-MSCs和ASCs均可在体外诱导分化为心肌样细胞。即同时将GFP标记的32---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文DFAT细胞分别与心肌细胞共同培养、心肌细胞选择性培养基培养、Transwell小室培养及干细胞甲基纤维素半固体培养基培养，7天后，四种培养法培养的细胞均可用免疫染色法检测到GATA4、Nkx2．5、心肌肌动蛋白、肌钙蛋白-T等心肌特异性蛋白的表达。这表明四种培养法均可在体外诱导DFAT细胞分化为心肌样细胞，且在体外诱导DFAT细胞向心肌细胞分化的过程中，心肌细胞分泌的某些可溶性细胞因子是必要的、起着决定性作用的诱导因子，而与心肌细胞直接接触并不是必要的诱导因子。蛋白质定量分析显示，干细胞甲基纤维素半固体培养基培养法培养的DFAT细胞中Nkx2．5和肌钙蛋白-T的含量明显高于另3种培养法中DFAT细胞的含量。这表明三维的培养环境可能更有利于DFAT细胞向心肌细胞方向分化。此次试验中未检测到有收缩活动的心肌样细胞。1.4.2YANGH等[20]在体外使用可将胚胎肿瘤干细胞P19及P19CL6诱导分化成心肌细胞的催产素（0T），按不同的诱导时间（1周、2周、3周）及不同诱导浓度的OT（10-8M、10-7M、10-6M）对DFAT细胞进行诱导培养。结果显示，10-6M的OT可使DFAT细胞大量死亡。经10-8M及10-7M的OT诱导3周后可检测到部分细胞表达GATA4、NKX2.5、c-TnT等心肌特异性标记物，但这些标记物无论是在基因水平还是在蛋白质水平均达不到心肌细胞的水平。此次试验中亦未发现有自发收缩活动的细胞。1.1.1体外诱导DFAT细胞向起搏细胞方向分化1.2.1MedetJumabay等[21]用20%胎牛血清诱导培养DFAT细胞10天后,观察到约有10%的DFAT细胞分化为管状细胞,且周围聚集着少量圆形细胞。14天后，这些管状细胞形成肌管样结构，此时在部分管状细胞和其周边的圆形细胞可观察到自发的跳动。15天后，这些肌管样结构可通过分支纤维连接形成紧密的网状结构。第21天，可以观察到整个网络中的细胞可发生同步跳动。当加入β_异丙肾上腺素受体激动剂后，这些细胞的跳动频率明显加快，而加入β-受体拮抗剂可使其跳动频率减慢。PCR分析显示这些能自发性跳动细胞可表达NKx-2.5、GATA4、MEF-2C等心脏特异性mRNA。进一步试验发现应用Wnt信号通路抑制剂或可抑制脂滴聚集的骨形态发生蛋白抑制剂可以在体外促进DFAT细胞向起搏样心肌细胞分化。33---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文0.5支运霞等[22]进行了5-AZA体外诱导DFAT细胞分化试验。经5-AZA诱导后的DFAT细胞内可检测到Nkx2．5、GATA-4、Tn、Cx和HCN等心脏标志物在基因和蛋白质水平的表达。诱导3周后透射电镜下可见有肌节样结构和较多的缝隙连接。但与静息心室肌共同培养时，将这些经5-AZA诱导后的细胞并不能驱动静息的心室肌搏动。这表明这些分化为具有起搏细胞表型的细胞并不具备起搏细胞的功能。另外支运霞等还进行了与窦房结细胞共同培养的方法来诱导DFAT细胞向起搏样细胞分化的试验。结果显示与窦房结细胞共同培养后的DFAT细胞同样能表达Nkx2．5、GATA-4、Tn、Cx和HCN等起搏细胞表型且可以驱动静息的心室肌搏动。1.1.1体外诱导DFAT细胞向内皮细胞方向分化MedetJumabay等[23]在体外分析DFAT细胞生物学特性时发现,用MEM培养基培养至第5天时有少量DFAT细胞自发的分化为内皮细胞,PCR及免疫染色显示这种自发分化的细胞表达CD31、vWF、FLK1、VEGF及血管内皮钙粘蛋白等内皮细胞特异性标志物。至第15天发生自发分化的细胞数高达8.3%。进一步分析发现,向培养基中分别加入骨形态发生蛋白BMP4、BMP9可使DFAT细胞向内皮细胞分化的分化率净增加5.2%和12.1%。同时加入BMP4、BMP9效果更佳。该试验结果与Planat-Bernard[24]等脂肪细胞和内皮细胞有共同的祖细胞的论断不谋而合。1.1.2体外诱导DFAT细胞向脂肪细胞方向分化KenYagi[25]等观察到从小鼠胚胎中分离的3T3-L1和3T3-F442A系前脂肪细胞和DFAT细胞形态相同，都具有成纤维细胞样外观。