外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及Candida+Africana的分子鉴定

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分类号论文编号密级海军军医大学硕士学位论文外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及ＣａｎｄｉｄａＡｆｒｉｃａｎａ的分子鉴定ＳｐｅｃｉｅｓＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄＡｎｔｉｆｕｎｇａｌＳｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙＰｒｏｆｉｌｅｏｆＣａｕｓａｔｉｖｅＡｇｅｎｔｓｏｆＶｕｌｖｏｖａｇｉｎａｌＣａｎｄｉｄｉａｓｉｓａｎｄｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｎｏｆＣａｎｄｉｄａＡｆｒｉｃａｎａ研究生姓名：晏亮学号：２０１５１２８３指导教师：廖万清教授海军军医大学第二附属医院学科、专业：皮肤病与性病学学位类型：专业学位答辩日期：２０１８年５月二〇一八年五月 海军军医大学硕士学位论文外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定SpeciesDistributionandAntifungalSusceptibilityProfileofCausativeAgentsofVulvovaginalCandidiasisandMolecularIdentificatinofCandidaAfricana研究生姓名：晏亮专业：皮肤病与性病学学位类型：临床医学硕士专业学位导师：廖万清培养单位：海军军医大学第二附属医院二○一八年五月 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：日期年《月＞日学位论文版权使用授权声明、本人完全了解海军军医大学有关保留使用学位论文的规定，海军军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海军军医大学可以将学位论文全文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密用￥授权书（）学位论文作者签名：导师签名：日期：。曰日：：ｈ客年￥月多期年ｉｒ月日１ 目录中文摘要...........................................................................................................1英文摘要...........................................................................................................2缩略词表...........................................................................................................4前言...................................................................................................................6第一部分外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布和体外药敏分析.............8一、实验材料...................................................................................................8二、实验方法.................................................................................................10三、统计学处理.............................................................................................16四、实验结果.................................................................................................16五、讨论.........................................................................................................19六、结论.........................................................................................................31第二部分CandidaAfricana的分子鉴定.....................................................32一、实验材料.................................................................................................32二、实验方法.................................................................................................33三、实验结果.................................................................................................35四、讨论.........................................................................................................37五、结论.........................................................................................................39参考文献.........................................................................................................41文献综述.........................................................................................................51硕士期间发表文章.........................................................................................64致谢.................................................................................................................65 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定摘要第一部分外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布和体外药敏分析外阴阴道念珠菌病（VVC）是女性的常见病，病原菌包括最常见的白念珠菌以及光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌等。许多药敏研究报道了VVC念珠菌对常见抗真菌药物的敏感性降低，然而新疆地区VVC致病菌的菌种分布以及体外药敏的信息很少，因此本研究对新疆地区236株VVC念珠菌进行了菌种鉴定，并依照M27-A3方法检测了其对11种抗真菌药物（包括棘白菌素类以及新三唑类药物）的体外敏感性。结果显示236株VVC念珠菌由207株白念珠菌、18株光滑念珠菌、9株克柔念珠菌、1株近平滑念珠菌、1株热带念珠菌构成。新疆VVC白念珠菌分离株对棘白菌素类体外敏感性好，对卡泊芬净敏感性劣于另外两种棘白菌素类；对两性霉素B、5-氟胞嘧啶敏感性好；对氟康唑敏感性较好，但对伊曲康唑、伏立康唑敏感性差，且对伏立康唑耐药率高于其他报道；对新三唑类药物的敏感性好，但MIC值明显低于IFI念珠菌分离株；部分菌株对三唑类药物出现交叉耐药现象。新疆VVC光滑念珠菌分离株和克柔念珠菌分离株对卡泊芬净敏感性差，但对米卡芬净、阿尼芬净敏感性好；对两性霉素B、5-氟胞嘧啶体外敏感性好；对氟康唑、伊曲康唑敏感性差，对新三唑类药物的敏感性好；伏立康唑对光滑念珠菌分离株MIC50/90为0.5/1ug/ml，克柔念珠菌分离株对伏立康唑敏感性好。唯一的近平滑念珠菌对11种抗真菌药物均敏感，但唯一的热带念珠菌对卡泊芬净、伊曲康唑剂量依赖，对氟康唑、伏立康唑耐药，对其余7种抗真菌药物敏感。第二部分CandidaAfricana的分子鉴定Candidaafricana是白念复合体中的一个新物种，其能形成芽管但不能形成厚膜孢子，不能利用N-乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖、海藻糖和DL-乳酸作为唯一的碳源，实验室普通的鉴定手段难以将其从白念复合体中区分开来。Candidaafricana易感染/定植女性阴道粘膜，全球各地都有分离出该物种的报道，但目前对这一新物种的流行病学、遗传学分布及特征等信息了解尚少。本研究收集了来自新疆和上海的VVC菌株，运用HWP1基因扩增测序方法成功鉴定出4株Candidaafricana分离株，并对其进行多位点序列分型分析，发现3株属于亚洲特有的ST型—ST型782，另1株属于新的ST型（提交MLST数据库后被命名为ST型3432）。这4株Candidaafricana分离株对11抗真菌药物均具有良好的体外敏感性。关键词：VVC，菌种分布，体外药敏，Candidaafricana，分子鉴定-1- 海军军医大学硕士学位论文AbstractPartone:SpeciesDistributionandAntifungalSusceptibilityProfileofCausativeAgentsofVulvovaginalCandidiasisVulvovaginalcandidiasis（VVC）isaverycommondisease，whosecausativeAgentsincludesCandidaalbicans、Candidaglabrata、Candidakrusei、Candidaparapsilosis、Candidatropicalisetc.ThereweresomereportsonreducedsusceptibilityofCandidaisolatesfromvulvovaginalcandidiasistocommonantifungalagents,however,littleinformationisavailableregardingthespeciesdistributionandantifungalsusceptibilityprofileofcausativeagentsofvulvovaginalcandidiasisinwesternChina—Xinjiang.Ourresearchidentified236CandidaisolatesfromVVCpatientsinXinjiangandinvestigatedtheirantifungalsusceptibilityto11antifungalagents(includingthreeechinocandinsandthreenewtriazoles)accordingtoM7-A3protocol.207Candidaalbicansisolates、18Candidaglabrataisolates、9Candidakruseiisolates、1Candidaparapsilosisisolateand1Candidatropicalisisolatewerefound.CandidaalbicansisolatesfromXinjiangweresusceptibletothreeechinocandinswhilemicafunginandanidulafunginhadlowerMICvaluesthanthoseofcaspofungin;theyshowedgoodsusceptibilitytoAmphotericinBandflucytosine;mostofthemweresensitivetofluconazolewhereasitraconazoleandvoriconazolehadreducedactivitytohalfoftheCandidaalbicansisolatesandhigherrateofresistancetovoriconazolewasfound;theyweresusceptibletothreenewtriazolesbutthesusceptibilitywaslessthanthatofCandidaalbicansisolatescausinginvasiveinfections;andthereweresomeCandidaalbicansisolatescross-resistanttotriazoles.CandidaglabrataisolatesandCandidakruseiisolatesfromXinjianghadgoodsusceptibilitytoechinocandinsexceptcaspofungin;theyalsoreactedwelltoAmphotericinB、flucytosineandnewtriazoleswhiletheyperformedinactivelytofluconazoleanditraconazole;whenitcomestovoriconazole,CandidakruseiisolatesshowedgoodsusceptibilityandMIC50/90againstCandidaglabrataisolateswere0.5/1ug/ml.ThesoleCandidaparapsilosisisolatewassusceptibletoallantifungalagentsbutthesoleCandidatropicalisisolatehadreducedsusceptibilitytocaspofunginanditraconazoleandresistancetofluconazoleandvoriconazole.Parttwo:MolecularIdentificationofCandidaafricanaCandidaafricanaisanewspeciesorvarietywithintheCandidaalbicanscomplex.Itproducesagermtubebutnotchlamydosporesanddoesn’thavetheabilitytoassimilatethe-2- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定glucosamine、trehalose、DL-lactateandN-acetylglucosamine.ItisdifficulttodiscriminatethispathogenfromCandidaalbicanscomplexinclinicallaboratories.Ithasnaturaltendencytoinfectorcolonizethegenitalmucosaofwomenanditsdistributionappearstobeworldwide,butthereisapoorunderstandingofitsepidemiologyandgeneticsandmoreinvestigationisneeded.Inthepresentstudy,fourCandidaafricanaisolateswereidentifiedsuccessfullybyusingHWP1genePCRandtheMLSTresultsshowedthreeCandidaafricanaisolatessharedtheuniquesequencetypeofAsia—ST782andtheremainingoneisolatesharedanewsequencetype(ST3432namedbyMLSTDatabase).AllCandidaafricanaisolatesweresusceptibleto11antifungalagentstested.KEYWORDS:VVC,Speciesdistribution,invitroantifungalsusceptibility,Candidaafricana,Molecularidentification-3- 