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．分类号：Ｓ８５２６５单位代码：１０１８３研究生学号：２０１５８５２０４８密级：公开吉林大学硕士学位论文学术学位（）羊肠道病毒小鼠感染模型的建立及病毒组织嗜性的研究ＡＮｅｏｎａｔａｌＭｕｒｉｎｅＭｏｄｅｌｆｏｒＣａｒｉｎｅＥｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓＩｎｆｅｃｔｉｏｎｐａｎｄｔｈｅＶｉｒａｌＴｉｓｓｕｅＴｒｏｐｉｓｍ作者姓名：张群专业：兽医公共卫生学研究方向：动物检验检疫指导教师：王新平教授培养单位：动物医学学院２０１８年６月 羊肠道病毒小鼠感染模型的建立及病毒组织嗜性的研究ANeonatalMurineModelforCaprineEnterovirusInfectionandtheViralTissueTropism作者姓名：张群专业名称：兽医公共卫生学指导教师：王新平教授学位类别：农学硕士答辩日期：2018年6月7日 本研究受“十三五”国家重点研发计划（2016YFD0500904）；（2017YFD0500104）；国家自然科学基金资助项目（31572531）资助。 未经本论文作者的书面授权依法收存和保管本论文书，面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则应承担侵权的法律责任。，吉林大学博士或硕士学位论文原创性声明（）：本人郑重声明所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：Ｊ曰期：年月》々 中文摘要羊肠道病毒小鼠感染模型的建立及病毒组织嗜性的研究肠道病毒（enterovirus，EV）为小RNA病毒科肠道病毒属的成员，是导致人类与动物的消化、神经和呼吸系统疫病的重要病原体。根据病毒最新分类，肠道病毒属分为12个肠道病毒种和3个鼻病毒种。A、B、C、D种肠道病毒主要感染人，E种和F种主要感染牛，G种主要感染猪，H种和J种主要感染灵长类动物。I、K、L种肠道病毒为新的肠道病毒种。本实验室于2014年从吉林省某规模化养羊场暴发的临床上以呼吸困难、严重腹泻、发病率和致死率高达50-80%为特征的病羊体内分离到山羊肠道病毒CEV-JL14，首次确定了国内羊群存在肠道病毒感染。由于羊肠道病毒感染为国内新发疫病，有关本病的诊断、流行病学及病毒的致病机理等方面缺乏研究。本研究以分离的山羊肠道病毒CEV-JL14实验感染乳鼠，建立了羊肠道病毒感染小鼠模型。应用病毒感染不同品系的小鼠，确定出ICR小鼠为羊肠道病毒8易感小鼠品系。同时以2×10TCID50病毒液，分别通过腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种ICR乳鼠，发现各种接种途径均可感染小鼠。以不同剂量病毒感染乳鼠，确定出羊肠道病毒CEV-JL14感染小鼠的最低感染剂6量为2×10TCID50。应用RT-PCR方法，检测CEV-JL14病毒感染小鼠后不同时间的器官组织，确定出ICR小鼠感染病毒后带毒时间至少可持续16天。组织病理学检查显示，病毒感染引起乳鼠出现明显的组织病理学变化。心肌间质水肿，心肌细胞变性，且局部有淋巴细胞浸润。肝细胞肿胀，发生颗粒变性和水泡变性，肝脏组织中有大量的淋巴细胞和炎性细胞浸润。脾脏淋巴细胞增多，细胞坏死，红髓区有炎性细胞聚集。肺脏肺泡壁增厚，炎性细胞浸润，有明显的出血、淤血。肾脏肾小管上皮细胞颗粒变性，有淋巴细胞浸润。肠绒毛脱落，小肠绒毛空泡变性，肠粘膜上皮细胞肿胀。脑神经元存在不同程度空泡变性，神经元变性坏死，数量减少，脑室脉络丛大量淋巴细胞浸润。肌肉局部间质水肿，大量淋巴细胞浸润，少量纤维组织增生。应用免疫组织化学方法确定感染小鼠组织中的病毒抗原，I 发现感染小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、脑、肌肉组织中均能检测到羊肠道病毒病毒抗原，其中病毒抗原在心肌、肌肉、肝脏、肺脏中明显高于其他组织。综上所述，本研究成功建立了羊肠道病毒感染小鼠模型，确定出病毒的易感小鼠品系，病毒感染小鼠的途径与最低剂量，病毒的组织亲嗜性。该结果为进一步研究羊肠道病毒的致病机理、病毒感染诱导的免疫机理及疫苗研制奠定基础。关键词：羊肠道病毒；CEV-JL14；小鼠模型；组织嗜性；病理组织学；免疫组化II AbstractANeonatalMurineModelforCaprineEnterovirusInfectionandtheViralTissueTropismEnterovirusisanon-enveloped,positivesingle-strandedRNAvirusbelongingtothegenusEnteroviruswithinthefamilyofPicornaviridae.Asthemajorcausativeagents,enterovirusleadstodigestive,neurological,andrespiratorydiseases.Accordingtothelatestvirustaxonomy,Enterovirusaredividedinto12speciesenterovirusand3speciesrhinovirus.EnterovirusA-Dmainlyleadtoinfectionstohumans.EnterovirusEandEnterovirusFarecausativeagentsofbovineenterovirusinfectionincattleshowingclinicalsignsfromrespiratorytoentericdiseases.EnterovirusG,namedporcineenterovirusBpreviously,isthecausativepathogenofenterovirusinfectionsinswine.EnterovirusHandEnterovirusJmainlyinfectMonkeys.EnterovirusI,EnterovirusK,andEnterovirusLarerecentlyidentifiednewenterovirusspecies.In2014,CEV-JL14wasisolatedfromagoatherdcharacterizedbyrespiratoryanddigestivediseaseswithmorbidityandmortalityupto50-80%.Asanemerginginfection,thepathogenicityandviralpathogenesisremainslargelyunknown.Inthisstudy,wehaveemployedCEV-JL14virusestoinfectdifferentsucklingmicetoestablishamurinemodelforCaprineenterovirusinfection.Thesusceptiblemousestrain,theminimalinfectivedoes,theinfectionroute,thevirussheddingpatternweredetermined,separatelyusingdifferentapproaches.OutofKunming,BALB/CandICRmousestrains,theICRmousestrainwasdeterminedasthemostsusceptiblemousestrain.ResultsofRT-PCRdetectionandvirusrecoveryisolationfrommiceinfectedwithCEVshowedthatICRmicewereinfectedbyCEV-JL14viaallinfectionroutes,includingintraperitonealinjection,intramuscularinjection,subcutaneousinjection,intragastricadministrationandnasaladministration.TheIII 