为验证成熟脂肪细胞来源的DFAT细胞是否与前脂肪细胞一样可以再分化为成熟脂肪细胞：他们用1.2.1mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（MIX）、0.25μM地塞米松(DEX)及胰岛素铁硒传递蛋白X等诱导剂对DFAT细胞进行了体外诱导培养，2天后，即可在DFAT细胞中检测到参与脂肪酸代谢的转录因子PPARγ和C/EBP家族成员的表达，其中PPARγ2和C/EBPαmRNA的表达第2天即可达最大量。5～7d可以观察到DFAT细胞内有脂滴聚集，同时成熟脂肪细胞的特异性标志物磷酸甘油脱氢酶（GPDH）的活性明显增加。进一步分析发现，DFAT细胞传至第20代时，仍可34---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文被诱导分化为成熟脂肪细胞。HiroyukiNobusue等[1]后来的试验分析也得到了相同的结果。0.5体外诱导DFAT细胞向软骨细胞方向分化TaroMatsumoto等[2]在DMEM培养基中加入1%FBS、50μML-抗坏血酸-2-磷酸酯、40μg/ml脯氨酸、100μg/ml丙酮酸、10ng/mlTGF-β3等诱导因子对来源于人的DFAT细胞进行体外诱导培养。诱导3周后，免疫荧光可检测到培养基中有II型胶原阳性的小块状物形成。由于软骨蛋白聚糖在细胞外基质中聚集使小块状物阿辛蓝染色亦为阳性。RT-PCR显示，成熟软骨细胞的标志物：基底膜蛋白多糖、SOX9基因、软骨聚集蛋白聚糖等在诱导后高表达。这表明DFAT细胞已成功的在体外诱导分化为软骨细胞。二、DFAT细胞的体内生物学特性1.1.1DFAT细胞动物模型体内的多向分化潜能1.2.1体内向心肌细胞方向分化MedetJumabay[19]等用左冠状动脉结扎术建立大鼠急性心肌梗塞模型3小时后，将GFP染色但未经任何诱导处理的DFAT细胞注射入心肌5个不同的缺血区。8周后，可以观察到大量GFP阳性的DFAT细胞聚集在心肌梗塞区并表达心肌肌节蛋白。这表明DFAT细胞已在大鼠体内分化为心肌样细胞，且心肌肌节蛋白阳性的DFAT细胞可发生融合并形成肌管样结构。这可能是DFAT细胞修复受损心肌组织的途径。1.2.2体内向平滑肌方向分化为验证DFAT细胞是否可以在体内分化为平滑肌细胞，日本大学医学部泌尿外科的TakahiroSakuma[16]和DaisukeObinata[26]等人进行了深入的分析。TakahiroSakuma等[16]在小鼠建立膀胱损伤动物模型7天后，将用GFP标记的来源于人的DFAT细胞接种到小鼠损伤的膀胱壁，并用生理盐水处理对照组。移植后14-30天，可以在试验组小鼠检测到GFP阳性的DFAT细胞定植于膀胱壁损伤区，且大部分GFP阳性的DFAT细胞均表达α-SM-actin。与对照组相比，实验组小鼠膀胱壁受损区的α-SM-actin阳性率明显增高。DaisukeObinata等[26]对SD大鼠进行3小时的阴道扩张（VD），以建立泄漏点压力（LPP）降低、尿道括约肌受损的VD动物模型，来模拟女性压力性尿失禁的发病机制。建模成功后将GFP35---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文标记的DFAT细胞于耻骨联合上水平接种于尿道旁结缔组织。移植2周后，可在受损的平滑肌层检测到巨噬细胞的聚集和α-SM-actin阳性的DFAT细胞，形态计量学分析表明，试验组横纹肌厚度明显增加，α-SM-actin阳性区面积及LPP均明显大于对照组。以上试验结果均表明DFAT细胞可在体内分化为平滑肌样细胞并促进受损组织的修复。2.1.3体内向脂肪细胞方向分化HiroyukiNobusue等[1]将GFP转基因小鼠来源的未经诱导的DFAT细胞（DFAT-GFP细胞）直接接种于C57BL/6N小鼠皮下组织。移植后14天，在接种部位可检测到在紫外线下发绿色荧光的新脂肪垫形成。组织学分析显示，接种的DFAT-GFP细胞可直接分化为葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)阳性的成熟脂肪细胞形成异位脂肪组织。