海军军医大学硕士学位论文缩略词表英文缩写英文全称中文名称VVCVulvovaginalcandidiasis外阴阴道念珠菌病RVVCRecurrentvulvovaginalcandidiasis复发性外阴阴道念珠菌病OTCOver-the-Counter非处方药ITSInternalTranscribedSpacer内转录间隔区D1D2rDNAregionD1/D2D1/D2区HWP1HyphalWallProtein1菌丝蛋白1PCRPolymeraseChainReaction多聚酶链式反应MLSTMultilocusSequenceTyping多位点序列分型DMSODimethylSulphoxide二甲基亚砜AniAnidulafungin阿尼芬净CasCaspofungin卡泊芬净MicMicafungin米卡芬净AmBAmphotericinB两性霉素B5-FCFlucytosine5-氟胞嘧啶FluFluconazole氟康唑ItrItraconazole伊曲康唑VoriVoriconazole伏立康唑PosaPosaconazole泊沙康唑IsaIsavuconazole艾莎康唑RavRavuconazole雷夫康唑SDASabouraud’sAgar沙氏琼脂培养基STSequenceType序列型MICMinimalInhibitoryConcentration最小抑菌浓度MIC5050%ofMinimalInhibitoryConcentration50%最小抑菌浓度MIC9090%ofMinimalInhibitoryConcentration90%最小抑菌浓度SSusceptible敏感SDDSusceptibleDose-Dependent剂量依赖RResistant耐药-4- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定GMGeomeanvalue几何平均值-5- 海军军医大学硕士学位论文前言外阴阴道念珠菌病（vulvovaginalcandidasis,VVC）系由念珠菌感染所引起的外阴和阴道的炎症，其确切的发病率尚不可知，因为VVC不是一种可报道的疾病，其数据收集常受不准确的诊断、不具代表性的研究人群等影响。绝大多数女性一生中至少有过一次VVC的发作，其中一半会经历复发[1]。虽然VVC不致死，但它严重影响了广大女性的日常生活和身心健康，也带来了巨大的经济损失，据估计在美国VVC每年诊疗的花费约十亿美元[2]。VVC可分为单纯性VVC和复杂性VVC，单纯性VVC是指正常非孕女性偶发的、由白念珠菌导致的轻或中度VVC。复杂性VVC包括:复发性VVC（1年内发作次数≥4）、重度VVC、妊娠期VVC、非白念珠菌所致的VVC或宿主为未控制的糖尿病患者、免疫低下者[3]。VVC临床表现无特异性，可表现为外阴红肿、灼痛、性交痛、排尿困难、白带异常等，目前其治疗方法主要为局部外用咪唑类药物和口服氟康唑[4]。念珠菌在自然界广泛分布，可以定植在人体的生殖器粘膜、泌尿系统、皮肤、呼吸系统、胃肠道、口腔等处，当宿主免疫力下降或菌群失衡时可致病[5]。念珠菌种类繁多，可引起人类感染的约十余种，可引起VVC的包括白念珠菌（Candidaalbicans）、光滑念珠菌（Candidaglabrata）、克柔念珠菌（Candidakrusei）、近平滑念珠菌（Candidaparapsilosis）、热带念珠菌（Candidatropicalis）、都柏林念珠菌（Candidadubliniensis）、季也蒙念珠菌（Candidaguilliermondii）、葡萄牙念珠菌（Candidalusitaniae）、乳酒念珠菌（Candidakefyr）、挪威念珠菌（Candidanorvegensis）、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、平常念珠菌（Candidainconspicua）、红酵母（Rhodotorulaglutinis）等[6]。根据美国、欧洲、澳大利亚等地数据显示VVC病原菌中76%-89%为白念珠菌，7%-16%是光滑念珠菌；而在亚非有些地区（土耳其、尼日利亚、伊朗、印度等）白念珠菌的比例相对较低，甚至低于50%，但非白念珠菌的比例较高，尤其是光滑念珠菌比例可高达30%-50%[5,7]；而在我国，绝大部分地区VVC病原菌中白念珠菌所占的比例在70%-90%，光滑念珠菌所占比例在4%-20%[8]。总的来说，一般认为白念珠菌是VVC的主要病原菌，光滑念珠菌是非白念珠菌中最常见的病原体。由非白念珠菌引起的VVC被认为在逐年增加[9,10]，这可能与单剂治疗、低剂量唑类维持治疗、OTC抗真菌药使用所带来的菌群选择有关[11]；而非白念珠菌对抗真菌药物（尤其是唑类）不敏感的现象较白念珠菌更常见[12-14]；非白念珠菌容易引起绝经期或HIV感染或糖尿病控制不佳的女性罹患VVC，也易导致RVVC（在RVVC病原菌中占-6- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定32-40%，在非RVVC病原菌中占11%-20%）[7]，以上这些信息提示VVC病原学鉴定具有重要的临床意义。目前已有的抗真菌药主要分为五大类：多烯类、唑类、核苷类、烯丙胺类、棘白菌素类。多烯类包括制霉菌素和两性霉素B等；唑类可以分为三唑类和咪唑类，三唑类包括伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、艾莎康唑、雷夫康唑、泊沙康唑等，咪唑类包括咪康唑、克霉唑、益康唑等，主要被作为外用制剂；核苷类包括灰黄霉素与5-氟胞嘧啶等；特比萘芬是烯丙胺类的代表药物；棘白菌素类包括阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净等[15]。许多药敏研究报道了VVC念珠菌对常见抗真菌药物的敏感性降低，如制霉菌素、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、5-氟胞嘧啶等[16-33]，这说明对VVC病原菌进行动态的药敏监测的必要性。虽然我国VVC致病菌的菌种分布和体外药敏相关研究不少，但大多集中在北上广、浙江等发达地区，新疆地区罕有报道；且大多采用ROSCO或E-Test等非液基稀释法进行试验，试验药物集中在伊曲康唑、氟康唑、酮康唑、制霉菌素、5-FC等经典抗真菌药物[8]。本研究对来自新疆VVC患者的236株菌株进行了病原学鉴定和包括棘白菌素类、新三唑类药物在内的11种抗真菌药物体外敏感性分析，为临床诊断治疗提供参考。Candidaafricana（尚无中文名）是一种新发现的机会性致病菌，由Tietz等人从非洲、德国两地病人的阴道分泌物中首次分离出[34]，在2001年被正式命名为Candidaafricana，并作为白念复合体中的一个新物种[35]。Candidaafricana不能利用N-乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖、海藻糖和DL-乳酸作为唯一的碳源、能形成芽管但不能形成厚膜孢子，这些特性与白念珠菌不同[35]，但基于大多数实验室常用的鉴定手段如ITS和D1D2区测序等显示两者的种间差异仅为0.5%左右，以及两者表型相似，Candidaafricana通常被误认为白念珠菌[35-37]。不过目前，HWP1基因PCR、ITS2焦磷酸测序等分子诊断学方法已能明确鉴定Candidaafricana[38,39]。全球多地都有报道分离出Candidaafricana，主要来源于阴道分泌物，但也有血培养中分离出Candidaafricana的报道[40]。然而对Candidaafricana的流行病学数据以及生物学特点，我们尚知之甚少。本研究收集了来自新疆和上海VVC患者的菌株，对D1D2区测序已鉴定为白念珠菌的菌株进行HWP1基因扩增测序，鉴定是否有Candidaafricana菌种，并对其进行多位点序列分型分析（MLST），以便更好地了解菌株之间的表型变异，此外还检测Candidaafricana分离株对11种抗真菌药的体外药物敏感性。-7- 海军军医大学硕士学位论文第一部分外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布和体外药敏分析一、实验材料（一）实验菌株收集新疆医科大学第一附属医院2015年10月-2017年2月VVC患者阴道分泌物患者分离的菌株共236株。（二）质控菌株ATCC22019—近平滑念珠菌ATCC6258—克柔念珠菌（三）主要实验试剂二甲基亚砜（DMSO）国药集团化学试剂有限公司氯化钠（NaCl）生工生物工程股份有限公司50×TAE缓冲液生工生物工程股份有限公司AgaroseB琼脂糖生工生物工程股份有限公司Gelstain(10000×)北京全式金生物技术有限公司Trans2KplusIImarker北京全式金生物技术有限公司阿尼芬净（Ani）TorontoResearchChemicalsInc.卡泊芬净（Cas）Sigma-Aldrich公司米卡芬净（Mic）AstellasPharma公司两性霉素B（AmB）Sigma-Aldrich公司5-氟胞嘧啶（5-FC）Sigma-Aldrich公司氟康唑（Flu）Sigma-Aldrich公司伊曲康唑（Itr）Sigma-Aldrich公司伏立康唑（Vori）TorontoResearchChemicalsInc.泊沙康唑（Posa）Sigma-Aldrich公司艾莎康唑（isavuconazole,Isa）TorontoResearchChemicalsInc.雷夫康唑（ravuconazole,Rav）Sigma-Aldrich公司-8- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定快速裂解液LysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR（Takara公司）RPMI1640培养液：RPMI1640粉末1袋（LifeTechnologiesCorporation）、MPOS缓冲液粉剂34.5g（生工生物工程股份有限公司）、碳酸氢钠2g（生工生物工程股份有限公司）、碳酸氢钠（生工生物工程股份有限公司），用UP超纯水定容至1L后过滤除菌。沙氏琼脂培养基：沙保氏液体培养基30g（OXOID公司）、琼脂粉20g（国药集团化学试剂有限公司），UP超纯水1L，高压蒸汽灭菌，冷却后分装至无菌培养皿，置于4度冰箱备用。科马嘉培养基：念珠菌筛选显色培养基干粉47.7g（上海科马嘉微生物技术有限公司）、UP超纯水1L，微波炉加热至琼脂溶解，冷却后分装备用。26SrDNAD1/D2区基因扩增引物：上游引物NL-1：5´-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG下游引物NL-４：5´-GGTCCGTGTTTCAAGACGG（四）主要仪器与耗材电热恒温培养箱上海一恒科学仪器有限公司微波炉海尔电器有限公司4℃/-20℃医用低温保存箱海尔电器有限公司-40℃冰箱海尔电器有限公司-80℃冰箱RevcoScientific公司高压蒸汽灭菌锅施都凯仪器设备（上海）有限公司电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司分析天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司细胞克隆观测仪宁波新芝生物科技股份有限公司台式高速离心机德国Eppendorf公司C1000TouchPCR仪Bio-Rad公司96孔细胞培养板corning公司自动酵母计数仪（Countstar）上海睿钰Countstar酵母计数板上海睿钰0.5～20uL微量加样器德国Eppendorf公司10～100uL微量加样器德国Eppendorf公司50～200uL微量加样器德国Eppendorf公司1000uL微量加样器德国Eppendorf公司-9- 海军军医大学硕士学位论文10～100ul移液排枪德国Eppendorf公司50～1200ul多道电动移液器德国Eppendorf公司电动移液器ThermoScientific公司离心管、枪头德国Eppendorf公司生物安全柜HealForce公司女用无菌棉拭子浙江拱东医疗科技有限公司PH试纸国药集团化学试剂有限公司一次性培养皿上海卓康生物科技有限公司无菌接种环巴罗克集团有限公司电泳仪（型号EPS300）上海天能科技有限公司全自动数码凝胶成像分析系统上海天能科技有限公司漩涡混合仪生工生物工程股份有限公司干式恒温器杭州奥盛仪器有限公司超纯水机（Master-SPlusUVF）上海和泰仪器公司电热高温接种试管灭菌器天津开发区合普工贸有限公司超微量分光光度计德国TitertekBerthold公司真空抽滤泵青岛科恒实验设备有限公司二、实验方法（一）样本采集、培养图1科马嘉培养基各念珠菌不同颜色的菌落用无菌棉拭子置于患者阴道后穹窿处，沾取足量阴道分泌物后放回无菌管中。