6minimalinfectivedoseforCEVvirusinfectionwasdeterminedas2×10TCID50.Theviruswasdetectableevenafter16dpiinthetissueoftheinfectedmice,suggestingthatCEVcanpersistinmiceatleast16daysaftertheywereinfected.Histopathologicalobservationsrevealedthathearttypicallyshowedoedemaininterstitiumandlymphohistiocyticinflammatoryinfiltration.Inliver,cellsexhibitedgranulardegenerationandvacuolardegeneration.Ahugeamountsofinflammationcellsinfiltratedtothelungandresultedinthedisruptionandreplacementofnormalalveolarstructure.Theepithelialcellsinthekidneyandsmallintestinewereseverelydisrupted.Therearedifferentdegreesofvacuolardegenerationandnecrosisinbrainneurons.Interstitialedema,lymphocyticinfiltrationandfibroustissuewereobservedinmuscleofinfectedmice.Simultaneously,CEVviralantigenweredetectedintissuesincludingheart,liver,spleen,lung,kidney,intestine,brainandmusclebyimmunohistochemistryassay.Theviruswassignificantlyhigherinthemyocardium,muscle,liverandlungthaninothertissues.Insummary,wehavesuccessfullyestablishedCEVsucklingmousemodelanddeterminedthemostsusceptiblemousestrain,theminimalinfectivedose,theinfectionroutes,thepathologicallesions,andviraltissuetropism.TheseresultswilllaythefoundationforfurtherstudyofthepathogenicmechanismoftheCEV.Keywords:Caprineenterovirus;CEV-JL14;murinemodel;tissuetropism;histopathology;immunohistochemistryassayIV 目录引言.........................................................................................................1第一章文献综述.....................................................................................21.1肠道病毒的分类............................................................................21.2肠道病毒形态及理化学性质........................................................31.3肠道病毒基因组结构及其编码的蛋白功能................................41.4肠道病毒的复制............................................................................71.5肠道病毒的致病机理....................................................................81.6肠道病毒感染的流行情况..........................................................101.7肠道病毒感染小鼠模型的研究现状..........................................11第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立..........................................142.1材料...............................................................................................142.2方法...............................................................................................162.3结果...............................................................................................212.4讨论...............................................................................................282.5小结...............................................................................................29第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究......................................303.1材料...............................................................................................303.2方法...............................................................................................333.3结果...............