甲型H7N9流感病毒神经氨酸酶与其潜在小分子抑制剂的理论模拟研究

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７８单位代码１０１８３分类号：Ｑ：研宄生学号１４３４Ｅ００７密级：公开：２０吉林大学硕士学位论文（专业学位）甲型Ｈ７Ｎ９流感病毒神经氨酸酶与其潜在小分子抑制剂的理论模拟研究ＴｈｅｏｒｅｔｃａｌａｏｎｎｅｕｒａｍｓｅｏＡｌｓｉｍｕｔｉｏｎｓｔｕｄｉｎｉｄａｆｉｎｆｌｕｅｉｙｎｚａＨ７Ｎ９ｖｉｒｕｓａｎｄｉｔｓｏｔｅｎｔｉａｌｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（）ｐ作者姓名：高俊峰类别：工程硕士领域专业名称：生物工程指导教师：单亚明教授培养学位类别：工程硕士２０１７年１２月 甲型Ｈ７Ｎ９流感病毒神经氨酸酶与其潜在小分子抑制剂的理论模拟研究ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓｔｕｄｙｏｎｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡ（Ｈ７Ｎ９）ｖｉｒｕｓａｎｄｉｔｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｓｍａｌ！ｍｏｌｅｃｕｌｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ作者姓名：高俊峰（）工程领域方向：生物指导教师：单亚明教授学位类别：工程硕士答辩日期：年月日 未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，。除文中已经注明引用的内容外独立进行研宄工作所取得的成果，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名日期：年仏月／日 摘要摘要甲型H7N9流感病毒神经氨酸酶与其潜在小分子抑制剂的理论模拟研究流感病毒（Influenzavirus）是流行性感冒的病原体，感染流感病毒通常会引发多种病症，例如发烧、咳嗽、咽喉以及肌肉疼痛，病情严重时还可能发展为危及生命的肺炎。流感病毒主要分为甲、乙、丙三型，三种型别中，甲型流感病毒抗原性变异最高，曾经引起过多次世界性的大流行。H7N9流感病毒于2013年3月底首次在上海和安徽通报发现，随后全国陆续确诊多起H7N9病例，每年确诊人数几十至几百人不等，死亡人数也在陆续增加。H7N9型流感病毒是全球首次发现的新亚型流感病毒，流感病毒在序列上的变异程度再次引起了世界性的高度关注。当前流感病毒的防治主要依靠疫苗和抗病毒药物。近些年来，世界范围内对于流感疫苗的使用证实了其在预防方面的关键作用，尤其是针对季节性流感的防御，疫苗发挥作用巨大。但是，由于甲型流感病毒亚型多，各亚型抗原易变异，疫苗的有效性又主要依赖于制备疫苗的病毒株与当前流株之间抗原性的相似性程度，因而仅仅依靠疫苗难以完全控制病情，药物治疗仍然是防控流感的重要途径。流感病毒神经氨酸酶（Neuramidinase，NA）在流感病毒的生命周期中起着关键的作用。NA能够通过其催化作用使存在于唾液酸末端的N-乙酰基神经氨酸与邻近寡糖D-半乳糖或D-氨基半乳糖之间的α(2,6)或α(2,3)酮苷键裂解，从而协助子代的病毒从感染的宿主细胞表面释放，使子代病毒获得进一步感染新的靶细胞的能力。因其在流感病毒生命过程中所发挥的关键作用，以NA为靶点的抗流感病毒药物设计成为抗病毒领域的研究热点。本研究选取H7N9的NA为对象，主要利用虚拟筛选、分子动力学模拟，拉伸分子动力学模拟等方法考察作为H7N9NA潜在抑制剂的天然小分子与NA的结合机制及结合过程，主要研究内容分为如下两个方面：I 摘要1、考察并验证从ZINC数据库筛选出的天然小分子与NA的结合方式，为针对以NA为靶点的抑制剂前体药物设计提供理论线索。2、应用拉伸分子动力学方法考察小分子与NA的脱离/结合过程，探究小分子的动态行为以及其结合对于NA催化位点的影响，寻求抑制机制。关键词：甲型H7N9流感病毒，小分子抑制剂，虚拟筛选，分子动力学模拟，拉伸分子动力学模拟II AbstractAbstractTheoreticalsimulationstudyonneuraminidaseofinfluenzaA(H7N9)virusanditspotentialsmallmoleculeinhibitorsInfluenzavirusisthecausativeagentofinfluenza,andinfluenzavirusinfectionusuallycausesavarietyofdiseases,suchasfever,cough,sorethroat,musclepain,andlife-threateningpneumonia.Influenzavirusismainlydividedintothreetypes:A,B,andC.TheantigenicvariationofAtypeisthehighest,whichhascausedmanyworldwidepandemic.TheH7N9fluviruswasdiscoveredforthefirsttimeintheendofMarch2013inShanghaiandAnhui.Fromthenon,numbersofH7N9caseswerediagnosedandtheconfirmedanddeadpeopleareincreasing.H7N9influenzavirus,anewtypevirus,isthefirstdiscoveryintheworld,andthedegreeofvariationofinfluenzavirussequencehasattractedworldwideattention.Thepreventionandcontrolofinfluenzavirusmainlyrelyonvaccinesandantiviraldrugs.Inrecentyears,theworldwideuseofinfluenzavaccinehasconfirmeditskeyroleinprevention,especiallyfortheseasonalfluvaccinedefense.However,becauseofvaccineeffectivenessmainlydependsonthepreparationofvaccinevirusstrainsandantigenvariationexistsindifferentinfluenzaAvirussubtype,thevaccineisdifficulttocompletelycontrolthedisease.Therefore,drugtreatmentisstillanimportantwaytopreventionandcontrolofinfluenza.III AbstractNeuraminidase(NA)playsakeyroleinthelifecycleofinfluenzavirus.NAcancatalyzethedissociationofN-acetylneuraminicacidandadjacentoligosaccharideD-galactoseorD-galactosaminealpha(2,6)oralpha(2,3)ketoneglycosidebondinterminalsialicacid.Andintheprocess,NAcouldassistthereleaseofprogenyvirusfromthesurfaceoftheinfectedhostcells,andfurthermakeprogenyvirusinfectnewtargetcells.Becauseofitsroleininfluenzavirus,NAbecomethenewtargetofantiinfluenzavirusdrug.Inthisstudy,H7N9NAwasselectedastheobject.Virtualscreening,moleculardynamicssimulation,andsteeredmoleculardynamicssimulationmethodwereappliedtoinvestigatethepotentialinhibitorymechanismandbindingprocessofanewnaturalsmallmoleculetoH7N9NA.Themaincontentsaredividedintotwoaspectsasfollows:1、InvestigatingandverifyingthecombinationofnaturalsmallmoleculewhichscreenedfromtheZINCdatabase,andprovidingtheoreticalcluesforNAinhibitorsdesign.2、Exploringthedetachment/bindingprocessanddynamicbehaviorofsmallmoleculesbyusingsteeredmoleculardynamicsmethod.FurtherstudyingtheinfluenceofsmallmoleculetothecatalyticsiteofNA,andseekingtheinhibitionmechanism.Keyword：H7N9Influenzainfluenzavirus,smallmoleculeinhibitor,virtualscreening,moleculardynamicssimulation,steeredmoleculardynamicssimulationIV 目录目录第1章绪论.............................................................................................11.1流感病毒简介.................................................................................11.1.1流感病毒的流行.........................................................................11.1.2流感病毒的结构简介.................................................................21.2流感的防治.....................................................................................41.2.1流感疫苗介绍.............................................................................41.2.2抗流感药物简介.........................................................................51.3神经氨酸酶的结构和功能.............................................................51.4主要的研究内容.............................................................................7第2章理论计算方法概述和模拟参数设.............................................82.1理论计算方法概述............................................................