在-10- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定生物安全柜内将阴道分泌物接种于科马嘉培养基上，在30℃恒温箱内培养24-48h后初步判断菌种，初次培养分离后取单菌落转种于沙氏培养基，30℃恒温箱内培养48h。科马嘉培养基上菌种初步判定（见图1）：绿色—白色念珠菌；蓝灰色—热带念珠菌；粉红色—克柔念珠菌；紫色—光滑念珠菌；白色—其他念珠菌。（二）菌种鉴定1、提取DNA在灭菌的EP管中加入50μl快速裂解液，挑取单个菌落搅匀于EP管中，置于干式恒温器上80℃热变性15分钟，低速离心后，取裂解的上清作为PCR模板。2、分光分度计检测菌株DNA及其浓度：（1）微量移液器吸取1ulTE于基座上，校正分光光度计。（2）擦净基座上TE，微量移液器吸取1ulDNA裂解液于基座上，读取A260/A280、A260/A230，判断DNA纯度并记录相应浓度。（3）擦净后进行下一样本检测。3、26SrDNAD1/D2区基因PCR扩增（1）PCR反应体系（25ul）：DNA1.5ulNL-1(10uM)0.5ulNL-4(10uM)0.5ul2*EasyTaqPCRSuperMix12.5ulddH2O10.0ul（2）PCR反应条件94℃3min-11- 海军军医大学硕士学位论文94℃30sec5830sec30Cycles℃7230sec℃72℃10min4、PCR产物凝胶电泳检查用超纯水将50×TAE缓冲液稀释50倍（即l×TAE）后，加入电泳槽内。称取0.6gAgaroseB琼脂糖粉，加入40ml的l×TAE缓冲液中，混匀，置微波炉里加热到琼脂糖粉完全溶解（中高火1分钟），室温冷却后加入2.5ulGelstain后，往电泳槽注入胶液，完全凝固后取出梳子，把凝胶放入电泳仪中并使其浸没。取marker2.5ul、各PCR体系产物2.5ul上样于琼脂凝胶内。110伏电压电泳25分钟后取出琼脂凝胶，使用全自动数码凝胶成像分析系统，确认PCR产物。5、DNA测序PCR产物送至公司测序。6、26SrDNAD1/D2区基因序列分析应用seqman7.1.0将所得的双向序列进行拼接，将拼接后的fasta格式序列与BLAST数据库序列进行比较，确认菌种类型。数据库网址为https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。7、提交GenBank获取序列编号应用软件Sequin15.50版本提交相关序列数据：1、完善个人信息；2、选择批量提交序列；3、导入核酸序列（fasta格式）；4、填入物种、基因位置等信息；5、完善序列所对应的菌种信息、扩增引物信息等；6、选择“validate”检查是否有错误，按“done”提交序列，并发送邮件至gb-sub@ncbi.nlm.nih.gov获取序列编号。（三）体外抗真菌药物敏感试验参照美国国家临床实验室标准化委员会（CLSI）推荐的M27-A3和M27-S4，用微量稀释法进行体外抗真菌药物敏感性试验[41,42]。1、配制药物母液称取定量的阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净溶于DMSO中，配制成800ug/ml的-12- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定药物母液；称取定量的两性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑溶于DMSO中，配制成1600ug/ml的药物母液；称取定量的5-氟胞嘧啶溶于灭菌的超纯水中，配制成5120ug/ml的药物母液。对制备好的各药物母液进行分装后，放置于-40℃冰箱备用。2、制备药敏反应板两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑按照表1的方法稀释配备，阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净母液浓度调整为800ug/ml，具体稀释方法同表1；以上10种药物配制到中间浓度后，步骤1-10各浓度的药液用DMSO稀释50倍后分别加入96孔板的1-10列中，每列各孔加入100ul（试验终浓度为中间浓度稀释100倍）。表1溶于DMSO的药物药敏反应板稀释方法稀释100药物浓中间浓倍后的步骤度来源体积（ml)+水(ml)==度(ug/ml)终浓度(ug/ml)（ug/ml)11600母液16001621600步骤10.50.5800831600步骤10.51.5400441600步骤10.53.520025200步骤40.50.510016200步骤40.51.5500.57200步骤40.53.5250.25825步骤70.50.512.50.125925步骤70.51.56.250.06251025步骤70.53.53.130.03135-氟胞嘧啶按照表2的方法稀释配备，步骤1-10各浓度的药液用灭菌超纯水稀释5倍后分别加入96孔板的1-10列中，每列各孔加入100ul。各药物浓度范围如下：阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净为0.016-8ug/ml；两性霉素B、氟康唑、伊-13- 海军军医大学硕士学位论文曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑为0.0313-16ug/ml；5-FC药敏反应板稀释方法；5-氟胞嘧啶为0.125-64ug/ml。表25-FC药敏反应板稀释方法药物浓稀释10倍中间浓步骤度来源体积（ml)+水(ml)==后的终浓度(ug/ml)(ug/ml)度（ug/ml)15120母液17640642640步骤111320323640步骤113160164160步骤3118085160步骤30.51.54046160步骤30.53.5202720步骤611101820步骤60.51.550.5920步骤60.53.52.50.25102.5步骤9111.250.1253、配制菌悬液（1）将实验菌株以及质控菌株接种于SDA培养基，对菌株进行活化（35℃培养24h）。（2）配制0.85%的生理盐水，高压灭菌后分装于EP管中，用无菌接种环刮取适量的菌落溶于生理盐水中，漩涡混合仪涡旋震荡15s。（3）吸取20ul菌悬液置于countstar计数板，于自动酵母计数仪计数，每毫升菌悬液酵母数目控制在1×106-5×106个，若浓度过高或过低，则重新配制菌悬液。4、加样用1640培养液对菌悬液进行稀释，先稀释50倍，再稀释20倍。取出11个抗真菌药的药敏反应板置于生物安全柜中，各药敏反应板1-8行加入8种不同的稀释好的菌悬液，第1-11列每孔加入100ul菌悬液，第12列不加菌悬液；各药敏反应板第11列每孔再加入100ul溶有2%DMSO的1640培养液（生长对照），第12列每孔加入200ul溶有2%DMSO的1640培养液（空白对照）。加样前各液体均用漩涡混合仪充分混匀。-14- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定5、培养将加好样的药敏反应板置于35℃培养箱培养，棘白菌素类、两性霉素B、氟康唑的药敏反应板培养24h后读取结果，5-氟胞嘧啶、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑的药敏反应板培养48h读取结果。6、读取结果将药敏反应板放置于细胞克隆观测仪上，通过与生长对照孔比较菌株生长情况来视觉判定药物的最低抑菌浓度（MinimalInhibitoryConcentration，MIC）。使菌株生长抑制100%（完全澄清）的最低药物浓度作为两性霉素B的MIC值；其他10种药物则以使菌株生长抑制50%（浊度明显降低）的最低药物浓度作为MIC值。根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）公布的解释折点判定抗真菌药物对菌株的敏感性，敏感（Susceptible，S）、剂量依赖（SusceptibleDose-Dependent，SDD）、耐药（Resistant，R）[42,43]。各抗真菌药物对不同的念珠菌菌种体外药敏具体解释折点见表3。CLSI尚未公布两性霉素B、泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑对念珠菌体外药敏的解释折点，在本研究中定义两性霉素B对念珠菌的MIC≤1ug/ml时为敏感，MIC≥2ug/ml时为耐药[20-22,25]；泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑对念珠菌的MIC≤1ug/ml时为敏感[44-49]。表3各抗真菌药物对不同念珠菌体外药敏解释折点MIC范围药物菌种SSDDR白念≤0.250.5≥1光滑≤0.120.25≥0.5Cas热带≤0.250.5≥1克柔≤0.250.5≥1近平滑≤24≥8白念≤0.250.5≥1光滑≤0.060.12≥0.25Mic热带≤0.250.5≥1克柔≤0.250.5≥1近平滑≤24≥8-15- 海军军医大学硕士学位论文白念≤0.250.5≥1光滑≤0.120.25≥0.5Ani热带≤0.250.5≥1克柔≤0.250.5≥1近平滑≤24≥8白念≤24≥8光滑-a≤32≥64Flu热带≤24≥8克柔b---近平滑≤24≥8白念≤0.120.25-0.5≥1光滑---Vori热带≤0.120.25-0.5≥1克柔≤0.51≥2近平滑≤0.120.25-0.5≥1Itr念珠菌属≤0.120.25-0.5≥15-FC念珠菌属≤48-16≥32a:暂无数据b:克柔念珠菌对氟康唑天然耐药三、统计学处理使用Excel的GEOMEAN函数计算药物对所有菌株的MIC的几何平均值（GM）。能使50%以上的菌株生长抑制100%的最低药物浓度作为两性霉素B的MIC50。能使90%以上的菌株生长抑制100%的最低药物浓度作为两性霉素B的MIC90。能使50%以上的菌株生长抑制50%的最低药物浓度作为除两性霉素B外其他10种药物的MIC50。能使90%以上的菌株生长抑制50%的最低药物浓度作为除两性霉素B外其他10种药物的MIC90。四、实验结果1、菌种鉴定新疆VVC患者阴道分泌物分离的236株菌株中，白念珠菌有207株，占绝大多数（87.7%）；其余为光滑念珠菌18株（7.6%）、克柔念珠菌9株（3.8%）、近平-16- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定滑念珠菌1株（0.4%）、热带念珠菌1株（0.4%）。2、药敏结果（1）白念珠菌207株白念珠菌对11种抗真菌药物的体外敏感性结果见表4。表4新疆VVC分离的207株白念珠菌对11种抗真菌药物的体外敏感性MIC(ug/ml)药物范围MIC50/90GMS%SDD%R%Cas0.0625-10.25/0.250.1996.13.40.5Mic0.016-0.250.016/0.03130.0210000Ani0.016-10.016/0.03130.0299.500.5AmB0.25-10.5/10.52100-05-FC0.0625->641/20.7597.102.9Flu0.0313-640.5/40.7976.315.58.2Itr0.016->80.125/10.1555.134.810.1Vori0.016->160.125/40.2251.216.931.9Posa0.0313->160.125/0.50.1495.1--Isa0.0313->160.0625/20.1289.8--Rav0.0313-40.0625/10.1093.7--从表4中可以看出，96.0%-100.0%的白念珠菌对3种棘白菌素都敏感（卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净）；但卡泊芬净的MIC90为0.25ug/ml，较米卡芬净和阿尼芬净的MIC90高（均为0.013ug/ml）。1株白念珠菌对卡泊芬净、阿尼芬净和伊曲康唑交叉耐药。207株白念珠菌对6种三唑类抗真菌药物的体外敏感性不尽相同。大约一半的菌株对伊曲康唑、伏立康唑的体外敏感性降低，并且有10.1%的菌株对伊曲康唑耐药、31.9%的菌株对伏立康唑耐药。不同于伊曲康唑、伏立康唑，其他4种三唑类抗真菌药物对大多数白念珠菌都具有良好的体外活性，76.3%的菌株对氟康唑敏感，95.1%的菌株对泊沙康唑敏感，89.8%的菌株对艾莎康唑敏感，93.7%的菌株对雷夫康唑敏感。-17- 海军军医大学硕士学位论文所有的菌株对两性霉素B都敏感。97.1%的菌株对5-氟胞嘧啶敏感，剩余2.9%的菌株（6株）对5-氟胞嘧啶耐药，但这6株5-氟胞嘧啶耐药株对其余10种抗真菌药物均敏感。（2）非白念珠菌29株非白念珠菌对11种抗真菌药物的体外敏感性结果见表5。表5新疆VVC分离的29株非白念珠菌对11种抗真菌药物的体外敏感性菌种（n）CasMicAniAmB5-FCFluItrVoriPosaIsaRavMIC50/900.5/0.50.0313/0.03130.0625/0.1250.5/10.125/24/81/10.5/11/20.25/10.5/1GM0.380.030.060.580.23.30.610.460.820.320.34光滑（18）S%11.110094.4100100-5.6-77.8100100SDD%22.205.6-010038.9----R%66.70000055.6----MIC50/901/20.125/0.250.125/0.251/28/1616/320.5/10.5/10.5/20.5/10.25/1GM10.080.160.798.6417.280.460.580.630.40.31克柔（9）S%010010088.911.1-077.888.9100100SDD%22.200-88.9-88.922.2---R%77.80011.10-11.10---近平滑（1）MIC1120.50.1250.50.1250.03130.1250.03130.0313热带（1）MIC0.50.03130.062510.25>640.540.50.250.518株光滑念珠菌对米卡芬净和阿尼芬净敏感性较好（敏感率分别为100.0%和94.4%），但对卡泊芬净敏感性差（敏感率11.1%）。氟康唑对所有光滑念珠菌分离株的MIC值均小于32ug/ml（剂量依赖），未发现耐药株。光滑念珠菌对伊曲康唑敏感性差，敏感率仅5.6%。关于伏立康唑，CLSI尚未公布相应的解释折点，其对这18株光滑念珠菌的MIC50/90为0.5/1ug/ml。光滑念珠菌对三种新三唑类药物敏感性均较高，尤其是艾莎康唑和雷夫康唑（敏感率达100%）。所有光滑念珠菌对两性霉素B和5-氟胞嘧啶均敏感。9株克柔念珠菌对米卡芬净和阿尼芬净均敏感，但对卡泊芬净均不敏感。克柔念珠菌对氟康唑天然耐药，氟康唑对这9株克柔念珠菌分离株的MIC50和MIC90分别为16ug/ml和32ug/ml。9株克柔念珠菌对伊曲康唑均不敏感，其中1株耐药。大多-18- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定数克柔念珠菌对伏立康唑敏感。与光滑念珠菌类似，克柔念珠菌对三种新三唑类药物敏感性均较高，对艾莎康唑和雷夫康唑敏感率达100%。对于两性霉素B，8株敏感，1株耐药。对于5-氟胞嘧啶，1株敏感，8株剂量依赖。