且由DFAT细胞体内分化形成的异位脂肪组织可在小鼠体内存活1月之久。2.1.4体内向骨细胞方向分化YoshinaoOki等[18]将经RA诱导4天,尚未形成细胞基质矿化的DFAT细胞,用I型胶原凝胶以1*106个/100μL的浓度悬浮后注射入已消毒处理两侧均贴有滤过膜的扩散盒内。将扩散盒移植入8周龄小鼠的腹膜腔，进行体内培养，四周后将扩散盒取出，染色观察可见在没有任何宿主细胞侵入扩散盒的情况下，RA诱导的DFAT细胞已在扩散盒内形成骨样组织。TaroMatsumoto等[2]将来源于人的DFAT细胞接种于I型胶原海绵上并共同置于成骨细胞诱导培养基（DMEM培养基中加入10%FBS、100n地塞米松、10mMβ磷酸甘油及50mML-抗坏血酸-2-磷酸酯）中诱导培养2周后，再将胶原海绵种植于裸鼠皮下。3周后取出，可见海绵内有新生血管的骨组织生成，茜素红染色阳性。组织学分析显示该骨组织中含有：类骨质、编织骨、成骨细胞、破骨细胞等成分。1.1.1DFAT细胞体内修复损伤组织1.2.1体内修复神经损伤YukiOhta等[27]将10周龄的雌性大鼠制成脊髓损伤动物模型8天后，用立体定位显微注射器注射5μL未经任何诱导处理的大鼠DFAT细胞到大鼠脊髓损伤区，用BBB（Basso-Beattie-Bresnahan）得分评定大鼠的运动功能。注射后336---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文天，即可以观察到处理组大鼠后肢运动功能与对照组相比有所改善。注射后4周，处理组大鼠即可前后肢协调的行走，而对照组大鼠的运动功能虽也有所改善，但只能很吃力的缓慢爬行。通过免疫组织化学染色检测到移植的DFAT细胞可在脊髓损伤区表达脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子，这可能是DFAT细胞促进脊髓运动功能恢复的原因。此试验尚未得出DFAT细胞是否可在体内分化为神经细胞或神经胶质细胞的结论。2.2.2体内促进肾功能恢复Nur[28]等向腱糖蛋白C基因敲除的小鼠注射响尾蛇毒(HSV)诱导出小鼠肾功能不全动物模型后，再将血小板源性生长因子（PDGF-BB）诱导处理7天的DFAT细胞经小鼠尾部静脉注射入小鼠体内。结果显示，移植入DFAT细胞后可使HSV诱导增高的血清尿素氮降低、使HSV诱导的肾小球硬化修复。PCR显示，移植入DFAT细胞后可使HSV诱导肾皮质中增加的腱糖蛋白C、TGF-β1、纤维连接蛋白基因等明显降低。这表明DFAT细胞可能对肾功能不全有积极的治疗作用。2.2.3体内促进新生血管形成Planat-Benard等[24]结扎裸鼠右侧后肢股动脉以建立鼠后肢缺血动物模型。动脉完全闭塞5小时后，分别向缺血后肢的腓肠肌、股薄肌和股四头肌内注射25μL源于人未经诱导处理的DFAT细胞悬液（约含1*106个DFAT细胞）。15天后，可检测到缺血后肢的血管密度增加，在小鼠后肢新生成的血管中检测到CD31细胞。MedetJumabay等[19]、[23]进行的大鼠急性心肌梗塞模型试验中，通过检测异凝集素β4、抗平滑肌抗体染色，发现DFAT细胞接种后心肌梗塞区毛细血管的密度比对照组明显增加，毛细血管抗平滑肌抗体染色呈阳性。这表明DFAT细胞可增加大鼠体内梗塞区毛细血管的密度。三、结束语近十余年，对DFAT细胞多向分化潜能的分析虽然已取得许多可喜的成果,但仍滞留于寻求更高效的分化诱导因子的早期阶段。尽管目前已可在体外诱导DFAT细胞分化为同胚层来源的多种细胞甚至是跨胚层分化，但分化诱导方法仍不成熟，细胞分化水平均较低。尚有诸多基础性问题等待进一步探讨与分析，如DFAT细胞是处于何种分化状态的细胞，诱导因子诱导DFAT细胞向分化的机制是什么，如何调控DFAT细胞的分化方向、控制其分化阶段使其分化为特定类型37---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文的细胞，DFAT细胞在分化后是否会演变成肿瘤组织，等等。由此可见,若要将DFAT细胞作为再生医学的种子细胞投入临床应用,仍需大量分析工作，但是我们相信DFAT细胞所具有的来源丰富[16]、细胞纯度高[21]、增殖能力强[1]、免疫原性低[2]、对供者年龄要求较低[16]等优势将推动再生医学的发展。