................82.1.1虚拟筛选简介.............................................................................82.1.2分子动力学模拟简介.................................................................82.1.3拉伸分子动力学模拟简介.........................................................92.2本研究中的理论参数设定.............................................................102.2.1初始结构的获得及虚拟筛选参数设置...................................102.2.2分子动力学的参数设置............................................................102.2.3拉伸分子动力学参数设置........................................................11I 目录第3章结果与讨论.................................................................................123.1抑制剂的确定...............................................................................123.2NA结构合理性和模拟体系的平衡验证....................................133.3MOL-NA结合方式研究..............................................................143.4MOL-NA结合方式的验证..........................................................163.5MOL的结合对于NA活性位点的影响.....................................173.6MOL与NA结合过程研究.........................................................19第4章结论.............................................................................................24参考文献...................................................................................................25致谢.......................................................................................................29II 第1章绪论第1章绪论1.1流感病毒简介1.1.1流感病毒的流行流感病毒（Influenzavirus）是流行性感冒的病原体，当人感染流感病毒时，通常会引发多种病症，例如发烧、咳嗽、咽喉以及肌肉疼痛，病情严重时还可能发展为危及身命的肺炎[1,2]。流感病毒主要分为甲、乙、丙三型[3]。流感的流行呈现一定的周期性，除了季节性流感以外，有些年份还会出现流感的大流行[4]。据统计，每年季节性流感疫情能够使大约15%的世界人口感染，而偶然发生的全球性的流感大流行更是对人类的健康构成极大的威胁[5]。在甲型、乙型和丙型这三种型别的流感病毒里面，甲型流感病毒的抗原性最容易发生变异，甲型流感病毒曾经引起过多次世界性的大流行[3]。甲型流感病毒（InfluenzaAvirus,IAV）[3]可以根据其病毒表面的两个包膜糖蛋白即，血凝素蛋白（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）的不同，进一步分为18个H亚型（H1～H18）和11个N亚型（N1～N11），并且这些亚型的致病力和抗原性都有所不同。H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9及H10亚型的流感病毒均可感染人。目前在人群中造成季节性流感的甲型流感病毒亚型主要包括：H1N1亚型和H3N2亚型。甲型流感病毒的遗传变异主要以包膜蛋白（HA、NA）变异为主，这主要是由于HA与NA的抗原结构容易发生改变，这两种抗原的改变形式主要分为抗原飘移和抗原转变两种[6]。二十世纪以来，1918年的西班牙甲型H1N1流感[7]、1957年亚洲的甲型H2N2流感[8]、1968年及1997年香港流行的H3N2[9]及H5N1流感[5,10]，近些年的2009年的墨西哥H1N1流感[1,11,12]、2013中国H7N9流感[13,14]都给社会造成过巨大的损失[4]。1918年的H1N1甲型流感病毒最早是由西班牙政府公布的，因此被称为西班牙流感。西班牙流感大概可分为三轮，第一轮发生于1918年的春天，未造成大规模的人群死亡；第二轮发生在1918年的秋天，这轮流感流行的死亡率较高；1919年冬季到1920年春季发生第三轮流感流行，这轮流感的死亡率介于前两轮之间。这次流感造成上亿人的感染，死亡人数甚至超过了第一次世界大战。1 第1章绪论1957年亚洲H2N2亚型流感最开始于中国爆发，其致死率相对1918年H1N1亚型流感而言并不高，其发病率在15%-30%之间。该流感病毒后来通过抗原转变进化成了香港H3N2亚型流感，该亚型流感在1968年至1969年爆发。H5N1亚型流感具有较高的致病性，是禽流感病毒的一种亚型，1997年，中国香港报告了首例感染致死的病例，为一名3岁儿童，从流感死亡病例标本中分离鉴定出了H5N1病毒。