原核表达双链rna抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究

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缩略词表Amp：ampicillin，氨苄青霉素bp：basepair,碱基对eDNA：complementaryDNA，互补DNACHS：cha．1conesynthase，苯基苯乙烯酮合成酶CMV：Cucumbermosaicvirus，黄瓜花叶病毒CP：coatprotein，外壳蛋白CTAB：Cetyltrimethylammoniubromide，十六烷基三甲基溴化铵DEPC：Diethypyrocarbonate，焦碳酸．-DNA：deoxyribonueleicacid，脱氧核糖核酸dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸dsRNA：double．strandedRNA，双链RNAEDTA：ethylenediaminetetraceticacid，7,--胺四乙酸GUS：Glucoronnidase，葡糖苷酸酶h：hour，小时hpRNA：hairpinRNA，发夹RNAKb：Kilobase，千碱基kD：kilodalton,千道尔顿LB：luria-bertanimedium,LB培养基mRNA：messengerRNA，信使RNAMS：murashigeandskllgmedium，MS培养基nt=nucleotide．核苷酸OR．F：openreadingflames，开放阅读框PB：phosphatebuffer,磷酸缓冲液PBS：phosphate．bufferedsolution，磷酸盐缓冲液PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应PDR：Pathogen．derivedResistance，源于病原物获得的抗性PEG：polyetheleneglycol，聚7,--醇PTGS：post-transcriptionalgenesilencing，转录后基因沉默lIIIIIIII]IDll01111111111)IIIIIIJlJIIIIIilJlIJllJY2588422 RSV：Ricestipevirus,水稻条纹叶枯病毒RBSDV：Riceblack-streakeddwarfvirus，水稻黑条矮缩病毒RISC：RNAinducedsilencingcomplex，RNA诱导的沉默复合体RMVP．：RNAmediatedvirusresistance，RNA介导的病毒抗性RNA：ribonucleicacid，核糖核酸RNAi：RNAinterference，RNA干扰rpm：revolutionsperminute，转／分SDS：sodiumdodecylsulfate，十二烷基硫酸钠siRNA：smallinterferingRNA，小干扰RNATMV：Tobaccomosaicvirus，烟草花叶病毒TRV：Tobaccorattlevirus，烟草脆裂病毒TuMV：Turnipmosaicvirus，芜菁花叶病毒 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯lAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31．1RBSDV和RSV⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．1．1RBSDV和RSV分类和种属形态⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．1．2RBSDV和RSV传毒介体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．1．3RBSDV和RSV发病症状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．1．4RBSDV和RSV基因组的结构与功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．2基因沉默⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．61．2．1转录后基因沉默在生物界的广泛性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．2．2RNA干扰的机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71．2．3RNA介导的病毒抗性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．81．2．4RNA介导病毒抗性的特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．91．2．5原核表达dsRNA抗病毒的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．91．3本研究的目的及其意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1O2材料方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．1．1毒源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．122．1．2供试植物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．122。1．3菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．122．1．4常见缓冲液及培养基的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．122．1．5常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，122．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．2．1原核表达载体构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．2．2dsRNA的优化表达、提取和分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242．2-3dsRNA介导的田间病毒防效鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．2．4供试植株的ELISA检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272．2．5Northern杂交分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．28 2。2。6siRNA的提取和杂交⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯353．1RBSDV和RSV的CP基因dsRNA原核表达载体构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯353．1．1GUS片段PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．353．1．2GUS片段与pGEM载体连接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯353．1．3RBSDV和RSV外壳蛋白基因(CP基因)正向和反向目的片段的获得⋯⋯⋯⋯363．1．4正向目的片段与载体pGEM．GUS连接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯363．1．5反向目的片段与重组中间载体连接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．373．1．6重组表达载体转化大肠杆菌M．JMl09lacY菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．2dsRNA诱导表达条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯393．2．1IPTG浓度对dsRNA诱导表达产量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．393．2．2诱导温度对dsRNA诱导表达产量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯393．2．3诱导时间对dsRNA诱导表达产量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯403．2．4组合诱导条件对dsRNA诱导表达产量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯413．3dsRNA介导的田间病毒防效鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯423．4供试水稻植株的Northernblot杂交分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯494讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯515结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．。67攻读学位期问发表论文情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．68附蜀乏⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯69 山东农业大学硕士学位论文中文摘要水稻是一种重要的粮食作物，水稻的高产稳产对于保障粮食安全有重要的战略意义。水稻黑条矮缩病毒像iceblack-streakeddwarfdisease,RBSDV)和水稻条纹病毒(Ricestripevirus，RSV)是危害水稻的两种主要病毒病害，每年给水稻生产带来巨大经济损失。目前我国水稻病毒病防治主要以化学防治为主。而化学防治又存在诸如农药残留，污染生态环境和诱发传毒介体抗药性等问题。RNA介导的病毒抗性(RNA。mediatedvirusresistance)指依托于基因工程技术，构建包含病毒基因发夹RNA的植物表达载体，转化植物，以抵抗病毒侵染。目前利用该策略已转化获得多种抗病毒转基因植物。RNA介导的病毒抗性具有表型近乎免疫、抗性持久、生物安全性高等特点。尽管如此，由于公众出于对转基因植物生态风险和食品安全性的考虑，抗病毒转基因植物的应用仍然受到极大地限制。用细菌等原核生物表达病毒dsRNA处理植物，通过RNA沉默技术抵御病毒侵染，为我们提供另一条有效途径。本研究选取RBSDV和RSV的外壳蛋白基因(ComProtein，CP)作为靶序列，利用PCR技术分别扩增两个CP基因的中间区域长度为400bp的cDNA片段，分别构建发夹RNA(hpRNA)结构的原核表达载体，转入大肠杆菌M．JMl09lacY菌株中，经IPTG诱导，均可表达400bp的dsRNA。对单一变量温度、IPTG终浓度、诱导时间进行初步筛选，然后优化组合三个变量，进行诱导表达优化实验。结果显示，dsRNA的最适表达条件是在0．4mmol／LIPTG和32℃条件下，诱导3h，dsRNA的相对表达量最大。在病毒传毒介体飞虱迁飞时期即秧田期，用稀释不同倍数的表达载体菌液破碎液喷施水稻幼苗，进行水稻田间病毒防效实验。统计结果显示，喷施终浓度2．4x10。3“∥此pGEM．RBSDVCP400表达载体菌液破碎液的水稻发病率为25．1％，喷施终浓度2．4x10’3岭／此pGEM-RSVCP400dsRNA表达载体菌液破碎液的水稻发病率为11．7％，与同组其他稀释浓度相比发病率最低；而喷施TE缓冲液和水的对照组发病率分别为56．1％和62．8％；表明原核表达双链RNA可以有效地抵抗RBSDV和RSV的侵染。Northernblot检测显示，用原核表达dsRNA处理的水稻植株中，可以分别检测到RBSDV和RSV的siIⅢA，表明抗性是由RNA介导的。关键词：水稻黑条矮缩病毒；水稻条纹病毒；原核表达；双链RNA；RNA沉默 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究ResearchofdsRNAExpressedbyBacteriatoProtectRicefromRBSDVandRSVAbstractRiceisanimportantfeedcropinourdailylives．Socultivatinghealthyriceplayedanimportantroleinthefiledofensuringthesafetyoffoodsecurityproduction．RiceBlack—streakedDwarfandRiceStripeDiseasewhichwereinfectedbyRBSDVandRSVrespectively．ThetwodiseasescauseaseriouslosstoriceproductioninOUrcountry．ChemicalcontrolstillWasprimarycontrolstrategyofriceviraldiseasesinourcountry,butithadmanyproblems，suchaspesticideresidue，environmentalpollutionandaccumulatingresistance．SoexploringanewantivimssystemWasofutmosturgency．ProkaryoticexpressionofdsRNAcallinducepotentandspecificgenesilencing，whichcalledRNAinterference(RNAi)．RNAiisaplantself-resistantreactionandaprocessofsequence-specificgenesilencinginanimalsandplants．PTGSplaysanimportantroleindefensemechanismofplants，anddsRNAhomologoustothesilencedgenes．Sotwohot-spotgenesequencesfromRBSDV(KF576666)andRSV(FM958476)wereselectedandtwohpRNAvectorswereconstructed．Thisworkexplorestheoptimuminductionconditionsforhigh-efficiencyoutputdsRNAandthemosteffectivewayofdeliveringtoOryzasativa．ThispartexperimentWasconductedinvariouscombinationconditionsoftemperatures，IPTGconcentrationandinducingtimes．ThendsRNAWasextractedbythewayofTrizolmethod．ConcentrationofinducingdsRNA(atOD260)wasmeasuredbyultravioletspectrophotometer．ConcentrationofdsRNA=dilutionratio×A260X0．04．TheresultshowedthatdsRNAwiththecondition．32℃、3h、0．4mmoI／LIPTGCallgainhighoutput．Theresultofexperimentinricefieldshowed．TheconderationofpGEM·RSVCP400expressionvectorwas2．4×10。3gg／gLwhichCanagainstRBSDVinfectioninthebestlevel，withthelowestmorbiditybeing25．1％．TheconderationofpGEM-RSVCP400expressionvectorWas2．4x10‘3}tg／lxLwhichCallagainstRSVinfectioninthebestlevel，withthelowestmorbiditybeing11．7％．NorthernblotshowedthattheresistanceWasanRNA-mediatedvirusresistance．OurfindingsindicatethatdsRNAcouldbeaneffectivetoo]thatprotectsOryzasativafromRBSDVandRSVinfections．Keywords：l陋SDV；RSv；BacteriallyExpressed；double-strandRNA；RNAsilencing2 山东农业大学硕士学位论文1刖舌植物病毒种类繁多，传播途径广泛，对各种农作物在产量和品质上造成的损失日趋严重，全球每年因病毒危害造成经济损失高达数百亿元。由植物病毒引起的病害占植物病害的第二位，仅次于真菌性病害。国际病毒分类委员会(InternationalCommitteeononTaxononmyofViruses，ICTV)于2012年发表了最新的病毒分类第九次报告。将目前所承认的2284中病毒和类病毒归入6个目、87个科、19个亚科和349个属。其中植物病毒分为9个科，47个病毒属，729个种。其中DNA病毒只有1个科，5个属；RNA病毒则有8个科，42个病毒属，624种。依据核酸类型可将植物病毒分为五类：(1)双链DNA病毒，包含两个病毒属，31个种；(2)单链DNA病毒，1个科，3个病毒亚科，74个种；(3)双链RNA病毒，两个科，5个病毒属，41个种：(4)负单链RNA病毒，2个科，4个病毒属，25个种；(5)正单链RNA病毒，5个科，33个病毒属，558种。1．1RBSDV和RSV1．1。1RBSDV和RSV分类和种属形态水稻黑条矮缩病毒RBSDV属于斐济病毒属(Fauquetetal，2005)，由日本首次报导，之后研究结果表明该病毒与玉米粗缩病病毒MRDV形态结构相似并且二者有很高的同源性(AzuhataFetal，1993；JoelDAetal，2002)。最近研究发现，依据病毒的粒子形态，生物学特性以及氨基酸序列的同源性，发现我国玉米粗缩病的病原为RBSDV(Fang等，2001)。RBSDV病毒粒子为球状正二十面体结构或等轴病毒，直径约为75nm，在外壳表面有12个突起，长宽均约IIlII／l；核心粒子直接大约50Illll，表面也有12个突起，长约8nln，宽12nnl(Hattaetal，1977：Milneetal，1973)。水稻条纹病毒RSV属于纤细病毒属Tenuivirus，归入无包膜的单链RNA病毒中(Murph等，1995)。根据寄主范围、传毒介体、RNA组分数目及大小、相应基因编码蛋白的氨基酸序列和相应基因间隔区的相似性，将原属于纤细病毒组的水稻条纹病毒(Ricestripevirus，RSV)、玉米条纹病毒(Maizestripevirus，MSpV)、水稻白叶病毒(Ricehojablancavirus，RHBV)、稗草白叶病毒(Echinochloahojablancavirus，EHBV)、尾稃草白叶病毒(Urochloahojablancevirus，UHBV)、水稻草矮病毒(Ricegrassystuntvirus，GRSV)明确归入纤细病毒属(VanRegenmorteletal，2000)。RSV是第一个报道的具有 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究双义编码策略的植物病毒(刘丽华等，2000)。