《华南部分地区PRRSV流行病学调查及Nsp1α和Nsp1β的原核表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
学校代码：10564学号：2013202801分类号：S855.3密级：硕士学位论文华南部分地区PRRSV流行病学调查及Nsp1α和Nsp1β的原核表达白小磊王林川教授指导教师：张桂红教授学院名称：兽医学院专业名称：预防兽医学答辩委员会主席：黄淑坚教授中国·广州2016年6月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：学科带头人签名：日期： 摘要为了了解华南地区PRRSV的遗传变异情况及抗体水平，本实验对2014-2015年间收集的华南部分地区的猪血清和病料分别进行PRRSV抗体和抗原的检测，检测结果表明：2014共采集5046份猪血清，其中PRRSV抗体阳性血清为4195份，阳性率为83.13%（4195/5046）；95%置信区间为82.67%-83.59%；2015年共采集5531份血清，经检测PRRSV阳性血清共3992份，阳性率为72.18%（3992/5531），95%置信区间为70.38%-72.4%；2014年共采集病料583份，其中PRRSV检测为阳性的样本为192份，阳性率为33.01%（192/583），95%置信区间为32.78%-33.23%；2015年共采集病料964份，PRRSV检测阳性的样本数为356，阳性率为36.88%（356/964），95%置信区间为36.56%-37.2%，与2014年比较，2015年检测的PRRSV抗体阳性率有所下降而抗原的阳性率有所上升。研究又对PRRSV阳性样本进行Nsp2和GP5基因的扩增，成功地获得31条Nsp2序列和64个GP5序列，分析比对Nsp2和GP5基因的氨基酸序列后发现：其中26株PRRSV的Nsp2基因依然是29+1个氨基酸缺失，但也存在着其他形式的氨基酸位点的缺失。与参考毒株相比，GP5基因存在着广泛的氨基酸位点的突变，主要的突变区域为信号肽区、第一高变区以及第二高变区。GP5的遗传进化树结果表明：华南地区同时存在着欧洲型和北美型PRRSV，北美型PRRSV进一步分为6个亚群，华南地区主要流行的亚群是以JXA1为代表的SubgenotypeI亚群和以GM2为代表的SubgenotypeVI亚群，近几年新出现的NADC30-like亚群毒株在华南地区也有出现。分离、鉴定了10株PRRSV，10株PRRSV相互之间的核苷酸同源性为92.6%-97.5%，与JXA1、VR2332及CH-1R毒株的核苷酸同源性分别为95.3%-98.9%、87.8%-89.15%、91.5%-94.9%。基于全基因组的遗传进化树结果显示10株PRRSV除FJXM毒株属于过渡亚群Intermediatesubgroup外，其余均属于以JXA1为代表的JXA1-like亚群，彼此之间的亲缘关系较为密切。与参考毒株相比，部分毒株的GP3、GP5、GP6蛋白的抗原位点发生了氨基酸位点的突变。研究还对PRRSV的Nsp1α及Nsp1β基因进行扩增，将其连接到pET-28a表达载体后转化BL21感受态，经Westernblot验证Nsp1α及Nsp1β蛋白得到了成功表达。为后续研究Nsp1α及Nsp1β蛋白的功能奠定了基础。关键词：猪繁殖与呼吸综合征；ORF5；Nsp2；非结构蛋白；原核表达I EpidemiogicalinvestigationofPRRSVinpartsofSouthernChinaandprokaryoticexpressionofNsp1αandNsp1βBaiXiaolei(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract：ToanalyzethegeneticvariationandsurveytheantibodylevelofPRRSVinSouthernChinafrom2014to2015,inthisexperiment,werespectivelydetectedthePRRSVantibodyandantigeninserumandpathologicalsamplescollectedduring2014to2015fromSouthernChina.Testresultsshowedthat,In2014year,wecollected5046serumsamples,thePRRSVantibodypositivesampleswas4195,thepositiveratewas83.13%(4195/5046),95%confidenceintervalwas82.67%-83.59%.In2015year,wecollected5531serumsamples,thepositivesampleswas3992,thepositiveratewas72.18%(3992/5531),95%confidenceintervalwere70.38%-72.4%.In2014year,wecollected583samples,thePRRSVpositivesamplewas192,theantigenpositiveratewas33.01%(192/583),95%confidenceintervalwere32.78%-33.23%.In2015year,wecollected964samples,thePRRSVpositivesamplewas356,theantigenpositiveratewas36.88%(356/964),95%confidenceintervalwere36.56%-37.2%.Comparedwith2014,thepositiverateofantibodydecreasedwhilethepositiverateofantigenincreasedin2015.AmplificationofNsp2andGP5genesinPRRSVpositivesamples,31Nsp2sequencesand64GP5sequencesweresuccessfullyobtained.Aminoacidanalysisresultsshowedthat26of31Nsp2genescontained29+1aadeletions,buttherewerealsosomeotherformsofdeletionsinNsp2.Comparedwithreferencestrains,GP5geneshadawiderangeofaminoacidmutations,themainmutationdomainwereSignalpeptideregion,HVR1andHVR2.GP5phylogenicanalysisrevealedthatSouthernChinaexistingbothtypeIandtypeIIPRRSV,typeIIPRRSVfurtherdividedintosixsubgenotypes,themainepidemicsubgenotypesinSouthernChinawereSubgenotypeIandSubgenotypeVIrepresentedwithJXA1strainandGM2strain,respectively.TenstrainsofPRRSVwereisolatedandidentificated,thenucleotidehomologybetweentenstrainswas92.6%-97.5%,thenucleotidehomologywithJXA1,VR2332andII CH-1Rwere95.3%-98.9%,87.8%-89.15%,91.5%-94.9%,respectively.ThecompletegenomephylogenetictreeshowedthattenstrainsexceptFJXMstrainsallbelongedtoJXA1-likesubgroupandhadacloselyrelationshipwitheachother,whiletheFJXMstrainbelongedtoIntermediatesubgroup.Comparedwithreferencestrains,theantigenepitopeofGP3,GP5andGP6proteinshadsomeaminoacidmutationsites.AmplificationoftheNsp1αandNsp1βgenesofPRRSVandconnectedtopET-28aexpressionvector,thentherecombinantplasmidweretransformedintoBL21competentcells,finally,thePRRSVNsp1αandNsp1βproteinsweresuccessfullyexpressedinE.coli,meanwhilewealsooptimizetheexpressionconditions,thiswillprovideamaterialbasisforfurtherstudyofNsp1αandNsp1βproteins.Keywords:PRRSV,ORF5,Nsp2,nonstructuralprotein,prokaryoticexpressionIII 英文缩写对照表英文缩写英文全称中文全称及注释aaAminoacid氨基酸AmpAmpicillin氨苄青霉素Bp,kbBasepair,Kilobasepair碱基对，千碱基对CPECytopathiceffect细胞病变DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸DMEMDulbecco’sModifiedEagleMedium改进的Eagle培养基ELISAEnzyme-linkedImmunosorbentAssay酶联免疫吸附试验EBEthidiumbromide溴化乙锭FBSFetalbovineserum胎牛血清FITCFluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IFAIndirectimmuneoffluoresenceassay间接免疫荧光试验LBLuria-BertanimediumLB培养基mol/Lmole/liter摩尔/升ntnucleotide核苷酸Nspnonstructuralprotein非结构蛋白ORFOpenreadingframe开放阅读框PAMsPorcineAlveolarMacrophages猪肺泡巨噬细胞PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction多聚酶链式反应RERestrictionendonuclease限制性内切酶rpmrotateperminute转/分RNARibonucleicacid核糖核酸sec,min,hsecond,minute,hour秒，分钟，小时sgmRNASubgenomicmRNA亚基因组mRNAμl,mL,LMicroliter,milliliter,liter微升，毫升，升IV μg,mg,gMicrogram,milligram,gram微克，毫克，克IPTGIsopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷KanKanamycin卡那霉素V 目录1前言.....................................................................................................................................11.1PRRSV病原学.................................................................................................................11.1.1PRRSV的分类地位及基因组结构..............................................................................11.1.2PRRSV的形态结构及理化性质..................................................................................11.1.3PRRSV的结构和非结构蛋白......................................................................................21.1.4PRRSV的非结构蛋白..................................................................................................41.1.5PRRSV的基因分型......................................................................................................51.2PRRSV的流行病学特征.................................................................................................51.2.1PRRSV的宿主及临床症状..........................................................................................51.2.2PRRSV的病理变化......................................................................................................61.2.3PRRSV的传播途径......................................................................................................61.2.4PRRSV的疫苗与防控措施..........................................................................................61.3PRRSV的遗传变异.........................................................................................................71.3.1RNA病毒的复制特性..................................................................................................71.3.2准种现象.......................................................................................................................71.3.3基因重组.......................................................