2009年甲型H1N1流感是流感病毒的新型变体，2009年3月底，该亚型流感开始在墨西哥和美国加利福尼亚州、得克萨斯州爆发，随后迅速蔓延。此次流感病毒致死率高，疫情持续了将近一年的时间，涉及到的国家和地区多达二百余个[7-14]。H7N9亚型流感病毒于2013年3月底首次在上海和安徽两地通报发现，截至到2013年5月29日，全国已确诊131人，死亡37人。而在其后的几个月及2014年、2015年和2016年，全国仍陆续有确诊的H7N9病例出现，数量为每年几十至几百人不等，死亡的人数也在陆续增加。2017年2月16日，国家卫计委网站公布，2017年1月份全国“人感染H7N9禽流感”发病人数为192，死亡人数为79，病例分布于北京、上海、江苏、浙江、河南、安徽、山东、福建、东莞、汕尾、台湾等地区。H7N9型禽流感病毒是全球首次发现的新亚型流感病毒，流感病毒在序列上的变异程度再次引起了世界性的高度关注[13,14]。1.1.2流感病毒的结构简介流感病毒呈球状颗粒（如图1.1所示），粒子的直径通常为80-120纳米，而刚分离的流感病毒颗粒也能呈丝状物，丝状物的长度可达到300纳米甚至数微米以上[3]。流感病毒的八段单股负链RNA一共能够编码10种不同的蛋白质（其中，甲型流感病毒和乙型流感病毒具有8股RNA链，而丙型流感病毒具有7股RNA链）。被编码的这10种蛋白质分别为：聚合酶（Polymerase）蛋白（PB2、PB1和PA）、核蛋白（Nucleoprotein，NP）、包膜糖蛋白：血凝素蛋白（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）、基质蛋白（Matrixprotein1，M1和Matrixprotein2，M2）及2种非结构蛋白（Non-structralprotein1，NS1和Non-structralprotein2，NS2[3,7]。2 第1章绪论图1.1流感病毒颗粒示意图（图片摘自网络）聚合酶PB2是RNA转录酶的主要成分，其作用是识别和结合宿主细胞的pre-mRNA5'帽子结构，PB2在流感病毒转录起始过程以及流感病毒的复制过程具有重要作用。PB1同样是RNA转录酶的主要成分，PB1具有核酸内切酶活性，能够启动转录和催化RNA合成延伸。PA同时具有核酸内切酶和蛋白酶活性，其同样为RNA转录酶成分，PA主要参与vRNA和cRNA启动子结合过程，PA的N端能够切割宿主细胞的pre-mRNA，C端与PB1作用[3,7]。NP是核糖核蛋白复合物(vRNPs)的重要组成部分，NP的主要功能是使流感病毒基因组壳体化，协助vRNA和聚合酶复合物入核，帮助流感病毒转录、RNA复制、基因组整合和病毒组装[3]。HA为同源三聚体，是流感病毒表面糖蛋白，其主要功能是结合宿主细胞，并在胞饮小泡酸性条件下进行变构，拉近病毒和宿主细胞之间的距离，促进膜融合过程。NA为同源四聚体蛋白，同样位于流感病毒表面，主要作用为协助流感病毒子代病毒的释放[2,3]。基质蛋白M1的主要功能是构成基质，其可调节子代流感病毒颗粒的装配，并稳定流感病毒的核心部位。M2是四聚体，是离子通道蛋白，起着离子通道的作用，其只存在于甲型流感病毒中，M2可酸化宿主细胞内部正处于来装配过程3 第1章绪论的流感病毒[3]。非结构蛋白NS1主要功能为抑制干扰素合成、抑制蛋白激酶R活性并促进流感病毒的复制等。NS2蛋白含核输出信号，与M1协同促进新RNP的出核，与病毒的转录和复制有关[3]。1.2流感的防治1.2.1流感疫苗介绍当前，在流感病毒的防御和治疗方面主要依靠的是流感疫苗以及抗流感病毒相关药物。流感疫苗主要分为灭活疫苗和减毒活疫苗。灭活疫苗又主要可以分为全病毒灭活疫苗、病毒样颗粒、裂解疫苗和亚单位疫苗[15-17]。这几种疫苗均包含甲型流感病毒H1亚型、H3亚型以及乙型流感病毒或抗原组分。流感全病毒灭活疫苗是由甲型H1亚型、H3亚型和乙型流感病毒的流行毒株，经鸡胚培养、灭活、纯化后三型等量混合制成。流感病毒样颗粒是含有流感病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒核酸，不能自主复制，在形态上与真正病毒粒子相同或相似，俗称伪病毒。流感病毒裂解疫苗是利用世界卫生组织推荐的并经国家药品管理部门批准的流感病毒株分别接种鸡胚，经培养、收获病毒液，病毒灭活、纯化、裂解后制成的疫苗，该类疫苗可用于预防本型流感病毒引起的流行性感冒。亚单位疫苗，即通过化学分解或有控制性的蛋白质水解方法，提取细菌、病毒的特殊蛋白质结构，筛选出的具有免疫活性的片段制成的疫苗。流感病毒亚单位疫苗是将病原体主要的保护性免疫原存在的组分制成的疫苗，也叫组分疫苗[15-17]。流感病毒减毒活疫苗是将一种冷适应的病毒骨架和当年选定的流感疫苗毒株的血凝素蛋白HA、神经氨酸酶NA进行重组，重组后得到的毒株对温度较为敏感，此类毒株可在鼻咽中有效进行复制，而在呼吸道以及肺中等稍高温度部位的复制受限，从而诱导免疫保护，又不会对人群造成危害，临床实验结果表明，匹配的流感病毒减毒活疫苗的保护率较高，可达到80%以上[15-17]。近些年来，世界范围内对于流感疫苗的使用证实了其在预防方面的关键作用和重要性，特别是针对季节性流感疫情的防御工作，疫苗的使用发挥着十分巨大的作用[18]。但是，由于甲型流感病毒亚型多，并且各个亚型抗原易发生变异，疫4 第1章绪论苗的有效性又主要依赖于用来制备疫苗的病毒株与当前流株之间抗原性的相似性程度，因而仅仅依靠季节性疫苗防止难以完全控制病情。随着近些年新亚型流感病毒疫情的流行，疫苗领域的研究有相当一部分的焦点都集中在广谱通用型疫苗的研制方面。1.2.2抗流感药物简介除了接种疫苗预防流感以外，药物治疗仍然是防控流感的重要途径和手段[19,20]。靶向流感病毒的特异性治疗及预防药物主要有两种类型：一类是M2蛋白离子通道抑制剂类药物，包括金刚烷胺和金刚乙胺。