唯一的近平滑念珠菌分离株对11种抗真菌药物均敏感。唯一的热带念珠菌分离株对卡泊芬净和伊曲康唑剂量依赖，对伏立康唑耐药，对其他8种抗真菌药物均敏感。五、讨论新疆在中国的西北，在各省中面积最大，民族构成复杂，主要为汉族、维吾尔族、哈萨克族。地理上新疆深居内陆，四周有高山阻隔，与中国其他人口密度高的地方相对隔绝。本实验收集了新疆一定数目的VVC患者阴道分泌物分离的念珠菌，检测了其菌种分布情况和对11种抗真菌药物的体外敏感性。（一）菌种分布VVC是引起阴道感染的最常见病因之一，约75%的育龄期女性患过VVC。据国外的文献报道，在大多数地区VVC的主要病原体为白念珠菌，比例在75%-95%左右，其次为光滑念珠菌，此外克柔念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌也较常见[5,11]。我国大多数省市的研究报道显示VVC病原体中白念珠菌所占的比例在70%-90%范围内，光滑念珠菌是非白念珠菌中最常见引起VVC的菌种，比例在4%-20%范围内，克柔念珠菌比例在4%以内，近平滑念珠菌比例在5%以内，热带念珠菌比例在1%-10%范围内[8]。新疆有少数的研究报道了VVC的病原菌菌种分布情况。田爱军等收集了2008-2009年就诊于新疆乌鲁木齐某医院的171例VVC患者的阴道分泌物，分离出171株念珠菌，其中白念珠菌占67.44%，光滑念珠菌占14.77%，克柔念珠菌占3.98%，热带念珠菌占16.98%[50]。本研究收集了新疆236株菌株，白念珠菌占87.7%，光滑念珠菌占7.6%，克柔占3.8%，近平滑1株占0.4%，热带占0.4%。这些数据与国内的总体分布大致相同，但白念珠菌比例明显高于田爱军等人的报道[50]，光滑念珠菌和热带念珠菌的比例低于其报道。（二）药敏结果目前念珠菌的体外抗真菌药物敏感性试验主要分为三大类：液基稀释法（常量、微量）、琼脂扩散法和商业试剂盒。液基稀释法现有两种国际标准试验方法：一种由CLSI制定，2008出版了最新的M27-A3方案，2012出版了M37-A3的补充信息M27-S4；另一种为欧洲抗生素药物-19- 海军军医大学硕士学位论文敏感试验委员会（TheEuropeanCommitteeonAntimicrobialSusceptibilityTesting，EUCAST）制定发布，2008年发布了最新的EUCASTEdef.7.1。这两种方法都是标准化的方案，对于各种细节作了明确的规定，多年的实践证明重复性好，客观性强，但其操作过程复杂、需要花费大量的时间和精力，因此在临床实验室开展的难度较大。琼脂扩散法主要指CLSI推出的M44-A2酵母菌琼脂纸片扩散法，该法方便、经济和快速，适合在临床微生物实验室广泛开展。商业试剂盒包括E-test纸条（ABBIODISK公司，瑞典）、Neo-Sensitabs抗真菌药敏片（ROSCO公司，丹麦）、ATB-Fungus3（bioMe´rieux公司，法国）、SensititreYeastOne比色法真菌药敏板（TrekDiagnostics公司，美国）。E-Test和Neo-Sensitabs均为琼脂扩散法的改良产品，E-Test方便、准确，研究显示一致性较好[51]，但价格高，对部分菌株结果准确率较低。Neo-Sensitabs操作方便，价格经济，适用范围广，但对部分药物其无法区分敏感与耐药，且和标准法相比结果差异较大。ATB-Fungus3和SensititreYeastOne都是液基稀释法的改良产品，ATB-Fungus3操作方便，可机器判读结果，也可人工判读，准确度较高，但判读唑类药物的结果时变异系数较大；SensititreYeastOne和M27-A3一致性高于90%，但对氟康唑和伏立康唑一致性略差，光滑和热带念珠菌的结果和标准方法比较，一致性较差[52]。本研究依照CLSI的M27-A3法进行体外抗真菌药物敏感性试验，综合了M27-S3和M27-S4的解释折点来判定各抗真菌药物对菌株的敏感性，所得数据稳定、药物敏感性评判较为客观。1、白念珠菌白念珠菌是引起VVC的主要病原体，虽然经验性治疗常常有效，但对唑类敏感性降低甚至耐药的临床分离株也常有报道。因此对白念珠菌进行体外药敏试验对临床诊治和甄选新型治疗药物都具有重要意义。棘白菌素类药物是一类杀真菌剂，其抗菌谱广、不良反应小且轻、与唑类药物无交叉耐药现象，已被推荐作为粒细胞缺乏症患者念珠菌血症的一线治疗[53]。由于棘白菌素类药物尚无口服及阴道用制剂等原因，目前并没有被应用在VVC的治疗中，但未来其有望被应用在浅部念珠菌感染中。国内外关于VVC念珠菌对棘白菌素类药物体外敏感性的数据较少[22,54,55]。Xiao-YuShi[54]等人检测了广东湛江VVC患者来源的170株白念珠菌对卡泊芬净的体外敏感性，结果显示大部分白念珠菌对卡泊芬净敏感；AyşeKalkanci[22]等人检测了土耳其AVVC（一年发作次数少于4次））患者来源的46株白念珠菌对卡泊芬净的体外敏感性，发现卡泊芬净对白念珠菌分离株的MIC50/90为0.25/0.5ug/ml，提示大部分白念珠菌分离株对卡泊芬净敏感；DinaA.Boikov-20- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定等[55]检测了60株白念珠菌分别在PH为4和7的情况下对卡泊芬净、阿尼芬净和米卡芬净的体外敏感性，在PH为7时，少数白念珠菌分离株对卡泊芬净耐药，MIC50/90为0.25/0.5ug/ml，而所有白念珠菌在两个PH值下均对阿尼芬净和米卡芬净敏感。本研究首次检测了较大样本的VVC念珠菌分离株对3种棘白菌素类药物（卡泊芬净、阿尼芬净和米卡芬净）体外的敏感性。我们的结果显示96.0%-100.0%白念珠菌分离株均对棘白菌素类敏感，卡泊芬净的MIC90（0.25ug/ml）高于米卡芬净和阿尼芬净（均为0.0313ug/ml）。本研究中卡泊芬净的体外活性与Xiao-YuShi等、AyşeKalkanci等、DinaA.Boikov等报道的结果[22,54,55]类似。本研究中所有新疆VVC白念珠菌分离株对米卡芬净均敏感，这与DinaA.Boikov等报道的结果[55]类似。本研究中99.5%的新疆VVC白念珠菌分离株（206/207）对阿尼芬净敏感，0.5%（1/207）对阿尼芬净耐药，这与DinaA.Boikov等报道的结果[55]基本一致。棘白菌素类药物之间的交叉耐药现象在念珠菌性食道炎的白念珠菌分离株和其他念珠菌种中有报道，但尚无关于VVC白念珠菌的相关报道。此外，目前尚无白念珠菌对棘白菌素类和唑类交叉耐药的数据。在本研究中，从一名35岁的RVVC患者阴道分泌物中分离出1株白念珠菌，其对卡泊芬净、阿尼芬净和伊曲康唑交叉耐药（对3药的MIC均为1ug/ml）。表6汇总了2003-2017年国内外发表的VVC分离白念珠菌对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶体外敏感性的相关数据。从表6我们可以看出，作为VVC治疗的一线口服用药，氟康唑对大部分白念珠菌的体外活性良好。阿根廷、巴西、土耳其、美国、意大利的研究数据显示VVC白念珠菌分离株对氟康唑的敏感率在90.3%-100.0%范围[17,20-22,24,25,28]，Shu-HuaGe等[26]、Jie-YuZhang等[27]报道的深圳菌株敏感率数据与之类似（敏感率分别为98.1%和88.3%），但另三个国内的研究（菌株分别来自深圳[32]、上海[16]、北京[33]）提供的敏感率数据较其降低（敏感率70.0%-83.0%）。本研究显示中国西部新疆的VVC白念珠菌分离株对氟康唑的敏感率为76.3%，虽然与国内外敏感率数据稍有差异，但是总的敏感趋势是一致的，即大部分VVC白念珠菌对氟康唑敏感。C.C.Bulik等也发现1996-2007年期间VVC白念珠菌对氟康唑的MIC[56]90并没有明显的改变。这提示我们尽管氟康唑在VVC的治疗上已应用的年限长、范围广，但目前体外药敏试验提示并无大规模的耐药现象产生，其仍然对大部分白念珠菌引起的VVC有效。-21- 海军军医大学硕士学位论文2428参考文献菌株数目1151035416581769181920375823103529252630327512120629161230311775323396.70.03.34200.125/198.31.7/0.250.5/1100.00.00.25/490.010.00.038210.5/0.598.51.50.03/0.12100.00.00.25/496.04.00.00.125/0.25460.06/0.12<0.03/<0.032281.05.014.098.31.70.00.008/0.252003-2017年VVC白念珠菌体外药敏汇总10.10.125/451.216.931.90.5/1100.054.10.00.01/297.10.02.9207本文0.051.5表634.870.722.46.921.699.524.382.80.562.16.935.910.31.985.090.615.046.57.22.02.2<0.03/10.06/0.120.03/0.060.0氟康唑伊曲康唑伏立康唑两性霉素B5-氟胞嘧啶83.010.07.082.812.05.232.410.856.8100.00.094.80.098.15.20.088.31.90.07.04.792.781.86.817.10.570.81.112.516.6MIC50/90S%SDD%R%MIC50/90S%SDD%R%MIC50/90S%SDD%R%MIC50/90S%R%MIC50/90S%SDD%R%M27-A0.125/0.2598.5M27-A20.0M27-A21.5M27-A2M27-A2M27-A2M27-A2M27-A2M27-A20.25/20.25/0.5M44-A97.7M44-A0.25/40.0Rosco2.30.06/0.4试验方法M27-A3S40.5/4M27-A3S4M27-A3S476.3M27-A3S315.5/40.25/18.20.125/1M27-A3S390.3M27-A3S33.955.10.5/25.80.5/295.0/0.2596.05.04.00.00.25/0.50.25/0.583.080.013.016.04.04.0ATBfungus3简写:S%，敏感率；SDD%，剂量依赖率；R%，耐药率-22- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定伊曲康唑对皮肤癣菌、霉菌、酵母菌等引起的感染有效，虽然它不是国内外指南中VVC治疗推荐的首选用药，但临床常应用伊曲康唑口服联合克霉唑或乳酸杆菌阴道栓等外用来治疗RVVC，能有效控制RVVC[57,58]。表6中土耳其[19,21,22]、巴西[25]、美国[24]的数据显示VVC白念珠菌分离株对伊曲康唑的体外敏感率为70.7%-99.5%，提示伊曲康唑对VVC白念珠菌体外活性良好；但国内多地的数据显示VVC白念珠菌分离株对伊曲康唑的体外敏感率为50%左右[26,33,54]，本研究中新疆VVC白念珠菌分离株对伊曲康唑的敏感率也仅为55.1%，这些数据提出一个问题：国内伊曲康唑的广泛应用是否已经影响了VVC白念珠菌对伊曲康唑的敏感模式？伏立康唑是氟康唑的衍生物，目前已应用在侵袭性念珠菌感染中，尚未应用在VVC的治疗中。至今VVC念珠菌对伏立康唑体外敏感性的研究数据较少，国外仅DotaKFD等有所报道，DotaKFD等的研究显示VVC白念珠菌分离株对伏立康唑很高的敏感率（98.3%）[25]；国内仅ChunmeiYing有所报道，他们对上海的115株VVC白念珠菌分离株进行了研究，发现其对伏立康唑的敏感率为81.0%[16]。这些已有的数据和本研究的数据大相径庭，新疆207株VVC白念珠菌分离株对伏立康唑的敏感率仅为51.2%，而且对伏立康唑的耐药率高达31.9%（现有数据中最高），这差异的形成可能与新疆的特殊民族构成、地理位置和抗真菌药临床应用情况有关。泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑都是新型的三唑类抗真菌药物，抗菌谱广、抗菌活性强。泊沙康唑目前应用于预防侵袭性真菌感染、难治性口咽念珠菌病等。雷夫康唑由伏立康唑发展而来，能对耐氟康唑菌株发挥作用，目前处于II期临床试验阶段[59]。艾莎康唑具有水溶性，抗菌谱广，目前正在进行III期临床试验[60]。许多研究都显示这些新三唑类药物对侵袭性感染白念珠菌分离株的体外活性良好[61-65]。美国[66]和科威[67]两个研究报道了泊沙康唑对VVC白念珠菌分离株的体外活性良好（MIC特90分别为0.03ug/ml和0.064ug/ml），关于艾莎康唑和雷夫康唑对VVC白念珠菌分离株的体外活性，目前尚无相关研究。在本研究中，泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑对新疆VVC白念珠菌分离株的体外活性良好，近90%的白念珠菌分离株都能在1ug/ml以内的药物浓度内被明显抑制生长（1ug/ml被视为念珠菌对新三唑类药物的敏感折点）。泊沙康唑对新疆VVC白念珠菌分离株的MIC[59][60]90为0.5ug/ml，高于美国和科威特的结果（差异大于2个稀释浓度）。艾莎康唑对新疆VVC白念珠菌分离株的MIC50/90是0.0625/2ug/ml，明显高于国外念珠菌血症白念珠菌分离株的数据（MIC[61]50/90分别是0.002/0.004ug/ml以及0.015/0.03ug/ml[62]）。新疆VVC白念珠菌分离株对雷夫康唑的MIC50/90是0.0625/1ug/ml，也显著高于念珠菌血症白念珠菌分离株的数据（MIC50/90是0.007/0.03-23- 海军军医大学硕士学位论文ug/ml[44]以及0.016/0.125ug/ml[63]）。关于艾莎康唑和雷夫康唑，新疆VVC白念珠菌分离株和国外念珠菌血症白念珠菌分离株的MIC90的差异均大于两个稀释浓度，这差异可能与地域差异有关系，也可能和白念珠菌不同来源（分离自VVC病人或念珠菌血症病人）有关。有念珠菌监测研究表明对氟康唑耐药高度预示着对伏立康唑耐药[64]。本研究结果进一步确认了这一结论，17株对氟康唑耐药的白念珠菌分离株中有14株对伏立康唑耐药。而且，对氟康唑不敏感（剂量依赖或耐药）的白念珠菌分离株基本对伊曲康唑和伏立康唑也不敏感（49株对氟康唑不敏感的白念珠菌分离株中有49株对伊曲康唑不敏感、有47株对伏立康唑不敏感）。新疆VVC白念珠菌分离株中有92株对氟康唑或伊曲康唑不敏感，有115株对氟康唑和伊曲康唑均敏感，三个新三唑类药物对92株不敏感菌株的MIC90和GM值比115株敏感菌株降低6倍以上（详见表7）。这暗示氟康唑和伊曲康唑的滥用有可能导致对三唑类药物的全耐药。表7两组菌株对3个新三唑类药物的MIC50/90、GMS(115)aNS(92)b药物MIC50MIC90GMMIC50MIC90GMPosa0.03130.250.06141.17Isa0.03130.1250.050.2540.37Rav0.03130.1250.040.2520.28a:该组白念珠菌分离株对氟康唑和伊曲康唑均敏感b:该组白念珠菌分离株对氟康唑或伊曲康唑不敏感两性霉素B是经典的抗真菌药物，但毒性较大。5-氟胞嘧啶对念珠菌属具有良好的抗菌活性。目前两性霉素B和5-氟胞嘧啶尚未应用在白念珠菌引起的VVC治疗中。