第13章 细胞衰老与凋亡.ppt

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第十三章细胞衰老与程序性细胞死亡 一、细胞衰老的概念与特征第一节细胞衰老(cellularaging)（一）概念：一般指复制衰老，即体外培养的正常细胞经过有限次数的分裂后，停止分裂，细胞形态和生理代谢活动发生显著改变的现象。1、1881年，魏斯曼指出细胞分裂能力是有限的。2、Carrel认为细胞永生不死。 3、Hayflick界限（1）实验证据：老男和少女细胞共同培养，显示细胞内部决定衰老。（2）概念：细胞、至少是培养的细胞，不是不死的而是有一定寿命的。它们的增殖能力不是无限的，而是有一定界限的。这就是有名的Hayflick界限。 体外培养细胞增殖与个体寿命的关系物种成纤维细胞传代数个体最长寿命（年）龟90-125175水貂30-3410鸡15-3530小鼠14-283.5人胚胎40-60110出生至15岁20-4015岁以上10-30早老病患者2-1010-20 味觉丧失64％肾小球减少44％肾小球过滤率减少31％脊神经元减少37％神经传导速度减慢10％脑供血量减少20％肺活量减少44％细胞在体内条件下的衰老～一名男子从36岁到75岁 高等动物体内存在了3种不同类型的细胞：接近于动物的整体寿命的细胞，如神经元和肌肉细胞等。在胚胎发育终了时，这些细胞不再增加数量，在个体的生长期中它们可增长细胞体积，以使其与躯体成比例。它们随着个体衰老而衰老，或者由于这些细胞的衰老、死亡引起个体死亡。缓慢更新的细胞，它们的寿命短于动物的平均寿命，如肝细胞，胃壁细胞等。快速更新的细胞，如皮肤的表皮细胞、红细胞和白细胞等。 1、细胞核的变化：（1）随着细胞分裂次数的增加不断增大；（2）核膜内折，染色质固缩化。（二）衰老的特征2、内质网的变化:衰老动物内质网弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了。 3、线粒体的变化:通常细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大。4、致密体的生成：溶酶体和线粒体转化来5、膜系统的变化：（1）膜流动性降低、韧性减小;（2）衰老细胞间间隙连接减少;（3）离子转运效率下降,兴奋性降低。 二、细胞衰老的分子机制(一)复制衰老(RS)的机制端粒缩短作为一种DNA损伤诱导p53的表达,继而诱导p21表达,抑制CDK活化,使得Rb不能被磷酸化,E2F持续失活,使G1/S的转换被停滞,从而阻断细胞周期的正常运行,引发复制型细胞衰老。 (二)胁迫诱导的早熟性衰老(SIPS)氧化损伤理论：代谢过程中产生的活性氧基团或分子引发的氧化性损伤积累导致衰老。(三)单细胞生物的衰老酵母染色体外rDNA环（ERC）的积累，导致细胞衰老。 （四）沉默信息调节蛋白复合物（Sircomplex）与衰老：Sircomplex存在于异染色质区，其作用在于阻断所在位点DNA转录。（五）SGS1基因和WRN基因与衰老：SGS1基因和WRN基因同源,编码解旋酶;酵母sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均9.5代:24.5代）;wrn突变引发早老症。（六）发育程序与衰老:（七）线粒体DNA与衰老:Sen-DNA(80年代);mtDNA突变积累与细胞衰老有关。 三、细胞衰老与个体衰老和癌症的关系(一)对于多细胞生物,特别是哺乳动物,现有的细胞衰老模型尚不能解释个体衰老。体外培养细胞与体内细胞差异巨大。（二）细胞衰老是有机体在长期演化过程中形成的防止细胞过度生长或癌化的一种保护机制。 早老症是人体衰老中的一种病症 研究发现，不论是单细胞生物还是多细胞生物，其细胞死亡往往受到细胞内某种由遗传机制决定”的死亡程序“控制，称为细胞程序性死亡（programmedcelldeath,PCD）。广泛存在于动物细胞、植物细胞、真菌细胞和细菌中。第二节程序性细胞死亡 （一）细胞凋亡(Apoptosis)1、概念和特征：（1）概念：指受基因控制的主动的生理性细胞自杀行为。（2）特征：一、动物细胞的程序性死亡 凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布。凋亡小体形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个凋亡小体。凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化。 2、生理意义：（1）对动物个体的正常发育，自稳态的维持，免疫耐受的形成，肿瘤监控等多种生理及病理过程有重要意义。（2）是一种生理性保护机制，能够清除体内多余、受损或危险的细胞。（3）细胞凋亡失调会引发多种疾病。 顺铂处理CaCl2溶液处理正常细胞坏死细胞3、细胞凋亡的检测方法（1）形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察。 鼠肝细胞AO/EB荧光双染 细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0h2．细胞色素c诱导1h3．细胞色素c诱导2h4．细胞色素c诱导3h5．细胞色素c诱导4h6．阴性对照7．Marker（2）DNA电泳：DNA片段呈现梯状条带。 （3）TUNEL测定法：对DNA断裂产生的3`-OH末端进行原位标记。