早期研究发现表明，水稻条纹病毒RSV是直径3011111的球状病毒(K．isoetal，1974)。但是在以后的研究中证实水稻条纹病毒(RSV)并非直径30nln的球状病毒而是直径约为3～8nlTl的分枝丝状体(Yamashitaetal，1985)。在对灰飞虱进行水稻条纹病毒RSV注射后，结果发现注射病毒后的灰飞虱体内保持了感染性(Koganezawaetal，1975)。并且在灰飞虱体内发现了有类似砂状的内含体(谢联辉等，1991)，而且经过电镜观察发现RSV病毒粒体为完整的丝状粒体。进一步的病毒粒体超微结构研究中则发现，RSV的病毒粒体是直径3nln而长度不等的丝状体(林含新等，1999)。1．1．2RBSDV和RSV传毒介体水稻黑条矮缩病毒RBSDV以灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)为主要传毒介体，介体在染毒后终身带毒，但是不会经过卵传毒，白脊飞虱(Unkanodessapporonus)和白条飞虱(Chilodephaxalbifacia)也能传毒，但传毒效率较低。褐飞虱(Nilaparvatalugens)不能传毒。研究发现，随白背飞虱虫龄的不断增大，其获毒时间则相应缩短，其中，长翅型成虫和短翅型成虫的最短获毒时间仅为2min，最长获毒时间为8min，对三叶一心稻苗的最短接毒时间分别为5min和6min，最长接毒时间分别为10min和11min。曹杨等人同时发现，白背飞虱获毒后可终身传毒，但不能经卵传毒，单虫一生当中最多可传毒株数为87株，平均每头一生可传毒48．34-0．8株。可见，白背飞虱对水稻黑条矮缩病具有较强的获毒和传毒能力(曹杨等，2011)。水稻条纹病毒RSV主要是由灰飞虱(LaodelphaxstriatellusFallen)持久性经卵传播RSV引起的，灰飞虱一经获毒便可终生传毒，灰飞虱雌雄个体成虫和若虫均可带毒，但是雌虫传毒效率比雄虫高(Shinkaietal，1985；Toriyamaetal，1983；Gingeryetal，1988)。灰飞虱最短获毒时间为10～15min，饲毒48h的灰飞虱获毒率最高，带毒虫刺食健株10rain即可达10％的传毒率，病毒在介体内的循回期为3～30d(林奇英等，1991)。介体获毒后传毒能力逐渐下降，即使灰飞虱不能直接传毒给寄主植株仍可将病毒经卵传播给后代，后代带毒率约为75％100％(Shinkaietal，1962)。1．1．3RBSDV和RSV发病症状水稻黑条矮缩病在水稻整个生长期都会发生，在水稻幼苗期发病，发病心叶顶端螺旋状卷曲。秧田期，感病秧苗叶片僵硬直立，叶色墨绿，根系短而少，生长发育停滞。分蘖期表现明显矮缩，叶片短，叶色深绿，叶脉茎秆呈现蜡白色，轻病株可抽穗，茎基4 山东农业大学硕士学位论文部在节间有明显的蜡白色隆起。但在不能抽穗的重病株，没有发现这种典型症状(阮义理等，1984；李湘明等，2008)。水稻拔节时期，感病植株严重矮缩，高位分蘖、茎节倒生有不定根，茎秆基部表面有纵向瘤状乳白色凸起。水稻条纹病毒引起的水稻条纹叶枯病多在苗期发病，叶片上出现褪绿黄斑，随发病时间增长黄白斑面积增大成为与叶脉平行的条纹。之后叶片会出现黄白，下垂，呈枯心状，老叶不显病。不同品种的水稻发病病症不同，籼稻品种不出现枯心状，糯稻品种则有半数会表现枯心状。病株常畸形不实。拔节后发病在剑叶下部出现黄绿色条纹，但抽穗畸形，所以结实很少。1．1．4RBSDV和RSV基因组的结构与功能RBSDV基因组由10条dsRNA片段组成，依照其在变性凝胶上的迁移距离大d,J10ji序依次命名为S1．SIO(Azuhataetal，1993)。每条dsRNA基因组的正链5’端带帽子结构，3’端无poly(A)，也没用类似tRNA的结构。研究人员以浙江分离物为材料首次完成了RBSDVl0条基因组的全基因组测定(Zhangetal，2001)。研究结果表明RBSDV的基因组是当前呼肠孤病毒科中最大的基因组，全长2914nt。在该病毒基因组中至少含有13个开放阅读框(OI江)，除S5、S7、S9含有两个ORF外，其余7条基因片段只含有一个ORF。RSV基因组有4条单链RNA组成，依据分子大小分别名为为RNAl．RNA4。其中，RNAl为负链编码策略，编码依靠RNA的RNA聚合酶(RNA—dependentRNApolymerase，IⅪRp)，RNA2、3、4都采取双义(ambisense)编码策略，即在RNA的毒义链(virussenseRNA，vRNA)和毒义互补链(viruscomplementaryRNA，vcRNA)上各有一个开放阅读框(openreadingflames，ORF)，均可以编码蛋白质(Kakutanietal，1990，1991；Takahashietal，1993；Zhuetal，1991，1992：Toriyamaetal，1994(图1．1)。基因组高度保守的末端序列可以相互配对，以形成锅柄panhnadle)结构；RNA聚合酶的识别位点位于锅柄结构的互补区域上(Takahashietal，1990)。 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究RSVRNA1(Tenuivirus)Pol336．8kRNA222．8k94kRNA323．9k35．1kRNA420．5k32．4k口口口__口◆+◆+◆+NS2NSvc2NS3CPSPNSvc4图1．1．RSV基因组结构(引自Morozovetal，1999)箭头：编码基因从N-C的方向，黑色图表示已确定功能的基因片段Fig．1．1．GenomeorganizationofRSV(ReferencedfromMorozovetal，1999)Arrow：thedirectionfromN．-toC··terminioftheencodedgenes,theblackindicatesthegenefragmenthavingcertainfunction．1．2基因沉默基因沉默(genesilencing)是指当外源基因导入生物体内时，目的基因和内源基因表达被特异性抑制的基因调控现象(Brendaetal，2000)。基因沉默对其他基因表达不会产生影响。基因沉默依据基因沉默发生的时期分为转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默。启动子失活阻碍mRNA的合成进而引起基因沉默是转录水平的基因沉默。而转录后水平的基因沉默则是mRNA的合成没有受启动子阻碍，但是mRNA被降解而不能存留(kooteretal，1999)。mRNA在PTGS启动细胞内的RNA降解机制作用下被特异地降解，其包括反义RNA，共抑制(co．suppression)、RNA干扰(RNAinterference，RNAi)、基因压抑(quelling)和翻译抑制等。在自然界各种生物中都存在转录后的基因沉默现象，主要表现为通过抑制外源基因表达防止病毒侵染，并且维持生物基因组的稳定性。目前，转录后的基因沉默获得人们的广泛关注，成为分子生物学领域的热点之～(Cogonietal，2000)。 山东农业大学硕士学位论文1．2．1转录后基因沉默在生物界的广泛性最早研究发现的转录后基因沉默被称为共抑制(co．suppression)。美国RichardJorgensenb趼究小组(Napolietal，1990；VanderKroletal，1990)在80年代末期对矮牵牛的研究中首次发现转基因沉默现象，他们向植株中转入查儿酮合酶(ChalconeSynthase，CHS)以求获得花色更深的矮牵牛植株，想以此实现花色的加深。但是花色并没有因此加深，反而还有很多花由原来的紫色变成了杂色甚至白色，他们将这种转基因的表达被抑制，内源同源基因的表达也受到了抑制的现象称为共抑制。在之后的研究中研究人员发现这种共抑制现象存在于多种植物中如：矮牵牛、烟草、拟南芥、番茄、马铃薯和水稻等(Dalmayetal，2000；Doughertyetal，1995)。因此共抑制是指内源基因在转基因或病毒感染的诱导下发生的基因沉默现象(PTGS)。研究表明：共抑制现象还受周围环境条件的影响，如烟草几丁质酶基因的沉默受早期的转基因植株的培养条件影响(Hartetal，1992)。PTGS是指被抑制的基因可以正常转录，但转录后的mRNA产物会被迅速的降解掉而无法累积和发挥功能，所以属于转录后水平的基因沉默机制。CO．suppression、PTGS、quelling和RNAi均会导致靶基因mRNA的降解，因此将其统称为RNA沉默(RNAsilencing)，并且都属于转录后水平的基因沉默。1．2．2RNA干扰的机理RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指当将同源dsRNA分子导入动物细胞后能诱导发生的序列特异性转录后的基因沉默。该现象是在利用反义RNA抑制线虫(Caenorhabditiselegans)基因表达时发现的(Fireetal，1998)。通过向线虫生殖腺等部位注射dsRNA、dsRNA浸泡或饲喂表达特定基因有义、反义链的大肠杆菌，其子代都能表现针对干扰基因的沉默。典型的RNAi途径包括起始、效应和信号扩增3个阶段，具体过程为：由Dicer酶(壬斟嬲eIII家族)将dsRNA切割成21～25nt的siRNA(smallinterferenceI矾A)：这些siRNAs与RNA沉默复合物结合并指导目标mRNA的降解；在RDR酶(RNAdependentRNApolymerase)的作用下，以RNA为模板，合成dsRNA，并被DCL切割为次级siRNA，产生新一轮的RNAi效应。 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究井潭教麓RNA病毒双髓RN^l111值鼹链RNA／,舅bI#NIURNAl。。．f??眦脚HAIDi。er●一祷I啦登E艟台．siRNAMEe．i；P看此日‰讯N^量自复合伟，R巧cI◆fFr尊一尊了rrmRNAj一硼、警。．惫孵鄹f警眦台一龇№l州^岬渭吼啊图1．2．RNAi的作用机制(引自Biomics)Fig．1-2．ThemechanismofRNAi1．2．3RNA介导的病毒抗性利用DNA重组技术，构建病毒基因发夹结构RNA(hairpinRNA)(转录后均形成dsRNA)的植物表达载体，转化植物，获取抗病毒转基因植物是基因工程控制植物病毒病害的最有效策略。这一策略通常称为RNA介导的病毒抗性(RNA．mediatedvirusresistance)。利用该策略已获得了多种抗病毒转基因植物(Waterhouseetal，1998；Smithetal，2000；Wangetal，2005；朱俊华，2004；竺晓平，2006；李鹏，2007)。RNA介导的病毒抗性具有近乎免疫和抗性持久的特点，并且功能病毒基因或蛋白并非插入到植株基因组中，所以mRNA在植株中不会积累，因此则不会出现互补、异源包壳、协生和重组的风险，生物安全性比常规转基因植株高(Prinsetal，1995)。目前抗病毒转基因植物的应用推广由于受到公众的质疑而被制约，公众对于转基因的安全性和生态风险的考虑是制约转基因发展的重要因素。Tenlloda等(2003)建立的原核表达dsRNA体系为我们提供了一条新的研究路线。Tenlloda等依靠自然突变的实验策略得到大肠杆菌缺失RnaseIII的突变体“HTll5”。细菌中大部分dsRNA能被RnaseIII降解，因此依靠大肠杆菌缺失RnaseIII菌株可以产生大量dsRNA。基于此研究结果，Tenlloda等选取辣椒轻斑驳病毒PMMoV54kD区域构建原核表达载体，转入大肠杆菌HTll5菌株中获得病毒dsRNA，之后的病毒侵染实验结果表明，细菌产生的dsRNA可以对PMMoV侵染产生防效。而混合接种PMMoV和dsRNA提取物的烟草在接种后整个生长周期内均无发 山东农业大学硕士学位论文病症状出现，也没有病毒积累。而dsRNA提取物喷施到植物叶片后，对喷施的植物叶片接毒PMMoV，发现该植物对PMMoV病毒仍具有免疫作用。1．2．4RNA介导病毒抗性的特点研究结果表明，转基因植物对病毒的抗性与转基因在植物内病毒转基因蛋白质的积累量之间不存在正相关(Golemboskietal，1990；Kawchuketal，1991；Lawsonetal，1990；VanderWilketal，1991)。RNA介导的病毒抗性和蛋白质介导的病毒抗性存在显著差异：(1)RNA介导的病毒抗性与接种物的剂量不存在关系，近乎于免疫，但是蛋白质介导的抗性表现型与病毒浓度呈正相关。(2)接种物性质会对蛋白质介导的抗性产生影响。(3)RNA积累水平和抵抗性水平之间并无直接联系，抗性水平与细胞内RNA含量存在负相关(Smithetal，1994；Swaneyetal，1995)。在RNA介导的抗性中，转基因可以高水平转录，却没有大量稳定的RNA积累(Smithetal，1994；Swaneyeta，1995；郭兴启等，2001；朱俊华等，2004；白庆荣等，2005；迟胜起等，2005；竺晓平等，2006；李鹏等，2007)。(4)与转基因获得抗病毒植物相比，用细菌表达的dsRNA沉默病毒基因的表达，具有更高的生物安全性，且避开了转基因工作量大、周期长、费时费力等问题；并能以一种简单方式投递多种病原dsRNA，同时防治多种病毒(温孚江等，2001)。1．2．5原核表达dsRNA抗病毒的研究通过特定细菌株表达目的基因dsRNA，达到阻抑目的基因表达，产生RNAi效应的方法，最早是由Timmons和Fire等(1998)在线虫中开创使用的。随后，相关实验方法进一步得到优化，Timmons等(2001)从多个大肠杆菌菌株筛选到了具有高dsRNA表达效率的RNaseA缺陷型菌株HTll5。此后，这一策略逐渐在多个物种中广泛应用(Newmarketal，2003；Solisetal，2009)。利用该策略已获得了多种抗病毒转基因植物(李鹏等，2007；朱俊华等，2004；竺晓平等，2006；Waterhouseetal，1998：Smithetal，2000；Wang等，2005)。RNA介导的病毒抗性表型近乎免疫、抗性持久，且由于在转基因植株中不存在有功能的病毒基因或蛋白，也不存在转基因的mRNA的积累，因而不存在发生互补、异源包壳、协生和重组的风险，具有较高的生物安全性(Primetal，1995)。研究人员发现(Tenlladoeta1．，2003，2004)，将甘蔗花叶病毒(Sugarcanemosaicvirus，SCMV)的衣壳蛋白CP基因片段构建进入L4440载体，导入细菌HTl15，诱导dsRNA表达，向玉米喷施细菌RNA粗提物，发现表达的dsRNA的粗提物可以抑制SCMV的侵染，且来自上游区域(CPl)的dsRNA比来自于下游区域(CP2)的dsRNA 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究抑制效果更好(Ganetal，2010)。而尹国华等(2009)利用Red重组系统，敲除了大肠杆菌的l"nc基因，获得了RNaselII缺失菌株，构建了dsRNA高效表达系统；进而，构建了包含TMV的CP基因、NIb基因、运动蛋白(MP)基因和PVY的蚜虫辅助蛋白(HC．Pro)基因、NIb基因、CP基因，以及PVY的NIb基因的5端、中间、3端eDNA区段的dsRNA表达载体。用表达的dsRNA和病毒处理烟草，结果显示，表达的各功能基因及功能基因不同位置的dsRNA均可介导对病毒的抗性(Ⅵn等，2009；Sun等，2010a；Sun等，2010b)，张德咏等(2008)也开展了表达dsRNA的细菌提取液抑制黄瓜花叶病毒对烟草的侵染的研究。与通过常规转基因技术获得抗病毒植物相比，通过dsRNA沉默病毒基因的表达，虽然在抗性持续性上不能与常规转基因技术获得的植株相比，但是细菌表达的dsRNA技术则有更高的食品安全性和生态安全性。与常规转基因技术的实验方法相比，原核表达dsRNA技术工作量小，周期短，实验方法简单，并且可以针对多种病毒投递不同的dsRNA进行防治，可同时对多种病毒进行防治。因此更容易得到生产运用和推广(Tenlladoetal，2003：Tenlladoetal，2004；Zhangetal，2008；Y'metal，2009；Sunetal，2009；Ganetal，2010；Sunetal，2010)。1．3本研究的目的及其意义水稻是我国最重要的粮食作物之一，年播种面积约3000多万公顷，约占粮食播种面积的28％，产量约占粮食总产量的40％。水稻黑条矮缩病和水稻条纹叶枯病在我国从南至北都有发生，是我国水稻上分布最广的两种病毒病。病害的流行和发生常常给水稻生产造成重大损失。当前病毒病主要防治策略是使用化学农药进行防治，但是由于化学农药的大量使用，造成水稻中农药残留增加，病害的抗药性增强，严重违背当前食品安全的要求，影响农业的良性发展，危害人类健康、破坏生态平衡。当务之急是寻求一条安全有效并且具有更高生物安全性的抗病毒基因工程新策略。与通过转基因的途径产生dsRNA培育抗病毒转基因植物相比，通过原核表达dsRNA分子抗病毒的研究策略具有明显的优势。细菌表达的dsRNA技术与传统转基因技术相比具有更高的食品安全性和生态安全性。而且原核表达dsRNA技术工作量小，周期短，实验方法简单，并且可以针对多种病毒投递不同的dsRNA进行防治，可同时对多种病毒进行防治。并且，由于dsRNA在体外具有高稳定性，这为原核表达dsRNA 山东农业大学硕士学位论文在田间运用提供了必要的技术支持。因此更容易得到生产运用和推广。本研究以水稻上的危害严重的水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus,RBSDV)和水稻条纹病毒(Ricestripevirus，RSV)为实验材料，RT-PCR克隆各病毒的外壳蛋白(Coatprotein，CP)基因，构建hpRNA结构的原核表达载体，利用细菌表达dsRNA，探讨不同诱导条件对dsRNA相对表达量的影响；继而开展dsRNA田间防治RBSDV和RSV的实验，研究施用浓度对防效的影响，探讨原核表达dsRNA防治水稻病毒病的可行性。 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究2材料方法2．1材料2．1．1毒源RSVCP基I因(FM958476)和RBSDVCP基因(KF576666)由山东农业大学作物生物学国家重点实验室植物抗病基因工程研究室克隆。2．1．2供试植物紫香糯水稻2．1．3菌株菌株：大肠杆菌(Escherzchiacoli)DH5a菌株和大肠杆菌M．JMl091acY(DE3)菌株(RNaseIII缺失体)由本实验室保存。2．1．4常见缓冲液及培养基的配制见附录12．1．5常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器见附录212 山东农业大学硕士学位论文2．2方法2．2．1原核表达载体构建2．2．1．1PCR扩增特异性引物表2．1引物设计Table．2-1Primersforgeneamplification2．2．1．2原核表达载体的构建策略原核表达载体的构建策略见图2．1： 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究EcoRI毯∞lU图2·1表达载体构建策略Fig．2-1swageofexpressionvectorsTheconstructionprocessincludedPCRamplification，transformation，post-transcription．pBll21vectorwasusedasatemplateforamplifyinga120bpglucuronidasegene，Ampg．pGEM．CP400vector，oneT7promoter,inverted-repeatpartofcDNAsequence．2．2．1．3pGEM．GUS的构建过程：以质粒pBll21为模板，用引物GUS．5(带EcoRI酶切位点)和GUS．3(带nfI酶切位点)扩增120bp葡萄糖苷酸酶基因部分序列(作为发夹结构的“环”)，1％琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物后切胶回收目的条带。用EcoRI和脚fI两种限制性内切酶对回收的PCR产物和载体pGEM进行酶切，用PCR纯化试剂盒回收酶切后的PCR片段和载体片段，T4连接酶连接回收产物，连接120bp葡萄糖苷酸酶基因的载体pGEM．GUS构建完成。