参考文献[1]NobusueH，EndoT，KanoK．EstablishmentofapreadipocytecelllinederivedfrommatureadipoeytesofGFPtransgenicmiceandformationofadiposetissue[J]．CellTissueRes，2008，332(3)：435—446．[2]MatsumotoT，KanoK，KondoD，eta1．Matureadipocyte-deriveddedifferentiatedfatcellsexhibitmultilineagepotential[J]．JCellPhysiol，2008，215(1)：210—222．[3]程飞飞,魏翠,潘文雯等.去分化脂肪细胞的生物学特性探究[J].中国美容整形外科杂志,2012,23(12):760-763.[4]ShenJF,AtsunoriS,JoeY,eta1．Dedifferentiatedfatcells:analternativesourceofadultmultipotentcellsfromtheadiposetissues[J].IntJOralSci,2011,3(3):117-24.[5]廖云君.去分化脂肪细胞的细胞生物学分析[D].南方医科大学,2008.[6]王兆杰,安荣泽,张弛等.兔成骨细胞和脂肪细胞横向分化的分析[J].中华实验外科杂，2012,29(7):1262-1264.[7]NaotakaK,YoshihiroM,YoshiyaH，eta1．Theosteoblasticdifferentiationabilityofhumandedifferentiatedfatcellsishigherthanthatofadiposestemcellsfromthebuccalfatpad[J]．ClinOralInvestig,2013Dec21,[Epubaheadofprint].[8]吴迪.去分化脂肪细胞与脂肪干细胞成骨成软骨能力的比较分析[D].遵义医学院,2012.[9]陈晓炜,姜平,高建华等.去分化脂肪细胞与脂肪来源干细胞体内成脂能力比较的初步分析[J].中华整形外科杂志,2010,26(5):372-377.[10]ZhangHH，KumarS，BarnettAH，eta1．Ceilingcultureofmaturehumanadipocytes：useinstudiesofadipocytefunctions[J]．JEndocrinol，2000，164(2)：119—128．[11]KouL,LuXW,WuMK,eta1．Thephenotypeandtissue-specificnatureofmultipotentcellsderivedfromhumanmatureadipocytes[J]．IntJOralSci.20113(3):117-24.[12]宋子仪,史新娥,杨浩等.基于一种新的天花板培养方法分析猪成熟脂肪细胞去分化过程中关键基因表达模式[J].农业生物技术学报,2013,21(4):379-387.[13]王欢欢,孙文星,徐春瑛等.猪成熟脂肪细胞分离培养及去分化分析[J].农业生物技术学38---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文报,2012,20(8):915-921.[14]WeiS,DuM,JiangZ,eta1．Bovinededifferentiatedadiposetissue(DFAT)cells:DFATcellisolation[J].IntJOralSci.2011,3(3):117-124.[15]WeiS,BergenWG,HausmanGJ,eta1．CellculturepurityissuesandDFATcells[J].BiochemBiophysResCommun.2013,433(3):273-275.[16]SakumaT，MatsumotoT，KanoK，eta1．Mature，adipocytederived，dedifferentiatedfatcellscandifferentiateintosmoothmuscle—likecellsandcontributetobladdertissueregeneration[J]．