可是这类药物仅对甲型流感病毒有效，对其他型别无效，而且金刚烷胺和金刚乙胺在用于治疗和预防流感病毒的使用时间已经超过四十年，当前针对这两类药物已经出现大量耐药流感病毒株。此外，这些耐药株的致病性和传染性以及所导致的中枢神经系统副作用等都限制了金刚烷胺和金刚乙胺的应用，所以目前M2离子通道阻滞剂已不推荐作为甲型流感病毒的防治药物[19]。另一类抗流感病毒药物是神经氨酸酶(neuraminidase，NA)抑制剂[21]。NA在流感病毒生命周期中的重要作用，以及其序列和结构的保守性，使其成为了重要的抗流感药物设计靶点。神经氨酸酶抑制剂类药物包括扎那米韦[22]、奥司他韦、帕拉米韦、拉尼米韦等。神经氨酸酶这类药物对各种具有高致病性的流感病毒亚型均具有很好的抑制作用，且其安全性高、耐药性好，可以广泛地应用于流感病毒的防治，但由于这类药物的广泛使用，耐药性流感毒株也逐渐出现[2,23,24]。1.3神经氨酸酶的结构和功能神经氨酸酶存在于流感病毒表面，它是由流感病毒基因组RNA的第六个片段编码的糖蛋白，具有重要的功能性，在流感病毒生命周期中起关键的作用[25]。NA是由四个相同的糖基化多肽组成的同源四聚体蛋白（图1.2），整体呈现蘑菇形状，每个单体由六个β片层围成桶状结构，每个桶状结构的中心都包含酶活性位置，活性中心呈口袋形状，即使所有甲型和乙型流感病毒的NA，在一级结构上同源性并不是很高，但NA催化中心周围的氨基酸残基一级序列却是十分保守的[26]。甲型流感病毒的NA可分为两个进化枝，进化枝I包括N1、N4、N5、N8，5 第1章绪论进化枝II包括N2、N3、N6、N7和N9。两组NA之间在活性中心附近存在着显著的差异，这个差异存在于氨基酸残基142-152组成的150-环附近。进化枝I中的NA150-环呈现开放状态，结合配体后该环呈现闭合状态；而进化枝II中的NA150-环在结合与不结合底物的情况下都是闭合的。二者的不同使得进化枝I中的NA拥有一个特有的150空穴，正是由于这处差异，NA的142-152号残基组成的150环是近年来NA抑制剂研究的热点位置[21]。图1.2神经氨酸酶的三维结构示意图流感病毒NA在流感病毒的生命周期中起着关键的作用。每个流感病毒的表面大概含有100多个NA同源四聚体结构，这些NA能够通过其催化作用使存在于唾液酸末端的N-乙酰基神经氨酸与邻近寡糖D-半乳糖或D-氨基半乳糖之间的α(2,6)或α(2,3)酮苷键裂解[5]，从而协助子代的流感病毒颗粒从被感染的宿主细胞表面释放出来，使子代病毒获得感染其他新的靶细胞的能力。因其在病毒生命过程中所发挥的关键作用，NA已成为流感防治领域的热点研究对象，针对NA为靶点的抗流感病毒药物设计正如火如荼地进行[27-29]。6 第1章绪论1.4主要的研究内容本研究选取H7N9亚型流感病毒的神经氨酸酶为对象，主要利用虚拟筛选[30]、分子动力学模拟[31]，拉伸分子动力学模拟[32]等理论方法考察作为H7N9NA潜在抑制剂的天然小分子与NA的结合机制及结合过程，主要研究内容分为如下两个方面：1、考察并验证从ZINC数据库筛选出的天然小分子与NA的结合方式，为针对以NA为靶点的抑制剂前体药物设计提供理论线索。2、应用拉伸分子动力学方法考察小分子与NA的脱离/结合过程，探究小分子的动态行为以及其结合对于NA催化位点的影响，寻求抑制机制。本论文的研究成果可以对于进一步深入理解神经氨酸酶的结构与功能提供线索，并且，对于今后以流感病毒神经氨酸酶为靶点的新型抗流感药物设计与发展提供一定的理论支持和依据。7 第2章理论计算方法概述和模拟参数设定第2章理论计算方法概述和模拟参数设2.1理论计算方法概述2.1.1虚拟筛选简介虚拟筛选[30,33]是基于药物设计的理论建立而起来的一种理论计算方法的延伸计算方法，该方法主要是借助计算机技术从大量的化合物中筛选出潜在的可利用的药物前体，从而为实验上的活性评价提供研究方向。虚拟筛选技术主要分为两种，一是基于生物大分子结构，即受体的药物设计，二是基于小分子结构，即配体的药物设计[34]。常用的虚拟筛选软件和程序有：DOCK、Autodockvina、DiscoveryStudio、FlexX和GOLD等[35-39]。虚拟筛选现已成为高通量筛选的互补工具，并受到世界各地的研究课题组以及相关制药公司的关注。2.1.2分子动力学模拟简介分子动力学方法[31,40]，是一种依赖于计算机资源和模拟软件，能够根据基本力学原理来进行的描述原子和分子物理运动的手段。随着蒙特卡罗模拟的早期成功，分子动力学思想在二十世纪五六十年代末发展起来。众所周知，由分子组成的体系基本是由大量的粒子构成的，如此复杂庞大的分子体系的性质很难得到很好的解析。分子动力学方法主要是是通过使用数值求解的思路去而避开了不能解析求解的这一难题。分子力场[41-43]是分子模拟的基础，力场的设定能够允许体系中的原子和分子等在特定的一段时间内执行相互作用。分子力学力场定义了各个粒子之间的力和势能，通过数值法，最终求解众多相互作用粒子所形成的体系中的牛顿运动方程，进一步得到所计算体系中原子和分子运动所形成的轨迹。在不同状态下的模拟体系所构成的系统中做大量的样本收集，之后计算体系的构型积分，并在构型积分结果的基础之上计算模拟体系中的各种宏观的性质。8 第2章理论计算方法概述和模拟参数设定2.1.3拉伸分子动力学模拟简介拉伸分子动力学是研究配体结合和解离机制以及蛋白质折叠的动力学方法，其主要的理论依据是模拟原子力显微镜的实验原理[44]。拉伸分子动力学模拟主要是由等外力拉伸和等速度拉伸两种模拟形式构成。在执行拉伸分子动力学模拟的过程中，配体或受体的某一部分会被施加一个外力，这个受力的部分则会在外力作用下快速的结合和解离，或变构[32]。在等外力拉伸模式下，受力部分的速度是变化的。比如在配体解离过程中如果使用等外力拉伸，则可通过模拟过程中被拉动配体的运动速度变化来判断其在解离通道的受阻情况，即结合情况，也就是说，当配体受较大的阻力时，受力组的运动速度会相应降下来，反之则速度提上去。如果使用等速度的拉伸方法，则可通过观察模拟过程中拉力随时间的变化来判断配体的具体动态情况，拉力大的时间段表明配体受到较大的阻力，拉力小的时间段内配体受到较小阻力[32,45]。