14 山东农业大学硕士学位论文EcoRI和风fI双酶切体系(80laL)"PCR片段风fIEcoRI10xH双蒸水50肛L2／．tL2p,L8“L18此质粒载体PstlEcoRIlO×H双蒸水15此21．tL2gL8“L53“L2．2．1．4pGEM．RBSDVCP400的构建过程：以RBSDV全长CP基因为模板，用引物RBl．5(带ApaI酶切位点)和RBl．3(带EcoRI酶切位点)扩增RBSDVC『尸基因中间区域、长度为400bp的eDNA片段，1％的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收。用ApaI和EcoRI两种限制性内切酶，对回收的PCR产物和载体pGEM．GUS进行酶切，PCR纯化试剂盒回收酶切后的PCR片段和载体片段，T4连接酶连接回收产物后表达载体的正向片段构建完成。ApaI和EcoRI双酶切体系(80laL)：PCR片段ApaIEcoRI10xH双蒸水50pL21．tL2pL8肛L18肛L质粒载体ApaIEcoRI10×H15“L2I,tL2I．tL8I．tL 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究双蒸水53此以RBSDV全长CP基因为模板，用引物RB2．5(带ArI酶切位点)和RB2．3(带SaII酶切位点)扩增RBSDVCP基因中间区域、长度为400bp的cDNA片段，1％的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收。用SalI和PstI两种限制性内切酶，对回收的PCR产物和载体片段进行酶切，PCR纯化试剂盒回收酶切后的PCR片段和载体片段，T4连接酶连接回收产物后表达载体pGEM．RBSDVCP400构建完成。风fI和SalI双酶切体系(80此)：PCR片段nfISalI10xH双蒸水50pL2gL2laL8p,L181．tL质粒载体PstlSalI10×H双蒸水15此2I．tL2laL8pL53此2．2．1．4pGEM．RSVCP400的构建过程：以RSV全长CP基因为模板，用引物RCl．5(带ApaI酶切位点)和RCl．3(带髓根I酶切位点)扩增RSV凹基因中间区域、长度为400bp的cDNA片段，1％的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收。用么阳I和EcoRI两种限制性内切酶，对回收的PCR产物和载体pGEM．GUS进行酶切，PCR纯化试剂盒回收酶切后的PCR片段和载体片段，T4连接酶连接回收产物后表达载体的正向片段构建完成。ApaI和助DRI双酶切体系(80“L)：PCR片段ApaIEcoRI10xH50pL2p,L21．tL81．tL16 山东农业大学硕士学位论文双蒸水18此质粒载体ApaIEcoRI10×H双蒸水15“L2此2“L8此53肛L以RSV全长CP基因为模板，用引物RC2．5(带nfI酶切位点)和RC2．3(带SalI酶切位点)扩增RSVCP基因中间区域、长度为400bp的cDNA片段，1％的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收。用SalI和nfI两种限制性内切酶，对回收的PCR产物和载体片段进行酶切，PCR纯化试剂盒回收酶切后的PCR片段和载体片段，T4连接酶连接回收产物后表达载体pGEM．RSVCP400构建完成。nfI和SalI双酶切体系(80“L)：PCR片段nfI．鼬，I10xH双蒸水50此2“L8“L18此质粒载体nrISalI10xH双蒸水15儿2pL2此8uL53止2．2．1．5目的片段PCR扩增(1)向容量为0．2mL的EppendorfPCR专用管中，依次加入如下试剂： 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究PCR上游引物(50mmol／pL)PCR下游引物(50mmoUpL)10mmol／LdNTP混合液10×TaqPCRBufferTaqDNApolymerase(5U／I_tL)模板DNA加双蒸水至总体积为2pL2“L4lxL5pL0．5“L2此50“L(2)将加入试剂的PCR管放入PCR仪器中。设置反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性40S，56℃退火40S，72℃延伸1min，循环35次后，72℃延伸10min。(3)PCR扩增反应结束后，从反应后的PCR管中取2此，进行1％琼脂糖凝胶中电泳检测扩增效果。(4)PCR产物纯化：将等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)和氯仿：异戊醇(24：1)加入PCR产物管中进行抽提。小心吸取上层清液，转移到新的离心管中并加入1／10的3mol／L的NaAc和2倍体积的无水乙醇，．20℃条件下过夜沉淀。然后取出离心管离心，12000rpm，10min离心，70％乙醇洗两次，最后加入50pLddHzO回溶。2．2．1．6目的片段和质粒的酶切和回收37℃金属浴酶切4h后1％琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物(普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒)。酶切反应体系如下：PCR片段AfI勋，I10xH双蒸水总体积50肛L2“L8肛L18肛L80“L质粒载体AfISalI10xH15弘L2pL2儿8止 山东农业大学硕士学位论文双蒸水总体积53此80pL(1)酶切产物和10Xloadingbuffer充分混匀，1％的琼脂糖凝胶电泳检测。(2)柱平衡步骤：将500止平衡液BL加入到吸附柱，吸附柱放入1．5mL离心管中，将离心管放到离心机中，转速12000rpm离心1min取出离心管倒掉管中废液，之后将吸附柱放回离心管中。(3)1％琼脂糖凝胶电泳后取出胶块置于紫外灯下，切下所需目的DNA条带，切胶过程中尽量切除多余胶，将切下胶块放入离心管中并称取重量。(4)加入3体积的溶胶液PN有胶块的离心管中进行溶胶(如凝胶重为0．1g，其体积可视为100p．L，依次类推)。将离心管放到50℃水浴锅中，水浴10min，水浴期间翻转离心管以保证胶块溶胶。若胶块未完全溶解，则继续放置几分钟或者补加溶胶液继续水浴至胶块溶解。(5)将溶胶所得溶液加入平衡后的吸附柱CA2中，吸附柱放入1．5mL离心管中，室温放置2min，将离心管放到离心机中，转速12000rpm离心1min取出离心管倒掉管中废液，之后将吸附柱放回离心管中。(6)向吸附柱中加入700p．L漂洗液PW，吸附柱放入1．5mL离心管中，将离心管放到离心机中，转速12000rpm离心1min取出离心管倒掉管中废液，之后将吸附柱放回离心管中。(7)向吸附柱中加入700}xL漂洗液PW，吸附柱放入1．5mL离心管中，将离心管放到离心机中，转速12000rpm离心1min取出离心管倒掉管中废液，之后将吸附柱放回离心管中。(8)将吸附柱重新放回收集管中，放到离心机中，转速12000rpm离心1min，尽可能除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟。彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。(9)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB(Elutionbuffer，通常用30～50IlL)或去离子水(如果回收的目的片段大于10kb，则洗脱缓冲液EB应置于65～70℃水浴预热)，室温放置1~2min，12000rpm离心2min洗脱DNA，．20℃保存备用。2．2．1．7目的片段与质粒DNA的连接(1)用移液器向无菌1．5mL离心管中依次加入以下成分： 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究扩增目的片段质粒DNA10x连接缓冲液T4DNA连接酶加双蒸水至总体积为5gL(约10腭)1此(约3lxg)2lxL1止20此(2)用手指轻弹封闭离心管数次，然后放入离心机中离心5S收集溶液。(3)将短暂离心后的离心管放入16℃水浴锅中过夜进行连接反应。并将连接产物用于下一步的转化反应。2．2．1．8感受态细胞的制备(1)在LB培养基平板上活化的E．coli菌落(大肠杆菌M．JMl09lacY)，然后挑取菌落，并将挑取的菌落接种到10mLLB液体培养基中，放到培养箱中，温度37℃，转速220～250rpm，进行培养过夜。(2)取培养过夜的菌液1mL接种到100mLLB(含相应抗生素)液体培养基中，放入培养箱中37℃振荡培养220-250rpm至对数生长期(OD600--0．4～1．0)。(3)培养物置于冰水混合物中冰浴10min。(4)将培养物转移至50mL离心管，将离心管放到冷冻离心机中，温度4℃，转速6000rpm离心5min。(5)取出离心管，小心吸出离心管中多的上清液，然后重悬菌体于20mL冷的0．1mol／LMgCl2由(6)之后将离心管再次放到冷冻离心机中，温度4℃，转速6000rpm离心5min。(7)取出离心管，小心吸出离心管中多的上清液，然后重悬菌体于20mL冷的0．1mol／LMgCl2中，冰浴20rai’n，之后将离心管再次放到冷冻离心机中，温度4℃，转速6000rpm离心5min。(8)小心吸出离心管中多的上清液，然后重悬菌体于10mL冷的O．1mol／LMgCl2中，加入终浓度为15％的甘油，轻轻旋转混匀，冰浴10rain以上。(9)分装细菌悬浮液，装入1．5mL离心管中，每管100此，立即置于．80℃冰箱保存备用。2．2．1．9质粒DNA向大肠杆菌中转化(热激法)(1)取出．80℃保存有大肠杆菌E．coli感受态细胞100gL的离心管，在冰上解冻20 一山东农业大学硕士学位论文后迅速加入T4连接产物20pL，充分混合。(2)将感受态与连接产物的混合物放置冰上30rain后，水浴2～3min，取出后放置冰上2min。(3)往混合物中加入1mL无抗生素的LB液体培养基，培养1~2h。之后放入42℃水浴锅中放置于摇床上37℃振荡(4)将培养产物放到离心机中，转速6000rpm，离心2min。(5)小心吸出离心后的上清液，用100皿LB培养液重新悬浮沉淀。(6)将重悬后的菌液均匀涂在LB固体培养基上(每100mL培养基加200pLmp)，之后放置于摇床上37℃过夜培养至长出单菌落。(7)用灭菌20此枪头在LB固体培养基挑取单菌落，之后将挑取的单菌落放到LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养3~4h，然后取培养后菌液进行PCR鉴定。(8)培养好的菌液，加入50％无菌甘油分装后-80℃保存。2．2．1．10质粒向大肠杆菌中的转化(电击法)(1)将0．2cm电击杯放置于冰上预冷，然后将1gL质粒与感受态细胞的混合物加入电击杯中混匀。(2)启动电转仪，调节至Manual，电压设置为2．3KV，之后将电击杯放入电转仪中，启动pulse键，在听到蜂鸣声后，将1mLSOC液体培养基立即加到电击杯中，重悬细胞后，加入到1．5mL的离心管中。(3)将离心管放到摇床上，温度设置37℃，转速220-250rpm进行培养1h。(4)将培养后的离心管放到离心机中离心，转速6000rpm，离心5mill，收集离心后的菌体，重悬菌体，将重悬后的100止菌液均匀涂在SOC固体培养基上(37℃预热)，之后37℃培养过夜。2．2．1．11转化菌落PCR鉴定挑取转化单菌落，悬浮于1mL液体LB中，37℃震荡培养3h，取3止作为PCR反应模板。反应完毕后取5此PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。21 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究PCR上游引物(50pmol／gL)PCR下游引物(50pmol／gL)10mmol／LdNTP混合液10xTaqPCRBufferZaqDNApolymerase(5U／gL)模板DNA加双蒸水至总体积为0．5gL0．5止2此2．5此0．5此2“L25“L2．2．1．12质粒DNA的大量提取(碱性SDS法)(1)在LB液体培养基中繁殖转入质粒的大肠杆菌，繁殖16～20h。(2)在TB培养基中繁殖大肠杆菌(含相应抗生素)，将5mL菌液接种到100mLTB培养基中。使用250mL三角瓶培养菌液，将三角瓶放置于摇床上，温度37℃，250rpm振荡培养20h(对数晚期即OD600=0．6)。(3)将培养后的菌体重悬也移到50mL离心管中，离心管放到冷冻离心机中4℃，转速6000rpm离心10rain，倒掉上清液。(4)菌块回溶与“l号溶液”(2．25mL／管)中，在菌块完全溶解后合管。(5)将O．5mL的10mg／mL溶菌酶加到l号溶液中，放置于室温下静置10min。(6)将所得溶液与10mL预冷的2号溶液混合，放置于室温下静置10min。(7)将5mL预冷的“3号溶液”加到管中，充分混匀至不再出现两个液相，置于冰水混合物中放置10min，充分摇动混匀。(8)将所得容易于冷冻离心机中4℃下转速11000rpm，15min。重复离心至染色体DNA完全沉淀，清除大分子DNA沉淀。(9)取上清液，依据所取体积加入0．6倍体积的异丙醇，充分混匀，放置于室温下静置10rain。(10)将所得上清液混合物放入离心机中，1000rpm每分钟，离心5min，(避免4"C离心防止盐沉淀)。70％乙醇清洗沉淀两次，干燥离心管。(11)在TE缓冲液中回溶DNA(每500mL菌液提取物加3mL)，混合物静置于室温下30rain。(12)往30mL离心管中加入溶解提取物，取等体积的5mol／LLiCl加入离心管中，充分混合后放置于冰水混合物中2～5min。之后将离心管放到离心机中4℃，10000rpm 山东农业大学硕士学位论文离心10min以沉淀大分子RNA。(13)于新的50mL离心管中加入上清液，并将等体积的异丙醇加入混合，充分混匀后室温下沉淀10min。之后放入离心机中10000rpm离心10min。(14)倒掉上清液并将离心管倒置出去残留上清液。室温下70％乙醇洗涤两次，干燥离心管5min蒸发乙醇。(15)加入500此的TE缓冲液溶解沉淀后加入20J-tg／mL的RNAaseA，将混合液加到1．5mL的离心管中于室温下放置30min。(16)对所得混合液进行抽提，取同体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)(4℃保存)抽提1次，小心吸取上清液用同体积的氯仿：异戊醇(24：1)再次抽提。(17)小心吸出上层液体，加到1．5mL离心管中，将1／10体积3mo儿NaAC和2倍体积(约1mL)的无水乙醇加到离心管中，室温下静置2h。(18)于室温下离心，转速12000rpm，离心10min，倒置离心管使乙醇蒸发。(19)取150p．LTE缓冲液溶解所得沉淀，紫外分光光度计测量样品OD260值，计算质粒DNA的浓度(10D260=50“g质粒DNA／mL)，．20℃保存。注：提取所需的实验用品均需灭菌，第一、二步要求无菌操作。2．2．1．13质粒的提取(TIANprepMiniPlasmidKit质粒小提试剂盒)(1)柱平衡步骤：将500此平衡液BL加入到吸附柱，吸附柱放入1．5mL离心管中，将离心管放到离心机中，转速12000rpm离心1min取出离心管倒掉管中废液，之后将吸附柱放回离心管中(2)将5mL培养过夜的茵液加到离心管中，放入离心机中进行离心，转速12000rpm离心1min，取出去除上层清液，若菌液较多可分管离心多次后合管收集到一个离心管中。(3)将250止溶液P1(使用前已加入RNaseA)加入到有菌体沉淀的离心管中，振荡或用移液枪吸打重悬菌体沉淀。(4)将2501．tL溶液P2加入离心管中，翻转几次确保菌体裂解。待菌液变为清凉喉停止，整个过程不超过5min。防治质粒被破坏。(5)将350lzL溶液P3加入到离心管中，翻转几次充分混匀待有白色絮状沉淀出现。随后进行离心，转速12000rpm离心10rain。离心后离心管底部会出现沉淀。(6)将所得上清液转移到吸附柱CP3中。然后放入离心机中进行离心，12000rpm 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究转速离心30～60S，倒掉管中废液并将吸附柱重新放回离心管中。(7)向吸附柱CP3中加入600此漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，然后将吸附柱CP3放入收集管中。(8)将600此漂洗液PW加到吸附柱CP3中，放入离心机中离心，转速12000rpm离心60S，倒掉废液。(9)将吸附柱CP3重新放入收集管中，放入离心中转速12000rpm离心2min以去除残留漂洗液。为避免乙醇的影响，将吸附柱CP3打开盖子置于室温放置以去除漂洗液。(10)另取一干净的离心管放置吸附柱CP3，滴加50～100pL缓冲液EB到吸附柱的膜上，室温条件下静置2min，放入离心机中离心，转速12000rpm离心1min，收集溶液与离心管中。2．2．1．14重组质粒的酶切鉴定将菌液PCR鉴定为阳性的重组菌落提取其质粒，取适量质粒，在37℃下，酶切4h。反应体系如下：质粒DNA酶1酶210×Buffer加双蒸水至总体积为8IxL2pL2pL4此40此上述物质混合后，37℃酶切反应4h，1．5％琼脂糖凝胶电泳，以鉴定酶切片段的大小及酶切是否完全。2．2．2dsRNA的优化表达、提取和分析2．2．2．1IPTG浓度对dsRNA表达量的影响取12mL过夜培养的新鲜菌液分别加4瓶到含四环素(终浓度为12．5斗g／mL)和氨苄青霉素(终浓度为50I．tg／mL)的200mLLB液体培养基中，每瓶200mLLB液体培养基加入3mL菌液，培养2h。分别加入IPTG至终浓度O．2mmol／L，0．3mmol／L，0．4mmol／L，0．5mmol／L。继续诱导37℃，3h诱导后用Trizol法提取dsRNA。将所提取的dsRNA用RNaseA和DNaseI消化，1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外分光光度计测定dsRNA在OD260时的浓度，则dsRNA样品的浓度(嵋／lxL)=A260×稀释倍数×4024 山东农业大学硕士学位论文／1000。2．2．2．2诱导温度对dsRNA表达量的影响取12mL过夜培养的新鲜菌液分别加4瓶到含四环素(终浓度为12．5pg／mL)和氨苄青霉素(终浓度为50pg／mL)的200mLLB液体培养基中，每瓶200mLLB液体培养基加入3mL菌液，培养2h。分别加入IPTG至终浓度0．4mmol／L。使用22℃，27℃，32℃，37℃继续诱导，3h诱导后用Trizol法提取dsRNA。将所提取的dsRNA用RNaseA和DNaseI消化，1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外分光光度计测定dsRNA在OD260时的浓度，则dsRNA样品的浓度(嵋／此)=A260×稀释倍数×40／1000。2．2．2．3诱导时间对dsRNA表达量的影响取12mL过夜培养的新鲜菌液分别加4瓶到含四环素(终浓度为12．5Ilg／mL)和氨苄青霉素(终浓度为50pg／mL)的200mLLB液体培养基中，每瓶200mLLB液体培养基加入3mL菌液，培养2h。加入IPTG至终浓度0．4mmol／L。32℃下继续诱导，分别诱导2h，3h，4h，5h，诱导后用Trizol法提取dsRNA。将所提取的dsRNA用RNaseA和DNaseI消化，1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外分光光度计测定dsRNA在OD260时的浓度，则dsRNA样品的浓度(鹏／gL)=A260x稀释倍数×40／1000。2．2．2．4组合条件对dsRNA表达量的影响取24mL过夜培养的新鲜菌液分别加8瓶到含四环素(终浓度为12．5“g／mL)和氨苄青霉素(终浓度为50“g／mL)的200mLLB液体培养基中，每瓶200mLLB液体培养基加入3mL菌液，培养2h活化菌株。组合诱导条件按(表2．2)所示。诱导后用Trizol法提取dsRNA，将所提取的dsRNA用RNaseA和DNaseI消化，1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外分光光度计测定dsRNA在OD260时的浓度，则dsRNA样品的浓度(嵋／“L)=A260×稀释倍数×40／1000。 