................................................................................353.4讨论...............................................................................................453.5小结...............................................................................................46结论.......................................................................................................47参考文献...................................................................................................48导师简介...................................................................................................59作者简介...................................................................................................60致谢.......................................................................................................61V 英文缩略词表英文缩写英文名称中文名称AEC3-amino-9-ethyl-carbazole3-氨基-9-乙基咔唑bpBasepair碱基对cDNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸CEVCaprineenterovirus山羊肠道病毒CPECytopathiceffect致细胞病变效应DMEMDulbecco'sModifiedEagle'sMedium细胞培养基EV-71Enterovirus71肠道病毒71型HEHaematoxylinandeosin苏木精伊红染色实验IFAImmunofluorescenceassay免疫荧光实验IgGImmunoglobulinG免疫球蛋白GIHCImmunohistochemistry免疫组织化学免疫过氧化物酶单层细IPMAImmunoperoxidasemonolayerassay胞实验ORFOpenReadingFrame开放阅读框PBSPhosphatebuffersaline磷酸缓冲盐溶液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应RT-PCRReversetranscriptionPCR反转录-聚合酶链式反应TCID50Tissuecultureinfectivedose半数组织细胞感染剂量UTRUntranslatedRegions非翻译区VI 引言引言肠道病毒（enterovirus，EV）为小RNA病毒科肠道病毒属的成员，是导致人类与动物的消化、神经和呼吸系统疫病的重要病原体。根据病毒最新分类，肠道病毒属分为12个肠道病毒种和3个鼻病毒种。A、B、C、D种主要感染人，E种和F种主要感染牛，G种主要感染猪，H种和J种主要感染灵长类动物。I、[1-3]K、L种肠道病毒为新的种，目前有关这三个种的感染报道较少。牛肠道病毒感染最早由Moll等于1959年从以呼吸系统疾病和发热为主要症状的病牛的粪便[4]中，分离到一株BEV而被证实。2013年，McClenahan等首次从羊驼的肺内分[5]离到F种牛肠道病毒，确定羊驼也可以感染BEV。国内自2011年首次报道BEV-F种感染后，许多地区也报道有本病的发生。2012年本实验室从临床上以严重腹泻和呼吸道症状为特征的病牛分离到一株E种肠道病毒。之后于2014年从腹泻山羊体内分离出肠道病毒CEV-JL14。上述结果显示动物肠道病毒感染已较为普遍，给养殖业造成严重危害。[6]绵羊肠道病毒感染最早于2012年由匈牙利学者报道。2014年，日本学者应用PCR从腹泻的羊群中扩增出病毒的基因片段，确定日本羊群存在肠道病毒[7]感染。2014年，本实验室从严重腹泻的山羊体内，分离出一株肠道病毒，通过生物学特性以及基因序列测定，确定为羊肠道病毒，并命名为CEV-JL14，目前CEV-JL14毒株被小RNA病毒国际分类权威列入G种肠道病毒的新的血清型[8]EV-G20的参考毒株。由于该病为国内新发疫病，其致病机制并不清楚。为了进一步研究CEV-JL14的致病机理，本研究应用CEV-JL14毒株接种小鼠，通过RT-PCR、IFA、IPMA等方法，确定了病毒易感小鼠的品系、易感小鼠的最低感染剂量、持续带毒时间。通过病理组织学和免疫组织化学的方法，确定了病毒感染小鼠后，小鼠体内组织器官的组织病理变化和病毒在体内的分布。该研究初步建立了CEV感染小鼠模型，并确定了病毒的组织亲嗜性，研究结果为CEV的致病机制和疫苗研究奠定了基础。1 第一章文献综述第一章文献综述1.1肠道病毒的分类肠道病毒是小RNA病毒科、肠道病毒属的成员。小RNA病毒科是自然界中广泛存在的病毒科，该病毒科与人类和动物疫病密切相关。根据国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV）发布的病毒分类，肠道病毒属是小RNA病毒科中的40个病毒属之一，它们是引起人类和动物[9]临床上呈现呼吸道、消化道和神经系统紊乱为特征疫病的病原体。2013年，ICTV将肠道病毒属分为12个肠道病毒种和3个鼻病毒种（如表1.1）。其中A、B、C、D种主要感染人而被广泛熟知，包括脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）、埃可病毒（Echovirus，EV）、柯萨奇病毒（Coxsackievirus，CV）、新型肠道病毒。[3,10,11]如表1.1所示，E、F种主要感染牛。G种主要感染猪，H种和J种是主要感染灵长类动物。I种是Woo等，于2015年从骆驼体内分离到的一种新的肠道[12][13]病毒。K种是Du等，于2016年从啮齿类动物体内分离到的新的肠道病毒。[14]L种是Ao等，于2016年从猕猴体内分离到的新的肠道病毒。2014年，本实验室等从严重腹泻的山羊体内，分离出一株CEV-JL14，最后确定为G种肠道病[8]毒。由于A、B、C、D种主要感染人，其致病性与人的健康息息相关，所以对人感染该病的报道屡见不鲜，对其做的研究也很广泛。但是，很少有对动物感染该病进行报道，研究的也不多。肠道病毒感染动物除了引起牛、羊、猪等呈现消化道、呼吸道、繁殖障碍等症状外，也有部分呈现隐性感染。2014年Zhu等报道，感染病牛临床表现为咳嗽、呼吸困难、严重腹泻、黏膜溃疡、发病率和致死[15]率高达50%以上。