表6中可以看出既往众多研究均表明两性霉素B和5-氟胞嘧啶对VVC白念珠菌分离株具有良好体外活性[20-22,24,25]，两性霉素B的耐药现象罕见，仅有少数研究报道[20,25]。本研究中207株白念珠菌分离株对两性霉素B均敏感，与Kalkanci.A[21,22]报道的100%的敏感率一致。本研究中超过95%的白念珠菌分离株对5-氟胞嘧啶敏感，与已发表的许多数据一致[22,25]；对5-氟胞嘧啶耐药的白念珠菌分离株对其他10种抗真菌药物均敏感，没有出现交叉耐药的现象，与M.A.Ribeiro等的研究结果一致，他们的研究中发现的4株5-氟胞嘧啶耐药珠对其他测试抗真菌药物均敏感（包括氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、两性霉素B）[65]。-24- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定2、非白念珠菌（1）光滑念珠菌光滑念珠菌是引起VVC的非白念珠菌中最常见的病原体，其更易导致RVVC[11]，引起的VVC症状相对较轻，但病原菌清除较难[66]，因此对光滑念珠菌进行体外药敏来指导临床诊治是十分必要的。对于光滑念珠菌引起的侵袭性感染，棘白菌素类是临床治疗的一线选择，但光滑念珠菌对棘白菌素的耐药率有逐渐上升的趋势[67]。本研究分离的18株光滑念珠菌分离株中有12株对卡泊芬净耐药（MIC≥0.5ug/ml），卡泊芬净的MIC50/90是0.5/0.5ug/ml，与AyşeKalkanci等报道的15株AVVC光滑念珠菌分离株的结果[22]、DinaA.Boikov等报道的21株VVC光滑念珠菌分离株的结果[55]、ClaireS.Danby等报道的40株VVC光滑念珠菌分离株的结果[59]类似。不同于卡泊芬净，本研究中的光滑念珠菌分离株对米卡芬净、阿尼芬净的体外敏感性良好，无耐药株出现，米卡芬净的MIC50/90是0.0313/0.0313ug/ml，阿尼芬净的MIC50/90是0.0625/0.125ug/ml，这与目前唯一发表的研究结果接近[55]。光滑念珠菌对氟康唑天然不敏感，既往关于VVC光滑念珠菌对氟康唑体外药敏的研究数据显示MIC[18-22,24,27,28,32]。90值范围在2-32ug/ml左右，耐药率在0%-15%左右在本次研究中尚未发现氟康唑耐药株，氟康唑对18株光滑念珠菌分离株的MIC90为8ug/ml，与既往研究数据无明显差异。除土耳其的相关研究外[19,21,22]，其余地区（日本、美国、巴西、意大利、中国北京）的研究[18,23,24,28,33,55]均显示VVC光滑念珠菌对伊曲康唑体外敏感性差，耐药率高（50%-70%），MIC90值高（1ug/ml-8ug/ml）。本研究中光滑念珠菌分离株对伊曲康唑的耐药率为55.6%，MIC90为1ug/ml，与大多数国家的研究结果一致。CLSI尚未公布光滑念珠菌对伏立康唑的解释折点，目前关于VVC光滑念珠菌对伏立康唑体外敏感性的研究尚少，SaraAsticcioli等人检测了意大利143株VVC光滑念珠菌分离株对伏立康唑的体外敏感性，显示MIC[28][60]50/90是0.5/1ug/ml；W.Alfouzan等人报道伏立康唑对19株孕妇VVC光滑念珠菌分离株的MIC50/90是0.125/0.19ug/ml，对22株未孕妇女VVC光滑念珠菌分离株的MIC[60]50/90是0.125/0.5ug/ml。本研究中伏立康唑对新疆18株光滑念珠菌分离株的MIC50/90是0.5/1ug/ml，与SaraAsticcioli等的报道[28]相同。新三唑类中仅泊沙康唑有对VVC光滑念珠菌的体外药敏数据，W.Alfouzan等人-25- 海军军医大学硕士学位论文报道泊沙康唑对19株孕妇VVC光滑念珠菌分离株的MIC50/90是1/4ug/ml，泊沙康唑对22株未孕妇女VVC光滑念珠菌分离株的MIC[60]50/90是1/32ug/ml；ClaireS.Danby等报道PH为7时，泊沙康唑对40株VVC光滑念珠菌分离株的MIC50/90是0.125/0.5ug/ml[59]。本研究中77.8%的光滑念珠菌分离株对泊沙康唑敏感（MIC≤1ug/ml），泊沙康唑对18株光滑念珠菌分离株的MIC50/90是1/2ug/ml，与前两个研究结果稍有差异。目前尚无VVC光滑念珠菌对艾莎康唑、雷夫康唑体外敏感性的研究，但侵袭性感染（invasivefungalinfection，IFI）来源的光滑念珠菌在体外药物敏感性试验中对艾莎康唑和雷夫康唑敏感性高[61,68-71]。全球多中心[68]、德国[61]、欧洲[69]等地来源数据显示艾莎康唑对光滑念珠菌分离株的MIC50/90分别是0.5/2、0.25/0.5、0.125/2ug/ml，敏感率在87%-90%。全球多中心[70]、美国艾奥瓦州[71]来源的数据显示雷夫康唑对光滑念珠菌分离株的MIC50/90分别是0.25/2、0.25/1ug/ml。全球多中心来源的数据显示光滑念珠菌分离株对雷夫康唑的敏感率为89%。本研究中艾莎康唑对VVC光滑念珠菌分离株的MIC50/90是0.25/1ug/ml，敏感率为100%，雷夫康唑的MIC50/90是0.5/1ug/ml，敏感率为100%，这与前面IFI光滑念珠菌的数据基本一致，并未提示VVC光滑念珠菌对新三唑类药物的体外敏感性与IFI光滑念珠菌有差异。本研究中两性霉素B对VVC具有良好体外活性，对所有光滑念珠菌分离株的MIC值均在1ug/ml以内，敏感率为100%，与既往研究一致[17,20-22,28]。本研究中5-氟胞嘧啶对VVC也具有良好体外活性，敏感率为100%，与SandraS.Richter等的报道[24]一致，但有少数研究报道VVC光滑念珠菌分离株对5-氟胞嘧啶敏感性下降或出现耐药[21,22]。本研究中新疆VVC光滑念珠菌分离株对米卡芬净、阿尼芬净、两性霉素B、5-氟胞嘧啶、泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑敏感性好，对卡泊芬净、氟康唑、伊曲康唑敏感性差，对伏立康唑的MIC50/90是0.5/1ug/ml。（2）克柔念珠菌普遍认为克柔念珠菌的毒力较弱，但其对非生物表面（如导管、人工瓣膜等）的粘附能力非常强，能粘附在无生命物质上并繁殖，因此有侵入性操作的病人和免疫力差者易感。克柔念珠菌造成的VVC更易发生在年老的女性中（平均年龄44岁）[72]，其临床症状、体征不易和白念珠菌等引起的VVC区别，发生率也较低，临床数据少，体外药敏的数据也十分匮乏[73]。棘白菌素类是中性粒细胞缺乏患者克柔念珠菌感染的一线治疗药物，体外药敏试验中棘白菌素类对IFI分离的克柔念珠菌的MIC值较低[53]，但也有临床治疗中卡泊-26- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定芬净对克柔念珠菌敏感性下降的报道[74]。目前关于VVC克柔念珠菌与棘白菌素类的研究较少，AhmetBariGGüzel等报道了卡泊芬净对20株VVC克柔念珠菌分离株的MIC值范围在0.03-0.06ug/ml[73]；ShivaniSingh等报道了卡泊芬净对26株VVC克柔念珠菌分离株的MIC范围在0.06-2ug/ml，MIC[72]50/90是0.5/1ug/ml；尚无VVC克柔念珠菌对米卡芬净、阿尼芬净体外敏感性的研究。在本研究中，9株克柔念珠菌对卡泊芬净敏感性差，MIC[73]50/90是1/2ug/ml，明显高于AhmetBariGGüzel等的结果，但是与ShivaniSingh等的结果接近[72]。与卡泊芬净不同，本研究中克柔念珠菌分离株对米卡芬净、阿尼芬净敏感性好，MIC50/90都是0.125/0.25ug/ml，与IFI来源克柔念珠菌的相关数据接近[75-77]。克柔念珠菌对氟康唑天然耐药，耐药的分子机制目前认为主要是两种：氟康唑作用的靶酶基因ERG11突变或过度表达；ABC1编码的药物外排泵的过度表达[78]。既往数据中氟康唑对VVC克柔念珠菌分离株的MIC[24,72,73]。50/90大概为32-128/128ug/ml在本研究中氟康唑对9株克柔念珠菌分离株的MIC50/90是16/32ug/ml，稍低于前面的数据。这可能与MIC值读取时间差异有关系（本研究MIC值读取时间为24h，既往大多研究MIC值读取时间为48h）。有研究显示体外药敏中48h读取的氟康唑对克柔念珠菌的MIC值比24h读取的值高一个浓度梯度[79]。在体外药敏试验中，对伊曲康唑耐药的VVC克柔念珠菌分离株常有报道[24,32,33,72,73]，本研究中也发现1株VVC克柔念珠菌分离株对伊曲康唑耐药，而其余8株VVC克柔念珠菌分离株对伊曲康唑剂量依赖（SDD），与JHolland等的报道[12]一致，本研究中伊曲康唑对克柔念珠菌分离株的MIC50/90是0.5/1ug/ml，与ShivaniSingh等[72]的报道一致。尽管克柔念珠菌对氟康唑天然耐药，但氟康唑的衍生物—伏立康唑却对克柔念珠菌敏感性良好。全球多中心数据显示不同地区不同部位分离的克柔念珠菌对伏立康唑总的敏感率为83%，生殖器部位分离的克柔念珠菌对伏立康唑敏感率为81.5%[76]。我们的研究中伏立康唑对VVC克柔念珠菌分离株的敏感率为77.8%，这与前面的数据接近。我们的研究中伏立康唑对VVC克柔念珠菌分离株的MIC50/90是0.5/1ug/ml，与ShivaniSingh等的报道接近[72]。目前暂无VVC克柔念珠菌对泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑体外敏感性的研究，但许多研究已证实IFI分离的克柔念珠菌对这三个新三唑类药物体外敏感性良好。全球多中心研究数据显示，IFI分离的克柔念珠菌对泊沙康唑敏感率高于90%，MIC50范围在0.25-0.5ug/ml，MIC[80,81]90约1ug/ml。IFI分离的克柔念珠菌对艾莎康唑敏感率范围在90%-100%，MIC[61,62,68,69]50范围在0.125-0.5ug/ml，MIC90范围在0.5-1ug/ml。IFI分离的克柔念珠菌对雷夫康唑敏感率范围在98%-100%，MIC50范围在0.25-0.5-27- 海军军医大学硕士学位论文ug/ml，MIC[44,45,70]90约0.5ug/ml。本研究中，VVC克柔念珠菌分离株对泊沙康唑敏感率为88.9%，MIC50/90是0.5/2ug/ml；VVC克柔念珠菌分离株对艾沙康唑敏感率为100.0%，MIC50/90是0.5/1ug/ml；VVC克柔念珠菌分离株对艾沙康唑敏感率为100.0%，MIC50/90是0.25/1ug/ml，本研究中VVC克柔念珠菌分离株对泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑体外敏感性的数据与全球多中心研究中IFI分离的克柔念珠菌数据接近，并无明显差异。通常克柔念珠菌对两性霉素B都是敏感的，但偶尔也有克柔念珠菌分离株对两性霉素B耐药的报道[82]。本研究中两性霉素B对1株克柔念珠菌分离株的MIC值为2ug/ml（被认为是耐药），其余8株克柔念珠菌分离株的MIC值范围在0.5-1ug/ml，这个MIC值范围与ShivaniSingh等的报道[72]接近。5-氟胞嘧啶对绝大多数念珠菌属均具有广谱抗菌活性，但对克柔念珠菌抗菌活性欠佳[53]。本研究中，除1株敏感外，其他的克柔念珠菌分离株均对5-氟胞嘧啶剂量依赖（MIC为8-16ug/ml），AhmetBariGGüzel等也报道了阴道分泌物分离的克柔念珠菌分离株中有35.7%（10/28）的剂量依赖率（SDD%）[73]。总的来说，本研究中新疆VVC克柔念珠菌分离株对米卡芬净、阿尼芬净、两性霉素B、伏立康唑、泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑敏感性好，对卡泊芬净、氟康唑、伊曲康唑敏感性差。（3）近平滑念珠菌近平滑念珠菌是引起VVC的非白念珠菌中较为常见的一种病原体，可导致0.0%-10.2%的VVC[5]，临床常规治疗效果较好[66]。对棘白菌素类，相比其他绝大多数念珠菌属物种，近平滑念珠菌天然具有更高的MIC值，提示近平滑念珠菌可能对棘白菌素类反应较差，IDSA建议对导致深部感染的近平滑念珠菌常规进行体外棘白菌素类药物敏感性试验[53]。但目前关于VVC近平滑念珠菌对棘白菌素类体外敏感性的研究数据很少，仅DinaA.Boikov等报道了美国底特律市来自14株VVC近平滑念珠菌分离株对三种棘白菌素类药物体外均敏感，PH为7时，卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净的MIC50/90分别是0.5/1ug/ml、0.5/1ug/ml、0.5/2ug/ml[55]。在本研究中，仅分离出1株近平滑念珠菌，该分离株对3株棘白菌素类药物体外均敏感，卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净的MIC分别是1ug/ml、1ug/ml、2ug/ml，与DinaA.Boikov等的报道相近[55]。从国内外数据总的来看，VVC近平滑念珠菌对氟康唑敏感性较好，敏感率范围为80.0%-100.0%[24,29,32,83]，但对氟康唑耐药的VVC近平滑念珠菌分离株并不罕见[21,55,84,85]。本研究中唯一的VVC近平滑念珠菌分离株对氟康唑敏感，MIC值为0.5-28- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定ug/ml，在既往报道的MIC值数据范围内。深圳[32,83]、美国底特律[55]的数据显示VVC近平滑念珠菌对伊曲康唑敏感率接近100%，但美国爱荷华的数据却与之大相径庭，30株VVC近平滑念珠菌分离株对伊曲康唑敏感率仅为36.7%[24]。本研究中唯一的VVC近平滑念珠菌分离株对伊曲康唑敏感，MIC值为0.125ug/ml。至今关于VVC近平滑念珠菌对伏立康唑体外敏感性的研究数据很少，仅RafatSiddiqi等报道了印度2株VVC近平滑念珠菌分离株中1株对伏立康唑敏感、1株耐药[84]。从总体临床分离近平滑念珠菌和IFI近平滑念珠菌数据来看，伏立康唑对近平滑念珠菌体外活性较高（敏感率70.0%-99.7%）、MIC值较低[68,80,86-88]。本研究中唯一的VVC近平滑念珠菌分离株对伏立康唑敏感，MIC值为0.0313ug/ml。目前尚无VVC近平滑念珠菌对三种新三唑类药物体外敏感性的研究数据。从全球多中心的临床分离近平滑念珠菌和IFI近平滑念珠菌数据来看，泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑对近平滑念珠菌体外活性都高，MIC值基本都在1ug/ml以内，泊沙康唑MIC[68,80,81]50范围在0.06-0.12ug/ml，MIC90约0.25-0.5ug/ml；艾莎康唑MIC50范围在0.016-0.12ug/ml，MIC[68,69,89]90约0.03-0.12ug/ml；雷夫康唑MIC50范围在0.015-0.12ug/ml，MIC[44,45,70]90约0.06-0.12ug/ml。本研究中泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑对唯一的VVC近平滑念珠菌分离株的MIC值分别为0.125ug/ml、0.0313ug/ml、0.0313ug/ml，显示了新三唑类药物对VVC近平滑念珠菌良好的体外活性。