................................................................81.4本研究的目的与意义......................................................................................................82材料与方法.......................................................................................................................102.1病毒、菌株、载体及细胞............................................................................................102.2细胞培养相关试剂........................................................................................................102.3工具酶、试剂盒及主要的分子生物学试剂................................................................102.4检测样品........................................................................................................................102.5仪器设备........................................................................................................................112.6PRRSV血清抗体的检测..............................................................................................112.7引物的设计与合成........................................................................................................122.8样品的RT-PCR检测....................................................................................................132.8.1总RNA的提取...........................................................................................................132.8.2cDNA的合成..............................................................................................................14VI 2.8.3PCR扩增.....................................................................................................................142.8.4PCR回收产物与载体连接.........................................................................................152.8.5感受态细胞的制备.....................................................................................................152.8.6连接产物转化感受态细胞.........................................................................................152.8.7PCR鉴定阳性菌液.....................................................................................................152.8.8ORF5及部分Nsp2基因测序结果分析.....................................................................152.9病毒的分离与鉴定........................................................................................................172.9.1病毒的分离.................................................................................................................172.9.2分离病毒的PCR鉴定...............................................................................................172.9.3分离病毒的间接免疫荧光鉴定.................................................................................172.9.4分离病毒的全基因组测序.........................................................................................182.9.5分离病毒的全基因组序列分析.................................................................................182.10PRRSVNsp1α及Nsp1β的原核表达...........................................................................182.10.1Nsp1α及Nsp1β的扩增..............................................................................................192.10.2PCR扩增产物的纯化...............................................................................................192.10.3目的片段与载体的双酶切.......................................................................................192.10.4目的片段与载体的连接...........................................................................................202.10.5大肠杆菌感受态细胞的制备....................................................................................202.10.6重组质粒的转化........................................................................................................202.10.7重组质粒的抽提........................................................................................................202.10.8重组质粒的酶切鉴定...............................................................................................212.10.9重组质粒序列的测定...............................................................................................212.10.10重组质粒转化感受态细胞.....................................................................................212.10.11重组蛋白的诱导表达及可溶性分析.....................................................................212.10.12重组蛋白SDS-PAGE鉴定....................................................................................212.10.13重组蛋白最佳诱导时间的确定.............................................................................222.10.14重组蛋白最佳IPTG诱导浓度的确定..................................................................222.10.15重组蛋白Western-Blot鉴定..................................................................................223结果...................................................................................................................................243.12014-2015年华南部分地区PRRSV抗体检测结果....................................................24VII 3.22014-2015年华南部分地区PRRSV抗原检测结果....................................................243.32014-2015年部分Nsp2基因氨基酸比对分析............................................................253.42014-2015年GP5基因遗传进化分析.........................................................................263.52014-2015年GP5基因氨基酸同源性分析.................................................................283.62014-2015年GP5基因氨基酸突变位点分析.............................................................283.7欧洲型PRRSVGP5遗传进化及突变分析.................................................................313.8病毒的分离鉴定............................................................................................................323.9PRRSV全基因组的扩增...............................................................................................323.10PRRSV全基因组的遗传进化分析.............................................................................333.11分离毒株全基因组的同源性分析..............................................................................353.12分离毒株Nsp2及GP3/GP5/GP6基因氨基酸突变位点分析..................................373.13分离毒株Nsp9/Nsp10基因氨基酸突变位点分析....................................................383.14Nsp1α及Nsp1β的扩增.................................................................................................383.15重组质粒的酶切鉴定..................................................................................................393.16重组质粒的表达与可溶性分析..................................................................................393.17重组蛋白的最佳诱导时间的确定..............................................................................403.18重组蛋白的最佳IPTG诱导浓度的确定...................................................................413.19重组蛋白Western-blot鉴定........................................................................................424讨论....................................................................................................................................434.12014-2015年华南部分地区PRRSV抗体和抗原的检测............................................434.2Nsp2和GP5基因遗传进化与变异分析......................................................................434.3PRRSV的分离鉴定及全基因组序列分析...................................................................444.4PRRSVNsp1α和Nsp1β的原核表达.............................................................................455全文总结...........................................................................................................................46致谢...............................................................................................................................47参考文献.........................................................................................................................48VIII 1前言猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起的一种世界范围内流行的传染病。