2 第一章文献综述表1.1肠道病毒属分类Currentspeciesname*FormerspeciesnameEnterovirusAHumanenterovirusAEnterovirusBHumanenterovirusBEnterovirusCHumanenterovirusCEnterovirusDHumanenterovirusDEnterovirusEBovineenterovirus(groupA)EnterovirusFBovineenterovirus(groupB)EnterovirusGPorcineenterovirusBEnterovirusHSimianenterovirusAEnterovirusI-EnterovirusJunclassifiedsimianvirusesEnterovirusK-EnterovirusL-RhinovirusAHumanrhinovirusARhinovirusBHumanrhinovirusBRhinovirusCHumanrhinovirusC（引自网页http://www.picornaviridae.com/enterovirus/enterovirus.htm）1.2肠道病毒形态及理化学性质肠道病毒是小RNA病毒科一类生物学性状相似、形态最小的单股正链RNA病毒。小RNA病毒科中的病毒，都有相同的基因结构。球形是该属病毒的形态，[1-3]衣壳二十面体立体对称，直径为22-30nm。病毒粒子包括其核衣壳和内部的遗传物质RNA。60个一样的壳粒构成了EV的衣壳，四种结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4构成了每个壳粒。病毒粒子的表面有三种结构蛋白，分别为VP1、VP2、VP3，并且可以和Fab段结合。VP4在衣壳里面，发挥保持构型稳定的作用，与[16,17]病毒基因组脱壳有关。病毒结构生物学研究显示，病毒的表面有一个大的“渠沟”，被称为峡谷。峡谷可以与宿主细胞表面的受体结合。受体与峡谷结合后，3 第一章文献综述就可以与谷底的氨基酸进行接触。峡谷周边的氨基酸如果发生突变，将影响与宿主细胞受体的结合。EV对理化因素的抵抗力强，由于小RNA病毒科的病毒壳外没有囊膜，所以能够抵抗有机溶剂，也能抵抗一些蛋白水解酶，耐乙醚、高锰酸钾、过氧化氢、漂白粉。病毒抵抗酸性的能力强，在酸性的环境中可以存活很久，不容易被胃酸消灭。肠道病毒的生存力很顽强，可以在粪便和污水中存活数月，病毒可以通过动物饮用水传播，所以保持动物生活环境干燥整洁极为重要。病毒可以在温度低的环境中长期存在，但是肠道病毒对高温较敏感，加热煮沸达到56℃及其以上温度，即可灭活病毒。EV对紫外线很敏感，用紫外照射病毒1小时可将其杀死。1.3肠道病毒基因组结构及其编码的蛋白功能1.3.1肠道病毒基因组结构[18]如图1.1所示，EV属于小RNA病毒科肠道病毒属的成员，其基因组为单股正链RNA。基因组长度大约为7400个核苷酸。病毒5’端一般长为624-1199个核苷酸，不含有一般宿主细胞mRNA的帽子结构。一般在感染宿主细胞后，[8]由于5’端缺少帽子结构，但在5’UTR含有一个内源核糖体进入位点（IRES）。基因组以一种独立的方式被翻译成一个单一的多聚蛋白，多聚蛋白随后被病毒编[19]码的蛋白酶2A和3C裂解掉，裂解为结构蛋白和非机构蛋白。同时5’非编码区的N端与一个小分子量蛋白VPg共价结合，因为VPg这个蛋白能够在细胞内[20,21]快速降解消失，所以大多数转录本没有这个VPg。EV的基因组只有一个[19]ORF，编码一个大的多聚蛋白。之后，在蛋白酶和水解酶的进一步加工作用下，生成了P1、P2、P3三个前体蛋白。P1最后被裂解为VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白，P2最后被裂解为2A、2B、2C三种非结构蛋白，P3最后被裂解为[3,22,23]3A、3B、3C、3D四种非结构蛋白，如图1.1所示。病毒基因组的3’端UTR[19]大约为47-125个核苷酸，含有polyA。不同毒株RNA3’端polyA长度不一，[24,25]一般为35-100个核苷酸。PV和鼻病毒的整个3’端UTR与其感染性无关。4 第一章文献综述[18]图1.1病毒基因组结构1.3.2肠道病毒基因编码的蛋白及其功能1.3.2.1VPg蛋白及其功能肠道病毒属的成员都含有一个大的ORF，编码一个大约为2178-2332个氨基酸的前体多聚蛋白。翻译蛋白的时候，多聚蛋白不断被水解成小片段蛋白。5’UTR的IRES是一个顺式作用元件，形成二级的RNA结构，并且也形成三级的RNA[19]结构，并且病毒的RNA能够借用细胞翻译装置。一个合理的二、三级结构以及一些茎环结构的生成，对由小RNA病毒IRES启动的内部翻译来说是至关重[26]要的。IRES介导的病毒翻译，与IRES识别相关的翻译因子有关。IRES依赖性翻译，需要大量的ITAFs因子来招募核糖体并启动翻译。这些蛋白可以作为IRES的伴侣，结合在RNA的多个域，并且稳定整个IRES的结构，这对结合的[26,翻译因子来说很合适。很多报道表示ITAFs的活动是依赖于它们的亚细胞定位27]。事实上，功能同ITAFs的细胞蛋白常穿梭在细胞核和细胞质之间，表明ITAFs的再分配是IRES依赖性翻译的绝对要求。5’UTR的N端与一个分子量相对较小的蛋白VPg共价结合，VPg是一种非[21,28,29]结构蛋白，VPg不仅能是基因组稳定，也发挥着重要的作用。对合成蛋5 第一章文献综述[30]白有很大的影响。VPg发挥调控作用。VPg的启动分两步，首先，VPg在病[31]毒聚合酶催化的反应中作为一个引物（VPg-pUpU）。目前认为病毒3AB蛋白是VPg的来源。其次VPg-pUpU被转移到正链或负链RNA的3’端，作为全长[21][32]RNA的引物。VPg可以与蛋白因子eIF4E、eIF4AE、eIF4G等作用。这些细胞因子与蛋白的翻译有关。VPg蛋白可以与RNA聚合酶相结合，VPg同样也可以与非结构蛋白相结合。VPg为编码的3B蛋白，P3裂解形成VPg。该蛋白仅含有20-24个氨基酸，其中酪氨酸残基的苯环羟基通过磷酸二脂键共价连接于病毒RNA5’端的pUpUp上。一般认为VPg在病毒RNA开始复制时起重要作用，[33]同时参与病毒的装配，只有在病毒RNA与VPg结合后，才能被装入病毒衣壳。1.3.2.2结构蛋白及其功能病毒编码的结构蛋白（衣壳蛋白）包括VP1、VP2、VP3和VP4。四个结构蛋白的分子量由大到小的顺序为VP1（1D）、VP2（1B）、VP3（1C）、VP4（1A）[34]。VP1、VP2和VP3均位于衣壳的表面，VP4在衣壳的里面，与病毒基因组[35][19]脱壳有关。VP3能够引起宿主体液免疫应答，并且具有抑制天然免疫的功能。[16]VP3还具有诱导宿主细胞凋亡的功能。结构蛋白可以大致概括为4种作用，即防止病毒RNA被RNA酶水解；识别宿主细胞膜上的病毒特异受体，进而确定宿主或组织的亲嗜性；使病毒进入细胞内并且将其释放到细胞内；选择与包装病毒RNA。研究表明，病毒编码的VP1含有5个β片层结构，VP2和VP3含有3个β[19]片层结构。VP1，VP2和VP3均含有2个α螺旋结构。与β片层结构相连的环形结构位于壳粒表面，在免疫学上有重要作用。VP1、VP2和VP3的C端位于壳粒外侧，N端位于内侧。依赖RNA的RNA聚合酶（3D）参与病毒基因组的合成、复制。1.3.2.3非结构蛋白及其功能病毒的非结构蛋白2A与3C相结合裂解病毒的多聚蛋白，并且分开宿主细胞蛋白以促进子代病毒颗粒的生产，以及逃避细胞的免疫应答。在表达2A蛋白[36,37]的HeLa和酵母中，2A蛋白酶的转录活性可以调节基因以利于病毒复制。2A还能通过切割eIF4G，诱导细胞的凋亡，对细胞的生理活动起到抑制的作用，6 第一章文献综述[38,39]从而逃避被宿主的免疫系统清除。在感染的细胞中，2B，即EV的非结构蛋白，在高尔基体上可以大量积累，使细胞膜的通透性发生变化，并且促进病毒的[40-43]复制能力。