既往研究数据中VVC近平滑念珠菌分离株基本都对两性霉素B敏感[20,29]，在我们的研究中唯一的VVC近平滑念珠菌分离株也对两性霉素B敏感（MIC值为0.5ug/ml）。SandraS.Richter等报道了30株VVC近平滑念珠菌分离株对5-氟胞嘧啶的敏感性，敏感率为100%，MIC[24]。本研究中唯一的VVC近平50/90是0.12/0.25ug/ml滑念珠菌分离株的MIC值是0.125ug/ml，在其报道的MIC范围内。（4）热带念珠菌热带念珠菌是侵入性念珠菌病最常见的NCA菌种，其感染通常与粒细胞缺乏、恶性肿瘤等相关，相比白念珠菌，热带念珠菌可能毒力更强、更易对常见的抗真菌药物耐药[90]。热带念珠菌约引起全球各地0.0%-17.9%的VVC[5]，妊娠、糖尿病控制不佳、低剂量唑类维持治疗是热带念珠菌性VVC的主要易感因素[91]。目前关于棘白菌素类对VVC热带念珠菌体外活性的研究数据很少，仅DinaA.Boikov等有所报道，13株VVC热带对卡泊芬净体外敏感性较差，MIC50/90是0.5/1ug/ml，但对米卡芬净和阿尼芬净体外敏感性好，敏感率均为100%，MIC50/90分别是0.008/0.016ug/ml、0.008/0.03ug/ml[55]。本研究中，新疆236株VVC分离株中仅分-29- 海军军医大学硕士学位论文离出1株热带念珠菌，卡泊芬净对该分离株的MIC是0.5ug/ml（剂量依赖），米卡芬净、阿尼芬净对该分离株的MIC分别是0.0313ug/ml、0.0625ug/ml（均敏感），三种棘白菌素类对该分离株的MIC值均在DinaA.Boikov等报道的MIC值范围内[55]。在全球药敏监测研究中，热带念珠菌临床分离株对氟康唑敏感性高（敏感率为98.3%）[92]，但热带念珠菌很快发展出对氟康唑耐药株而且对氟康唑耐药的热带念珠菌临床分离株在不断增加[93]。在已有报道中，VVC热带念珠菌分离株总体对氟康唑敏感性较好[20,23,24,29,30,32,55]，但也有少数耐药热带念珠菌分离株[33,55]。本研究中唯一的热带念珠菌分离株对氟康唑耐药（MIC＞64ug/ml），再次印证了VVC热带念珠菌对氟康唑耐药现象的出现。目前认为伊曲康唑对大多数热带念珠菌具有良好抗菌活性（MIC值比氟康唑低10倍左右），高耐药率现象很罕见，当热带念珠菌菌株对氟康唑敏感性降低时，伊曲康唑对其的MIC值会升高[94]。已有的VVC研究数据与前面的结论一致，大多数VVC热带念珠菌分离株对伊曲康唑敏感[23,29,32,55]，偶有较低的耐药率报道[32,33]。本研究中唯一的热带念珠菌分离株对氟康唑耐药，对伊曲康唑的敏感性下降（MIC值为0.5ug/ml，显示剂量依赖）。ARTEMIS（全球抗念珠菌属检测系统）数据显示伏立康唑对热带念珠菌体外活性良好[92]，来自印度的两个研究也显示VVC热带念珠菌分离株对伏立康唑敏感性较好，敏感率分别是92.3%[84]和71.4%[95]。不像克柔念珠菌等其他念珠菌属菌种，伏立康唑对热带念珠菌的体外活性并不比氟康唑高[90]。因此，本研究中对氟康唑耐药的热带念珠菌分离株对伏立康唑也耐药（MIC为4ug/ml）。目前尚无VVC热带念珠菌对三种新三唑类药物体外敏感性的研究数据。从全球多中心的临床分离近平滑念珠菌和IFI近平滑念珠菌数据来看，泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑对近平滑念珠菌体外活性都高，泊沙康唑MIC50在0.06ug/ml左右，MIC90范围在0.12-0.25ug/ml[68,80,81,88]；艾莎康唑MIC50范围在0.016-0.06ug/ml，MIC90范围在0.03-0.25ug/ml；雷夫康唑MIC[44,63,70]50为0.03ug/ml，MIC90为0.12ug/ml。本研究中泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑对唯一的VVC热带念珠菌分离株的MIC值分别为0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.5ug/ml，MIC均小于1ug/ml，提示新三唑类药物对该VVC热带念珠菌具有良好的体外活性。既往研究数据中VVC热带念珠菌分离株对两性霉素B都敏感[20,29,84]，在本研究中唯一的热带近平滑念珠菌分离株也对两性霉素B敏感（MIC值为1ug/ml）。SandraS.Richter等报道了8株VVC热带念珠菌分离株对5-氟胞嘧啶的敏感性，7株敏感（MIC范围为0.25-0.5ug/ml），1株耐药（MIC值大于128ug/ml）[24]，本研究中5-氟胞嘧啶对唯一的VVC热带念珠菌分离株的MIC值是0.25ug/ml，在SandraS.Richter-30- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定等[24]报道的MIC值范围内。六、结论本研究对新疆VVC的菌种分布和体外药敏进行了分析，共分离出207株白念珠菌、18株光滑念珠菌、9株克柔念珠菌、1株近平滑念珠菌、1株热带念珠菌。新疆VVC白念珠菌分离株对棘白菌素类体外敏感性好，对卡泊芬净敏感性劣于米卡芬净、阿尼芬净；对两性霉素B、5-氟胞嘧啶体外敏感性好；对氟康唑敏感性较好，但对伊曲康唑、伏立康唑敏感性差，且对伏立康唑耐药率高于其他报道；对新三唑类药物的敏感性好，但MIC值明显低于IFI念珠菌分离株；部分菌株对三唑类药物出现交叉耐药。新疆VVC光滑念珠菌分离株和克柔念珠菌分离株对卡泊芬净敏感性差，但对米卡芬净、阿尼芬净敏感性好；对两性霉素B、5-氟胞嘧啶体外敏感性好；对氟康唑、伊曲康唑敏感性差，对新三唑类药物的敏感性好；伏立康唑对光滑念珠菌分离株MIC50/90为0.5/1ug/ml，克柔念珠菌分离株对伏立康唑敏感性好。唯一的近平滑念珠菌对11种抗真菌药物均敏感，但唯一的热带念珠菌对卡泊芬净、伊曲康唑剂量依赖，对氟康唑、伏立康唑耐药，对其余7种抗真菌药物敏感。尽管白念珠菌仍占新疆VVC的主要病原菌，但非白念珠菌的比例仍不容小觑，尤其是光滑念珠菌、克柔念珠菌，它们对临床常用药物氟康唑、伊曲康唑敏感性差，本研究中也分离出对氟康唑、伊曲康唑敏感性差的热带念珠菌菌株，这提示我们对VVC病人常规进行分泌物培养、菌种鉴定的意义；而对于RVVC、治疗效果不好的VVC、NAC所致VVC，病原体体外抗真菌药敏试验对于调整治疗方案和药敏监测也具有十分重要的意义。尽管棘白菌素类、两性霉素B、5-氟胞嘧啶、新三唑类药物尚未应用到VVC的临床治疗中，但是这些药物对VVC病原体总体敏感性较好，未来有望成为氟康唑、咪唑类药物治疗失败患者的新选择。-31- 海军军医大学硕士学位论文第二部分外阴阴道念珠菌病来源CandidaAfricana的分子鉴定一、实验材料（一）实验菌株收集了新疆医科大学第一附属医院2015年10月-2017年2月VVC患者阴道分泌物患者分离的菌株共236株以及上海长征医院妇科门诊2016年10月至2017年1月VVC患者阴道分泌物分离的菌株共53株。（二）质控菌株以白念珠菌ATCC10231和CandidaafricanaCBS8781作为标准株。（三）主要实验试剂TransDNAmarkerII北京全式金生物有限公司26SrDNAD1/D2区基因扩增引物：上游引物NL-1:5´-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG下游引物NL-4:5´-GGTCCGTGTTTCAAGACGGHWP1基因扩增引物：上游引物CR-f:5´-GCTACCACTTCAGAATCATCATC下游引物CR-r:5´-GCACCTTCAGTCGTAGAGACGMLST七对管家基因扩增引物：a)AAT1a上游引物：5´-ACTCAAGCTAGATTTTTGGC下游引物：5´-CAGCAACATGATTAGCCCb)ACC1上游引物：5´-GCAAGAGAAATTTTAATTCAATG下游引物：5´-TTCATCAACATCATCCAAGTGc)ADP1上游引物：5´-GAGCCAAGTATGAATGATTTG下游引物：5´-TTGATCAACAAACCCGATAATd)MPIb-32- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定上游引物：5´-ACCAGAAATGGCCATTGC下游引物：5´-GCAGCCATGCATTCAATTATe)SYA1上游引物：5´-AGAAGAATTGTTGCTGTTACTG下游引物：5´-GTTACCTTTACCACCAGCTTTf)VPS13上游引物：5´-TCGTTGAGAGATAATCGACTT下游引物：5´-ACGGATGGATCTCCAGTCCg)ZWF1b上游引物：5´-GTTTCATTTGATCCTGAAGC下游引物：5´-GCCATTGATAAGTACCTGGAT其余试剂同第一部分。（四）主要仪器与耗材同第一部分。二、实验方法（一）样本采集、D1D2区测序鉴定从上海长征医院妇科门诊VVC患者阴道分泌物中分离培养出念珠菌，科马嘉培养基初步鉴定菌种后，取单菌落转种于沙氏培养基，提取DNA，对其进行D1/D2区基因PCR扩增，鉴定菌种，筛选出鉴定结果为白念珠菌的分离株，实验方法同第一部分。活化白念珠菌ATCC10231和CandidaafricanaCBS8781两株标准株后，提取DNA，对其进行D1/D2区基因PCR扩增，鉴定菌种，实验方法同第一部分。（二）HWP1基因PCR鉴定CandidaAfricana1、HWP1基因PCR筛选出新疆、上海VVC念珠菌分离株中D1D2区测序鉴定为白念珠菌的菌株，以其DNA作为模板扩增HWP1基因。以白念珠菌ATCC10231和CandidaafricanaCBS8781的DNA作为模板扩增HWP1基因，作为标准株对照。-33- 海军军医大学硕士学位论文（1）PCR反应体系（25ul）：DNA1.5ulCR-f(10uM)0.5ulCR-r(10uM)0.5ul2*EasyTaqPCRSuperMix12.5ulddH2O10.0ul（2）PCR反应条件95℃5min94℃45sec58℃40sec30Cycles72℃55sec72℃10min2、PCR产物凝胶电泳检查制备2%的琼脂糖凝胶，方法同第一部分，取TransDNAmarkerII2.5ul、各PCR体系产物2.5ul上样于琼脂凝胶内；110伏电压电泳25分钟；取出琼脂凝胶后使用全自动数码凝胶成像分析系统观察结果。与标准株的电泳条带进行比对，筛选出Candidaafricana分离株。（三）多位点序列分型（MLST）1、管家基因片段扩增分别扩增Candidaafricana分离株的7个管家基因，包括AAT1a、ACC1、ADP1、MPIb、SYA1、VPS13、ZWF1b。（1）PCR反应体系（25ul）：DNA1.5ul上游引物(10uM)0.5ul下游引物(10uM)0.5ul2*EasyTaqPCRSuperMix12.5ulddH2O10.0ul-34- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定（2）PCR反应条件942min℃9460sec℃5260sec25Cycles℃7260sec℃72℃10min2、确定核酸序列凝胶电泳检查确认PCR产物后，送至公司双向测序，确定各目的基因核酸序列。3、MLST数据分析下载7个管家基因的标准核苷酸序列，人工比对测序结果和色谱图确认是否存在杂合碱基，修正测序结果。将整理好的核酸序列提交至MLST数据库网站（https://pubmlst.org/calbicans/),可以得到确认每个管家基因的等位基因编号。按顺序将每株菌所得的7个等位基因编号进行排序，提交至MLST数据库网站，得到序列型（sequencetype，ST型）。（三）体外抗真菌药物敏感试验对筛选出来的Candidaafricana分离株进行体外体外抗真菌药物敏感试验，检测其对11种抗真菌药物（阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑）的体外敏感性，方法同第一部分。三、实验结果新疆VVC来源的236株念珠菌经D1D2区测序鉴定出207株白念珠菌，上海VVC来源的53株念珠菌经D1D2区测序鉴定出49株白念珠菌。经HWP1基因PCR鉴定，207株新疆VVC白念珠菌中筛选出1株Candidaafricana分离株（菌株编号为H101），49株上海VVC白念珠菌中筛选出3株Candidaafricana分离株（菌株编号分别为K9、K17、K24）。筛选出的4株Candidaafricana分离株均产生了一个与Candidaafricana标准株CBS8781相同的~700bp的扩增子（见图2），白念珠菌标准株ATCC10231则产生了~1000bp的扩增子。每株Candidaafricana分离株基于7个管家基因测序共得到2883bp。上海VVC-35- 海军军医大学硕士学位论文来源的Candidaafricana分离株K9、K17、K24的序列型为ST782（与MLST数据库中日本阴道分泌物分离的菌株JIMS500002一致）。新疆VVC来源的Candidaafricana分离株H101的等位基因谱在MLST数据库中未发现完全匹配的序列型，上传至数据库获得新的ST型3432。表8中汇总了4株Candidaafricana分离株各管家基因的等位基因编号以及对应的ST型。表9为4株Candidaafricana分离株对11抗真菌药物体外敏感性数据，4株Candidaafricana分离株对检测的11种抗真菌药物均敏感，卡泊芬净的MIC值范围是0.125-0.25ug/ml，米卡芬净的MIC值均为0.016ug/ml，阿尼芬净的MIC范围是0.016-0.0313ug/ml，两性霉素B的MIC范围是0.25-0.5ug/ml,5-氟胞嘧啶的MIC范围是2-4ug/ml，氟康唑的MIC范围是0.125-0.25ug/ml，伊曲康唑的MIC范围是0.0313-0.0625ug/ml，伏立康唑的MIC值均是0.0313ug/ml，泊沙康唑的MIC范围是0.0313-0.0625ug/ml，艾莎康唑、雷夫康唑的MIC值均是0.0313ug/ml。图2HWP1基因PCR产物电泳结果：M道为引物TransDNAmarkerII；1道为白念珠菌标准株ATCC10231（~1000bp）；2道代表Candidaafricana标准株CBS8781（~700bp）；3、4、5、6道分别代表Candidaafricana分离株H101、K9、K17、K24（均~700bp）。