PRRSV具有严格的宿主和组织嗜性，主要感染猪单核细胞系尤其是猪肺泡巨噬细胞（PAM）（Villarrealetal.,2000；Duanetal.,1997）。20世纪80年代末在欧洲和美洲首次出现，被命名为“神秘病”，临床症状主要表现为不同年龄段猪群的呼吸道症状以及妊娠母猪的繁殖障碍（Wensvoortetal.,1991；BaronTetal.,1992；Collinsetal.,1992；Hopperetal.,1992；Morinetal.,1991）。PRRSV可分为欧洲型和美洲型两个不同的基因型，2个基因型之间的核苷酸约有40%的不同（Wensvoortetal.,1991；Benfieldetal.,1992；Collinsetal.,1992；Meulenbergetal.,1994；Nelsenetal.,1999）。自首例PRRSV出现后，PRRSV已在世界范围内流行且其基因组会不断发生突变和重组，是威胁世界养猪业健康发展的重要疫病之一（Murtaughetal.,2010；Goldbergetal.,2003；Meng,2012）。1.1PRRSV病原学1.1.1PRRSV的分类地位及基因组结构PRRSV为尼多病毒目成员，与猴出血热病毒（SHFV）、鼠乳酸脱氢酶病毒（LDV）、新发现的颤抖的负鼠病病毒（WPDV）以及马动脉炎病毒（EAV）均归属于动脉炎病毒科（Plagemannetal.,1992；Dunowskaetal.,2012）。，，PRRSV为单股正链RNA病毒，基因组长度约为15kb，5端具有cap结构3端具有ploy（A）尾，编码至少14种非结构蛋白（nonstructuralprotein,nsp）和8种结构蛋白（Ziebuhretal.,2000；denBoonetal.,1995；Snijderetal.,2013；vanAkenetal.,2006）。基因组为多顺反子结构，分别编码ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-7以及位于ORF5内部的ORF5a。ORF1a、ORF1b分别编码两个大的多聚蛋白pp1a和pp1ab（Snijderetal.,2013），而pp1a和pp1ab可进一步被分割产生16个非结构蛋白，其中pp1a编码nsp1-8，pp1ab编码nsp1α、nsp1β、nsp2-6、nsp7α、nsp7β以及nsp8-12（Hanetal.,2009；Snijderetal.,2013）。ORF2a/b编码GP2蛋白和E蛋白，ORF3编码GP3蛋白，ORF4编码GP4蛋白，GP5蛋白由ORF5基因编码，ORF5a编码ORF5a蛋白，而M及N蛋白分别由ORF6和ORF7编码（Wissinketal.,2005；Dasetal.,2010）。1.1.2PRRSV的形态结构及理化性质1 早期的负染及薄片电镜观察显示，PRRSV为一个表面光滑、直径约60nm的近球形/卵圆形颗粒。冷冻电子显微镜观察显示病毒粒子为圆形或卵圆形，直径约在50nm-74nm之间，病毒粒子表面较为光滑但存在一些小的突起，小的突起为病毒的包膜蛋白GP5和M，病毒囊膜的脂质双分子层在电镜下清晰可见，厚度约为4.5nm（Mardassietal.,1994；Deaetal.,1995；Dokland,2010）。PRRSV在pH6.0-7.5时较为稳定，如果环境pH低于6.0病毒即失去复制能力，当环境的pH维持在7.5时，PRRSV在-20℃-70℃可长期稳定地存活而在4℃放置140h即可使半数的病毒粒子失活。病毒在氯化铯中的浮力密度为1.18-1.20g/mL，在蔗糖中的平均密度为1.15g/cm3。病毒粒子无血凝活性（Patonetal.,1991；Mardassietal.,1994）。1.1.3PRRSV的结构和非结构蛋白PRRSV基因的复制遵循尼多病毒目病毒复制的常规方式，即先合成一组套式负，链亚基因组mRNA，每个负链亚基因组mRNA都含有一个共同的5调控序列，并通，过不连续转录的方式在3端连接不同的亚基因组mRNA序列，以生成的负链亚基因组mRNA为模板合成正链亚基因组mRNA，然后翻译成各种结构蛋白（Yuanetal.,2000；Gorbalenyaetal.,2006；vanHemertetal.,2008；Yuanetal.,2004）。图1.1PRRSV基因组结构示意图（Kappesetal.,2015）GP2a和E蛋白：PRRSV的GP2a和E蛋白分别由ORF2a和ORF2b编码，GP2a为I类膜蛋白大小约29KD-30KD，N端具有信号肽，C端为膜锚定序列，含有2个糖基化位点，GP2a可与CD163受体相互作用从而影响病毒的吸附（Dasetal.,2010；Wissinketal.,2004）。E蛋白大小约为10KD，N端含有N-myristoylation以及casein2 kinaseII磷酸化位点，中间为疏水性区域，疏水性的C端含有较多的碱性碱基。E蛋白是一种离子通道蛋白，是PRRSV感染和复制的必需蛋白，同时E蛋白还对PRRSV感染PAM细胞后引起的炎性介质的激活起到重要的作用（Zhangetal.,2013；Wissinketal.,2005）。GP3蛋白：GP3蛋白大小约为42KD，含有7个糖基化位点（Goninetal.,1998），其中42位、50位以及131位糖基化位点对于PRRSV的感染起到重要作用，而缺失了GP3蛋白131位及GP5蛋白51位糖基化位点的PRRSV毒株对PRRSV中和抗体的敏感性大大提高，这表明PRRSV可能通过GP3和GP5糖基化位点的遮蔽作用而实现免疫逃逸（Goninetal.,1998；Jiangetal.,2007；Mardassietal.,1998）。Kim等的实验表明，GP3蛋白定位于细胞的内质网，可能对于病毒的蛋白组装发挥重要的作用。Chen等的实验又确定GP3蛋白上存在两个B细胞抗原位点分别为：T59RQAAAEILE68和H87DELGFMV94（Kimetal.,2013；Chenetal.,2014）。GP4蛋白：GP4蛋白由ORF4基因编码大小约为31KD，GP4蛋白和GP2以及GP3形成多聚蛋白对于PRRSV的侵入起到重要作用，同时GP4蛋白可与CD163分子相互作用对病毒侵入发挥作用。GP4蛋白含有4个糖基化位点，糖基化位点的突变并不会影响病毒的拯救但会增加病毒基因组的致死性突变（Dasetal.,2011）。GP5蛋白：GP5蛋白由ORF5编码，含有200个氨基酸大小约为25KD，含有3个跨膜区，C端含有一个亲水区（Gagnonetal.,2003；Costersetal.,2008）。GP5和M通过二硫键相连接从而形成二聚体结合于PRRSV的硫酸肝素受体，对病毒的吸附过程有重要影响（Delputteetal.,2002）。GP5为糖基化的囊膜蛋白，也是PRRSV结构蛋白中变异程度最大的蛋白之一，含有两个主要的线性抗原表位：37SHLQLIYNL45和36SSHLQLIYNLTLCELNG52，常作为PRRSV分子流行病学调查的靶基因之一（Caoetal.,2014；Plagemann,2004），GP5的13、151位氨基酸位点被认为是区分病毒毒力强弱的标志性氨基酸位点（Zhouetal.,2009）。GP5蛋白在PRRSV的装配、入侵以及免疫反应等方面发挥重要作用（Zhaoetal.,2005；Doveetal.,2006）。M蛋白：M蛋白由ORF6编码，是PRRSV结构蛋白中最保守的蛋白之一。N端含有一个短的胞外区，3个跨膜区，胞外区不含有信号肽和糖基化位点（deVriesetal.,1992）。M蛋白和GP5蛋白形成二聚体复合物从内质网内转运到高尔基体，然后组装进入病毒粒子（Snijderetal.,2003）。Benjamin等的实验表明，M蛋白的第10位氨基酸对于PRRSV病毒的广泛性中和抗体的产生发挥重要作用（Tribleetal.,2015）。3 N蛋白：N蛋白由ORF7编码，为PRRSV的核衣壳蛋白。N蛋白含有5个重要的抗原表位区域分别为30–52aa、37–52aa、52–69aa、69–112aa以及112–123aa，其中靠近C端的112–123aa对于N蛋白结构的形成产生重要影响（Woottonetal.,1998；Rodriguezetal.,1997）。N蛋白含有一个隐含的核定位序列即NLS-1、一个功能性核定位序列即NLS-2以及一个核仁定位序列NoLS（Rowlandetal.,2003；Doanetal.,2003）。1.1.4PRRSV的非结构蛋白Nsp1α：Nsp1α蛋白含有3个结构域分别为：N端的锌指结构域、木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶结构域以及C端的延伸结构域（Darwichetal.,2011）。Nsp1α被认为与PRRSVRNA的合成有关，针对Nsp1α设计的SiRNA可以显著地降低PRRSV在Marc-145细胞上的复制能力（Shietal.,2015）。Huang等的实验发现Nsp1α可以调节PRRSV感染后细胞的IFN-β的表达（Huangetal.,2014）。Du等的实验表明Nsp1α可以与PAM细胞中的SLA-I分子相互作用，在PRRSV感染PAM细胞过程中发挥作用（DuJetal.,2015）。Nsp1β：Nsp1蛋白在第180位氨基酸发生切割产生两个亚基，分别为Nsp1α和Nsp1β，Nsp1α较为保守而Nsp1β则相对较为多变，Nsp1β的Cys276和His345是其关键的氨基酸作用位点（Kroeseetal.,2008；Sunetal.,2009）。Nsp1β可发挥多种作用，在抑制宿主的天然免疫以及激活宿主细胞的PRF信号通路的过程中发挥重要作用。Li等的实验表明位于Nsp1β中的123GKYLQRRLQ131结构域内的R128及R129位氨基酸对于PRRSV在机体内的增殖以及诱导机体的天然免疫应答和适应性免疫应答过程中发挥关键作用（Lietal.,2016）。He等的实验表明Nsp1β对于PRRSV体外诱导TNF-α的表达起到调节作用（Heetal.,2015）。Nsp2：Nsp2是PRRSV众多非结构蛋白中最多变的蛋白，Nsp2蛋白的中间区域存在多种形式的氨基酸位点的缺失（Roppetal.,2004；Darwichetal.,2011；Fangetal.,2007）。Nsp2蛋白含有4个结构域分别为：N端的木瓜蛋白酶结构域、非特异性中心功能区、C端的疏水区以及保守的C端末尾（Ziebuhretal.,2000；Fangetal.,2006）。Nsp2蛋白可在感染的细胞内大量表达，与Nsp3及Nsp5共同作用以调节感染细胞的细胞膜结构、调节病毒复制过程中多聚蛋白的组装。Nsp2还可作为Nsp4的辅助因子（Snijderetal.,2001；Pedersenetal.,1999）。有的实验表明Nsp2可能是病毒的一种结构蛋白（Kappesetal.,2013），这正好可以解释PRRSV的阳性血清中存在着针对Nsp2的中和抗体（Oleksiewiczetal.,2001；deLimaetal.,2006）。4 Nsp4:Nsp4是一种糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，含有一个三联的催化结构域，可以对Nsp3和Nsp12进行切割，是一种重要的蛋白激酶（Wassenaaretal.,1997；vanDintenetal.,1996）。Chen等发现高致病性PRRSVJXWn06毒株与低致病性毒株HB-1/3.9相比其Nsp4可以显著地抑制机体IFN-β、NF-κB以及IRF3细胞因子的表达，而Nsp4的这种抑制作用依赖其第155位氨基酸（Chenetal.,2014）。Nsp9和Nsp10：Nsp9为高度保守的RNA依赖性的RNA聚合酶蛋白是PRRSV基因复制和转录所必须的，Nsp10为解旋酶，其末端含有一个金属络合区结构域（Wassenaaretal.,1997），Zhang的实验表明Nsp10的第227位丙氨酸对于其发挥解旋酶的作用至关重要（Zhangetal.,2015）。有的实验表明Nsp9可以和多种细胞因子相互作用从而促进PRRSV的复制（Dongetal.,2014）。最近，Li等的实验表明Nsp9和Nsp10共同作用可以提高中国HP-PRRSV毒株的致病性（Lietal.,2014）。Nsp11和Nsp12：Nsp11蛋白具有核糖核酸内切酶活性，而这种内切酶活性在尼多病毒目病毒中是较为保守的（Nedialkovaetal.,2009）。Wang等的实验表明Nsp11可以抑制HEK293细胞中IRF-3和IFN-β的转录（Wangetal.,2015）。Nsp12的具体功能至今尚不清楚。1.1.5PRRSV的基因分型目前，PRRSV共可分为2个基因型：即以Lelystad毒株为代表的TypeI型，主要分布在欧洲国家和地区；以VR-2332毒株为代表的TypeII型，主要分布在北美以及亚洲地区，TypeI和TypeII型毒株的基因同源性约为60%（Wensvoortetal.,1991；Benfieldetal.,1992）。1.2PRRSV的流行病学特征1.2.1PRRSV的宿主及临床症状猪是PRRSV感染的唯一宿主动物，病猪和带毒猪是本病的主要传染源，各个年龄段和品种的猪群均可感染。PRRSV主要入侵血液单核细胞（BMo）以及猪肺泡巨噬细胞（PAM），CL2621、MA-104以及MARC-145细胞系亦可以感染PRRSV，常作为体外研究实验的细胞系（Snijderetal.,1998；Hedgesetal.,2001；Mardassietal.,1994；Plagemannetal.,1992；Snijderetal.,1998）。PRRSV可导致怀孕母猪流产、产死胎、木乃伊胎，仔猪表现明显的呼吸道症状。