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究表2-2组合诱导条件Table．2-2Compositioninducingconditions2．2．2．2Trizol法提取dsRNA(1)取过夜培养的菌液1mL进行离心，转速9000rpm，离心5min后弃去培养液。加入1mLTrizol试剂，振荡混匀30S确保菌体溶解，并置于室温下静置5min。(2)向管中加入200此氯仿后摇晃试管，室温下孵育15min，4℃，9000rpm，离心15mitt。取上层清液并加入500此异丙醇后充分混匀，室温下静置10min，放入冷冻离心机中离心，4℃，转速9000rpm，离心15min。(3)去掉上层清液，用70％乙醇漂洗RNA沉淀，放入离心机中离心，4℃，转速7500rpm，离心5min，倒掉离心后残留的乙醇。干燥RNA5min，在10此10mmoULTris(PH=7．5)，1mmoFLEDTA缓冲液中溶解沉淀。2．2．2．3高压破碎仪获得大量dsRNA(1)将获得的菌体在4℃冰箱中预冷后离心，4℃，转速10000rpm，离心15min后收集离心产物。(2)于盐溶液(PH=7．5，10mmol／LEDTA，50mmol／L嘶s)中重悬菌体。(3)在12000psi(880Bar)高压破碎仪中破碎菌体重悬液，调节流速约每秒／滴，在置于冰上的容器重收集上清液。(4)将上清液放入离心机中离心，转速9000rpm，离心20min，取上清进行抗病毒实验。2．2．3dsRNA介导的田间病毒抗性鉴定田间病毒抗性在山东省水稻研究所实验农场进行。选取紫香糯水稻为供试植物，pGEM-RBSDVCP400表达载体破碎液和pGEM．RSVCP400表达载体破碎液分别名为RBSDVCP和RSVCP。将提取的dsRNA表达载体破碎液以大约1l-tg／rtL(dsRNA的浓 山东农业大学硕士学位论文度为0．48p∥此)溶解在TE缓冲液(10mmol／LTris，lmmol／LEDTA，pH值7．5)中。田间试验分为16个组别，每个组有三个重复试验，每组区域面积为50x50cm2。dsRNA表达载体破碎液分别稀释不同浓度，使其终浓度分别为1．2×10一“g／此、2．4x10。“g／此和4．8x10。3蚓此。于水稻秧田期喷施三次dsRNA破碎液。16个组别名称如下表2-3：表2—3原核表达田间试验组别Table．2-3Namesofgroupsinricefieldresistanceanalysis．2．2．4病毒的ELISA检测使用的第一抗体为兔抗血清，工作浓度是1：2000；第二抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔血清，工作浓度是1：1000。ELISA检测程序如下：(1)包被抗原：称量植物叶片并加入1：10比例的缓冲液(1g叶片加10mL)进行研磨稀释后离心，转速6000rpm，离心5min。取离心后上层清液，包被聚苯乙烯板，每孔200p．L，用湿纱布和塑料袋包好后放入37℃培养箱，保温保湿4h。(2)洗板：使用PBST缓冲液洗涤聚苯乙烯板4次。第一次洗涤要注意快速到处27 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究洗涤液，其余三次将PBST缓冲液置于孔中放置3min。洗涤完成后将聚苯乙烯板甩干，并置于滤纸上去除缓冲液和气泡。(3)加一抗：1：20的健康叶子的汁液(1g叶片加20mLPBS)研磨一抗后离心，转速6000rpm，离心5min取上层清液。包被聚苯乙烯板，每孔180p,L，用湿纱布和塑料袋包好后放入37℃培养箱，保温保湿4h。(4)洗板：使用PBST缓冲液洗涤聚苯乙烯板4次。第一次洗涤要注意快速到处洗涤液，其余三次将PBST缓冲液置于孔中放置3min。洗涤完成后将聚苯乙烯板甩干，并置于滤纸上去除缓冲液和气泡。(5)加二抗：稀释二抗用结合缓冲液，每孔180此，用湿纱布和塑料袋包好后放入37℃培养箱，保温保湿4h。(6)洗板：使用PBST缓冲液洗涤聚苯乙烯板4次。第一次洗涤要注意快速到处洗涤液，其余三次将PBST缓冲液置于孔中放置3min。洗涤完成后将聚苯乙烯板甩干，并置于滤纸上去除缓冲液和气泡。(7)将150¨L底物缓冲液加入到每个孔中，避光条件下静置显色30min。(8)将40此终止液2NH2S04加入孔中以终止实验反应。(9)通过酶联免疫检测仪测量板上各孔的OD490，阳性判断标准为ODr,／OD阴>2，每个样品设置4个重复。2．2．5Northem杂交分析2．2．5．1水稻植株总RNA的提取(Trizol一步提取法)(1)取0．2g植物叶片，置于液氮中研磨，将2mLT砒zol加到研钵中，充分混匀后于室温下放置10min。(2)小心吸取研磨物加入1．5mL离心管中，并向管中加入200gL氯仿，封闭离心管涡旋振荡后室温静置10min。(3)静置后的离心管放入离心机中离心，转速12000rpmin，离心15min后吸取上层液体加入到另一新离心管中。(4)向离心管中加入5001．tL等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀管中液体后室温静置10min。(5)放入离心机中离心，4℃，转速12000rpmin离心15rain后小心吸取上层清液。2R 山东农业大学硕士学位论文(6)加入75％乙醇洗涤两遍后离心，4℃，转速8000rpm离心10min，去掉残留乙醇，干燥5rain。(7)向管中加入DEPCddH20，封闭管放入65℃水浴锅中溶解，取少量进行OD值测量和琼脂糖电泳检测。2．2．5．2甲醛的凝胶RNA电泳(1)配制10xMOPS甲醛凝胶电泳缓冲液。(2)甲醛变性凝胶的配制：向48mLDEPCddH20中加入0．72g琼脂糖，待其加热后溶解再加入6mL10xMOPS和6mL甲醛溶液混匀倒胶(3)样品处理：向经过DEPC处理的离心管中加入20“glLNA样品和10此上样缓冲液，放到60℃水浴锅中温浴15min，取出后放入冰水混合物中冷却5min，离心5s确保管中液体收集到管底。(4)预电泳30min后加样至凝胶加样孔。(6)调整电压为3~4v／cm，1-2h电泳后收集混合两液槽的缓冲液，继续进行电泳。(7)电泳完毕后观察结果，并拍照记录。2．2．5．3转膜(1)电泳后用DEPCH20冲洗甲醛凝胶确保没有甲醛残留。(2)使用DEPCH20冲洗凝胶，并将凝胶置于10xSSC浸泡30rain。(3)20xSSC浸泡滤纸后平铺滤纸于平台，除去平台与滤纸之间的气泡。(4)将凝胶中无样品部分尽可能的切除，于加样孔端右上角作标记以记录各样品位置。反扣凝胶于滤纸上并用玻璃棒赶走气泡。(5)取与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜置于无RNase的水中5min，然后放在凝胶上面。膜的边缘可以盖于加样孔的边缘。放置后不要移动，不要出现气泡。(6)对凝胶的四周使用保鲜膜进行封闭，然后放置用20xSSC浸泡的尼龙膜和两张3mill滤纸，再使用玻璃棒去除气泡后再凝胶上盖多层吸水纸，压上0．5蚝重物。(7)添加20xSSC到转移装置中，转移RNA，转移过程持续20h，途中应及时更换吸水纸。(8)转移后取出尼龙膜，在2xSSC溶液中浸泡15min，确保尼龙膜上的琼脂糖碎片完全除去。(9)取出尼龙膜，室温下干燥30min。29 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究(10)两张滤纸中间夹上晾干的尼龙膜，80℃烘膜2h，烘干后保存备用，2．2．5．4探针制备(1)PCR获得目的片段，纯化后备用(2)向经DEPC处理的1．5mL离心管中加入如下试剂(离心管置于冰上)。模板DNA标记混合物5x(1a)转录缓冲液5x(1b)RNA聚合酶T7DEPCddH204gL(200ng)4lxL4lxL2肛L6“L混合后，短暂离心，42℃金属浴中反应1h。(3)将2pLDNaseI加到反应体系中，37℃温育15min。(4)将2gL0．2MEDTA(pH8．O)加入反应体系中以确保反应停止。2．2．5．5DIG标记有效性检测(1)1．5mL离心管经DEPC处理并高压灭菌，取10支离心管，将按照比例将标记RNA和对照RNA稀释成一系列浓度(表2．4)。(2)在聚酯膜覆盖尼龙膜，在尼龙膜上点样，并且在聚脂膜上做好点样浓度标记，切记不可在尼龙膜上做记号，不能手摸尼龙膜，对照样品点在第一排上而待测样品点在第二排上。(3)120℃烘膜30min，确保RNA固定于膜上。(4)洗膜缓冲液(10mL)洗膜2min。(5)把膜放置于10mL封闭液中室温条件下封闭30min。(6)抗体溶液的准备在封闭即将结束时进行，Anti．DIG．AP在12000rpm下离心5min确保没有小的凝聚体残留导致背景过高。封闭液与Anti．DIG．AP按照1：10000(75mU／mL)比例进行稀释。每laLAnti．DIG．AP加入20mL封闭液混匀。封闭结束后倒掉封闭液，并将膜放置于抗体溶液中室温下保存30min。(7)在室温的条件下用洗膜缓冲液洗膜2次每次15min(8)将膜置于检测缓冲液中平衡2—5min确保没有洗膜缓冲液残留。(9)在展开槽上铺开膜，确保RNA面朝上，并滴加CDP．Star至膜上。让溶液在膜的表面扩散。之后将膜放平，排除气泡，确保膜的四周充满液体，于37℃烘箱放置30 山东农业大学硕士学位论文20min。(10)在暗室压片子，显影，定影。(11)比较对照和样品的斑点强度，估测DIG标记的RNA的浓度。表2．4DIG标记有效性检测!些!!!：!竺型!!垄!堡!!竺笪堕里!鱼旦竖Fromtube撑RNA稀释缓冲液(此)稀释比例终浓度编号RNA(此)对照l心JAl23456710ng／¨L1ng／肛L10pg／pL3pg／gL1pg／gL0．3pg／斗LO．1pg／gLO．03pg／IILO．01pg／gL02．2．5．6杂交(1)在杂交管中放入膜并赶除膜与管的气泡，向管中加入5mL杂交液(3．5mL／100cm2膜)，将杂交管放入杂交炉中68℃预杂交3h。(2)将100gL杂交液加入到2．5此探针中混匀，放入沸水中变性5min。然后取出后冰浴5min。(3)过夜杂交。(4)洗膜：用洗膜液2xSSC在室温条件下进行洗膜两次，每次洗5mirl：然后再用0．5xSSC进行洗膜，洗膜2次，每次洗膜15rain。(5)用洗膜液洗膜2rain。(6)用20mL的封闭液把膜封闭，在室温条件下静置30rain，然后放到摇床上轻缓摇动。(7)抗体溶液的准备在封闭即将结束时进行，Anti．DIG．AP在12000rpm下离心5min确保没有小的凝聚体残留导致背景过高。封闭液与Anti．DIG．AP按照1：10000(75mU／mL)比例进行稀释。每gLAnti．DIG．AP加入20mL封闭液混匀。封闭结束后倒掉m"m—hkhkhk．一螺嘲弱钙帖的钙邪如 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究封闭液，并将膜放置于抗体溶液中室温下保存30min。(8)将抗体溶液倒掉，在室温条件用洗膜缓冲液进行洗膜，2次，每次洗膜15min。(9)将洗膜缓冲液倒掉，然后将膜放入检测缓冲液中静置2～5min。(10)在展开槽中将膜平铺，使RNA面向上，从以下方法中选择一种进行发光底物处理：1)单张杂交膜处理：将置于保鲜膜中的膜用镊子抬起-N，然后将O．5mL(大约4滴)化学发光底物用消毒后的吸管从顶端加入，确保底物溶液均匀扩增至膜表面，然后放平膜，再去一湿润滤纸将膜上气泡排除，确保膜被液体封闭，装入暗盒中放入37℃烘箱放置20min。2)成批膜处理：将膜置于以消毒后盘中，加入5～10mL的底物溶液，然后倾斜盘子使膜进入底物溶液中，室温条件下静置5min。然后用镊子提起膜使膜上液体滴出。然后放入干净的保险膜中，不停重复此过程，全部处理后转移到暗盒里，放入37℃烘箱中。(11)在暗室压片子、显影、定影。2．2．6siRNA的提取和杂交2．2．6．1siRNA提取步骤(PurelinkTMmiRNAisolationKit提取)(1)取0．1g供试植物叶片放入液氮中研磨，研磨后装入1．5mL离一tl,管中并向管中加入300I．tLL3充分混匀。(2)将离心管放入离，fl,机中，转速12000rpm离心2min后吸取上层清液加入一个新离心管中，并向新离心管中加入300此70％7,醇(使乙醇的终浓度为35％)充分混匀。(3)将混合液上柱，12000rpm，离心1min，总RNA结合于柱上，保留收集管中的液体。(4)将96％的乙醇加到收集管中，调整乙醇终浓度为70％(即：600gL溶液中，加入700此96％"100％乙醇)后充分混匀。(5)将700此混匀液体加入第二个柱中，放入离心机中离心，转速12000rpm离心1min，取出离心管倒掉废液。(6)向管中加入500皿漂洗液(W5)后放入离心管中离心，转速12000rpm离心1min后弃掉废液。(7)再次离心，最大离心速度13200rpm离一tl,3rain后倒掉残存漂洗液。 山东农业大学硕士学位论文(8)将离心柱放入离心管中并向管中加入1001．tLDEPCH20进行洗脱，室温下静置1min后离心，转速13200rpm离心1min后放入．80℃冰箱中保2．2．6．2siRNA的采用PAGE电泳(1)仪器清洗1)使用Liquinox清洗剂和10％SDS的蒸馏水对玻璃板和电泳槽进行清洗。2)玻璃板的尺寸为14cmxl6em，板间距为1．5mnl3)用琼脂对玻璃板进行封闭防止液体渗漏(2)配凝胶1)配母液(30mL)30％聚丙烯酰胺(丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺，37．5：1)尿素10xTBEH2017mL12．6g1．5mL2mL注：a．尿素不能灭菌，应把其它灭菌，用DEPC·H20处理后再配母液。b．彻底的倒置混合，不要摇动或漩涡混合，避免产生气泡影响聚合。加热至37℃溶解尿素。2)混合加入151．tLTEMED(N，N，N’，N’．四甲基乙二胺)。3)将60gL25％过硫酸胺(APS)加入混合(3)将凝胶倒入组装好电泳槽，聚合1h。(4)加入O．5xTBE电泳缓冲液。(5)漂洗加样孔。(6)再次漂洗加样孔后将20此上样液加到RNA探针中，放入65℃水浴锅中进行变性，10min后冰浴条件1min后进行电泳2h，确保RNA被全部分离。(7)O．5I_tgmL的溴化乙淀染胶后照相。2．2．6．3转膜(1)O．5×TBE缓冲液浸泡PAGE。(2)设置电转装置，并准备4张与凝胶等面积的Whatman3ITlln滤纸和1张尼龙膜。 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究(3)凝胶、尼龙膜、滤纸和塑料垫依次放入凝胶支持夹中，赶除各层之间的气泡(4)正极置于尼龙膜侧，负极置于凝胶侧电转，电压设置为25V转移1h。(5)O．5xTBE漂洗电转后尼龙膜并用干净滤纸吸干，放入烘箱中80℃烘烤2h固定备用。2．2．6．4siRNA杂交和检测siRNA杂交温度一般为38—42℃，具体杂交过程和检测参照植物中总RNA的杂交过程。34 山东农业大学硕士学位论文3结果与分析3．1RBSDV和RSV的CP基因dsRNA原核表达载体构建3．1．1GUS片段PCR扩增以GUS-5和GUS一3为引物扩增质粒pBll21长度120bp的葡萄糖苷酸酶基因，1％琼脂糖凝胶电泳结果(图3-1)表明PCR扩增得到正确的120bpGUS片段。1M．．卜—一100bp图3-1葡萄糖苷酸酶基因部分序列PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果Fig．3-1GlucosideacidenzymegenesequenceofPCRproductsinagarosegellaneM：marker；1：PCRproduct．3．1．2GUS片段与pGEM载体连接用EcoRI和风fI两种限制性内切酶对重组表达载体双酶切。1％琼脂糖凝胶电泳结果显示(图3-2)重组表达载体双酶切切出120bp左右的片段，表明GUS片段与pGEM载体正确连接，将获得的pGEM重组载体命名为pGEM．GUS。M13000bp————◆100bp————◆图3-2载体pGEM与GUS片段连接后酶切鉴定Fig．3-2EnzymeidentificationofpGEMandfi'agmentofGUSlaneM：marker；1：recombinantplasmidsofpGEM-GUSdigested．35 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究3．1．3RBSDV和RSV外壳蛋白基因(CP基因)正向和反向目的片段的获得RBSDVCP基因和RSVCP基因正向片段为两端连接EcoRI和ApaI的目的片段，反向片段为连接nfI和SalI的目的片段。分别取5l上LPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果显示(图3．3)以各区段的正向的5’端、3’端引物和反向的5’端、37端引物各扩增出约400bp序列，与预计的片段大小一致，且无非特异带，说明正确扩增RBSDVCP基因和RSVCP基因的正向和反向目的片段。1234M图3-3PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果Fig．3-3PCRproductsinagarosegellaneM：marker；1：RBSDVCPPCRproductofforwordfragments；2：RSVCPPCRproductofforwordfragments；3：RBSDVCPPCRproductofreversefragments；l：RSVCPPCRproductofreversefragments；3．1．4正向目的片段与载体pGEM-GUS连接以载体pGEM．GUS上的M13F．47引物为5’端引物，以正向目的片段的自身3’端引物为3’端引物，以水为模板作为阴性对照进行菌液PCR鉴定。电泳结果显示(图3．4)各抗性菌落分别扩增到400bp左右的片段。将PCR鉴定结果为阳性的菌株进行测序；用DNAman软件将测序结果与原序列进行比对，结果显示测定的序列与原序列完全一致，表明各正向片段已连入pGEM．GUS载体中，将获得的重组中间载体分别命名为pGEM．GUS．RBSDV和pGEM．GUS．RSV。 山东农业大学硕士学位论文500bpMl23456N图3-4正向片段的PCR扩增产物的琼月旨糖凝胶电泳结果Fig．3-4PCRproductsofforwordfragmentsinagarosegellaneM：marker：laneN：negativecontrol；1-3：RBSDVCPPCRproductofforwordfragments；4-6：RSVCPPCRproductofforwordfragments3．1．5反向目的片段与重组中间载体连接以反向目的片段的自身3’端引物为5’端引物，以载体pGEM．GUS上的M13R-48引物为3’端引物，以水为模板作为阴性对照进行菌液PCR鉴定。电泳结果显示(图3．5)各抗性菌落分别扩增到400bp左右的片段。将PCR结果为阳性的菌株进行测序；用DNAman软件将测序结果与原序列进行比对，结果显示测定的序列与原序列完全一致，表明含发夹结构的原核表达载体构建完成，分别将这两个原核表达载体命名为pGEM-RBSDVCP400和pGEM-RSVCP400aMN123456图3．5反向片段的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果Fig．3-5PCRproductsofreversefragmentsinagarosegellaneM：marker：laneN：negativecontrol；l-3：RBSDVCPPCRproductofreversefragments；4-6：RSVCPPCRproductofreversefragments． 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究双酶切鉴定提取重组的质粒DNA，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示(图3．6)重组表达载体双酶切切出920bp的片段。