JUrol，2009，182(1)：355-365.[17]KazamaT，FujieM，EndoT，eta1．Matureadipocyte-deriveddedifferentiatedfatcellscantransdifferentiateintoskeletalmyocytesinvitro[J]．BiochemBiophysResCommun，2008，377(3)：780—785．[18]OkiY，WatanabeS，EndoT，eta1．Matureadipocyte-deriveddedifferentiatedfatcellscantrans-differentiateintoosteoblastsinvitroandinvivoonlybyall-transretinoicacid[J]．CellStructFunct，2008，33(2)：211-222．[19]JumabayM，MatsumotoT，YokoyamaS，eta1．Dedifferentiatedfatcellsconverttocardiomyocytephenotypeandrepairinfractedcardiactissueinrats[J]．JMolCellCardiol，2009，47(5)：565—575．[20]YANGH,eta1.OxytocininducescardiacdifferentiationofdedifferentiatedFATcells.ChinHeartJ2011，23(6):705-710.[21]JumabayM，ZhangR，YaoY，eta1．Spontaneouslybeatingcardiomyocytesderivedfromwhitematuredipocy-tes[J]．CardiovaseRes，2010，85(1)：17-27．[22]支运霞.去分化脂肪细胞向起搏细胞的诱导分化[D].第二军医大学,2012.[23]JumabayM,AbdmaulenR,UrsS,etal.Endothelialdifferentiationinmultipotentcellsderivedfrommouseandhumanwhitematureadipocytes[J].JournalofMolecularandCellularCardiology.2012,53:790-800.[24]Planat-BenardV,SilvestreJS,CousinB,AndreM,NibbelinkM,TamaratR,etal.Plasticityofhumanadiposelineagecellstowardendothelialcells:physiologicalandtherapeuticperspectives.Circulation2004;109:656-663.[25]YagiK，KondoD，OkazakiY，eta1．Anovelpreadipocytecelllineestablishedfrommouseadultmatureadipocytes[J]．BiochemBiophysResCommun，2004，321(4)：967-974．---- -------39---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文[26]ObinataD，MatsumotoT，IkadoY，eta1．Transp1antatIOnofmatureadipocyte-deriveddedifferentiatedfat(DFAT)cellsimprovesurethralsphinctercontractilityinaratmodel[J]．IntJUrol,2011，18(12)：827—834．[27]OhtaY，TakenagaM，TokuraY，eta1．Matureadipocyte-derivedcells，dedifferentiatedfatcells(DFAT)．promotedfunctionacdrecoveryfromspinalcordinjuryinducedmotordysfunctioninrats[J]．