2016年，Cong等报道EV71的2B蛋白直接诱导凋亡蛋白Bax[44]构象激活，发生细胞凋亡的现象。2016年，Wu等报道柯萨奇病毒2B蛋白具[45]有自噬诱导能力。2C可以结合结构蛋白，是复制过程中重要的一部分。2C可以促进RNA的复制，因其具有RNA解旋酶的活性，所以2C可以利用这个活性提高模板的利用率，以此来促进RNA复制。3A蛋白是膜结合蛋白，在病毒感染过程当中，发挥递呈膜蛋白的作用。3A蛋白也能够使蛋白的运输发生混乱。3B蛋白也可以叫做VPg。在合成RNA的过程中，3A和3B起着非常重要的作用。同样，在形成EV复制复合体的过程中，[46-48]3A和3AB对其影响很大。2012年，Sadeghipour等报道3A是抗病毒治疗[49][50]的理想靶点。前体蛋白经3C裂解后，分别为结构蛋白和非结构蛋白。3C和2A蛋白是病毒成功复制的关键，这两个蛋白与其他非结构蛋白不一样。对前体蛋白进行初级加工的是2A蛋白，对前体蛋白进行次机加工的是3C蛋白，两[51]者稍有区别却相辅相成。2018年，Xie等报道肠道病毒3C蛋白酶能够中和宿主抗病毒ZAP的活性，表明病毒3Cpro介导的ZAP裂解可以作为一种逃避宿主[35]的抗病毒反应的机制。3D是EV复制的重要酶，能够发挥RNA聚合酶的作用，[52-55]也被称为3D聚合酶。在EV复制的时候，3D以RNA的一条正链为模板，互补出另一条负链RNA，再以新链为模板，最后，合成了子代RNA正链。肠VPg-pUpU是合成EVRNA的引物，然后3D能够催化VPg，使VPg发生尿苷酸[56-58]化，形成复合物，最后VPg又使病毒的RNA从3’处开始进行RNA的复制。多种宿主蛋白可以与RNA聚合酶相互作用，通过调控其活性从而影响病毒的复[59]制。SIRT1通过干扰3D活性，从而对病毒的复制产生抑制作用。1.4肠道病毒的复制肠道病毒的复制过程包括病毒吸附、侵入、脱壳、病毒大分子合成、病毒的[33]组装与释放。病毒的遗传物质要进入到宿主细胞内，病毒必须先与特异的受体[53]结合。种属不同的EV，其受体也是不一样的。有些病毒具有相同的受体，如7 第一章文献综述CD55是多种病毒的共同受体。细胞的表面被病毒吸附后，如PV，VP1与宿主[58,细胞受体结合后，壳体构型发生改变导致破损，病毒基因组脱衣壳穿入细胞内60]。病毒的遗传物质RNA是具有感染性的核酸，该遗传物质进入细胞后，VPg蛋白从5’移除，开始翻译。翻译出一个多聚蛋白（polyprotein），但是在宿主细[19]胞内的酶不参与这个蛋白的加工。2A与3C是加工前体蛋白过程中重要的两个蛋白，这两个蛋白结合后，能够裂解大多数前体蛋白。该蛋白经蛋白酶及水解酶作用后，于是形成了VP1-VP4以及一些功能蛋白。复制的过程是在细胞浆中进行的，复制是以RNA为模板，3D作为RNA聚合酶，先是合成互补的RNA[51]负链，然后再新合成的RNA链为模板，再合成出正链RNA。然后以其作为模板，在核糖体翻译出许多病毒蛋白。壳粒是由衣壳蛋白经过裂解形成，VP4能固[37]定RNA分子，立即装配成有感染性的病毒颗粒。组装完成后，病毒颗粒整齐排列，形成了细胞内的结晶体。这些结晶体最后被依次释放到细胞外。最后，大[61]多数成熟的病毒经细胞裂解而被释放。1.5肠道病毒的致病机理人感染肠道病毒后，主要表现为中枢神经系统疾病和手足口病。手足口病是儿童普遍的一种疹病，手部和脚掌有轻微的水疱性皮疹，并且伴有发热现象。其他特征包括上呼吸道感染、肠胃炎和非特异性病毒性皮疹，尤其是小儿支气管哮[62]喘、肺炎加重。EV71可以引起神经性疾病，以及其他不常见的症状。不同于其他大多数肠道病毒，EV71脑炎是一种典型的脑干性脑炎，常伴有严重的心肺症状，类似于脊髓灰质炎。由于病毒耐酸性强，病毒进入机体后在小肠处大量生存繁殖。较长时间后，病毒能够可以侵入血液，随血液传播扩散，形成病毒血症。[63,64]进而病毒可以随血液到达各个靶组织如脾脏、肝脏、骨髓和淋巴组织。发病机制是一个复杂的过程，当病毒和受体相互作用时，感染开始，并且细胞内环境的情况影响疾病的发展；诱导宿主产生高效的免疫反应的能力；病毒的复制速度；致细胞性；以及感染在组织内或组织间传播，这种感染可能或不可能[63]依赖于特定或不同的细胞受体的存在。Chua的实验表明，在BALB/c试验EV71[23]最强毒力毒株。这株病毒在VP1段突变（G145E）导致病毒毒力增高。表达8 第一章文献综述VP1段（K244E）突变的病毒是毒力的关键遗传决定因素。大量的研究表明，肠道病毒的5’端UTR和3’端UTR对组织嗜性、毒力、病毒的致病机制上有相当[65-67]大的影响。PV的5’UTR的480、481和472位核苷酸被作为是PV1、2和3[68,69]的神经毒性的决定因素。CVB1和CVB35’UTR的茎环Ⅱ决定心毒力表型。在各种反向遗传学试验中显示在EV71VP1BC环区域（L97R）在细胞嗜性方面扮演重要角色，可能有助在免疫力低下的病人体内传播和神经嗜性。朱利塞发现[19]E种肠道病毒HY12的准种具有多样性和复杂性，随着传代次数增加而升高。朱利塞还发现导致HY12毒株病毒滴度增高、病毒复制能力和致病性增强的原因是VP1的R91H突变。肠道病毒感染人时，主要引起人的胃肠道、心肌、呼吸系统和中枢神经系统的疾病。当病毒与细胞表面的受体结合后，病毒感染开始。细胞表面与病毒相结合的受体影响在细胞组织嗜性和病毒的致病性。最近hSCARB2和PSGL-1被认[70]为是EV71的受体。除此之外，EV71使用SA连接聚糖作为感染的受体。有[71,72]多种研究表明hSCARB2在病毒感染和人类疾病的发展扮演重要角色。CVA14和CVA16是手足口病（HFMD）的主要病原体，同样使用hSCARB2作[71,73]为受体。与神经系统疾病有关的柯萨奇病毒（CVA7）在病毒感染过程中，[73]同样使用hSCARB2作为受体。EV能够免疫逃逸到达中枢神经系统（CNS），并且能够穿过血脑屏障，从血[74]液、受感染的白细胞和神经细胞扩散到CNS。对于PV，CNS入侵被认为是破坏血脑屏障或者是逆轴突运输。PSGL-1是EV71的受体，主要被表达在白细胞[75]表面，在炎症反应中起很重要的作用。一些EV71的病毒株能与PSGL-1结合[76]并且感染免疫细胞，但是有一些不会。Nishimura等观察到EV71结合到PSGL-1的N端酪氨酸硫酸化作用，同时还发现，VP1的145位单个氨基酸残基，通过影响邻近的病毒表面的VP1244位赖氨酸的方向决定病毒是否能够结合到PSGL-1受体上，此研究提出VP1145位氨基酸通过改变VP1244位侧链带正电荷的赖氨酸到带负电荷的PSGL-1受体N端的可接近性，从而控制病毒的嗜性。[77]这个结果揭示了新的病毒与受体的相互作用。PSGL-1主要在白细胞表面表达，SCARB2在多种细胞上被广泛，包括中枢神经系统的神经元。在特定的细胞或者组织内，特定的病毒在该场所进行复制。病毒特有的疾病模式是组织的亲嗜性造9 第一章文献综述[78]成的。在病毒识别众多受体后，宿主体内的受体分布比病毒复制位点更广。有研究报道，干扰素反应控制组织嗜性和致病机制。小RNA病毒对干扰素[79,80]很敏感，说明干扰素在抗病毒的固有免疫反应中发挥核心作用。IFN-/β干扰素反应控制组织嗜性以及PV和CVB3的致病性。肠道病毒抑制由RIG-1和TLR3介导的Ⅰ型干扰素反应，而且这个过程涉及到3C蛋白酶裂解病毒干扰素[81-83]调节因子7（IRF7）。除了宿主蛋白和病毒基因组多样性外，还报道了一些[84-86]小RNA参与调节病毒生命周期中的病毒复制和翻译。B组柯萨奇病毒（CVBs）是B种肠道病毒。