通过以上鉴定结果表明，表达载体中片段均正确插入了载体，表达载体构建成功。123M图3-6提取重组质粒的酶切鉴定Fig．3-6IdentificationofrecombinantplasmidsdigestedbyrestrictionenzymelaneM：marker：lane1：RBSDVCP920；lane2·3：RSVCP920．3．1．6重组表达载体转化大肠杆菌M．JMl091acY菌株取构建好的重组表达载体分别转入大肠杆菌M．JMl091acY。挑取抗性菌落，以M13F．47为5’端扩增引物和GUS．3为3’端扩增引物进行正向扩增；以GUS．5为5’端扩增引物和M13R-48为3’端扩增引物进行反向扩增。以水为模板作为阴性对照，进行菌落PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示(图3．7)显示，两组引物均扩增出620bp左右的目的条带，表明表达载体正确导入大肠杆菌M．JMl091acY中。N1234567RM91012图3．7M．JMl09lacY中重组质粒的菌落PCR鉴定 山东农业大学硕士学位论文Fig．3-7TheelectrophoresisofcolonyPCRproductsinagarosegelLaneM：DNAmarker；LaneN：negativecontrol，；lane1--6：RBSDVPCRproducts；lane7～12：RSVPCRproducts．3．2dsRNA诱导表达条件的优化3．2．IlPTG浓度对dsRNA诱导表达产量的影响Trizol法提取dsRNA，测定dsRNA浓度，将3次测定结果取平均值后绘制IPTG浓度与dsRNA相对表达量的曲线图。结果显示(图3．8)dsRNA的表达量受IPTG浓度影响。在IPTG终浓度范围在0．2mmol／I／v0．4mmol／L时，dsRNA表达量会随IPTG浓度增加而增大。达到峰值后，dsRNA表达量会下降。当加入IPTG至终浓度O．4mmol／L，继续诱导37℃，3h诱导后dsRNA的相对表达量比较高。图3—8PTG浓度对dsRNA表达量的影响Fig．3-8DifferentconcentrationsofIPTGeffectedondsRNAinducedexpressionquantity3．2．2诱导温度对dsRNA诱导表达产量的影响Trizol法提取dsRNA，测定dsRNA浓度，将3次测定结果取平均值后绘制诱导温度与dsRNA相对表达量的曲线图。结果显示(图3．9)dsRNA的表达量受诱导温度影响。当诱导温度为32℃时，dsRNA的相对表达量会达到峰值。因此加入IPTG至终浓度0．4mmol／L，调整诱导温度为32℃，3h诱导后dsRNA的相对表达量比较高。39 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究Inducingte坤Ⅱatures／℃图3．9诱导温度对dsRNA表达量的影响Fig．3-9DifferentinducingtemperatureseffectedondsRNAinducedexpressionquantity3．2．3诱导时间对dsRNA表达产量的影响Trizol法提取dsRNA，测定dsRNA浓度，将3次测定结果取平均值后绘制诱导时间与dsRNA相对表达量的曲线图。结果显示(图3．10)dsRNA的表达量受诱导时间影响。当加入IPTG后继续诱导时间为3h，dsRNA的相对表达量会达到峰值。因此加入IPTG至终浓度0．4mmol／L，调整诱导温度为32℃，3h诱导后dsRNA的相对表达量比较高。 山东农业大学硕士学位论文0．450．40．350．30．250．20．150．10．050Inducinghn口s／h图3．10诱导时间对dsRNA表达量的影响Fig．3-10DifferentinducingtimeseffectedondsRNAinducedexpressionquantity3．2．4组合诱导条件Trizol法提取dsRNA，测定dsRNA浓度，将3次测定结果取平均值后绘制组合条件与dsRNA相对表达量的曲线图。结果显示(图3．11)dsRNA的最适表达条件是在0．4mmol／LIPTG和32℃条件下，诱导3h，dsRNA的相对表达量最大。4l_【．—，．∞了、毒色n可uonco=日hpcuuGou 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究图3．11组合条件对ds时蛆表达量的影响Fig．3-11CompositionconditionsinducingeffeetedondsRNAinducedexpressionquantity(1)。32℃，3h，0。3mmol／LIPTG；(2)．32℃，3h，0．4mmol／LIPTG；(3)．32℃，4h，O．3mmol／LIPTG；(4)。32℃，4h，0．4mmol／LIPTG；(5)．37℃，3h，0．3mmol／LIPTG；(6)．37℃，3h，0．4rnmol／LIPTG；(7)．37℃，4h，0．3mmol／LIPTG；(8．)37℃，4h，0．4rllmoULIPTG．3．3dsRNA介导的田间病毒抗性鉴定pGEM．RBSDVCP400表达载体菌液破碎液和pGEM-RSVCP400表达载体菌液破碎液分别稀释不同浓度。于水稻秧田期喷施三次dsRNA破碎液。田间抗病毒结果(图3．12)显示。统计结果表明，喷施稀释后终浓度4．8x10。3u∥此的pGEM．RBSDVCP400表达载体菌液破碎液的水稻发病率为39．5％；喷施稀释后终浓度4．8×10。3p∥皿的pGEM．RSVCP400dsRNA表达载体菌液破碎液的水稻发病率为24．O％；喷施稀释后终浓度2．4x10习“g／皿的pGEM—RBSDVCP400表达载体菌液破碎液的水稻发病率为25．1％；喷施稀释后终浓度2．4x10弓肛∥此的pGEM-RSVCP400dsRNA表达载体菌液破碎液的水稻发病率为11．7％；喷施稀释后终浓度1．2x10。3“g／皿的pGEM．RBSDVCP400表达载体菌液破碎液的水稻发病率为33．O％；喷施稀释后终浓度1．2xlOo“∥p．L的pGEM．RSVCP400dsRNA表达载体菌液破碎液的水稻发病率为18．8％，终浓度为2．4x10‘3rig／IxL表达载体菌液破碎液在所有实验组别中防效最好，而未经过IPTG诱导的表达载体防效明显低于经过IPTG诱导的表达载体。喷施两种浓度的空菌株42 山东农业大学硕士学位论文M．JMl091aeY实验组的水稻发病率分别为48．1％和47．3％，喷施TE缓冲液的水稻发病率达56．1％，喷施水的水稻发病率为62．8％。而ELISA检测结果(表3．2)显示感染水稻黑条矮缩病毒的水稻与感染水稻条纹病毒的水稻在病毒含量上与未经防效实验处理的感病水稻植株无明显差异；未感病型供试水稻植株在整个生育期内均无任何症状产生，用ELISA几乎检测不到病毒。表明田间发生病毒病害是由RBSDV和RSV侵染所致。43 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究56 山东农业大学硕士学位论文9452 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究1315紧鬻鬻嘲辫霉罨黪14图3．12．水稻田间试验Table．3-12Experimentinricefield16l：pGEM．RBSDVCP400表达载体菌液破碎液浓度为4．8x10。3耻∥吐的实验组：2：pGEM-RBSDVCP400表达载体菌液破碎液浓度为2．4x10"3p∥此的实验组；3：pGEM．RBSDVCP400表达载体菌液破碎液浓度为1．2×10"3恤∥此的实验组；4：pGEM．RSVCP400表达载体菌液破碎液浓度为4．8×10‘3肛∥此的实验组；5：pGEM·RSVCP400表达载体菌液破碎液浓度为2．4×10。3岭，pL的实验组；6：pGEM．RBSDVCP400表达载体菌液破碎液浓度为1．2×10‘3p∥扯L的实验 山东农业大学硕士学位论文组；7：pGEM-RBSDVCP400表达载体菌液破碎液(未经过IPTG诱导)浓度为4．8×10。p鲥上L的实验组；8：pGEM·RBSDVCP400表达载体菌液破碎液(未经过IPTG诱导)浓度为2．4x10。3嵋仙的实验组：9"pGEM-RBSDVCP400表达载体菌液破碎液(未经过IPTG诱导)浓度为1．2×10。峙／此的实验组；10：pGEM．RSVCP400表达载体菌液破碎液(未经过IPTG诱导)浓度为4．8×10。3“g，此的实验组；11：pGEM-RSVCP400表达载体菌液破碎液(未经过IPTG诱导)浓度为2．4×10’3p∥止的实验组；12：pGEM-RBSDVCP400表达载体菌液破碎液(未经过IPTG诱导)浓度为1．2x10‘3pg，皿的实验组；13：喷施200倍稀释的Escherichiacoilstrain空菌株M-JMl09lacY破碎液的实验组；14：喷施400倍稀释的Escherichiacoilstrain空菌株M．JMl091acY破碎液的实验组；15：喷施TE缓冲液的实验组；16：喷施水的对照组。1．pGEM-RBSDVCP400bacteriaexpressionvector4．8x10。3p啡L；2．pGEM．RBSDVCP400bacteriaexpressionvector2．4x10’3pgmL；3．pGEM-RBSDVCP400bacteriaexpressionvector1．2×10。3枞；4．pGEM-RSVCP400bacteriaexpressionvector4．8x10。3vedvL；5．pGEM-RSVCP400bacteriaexpressionvector2．4×10‘3p酌正；6．pGEM-RBSDVCP400bacteriaexpressionvector1．2x10。pg佴IL；7．pGEM-RBSDVCP400bacteriaexpressionvector4．8x10‘3pg／IlLwithoutIPTGinduced；8．pGEM-RBSDVCP400bacteriaexpressionvector2．4×10。p∥止withoutIPTGinduced；9．pGEM-RBSDVCP400bacteriaexpressionvector1．2xlff3弘g，皿withoutIPTGinduced；10．pGEM-RSVCP400bacteriaexpressionvector4．8x10。3p∥此withoutIPTGinduced；II．pGEM-RSVCP400bacteriaexpressionvector2．4×10‘3州此withoutIPTGinduced；12．pGEM-RSVCP400bacteriaexpressionvector1．2x10‘3pg／止withoutIPTGinduced；13：EscherichiacolistrainM-JMl091acYdiluteby200；14：EscherichiacolistrainM·-JMl091acYdiluteby400；15：TE；16：1--120表3-l田问试验水稻发病率统计结果Table．3-1Statisticcalresultsofmorbidityinricefields47 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究 ．一．些查奎些奎堂堡主兰垡堡塞一———————__———————————_-———————————_————————————————————————————————●———————————————一一_-一—_●_——————-———●_——_——_●—_-__l————●----—_-—I_l-—--—l一318515233745．1％菌榭VI-JMl09lacY400倍稀释2TEbuffersolutionH2010812215117216215419613621428031531327028934722350．5％47．3±3．50％43．6％47．9％55．O％56．1±3．52％60．O％53．2％56．6％62．8±7．22％61．O％311928840770。8％●_●_____—●________-I_-___●__●_-●l----_I_-____l—●___●___-●__-__-一●●__-l-____l一。。。’‘。。。’。。。。。’’。_一表3-2病毒的ELISA结果(OD490nm)Table3．2ELISAdeteetionofvirus(OD490nm)重组载体recombinant转基因植株数表型ELISA结果vectorTransgenicplanttypeofresponseResultofELISApGEM．RBSDVCP4006H0．074i-0．00615H0．080-x0．00522H0．083：e0．002pGEM．RBSDVCP4008SO．24l士0．00517S0．229-J：0．00720S0。229士o。007pGEM．RSVCP4004H0．0921-0．00214H0．088士-0．01123H0．089-1-0．006pGEM．RSVCP4009S0．372-<-0．00418S0．359-i-0．00327S0．359-1-0．003CKlSO．230-I-0．005CK2S0．391：L-0．003CK3-0．07I：L-O．007CI(4—0．090-I-0．008H：Heath：S：Susceptible．CKI：未经防效实验处理感染水稻黑条矮缩病毒：水稻植株；CK2：未经防效实验处理感染水稻条纹病的水稻植株；CK3，CK4：未经防效实验处理的健康植株．3．4供试水稻植株的Northemblot杂交分析在田间随机选取发病和未发病的水稻进行Northernblot分析。阳性对照分别选择未经出任何处理的具有水稻黑条矮缩病症状和水稻条纹叶枯病症状的水稻植株，阴性对照4968l185l；m：2怕H加B”&3123l2 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究则选择未经原核表达处理没有任何症状出现的未发病株数。杂交结果显示，发病植株能分别杂交出RBSDV和RSV的RNA，未发病病植株则没有信号(图3．13)。进一步的siRNA杂交结果显示(图3．14)供试水稻植株中未发病植株和感病植株中均能够检测到siRNA，但未发病植株中检测到的siRNA的量相对感病植株中的较多，而未经防效实验处理的植株均检出不出siRNA。上述结果表明所获得的病毒抗性是由RNA介导的。l2345图3．13水稻植株的Northem杂交分析Fig．3-13NorthernAnalysisofRiceplantsl：感染水稻条纹病毒的植株；2：感染水稻黑条矮缩病毒的植株；3：喷施RSVdsRNA表达载体茵液破碎液后未发病的植株；4：喷施RSVdsRNA表达载体菌液破碎液未发病的植株；5：未经过任何处理的未发病植株。1：PlantsinfectingRSV；2：PlantsinfectingRBSDV；3：HeathplantswithpGEM-RSVCP400；4：HeathplantswithpGEM-RBSDVCP400；5：Heathplants．234M图3．14供试水稻植株中siRNAFig．3-14NorthernblotanalysisofsiRNAsfromtestedriceplantsl：喷施pGEM．R．sVCP400的未发病植株；2：喷施pGEM-RBSDVCP400未发病植株；3：喷施pGEM-RSVCP400的感病植株；4：喷施pGEM-RBSDVCP4001拘感病植株；M：健康植株。l：TestedHeathPlantswithpGEM-RSVCP400expressionvector；2：TestedHeathPlantswithpGEM-RBSDVCP400expressionvector；3：TestedsusceptiblePlantswithpGEM-RSVCP400expressionvector；3：TestedsusceptiblePlantswithpGEM-RBSDVCP400expressionvector；M：HeathPlantswithouttested．Thesizeofallhybridizedbandswereabout21—25tatand5SrRNAwasusedtoshowthatanequalamountofsmallRNAfractionwasloadedintoeachlane． 山东农业大学硕士学位论文4讨论(1)dsRNA原核表达体系的优化在原核表达过程中，选择构建一个合适的原核表达体系需要综合考虑3大因素：宿主菌株、表达载体和表达诱导条件，以获得最满意的表达效果。优化原核表达系统有助于原核表达dsRNA抗病毒体系进一步发展成为一种安全性高、防效好的防治植物病毒的新方法。尹国华等(2009)通过用Red重组系统敲除大肠杆菌rnc基因获得大肠杆菌缺失RNaseIII的突变体M．JMl09、M．HMSl74、M-origami和M．JMl091acY，与原核表达载体pGEM组合，构建不同类型的表达载体，组配组合，进行表达研究。研究表明pGEM确实是一种高效的表达载体，而菌株筛选实验中大肠杆菌M—JMl091aeY的dsRNA表达量显著高于实验中所使用的其他菌株。大肠杆菌M．JMl091acY与载体pGEM组合为dsRNA最高效表达的组合。而胡有燕等(2011)对原核表达系统的诱导条件诱导时间和IPTG浓度的进行不同组合，研究dsRNA表达量高的组合条件，研究表明当菌体浓度OD600约0．6时，加入IPTG使其终浓度为O．3～0．4mmol／L后继续诱导3~4h，dsRNA表达量最高。基于这两项研究结果我们在本研究中选择高效表达的大肠杆菌M．JMl091acY与载体pGEM组合作为宿主菌株和表达载体，然后对表达诱导条件进行优化。本研究组合诱导过程中的三个变量，对单一变量温度、IPTG终浓度、诱导时间进行初步筛选，然后优化组合三个变量，进行诱导表达优化实验。结果显示，dsRNA的最适表达条件是当菌体浓度OD600约为0．6，即大肠杆菌到达对数生长期时，加入IPTG达终浓度0．4mmol／L时，32℃继续诱导3h，dsRNA的相对表达量最大。本研究在之前的研究基础上，对原核表达系统进一步优化，获得高效的dsRNA诱导表达量。而是否有更高效的宿主菌株、表达载体和表达条件的组合，还需要更深入的研究。(2)dsRNA原核表达体系田间防治体系利用RNA干扰(或称RNA沉默)机制可以高效地抑制病毒的增殖和复制，赋予植物高水平的病毒抗性。已有多种抗病毒转基因植物通过该策略获得(朱常香等，2005；朱俊华等，2004；Liu等，2007；Prim等，1995；Smith等，2000；Waterhouse等，1998)。而用细菌表达病毒病原dsRNA的RNA干扰技术与用传统策略抗病毒转基因植物相比较则具有明显的优势(张德咏等，2008；Francisco等，2001，2003，2004)。dsRNA在体外具有较高的稳定性的特点为大田应用原核表达的dsRNA防治病毒病提供了技术支持。 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究RBSDV和RSV是危害最为严重的两种水稻病毒，引起水稻黑条矮缩病和水稻条纹叶枯病，严重危害水稻的产量，造成水稻减产甚至绝产。本研究通过构建dsRNA的原核表达载体，通过进行水稻田间试验，确定防治水稻黑条矮缩病和水稻条纹叶枯病的最佳时期，并针对dsRNA破碎液不同浓度进行田间抗病性试验，筛选出了最佳防效的喷施浓度。本研究首次将原核表达dsRNA体系运用到田间水稻病毒病防治实验中，有助于将原核表达dsRNA这一安全性高防效好的防治策略运用到我国水稻生产中，解决水稻病毒病日益严重的问题。不同浓度的dsRNA病毒防效实验结果显示，当表达载体菌液破碎液浓度为1．2×10弓p,g／p,L到2．4x10弓}tg／rtL时，随着浓度升高防效越好，发病率越低，而当浓度为2．4×10。3“虮L到4．8x10刁p虮L时，随着浓度升高防效降低，发病率升高，可见并非浓度越高防效越好。推测出现此结果的原因可能是由于4．8×10‘3一此的表达载体菌液破碎液在破碎离心之后仍残留有大肠杆菌菌体，其含有异味吸引飞虱在水稻上停留传毒，导致发病率高于终浓度2．4×10。3州此的表达载体菌液破碎液。研究表明最佳的防效浓度为2．4x10一gg／gL。未经IPTG诱导的表达载体菌液破碎液和空菌株菌液破碎液对水稻植株均有一定的防效。