（4）彗星电泳法（cometassay）：单细胞电泳（5）流式细胞分析：采用碘化丙啶使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞。 4、诱导细胞凋亡的因子（1）物理性因子，包括射线（紫外线，射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等。（2）化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子等。 5、细胞凋亡的分子机制(1)Caspase依赖性的细胞凋亡①Caspase概念：是一组存在于胞质溶胶的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们都能特异地断开天冬氨酸残基后的键，因此称为Cysteineasparticacicspecificprotease，Caspase。活化：除将Ｎ端肽段切除以外，还需在两个亚基连接区的Ａsp位点切割，形成两个亚基组成的异二聚体。凋亡起始者Caspase2,8,9,10,11同性活化.凋亡执行者Caspase3,6,7异性活化. caspase超家族成员及其相应底物 ②途径:死亡受体其始的外源途径和线粒体起始的内源途径。 ③Bcl-2家族Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡，延长细胞生存，而不是促进细胞增殖。Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1、BH2和BH3，它们是调节细胞凋亡以及蛋白质相互作用所必需的。 BCL-2家族成员 (2)Caspase非依赖性的细胞凋亡线粒体发挥关键作用：①凋亡诱导因子（AIF):位于线粒体外膜，凋亡时转移到细胞质内，进而进入细胞核，引起核内DNA凝集并断裂成50bp的片段。②限制性内切核酸酶G（EndoG）：Mg2+依赖性核酸酶，在线粒体中负责DNA的复制和修复。凋亡时，从线粒体释放进入细胞核，对核DNA进行切割，产生以核小体为单位的DNA片段。 (3)细胞凋亡的调控①Caspase抑制因子（IAP):直接与Caspase活性分子结合，阻抑其对底物的切割，包括c-IAP家族，c-FLIP，BAR，ACR，都含有由70个氨基酸残基组成的BIR结构域，是抑制凋亡必需的。②内源性凋亡激活因子：Smac/DIABLO和Omi/HtrA2，含有IAP结合结合基序（IBMs），能够与IAP结合并释放出被IAP封闭的Caspase。 细胞坏死与细胞凋亡（二）细胞坏死(necrosis)当细胞凋亡不能正常发生而细胞必须死亡噬，坏死作为凋亡的替补形式。 坏死细胞凋亡细胞 （三）细胞自噬(autophagy)1、寿命较短的蛋白质通过泛素－蛋白酶体系统降解；而寿命较长的细胞结构及蛋白质则通过细胞自噬途径，由溶酶体降解。2、细胞自噬的特征是细胞中出现大的双层膜包裹的自噬泡。3、生理状态下，细胞自噬种族要发生在个体遭遇营养危机时、胚胎发育和变态发育期间。4、当细胞凋亡所需的关键因子被抑制时，细胞发生自噬。 （一）植物细胞的程序性死亡（二）酵母细胞的程序性死亡二、植物细胞与酵母细胞的程序性死亡 胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径凋亡信号通路当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptorprotein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡。 下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNALadder;裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。 13.2.2细胞凋亡的形态学和生物化学特征1、细胞凋亡与坏死(necrosis)主要区别：细胞凋亡时质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然后逐渐分离，形成众多凋亡小体（apoptoticbodies），凋亡小体为邻近细胞吞噬。整个过程中质膜整合性好，细胞内容物不会逸散到胞外环境中，因而不引发炎症反应。相反，细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段释放到胞外，导致炎症反应。 细胞坏死与程序性细胞死亡比较 坏死细胞凋亡细胞 a正常T细胞杂交瘤细胞b凋亡细胞(扫描电镜)c凋亡细胞(透射电镜) Bcl-2、线粒体与细胞凋亡：当Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另一方面使Bad裂解成2个片段，其中含BH3结构域的C-端片段被运送到线粒体，与Bcl-2/Bax的BH3结构域形成复合物，导致细胞色素C释放。CytC与胞质中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor)结合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起细胞凋亡。哺乳动物细胞中发现的Apaf2即是CytC。 3、P53与细胞凋亡P53是肿瘤抑制基因，人类肿瘤有50%以上是由P53基因的缺失造成的。将P53重新导入转化细胞，可产生两种结果：生长阻遏或细胞凋亡。P53通过调节Bcl-2和Bax的表达来影响细胞凋亡。