2006年中国爆发了以JXA1毒株为代表的HP-PRRSV疫情，其基因组在Nsp2位置发生了5 30个氨基酸的缺失，与经典毒株相比，HP-PRRSV主要的临床表现为：感染猪只体温较高可达40-42℃；皮肤发红、血斑、瘀点、红斑皮疹；抑郁、厌食、咳嗽、哮喘、跛行；颤抖；呼吸衰竭；感染猪群死亡率较高（Zhouetal.,2008；Guoetal.,2012；Tianetal.,2007；Tongetal.,2007）。1.2.2PRRSV的病理变化剖检后可以发现：病猪肺部发生增生性病变、肺水肿、肺部有出血点、斑；脾脏梗死、膀胱充满褐色尿液；肾脏有出血点、斑；心肌坏死；肝脏出血、出现黄白色坏死点；脑组织软化；淋巴结出血明显；关节肿胀；肠道有溃疡灶（Tianetal.,2007）。1.2.3PRRSV的传播途径PRRSV既可以垂直传播也可以水平传播，怀孕母猪可以通过胎盘将病毒感染胎儿，PRRSV感染后导致的持续性感染病猪是本病的一个重要传染源（Horteretal.,2002）。水平传播则可以通过多种途径的直接或间接接触来实现，精液、污染的器械、运输工具、昆虫媒介、气溶胶、新鲜肉制品等多种途径均可传播（vanderLindenetal.,2003；Deeetal.,2004；Otakeetal.,2003；Otakeetal.,2004；Otakeetal.,2002；Pitkinetal.,2009）。1.2.4PRRSV的疫苗与防控措施2006年以来中国爆发了HP-PRRSV，给中国的养猪业造成了巨大的经济损失，HP-PRRSV毒株已成为中国大陆地区的主要流行毒株。自2010年以来中国政府已经批准了多个PRRSV活疫苗，其中包括：JXA1(P80)（Hanetal.,2009）、HuN4-F112(P120)（Tianetal.,2009）、TJM(P90)（Lengetal.,2012）以及GDr180（P180）（Liuetal.,2015），多种疫苗毒株的同时存在可能会导致同一猪场内共同存在着多个流行毒株，同时这也会加大疫苗毒株与PRRSV野毒重组的风险（Jiangetal.,2015），已有实验室分离到疫苗毒株和自然野毒重组的PRRSV毒株，重组的毒株与亲本毒株相比致病力更强可以导致感染猪群更长时间的高热症、更明显的临床症状以及更严重的肺部病变（Luetal.,2015）；弱毒疫苗同时存在着毒力返强的潜在风险，Jiang等在未免疫过HP-PRRSV疫苗的猪场内分离到3株PRRSV：NT-1、NT-2以及NT-3，3株PRRSV对猪群均表现出高致病性和高死亡率的特征，序列分析表明3株PRRSV野毒与JXA1-P80基因同源性最高，而且其基因组中存在着疫苗毒株选育过程中存在的特有的氨基酸突变位点，这表明3株野毒可能是JXA1-P80毒力返强毒株（Jiangetal.,2015）。灭活疫苗虽然较为安全，但其免疫效果相对较差且需要多次重复免疫，免疫所需6 的计量较大，对异源毒株的保护效果也相对较差。PRRSV的防控和净化是一个全球性难题。而我国的养殖环境较为复杂、饲养管理水平相较欧美等发达国家而言较为落后，防控和净化PRRSV更是压力巨大。一般而言，在猪群群体水平上控制PRRSV疫情主要是通过控制公猪的精液，避免PRRSV阳性精液传播进入母猪群（Robertson,1992）；加强猪群的饲养管理避免猪群受到各种病原菌的继发感染；母猪群进行血清驯化，使母猪群只感染本场内流行的单一毒株，这样就会使得繁殖的仔猪尽早感染该毒株，从而在转入育肥阶段后控制PRRSV疫情（Deeetal.,2006）；合理选择疫苗制定合理的免疫程序。净化母猪群PRRSV的主要手段有：对母猪群进行血清学监测，发现PRRSV阳性的猪只及时清除（Deeetal.,1998；Deeetal.,2001）；淘汰所有的PRRSV阳性繁殖和育肥猪只，对猪场所有的设备进行消毒，重新引进PRRSV阴性猪只，该方法可以有效地清除PRRSV，但是成本较高（Corzoetal.,2010）；在引入新的后备母猪时，提前对猪群进行6个月以上的封群管理，不再引入后背猪只，此举是为了减少PRRSV感染的猪只数量以逐步消除PRRSV。1.3PRRSV的遗传变异1.3.1RNA病毒的复制特性PRRSV为单股正链RNA病毒，其基因组RNA在复制的过程中容易发生错误，因为PRRSV的聚合酶缺乏有效的校正机制。虽然没有明确的资料显示PRRSV的基因组具有较高的突变概率，但人们普遍认为任何生物体内的RNA病毒都具有较高的突变率，大约每复制一次就会发生一次突变（Sanjuanetal.,2010；Duffyetal.,2008）。从病毒复制的动力学角度讲，在单个病毒粒子感染后的几个小时之内就可以产生大量的病毒粒子，而这种复制能力在病毒感染的高峰期就显得尤为突出，大量的病毒粒子之间会面临着自然选择，而新产生的突变基因会淘汰一些劣势的基因。此外，宿主细胞内的各种细胞酶也会增加病毒基因组复制过程中的突变概率（Murtaughetal.,2015）。1.3.2准种现象PRRSV基因复制的不精确导致PRRSV很容易产生准种现象，即同一个个体内存在着一群密切相关但不相同的变异毒株，但没有足够充分的研究表明准种现象在PRRSV进化过程中发挥了作用（Murtaughetal.,2015；Holmes,2010）。7 1.3.3基因重组从遗传进化的角度来讲，当不同基因型的病毒同时存在于同一个个体内时，基因重组现象就会发生，使得有利于病毒自身的基因增多而损害性的基因会减少。细胞培养实验发现：PRRSV的重组现象在I型和II型PRRSV中均可发生，但是并没有发现I型和II型之间的重组（Yuanetal.,1999；Murtaughetal.,2011）。最近，许多PRRSV重组毒株被发现，Lu等分离出一株由疫苗毒株MLV和野毒QYYZ重组的毒株GM2，该毒株与亲本毒株相比可以导致更长时间的持续性高热（Luetal.,2015）。Zhao等发现JL580和HLJ58毒株为美国2008年分离毒株NADC30和中国HP-PRRSV毒株JXA1重组而产生，动物实验表明JL580和HLJ58表现出较强的致病力（Zhaoetal.,2015）。基因的同义突变和重组是PRRSV基因变异的内在原因，而PRRSV流行病学的多样性则是由诸多外部因素导致的，如病毒的传播方式、猪群的管理、疫苗的免疫状况、疫苗毒株的选择以及不同品种猪本身的基因多样性等，这些不确定的因素将会影响一个区域内PRRSV基因的多样性（Murtaughetal.,2015）。1.4本研究的目的与意义猪繁殖与呼吸综合征，俗称猪“蓝耳病”，是由PRRSV引起的一种可导致母猪发生繁殖障碍和仔猪发生呼吸道症状的传染性疾病。2006年，中国多个省份爆发了以“高热”症状为特征的HP-PRRSV，给养猪业造成了巨大的损失。目前我国还不能完全控制HP-PRRSV，尤其是一些中、小规模的猪场还频繁的受到HP-PRRSV疫情的威胁。PRRSV感染会导致猪场的生产效率下降，尤其表现在仔猪和保育猪。而近几年中国的II型PRRSV的基因多样性有增加的趋势，而Nsp2基因的30个氨基酸的缺失不能再作为中国HP-PRRSV的分子标记。本实验对华南地区的PRRSV进行分离、鉴定和全基因组序列的测定，同时收集了2014-2015年华南部分地区PRRSV的GP5和部分Nsp2基因序列，其目的在于分析华南地区PRRSV的遗传变异规律，丰富华南地区PRRSV的分子流行病学资料，为PRRSV的防控以及疫苗毒株的选择提供一定的参考。越来越多的实验表明非结构蛋白在病毒的复制以及与宿主细胞蛋白相互作用过程中发挥了重要的作用，而Nsp1α与Nsp1β在调节宿主细胞内多种细胞因子的表达、细胞免疫以及与宿主蛋白相互作用的过程中发挥了重要的作用，针对PRRSV的非结构Nsp1α及Nsp1β开展相关研究，有助于探索PRRSV的致病与免疫机制，本实验对8 PRRSV的Nsp1α与Nsp1β进行了原核表达，为进一步开展Nsp1α与Nsp1β相关实验、临床上PRRSV的防控等研究提供实验材料。9 2材料与方法2.1病毒、菌株、载体及细胞HP-PRRSVXH-GD株、Marc-145细胞、克隆菌感受态细胞DH5α、表达菌感受态细胞BL21、pMD-18T载体及原核表达载体pET-28a均为华南农业大学兽医学院传染病教研室保存。PRRSVN蛋白单克隆抗体由中国农业科学院上海兽医研究所童光志研究员惠赠，His标签单克隆抗体购自杭州联科生物，FITC标记的羊抗鼠IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。2.2细胞培养相关试剂高糖DMEM培养液，胎牛血清，胰蛋白酶购自Gibco公司，二甲基亚砜（DMSO）购自Amresco公司，细胞培养板/瓶购自Nunc公司。2.3工具酶、试剂盒及主要的分子生物学试剂PRRSV抗体ELISA抗体检测试剂盒为美国IDEXX公司产品，RNA抽提试剂盒购自上海飞捷生物公司，质粒抽提及胶回收试剂盒为OMEGA公司产品，蛋白胶配制试剂盒为杭州联科生物公司产品，反转录相关试剂、T4DNA连接酶及ExTaq酶为Takara公司产品，HindIII和XhoI限制性内切酶为NEB公司产品，IPTG购自北京鼎国生物，琼脂糖为Biowest公司产品，溴化乙锭（EB）为宝泰克生物科技公司产品。50×改良TAE：242gTris，57.1mL冰醋酸，10mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加双蒸水至1000mL，工作液1×。DEPC处理水：按1：1000（V/V）的比例将DEPC加入双蒸水中，室温放置12h以上，高压灭菌后4℃保存。PBS缓冲液（pH7.3）：NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，加双蒸水至1000mL，高压灭菌，4℃保存备用。含氨苄青霉素/卡那霉素（100µg/mL）的LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5％（W/V）高压灭菌后加入氨苄青霉素/卡那霉素至终浓度为100µg/mL，分装入灭菌平皿，凝固后4℃保存。含氨苄青霉素/卡那霉素（100µg/mL）的LB液体培养基：在灭菌后的LB液体培养基中加入氨苄青霉素/卡那霉素至终浓度为100µg/mL，4℃保存。10 2.4检测样品实验所用样品为2014-2015年在华南不同地区的猪场采集及送检的病料和血清样本，-20℃保存备用。2.5仪器设备本实验所使用的仪器见表2.1。表2.1实验所用仪器汇总DMTL倒置显微镜德国Leica公司酶标仪美国Bio-Rad公司微量可调移液器德国Eppendorf公司CO2培养箱美国Thermo公司-80℃超低温冰箱美国Thermo公司-20℃冰箱中国海尔公司高压灭菌锅日本Sanyo公司高速冷冻离心机德国Eppendorf公司凝胶电泳仪美国Bio-Rad公司普通离心机美国Bio-Rad公司Elix100双蒸水装置美国Millipore公司2.6PRRSV血清抗体的检测根据IDEXX的HerdCheck*PRRSX3试剂盒的操作说明书进行血清抗体的测定，具体操作步骤如下：1、用样品稀释液40倍稀释被测样品2、取出抗原包被板，在记录表上记录样本的位置。3、在包被孔内加入100uL没有稀释的阴性对照，每次检测2个重复。4、在包被孔内加入100uL没有稀释的阳性对照，每次检测2个重复。5、在相应的孔中加入100uL已稀释好的样本。6、18-25℃孵育30±2min。7、吸取各孔的液体弃入废液筒。8、用大约300uL洗涤液洗涤板孔，共洗涤3-5次。每次洗涤后应吸去孔内的液体。11 注意：应避免包被孔干燥。在最后一次洗涤液吸去后，将每块板中残留的洗涤液扣拍到吸水材料上。9、每孔加入100uL辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG抗体。18-25℃孵育30±2min。10、重复步骤6和7。每孔加入100uLTMB底物液。11、18-25℃孵育15±1min。12、每孔加入100uL终止液，终止反应。13、测量并且记录样本和对照的吸光值A(650)。14、计算结果。15、如果S/P值低于0.4，样品应判定为PRRS抗体阴性。如果S/P值大于或等于0.4，样品应判定为PRRS抗体阳性。2.7引物的设计与合成对GenBank中美洲株VR-2332毒株（EF536003）全基因序列进行生物信息学分析，选取保守区域，设计引物扩增ORF5/Nsp2/Nsp1α/Nsp1β基因，将全基因组分成14个相互重叠的基因片段，设计14对特异性引物，用于扩增所分离到的PRRSV毒株的全基因组序列，根据欧洲株LV（M96262）的基因信息设计引物用于扩增GP5基因，引物的合成由上海英骏生物技术有限公司完成，各段引物的序列、扩增片断大小及引物名称见表2.2表2.2PCR引物序列表扩增片段引物名称引物序列（5’~3’）片段长度P1p1FATGACGTATAGGTGTTGGCTCT1575bpp1RTACTCTTTCAGGAAGGGTGGP2p2FACGCTCTGGTGCGACTACTA892bpp2RAGGTTGTTCGGTTGTCTGATTP3p3FCCTCCGTGGCGCAACAAGTCTTG1064bpp3RCGATGATGGCTTGAGCTGAGTATP4p4FTGAGCCTCTGGATTTGTCTGC1378bpp4RGGCGATCTCATTAGGAGCAGTTP5p5FTGCTTAGGCTTGGCATTGTTG1351bpp5RACGGTGTTCAGTGAGGGCTTTP6p6FACTAACATTGCTGGTCTCGTCA1401bpp6RAAGGAAATCCAAGTCCTCGTCP7p7FTTGTGACCTCGCCAGTCCCAGTG1423bp12 p7RCCAAAGCGTGCCATCAATCCCP8p8FGGTTGATGGTGGTGTTGTGCT1440bpp8RGTCTTCTTTGGGTCCGTCTGGP9p9FTGGTCACCCTCATGGCCTTCT1286bpp9RCAAATACATAGCAATGGGAGTCAAAP10p10FTTCCTGGATGAAGCGGCGTAT1380bpp10RAACTCGGATGTATGAGGCGTAGP11p11FGGTGCTGGAAAGTGATGTTGG1335bpp11RAAAGCGGGCATACCGTGTAATP12p12FAGTGGTTTGGATGTGGTGGCT1404bpp12RTGTTGTTGTTGCTGGCGTTGAP13p13FATGTGCGACTGCTTCATTTCA1228bpp13RTTTGCTGCTTGCCGTTGTTATP14p14FTCCACTACGGTCAACGGCACAT625bpp14RTTTTTTAATTDCGGCCGCATGGORF55FGAGTTTACCCAACGCTCCT904bp5RCGAATGTCATGTACCCGAAGNsp22FTAAAGACCAGATGGAGGAGGAT449/539bp2RGGTGCGTCAGCGTTGTTGNsp1α28a-Nsp1α-FGCAAAGCTTGCATGTCTGGGATACTTGATCGGTGCA540bp28a-Nsp1α-RTAGCTCGAGTCATAGCACACTCAAAAGGGCAAGAGNsp1β28a-Nsp1β-FGCAAAGCTTGCGCTGACGTCTATGACATTGGTCGTG609bp28a-Nsp1β-RTAGCTCGAGTACCGTACCACTTATGACTGCCAAACII-PRRSV-GP5II-PRRSV-FTCTGGCGTTGTTTCTGCTT977bpII-PRRSV-RCGACACGGTTGGTGGATTG注：下划线序列为保护性碱基，斜体部分为酶切位点。2.8样品的RT-PCR检测2.8.1总RNA的提取根据RNAfast200试剂盒进行病毒总RNA的提取，具体操作如下：1.