CellTransplant，2008，17(8)：877—886.[28]NurR，FukudaN，MatsumotoT，eta1．ImplantationofdedifferentiatedfatcellsamelioratesHabusnakevenom-inducedchronicrenaldysfunctionintenascin-C-deficientmice[J]．NephronExpNephro1，2008，110(3)：e91—98．---- -------40---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文作者简历姓名：李福海性别：男出生年月：1989年5月民族：汉族籍贯：湖北政治面貌：党员一、简要学历及工作经历2007年9月-2012年6月贵阳医学院临床医学专业，医学学士；2012年9月-2015年6月贵阳医学院攻读临床医学硕士专业学位二、攻读学位期间发表的学术论文（一）已录用待发表论文0.5李福海，李宗庄，蒋智等；维生素C提高体外培养去分化脂肪细胞的心肌分化效率[J].中国病理生理杂志，2015，31（8）0.6李福海，王志，张陈匀；DFAT细胞体外分化诱导实验及体内生物学特性综述[J].北京生物医学工程，2015，34（2）---- -------41---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文致谢由衷地感谢我敬爱的导师张陈匀教授，三年来，您以极大的耐心和责任心包容了我的种种缺点和错误，您严谨的治学精神、精湛的医术、高尚的医德、精益求精的科学态度深深的影响着我,这是我美好的回忆和人生宝贵的财富,使我终生受益。您对我工作和学习方面的支持和指导，对我生活的关心和帮助，使我度过了充实、愉快的读研生活。您正直的人格、热忱的人生态度深深的感染我；在此，我向导师表达最衷心的感谢和崇高的敬意！感谢李宗庄、田野、岳峰、刘启方、王志师兄们及蒋智博士在我的课题设计、实施、数据分析及论文撰写投稿过程中给予我悉心指导。感谢贵州省人民医院病理科易韦教授在实验过程中给予我的无私帮助和指导。感谢同窗好友田茂波、杨君、冯柯在实验期间的无私的帮助。感谢吴强主任、杨龙主任、陈丹丹主任、刘志琴主任、李玲主任、刘晓桥主任、韦方主任、张萍主任、蒋清安主任、陈保林主任、安亚平主任等各位资深专家在我临床实习期间的悉心指导，使我的临床工作得到了迅速的进步。在此，向省医心内科的全体老师呈上我最真诚感谢。感谢我的家人，正是他们在我身后默默地给予我关心、支持和理解，使我能够无忧地全身心投入到科研和临床工作中。最后感谢各位答辩委员会老师及秘书老师在百忙中抽出时间来参加我们的论文答辩，您们辛苦了！---- -------42---- -------贵阳医学院2015届专业学位硕士分析生学位论文学位论文数据集关键词*密级*中图分类号*UDC论文资助去分化脂肪细胞维生素C公开R541.4616.1心脏组织裂解液诱导分化学位授予单位名称*学位授予单位代码*学位类别*学位级别*贵阳医学院10660专业学位医学硕士论文题名*论文语种*不同诱导条件对去分化脂肪细胞分化为心肌样细胞的实验分析中文并列题名*EffectsofDifferentInductionConditionsonDifferentiationofDedifferentiatedFatCellsintoCardiomyocyte-likeCells作者姓名*李福海学号*10660S120336培养单位名称*培养单位代码*培养单位地址邮编贵阳医学院10660贵阳市北京路4号550004学科专业*分析方向*学制*学位授予年*内科学（心血管病）冠心病三年2015年论文提交日期*2015-03-27导师姓名*张陈匀职称*教授评阅人答辩委员会主席*答辩委员会成员吴强教授李洁琪教授文美教授电子版论文提交格式文本（）图像（）视频（）音频（）多媒体（）其它（）推荐格式：application/msword；application/pdf电子版论文出版（发布）者电子版论文出版（发布）地权限声明论文总页数*43页共33项，其中带*为必填数据，为22项。---- -------43----