贾金磊等人(2011)的研究表明，大肠杆菌HTll5空菌株对TMV会产生一定防效，推测原因可能是由于大肠杆菌HTll5引起植物自身防御机制。在本研究中出现与贾金磊等人(2011)相似的研究结果，未经IPTG诱导的表达载体菌液破碎液和空菌株菌液破碎液对水稻植株均有一定的防效。因而可以推测表达载体菌液破碎液和空菌株菌液破碎液产生防效的原因可能是由于水稻植株对大肠杆菌出现的防御机制。确切的机制还需要进～步的研究。而且TE缓冲液处理的实验组发病率要低于水处理的对照组，出现该种结果的原因可能是由于TE缓冲液中的强s—HCl和EDTA起到一定化学防治作用，导致飞虱没有对其停留传毒。(3)展望原核表达的dsRNA能够抵抗病毒的侵染，且与转基因植物相比具有更高安全性。原核表达dsRNA在生产的实际应用，对于解决当前困扰我省水稻生产的日益严重病毒病问题，提高产量，减少农药使用量，减轻环境污染，维持生态平衡有着至关重要的作用。另，一种病毒往往能够侵染多种植物(如RBSDV不但侵染水稻，而且侵染玉米，引发中国玉米粗缩病)，所以该技术极易推广应用于其它蔬菜和作物的病毒病的防治，有着广阔的应用前景。但是它也有其局限性，还有许多急需解决的问题，例如：如何提高dsRNA的投递效率，提高抗病效果，降低大规模生产成本等，因此我们期待真正应52 山东农业大学硕士学位论文用的那一天。53 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究5结论(1)原核表达dsRNA的生产流程是制约其推广使用的关键因素，因此本研究通过优化dsRNA诱导表达条件以达到降低成本的目的。通过对诱导表达过程的关键因素温度、诱导时间和IPTG终浓度的优化组合。得出dsRNA的最适表达条件是在0．4mmol／LIPTG和32℃条件下，诱导3h，dsRNA的相对表达量最大。表达量可达0．48¨∥此。(2)在大田试验中，原核表达dsRNA表达载体菌液破碎液可以有效抑制水稻黑条矮缩病和水稻条纹叶枯病的发病率。筛选出防效最好的原核表达dsRNA表达载体菌液破碎液对于提高防效和降低成本有重要作用。田间试验发病率统计结果显示，喷施稀释后终浓度2．4x10。3“∥此的pGEM．RBSDVCP400表达载体菌液破碎液和喷施稀释后终浓度2．4x10。3gg／lxL的pGEM．RSVCP400dsRNA表达载体菌液破碎液防效最好。Northemblot检测表明这个抗性来源于RNA介导的病毒抗性。 山东农业大学硕士学位论文参考文献白庆荣，朱俊华，刘晓玲，朱常香，宋云枝，温孚江。利用RNA介导的抗病性获得抗2种病毒的转基因烟草。植物病理学报，2005，35：148．154曹杨，潘峰，周倩，等．南方水稻黑条矮缩病毒介体昆虫白背飞虱的传毒特性[J】．应用昆虫学迟胜起，宋云枝，朱常香，郑成超，刘晓玲，温孚江。核基质结合区对马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因介导抗病性的影响。植物病理学报，2005，35(4)：345—351郭兴启，吕士恩，朱常香，宋云枝，孟祥兵，郑成超，温孚江。利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草。植物病理学报，2001，31(4)：250．256胡有燕，牛娜，迟胜起。植物病毒源dsRNA原核表达条件的研究。青岛农业大学学报，李鹏，宋云枝，刘晓玲，朱常香，温孚江。马铃薯Y病毒CP基因5’端和3’端反向重复结构介导的抗病性研究。植物病理学报，2007，37(1)：69．76李云，宋云枝，朱常香，温孚江。hprⅢa的茎环比例对RNA介导的病毒抗性产生的影响。植物病理学报，2008，38：67．80林含新。水稻条纹病毒的病原性质、致病性分化及分子变异。博士学位论文，福州：福建农业大学，1999林奇英，谢联辉，周仲驹，谢莉妍，吴祖建。水稻条纹叶枯病的研究I：病害的分布和损失。福建农学院学报，1990，19(4)：421．425林奇英，谢联辉，周仲驹，谢莉妍，宋秀高。水稻条纹叶枯病的研究II：病害的症状与传播。福建农学院学报，1991，20(1)：24．28刘丽华，吴祖建，林奇英。水稻条纹叶枯病细胞病理变化的观察。植物病理学报，2000，牛娜，牛成峰，胡有燕。源于马铃薯Y病毒CP基因dsRNA原核表达及提取。青岛农业大学学报，2009，26(3)：184．187 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究阮义理，陈声祥，林瑞芬，蒋文烈，金登迪。水稻黑条矮缩病的研究[J]：浙江农业科学：1984年04期温孚江，朱常香。转录后的基因沉默与植物病毒抗性。生物工程学报，2001，17(3)：159．264谢联辉，周仲驹，林奇英。水稻条纹叶枯病的研究III：病害的病原性质。福建农学院学报，1991，20(2)：144．149尹国华，刘楠，孙兆楠，宋云枝，朱常香，温孚江。利用Red重组系统敲除大肠杆菌rnc基因构建dsRNA原核表达体系。山东农业大学学报，2009，40(3)：461-464朱俊华，朱常香，温孚江，宋云枝。正向和反向重复RNA介导的抗马铃薯Y病毒基因工程比较研究。植物病理学报，2004，34(2)：133．140竺晓平，朱常香，宋云枝，温孚江，刘红梅，李向东。CP基因3’端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性．中国农业科学，2006，39(6)：1153．1158AzuhataF，UyedaI，KimuraI，eta1．Closesimilaritybetweengenomestructuresofriceblack—streakeddwarfandmaizeroughdwarfviruses[J]．J．Gen．Vir01．，1993，74(7)：1227．1232BrendaL．B．．Double-strandedRNAasatemplateforgenesilencing．Ce／／，2000，101：235．．238ChuangC．F．andMeyerowitzE．M．Specificandheritablegeneticinterferencebydouble—strandedRNAinArabidopsisthaliana．．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，2000，97：4985-4990CogoniC．andMacinoG．．Post—transcriptionalgenesilencingacrosskingdoms．CurrentOpinion加Gene盯cs＆Development,2000，10：638-643CooperB．，LapidotM．，HeickJ．A．，DoddsJ．A．andBeaehyR．N．．AdefectivemovementproteinofTMVintransgenicplantsconfersresistancetomultipleviruseswhereasthefunctionalanalogincreasessusceptibility．Virology，1995，206：307-313DalmayT．，HamiltonA．，RuddS．，AngellS．andBaulcombeD．C．．AnRNAdependentRNApolymerasegeneinArabidopsisisrequiredforpost-transcriptionalgenesilencingmediatedbyatransgenebutnotbyavirus．Cell，2000，101：543—55356 山东农业大学硕士学位论文DehaanP．，GielenJ．L．，PrinsM．，WijkampI．G．，SchepenA．，PetersD．，vanGrinsvenM．M．andGoldbachR．．CharacterizationofRNA．mediatedresistancetotomatospottedwiltvirusintransgenictobaccoplants．Bio．Technology，1992，10：1133—1137DeF．G．，JiaoZ．，HalB．J．，TongJ．，SuW．Z．andBeiJ．C．．BacteriallyexpresseddsRNAprotectsmaizeagainstSCMVinfection．PlantCellRep．，2010，29：1261—1268DOI10．1007／s00299．010．0911-zDoughertyW．G．andParksT．D．．Transgenesandgenesuppression：tellingUSsomethingnew?CurrentOpinioninCellBiology，1995，7：399-405FireA．，XuS．，MontgomeryM．K．，KostasS．A。，DriverS．E．andMelloC．C．．Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans．Nature，1998，391：806—811FauquetCM，BishopDHL，eta1．VirusTaxonomy：SeventhReportoftheIntemationalCommitteeonTaxonomyofViruses．NewY，ork：Springer，2000：395—462GanD．F．，ZhangJ．，JiangH．B．，JiangT．，ZhuS．W．，ChengB⋯JBacteriallyexpresseddsRNAprotectsmaizeagainstSCMVinfection．PlantCellReports，2010，29：1261-1268．GingeryR．E。，nlericestripevirusgroup．InThePlantViruses(editedbyMilneRG)．PlenumPubl括hingCD职NewYorL1988，(4)：297-329．GolemboskiD．B．，LomonossoffG．P．andZaitlinM．．Plantstransformed诵tllatobaccomosaicvirusnonstructuralgenesequenceareresistancestothevirus．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，1990，17：6311-6315GotoK．，KanazawaA．，KusabaM．andMasutaC．．PlantMoLBioLRep．，2003，21：51·58．GregoryR．I．，YanK．，AmuthanG．，ChendrimadaT．，DoratotajB．，CoochN．andShiekhattarR．．ThemicroprocessorcomplexmediatesthegenesisofmicroRNAs．Nature，2004，432：235．240GuoH．S．andGarciaJ．A．．DelayedresistancetoplumpoxpotyvirusmediatedbyamutatedRNAreplicasegene：Invovementofagenesilencingmechanism．MolecularPlan纠协crobeInteractions，1997，1O：160-170GuraT．A．．silencethatspeaksvolumes．Nature，2000，404(6780)：804-808HamiltonA．J．，BrownS．，HanY。Y。，IshizukaM．，LoweA．，SolisA．G．A．andGriersonD．．57 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究AtransgenewithrepeatedDNAcausehighfrequency，post-transcriptionalsuppressionofACCoxidasegeneexpressionintotomato．PlantJournal,1998，15(6)：737．746HamiltonA．J．，VoinnetO．，ChappellL．andBaulcombeD．C．TwoclassesofshortinterferingRNAinRNAsilencing．EMBOJournal，2002，21(17)：4671．4679HammondS．M．，BemsteinE．，BeachD．andHannonG．J—AnRNA．directednucleasemediatespost—transcriptionalgenesilencinginDrosophilacells．Nature，2000，404：293．296HanY．andGriersonD．．RelationshipbetweensmallantisenseRNAsandaberrantRNAsassociatedwithsensetransgenemediatedgenesilencingintomato．PlantJournal,2002，29(4)：509—519HartC．M．，FischerB．，NeuhausJ．M．andMeinsF．．RegulatedinactivationofhomologousgeneexpressionintransgenicNicotianasylvestrisplantscontainingadefense-relatedtobaccochitinasegene．MolecularandGeneralGenetics,1992，235：179．188HarmT，R．I．B．Francki．Morphologyof丘jidiseasevirus．Virology，1977，76(2)：797．807．HelliwellC．andWaterhouseP．．Constructsandmethodsforhi曲一throughputgenesilencinginplants．Methods，2003，30：289-295HimberC。，DunoyerP．，MoissiardG．，RitzenthalerC．andVoilmetO．．Transitivity—dependentand-independentcell·to—cellmovementofRNAsilencing．TheEMBOJournal，2003，22：4523．4533HolenT．，AmarzguiouiM．，WiigeM．T．，BabaieE．andPrydzH。PositionaleffectsofshortinterferingRNAstargetingthehumancoagulationtriggertissuefactor．Nucl．AcidsRes．，2002，30(8)：1757—1766JonesL．，HamiltonA．J．，VoinnetO．，ThomasC．L．，MauleA．J．andBaulcombeD．C．．I矾A-I)NAinteractionsandDNAmethylationinpost-transcriptionalgenesilencing．P勉耐＆ll，1999，11：2291—2301KalantidisK．，PsaradakisS．，TablerM．andTsagrisM．．TheoccurrenceofCMVSpecificshortRNAsIntransgenicTobaccoexpressingVirus-DedvedDoublestrandedRNAisindicativeofresistancetothevirus．Plant-microbeinteract．，2002，15(8)：826．833KakutaniT．，HayanoY，HayashiT．，MinobeY．Ambisensesegment4ofricestripevirus：58 山东农业大学硕士学位论文possibleevolutionaryrelationship丽血phlebovirusesanduukuviruses(Bunyaviridae)．JournalofGeneralHrology，1990，71(7)：1427—1432．KakutaniT．，HayanoY，HayashiT．，MinobeY．Ambisensesegment3officestripevirus：thefirstinstanceofaviruscontainingtwoambisensesegments．JournalofGeneralVirology，1991，(72)：465-468KawchukL．M．，MartinR．R．andMcphersonJ．．SenseandantisenseRNA-mediatedresistancetopotatoleafrollvirusinrussetBurbankpotmoplants．MolecularPlant-MicrobeInteractions，1991，4：247—253KennerdellJ．R．andCarthewR．W．．UseofdsRNA-mediatedgeneticinterferencetodemonstratethatfrizzledandfrizzled2actinthewinglesspathway．Ce／／，1998，95：1017．1026KisoA．，YamamotoT．，KitaniK．．Studiesonricestripedisease诵廿lspecialreferencetothecausalvirus，itslactioninthediseasedtissuesandthemetabolicchangesinthediseaseplant．BulletinShikokuAgriculturalExperimentStation，1974，(27)：1-5KoganezawaH．．Purificationandpropertiesofricestripevirus．In：SymposiumonVirusDiseasesofTropicalCrops．TropicalAgricultureResearch，1977，(10)：151—154KoganezawaH．，DoiY，YoraK．．Purificationofricestripevirus．AnnuabofthephytopathologicalsocietyofJapan，1975，(41)：148-154KooterJ．M．，MatzkeM．A．andMeyerP．．Listeningtothesilentgenes：transgenesilencing，generegulationandpathogencontr01．TrendsPlantScience，1999，4：340-347KumagaiH．andKouchiH．．GenesilencingbyexpressionofhairpinRNAinLotusjaponicusrootandrootnodules．MolecularPlant-MicrobeInteractions，2003，16(8)：663-668LawsonC．，KaniewskiW．，HaleyL．，RozmanR．，NewellC．，SandersP．andTurnerN．E．．Engineeringresistancetomixedvirusinfectioninacommercialpotatocultivar：ResistancetopotatovirusXandpotatovirusYintransgenicRussetBubank．Bio．Technology，1990，8：127-134LindboJ．A．andDoughertyW．G．．UntranslatabletranscriptsofthetobaccoetchviruscoatproteingenesequenceCallinterferewithtobaccoetchvirusreplicationintransgenicplantsandprotoplasts．Virology，1992，189：725-73359 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究LipardiC．，WeiQ．andPatersonB．M．．