取待检样品100μL加入1.5mLEP管中，加入RA2液500μL，充分颠倒混匀10次，静置1min。2.将样本裂解物全部加入到内套管中，10000rpm离心1min。3.取出内套管，弃去外套管中液体后放回内套管，加入500μL洗液，12000rpm离心1min。4.重复步骤3再洗一次。5.取出内套管，弃去外套管中液体后放回内套管，12000rpm离心1min。6.将内套管移入新的1.5mLEP管中，在膜中央加入洗脱液50μL。13 7.室温静置1min后，12000rpm离心1min，获得总RNA。8.将RNA放入-80℃冰箱保存或立即进行反转录。2.8.2cDNA的合成使用的反转录引物为随机引物R:O。参照宝生物工程（大连）有限公司的MLV反转录酶的使用说明书，将按下列组分加入混合后进行反转录反应（表2.3）：表2.3反转录反应体系试剂体积RNA提取液9.5μL5×MLVBuffer4.0μLMLV反转录酶1.0μLdNTPs（2.5mmoleach）4.0μLRNaseInhibitor（20U/μL）0.5μL反转录引物（R:O）1uL2.8.3PCR扩增以反转录所得cDNA为模板，用PRRSV-ORF5/Nsp2特异性引物进行PCR扩增。其PCR扩增体系（20µL）如下（表2.4）：表2.4PCR扩增体系试剂体积TaKaRaExTaqDNA聚合酶10µL上游引物F（20pmol/µL）0.5µL下游引物R（20pmol/µL）0.5µLcDNA2.0µL灭菌双蒸水7µLPRRSVORF5/Nsp2特异性引物的PCR反应条件为：94℃5min，1个循环；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。14 2.8.4PCR回收产物与载体连接PCR胶回收、纯化产物与载体连接按照TaKaRa公司产品pMD18-Tvector试剂盒的使用说明书进行。连接反应体系（10µL）为：2×LigaseBuffer(LigationSolutionI）5.0µL，PCR纯化产物4.5µL，pMD18-Tvector0.5µL，震荡仪混匀后，置16℃连接反应仪过夜。2.8.5感受态细胞的制备参照《分子克隆实验指南》，应用CaCl2法制备DH5α感受态细胞。挑取DH5α单菌落接种于3mLLB液体培养基中进行一级培养，放置37℃摇床过夜。再将一级培养物接种于100mL新鲜LB液体培养基中进行二级培养，37℃振摇2～3h。待细菌进入对数生长期，即OD600=0.6左右时，再将二级培养物分装到50mL离心管中，冰浴10min，4℃4100r/min离心10min；彻底弃去上清液后，用30mL预冷的0.1MCaCl2重悬菌体，冰浴15min，4℃4100r/min离心10min；再彻底弃去上清液，再用2mL预冷的0.1MCaCl2重悬菌体。将制备好的感受态细胞直接用于转化或加入终浓度为10％的灭菌甘油于-80℃保存待用。2.8.6连接产物转化感受态细胞在50µL感受态细胞DH5α中加入连接产物5µL，轻轻混匀后，冰浴30min。于42℃水浴锅中热冲击90s，然后迅速取出放置冰浴中5min；冰浴后再加入700µLLB液体培养基，放置在37℃150r/min的摇床中振摇培养45min；将培养物以4000r/min离心4min，弃去部分上清液，再补入100µL新鲜LB液体培养基重悬菌体。将混悬液均匀涂布于之前准备好的含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB琼脂平皿上，待吸收后于37℃培养箱中倒置培养12～18h。2.8.7PCR鉴定阳性菌液用高压灭菌枪头分别挑取可疑菌落于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基中，于37℃振荡培养4～6h，取适量菌液作PCR鉴定。PCR扩增体系（20µL）为：TaKaRaExTaqDNA聚合酶10µL，上游引物F（20pmol/µL）0.5µL，下游引物R（20pmol/µL）0.5µL，菌液2.0µL，灭菌双蒸水7µL。PCR结束后进行凝胶电泳观察，将PCR鉴定为阳性的菌液送上海英俊生物技术有限公司进行序列测定。2.8.8ORF5及部分Nsp2基因测序结果分析对收集的样本信息进行整理，具体的样本信息见表2.5，对测得的64个GP5和31个Nsp2基因进行同源性和进化关系分析，参考毒株见表2.6。15 表2.52014-2015年采集的PRRSV样本信息Accessionno.Accessionno.SamplesOriginNsp2GP5SamplesOriginNsp2GP52014-CH-JXJiangxiKT198687KT208294gddg-2014GuangdongKT198708KT2083272014-FJFZNFujianKT198688KT2082952015-JXGZJiangxiKT198706KT2083122014-JXJDZJiangxiKT198689KT208296gdhz1-2014GuangdongKT198709KT2083292014-JXNCJiangxiKT198690KT208297gdhz2-2014GuangdongKT198710KT2083302014-JXNC-1JiangxiKT198691KT208298gdnp-2014GuangdongKT198711KT2083312014-JXNFJiangxiKT198692-GDSG-2015GuangdongKT198712KT2083322014-JXSRJiangxiKT198693KT208299GDYJ-2015GuangdongKT198713KT2083332014-JXSR-1JiangxiKT198694KT208300gdzs-2014GuangdongKT198714KT2083342014-JXYRJiangxiKT198695KT208301HuN-2014HunanKT198715KT2083352015-FJNAFujianKT198696KT208302jxfz-2015JiangxiKT198716-2015-FJXMFujianKT198697KT2083032014-JXNF-1JiangxiKT198717-2015-FJZZ-2FujianKT198698KT2083042015-GDYJGuangdongKT198702KT2083082015-GDHYGuangdongKT198699KT2083052015-HY1GuangdongKT198703KT2083092015-GDYF-1GuangdongKT198700KT2083062015-HY2GuangdongKT198704KT2083102015-GDYF-2GuangdongKT198701KT2083072015-HY3GuangdongKT198705KT208311fjzz-2015FujianKT198707KT2083132014-GDZS3Guangdong-KT2083442014-GX1Guangxi-KT2083142015-4-gdzqGuangdong-KT2083462014-HenanGuangdong-KT2083152015-4-guangxiGuangxi-KT2083472015-4-gdjmGuangdong-KT2083162015-FJFQFujian-KT208348ZhangzhouFujian-KT2083172015-FJZZ-1Fujian-KT2083492015-GDDGGuangdong-KT208318gddg-2-2015Guangdong-KT2083502015-GDKPGuangdong-KT208319gdgs-2015-1Guangdong-KT2083512015-HBWHHubei-KT208320gdjm-2014Guangdong-KT2083522015-HY4Guangdong-KT208321GDMM-2014Guangdong-KT2083532015-jxjjJiangxi-KT208322gdqy-2015-4Guangdong-KT208354ch-fj-II-2015Fujian-KT208323gdsg-2014Guangdong-KT208355ch-jx-2014Jiangxi-KT208324jiujiang-2015Jiangxi-KT208356fjna-2015Fujian-KT208325Longmen-2014Guangdong-KT208357gddg-1-2015Guangdong-KT2083262014-GDNP3Guangdong-KT2083402014-FJFQFujian-KT2083362014-gdyj-1Guangdong-KT2083412014-GDCSGuangdong-KT2083372014-gdyj-2Guangdong-KT2083422014-guangxiGuangxi-KT208345maoming-2014Guangdong-KT2083282014-GDJM1Guangdong-KT2083382014-GDZS2Guangdong-KT2083432014-GDNP2Guangdong-KT20833916 表2.6GP5遗传进化分析所选参考毒株SamplesAccessionno.SamplesAccessionno.BJ-4AF331831.1NT1EU273680.1CH-1aAY032626.1NT2EU273681.1CH-1REU807840NT3EU273682.1GD-100thGU143913.1PRRSV-2_HungaryKM514315.1GM2JN662424.1NT0801HQ315836.1HB-1(sh)/2002AY150312.1QYYZJQ308798.1HB-2(sh)/2002AY262352R98DQ355796.1HUN4EF635006RespPRRSMLVAF066183.4JXA1P80FJ548853.1TJEU860248JXA1EF112445.1VR2332U87392JXA1-P170JQ804986.1JXwn06EF641008LVM96262NADC30JN654459.1MN184EF442777.12.9病毒的分离与鉴定2.9.1病毒的分离检测样品鉴定为阳性后，将阳性样本先用0.22um微孔滤器过滤除菌后，取1mL接种于长成单层的Marc-145细胞培养瓶中，孵育60min后，弃去上清加入10mL含2%犊牛血清的DMEM维持液，置于37℃、5%CO2条件下培养。每天观察细胞病变情况，未有细胞病变时维持3-4天后收取细胞悬液继续传代，待细胞病变达到70%-80%及时收集细胞液，盲传3代后进行检测。同时设立接种阳性病毒的细胞作为阳性对照，并设未接种病毒的Marc-145细胞做为阴性对照。2.9.2分离病毒的PCR鉴定参照2.8.1-2.8.3步骤进行病毒的RT-PCR鉴定。2.9.3分离病毒的间接免疫荧光鉴定在长满单层的Marc-145细胞6孔细胞板上接种分离的病毒，同时设正常的细胞作空白对照。在37℃、5%CO2培养箱中培养48h后弃去悬液，用PBS洗涤6孔板317 次，然后每孔加入1mL的固定液（丙酮和无水乙醇按体积比3：2混合）。-20℃作用15min弃去固定液，用PBS洗涤6孔板3次，将抗美洲型单克隆抗体N蛋白1：100倍稀释后，每孔1mL置于6孔板中，37℃湿盒中作用2h。弃去一抗，用PBS洗涤6孔板5次，加入1:1000稀释FITC标记的抗鼠的二抗，每孔1mL置于6孔板中，37℃湿盒中作用1h。弃去二抗，用PBS洗涤6孔板5次后，置免疫荧光显微镜下观察。2.9.4分离病毒的全基因组测序按照2.8.1-2.8.7操作步骤对分离的10株病毒进行全基因组的扩增和序列的测定。其中P1、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12以及P13段PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃1min30s，共35个循环；72℃10min。P2及P14段PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃10min。2.9.5分离病毒的全基因组序列分析将PRRSV全长分为14段进行RT-PCR，测序结果利用DNAstarLasergne软件进行人工拼接，得到10株PRRSV，分别命名为JXJJ株、FJZZ株、FJNA株、FJXM株、GDLM株、GDNP株、GDHZ株、GDZQ株、GDSG株及GDMM株。参考相关文献从GeneBank中选取具有代表性的PRRSV，具体所选参考毒株见表2.7，运用DNAstar7.0和MEGA5.0进行同源性分析及遗传进化分析。表2.7PRRSV全基因组遗传进化分析所选参考毒株SamplesOrigin/YearAccessionno.SamplesOrigin/YearAccessionno.BJ-42000AF331831JXA12006EF112445CH-1a1996AY032626JXwn062009EF641008CH-1R2008EU807840LV1993M96262GM22011JN662424NADC302008JN654459HB-1(sh)-20022002AY150312QYYZ2011JQ308798HB-2(sh)-20022002AY262352TJ2006EU860248HENAN-XINX2013KF611905VR23321995EF536003HUN42007EF635006XH-GD2007EU62411718 2.10PRRSVNsp1α及Nsp1β的原核表达2.10.1Nsp1α及Nsp1β的扩增参照2.8.1-2.8.3对HP-PRRSVXH-GD株的Nsp1α及Nsp1β基因进行RT-PCR扩增。2.10.2PCR扩增产物的纯化参照OMEGAE.Z.N.A.GelExtractionKit公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书对扩增的Nsp1α及Nsp1β目的片段进行胶回收。1、将琼脂糖凝胶置于紫外灯下，用小刀小心切下目的条带，装入1.5mLEP管中。2、称取凝胶的重量，按1g/mL的比例加入BindingBuffer。将EP管置于55℃金属浴10min直至凝胶全部溶解，用振荡器振荡3min。3、将溶解的液体加入内套管中，室温10000rpm离心1min。4、去除外套管中的液体。5、向内套管中加入300μL的BindingBuffer，室温10000rpm离心1min。6、去除外套管中的液体，向内套管中加入700μL的SPWWashBuffer，室温10000rpm离心1min。7、重复步骤5。8、去除外套管中的液体，室温13000rpm离心2min。9、将内套管置于新的1.5mL上，加入30μLElutionBuffer，静置2min，室温13000rpm离心1min。10、重复步骤8。将回收的产物于-20℃冰箱保存。2.10.3目的片段与载体的双酶切将回收的目的片段和载体分别进行双酶切，条件为37℃，2h，具体的酶切体系为（表2.8）：表2.8双酶切体系试剂体积目的片段/载体1ug10×2.1buffer5uLHindIII1uLXhoI1uL灭菌水补足50uL19 2.10.4目的片段与载体的连接参照2.10.2将双酶切后的目的片段和载体进行连接，体系如下（表2.9）：表2.9连接体系试剂体积目的片段500ng载体100ng10×T4DNALigaseBuffer2uLT4DNALigase1uL灭菌水补足20uL2.10.5大肠杆菌感受态细胞的制备按照2.8.5方法制备DH5α感受态细胞。