-36- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定表84株Candidaafricana分离株多位点序列分型（MLST）结果菌株STAAT1ACC1ADP1MPIbSYA1VPS13ZWF1b编号H1013432*337324325848K9782337324326148K17782337324326148K24782337324326148*新发现的ST型表9Candidaafricana分离株对11抗真菌药物体外敏感性菌株患者MIC(ug/ml)诊断编号年龄CasMicAniAmB5-FCFluItrVoriPosaIsaRavH10127VVC0.250.0160.03130.2520.1250.03130.03130.06250.03130.0313K935VVC0.1250.0160.03130.520.250.03130.03130.03130.03130.0313K1744VVC0.250.0160.0160.540.250.06250.03130.06250.03130.0313K2427RVVC0.250.0160.0160.2540.1250.03130.03130.06250.03130.0313四、讨论（一）CandidaAfricana的分布及在白念复合体中的发生率从1995年报道马达加斯加、安哥拉、德国三地分离出Candidaafricana以来[34]，全球各地均有发现Candidaafricana，包括欧洲[36,37,39,96-98]（英国、意大利、西班牙、会议）、非洲[35,99-101]、哥伦比亚[102]、智利[103]、阿根廷[104]、美国[105]、伊朗[106]、沙特阿拉伯[107]、印度[40]、日本[103]、中国[108,109]、韩国[110]等地。从这些数据来看，Candidaafricana容易定植在人类生殖器粘膜处，虽然其他部位，如血液、肾脏、尿、支气管肺泡灌洗液、导尿管、直肠、粪便、皮肤[102,103,105,107,110]，也可分离出Candidaafricana，但其主要造成外阴阴道的感染，也可导致念珠菌性龟头炎[108]，说明存在通过性传播的可能性，德国柏林一对情侣生殖器部位同时感染Candidaafricana的报道则进一步证实了这个可能性。Candidaafricana对生殖器粘膜的感染/定植主要发生在年轻女性，年龄集中在18-40岁[39,96,102,106,107,109]，少数超过此范围[106,107]。除了ThierryK.Ngouana等的报道-37- 海军军医大学硕士学位论文（2位艾滋病I期女性阴道分泌物中分离出Candidaafricana外[99]），其他被Candidaafricana感染/定植的女性全是免疫正常的。Candidaafricana在全球的地理分布广泛，但因它与白念珠菌在临床实验室中难以区分，它的流行病学信息尚不清楚，有待更进一步的研究。Candidaafricana在欧洲地区阴道分泌物白念复合体中的发生率约在6.0%-16.0%[37,39]；在伊朗阴道分泌物白念复合体中的发生率为4.4%[106]，在中国深圳阴道分泌物白念复合体中的发生率为1.5%[109]；而其在非洲地区阴道分泌物白念复合体中的发生率差异较大，尼日利亚、塞内加尔为2.0%左右[100,101]，马达加斯加为22.8%，安哥拉为39.6%[34]；马来西亚、土耳其的两个研究却显示Candidaafricana在阴道分泌物白念复合体中的发生率为0%[111,112]。在本研究中，从新疆上海两地VVC患者阴道分泌物中共分离出4株Candidaafricana，4名患者均为免疫正常的女性，其中1名女性年龄超过40岁（见表9）。Candidaafricana在新疆地区阴道分泌物白念复合体中的发生率为0.5%（1/207），在上海地区阴道分泌物白念复合体中的发生率为2.0%（3/49）。（二）CandidaAfricana的ST型AAT1a、ACC1、ADP1、MPIb、SYA1、VPS13、ZWF1b这7个管家基因是国际公认用于白念珠菌MLST的最佳管家基因位点组合标准[113]，据我们所知，已报道进行了MLST的Candidaafricana分离株共58株（参考MLST数据库以及AnuradhaChowdhary等的报道[114]），分为7个ST型，这些菌株的ST型分布和各ST型的等位基因谱见表10。表1058株Candidaafricana分离株的ST型分布和等位基因谱报道的ST型AAT1ACC1ADP1MPIbSYA1VPS13ZWF1b菌株数3057133732133213614830581337321342146148219133373213526148182393373226261483142233732262584879713391026112141178210337324326148-38- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定可以看到ST型182是全球最常见的ST型，其次是ST型782。ST型182也是欧洲、非洲地区主要的ST型，欧洲13株Candidaafricana分离株经MLST显示均为ST型182，非洲13株Candidaafricana分离株中12株为ST型182（另1株为ST型797）；中国的Candidaafricana分离株中虽然部分为ST型182，但以ST型782居多，日本唯一的1株Candidaafricana分离株也是ST型782；印度、伊朗也报道了ST型182的Candidaafricana分离株，但也有其他ST型（ST型2191、ST型3057、ST型3058）报道，印度的Candidaafricana分离株基因变异性较大，7株分离株出现4种ST型（参考MLST数据库以及AnuradhaChowdhary等的报道[114]）。现有的7个ST型均属于白念珠菌13进化枝[114]，其中ST型797基因多样性最高，有5个管家基因位点（ACC1、ADP1、SYA1、VPS13、ZWF1b）与ST型182不一致。其他6个ST型，MPIb、SYA1、VPS13三个基因位点存在差异。本研究中上海的3株Candidaafricana分离株均为ST型782，既往报道中ST型782的Candidaafricana分离株均来自中国、日本，是亚洲特有的ST型，本研究的结果进一步印证了东亚地区Candidaafricana的主要ST型是ST型782。本研究中新疆的1株Candidaafricana分离株MLST结果显示是一种的新的ST型（表8），该菌株同来自中国Candidaafricana8866（ST型3142）一样，管家基因VPS13位点的等位基因编号为58（其他ST型VPS13位点的等位基因编号为61），VPS13位点的第53位碱基从杂合状态（G/A）变为纯合的G/G。（三）CandidaAfricana的体外药敏绝大多数研究显示Candidaafricana对常用的抗真菌药物体外敏感性良好，包括棘白菌素类、5-氟胞嘧啶、两性霉素B、制霉菌素、唑类、特比萘芬[36,39,40,103,104,106,108]，本研究中的Candidaafricana分离株也对检测的11种抗真菌药物均敏感。Candidaafricana造成的VVC的临床治疗也证实了Candidaafricana对常用抗真菌药物的敏感性，外用咪唑类、口服氟康唑等治疗能有效达到临床和真菌学治愈[40,105]。然而也有少数Candidaafricana分离株耐药的报道，ThierryK.Ngouana等报道了1株Candidaafricana分离株对酮康唑耐药（分离自喀麦隆一名艾滋病I期女性的阴道分泌物）[99]，S.S.A.AL-HEDAITHY等报道了部分Candidaafricana分离株对氟康唑、伊曲康唑、酮康唑或5-氟胞嘧啶耐药[107]，Czaikaetal.等报道了Candidaafricana分离株对5-氟胞嘧啶、伏立康唑、特比萘芬耐药[36]。五、结论Candidaafricana易感染/定植女性阴道粘膜，新疆、上海VVC患者阴道分泌物-39- 海军军医大学硕士学位论文中可分离出Candidaafricana，运用HWP1基因PCR方法能成功把Candidaafricana从白念复合体中筛选出来，MLST发现新疆的1株Candidaafricana分离株是新的ST型（ST型3432），而上海3株Candidaafricana分离株是亚洲特有的ST型—ST型782，这4株Candidaafricana分离株对检测的11种抗真菌药物均敏感。目前对Candidaafricana的研究尚少，其流行病学、遗传学分布及特征等信息尚不清楚，有待更多更深入的研究。-40- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定参考文献[1]HurleyR，deLouvoisJ.Candidavaginitis[J].PostgradMedJ,1979,55(647):645[2]FoxmanB，BarlowR，D'arcyH，GillespieB，SobelJD.Candidavaginitis:Self‐ReportedIncidenceandAssociatedCosts[J].SexTransmDis,2000,27(4):230-235[3]刘朝晖，廖秦平.外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)诊治规范修订稿[J].中国实用妇科与产科杂志,2012,28(06):401-402[4]WorkowskiKA，BolanGA.Sexuallytransmitteddiseasestreatmentguidelines(2015)[J].ReproductiveEndocrinology,2015,24):51-56[5]GonçalvesB，FerreiraC，AlvesCT，HenriquesM，AzeredoJ，SilvaS.Vulvovaginalcandidiasis:Epidemiology,microbiologyandriskfactors[J].CritRevMicrobiol,2016,42(6):905-927[6]PaulitschA，WegerW，Ginter‐HanselmayerG，MarthE，BuzinaW.A5‐year(2000–2004)epidemiologicalsurveyofCandidaandnon‐CandidayeastspeciescausingvulvovaginalcandidiasisinGraz,Austria[J].Mycoses,2006,49(6):471-475[7]AchkarJM，FriesBC.Candidainfectionsofthegenitourinarytract[J].ClinMicrobiolRev,2010,23(2):253-273[8]晏亮，邓淑文，张东兴，潘炜华，廖万清.外阴阴道念珠菌病病原菌对11种抗真菌药物体外敏感性分析[J].中国真菌学杂志,2017,12(6):356-358[9]SpinilloA，CapuzzoE，GulminettiR，MaroneP，ColonnaL，PiazziG.Prevalenceofandriskfactorsforfungalvaginitiscausedbynon-albicansspecies[J].AmJObstetGynecol,1997,176(1):138-141[10]SchiffE，FriedmanSA，SibaiBM.Fungalvaginitiscausedbynonalbicansspecies[J].AmJObstetGynecol,1997,177(2):485-486[11]SobelJD.Vulvovaginalcandidosis[J].TheLancet,2007,369(9577):1961-1971[12]HollandJ，YoungM，LeeO，ChenSC.VulvovaginalcarriageofyeastsotherthanCandidaalbicans[J].SexTransmInfect,2003,79(3):249-250[13]ErdemH，CetinM，TimurogluT，CetinA，YanarO，PahsaA.Identificationofyeastsinpublichospitalprimarycarepatientswithorwithoutclinicalvaginitis[J].AustralianandNewZealandjournalofobstetricsandgynaecology,2003,43(4):312-316[14]BautersTG，DhontMA，TemmermanMI，NelisHJ.Prevalenceofvulvovaginalcandidiasisandsusceptibilitytofluconazoleinwomen[J].AmJObstetGynecol,2002,187(3):569-574[15]魏文华，曲秀君，胡欣，张君.抗真菌药物研究进展[J].中国现代药物应用,2012,6(23):111-112-41- 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外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定文献综述我国外阴阴道念珠菌病致病菌菌种分布及体外药敏研究现状【摘要】目的：回顾性分析国内外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布及体外药敏研究情况。方法：检索分析万方、中国知网、维普、Pubmed等数据库15年来中国外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布和体外药敏相关文献资料。结果：共计检索筛选60篇文献，从现有数据来看，不同地区妇科患者中VVC的患病率为10%～40%，平均为20.3%；各地研究显示外阴阴道念珠菌病的主要病原体是白念珠菌，约占70%～90%，非白念珠菌以光滑念珠菌为主；非白念珠菌在复发性外阴阴道念珠菌病的病原体中所占比例更大。大多数研究显示氟康唑、制霉菌素、两性霉素B体外抗真菌活性较高，外阴阴道念珠菌病分离的念珠菌对氟康唑敏感率在70%～98%左右，对制霉菌素、两性霉素B的敏感率超过95%；过半的研究显示外阴阴道念珠菌病分离的念珠菌对伊曲康唑敏感性高；对5-FC、酮康唑的药敏结果各地差异较大。结论：对VVC患者进行病原学鉴定和体外药敏检查十分重要，尤其是难治性VVC、复发性VVC患者，若发现病原菌为NAC，应根据体外药敏结果适当调整方案，可以选用非氟康唑类药物如AmB外用制剂、硼酸胶囊等；而对于大多数由白念珠菌引起的VVC，应用传统药物如氟康唑、制霉菌素、伊曲康唑等仍是较好的选择，酮康唑、5-FC等药物不建议作为常规选择。外阴阴道念珠菌病（vulvovaginalcandidasis,VVC）是困扰女性的常见病，据估计3/4的女性在育龄期至少患过1次VVC，其中一半人经历过复发，有5%～8%的成年女性1年发作4次以上（即复发性VVC，recurrentvulvovaginalcandidiasis，RVVC）[1]。国外研究数据显示引起VVC的病原菌中白念珠菌占70%～90%，非白念珠菌（non-albicanscandidaspecies，NAC）中以光滑念珠菌为主，克柔念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌也较常见[2,3]。此外引起VVC的病原体还包括都柏林念珠菌（C.dubliniensis）、季也蒙念珠菌（C.guilliermondii）、葡萄牙念珠菌（C.lusitaniae）、乳酒念珠菌（C.kefyr）、土生念珠菌（C.humicola）、清酒念珠菌（C.sake）、无名念珠菌（C.famata）、挪威念珠菌（C.norvegensis）、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、平常念珠菌（C.inconspicua）、红酵母（Rhodotorulaglutinis）、溶脂念珠菌（Candidalipolytica）、异常毕赤酵母（Pichiaanomala）等[4-7]。