一般情况下，等速度拉伸方法是比较常用的拉伸方法。等速度拉伸的基本可以描述为，在受力的部分蛋白或配体的某一点上附着一个虚拟的弹簧，这个虚拟弹簧的相反一端则连接一个没有质量的虚拟化的原子，在进行拉伸动力学的时候，这个被虚拟化了的原子则会以一个恒定不变的速度在特定的优势运动方向上进行移动，进而使这个附着着的虚拟弹簧发生形变，而此时这个虚拟弹簧的弹力变化就可以反映出受力部分/配体与不动部分/受体之间的相互作用关系[45]。在做拉伸分子动力学模拟时，首要需选择适当的拉伸途径或拉伸方向，即为理论上的结合或解离通道，以防止受力的部分在不存在的路径上强行运动，进而而破坏了体系结构的完整性。一般受力组的运动方向可根据其他的理论模拟方法预测，也可以结合动力学实验和相应的突变实验来预测出合理的拉伸运动路径。此外，因为模拟情况下，在拉伸分子动力学中受力的部分运动要远远大于原子力显微镜实验中的速度，大约可达到高出6个数量级，所以拉伸动力学过程中的弹力系数以及拉伸过程中速度的选择会直接影响模拟结果的准确性及可靠性，因而在模拟实验条件以及计算服务器资源允许的条件下，应该进行多组重复平行的测试实验以确定最终拉伸参数组合[44,45]。9 第2章理论计算方法概述和模拟参数设定2.2本研究中的理论参数设定2.2.1初始结构的获得及虚拟筛选参数设置首先通过序列对比得到一条保守性较高的氨基酸序列，作为获得NA结构的目标序列。取得目标序列后，通过BLAST搜索找到甲型流感病毒神经氨酸酶N9的同源序列，其中结构4MWJ[46]与目标序列同源性为100%，因此选择使用此结构作为NA的三维结构，以进行后续的虚拟筛选等工作。本实验通过应用分子对接软件AutoDockVina，进行小分子抑制剂的虚拟筛选实验，本研究中所选取的小分子化合物库是来自于ZINC数据库[47]中的天然产物数据库（NPD）中的五个子库。这五个库包含约110000个天然产物以及天然产物的化学衍生物。我们首先利用Autodocktools将从数据库中下载的小分子数据包切割为pdbqt格式的小分子，与NA和参数文件放在一起，进行虚拟筛选，并将最终的虚拟筛选结果通过亲和能的高低进行排序，从而得到10个最优的候选小分子化合物，这些代表性小分子与NA有很好的亲和作用。在筛选结果中，综合考虑到结合自由能评分及分子性质等因素，选择小分子ZINC02140075作为后续工作的研究对象，用于NA-ZINC02140075体系的分子动力学及拉伸分子动力学模拟。2.2.2分子动力学的参数设置为了得到最优、最稳定的复合物结构，进而得到小分子结合方式，我们首先应用动力学常用软件Gromacs4.5.2[48]软件包对复合体系MOL-NA及未结合配体的自由NA蛋白结构分别进行了分子动力学模拟。模拟条件首先设定为常温常压。为了描述复合物体系中的蛋白质和小分子抑制剂MOL，我们采用了Gromos53A6力场[49]。将模拟的MOL-NA和NA体系放入充满了SPC水分子[50]模型的立方体中，将其设定为具有周期性的溶剂盒子，随后将各个模拟体系与溶剂盒子边界的最短距离设为0.8Å。加入一定量的抗衡离子，使模拟系统保持电中性状态，使抗衡离子随机替换体系中的水分子[51]。应用V-rescale和Parrinello–Rahman算法[52]使考察的模拟体系的温度维持在300K，偶合时间设定为0.1ps。于此同时，考察的体系压力维持在1.01×105Pa，偶合时间设定为2.0ps。10 第2章理论计算方法概述和模拟参数设定控制水的模拟等温可压缩比设定为4.5×10-5Pa-1[53]。所有原子键长均使用LINCS算法束缚，以加快模拟速度，采用PME方法计算长程静电相互作用，其中的栅格宽度为1.2Å[54,55]。应用最陡下降法对考察的体系进行最小化处理，以免存在可能的原子碰撞。在系统进行完能量优化之后，执行100ps的NVT和100ps的NPT平衡。模拟系统的温度和压强将在这两步平衡计算中到达预设值。系统平衡后，进行50ns的分子动力学模拟取样。在动力学取样过程中，每2ps保存一次坐标，模拟时间步长设置为2fs[49]。2.2.3拉伸分子动力学参数设置应用拉伸分子动力学模拟能够研究小分子脱离或结合NA活性位点的过程[32,56]。我们将利用上述的50ns的分子动力学得到的稳定复合物结构，作为考察对象，进行拉伸研究。拉伸分子动力学(SMD)方法能够模拟配体-受体的脱离或结合过程，是一种特殊的分子动力学模拟方法[32,44,45]。SMD通常分为两类：常力SMD和常速SMD，本文使用的是常速SMD[32,56]。50ns的常规动力学模拟后，体系达到平衡，此时的复合物结构适合作为拉伸动力学模拟起点。我们在速度为0.1nmns-1的基础上，考察了三种不同的弹性系数（50、100、1000kJ·mol-1·nm-2），在小分子MOL的质心上施加一个简谐势，将MOL沿着确定的方向拉出活性结合位置，动力学模拟步长为2fs，轨迹每1ps保存一次，拉伸时间设定为为20ns[56]。11 第3章结果与讨论第3章结果与讨论3.1抑制剂的确定本研究以甲型H7N9流感病毒的NA为靶点，利用Autodockvina软件包对ZINC数据库的天然产物数据库中约十万个小分子进行了虚拟筛选，综合考虑结合自由能评分及分子性质等因素后，选取NA潜在抑制分子ZINC02140075（简称MOL，其与NA的结合能约为-11.40kcal·mol-1）作为主要的分子动力学模拟研究对象。虚拟筛选实验表明MOL与NA具有很好的结合力，为了考察具体的结合方式，我们对二者的复合物体系进行了50ns的分子动力学模拟，以详细考察MOL与NA结合的动态行为。同时，为了便于比较MOL结合前后对NA的影响，我们对未结合配体的NA也执行了50ns的分子动力学模拟实验。如图3.1所示为MOL在NA活性位点处的结合示意图。图3.1MOL在NA活性位点处的结合示意图12 第3章结果与讨论3.2NA结构合理性和模拟体系的平衡验证在分析结合模式之前，我们首先通过拉式图Ramachandranplot绘制的方式来评估模拟之后的NA三维结构的键角、二面角等性质，以确定每个氨基酸的构象是否合理。