2.10.6重组质粒的转化按照2.8.6方法将连接过夜的重组质粒转化制备的DH5α感受态细胞。2.10.7重组质粒的抽提按照OMEGAE.Z.N.A.PlasmidMiniKitI质粒抽提试剂盒进行操作，步骤如下：1、将菌液PCR鉴定正确的菌体，按1:100的比例接种于含有5mLLB培养基的锥形瓶中，37℃300rpm摇菌16h。2、将菌体转移至1.5mLEP管中，室温10000rpm离心1min，去除上清液。3、用250μLSolutionI/RNaseA溶液重悬菌体沉淀，并用震荡器充分混匀。4、加入250μLSolutionII缓慢颠倒EP管数次，直至EP管内液体变为透明。5、加入350μLSolutionIII缓慢颠倒EP管数次，直至EP管内出现絮状物。6、室温13000rpm离心10min。7、小心将上清加入到内套管中，切勿加入絮状物。室温10000rpm离心1min。8、去除外套管中的液体，并向内套管中加入500μL的BufferHB，室温10000rpm离心1min。9、去除外套管中的液体，向内套管中加入700μL的DNAWashBuffer，室温10000rpm离心1min。10、重复步骤9。20 11、去除外套管中的液体后，内套管中不加入任何液体，室温13000rpm离心2min。12、将内套管置于新的1.5mL上，加入50μLElutionBuffer，静置2min，室温13000rpm离心1min。13、重复步骤12。将提取的质粒于-20℃冰箱保存。2.10.8重组质粒的酶切鉴定将2.10.7提取的重组质粒进行双酶切鉴定，酶切的条件为：37℃，2h。具体的酶切体系为：重组质粒1ug，HindIII1uL，XhoI1uL，10×2.1Buffer2uL，灭菌水补足至20uL，酶切后产物置于1%琼脂糖凝胶中进行电泳分离观察。2.10.9重组质粒序列的测定将菌液PCR和酶切鉴定正确的重组质粒，送至上海英骏公司进行序列测定。2.10.10重组质粒转化感受态细胞按照2.8.6的方法将测序正确的重组质粒转化BL21感受态细胞中。2.10.11重组蛋白的诱导表达及可溶性分析从转化的平板上挑取单个菌落接种于LB卡那霉素抗性液体培养基中，次日将活化的菌液重新按1:100接入含有LB卡那霉素抗性液体培养基的锥形瓶中，200rpm37℃摇床中扩增，待菌体OD值达到0.4-0.6时，从锥形瓶中抽取1mL菌体，记为0h样品。向锥形瓶中加入IPTG，终浓度为1mM，放入摇床中开始诱导，以后每隔1h取1mL菌液，至6h，将每个小时的样品离心去上清，菌体用少量PBS重悬。诱导结束后将剩余的菌液转至50mL离心管中，10000rpm4℃离心10min，弃去上清，PBS清洗一次，用适量PBS重悬菌体，充分混匀。将离心管放入超声破碎仪中，按400W，工作5s，休息6s，超声30min，直至菌液变得澄清。10000rpm4℃离心10min，分别收集上清液和沉淀。将处理后的上清和沉淀用5×SDSPAGEBuffer混匀，置于沸水中煮沸10min，瞬时离心，处理好的样本进行SDS-PAGE鉴定。2.10.12重组蛋白SDS-PAGE鉴定将蛋白胶板固定到固定槽上，加入5mL纯净水进行验漏，10min后若无液体漏出，倒掉胶板中的纯净水，并用滤纸吸净残留的液体。配制10mL15%分离胶（下层胶），按如下体系配制：蒸馏水1mL，30%Acr-Bis(29:1)5mL，pH8.8的1MTris3.8mL，10%SDS100μL，10%过硫酸铵100μL，TEMED4μL。将各种试剂加入到一锥形瓶中，用吸管缓慢吹匀，切勿吹打出气泡，缓慢加入到胶板上1/3处，在分离胶的上层加满异丙醇，约30min分离胶凝固后配制3mL浓缩胶（上层胶），体系如下：蒸馏21 水2.1mL，30%Acr-Bis(29:1)500μL，pH6.8的1MTris380μL，10%SDS30μL，10%过硫酸铵30μL，TEMED3μL。倒掉胶板中的异丙醇并用滤纸吸去残留的液体，缓慢加入新鲜配制的浓缩胶，插入加样梳。待30min浓缩胶凝固后，小心取下加样梳，将胶板固定至电泳槽中，向槽中加入电泳液，向加样口中加入处理好的样品，盖好电泳槽盖接通电源，先以恒压80V，待样品跑至分离胶与浓缩胶交界处，将电压调至120V，待样品跑至胶板底部时停止电泳，拆下胶板，小心取出凝胶，将凝胶用PBS清洗3次后，用考马斯亮蓝染色液室温染色30min-1h，随后用脱色液微波炉中脱色30min，观察结果。2.10.13重组蛋白最佳诱导时间的确定从转化的平板上挑取单个菌落接种于LB卡那霉素抗性液体培养基中，次日将活化的菌液重新按1:100接入含有LB卡那霉素抗性液体培养基的锥形瓶中，200rpm37℃摇床中扩增，待菌体OD值达到0.4-0.6时，从锥形瓶中抽取1mL菌体，记为0h样品。向锥形瓶中加入IPTG，终浓度为1mM，放入摇床中开始诱导，以后每隔1h取1mL菌液，至6h，将每个小时的样品离心去上清，菌体用适量PBS重悬，用5×SDSPAGEBuffer混匀，置于沸水中煮沸10min，瞬时离心，进行SDS-PAGE鉴定。根据SDS-PAGE结果确定蛋白诱导表达的最佳时间。2.10.14重组蛋白最佳IPTG诱导浓度的确定从转化的平板上挑取单个菌落接种于LB卡那霉素抗性液体培养基中，次日将活化的菌液重新按1:100接入含有LB卡那霉素抗性液体培养基的锥形瓶中，200rpm37℃摇床中扩增，待菌体OD值达到0.4-0.6时，从锥形瓶中抽取1mL菌体，记为0h样品。向锥形瓶中加入IPTG，至终浓度分别为0.4mM、0.6mM、0.8mM及1mM，重新放入摇床中诱导，诱导时间为2.10.13中确定的最佳诱导时间。诱导时间结束后，从锥形瓶中抽取1mL菌液，将样品离心弃去上清，菌体用适量PBS重悬，用5×SDSPAGEBuffer混匀，置于沸水中煮沸10min，瞬时离心，进行SDS-PAGE鉴定。根据SDS-PAGE结果确定蛋白诱导表达的最佳IPTG浓度。2.10.15重组蛋白Western-Blot鉴定SDS-PAGE结束后，在凝胶上切下目的条带，剪一张与切下的凝胶一样大小的硝酸纤维素膜及6张同样大小的3mm滤纸。硝酸纤维素膜及滤纸放入预冷的转膜缓冲液中平衡15min，按下列层次进行转膜：最下层3层滤纸，硝酸纤维素膜，凝胶，3层滤纸，依次由下到上放置，叠放整齐，避免产生气泡，避免上下两层滤纸相互接触。22 在半干式电转移上，以25V，1.3A恒流转移7min。转膜完毕后，取下硝酸纤维素膜进行如下操作：1、封闭：将硝酸纤维素膜条放入适当大小的玻璃器皿中，用5%脱脂奶粉/TBST缓冲液37℃，50r/min，2h。2、洗膜：弃去封闭液，用TBST缓冲液37℃，50r/min，5min，共3次。3、孵一抗：弃去TBST缓冲液，加入1:5000稀释的His标签单克隆抗体，4℃过夜。4、洗膜：回收一抗，用TBST缓冲液37℃，50r/min，5min，共3次。5、孵二抗：弃去弃去TBST缓冲液，加入1:8000稀释的IRDye800CWGoatanti-MouseIgG（H+L），室温，避光孵育1h。6、洗膜：回收二抗，用TBST缓冲液37℃，50r/min，5min，共3次。7、扫膜：将洗脱后的硝酸纤维素膜放入双色激光分析系统Odyssey中进行扫膜和分析。23 3结果3.12014-2015年华南部分地区PRRSV抗体检测结果2014共采集5046份猪血清，其中PRRSV抗体阳性血清为4195份，阳性率为83.13%（4195/5046）；95%置信区间为82.67%-83.59%；2015年共采集5531份血清，经检测PRRSV阳性血清共3992份，阳性率为72.18%（3992/5531），95%置信区间为70.38%-72.4%。与2014年比较，2015年检测的PRRSV抗体的整体阳性率有所下降。每月的检测结果见图3.1。图3.12014-2015年PRRSV抗体检测阳性率3.22014-2015年华南部分地区PRRSV抗原检测结果对采集的病料进行PRRSVGP5和部分Nsp2基因的RT-PCR扩增检测，扩增所得的GP5和部分Nsp2基因与预期的大小一致。扩增结果见图3.2及图3.3。1234512345750bp500bp2000bp1000bp图3.2Nsp2基因扩增结果图3.3GP5基因扩增结果1：DNAMarkerDL2000；2-4:阳性样本扩增结果；5：阴性对照24 2014年共采集病料583份，其中PRRSV检测为阳性的样本为192份，阳性率为33.01%（192/583），95%置信区间为32.78%-33.23%；2015年共采集病料964份，PRRSV检测阳性的样本数为356，阳性率为36.88%（356/964），95%置信区间为36.56%-37.2%，2015年PRRSV抗原检测的总体阳性率高于2014年。具体每月的PRRSV抗原检测结果见图3.4。图3.42014-2015年PRRSV抗原检测阳性率3.32014-2015年部分Nsp2基因氨基酸比对分析Nsp2是PRRSV非结构蛋白中变异较大的非结构蛋白之一，Nsp2基因存在着多种形式的缺失、插入以及突变等现象。对PRRSV检测为阳性的样本的PRRSVNsp2的高变区进行RT-PCR扩增、测序，最终成功对其中的31个Nsp2基因进行了扩增，将测得的Nsp2基因序列翻译为氨基酸后与选定的参考序列进行比对分析，氨基酸比对结果表明：与参考毒株相比，31个Nsp2基因中有26个Nsp2基因存在着“29+1”个氨基酸缺失的现象，即在481位以及532-560位分别发生1个和29个氨基酸的缺失，表明华南地区主要流行的PRRSV毒株还是以Nsp2基因缺失30个氨基酸为主的毒株。但是临床上检测的Nsp2基因也存在着其他形式的氨基酸位点的缺失，2014-FJFZN毒株的Nsp2基因在474-512位发生39个氨基酸的缺失，2015-FJNA毒株的Nsp2基因在484-488位发生5个氨基酸的缺失，而2015-GDYF-1、2015-GDYF-2以及gddg-2014毒株在481位以及532-560位并不存在氨基酸的缺失为经典毒株（图3.5）。25 图3.5Nsp2氨基酸比对结果3.42014-2015年GP5基因遗传进化分析GP5基因是PRRSV的囊膜蛋白，可以刺激宿主产生中和抗体。同时GP5也是PRRSV众多结构蛋白中变异程度最大的，常作为PRRSV分子流行病学调查的靶基因之一。对2014-2015年采集的PRRSV阳性病料进行GP5的扩增和测序，最终得到64个GP5基因的序列，其中2014年和2015年各32个。使用MEGA5软件对获得的GP5序列和参考毒株进行构建进化树，从GP5基因的进化树可以发现：目前，华南地区的PRRSV主要分为两个大的基因型，即北美型和欧洲型，主要流行的PRRSV毒株为北美型，仅有ch-fj-II-2015毒株为欧洲型，欧洲型PRRSV在中国不是优势毒株。进一步分析发现华南地区的PRRSV毒株具有亚群的多样性共可以分为6个亚群，即以JXA1HP-PRRSV毒株为代表的SubgenotypeI亚群；以HB-1(sh)-2002毒株为代表的介于经典株与变异株之间的SubgenotypeII亚群；以CH-1a毒株为代表的SubgenotypeIII亚群；以VR2332毒株为代表的SubgenotypeIV亚群；以NADC30毒株为代表的SubgenotypeV亚群；以GM2毒株为代表的SubgenotypeVI亚群。本实验的64株PRRSV毒株中有41株属于以JXA1为代表的SubgenotypeI亚群，26 有17株属于以GM2为代表的SubgenotypeVI亚群，SubgenotypeI和SubgenotypeVI亚群的毒株数量占本实验所收集的毒株总数的90.625%，表明华南地区流行的PRRSV毒株主要为SubgenotypeI和SubgenotypeVI亚群的毒株，SubgenotypeVI亚群为近几年开始出现的亚群，有资料表明GM2毒株为疫苗毒株MLV和野毒株QYYZ重组产生，动物实验表明GM2毒株相比较亲本毒株QYYZ而言可导致更长时间的持续性高热，所以对临床上的SubgenotypeVI亚群毒株应该多加监测。以NADC30毒株为代表的SubgenotypeV亚群为最近几年在中国出现的新亚群，实验表明NADC30毒株和中国HP-PRRSV毒株JXA1重组产生的PRRSV毒株已在中国出现，且重组毒株的毒力与JXA1相当，这应引起足够的重视。64株毒株中仅有2014-GDCS毒株分属于以CH-1a为代表的SubgenotypeIII亚群，2014-GX1和2014-GDNP3毒株分属于以HB-1(sh)-2002毒株为代表的SubgenotypeII亚群，没有检测到以VR2332毒株为代表的SubgenotypeIV亚群毒株的出现，上述3个亚群的毒株很少检出。图3.6GP5遗传进化树27 3.52014-2015年GP5基因氨基酸同源性分析对测得的63个GP5基因和所选择的参考毒株进行核苷酸和氨基酸的同源性比对分析，比对结果显示：2014年所测得的GP5基因相互之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为：81.3%-100%、79.1%-100%；2015年所测得的GP5基因相互之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为：81.1%-100%、78.1%-100%；2014年和2015年相互之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为80.8%-100%、77.6%-100%。而与疫苗毒株TJ、JXA1、HUN4等的同源性比对结果见表3.1。表3.12014-2015年核苷酸及氨基酸同源性比对结果year20142015TJVR2332JXA1HUN4R98CH-1R2014(nt)81.3%-100%80.8%-100%83.6%-99.3%83.3%-91.2%83.6%-99.5%83.6%-99.5%82.6%-90.5%85.1%-98.7%aa79.1%-100%77.6%-100%82.1%-99%81.1%-89.6%82.1%-99%82.1%-99.5%79.6%-87.6%83.1%-91.5%2015(nt)81.1%-100%82.9%-99.3%83.3%-89.1%82.9%-99.5%82.9%-99.5%82.3%-88.4%84%-94.2%aa78.1%-100%80.6%-99.5%80.1%-88.6%80.6%-99%81.1%-99.5%77.6%-86.6%82%-91.5%3.62014-2015年GP5基因氨基酸突变位点分析将本实验的63个GP5基因序列和所选择的参考序列进行氨基酸比对，比对结果表明：与所选择的参考毒株相比，2014-2015年间的PRRSVGP5蛋白存在着一些的氨基酸位点的缺失和突变。GP5蛋白氨基酸突变位点主要位于信号肽区（1-26aa）、第一高变区（SNNNS）、第二高变区（AQKFDW）及B细胞表位（181-200aa）（图3.7（a）、图3.7（b））。某些亚群的毒株存在着统一的氨基酸突变位点：SubgenotypeII-SubgenotypeVI亚群存在着统一的突变位点C9G；SubgenotypeV及SubgenotypeVI亚群的部分毒株存在着统一的突变位点R13Q/C，而R13被认为和病毒的毒力相关，该位点的突变可能会导致病毒的毒力发生改变；SubgenotypeVI亚群的27位氨基酸由V突变为A，38位氨基酸由H突变为Y，66位氨基酸由T突变为C/S，152位氨基酸由L突变为I，199位氨基酸由R突变为H，38位氨基酸处于GP5的中和抗原表位区域，这一突变是否会影响PRRSV中和抗体对该亚群毒株的中和效果还有待于进一步确定；SubgenotypeV亚群的57位氨基酸由A突变为N；SubgenotypeIII、SubgenotypeIV以28 及SubgenotypeVI亚群的101位氨基酸由Y突变为F；SubgenotypeII、SubgenotypeIII以及SubgenotypeIV亚群的第16位氨基酸由F突变为S，185位氨基酸由A突变为V。