CVBs分为6个血清型，是人类病毒性心肌炎的主[87]要病原体，可以导致扩张型心肌病和心力衰竭。1.6肠道病毒感染的流行情况1957年，手足口病第一次在新西兰被报道，之后流行于世界各地。柯萨奇病毒CVA16于1958年在加拿大首次被分离到。1959年，称为手足口病，并且通过一系列生物学鉴定与分析，CVA16为本病的主要病原。1969年，EV71于1969年在美国被首次报道。在1969-1970年期间，CVA16在日本暴发流行。在1972-1973年期间，EV71在澳大利亚暴发流行，病人大部分表现CNS症状，并且还伴随着严重的呼吸道疾病。在欧洲，1975年保加利亚和1978年匈牙利相继[88]暴发由EV71引起的，以CNS疾病为主要特征的疾病。婴幼儿感染EV71主要引起的神经系统表现如脑干脑炎，在20-21世纪，这样的病主要被报道于亚太[89-91]地区。在过去的15年中。EV71已经引起手足口病和偶尔的神经感染广泛流[92]行。自2008年以来，中国报道的EV71感染已经超过一百万例。在俄罗斯，2013年之前没有对由EV71引起的手足口病的相关报道，也没有研究过EV71的流行病学。因此，根据流行病学情况和疾病谱显示，在2008年-2009年期间，主[90]要在俄罗斯与中国相邻地区间盛行。牛肠道病毒感染也是以呼吸道症状和消化道症状为主要特征的一种新发传染病，病牛会表现出严重腹泻、严重脱水，最后死亡，对养殖业的发展有很大的影响。1959年，Moll等第一次报道此病，从以呼吸道的疾病和发热为主要症状[4]的病牛的粪便中，分离到BEV-165。同年，Moll等又从牛粪便样品中，分离到10 第一章文献综述一株BEV-261毒株，该病牛仍然表现呼吸系统疾病症状以及发热。随后，该病流行于美国、加拿大、巴基斯坦等多个国家，并且陆续有BEV的分离报道。有意思的是，McClenahan等于2013年，从羊驼的肺内分离到F种牛肠道病毒，该[5]羊驼是由呼吸道感染死亡，这也是首次从羊驼体内分离出BEV。在国内，2011年由李英利等，从腹泻的病牛体内分离到一株F种肠道病毒，表明国内的牛群也[93][94]存在牛肠道病毒感染。彭小薇等于2013年分离出一株BEV2型。2014年邢泽黎等分离到一株E种肠道病毒，这也是国内第一次分离到的E种肠道病毒，[95]称其为HY12株。随后，在全国各地均有此病的报道，给养殖业尤其是养牛业[6]带来很大的影响。2012年，羊肠道病毒首次报道于匈牙利。2014年，日本也[7]从腹泻的羊体内扩增出基因片段大小约560bp的基因片段。2014年，王明月等从严重腹泻、呼吸困难的山羊体内分离出1株病毒，经过病毒理化学特性分析和[8,96]序列的测定，确定分离到的病毒粒子是EV，是国内首次分离到的CEV。Woo[12]等，于2015年从骆驼体内分离到的一种新的肠道病毒。Du等于2016年从啮[13]齿类动物体内分离到的新的肠道病毒，被列入K种肠道病毒种。新的肠道病[14]毒种L种是Ao等，于2016年从猕猴体内分离到的。由此可知，EV流行范围广泛，造成的伤害力也是极大的。1.7肠道病毒感染小鼠模型的研究现状动物模型在药物、疫苗以及疾病的致病机制研究中是很重要的，也是最关键的一点。目前最常用的动物模型是小鼠模型。对小RNA病毒科病毒感染小鼠模型的研究，有助于后续实验的设计与进行。为了探究人感染EV71后临床上的表现，Chen等于2004年通过口服接种1日龄小鼠，从而建立了小鼠模型。发现口服接种后，该病毒最初在消化道上皮细胞中复制，随后扩散到循环系统和各种器官，这些器官包括心脏、肌肉、皮肤和肺，感染后的小鼠出现神经症状，并且EV71能从大脑和脊髓中分离出来。该模型模拟了中枢神经系统在EV71感染后的临床症状，并且揭示了EV71在中枢神[62]经系统中的发病机制。Wang等使用EV714643毒株腹腔接种1日龄ICR小鼠，[97]连续4次传代后，得到毒株MP4，其生长速度和细胞毒性比4643更快、更强。11 第一章文献综述MP4株能够口服感染7日龄小鼠，导致小鼠后肢瘫痪，在接种5-9天时死亡。组织病理学检查发现在脊髓中的神经元减少和细胞凋亡，肢体的肌肉显示出大量坏死。病毒早期在肠道中复制，而在感染后期，它在脊髓、大脑、肌肉中复制。该小鼠模型的建立是研究EV71发病机制和疫苗开发的一个独特的工具。2008年，Ong等用2周龄的小鼠建立了肠道病毒71型脑脊髓炎模型，该病的许多特征与[98]人中枢神经系统疾病相似。小鼠通过口服和胃肠道途径感染病毒，感染2-5天后，小鼠死亡。组织病理学观察，多数受感染的神经元位于前角、三叉神经运动核和脑干网状结构。病毒抗原大部分分布在骨骼肌及其周围，但是在其他组织中没有。通过病毒的分布，可知在骨骼肌受感染后，病毒通过外周运动神经进入CNS，并且在CNS内传播。该模型的建立对该病的致病机制和该病的治疗是有用的。近年来，EVD68已被越来越多的报道与严重的呼吸道感染和急性弛缓性脊髓炎相关。然而，目前还没有针对该病的疫苗和药物。为了促进疫苗的发展，2018年1月，Zhang等建立了ICR乳鼠模型。结果发现，9日龄ICR乳鼠通过腹腔注[99]射易感染该EVD68US/MO/14-18947病毒株。感染的小鼠在死亡前表现出后肢瘫痪，并且死亡率依赖年龄和病毒剂量。组织病毒载量分析显示，肢体肌肉和脊髓是病毒复制的主要部位。此外，组织病理学检查发现下肢和脊柱的肌肉严重坏死。重要的是，从抗血清转移和母体免疫实验结果清楚地表明，灭活EVD68疫苗能够在小鼠模型中对致命的病毒感染起保护作用。总之，结果表明小鼠模型的成功建立也为EVD68疫苗灭活病毒的发展提供了重要的信息。[100]Crotty等建立了小鼠模型对脊髓灰质炎病毒感染的致病机理进行了探索。当PV感染机体时，病毒首先在肠道中感染，在肠上皮细胞中复制，然后释放到血液中。传播的病毒在骨骼肌细胞中复制，最后到达外周神经，然后扩散到CNS。在骨骼肌中，病毒复制持续保持病毒血症。PV进入CNS可能通过穿透血脑屏障或者通过外周神经的传递。Koike等为了分析PV致病性和免疫应答的方法，建[101]立了PV受体转基因小鼠模型。表达人PV受体的转基因小鼠易感染PV并且能够发展成类似于人脊髓灰质炎的一种神经性疾病。对脊髓灰质炎病毒株的毒力水平的评估，包括反向遗传学产生的突变病毒、疫苗衍生PV和候选疫苗，这些对该病的致病性的基础研究是有用的。此外，该转基因小鼠可用于研究PV的组12 第一章文献综述织嗜性和宿主免疫反应。1993年，为了研究病毒复制和急性、慢性心脏病发展之间的相互关系，Klingel[102]K等用CVB3感染不同免疫活性小鼠品系。结果发现，急性感染是以炎性单核细胞密度增加的病毒诱导的肌细胞溶解为特征，而持续性感染显示在持续减少仍然进行的炎症下，心肌细胞减少。在急性、慢性心脏病发病机制中，病毒复制的重要作用通过组织损伤和病毒复制部位炎症持续发展被证实。没有观察到炎症病变是病毒独立复制的，表明持续性感染是慢性疾病发展的关键。这个由CVB3引起的心肌炎小鼠模型的可用性，证明对肠道病毒的持久性的分子机制的研究是有用的。Stone等为了验证生产的疫苗是否能够抗柯萨奇病毒并且预防病毒性糖[103]尿病，建立了小鼠实验模型。连续三天的测量病毒血症的情况，发现接种疫苗的小鼠没有感染的迹象，而未接种疫苗的小鼠能够检测出病毒的RNA。建立这个小鼠模型为病毒疫苗作用的研究打下基础。Dong等为了检测CV-B4感染是[104]否导致心肌炎和中枢神经系统感染，建立了CV-B4ICR小鼠模型。研究发现治疗组和对照组的小鼠生存率很高，而CV-B4感染的小鼠在大脑和心脏中病变明显。感染2天后，病毒量在神经和心脏中也很高。