如图3.2所示，图中颜色最深的区域为构象“最适合的区域”，这个区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定，非键合原子间的距离大于一般正常的允许距离，氨基酸个数落在这个区域内越多，说明模拟的NA结构越可信。图中次深色区域为“允许的区域”，这个区域中，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般正常允许距离之间，立体化学允许，但构象稳定性相对弱一些。图中的白色区域为构象不合理的氨基酸所在区域，是不允许区，该区域内的非键合原子间距离小于最小允许距离，任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，在此区域的构象中，斥力相对较大，构象非常地不稳定。如图3.2所示，本研究中经模拟后得到的NA结构中的氨基酸结构大多数都落在“最适合的区域”，少数落在“允许的区域”，极少数落在“不允许的区域”内。结果表明，本研究中NA的结构是合理的，可以用于进一步的结合模式分析。图3.2NA构象中氨基酸残基的Ramachandranplot图13 第3章结果与讨论其次，在分析具体结合模式之前，还要保证所考察体系在整个50ns动力学模拟过程中的平衡状态。因此，我们首先调取了50ns过程中体系的均方根偏差RMSD，RMSD可以很好地反应出任意模拟时间点上的构象与初始构象之间的差异，RMSD的值趋于稳定则表明体系达到平衡状态。如图3.3所示为50ns过程中NA和NA-MOL复合物体系的Cα原子的RMSD值变化。体系的RMSD值大概在25ns以后趋于稳定，平均值为0.3nm，说明体系在模拟中达到平衡状态。图3.350ns模拟过程中NA和NA-MOL复合物体系的Cα原子的RMSD值变化3.3MOL-NA结合方式研究通过上述验证，我们确定了所考察体系均随着模拟时间的进行处于稳定平衡状态，因此稳定状态下的结构可以用来作为最优结合方式的分析对象。我们调取了平衡状态下的MOL-NA复合物体系构象并对MOL的结合情况进行了剖析。如图3.4所示，MOL可以稳定结合在由His151、Arg294、Gly349、Arg372以及Trp403等氨基酸残基组成的结合口袋之中。具体作用如图3.5所示，MOL与His151之间存在Pi-Sigma作用，Arg294、Arg372的侧链与MOL之间存在Pi-Cation作用，Gly349与MOL依靠氢键相互作用，而Trp403与MOL之间则存在Pi-Pi相互作用。14 第3章结果与讨论图3.4MOL在NA中的结合位置图3.5MOL与NA之间相互作用二维示意图15 第3章结果与讨论3.4MOL-NA结合方式的验证为了进一步的验证上述提出的复合物体系结合方式，我们考察了模拟过程中NA和MOL-NA两个体系氨基酸残基的均方根浮动RMSF，并将二者做了比较。RMSF的变化可以反应出氨基酸残基侧链的柔性变化，某个氨基酸残基RMSF值越大，表示该残基的柔性就越大，反正则表示柔性较小。通过对比结合MOL的NA以及未结合MOL的NA中残基RMSF的差异，可以考察出MOL对结合处的影响，进而确定MOL结合位置的准确性。图3.6中给出了50ns模拟过程中NA和MOL-NA两个体系氨基酸残基的RMSF对比，黑色线条表示NA在没有结合MOL时，NA中每一个氨基酸的RMSF值，而红色的线条则表示在结合了配体MOL之后NA的每一个氨基酸残基的RMSF值。由图3.6可知，在上述提出的结合口袋残基即，His151、Arg294、Gly349、Arg372以及Trp403所处区域，NA和MOL-NA两个体系的RMSF值存在明显的差异。在结合口袋附近，相对应的未结合MOL的NA残基比结合了MOL的NA氨基酸残基RMSF值大，也就是说，未结合MOL的NA残基柔性较大，结合了MOL后，MOL与NA结合位点处残基的相互作用稳定住了相关残基的侧链，使之柔性降低。因而，RMSF的对比表明，MOL确实在我们提出的结合位点处与NA有效结合。图3.650ns模拟过程中NA和MOL-NA两个体系氨基酸残基的RMSF对比16 第3章结果与讨论同时，我们对Gly349与MOL之间的氢键作用进行了进一步的验证。我们调取了50ns动力学模拟过程中二者之间氢键存在情况，如图3.7所示，在模拟过程中，氢键数目绝大多数时间都稳定在1个，这个结果同样证明了上述提出的结合方式的准确性。图3.7模拟过程中Gly349与MOL之间的氢键数目3.5MOL的结合对于NA活性位点的影响本部分将着重研究MOL的结合对于NA活性位点的影响。根据对比结合与未接MOLNA的RMSF，图3.6，我们发现MOL的结合十分显著的降低了第150号残基附近的柔性。据此，我们分别调取了NA和NA-MOL两个体系平衡阶段的结构进行对比，如图3.8，发现MOL的结合使得原本就呈现闭合状态的150-环更进一步地向活性位点方向延伸从而锁住MOL，并大大减小了NA活性口袋的尺寸。17 第3章结果与讨论图3.8MOL的结合对NA活性口袋的影响为了排除150-环的此种表现是动力学过程中的偶然行为，我们对两个体系中的150-环的活动范围进行了考察。我们调取了NA的150-环在结合与未结合配体时的整体RMSD值并进行了对比，如图3.9，未结合配体的NA150-环RMSD在25ns以后达到0.4nm左右，而结合了配体之后的NA150-环RMSD维持在0.3nm左右。该结果表明，MOL的结合确实进一步降低了150-环的柔性，二者的作用一方面稳定住了MOL的结合，另一方面缩小了NA的活性结合口袋，MOL在NA活性位点处的这种影响对于其有效发挥抑制作用十分重要。18 第3章结果与讨论图3.9NA的150-环在结合与未结合配体时的整体RMSD值并进行对比3.6MOL与NA结合过程研究在上面的研究中，我们确定了MOL在NA上的结合位点，并对其结合方式进行了验证。结合位点分析结果表明，MOL占据了NA的活性位点位置，从而具有有效抑制NA行使催化功能的潜力。