2015-HY1、2015-HY2及2015-HY4毒株的N34位发生缺失。SubgenotypeVI亚群大部分毒株的30位氨基酸由N突变为G/S，该位点的突变使得该亚群减少了一个糖基化位点，SubgenotypeIII、SubgenotypeIV、SubgenotypeVI以及SubgenotypeV亚群的大部分毒株的35位氨基酸由N突变为S，该位点的突变导致35位糖基化位点的缺失，糖基化位点的减少会导致膜外域和抗原识别位点的大量突变。44位和51位N-糖基化位点在6个亚群均稳定存在较为保守（图3.7（a）、图3.7（b））。SignalpeptideDecoyHVR1PNEHVR2图3.7GP5氨基酸比对分析（a）29 TcellepitopeTcellepitopeBcellepitope图3.7续图GP5氨基酸比对分析（b）30 3.7欧洲型PRRSVGP5遗传进化及突变分析欧洲型PRRSV在中国大陆地区很少检测到，2014-2015年共采集了1547份病料，仅检测到1株PRRSV。基于GP5构建的遗传进化树可以发现：ch-fj-2015毒株与2006年中国分离到的欧洲型PRRSVBJEU06-1、2011年分离到的欧洲毒株NVDC-NM1-2011及2007年比利时分离毒株07V063的亲缘关系较近（图3.8）。GP5氨基酸比对分析发现：与参考毒株相比，ch-fj-2015毒株的GP5基因在14aa、74aa、101aa及153aa发生特有的氨基酸位点的突变（图3.9）。图3.8欧洲型PRRSVGP5遗传进化树图3.9欧洲型PRRSVGP5蛋白氨基酸比对分析31 3.8病毒的分离鉴定将RT-PCR鉴定为阳性的病料和血清接种Marc-145细胞，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养3-4天，当细胞出现聚集、皱缩、脱落等明显的细胞病变时，通过间接免疫荧光（IFA）进行鉴定，PRRSV感染的阳性细胞中可以观察到特异性的绿色荧光。本实验共分离了10株PRRSV，分别命名为：JXJJ株、FJZZ株、FJNA株、FJXM株、GDLM株、GDNP株、GDHZ株、GDZQ株、GDSG株以及GDMM株（图3.10）。JXJJ株FJZZ株FJNA株FJXM株GDLM株GDNP株GDHZ株GDZQ株GDSG株GDMM株阴性对照图3.10PRRSVIFA鉴定结果（×200）3.9PRRSV全基因组的扩增参照2.7中设计的特异性引物，将PRRSV分成相互重叠的14段进行RT-PCR扩增，所获得的目的条带与预期的大小一致，具体的扩增结果见图3.11。123456789101112131415162000bp1000bp图3.11PRRSV全基因组RT-PCR扩增结果1：DNAMarkerDL2000；2-15:PRRSV全基因组各个片段；16：阴性对照32 3.10PRRSV全基因组的遗传进化分析分别使用10株PRRSV的全长基因组、GP5、GP7、Nsp9以及Nsp10构建遗传进化树。遗传进化树的结果表明：10株PRRSV分离毒株均为美洲型分离毒株。基于PRRSV基因组全长、GP5和GP7基因构建的遗传进化树表明：10株分离毒株除FJXM毒株外均属于以JXA1为代表的JXA1-like亚群，彼此之间的亲缘关系较为密切，而FJXM毒株属于经典亚群和变异亚群中间的一个过渡亚群即：Intermediatesubgroup，该亚群的代表毒株为HB-1(sh)-2002（图3.12(A)、3.12(D)、3.12(E)）。基于Nsp9构建的遗传进化树表明：10株分离毒株除FJZZ毒株外均属于以JXA1为代表的JXA1-like亚群，GDMM、JXJJ、GDZQ、GDLM以及GDNP的亲缘关系相对更近，而GDHZ、GDSG、JXNA和FJXM的亲缘关系更近，FJZZ毒株属于过渡亚群Intermediatesubgroup与其他9株的亲缘关系较远（图3.12(B)）。Nsp10构建的遗传进化树结果与Nsp9类似，但在Nsp10构建的进化树中GDNP毒株与GDHZ、GDSG、JXNA和FJXM毒株的亲缘关系更近（图3.12(C)）。A33 BCED图3.12PRRSV分离毒株遗传进化树A：全基因组进化树；B:Nsp9遗传进化树；C：Nsp10遗传进化树；D：GP5遗传进化树；E：GP7遗传进化树34 3.11分离毒株全基因组的同源性分析将10株PRRSV分离毒株的核苷酸同所选择的参考毒株进行同源性分析，10株PRRSV毒株相互之间的核苷酸同源性为92.6%-97.5%，分离毒株与JXA1毒株的核苷酸同源性为95.3%-98.9%；与VR2332毒株的核苷酸同源性为87.8%-89.15；与CH-1a毒株的核苷酸同源性为91.5%-94.9%；与CH-1R的同源性为91.3%-94.8%；与LV毒株核苷酸同源性为60.4%-60.8%；与NADC30毒株的核苷酸同源性为83.4%-84.4%；与HUN4毒株的核苷酸同源性为93.9%-99.1%；与TJ毒株的核苷酸同源性为93.8%-99.1%（图3.13）。同时将分离毒株的各个结构和非结构蛋白同JXA1、VR2332以及CH-1R毒株进行比较，比对结果表明：与所选的参考毒株相比，在PRRSV众多的结构蛋白和非结构蛋白中，分离毒株的M蛋白较为保守，与参考毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别高达97%-100%和96%-100%。其他各结构和非结构蛋白的具体比对结果见表3.2。图3.13PRRSV分离毒株核苷酸同源性比对35 表3.2分离毒株各基因与参考毒株同源性比对结果JXA1CH-1RVR2332ProteinsAminoacidNucleotideAminoacidNucleotideAminoacidNucleotideidentityidentityidentityidentityidentityidentityNsp1α93.3%-100%95%-98.9%90.6%-97.2%92.8%-96.5%88.9%-95.6%87.8%-91.5%Nsp1β87.7%-99%90.5%-99%81.8%-88.7%87%-93.1%79.8%-84.7%83.4%-87.7%Nsp289.3%-98.5%91.1%-99.2%85.2%-89.4%89.2%-92.9%73.7%-76.9%80.6%-83.1%Nsp397%-99.1%95.7%-99.1%93.5%-99.6%91.3%-94.9%90.4%-96.1%88.1%-90.3%Nsp496.6%-100%96.1%-99.7%93.6%-97.1%92.3%-96.2%91.7%-94.6%87.6%-90.2%Nsp593.5%-100%92.9%-99.2%91.2%-94.7%89.8%-94.7%90.6%-92.9%85.9%-89.8%Nsp656.2%-100%77.1%-100%56.2%-100%75%-97.9%50%-100%75%-95.8%Nsp7α94.6%-100%92.8%-98.9%94%-98%91.9%-97.5%91.9%-97.3%86.6%-91.3%Nsp7β93.6%-100%93%-99.7%89.1%-94.5%88.5%-93.6%80.9%-82.7%84.5%-88.2%Nsp897.8%-100%97.1%-99.3%97.8%-100%96.4%-100%97.8%-100%94.2%-97.1%Nsp994.2%-99.2%95.9%-99.1%93.5%-98.3%93.1%-96.6%92.5%-97.5%90%-92.35%Nsp1096.8%-99.1%95.2%-99.4%95.2%-97.7%93.2%-95.3%94.1%-96.1%88.4%-90%Nsp1197.8%-99.6%90.3%-99.4%97.3%-99.1%90.9%-95.7%93.7%-96%89.7%-90.9%Nsp1294.2%-100%85.5%-100%94.2%-97.4%86.1%-96.5%93.5%-95.5%89.6%-90%ORF1a92.5%-99.1%92.7%-99.2%89.4%-92.9%90.4%-94.2%84.2%-86.5%85.2%-87.4%ORF1b96.4%-99.3%94.4%-99.3%95.3%-98.1%92.6%-95.9%93.8%-96.4%89.4%-91.1%ORF2a74.3%-99.6%89.8%-99.4%73.1%-95.7%90.7%-96.1%71.1%-91.8%89.5%-92.9%ORF2b89.2%-100%90.5%-100%89.2%-95.9%91%-96.8%87.8%-90.5%91.4%-93.7%ORF385.1%-98.8%85.4%-99.2%85.9%-92.5%85.9%-95.3%85.9%-87.8%86.9%-89.2%ORF488.8%-98.3%88.8%-99.1%90.5%-97.2%89.2%-97%83.8%-90.5%86.8%-90.3%ORF5a90.4%-100%91.7%-99.4%84.6%-90.4%88.5%-90.4%80.8%-84.6%87.8%-89.1%ORF591.5%-99%94.2%-99.5%85.1%-90.5%89.2%-94%83.6%-88.6%86.6%-89.2%ORF696%-100%97%-100%93.1%-97.7%94.7%-97.1%93.7%-97.7%93%-95.6%ORF794.4%-100%93.3%-100%92.7%-96%91.7%-96.2%93.5%-95.2%91.4%-93.8%36 3.12分离毒株Nsp2及GP3/GP5/GP6基因氨基酸突变位点分析分离毒株的Nsp2基因和参考毒株进行氨基酸比对分析，结果表明：分离的10株PRRSV除FJNA株之外，9株PRRSV的Nsp2基因在481位以及533-561位发生了30个氨基酸的缺失，而FJNA株仅在481-486位发生缺失，表明分离的PRRSV毒株主要为变异毒株。GP3蛋白存在着两个抗原表位分别为67LEPGKSFW74、74WCRIGHDRCSEN85，与参考毒株相比，本实验中分离的毒株GDHZ及GDSG在68位由E分别突变为G和D，GDLM、GDMM、JXJJ及GDZQ毒株在79位由H突变为N；GP5蛋白存在着2个T细胞和1个B细胞抗原表位，除GDMM毒株外，其余9株PRRSV在这两个T细胞和1个B细胞抗原表位区域均有不同程度的位点突变；M蛋白的151-174位被证明是一个B细胞抗原表位，GDMM毒株在164位由Q突变为R（图3.14）。ABCD图3.14PRRSV分离毒株Nsp2、GP3、GP5及M蛋白氨基酸位点变异分析A：Nsp2比对结果；B:GP3比对结果；C：GP5比对结果；D：M蛋白比对结果37 3.13分离毒株Nsp9/Nsp10基因氨基酸突变位点分析Nsp9和Nsp10上存在着T细胞抗原表位，其中Nsp9蛋白中的T细胞抗原表位为119-135aa、151-167aa、207-223aa及519-535aa。而本实验分离的部分PRRSV毒株的Nsp9与参考毒株相比在T细胞抗原表位区域存在着一系列氨基酸位点的突变表3.3。表3.3分离毒株Nsp9蛋白氨基酸突变位点Nsp9GDHZGDLMGDNPGDZQGDMMFJXMJXJJ121aaA→V------122aa--A→G----123aa-S→T-----125aa-Q→F-----128aa--Q→H----159aa-----V→I-163aa---R→KR→K-R→K217aa-----S→T-3.14Nsp1α及Nsp1β的扩增使用设计的特异性引物通过RT-PCR成功的对Nsp1α和Nsp1β基因进行了扩增，目的基因的大小分别为540bp、609bp，与预期大小一致。（图3.15、图3.16）12121000bp750bp750bp500bp500bp图3.15Nsp1α扩增结果图3.16Nsp1β扩增结果1：DNAMarkerDL2000；2:目的片段38 3.15重组质粒的酶切鉴定将重组阳性重组质粒用HindIII和XhoI进行双酶切鉴定，酶切后可以观察到与pET-28a载体以及Nsp1α、Nsp1β大小相近的目的片段。酶切结果见图3.17。1235000bp600bp500bp图3.17重组质粒双酶切鉴定结果1：DNAMarkerDL5000；2:Nsp1β重组质粒双酶切结果；3:Nsp1α重组质粒双酶切结果3.16重组质粒的表达与可溶性分析将测序和双酶切鉴定正确的BL21菌液以及转化pET-28a空载体的菌液分别进行诱导表达，诱导表达的条件为：IPTG终浓度为1mM，37℃，6h；诱导结束后离心收集菌体、重悬，进行超声处理，然后进行SDS-PAGE分析，获得的目的蛋白的大小分别约为25KD和28KD，大小与Nsp1α和Nsp1β一致，表明目的蛋白得到了表达，超声处理后进行SDS-PAGE分析的结果表明重组蛋白以的包涵体形式存在（图3.18）。M12345678170KD25KD15KD10KD图3.18Nsp1α及Nsp1β重组蛋白SDS-PAGEM：170KD蛋白Marker；1、5:空载体对照；2、6:Nsp1α/Nsp1β诱导前对照；3、7：Nsp1α/Nsp1β超声后上清；4、8：Nsp1α/Nsp1β超声后沉淀39 3.17重组蛋白的最佳诱导时间的确定将保存的阳性菌液加入卡那抗性的LB液体培养基摇过夜，次日按照1:100的量加入新鲜的卡那抗性LB液体培养基，37℃摇至OD值至0.4-0.6时加入终浓度为1mM的IPTG，37℃进行诱导表达，分别在诱导后0h、1h、2h、3h、4h、6h各取出1mL菌液，12000rpm离心，1min，弃上清，按照25uL/mL的量加入PBS重悬菌体，按量加入LoadingBuffer并混匀，100℃，10min，高温处理后的样品10000rpm离心，1min，取离心后的上清进行SDS-PAGE分析，结果表明在诱导后5hNsp1α重组蛋白的表达量达到最高，而Nsp1β则在诱导后3h的表达量达到最高（图3.19、图3.20）。M12345678170KD25KD15KD10KD图3.19Nsp1α重组蛋白不同诱导时间SDS-PAGE分析M：170KD蛋白Marker；1:空载体对照；2:诱导前对照；3-8：诱导后1-6hM12345678170KD25KD15KD10KD图3.20Nsp1β重组蛋白不同诱导时间SDS-PAGE分析M：170KD蛋白Marker；1:空载体对照；2:诱导前对照；3-8：诱导后1-6h40 3.18重组蛋白的最佳IPTG诱导浓度的确定将保存的阳性菌液复苏后按1:100接入新鲜的卡那抗性LB液体培养基，摇菌待OD达到0.4-0.6时，分别加入终浓度为0.4mM、0.6mM、0.8mM及1mM的IPTG，37℃进行诱导表达，Nsp1α的诱导时间为5h，Nsp1β的诱导时间为3h，诱导结束后收集菌液，菌液离心后、重悬、加入适量LoadingBuffer，煮沸10min后进行SDS-PAGE分析，结果表明Nsp1α、Nsp1β重组蛋白的最佳IPTG诱导浓度均为0.6mM（图3.21、图3.22）。