该小鼠模型成功模拟由CV-B4感染引起的急性心肌炎和脑皮质神经元水肿，并且对候选疫苗和潜在的抗CV-B4病毒药物的评价是有用的。ICR小鼠是封闭群小鼠，本身具有良好的生长条件，常常被用做实验动物。HY12病毒是最近从表现严重呼吸道和消化道疾病，且高发病率和死亡率的牛体内分离出来的肠道病毒，而这个病毒展现出来的独特的生物的和分子的特征不同于其他E种肠道病毒，对这个病毒的致病机制更是不了解。Gai等为了研究HY12的致病性及致病机制建立了ICR小鼠模型，结果发现，病毒可以通过不同途径[105]感染小鼠。该研究对乳鼠各组织器官病变的影响进行了检测，在小肠、肺脏、肝脏和大脑有炎性细胞浸润。免疫组织化学发现，病毒抗原存在于大多数组织中，特别是小肠、肺脏和小鼠感染的大脑中。13 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立羊肠道病毒感染是近年来国内外报道的新发传染病，临床上以消化道和呼吸道的症状为主要临床特征，发病率和死亡率高达80%以上。由于本病在国内是一种新发传染病，其致病机理目前和如何有效防治尚不清楚。动物模型在研究病毒的致病机理以及疫苗的制备上具有重要意义，所以，建立有效的CEV感染动物模型至关重要。目前最常用于研究小RNA病毒科病毒的致病机制的动物模型是小鼠模型。因此，本研究通过病毒感染小鼠，确定了小鼠易感品系、易感小鼠感染途径、易感小鼠感染剂量及带毒时间，并通过病毒的分离及免疫学鉴定的方法对CEV-JL14进行检测，进一步确定CEV-JL14感染乳鼠模型是否成功。本研究建立了CEV感染小鼠模型，为深入研究CEV的致病机理及寻找安全、有效的防治方法奠定了基础。2.1材料2.1.1病毒与细胞羊肠道病毒CEV-JLI4为本实验室分离，-80℃保存备用。CEV-JL14易感的Vero细胞由本实验室保存。2.1.2实验动物购自长春生物制品所SPF级ICR18窝（10周龄ICR母鼠18只，3日龄ICR乳鼠256只）；SPF级BALB/c2窝（10周龄BALB/c母鼠2只，3日龄BALB/c乳鼠12只）；SPF级KM2窝（10周龄KM母鼠2只，3日龄KM乳鼠12只）。2.1.3主要试剂RNA提取试剂TRIzolReagent购自Invitrogen公司（美国）；无水乙醇、异丙醇、甲醇、CHCl3均购自北京化学试剂公司；DNAmarker、ReverseTranscriptaseTMM-MLV、dNTPMixture、2×PremixTaq、DNAmarker均购自Takara公司；DMEM粉末购自Gibico公司（美国）；胎牛血清购自CLARKBioscience公司；14 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立AEC购自长春尚宝生物有限公司；GoatAnti-Rabbit（HRP）抗体购自长春尚宝生物有限公司；GoatAnti-Rabbit的红色荧光抗体购自Abbkine（美国）。2.1.4主要仪器PCR扩增仪（ThermoFisher）；水平电泳仪（Tanon）；立式高压灭菌锅（上海博迅）；-80℃超低温冰箱（SANYO）；二氧化碳培养箱（SANYO）；高速冷冻离心机（长沙湘智）；Thermo生物安全柜（美国）；倒置荧光显微镜（上海立光精密仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）。2.1.5琼脂糖凝胶电泳相关溶液配制①50×TAE缓冲液：Tris-Base24.2g，冰乙酸5.71g，溶于20mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），溶解彻底后，定容至100mL，用二馏水稀释50倍使用，置于室温保存。②1.0%琼脂糖凝胶：琼脂糖1g，溶解于100mL1×TAE，在微波炉中彻底融化后，加入5μL10mg/mL的EB。2.1.6细胞培养相关溶液配制①DMEM培养基：按照产品说明书，将一包DMEM粉末溶到1L无菌的蒸馏水中，再加入3.7g/L的NaHCO3，充分混匀，待固体溶解后，用0.22μm的滤器对其进行过滤，于4℃放置。②胰蛋白酶液：胰酶0.25g，EDTA0.02g，溶于100mlSolutionA溶液中，以0.22μm的滤器进行过滤，于4℃放置保存备用。③SolutionA：HEPES7.149g，葡萄糖1.802g，KCl0.2236g，NaCl7.697g，Na2HPO4·7H2O0.268g溶于1L高压过的蒸馏水中，以0.22μm的滤器进行过滤，于4℃放置保存备用。2.1.7IFA及IPMA①PBS：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g溶于800mL蒸馏水中，固体彻底溶解后，定容至1L，对溶液的pH值进行调节，调节至7.4，高压灭菌后使用。15 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立②PBS-T：每1LPBS溶液中，加入500μLTween-20，Tween-20的终浓度是0.05%。③封闭液：每10mLPBS中，加入0.5g的脱脂奶粉，脱脂奶粉的终浓度为5%。④HRP标记羊抗兔IgG稀释：1mLPBS中加入2μLHRP标记羊抗兔IgG，即将其稀释500倍。⑤Texasred标记羊抗兔IgG稀释：1mLPBS中加入2μLTexasred标记羊抗兔IgG，即将其稀释500倍。⑥AEC底物显色液：按照试剂盒说明书将A液、B液分别用蒸馏水稀释10倍，然后将其A液和B液等量混匀，现配现用。2.2方法2.2.1羊肠道病毒CEV-JL14的培养待培养的Vero细胞生长密度为70-80%时，吸走细胞上清，用SolutionA洗1遍，然后加入鉴定过的实验室备存的羊肠道病毒CEV-JL1420μL，放到CO2细胞培养箱中，37℃感作1.5h，每15min轻轻摇晃一次，感作后，吸走上清。用SoutionA洗1遍，然后加入含2%FBS的DMEM培养液，每2h观察一次，待70-80%的Vero出现CPE后，将其在冰箱中连续冻融3次，在离心机中离心后，收集上清，于-80℃保存备用。2.2.2病毒TCID50的测定按照Reed-Muench两氏法进行。将病毒液在无菌的EP管内，进行不间断的10倍稀释，以获得一系列不同稀释梯度的病毒液。将每个稀释度的病毒液接种于96孔板单层Vero细胞，每个稀释梯度接种8个孔。每间隔一段时间就要查看细胞的生长状况及病变的程度，然后按照Reed-Muench两氏法，接毒后72h记好每个梯度的病毒液接种细胞，细胞出现CPE的孔数，计算病毒的TCID50。同时，设立未接毒细胞对照组。2.2.3CEV感染不同品系的乳鼠对不同品系的小鼠进行分组及病毒接种试验。选取6窝3日龄SPF级健康16 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立乳鼠，ICR、BALB/c、KM各2窝，每窝从中随机选取6只乳鼠。每窝为1组，共6组，每组又分为CEV感染组和阴性对照组。各窝乳鼠独立饲养。饲养在SPF环境下，温度保持在（233）℃，湿度（55.510）%，通风良好。给予充足的水和粮食，定期更换垫料清理鼠舍，保持乳鼠生活环境的舒适整洁。将2.2.18收集到的病毒液，以2×10TCID50病毒液的剂量颈部皮下注射各品系实验组乳鼠，各对照组乳鼠，颈部皮下注射相同体积的不含病毒的DMEM培养液。接种后，定期观察乳鼠的生长情况和肢体表现。在病毒接种第2天、5天和7天时，每组每次随机脱颈处死2只乳鼠，并收集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、脑、肌肉等各组织、器官，于-80℃保存备用。