MOL作为潜在的NA抑制剂，我们对于其结合或脱离NA的过程也十分地感兴趣。拉伸分子动力学可以模拟配体脱离受体的过程，而在考察这个这个过程的同时，同样也可以体现出反方向的配体受体结合，即复合物形成过程。本部分研究以平衡阶段的MOL-NA复合物作为模拟起点，采用常速拉伸分子动力学对于MOL的运动行为进行分析，并进一步深入探究NA活性位点周围残基对于MOL结合的贡献程度。3.6.1拉伸速度和劲度系数的设定我们在拉伸分子动力学模拟实验的过程中采用0.1nmns-1的速度，并同时考察了三组不同的劲度系数：50、100和1000kJ·mol-1·nm-2。如图3.10所示的拉力曲线可以反应出各种系数的优劣。当劲度系数较小的50kJ·mol-1·nm-2时，拉伸用时较长。而拉伸系数为较大的1000kJ·mol-1·nm-2时，拉伸虽然可以快速完成，但不利于考察各时间点的结构。当劲度系数为100kJ·mol-1·nm-2时，拉伸可以在20ns以内完成，并且拉力曲线表现良好，利于拉伸细节分析。因此，我们将选取拉伸速度为0.1nmns-1，劲度系数为100kJ·mol-1·nm-2的动力学体系进行MOL解19 第3章结果与讨论离的分析。-1-2图3.10不同的劲度系数（50、100和1000kJ·mol·nm）下的拉力曲线20 第3章结果与讨论3.6.2拉伸分子动力学的取样分析根据图3.11所示，MOL在受力脱离NA的过程中，MOL的拉伸距离主要经历三个平衡阶段。16ns以前，拉伸距离始终小于1.5nm且伴有较小浮动，说明MOL受力后试图摆脱NA位点束缚而进行了小程度位置调整，未开始进行明显移动。16ns以后，距离曲线上升至2.0nm左右并维持近1.7ns左右的平衡，说明此时MOL已开始挣脱掉部分NA束缚，并逐步向活性位点外移动，但此时MOL与NA的氨基酸残基作用仍使得MOL进行短暂的逗留至17.7ns。17.7ns以后距离曲线上升至2.5nm左右并维持恒定，直到19ns拉伸结束，说明MOL已完全脱离NA活性中心。图3.10中，拉力曲线在上述各个时间点的变化同样证实了上述MOL的移动过程。根据对拉伸距离曲线的分析，我们可以确定MOL在脱离NA过程中经历的关键时间点。分析这些时间点上的复合物结构可以帮助我们很好地理解MOL脱离过程中NA活性位点周围残基的表现，进而帮助我们理解MOL结合NA的过程。图3.11MOL在受力脱离NA的过程中，MOL的拉伸距离曲线我们调取了16ns、17.7ns以及18ns三个具有代表性时间点处的复合物结构进行了具体分析，如图3.12。从图3.12中我们可以清楚的看到MOL随着模拟时间的进行，逐步脱离出NA的结合位点。21 第3章结果与讨论图3.12拉伸过程中16ns、17.7ns以及18ns三个代表性时间点处的复合物结构为了更加具体地确定MOL在这期间与NA的相互作用，我们考察了这几点复合物的二维结合模式，如图3.13。在上文的研究中我们提出，MOL在结合状态下可以稳定在由His151、Arg294、Gly349、Arg372以及Trp403等氨基酸残基组成的结合口袋之中，从图3.13中可以看出，16ns以后，MOL之前与His151之间存在Pi-Sigma作用及Arg294侧链与MOL之间存在Pi-Cation作用首先消失；17.7ns以后，除了Arg372的侧链继续与MOL之间存在Pi-Cation作用之外，Gly349与MOL之间的氢键及Trp403与MOL之间的Pi-Pi相互作用又相继消失，但有趣的是此时His151又再次与MOL之间形成Pi-Pi相互作用。18ns以后，MOL失去与NA的全部作用关系。以上结果表明，MOL在与NA的结合过程中，22 第3章结果与讨论His151和Arg372可能是两个起着关键作用的氨基酸残基。图3.13拉伸过程中16ns、17.7ns以及18ns三个代表性时间点处复合物结构的二维结合示意图23 第4章结论第4章结论本研究选取H7N9的NA为对象，主要利用虚拟筛选、分子动力学模拟，拉伸分子动力学模拟等方法考察作为H7N9NA潜在抑制剂的天然小分子与NA的结合机制及结合过程。通过虚拟筛选模拟实验，我们选出了与NA结合能力较高的小分子MOL（ZINC02140075）作为分子动力学模拟的研究对象，并考察了MOL在NA活性位点处的结合方式。结合模式研究结果表明，MOL可以稳定结合在由His151、Arg294、Gly349、Arg372以及Trp403等氨基酸残基组成的结合口袋之中。MOL与His151之间存在Pi-Sigma作用，Arg294、Arg372的侧链与MOL之间存在Pi-Cation作用，Gly349与MOL依靠氢键相互作用，而Trp403与MOL之间则存在Pi-Pi相互作用。同时发现MOL的结合进一步降低了150-环的柔性，MOL与NA的作用一方面稳定住了MOL的结合，另一方面缩小了NA的活性结合口袋，MOL在NA活性位点处的这种影响对于其有效发挥抑制作用十分重要。本研究还利用拉伸分子动力学模拟对于MOL的运动行为进行了分析，并进一步深入地探究NA活性位点周围残基对于MOL结合的贡献程度。经分析，His151和Arg372可能是MOL在与NA的结合过程中两个起着关键作用的氨基酸残基。本文的研究为针对以NA为靶点的抑制剂前体药物设计提供了理论线索。24 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致谢致谢本论文是在我的导师单亚明教授的精心指导下完成的。单亚明教授对待工作负责严谨，态度谦逊，对待学生平和耐心，亦师亦友。导师在指引我如何走好科研道路的同时，更教会了我许多做人的道理。本论文的完成倾注了导师大量的汗水和心血。我衷心感谢我的导师单亚明教授对我选择的课题和撰写的论文给予悉心的指导。我们的团队是一个拼搏向上、充满活力的集体，很荣幸能成为其中的一员。一路走来，感谢课题组内的所有成员对我的帮助以及对本论文提出的各项建议和意见，感谢其他关心和帮助过我的同学们。最后，感谢家人对我多年的支持与关怀。29