M123456170KD35KD25KD15KD图3.21Nsp1α重组蛋白不同IPTG诱导浓度SDS-PAGE分析M：170KD蛋白Marker；1:空载体对照；2：诱导前；3-6:0.4-1mMIPTGM123456170KD35KD25KD15KD10KD图3.22Nsp1β重组蛋白不同IPTG诱导浓度SDS-PAGE分析M：170KD蛋白Marker；1:空载体对照；2：诱导前；3-6:0.4-1mMIPTG41 3.19重组蛋白的Western-blot鉴定切下凝胶上的目的蛋白条带使用半干转膜仪参照2.10.5步骤的操作方法将目的蛋白条带转印至硝酸纤维素膜分别加入His一抗及相应二抗后进行Western-blot验证，结果表明重组Nsp1α及Nsp1β蛋白可以和His标签单克隆抗体发生特异性的反应（图3.23）。M1235KD25KD15KD图3.23Nsp1α及Nsp1β重组蛋白Western-blot鉴定M：170KD蛋白Marker；1:Nsp1α；2：Nsp1β42 4讨论4.12014-2015年华南部分地区PRRSV抗体和抗原的检测PRRSV是危害全球养猪业的一个重要病原，近几年PRRSV给中国的养猪业造成了巨大的经济损失，尤其是2006年以来爆发的HP-PRRSV更是困扰养猪业的棘手问题（Tianetal.,2007）。本实验对2014-2015年采集的华南部分地区的病料和血清进行检测，检测的结果显示：2014年华南地区的PRRSV抗原和抗体的阳性率分别为33.01%、83.13%，2015年PRRSV的抗原和抗体的阳性率分别为36.88%、72.18%，2015年的抗体阳性率相较于2014年有所下降而抗原检测的阳性率则有所升高，2014-2015年华南地区的PRRSV抗体普遍维持在较高的水平，可能的原因为：一方面是由于华南地区PRRSV疫苗的普遍使用，HP-PRRSV毒株在华南地区流行的广泛性与多样性，另一方面是本实验检测的PRRSV抗体主要是针对PRRSVN蛋白的抗体，N蛋白抗体在PRRSV感染后的早期即可检测到，且N蛋白抗体可以持续较长的时间，检测N蛋白抗体具有更高的灵敏性适合用于PRRSV临床的监测（Deaetal.,2000）。4.2Nsp2和GP5基因遗传进化与变异分析2006年中国江西地区爆发了HP-PRRSV，随后HP-PRRSV蔓延全国各个省份，HP-PRRSV基因组的显著性特征是其Nsp2基因发生“29+1”个氨基酸的缺失，随后证明30个氨基酸的缺失并不影响PRRSV的毒力（Tianetal.,2007）。本实验对31株PRRSV的Nsp2高变区进行了测序分析，其中26株PRRSV的Nsp2基因均发生30个氨基酸的缺失仅有3株PRRSV（2015-GDYF-1、2015-GDYF-2及gddg-2014毒株）的Nsp2基因没发生30个氨基酸的缺失，这表明华南地区的PRRSV毒株大部分为Nsp2发生30个氨基酸缺失的变异毒株；然而2014-FJFZN毒株的Nsp2基因在474-512位发生39个氨基酸的缺失，2015-FJNA毒株的Nsp2基因在484-488位发生5个氨基酸的缺失，Nsp2基因可以容许大量氨基酸的缺失和插入，其160-814位为高变区，最近的研究表明：Nsp2的高变区可以和多种细胞蛋白相互作用，从而可能会影响细胞的活性、病毒的复制、组装等多个过程（Xiaoetal.,2015），2014-FJFZN和2015-FJNA毒株在Nsp2高变区发生不同与以往的氨基酸位点的缺失，这可能会导致该毒株的某些生物学特性发生改变。GP5基因的遗传进化分析表明：华南地区同时存在欧洲型和北美型PRRSV，主要以北美型PRRSV为主，其中2型PRRSV又可以进一步分为6个亚群，PRRSV毒43 株的多样性可能与多种弱毒疫苗的大量和同时使用、疫苗毒力的返强等因素有关。64株PRRSV毒株中有41株属于以JXA1为代表的SubgenotypeI亚群，有17株属于以GM2为代表的SubgenotypeVI亚群，2个亚群毒株所占比例高达90.625%，有实验表明GM2毒株为疫苗毒株和野毒重组而产生，其毒力与亲本毒株而言可以导致持续性的高热，而2014-Henan、2015-FJFQ毒株分属于以MN184和NADC30为代表的SubgenotypeV亚群为，该亚群为最近几年新出现的亚群（Zhouetal.,2015；Zhaoetal.,2015），Tong等的实验表明该亚群毒株的毒株致病力大致与JXA1相当（Zhaoetal.,2015），这对于临床防控PRRSV提出了更加严峻的挑战，应引起足够的重视、加强对该亚群毒株的临床监测，在平时的饲养管理中应该采取严格的生物安全措施严防该类毒株的侵入。GP5蛋白是PRRSV变异程度最大的结构蛋白，为病毒的囊膜蛋白，在中和抗体产生过程中发挥重要作用，常作为PRRSV分子流行病学调查的靶基因。与所选择的参考毒株相比，本实验中的GP5蛋白主要的变异位点集中在信号肽区、第一和第二高变区，这与以往的流行病学调查结果是一致的（Xieetal.,2014；Xieetal.,2013）。而以GM2为代表的SubgenotypeVI亚群毒株在2个T细胞和1个B细胞抗原表位区域内均有氨基酸位点的突变，这一突变可能会到导致GP5蛋白抗原性的改变。在中国大陆地区主要流行的PRRSV为美洲型，欧洲型PRRSV很少检测到，本实验中的欧洲毒株与早年间中国分离的欧洲型PRSSVBJEU06-1、NVDC-NM1-2011的亲缘关系较近。中国大陆地区同时存在着I型和II型PRRSV，而两者之间的基因同源性仅有60%左右，且抗原性差异较大，有的实验表明欧洲型PRRSV对猪也有较强的致病力（李冰等，2015），可以导致肺部和淋巴结产生明显的病变，这会进一步加大PRRSV的防控难度。4.3PRRSV的分离鉴定及全基因组序列分析将RT-PCR检测为阳性的样品接种Marc-145细胞，通过PCR检测、IFA验证，本实验共分离得到10株PRRSV，相对于本实验的PRRSV抗原检测阳性率而言PRRSV分离率相对较低，病毒分离率较低的原因可能为：一方面PRRSV感染的主要靶细胞为单核细胞尤其是PAM细胞，也可以在Marc-145细胞中增殖，一般的实验常将Marc-145细胞作为实验材料来使用，但已有实验发现某些毒株仅能在PAM细胞中增殖而不能在Marc-145细胞上增殖（Lengetal.,2014），使用PAM细胞来分离PRRSV44 应该更具有优势；另一方面可能是收集的样品中并不存在活的、具有感染性的病毒粒子从而失去感染细胞的能力；也可能是病毒分离过程中实验操作不当导致分毒失败。PRRSV全基因组系统进化树分析可以发现：本实验分离的10株PRRSV中有9株和JXA1毒株的亲缘关系较为紧密，而仅有FJXM毒株属于经典亚群和变异亚群中间的过渡态亚群，与选择的参考毒株相比，本实验分离的PRRSV的部分结构蛋白的抗原表位发生不同程度的突变，这些抗原位点的突变可能会使得分离毒株的抗原性发生改变。已经证明Nsp9蛋白可以和多种细胞蛋白相互作用，Dong的实验表明Nsp9蛋白可以与Marc-145及PAM细胞中的pRb蛋白相互作用以促进PRRSV在细胞内的复制（Dongetal.,2014），Zhao等的实验表明Nsp9可以和PAM细胞中的DDX5蛋白相互作用从而调节PRRSV的复制（Zhaoetal.,2015），Li等证明Nsp9的201-388aa及389-523aa区域可以和宿主细胞的ANXA2蛋白相互作用从而促进病毒的复制（Lietal.,2014），而本实验中的FJXM毒株的Nsp9蛋白的217位氨基酸发生突变（S→T），该突变位点可能会影响Nsp9蛋白与ANXA2蛋白的相互作用从而影响其在体外的复制。4.4PRRSVNsp1α和Nsp1β的原核表达近几年越来越多的实验表明：PRRSV的非结构蛋白在引起宿主细胞的免疫反应及与宿主细胞蛋白相互作用过程中发挥着重要的作用。Wang等的实验表明Nsp1α可以通过负调节宿主蛋白mdm2以及p53的表达以促进PRRSV在感染细胞早期的复制（Wangetal.,2016），Du等的实验证明Nsp1α可以和PAM细胞表面的SLA-I相互作用，而SLA-I在许多病毒与细胞相互作用的过程中发挥着非常重要的作用（DuJetal.,2015）。Li等的实验表明Nsp1β在调节宿主INF-α及INF-β表达的过程发挥重要作用（Lietal.,2016），He等的实验证明Nsp1β在调节PAM细胞TNF-α表达的过程中发挥作用（Heetal.,2015）。本实验扩增了XH-GD株的Nsp1α及Nsp1β，将其连接到原核表达载体pET-28a转化到BL21感受态，最终成功地对Nsp1α及Nsp1β进行了原核表达，为进一步研究其功能提供物质基础。45 5全文总结1、2014-2015年华南部分地区流行的PRRSV毒株主要属于以JXA1为代表的SubgenotypeI亚群和以GM2为代表的SubgenotypeVI亚群，新出现的以NADC30毒株为代表的新亚群的毒株在华南地区亦有发现。2、成功分离、鉴定了10株PRRSV，分离的毒株多与JXA1毒株亲缘关系较近。3、成功地对PRRSV的Nsp1α和Nsp1β蛋白进行了原核表达并对表达条件进行了一系列优化。46 致谢三年时光稍纵即逝，转眼间已到了要说再见的时候，一路走来有欢歌笑语也有失落、遗憾和彷徨。感谢恩师王林川教授、张桂红教授。恩师张桂红教授博学多才而又平易近人，恩师渊博的学识、豁达的胸怀、实事求是的工作作风是我一生的学习榜样！进入禽病实验室以来，恩师无论是实验上、生活上还是我的工作上都给予无微不至的教导和关怀，感谢恩师提供的自由的学术环境，感谢恩师在我想要放弃学业、无路可走之时对我的收留和帮助，感谢恩师教会了我如何乐观的去面对现实生活！师恩难忘！永记在心！由衷感谢辛朝安教授、李守军教授、廖明教授、任涛教授、亓文宝教授、王衡副教授、宁章勇教授、孙凌霜副教授、远立国副教授、樊慧英教授、曹伟胜副教授、罗开健副教授、焦培荣副研究员、贾坤老师、贾伟新老师、徐成刚老师给予的帮助和指导！特别感谢博士生崔进、周晗、陈耀在实验设计上给予的指导和建议，感谢已毕业的曹楠博士、崔甜甜硕士、邓胜朝硕士，感谢硕士生孙彦阔、石庆伟、秦锋、冯嘉萍对我实验上的帮助和支持。感谢博士生陈济铛、曹振鹏、周沛、郑运、王丽芳、付新亮，感谢硕士生纪方晓、何淑仪、赵苗苗、马骏、罗勇峰、冯松林、汪志、方博、卜德新在平时的实验室生活中给予的关心和帮助，感谢实验员徐小芹、罗玉丽、杨二霞对病料收集和血清测定工作给予的大力帮助。真心感谢挚友杨思佳同学在我最困苦的时候对我的关心、支持和帮助，感谢本科郭宇飞老师带给我的希望之火。感恩父母双亲一直对我默默的付出！无论我做出何种选择您们都义无反顾地支持我、理解我！本论文获得公益性行业（农业）科研专项经费资助（201203039）、国家生猪产业技术体系资助（CARS-36）、国家自然科学基金面上项目资助（31272564），在此特别表示感谢！本论文是在华南农业大学人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室、农业部兽用疫苗创制重点实验室、广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室和广东普通高校人兽共患预防与控制重点实验室完成。47 参考文献李冰,刘丽颖,王辉暖,等.欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪病理学特征及其组织内病毒分布[J].动物医学进展,2015,36(7):67-70.BaronT,AlbinaE,LeforbanY,etal..Reportonthefirstoutbreaksoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)inFrance.Diagnosisandviralisolation[J].AnnRechVet,1992,23(2):161-166.BenfieldDA,NelsonE,CollinsJE,etal..Characterizationofswineinfertilityandrespiratorysyndrome(SIRS)virus(isolateATCCVR-2332)[J].JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation,1992,4(2):127-133.CaoY,OuyangH,ZhangM,etal..AnalysisofmolecularvariationinporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinChinabetween2007and2012[J].VirolSin,2014,29(3):183-188.ChenJZ,WangQ,BaiY,etal..IdentificationoftwodominantlinearepitopesontheGP3proteinofhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(HP-PRRSV)[J].ResearchinVeterinaryScience,2014,97(2):238-243.ChenZ,LiM,HeQ,etal..Theaminoacidatresidue155innonstructuralprotein4ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruscontributestoitsinhibitoryeffectforinterferon-betatranscriptioninvitro[J].VirusResearch,2014,189:226-234.CollinsJE,BenfieldDA,ChristiansonWT,etal..Isolationofswineinfertilityandrespiratorysyndromevirus(isolateATCCVR-2332)inNorthAmericaandexperimentalreproductionofthediseaseingnotobioticpigs[J].JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation,1992,4(2):117-126.CorzoCA,MondacaE,WayneS,etal..Controlandeliminationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].VirusResearch,2010,154(1-2):185-192.CostersS,LefebvreDJ,DelputtePL,etal..Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusmodulatesapoptosisduringreplicationinalveolarmacrophages[J].ArchivesofVirology,2008,153(8):1453-1465.DarwichL,GimenoM,SibilaM,etal..GeneticandimmunobiologicaldiversitiesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromegenotypeIstrains[J].VeterinaryMicrobiology,2011,150(1-2):49-62.DarwichL,GimenoM,SibilaM,etal..Geneticandimmunobiologicaldiversitiesofporcine48 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