近年来NAC在VVC病原体中比例有上升的趋势[8]，而NAC对唑类抗真菌药物的敏感性通常认为比白念珠菌低[9]，-51- 海军军医大学硕士学位论文这给VVC的治疗带来困难，因此VVC病原学鉴定和体外抗真菌药敏的结果对指导临床用药至关重要。我国对VVC的研究较多，诊治方面已达成基本共识，在此不赘述，但VVC致病菌菌种分布和体外药敏相关的研究大多规模小、地区范围局限，因此本研究拟对近15年国内VVC这两方面的研究进行汇总分析，从而了解其概况，为VVC的进一步研究提供方向，为临床医生合理使用抗真菌药物提供信息。1文献检索策略以“外阴阴道念珠菌病”或“霉菌性阴道炎”或“念珠菌性阴道炎”为关键词，计算机检索万方数据库、中国知网数据库、维普数据库，以“vulvovaginalcandidiasisinchina”搜索pubmed数据库，收集国内2003-2017年发表的有关VVC流行病学和致病菌体外药敏相关文献，去除数据错误及数据重复的文献，共纳入60篇。对同一地区同一时间段的菌种分布数据进行汇总计算。所有数据分析均由SPSS15.0软件完成，计数资料比较采用卡方分析。2.1VVC患病率及菌种分布情况从一项纳入北京、上海等10个地区共3590名妇科门诊患者的流行病学研究发现VVC患病率为11.6%，其中RVVC患病率为0.58%[10]；唐山的一项研究显示当地10781名妇科患者中VVC患病率约13.09%[11]；石晓等人整合统计了不同地区阴道炎患者阴道分泌物病原体分布情况，发现VVC患病率为10.4%～39.2%，平均为24.5%[12]。从这些数据来看，妇科患者中VVC的患病率为10%～40%，平均为20.3%。但这三个研究的数据存在以下问题：第一：仅对阴道分泌物进行了真菌镜检，未进行真菌培养，存在一定的漏诊率[13,14]；第二：研究对象均为妇科门诊或住院患者，研究对象不全面；第三：研究地域较局限；因此不能准确反映中国女性VVC的发病率，而要了解VVC在女性群体中确切的发病率，有赖于更大范围、更大样本、更高质量的流行病学研究。本研究共统计了32个地区不同时间段VVC病原体分布情况[15-66]，共统计菌株22341株，分布在四川、河北、新疆、云南、广西、辽宁、天津、海南、山西、福建、山东、广东、浙江、江苏、上海、北京等省市，除白念珠菌和常见的4种念珠菌（光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌）外，我国各地报道的其他念珠菌有都柏林念珠菌、季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌、无名念珠菌、土生念珠菌、清酒念珠菌、乳酒念珠菌（也称伪热带念珠菌）、溶脂念珠菌等，红酵母、酿酒酵母、毕赤酵母、毛孢子属也有报道从VVC患者阴道分泌物中分离出来。表1[19-55]汇总了各地区VVC病原体中常见的5种念珠菌的分布情况。各地的研-52- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定究均显示白念珠菌是引起VVC的主要病原体，绝大部分地区白念珠菌分布的比例在70%～90%，白念珠菌所占比例最低是61%（山东单县[19]），最高是95.99%（广东佛山[26]）。除来自乌鲁木齐[48]、天津[46]、佛山[26]的3个研究外，其余各地研究均报道光滑念珠菌是NAC中比例最高的菌种，比例集中在4%～20%。克柔念珠菌所占比例集中在4%以内，少数报道超过4%[15,46]，最高为11.7%（天津[46]）。多数地区报道热带念珠菌所占比例在1%～10%，乌鲁木齐[48]报道了176株VVC来源的念珠菌中发现29株热带念珠菌，所占比例为16.48%（比例最高）；近平滑念珠菌所占比例均在5%以内。表1我国不同地区VVC五种致病念珠菌菌种分布情况Tab.1Speciesdistributionof5CandidastrainsfromVVCinChina菌株各念珠菌菌种百分比（%）收集时间/文献地域总数白念光滑克柔热带近平滑四川成都11086.4010.000.901.800.902004-2005[23]赣州南昌22279.287.662.706.760.002005-2007[39]江西南昌78567.4020.907.304.500.002006-2009[15]河北衡水36584.404.103.303.300.002005-2007[38]乌鲁木齐17664.7714.773.9816.480.002008-2009[48]广西田东15672.409.601.908.400.602007-2008[30]广西柳州19674.509.701.509.200.002007-2008[29]广西贵港17974.308.902.2011.702.802014[22]辽宁大连30673.8612.090.007.844.252008[24]天津12070.0010.8011.702.502.502010-2011[46]海南海口31177.1710.281.608.680.002008-2010[35]山西大同11981.5115.130.001.681.682012[25]福建福州47284.757.422.123.390.852008-2013[27-29]山东聊城24682.118.542.854.880.812009-2010[40]山东青岛31387.864.151.602.242.562011[41]山东单县100061.0023.400.0011.000.002008-2011[19]广东广州31487.904.781.912.230.321999-2004[33-34]广东广州79680.288.790.003.020.752007-2012[31-32]广东佛山32495.990.621.541.540.312003-2004[26]广东深圳318185.0010.600.501.001.502003-2012[18]广东湛江18691.404.300.003.201.102012-2013[16]-53- 海军军医大学硕士学位论文广东韶关35478.809.001.405.102.802013-2014[44]浙江杭州134879.3012.980.452.741.932001-2004[36-37]浙江温州29374.0616.380.348.191.022006-2007[47]浙江余姚90076.5611.10/*//2008-2011[49]浙江台州12069.2019.201.701.702.502015[45]上海38575.069.612.344.682.602008-2011[42-43][20-21、51]上海314987.089.150.701.271.432013-2016北京多地25089.605.200.400.401.202003[50]北京220480.5018.101.200.100.002006-2013[17]*：未分类表2[52-66]汇总了国内多地RVVC研究中常见的5种念珠菌的分布情况。这些研究的菌种分布基本与表1中VVC菌种分布情况相似，但部分研究[52-56,61,65]显示RVVC病原菌中克柔念珠菌比例较高（高于4%，最高23.8%[61]），扬州[56]的研究中RVVC组各非白念珠菌比例均明显高于其他研究。表2我国不同地区RVVC五种致病念珠菌菌种分布情况Tab.2Speciesdistributionof5CandidastrainsfromRVVCinChina菌株各念珠菌菌种百分比（%）地域分组收集时间/文献总数白念光滑克柔热带近平滑非RVVC5887.936.903.451.720.00云南昆明2008[52]RVVC6770.1517.918.962.990.00非RVVC6088.336.673.331.670.00广东东莞2010-2011[53]RVVC6073.3316.678.331.670.00非RVVC2495.830.000.004.170.00广东广州2001-2003[54]RVVC6275.813.238.066.450.00非RVVC18989.943.170.006.870.00山东聊城2008-2010[55]RVVC7678.947.896.576.570.00非RVVC8085.006.253.753.751.25江苏扬州2013-2015[56]RVVC8040.0025.0012.5013.758.75非RVVC14078.578.571.435.715.71辽宁大连2011[57]RVVC14065.0021.431.437.864.29-54- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定非RVVC13478.368.963.736.722.24江苏无锡2009[58]RVVC7671.0519.742.635.261.32非RVVC48096.462.290.210.830.21江苏无锡2004-2006[59]RVVC11491.225.260.002.630.88温州上海RVVC25478.008.304.306.700.002005-2007[60]四川宜宾RVVC6361.909.5023.800.000.002010-2011[61]上海RVVC19270.0019.004.002.005.002002[62]广东广州RVVC10584.809.520.000.952.852003-2009[63]广东深圳RVVC32882.6011.901.503.100.902003-2005[64]佛山RVVC56959.5824.085.107.032.282012[65]深圳RVVC11071.8011.800.002.731.822002-2003[66]在8个RVVC与非RVVC的分组研究中，RVVC组NAC比例均高于非RVVC组，差异均具有统计学意义（P均<0.05）；虽然8个研究中RVVC组光滑念珠菌比例均高于非RVVC组，但仅扬州[56]、大连[57]、无锡[58]的3个研究数据显示两组光滑念珠菌比例差异有统计学意义（P均<0.05）。2.2VVC致病真菌体外抗真菌药物敏感性特点表3[15,16,18,19,24,27,28,31-33,35-37,40,42,46-49,67-70]汇总了国内各地VVC念珠菌对6种抗真菌药物的敏感率（S%）、剂量依赖率/中度敏感率（SDD%）、耐药率（R%）等相关数据。所有地区VVC念珠菌对伊曲康唑的敏感率在40%～90%内，一半以上的研究显示敏感率>70%。大部分研究报道VVC念珠菌对氟康唑敏感率在70%～98%左右，但李季[68]等人报道的广州地区来源的VVC念珠菌对氟康唑敏感率（46.83%）明显低于同地区的其他研究（69.14%-95.83%），可能与其菌株全部来源于早孕VVC患者的阴道分泌物有关；山东单县[19]、聊城[40]两地的研究均报道了VVC念珠菌对氟康唑较低的敏感率（分别是51.60%和27.64%），但这两地尚无其他VVC药敏研究报道，因此山东地区来源的VVC念珠菌对氟康唑敏感性较差这个结论需要更多当地数据来证实。各地区酮康唑体外药敏结果差异很大，敏感率最低21.43%[70]，最高97.47%[68]。国内两性霉素B和制霉菌素体外药敏结果较为一致，绝大部分研究都报道VVC念珠菌对两药的敏感率超过95%。关于5-氟胞嘧啶（5-FC）对VVC念珠菌体外活性的研究相对较少，大理[70]、乌鲁木齐[48]、广州[32]、深圳[69]四地的研究报道VVC念珠菌-55- 海军军医大学硕士学位论文对5-FC敏感率在90%左右，而杭州[36,37]的两个研究报道对5-FC敏感率为23.64%和31.8%。从耐药率角度来看，大多数研究显示VVC菌株对伊曲康唑、氟康唑的耐药率在20%以内；对两性霉素B、制霉菌素的耐药率在5%以内；对酮康唑、5-FC的耐药率报道差异很大。表4[53,54,57-63,66,71]汇总了RVVC药敏研究中的相关数据，可以发现RVVC念珠菌对抗真菌药物的敏感性各地报道差异很大。相比其他5个研究，无锡、宜宾两地的研究[58,59,61]显示RVVC念珠菌对伊曲康唑和氟康唑的敏感率较低（低于40%）；而就RVVC念珠菌对制霉菌素、两性霉素B的敏感率，上海、深圳[62,66]的报道明显低于其他地区（低于80%）。在广州、无锡、东莞、大连[53,54,57-59]的5个分组研究中，RVVC组与非RVVC组念珠菌对伊曲康唑、两性霉素B、制霉菌素、5-FC这4种抗真菌药物敏感率的差异均无统计学意义（P均>0.1）；但在无锡的一个研究中，两组念珠菌对酮康唑敏感性的差异有统计学意义（P<0.05），以及在大连[57]的研究中，两组念珠菌对氟康唑敏感性的差异具有统计学意义（P<0.05）。3结论VVC是引起阴道感染的最常见原因之一，影响广大女性的生活和健康。根据国内现有研究数据显示，VVC最主要的病原体是白念珠菌，NAC中光滑念珠菌最常见；比起偶发性VVC，NAC更易导致RVVC；总的来说VVC念珠菌对氟康唑、制霉菌素、两性霉素B的体外敏感性较高；多数研究提示VVC念珠菌对伊曲康唑敏感；各地VVC念珠菌对酮康唑、5-FC的敏感性差异较大。这提示临床工作者对VVC患者进行病原学鉴定和体外药敏检查的重要性，尤其是难治性VVC、复发性VVC患者，若发现病原菌为NAC，应根据体外药敏结果适当调整方案，可以选用非氟康唑类药物如AmB外用制剂、硼酸胶囊等[1]；而对于大多数由白念珠菌引起的VVC，应用传统药物如氟康唑、制霉菌素、伊曲康唑等仍是较好的选择，酮康唑、5-FC等药物不建议作为常规选择。目前国内VVC的病原学鉴定和体外药敏检查尚未在临床得到普及，若能有相关专家共识提出，对病原学鉴定方法、药敏实验方法和参考折点进行规范和解读，将十分有利于VVC的临床管控和科学研究。-56- 外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定-57- 海军军医大学硕士学位论文-58- 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外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布、体外药敏分析以及CandidaAfricana的分子鉴定致谢硕士三年时光很快就过去了，首先感谢导师廖万清院士，不论是科研能力、临床水平，还是生活态度、待人接物、医德医风，我都从导师廖万清院士身上学到了很多，他用言传身教的方式在潜移默化中让我们不断改善、不断提高，尽管工作很忙，但仍不忘悉心教导我们。在以后的工作生活中，我会谨记恩师的教导，不断进取、努力拼搏！衷心感谢邓淑文老师、陈敏师兄等对我科研方面的指导，总能为我指正错误、指引方向，认真为我答疑解惑，使我在科研路上不迷茫、不气馁。感谢实验室的师兄师姐、师弟师妹在学习生活中的帮助，有你们一同前行我很幸运。感谢科里各位教授老师对我临床学习的帮助，你们的教导让我受益良多。感谢我的家人和朋友，在我彷徨、失落的时候开导我、支持我、鼓励我，你们是我最坚实的后盾！本文参考了大量的参考文献，在此，向各位在科研路上不懈奋斗的前辈们致敬！-65-