RNAiasrandomdegradativePCRsiRNAprimersconvertrnRNAintodsRNAthataredegradedtogeneratenewsiRNA．Cell，2001，107(3)：297—307LiuH．M．，ZhuC．X．，ZhuX．P。，GuoX．Q．，SongY．Z．andWenF．J．．ZPhytopath01．，2007，155：676．682LongstaffM．，BrignetiG．，BoccardF．，ChapmanS．andBaulcombeD．．ExtremeresistancetopotatovirusXinfectioninplantsexpressingamodifiedcomponentoftheputativeviralreplicase．EMBOJ，1993，12(2)：379—386MacFarlaneS．A．andDaviesJ．W．Plantstransformed谢tllaregionofthe201-kilodaltonreplicasegenefrompeaearlybrowningvirusRNAlareresistanttovirusinfection．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA，1992，89：5829_5833MacraeI．J．，ZhouK．，LiF．，RepicA．，BrooksA．N．，CandeW．Z．，AdamsP．D．andDoudnaJ．A．．Structuralbasisfordouble．sgandedRNAprocessingbyDicer．Science,2006，311：195．198M蠲oriM．，MatzkeA．J．M．andKooterJ．M．．RNA：GuidingGeneSilencing．RNA，2001，293(10)：1081—1083．MurphyF．A，FanaquetC。M．，BishopD．H⋯IClassificationandnomenclatureofviruses：SixthReportoftheInternationalCommittee0nTaxonomyofViruses。Archivesofvirolagyl，1995，10：316-318NapoliC。，LemieuxC．andJorgensenR．。IntroductionofachimericchalconesynthetasegeneinPetuniaresultsinreversibleco．suppressionofhomologousgenesintransplants．PlantCell，1990，2：279—289NewmarkPA，ReddienPWCebriaF，SanchezA．Ingestionofbacteriallyexpresseddoubled．s2andedRNAinhibitsgeneexpressioninplanarians．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA，2003，100：11861·11865．NiuQ．W，，LinS．S．，ReyesJ．L．，ChenK．C．，WuH．W．，YehS．D．andChuaN．H．．ExpressionofartificialmicroRNAsintransgenicArabidopsisthalianaconfersvirusresistance．Nat．Biotechn01．，2006，24：1420—1428NykallenA．，HaleyB．andZamoreP．D。ATPrequirementsandsmallinterferingRNA 山东农业大学硕士学位论文s咖clureintheRNAinterferencepathway．Ce／／，2001，107：309-321PaddisonP．J．，CandyA．A．，BemsteinE．，HarmonG．J．andConklinD．S．．Shortha卸inRNAs(shRNAs)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells．Genes＆Development，2002，16：948-958PalauquiJ．C．，ElmayanT．，PollienJ。M．andVaucheretH．．Systemicacquiredsilencing：transgenespecificposttranseriptionalsilencingistransmittedbygraftingfromsilencedstockstonon-silencedscions．TheEMBOJournal，1997，16：4738—4745PallG．S．，Codony-ServatC．，ByrneJ．，RitchieL．andHamiltonA．J．．NucleicAcidsRes．，2007，35：e60PancoskaP．，MoravekZ．andMollU．M．．EfficientRNAinterferencedependsonglobalcontextofthetargetsequence：quantitativeanalysisofsilencingefficiencyusingEuleriangraphrepresentationofsiRNA．Nucleicacidsresearch，2004，32(4)：1469—1479PandolfiniT．，MolesiniB．，AvesaniL．，SpenaA．andPolverariA．．Expressionofself-complementaryhairpinRNAunderthecontroloftherolepromoterconferssystemicdiseaseresistancetoPlumPoxVirus(PPV)withoutpreventinglocalinfection．BMCBiotechnology,2003，3：7-22ParrishS．andFireA．．DistinctrolesforRDElandRDE4duringRNAinterferenceinCaenorhabditiselegans．RNA，2001，7：1397-1402PaulA．．RNA-DependentRNAPolymerases，Viruses，andRNASilencing．Science，2002，296(17)：1270-1273PhillipD．andZamore．A．．PathwaysProgrammedbySmallRNAs．Science，2002，296(17)：1265．1269．PrinsM．andGoldbachR．．RNA-mediatedvirusresistanceintransgenicplants．ArchivesofVirology,1996，141(12)：2259-2276PrinsM．，deHaanP．，LuytenR．，VanVellerM．，vanGrinsvenM．Q．andGoldbachR．．Broadresistancetotospovirusesintransgenictobaccoplantsexpressingthreetospoviralnucleoproteingenesequences．MolecularPlant-MicrobeInteractions，1995，8：85-91RatcliffF．，HarrisonB．D．andBaulcombeD．C。Asimilaritybetweenvirusdefenseandgenesilencinginplants．Science，1997，276：1558—156061 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究RunzeSun，ZhaonanSun，XueyingXie，ChangxiangZhu，FujiangWen．DifferentAbilitiesofDeliveryWaysfordsRNAExpressedbyBacteriatoProtectTobaccofromCo—infection谢t11PVYandTMV．JASAVolume2，Issue2Jun．2013PP．57—60SayakaH．，Shin-ichiroO．，EriA．．TheeffectsofspacersequencesonsilencingefficiencyofplantRNAivectors．PlantCellRep．，2007，26：651—659ShimizuT．，Nakazono-NagaokaE．，Uehara-IchikiT．，SasayaT．andOmuraT．．TargetingspecificgenesforRNAinterferenceiscrucialtothedevelopmentofstrongresistancetoRicestripevirus．PlantBiotechnologyJournal，2011，9(4)：l-10ShinkaiA．．StudiesoninsecttransmissionsofricevirusdiseaseinJapan．TheBulletinInstituteofAgricultureScience,SeriesC，1962，(14)：1—112ShinkaiA．．Presentsituationofricestripedisease．PlantProtection(Japan)，1985，(11)：503．507SijenT．，WellinkJ．，HifiartJ．B．andvailKammenA．．RNA—mediatedvirusresistance：roleofrepeatedtransgenesanddelineationoftargetedregions．PlantCell,1996，8：2277·2294SmithH．A．，SwaneyS．L．，ParksT．D．，WemsmanE．A．andDoughertyW．G．TransgenicplantvirusresistancemediatedbyuntranslatablesenseRNAs：Expression，regulationandfateofnonessentialRNAs．ThePlantCell，1994，6：1441-1453SmithN．A．，SinghS．P．，WangM．B．，StoutjesdijkP．A．，GreenA．G．andWaterhouseP．M．．Totalsilencingbyintron—splicedhairpinRNAs．Nature，2000，407：319—320SonadaS．andTsumukiH．．AnalysisofgenesequencesforthenucleocapsidproteingenefromTomatospottedwiltvirusforpromotingRNAmediatedcrossprotectionusingthePotatovirusXvectorsystem．Gen．PlantPath01．，2004，70(4)：239-242SonadaS．．AnalysisofthenucleocapsidproteingenefromTomatospottedwiltvirusastargetandinducerforposttranscriptionalgenesilencing．Plantscience，2003，164：717-725StamM．，deBruinR．，KenterS．，RenierA．L．，VanderH．，BloklandR．，MolJ．N．M．andKooterJ．M。Post-transcrifltionalsilencingofchalconesynthaseinPettmiabyinvertedtransgenerepeats．PlantJournal．，1997，12：63-82StoutjesdijkP．A．，SinghS．P．，LiuQ．，HurlstoneC．J．，WaterhouseP．A．andGreenA．G．．HpRNA．MediatedTargetingoftheArabidopsisFAD2GeneGivesHighlyEfficientand62 山东农业大学硕士学位论文StableSilencing．Plantphysiology，2002，129：1723-1731SunZ．N．，YinG．H．，SongY．Z．，ZhuC．X．andWenF．J．．BacteriallyExpressedDouble-·StrandedRNAsagainstHot·-SpotSequencesofTobaccoMosaicVirusorPotatoVirusYGenomeHaveDifferentAbilitytoProtectTobaccofromViralInfection．ApplBiochemBiotechn01．，2010，DOI10．1007／812010—010-8968—2SunZ．N．，YinG．H．，SongY．Z．，ZhuC．X．andWenF．J．．HpRNAsDedvedfromDifferentRegionsoftheNIbGeneHaveDifferentAbilitiestoProtectTobaccofromInfectionwithPotatoVirusY．JPhytopath01．，2009，doi：10．II1I／j．1439—0434．01650．xSwaneyS．，PowersH。，GoodwinJ．，RosalesL．S．andDoughertyW．G．．RNA-mediatedresistance、Ⅳitllnonstructuralgenesfromthetobaccoetchesvirusgenome．MolecularPlant-MicrobeInteractions，1995，8(6)：1004-1011TenlladoF．andDiaz-Ru／zJ．R。Double-strandedRNA—mediatedinterferencewinlplantvirusinfection．JViroL，2001，75：12288—12297TenlladoF．，LlaveC．andDiaz-RuizJ．R．．RNAinterferenceasanewbiotechnologicaltoolforthecontrolofvirusdiseasesinplants．VirusRes．，2004，102：85-96TenlladoF．，Mart／nez-GarciaB．，VargasM．andDiaz-RuizJ．R．．CrudeextractsofbacteriallyexpresseddsRNACanbeusedtoprotectplantsagainstvirusinfections．BMCBiotechn01．，2003，3：3TenUadoF．，CarciaL．andSerraM．T．．Resistancetopeppermildmottletobamovirusconferredbythe54kDgenesequenceintransgenicplantsdoesnotrequireexpressionofthewild—type54kDprotein．Hrology，1996，219：330·335TijstermanM．，KettingR．F．，OkiharaK．L．，SijenT．andPlasterkR．H．．RNAhelicaseMUT-14-dependentgenesilencingtriggeredinC．elegansbyshortantisenseRNAs．Science，2002，295：694-697TimmonsL．，CourtD．L．andFireA．．IngestionofbacteriallyexpresseddsRNAscallproducespecificandpotentgeneticinterferenceinCaenorhabditiselegans．Gene，2001，263：103．112TimmonsL。．FireA．SpecificinterferencebyingesteddsRNA．Nature，1998，395：854ToriyamaS．．Ricestripevirus．CMI／ABB．Descriptionofplantviruses，1983，(269)：1563 原核表达dsKNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究TofiyamaS．．AnRNA—dependentRNApolymeraseassociatedwiththefilamentousnuleoproteinsofficestripevirus．JournalofGeneralVirology，1986，(67)：1247-1255TuschlT．，ZamoreP．A．，LehmanR．，BarrelD．P．andSharpP．A．．TargetedmRNAdegradationbydouble-strandedRNAinvitro。Genes＆Development，1999，13：3191．3197VanderKrolA．R．，MurL．A．，deLangeP．，MolJ．N．andStultjeA．R．．InhibitionofflowerpigmentationbyantisenseCHSgenes：promoterandminimalsequencerequirementsfortheantisenseeffect。PlantMolecularBiology，1990，14：457—466VanderVlugtR．A．A．，RuiterR．K．andGoldbaekR．．EvidenceforsenseRNA—mediatedvirusresistancetoPVYNintobaccoplantstransformedwiththeviralcoatproteincistron．PlantM01．Biology，1992，20：631—639VanderWilkF．，WillinkD．P．L．，HuismanM．J．，HuttingaH．andGoldbachR．．Expressionofthepotatoleafrollluteoviruscoatproteingeneintransgenicpotatoplantinhibitsviralinfection．PlantMolecularBiology，1997，17：431-439VanRegenmortel，M．H．V，Fauquet，C．M．，Bishop，D．H．L，Carstens．VirusTaxonomyClassificationandNomenclatureofViruses。SeventhReportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses．AcademicPress，California,USA．2000．VanitharaniR．，ChellappanP．andFauquetC．M．．ShortinterferingRNA-mediatedinterferenceofgeneexpressionandviralDNAaccumulationinculturedplantcells．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,USA，2002，100(16)：9632—9636VargasM．，Martinez-GarciaB．，Diaz—RuizJ．R．andTenlladoF．．TransientexpressionofhomologoushairpinRNAinterfereswithPVYtransmissionbyaphids．VirolZ，2008，5：42VoinnetO．，LedererC．andBaulcombeD．C．．AviralmovementproteinpreventsspreadofthegenesilencingsignalinNicotianabenthamiana．Cell，2000，103：157-167Voinnet0．，VainP．，AngeUS．andBaulcombeD．C．．Systemicspreadofsequence-specifictransgeneRNAdegradationinplantsisinitiatedbylocalizedintroductionofectopicpromoterlessDNA．Cell,1998，95：177-187WangM．B．，AbbottD．C．andWaterhouseP．M．．Asinglecopyofavirus-derivedtransgeneencodinghairpinRNAgivesimmunitytobarleyyellowdwarfvirus．Molecularplant 山东农业大学硕士学位论文pathology，2000，1：347-356WangM。B．，AbbottD．C．andWaterhouseP．M．．Intron—mediatedimprovementofaselectablemarkergeneforplanttransformationusingAgrobacteriumtumefaciens．』GeneLBreed,1997，51：325—334WaterhouseP．M．andGrahamM．W．．VirusresistanceandgenesilencinginplantsCanbeinducedbysimultaneousexpressionofsenseandantisenseRNA．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA，1998，95：13959—13964WesleyS．V．，HelliwellC．A．，SmithN．A．，WangM．，RouseD．T．，LiuQ．，GoodingP．S．，singhS．P．，AbboaD．，StoutjesdijkP．A．，RobinsonS．P．，GleaveA．P．，GreenA．G．andWaterhouseP。M。Constructdesignforefficient，effectiveandhigh-throughputgenesilencinginplants．PlantJournal,2001，27：581-590YamaguchiT．，YasuoS．，IshiM．．Studiesonricestripedisease，III．Studyonvarietiesresistancetostripediseaseofriceplant．JVent．AgrExp．Sta．1965，(8)：109-160YamashitaS．，DoiY，YoraK。Intercelluarappearanceofricestripevirus．AnnualsofthephytopathologicalsocietyofJapan，1985，51(5)：637—641YinG．H．，SunZ．N．，LiuN．，ZhangL．，SongY．Z．，ZhuC．X．andWenF．J．．Productionofdouble—strandedRNAforinterferencewithTMVinfectionutilizingabacterialprokaryoticexpressionsystem．Appl．Microbi01．Biotechn01．，2009，DOI10．1007／s00253--009--1967-·YYoshinariK．，MakotoM．andKazunariT．．EffectsonRNAiofthetightstructure，sequenceandpositionofthetargetregion．NucleicAcidsResearch，2004，32：691-699YoungS．L．andRichardC．W．．MakingabetterRNAivectorforDrosophila：useofintronspacers．Methods，2003，30：322-329YuJ．Y．，WangT．W．，VojtekA．B．，ParentJ．M．andTurnerD．L．．UseofshorthairpinRNAexpressionvectorstostudyMammalianneuraldevelopment．MethodsinEnzymology,2005，392：186-199ZaitlinM．，AndersonJ．M．，PerryK．L．，ZhangL．andPalukaitisP．．Specificityofreplicase-mediatedresistancetocucumbermosaicvirus．ArchivesofVirology,1994，201：200．20565 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究ZamoreP．D．．AncientPathwaysProgrammedbySmallRNAs．Science，2002，296(17)：1265．1269ZhangD。Y。，ZhuC．H．，ChengF．X．，HeM．Y．，ZhangZ．H．andLiuY．．CrudeextractsofbacteriallyexpresseddsRNAcanbeusedtoprotecttobaccosagainstCMVinfections．ActaPhytopathologicaSinica，2008，38：304·31ZhuC．X．，SongY．Z．，YinG．H．andWenF．J．．InductionofRNA-mediatedMultipleVirusResistancetoPotatovirusY，TobaccomosaicvirusandCucumbermosaicvirus．■P坶topathology，2009，157：101—107 山东农业大学硕士学位论文致谢本研究从选题、确定技术路线和开展，到研究结果的分析整理及后期的论文撰写，离不开温孚江教授和朱常香教授的悉心指导，无不凝聚着两位老师的心血与智慧。回首过往三年，若非两位老师的谆谆教诲，愚钝小儿，难堪大用。在两位老师的教育影响下，学生不仅是完成学业，更重要的是我从两位老师身上学到的能使我受益终生的为人之道。温老师丰神俊朗，气度俨然，博闻强识，泰而不骄，犹如入世之旗帜，为学生指明前进方向，以布为旗，可以知方向；以师为旗，可以知正道。朱老师才华横溢，一丝不苟，精益求精，求真务实，犹如人生之卡尺，为学生纠正错误，以骨为尺，可以知长短；以师为尺，可以纠不足。学生对两位老师的感激之情是无法用语言表达的。作物抗病毒基因工程实验室自建立以来，培养了无数优秀学子，他们为实验室的发展做出了巨大贡献，学生之所以能在这样一个先进，舒适的环境中进行学习实验离不开他们的心血，在这里请接受我真诚的谢意!特别感谢宋云枝老师，她不仅在学业给我以精心指导，更在生活对我无微不至的关怀，让在外求学的我感受到母亲般的关怀。在此向宋老师致以诚挚的谢意。我还要感谢孙兆楠师姐、吴斌师兄、谢雪迎师姐、袁彤彤师姐、韩全军师兄、刘秀芳师姐、姜雅元师姐在我读研期间对我的照顾，无论从学习还是生活上，他们都给予我无私的帮助。感谢范志航、孙林、王赛寒、毕吕杰、邢芳雨、王宁、郑新新对我的帮助，感谢这段让我终生难忘的求学历程。感谢植物保护学院领导及全体老师的理解和支持。感谢植物保护学院研究生会的所有同僚，与你们一起工作是我一生弥足珍贵的经历。感谢我的家人，特别是我的父母对我的支持和帮助。感谢我的父母，您们的辛苦工作为我提供的支持让我可以心无旁骛的完成求学之路。感谢参加本论文评阅、答辩和对本论文提出宝贵建议的所有专家和同行。67 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究攻读学位期间发表论文情况RunzeSun，ZhaonanSun，XueyingXie，ChangxiangZhu，FujiangWen．DifferentAbilitiesofDeliveryWaysfordsRNAExpressedbyBacteriatoProtectTobaccofromCo．infectionwithPVYandTMV．JASAVolume2．Issue2Jun．2013PP．57．60Yun-ZmSong，Quan—JunHan，FangJiang，Run-ZeSun，Z11i-HangFan，Chang-XiangZhu，Fu-JiangWen．EffectsofthesequencecharacteristicsofmiRNAsonmulti-viralresistancemediatedbysingleamiRNAsintransgenictobacco．PlantPhysiologyandBiochemistry77(2014)90．98． 山东农业大学硕士学位论文附录附录1常见培养基的配制1．LB培养基2．SOB培养基(100mL)3．SOC培养基酵母粉5g／L胰蛋白胨10g／LNaCl10g／LpH7．0(固体加1％琼脂粉)Bacto⑧胰蛋白胨2．0gBacto@酵母抽提物0．5g】MNaC】1mL1MKCl0．25mLBacto@胰蛋白胨2．0gBacto@酵母抽提物0．5glMNaCIlmL1MKCl0。25mL2MM92+母液，过滤灭菌(按下法配制)1mL2M葡萄糖，过滤灭菌1mL将Bacto@胰蛋白胨、Bacto⑧酵母抽提物、NaCl及KCl加到97mL的去离子水中，搅拌使之溶解。高压灭菌并冷却到室温。加入2MM孑+母液和2M葡萄糖至终浓度20mM。补加消毒蒸馏水至100mL，最终pH值为7．0附录2常见缓冲液制备—_TEpH7．410mmol／LTris。C1(pH7．4)1mmol／LEDTAQH8．O)pH8．010mmol／LTris。CI(pH8．O)1mmol／LEDTA(pH8．0)——O．5MEDTAQH8．O)NaEDTA186．1g6Q 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究水800ml用NaOH(约20g)调PH=8．0，定容至1L，高压灭菌。——1MTris．HCITris碱12．1g水80m1用浓HCI调PH=8．0(应使an,z,HCI后的溶液冷却至室温再最后调准PH值，定容至100mL，高压灭菌保存。——10％SDSNaSDS50g水400ml68℃搅拌至完全溶解，定容到500mL，用HCI调PH=7．2。—一20xSSC在800ml水中溶解175．39NaCl和88．29柠檬酸钠，加入数滴HCl，调节pH值至7．0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。——IPTG母液(0．1M)1．2克IPTG补加水至终体积50ml，过滤灭菌并贮存在．20℃冰箱中。杂交过程中常用溶液的配制：1．DETA0．2M．PH=8．02．TBE(5×)200ml"irisBase10．89硼酸5．59O．1MEDTA20ml此电泳液为转膜电泳使用。3．10％SDS(十二烷基磺酸钠)50mlSDS(呛人)5968℃搅拌至完全溶解定容到ml，用Hcl调节PH值到7．2。4．TEPH=8．0(20℃)10mMTris—HCl0．1mMEDTA5．带正电的尼龙膜7n 山东农业大学硕士学位论文6．RNA稀释缓冲液(RNAdilutionbuffer)，用于稀释RNA探针DEPC处理的ddH20：20xSSC．．37％甲醛=5：3：2最好现用现配。7．洗膜缓冲液(Washingbuffer)，用于除去非特异性结合的抗体。0．1M顺丁烯二酸0．15MNaCl0．3％(VⅣ)Tween20将上述两种在适量的DEPC处理的ddH20中溶解，调节PH=7．5，然后加入Tween20，室温保存。8．顺丁烯二酸缓冲液(Maleicbuffer)，用于稀释封闭液。O．1M顺丁烯二酸0．15MNaCl用NaOH(固体)调PH=7．5，室温保存。9．检测缓冲液(Detectionbuffer)0．1M嘣s—HClO．1MNaCl调节PH=9．5，室温保存。10．10×MOPS，PH=7．0(用NaOH调PH值)1000ml的配方200mMMOPS41．86950mMNaAC6．8920mMEDTA7．449过滤灭菌，避光保存。11．上样缓冲液没(现用现配)500ul250ul100％甲酰胺831ll37％甲醛50ul10×MOPS50ul100％甘油10ul2．5％溴酚蓝57ulDEPC·ddH2012．PAGE胶溶液：71 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究14．20×SSCNacl87．659柠檬酸钠44．19要先定容到500ul，再用1MHCl调节PH=7．0，再过滤，最后灭菌。2xSSC0．1％SDS0．1xSSC0．1％SDS15．杂交袋16．封闭液：用10x封闭液稀释，稀释用顺丁烯二酸缓冲液。现用现配，用于封闭膜上的非特异结合位点。5％(州)SDS17mmol／LNa2HP048mmol／LNaH2P04室温保存，如果需要，用0．45urn的滤膜除菌。17．4xBPBloadingbuffer配方：50％glycerol(甘油)50ml0．03％溴酚蓝0．03950mMTrisPH7．75mloflL贮存液50mMEDTAlmlof0．5M贮存液DEPC·I-120100ml18．3％H202溶液：体积比为3％。附录3常用化学试剂、分子生物学试剂T4DNA连接酶、各种限制性内切酶购于大连宝生：载体pGEM圆．TEasy购自普洛格林公司；DIGNorthernStarterKit试剂盒购于Roche公司："raqDNA聚合酶、DNA和dsRNAMarker、质粒小提试剂盒均购自Genestar公司；KOD．plus酶购自上海东洋纺生物科技有限公司；DNA产物纯化试剂盒购于TIANGEN公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于TIANGEN公司；Hybond．旷尼龙膜购于Amersham公司；Trizol(15596．026)购于Invitrogen公司；甲酰胺、伊巯基乙醇、3．(N．吗啉代)丙硫酸(MOPS)等化学试剂购 山东农业大学硕士学位论文附录5pGEM⑩-TEasy载体图和相关序列位点附录6克隆的基因序列RBSDVCP基因序列6,470778B9。9710911812714tATGGCTGACATAAGACTCGACATAGCGCCCGATCl’TATCCATAATGGTGTACCCCAGAGACTTTCCGAlACAATAATTTTGAACAACCGACCAACAATCACTCTGCTATCTCATTTCAACAATCTATTTCATGAATTAAACATTGTCAAATCGCCCCACGTTGCATCTTCCCAAACTACCGTTAATTTGTAC√盯TC(汀AAGCATTTGTTGACCCGACTTCATGATAGACTGCAAACCGTAGAAACTAGCACTTTACCCAACATCACGCAACTTAAAGACCATATTCGTAGCTCCTTTCAAAATGAACACCAACCTATTTTCCAGACCCTAACGAACAATGACCTAAGTGAAGAAlTTGTAGGTGTGACTACTl、TTGGACTAAGCTTATTTGCTACCTCCAAACTTGATGCTGAACAAATAGAACGTGTACAAATTGAGACCCTAACTGAAGGAAATATTACl’TTGAAGCCTTTTTCCGCTGATGGTTTAGAAGTCATTCTCGATGATAGTTATATTGGTATAGTTGGTAAATTCCAGGTTTAGAAGTTCATAA73a髓，¨：}己={|已割∞啦媳蠊轮《鼍m呈^^器■- 原核表达dsRNA抗水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹病毒研究ATTGCTAGATAAATGTTG仃CGTGAAGTTCCTGCTCAAATGGGAATACTTACT(认TGAAGTTAAACTTTTGATGCGTACTG(汀AAA1_【1AAGAATTGATGGTGGTTACGATTTTAATTGTCCCGCAAGCACTACGGATGTTACACATTACGGTGGTTATGACCAATTTTCACGTCAAATGTTCGAACGTTTGAATCTATTTTACAATATTAGTCTTAGCATAATCCCCGTTTCAGCTTTGAAAACAGTTCATTTATTTGAAAAAGAACTAAGTGTTTTGGATGCAGATAAATCTTTACTCGAACAAACTTGGAGCGCAGTAGCGTCATTTGTTGAAACTTGGCAGGTTAAATCTAAAGTTAAAGCCGATGATCCAGATGAATATGAATTGACCAGTTTGTCCACGTTGCGCACTAATTACGATGGCACCTCTGCTTCTAGTCCTTTCACAGATAAGAAATTCATTGATTGGTACATTAAGACTTTTTCTAAAACTGAGAAAGGATCGTCGTTGCGTCGAAACGAATTAGAAGAGAAAGTGCCACTAGTACTCCAACTACAGTAAAGAAGGTTAAATTCATTTCTCCGTTCAGTATTTT(认TGAATTTAAAGTTAACGGACATGAAGAAAGCGTTGTAGTTCAAACTCATAAAGGCGAAATGACGTTAGATTATTATCGTAAAATTGGCGAAGTGTTAAGTGCTATTTGGAAACGTGGTAAATCTTTGGCTGTACCTTGTTTTGATTACATTAAGCTTGGCGTTGAGAAGCATTTCATTTAGCACCCGTAATTCTGAAGAAGTATAACTTGACTATTGATGATATTATCAACTTCATTGATAAGGACCTTCTTATTTAGCTAAATTAGACAAGATTGATGATTGGTCTTTAATTTCAAAGCTTATCATTACTAGCGTTTTACCTAATATCATTCAAGCTGTTTACAAACCGATCCAAGTAATAATGTTATGAACTCAGTAATTATCAGTAGAGCGAACAATTTGTTGAAATCTGATAGGGATAGGCTATTAAAGAAGGCACTTTCCGCCAACGTTTCTTCTTCTAACACATCTAGTCATGAGCATGTACAGAAGATAGTATTAAACAAAGTGACAAGATGARSVCP基因序列ArGGGCACCAACAAGCCAGCCACTCTAGCTGA订TGCAGAAGGCAArCAATGACATCTCCAAAGATGCGTTGTCTl’ACCTGACTGCTCp(I’AAAGCTGATGTTGTGACCTTTGCTGGTCAGAI：AGAGT—口GCAGGCTATGATGCTGCAACTCT(诈汀TGGCATp汀TGAAGGACAAAGGTGGTGACACACTGGCCAAGGATATGACTATGTGCATCACCArGAGAⅨrGTGAGAGGCACTGGCTTTGTGAGAGATGTCACTAAGAAAGTGAAAGTGGCAGCTGGAAGCACAGAGGCTTCGACCCTGGTGTCGAGGTATGGGAL～GTGTCCTCGGTGGGAACTAATGCCAATGCTATCACACTTGGAAGGCTGGCTCAGCTATTCCCAAATGTCTCACATGAAGTTGTGAGACAATCTCTGGTGTT久AGATGGCTGTGGACTCTTCTGAC74 山东农业大学硕士学位论文CTGGGACTAACAGGATGTGACAACTTACTGTGGGACTATGTTCCACAATATATCAAACTGGAGAGTGAAACAGCTCCTl’ACTGCACAACTCACTCCC瞰GTCACA订TTGTTTGTTGTGCACATCArTCACTCCTTCCAGp正AACCAAAAAAGACCATGCCAGAGGG7I：AAGAAGAAGGAGCGTGGTCTGACAAAAGACArAGACATGATGAAGTACACAACTGGTCTCCTGGTCATCACATGCAAGTCAAAGAACCTGGCTGACAAGAAGAAGGAAGATGGCAGAAAGAAGGTCTTA(“rGAp汀TCATCACCAATGGGAAAGTGAAGACCACAATCTTCGATGCGCTGGCTGG-IⅪGTCTGTCAATACGATCAGCACTTATGGGAATCAGACAAGGCTGl’ACTTGGCTCAACAGAGCAAACTGATGAA(讼TCCTTGCTGAGAACACTTCAAAGACAGCATCTGAAGTCAGCGGGTTGGTGAAGGAGTTCTTCGAGGACGAGGCAGAAGGTGCAGATGACTAG75