2.2.4病料总RNA的提取①取各组乳鼠组织器官混合物，用液氮研磨后，将组织粉末移到含有600μLTRIzol的1.5mLEP管中。②轻轻晃动混匀后，加入300μL氯仿，振荡15s，静置2min，4℃离心，12000r/min，离心20min。③将上清液吸到无RNase的1.5mLEP管中，然后加入相同体积的异丙醇，轻轻混匀后，4℃离心，12000r/min，离心20min。④移走上清液保留沉淀，用75%的乙醇，轻轻洗涤沉淀，5000r/min，离心5min，吸走上清，将EP管置于冰盒，干燥。⑤加入适量的DEPCH2O溶解沉淀，-80℃保存备用。2.2.5病毒cDNA的合成病毒cDNA的合成按照Takara公司ReverseTranscriptaseM-MLV的说明书进行。反应体系中加入5μg总RNA，随机引物（25μM）2μL，加水补齐到12μL，混匀彻底后，放到70℃水浴锅中，对其进行水浴10min，然后迅速放到冰上，冷却2min，加入5×M-MLVbuffer4μL，dNTP混合物（10mM）1μL，RNaseInhibitor（40U/μL）0.5μL，ReverseTranscriptaseM-MLV（200U/μL）1μL，补加水至20μL，轻轻混匀后，按照程序：30℃，10min；42℃，1h进行，合成cDNA。17 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立2.2.6引物的设计与合成根据GenBank上提交的CEV-JL145’端UTR基因序列，利用软件primer5.0设计引物（表2.1），基因片段大小为433bp，引物由上海生工生物有限公司合成。表2.1CEV-JL14检测引物引物序列（5’-3’）C1TGAACACAAACCGACCAATAGC2TAATAAACAAATAAAGGAAACACG2.2.7聚合酶链式反应（PCR）PCR扩增按照常规的步骤进行，反应体系为50μL如下：模板（20ng）1μL上游引物1μM下游引物1μM2×TaqDNA聚合酶25μL水22μLPCR反应程序为：95℃5min95℃30s56℃30s36cycles72℃40s72℃10min反应完成后，用1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，然后将样品送给上海生工生物有限公司，进行测序。2.2.8感染及分组选取10窝3日龄ICR乳鼠，每窝随机选取16只乳鼠，每窝为1组，随机分为5组实验组和5组对照组，各实验组每只乳鼠分别以5种不同感染途径接种82×10TCID50病毒液，相对应的对照组每只乳鼠，以对应的感染途径接种相同体积的DMEM细胞培养液。各实验组编号为“A1、B1、C1、D1、E1”，相对应18 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立的各对照组编号为“A2、B2、C2、D2、E2”。具体分组如表2.2所示，乳鼠饲养条件同2.2.3。待病毒接种后，每日观察实验组和对照组乳鼠的体重变化和临床症状。表2.2病毒感染分组及感染途径与剂量RouteofInfectivedoseNumberofGroupDayoldinfection（TCID50）sucklingmice8A13dIP2×1016A23dIP-controlDMEM168B13dIM2×1016B23dIM-controlDMEM168C13dSC2×1016C23dSC-controlDMEM168D13dIG2×1016D23dIG-controlDMEM168E13dNA2×1016E23dNA-controlDMEM16注：腹腔注射（Intraperitonealinjection，IP）；肌肉注射（Intramuscularinjection，IM）；皮下注射（Subcutaneousinjection，SC）；灌胃（Intragastricadministration，IG）；滴鼻（Nasaladministration，NA）；DMEM：细胞培养液。2.2.9CEV感染乳鼠途径的确定每日观察2.2.8中实验组和对照组乳鼠的体重变化和临床症状。对各组乳鼠在接毒后第3、5、9、12、15、18、20、22天，各组随机脱颈处死2只乳鼠，并收集各器官组织。将收集到的各器官组织一分为二，一部分保存到-80℃冰箱，用于RT-PCR实验。另外一部分组织置于10%中性福尔马林中固定48h，然后保存到75%的酒精中，用于后续实验。2.2.10CEV易感乳鼠的最低感染剂量选取4窝3日龄ICR乳鼠，每窝从中随机选取6只乳鼠，每窝为1组，对468其中3窝每只乳鼠分别以颈部皮下注射2×10TCID50、2×10TCID50、2×1019 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立TCID50病毒液，分别命名为A、B、C组，余下的一窝乳鼠命名为D组，作为未接毒对照组。D组的6只乳鼠以颈部皮下注射相同体积量的DMEM培养液。乳鼠饲养条件同2.2.3。待病毒接种后，每日观察实验组乳鼠的生长情况和临床症状。接毒5天后，脱颈处死各组乳鼠，并收集乳鼠的各组织、器官，于-80℃保存备用。按照2.2.4、2.2.5、2.2.7所述方法，进行后续实验。2.2.11感染乳鼠组织内CEV的分离将上一步收集到的乳鼠组织，剪碎后，按照1:5（W/V）比例加入灭菌的10mM，pH7.4的磷酸盐缓冲液，用组织研磨器研磨组织，研磨后的悬液放于-20℃的冰箱中，反复冻融3次后，4000r/min，离心10min。用0.22μm滤器对离心后的上清液进行过滤除菌。将过滤后的组织滤液接种到生长密度为70-80%的Vero上，37℃感作2h，吸走滤液，加入含2%FBS的DMEM培养液。在Vero上进行盲传，直至Vero出现典型的CPE。同时，对照组小鼠做相同处理。2.2.12免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）鉴定CEV病毒将感染CEV的Vero细胞应用IPMA进行鉴定，具体操作步骤如下，弃掉感染的Vero细胞的上清液，细胞用甲醇于-20℃固定30min，PBST漂洗后，加入5%的脱脂奶粉，37℃封闭45min，PBST洗涤3次，每次5min，加入兔抗CEV的多克隆抗体（1:200倍稀释），37℃感作1h，洗涤同上，加入HRP标记的GoatAnti-RabbitIgG（1:500倍稀释），37℃作用45min，PBST洗涤3次，每次5min，加入AEC底物显色液，在室温条件下，避光显色10min。甘油封片后，在显微镜下观察结果。2.2.13间接免疫荧光（IFA）鉴定CEV病毒将盲传后，出现明显典型细胞病变的Vero细胞应用IFA进行鉴定，具体操作步骤如下，将弃掉上清的Vero细胞用甲醇于-20℃固定30min，PBST漂洗后，用5%的脱脂奶粉进行封闭，37℃45min，PBST洗涤同2.2.13。加入兔抗CEV的多克隆抗体（1:200倍稀释），37℃感作1h，洗涤同上。加入Texasred标记羊抗兔IgG红色荧光二抗（1:500倍稀释），37℃作用45min，洗涤同上。加入DAPI（1:1000倍稀释），在室温条件下避光染细胞核10min，PBST洗2次，室温风20 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立干封片，在荧光显微镜下观察结果。2.2.14CEV易感乳鼠带毒时间的确定选取2窝3日龄ICR乳鼠，每窝从中随机选取30只乳鼠，每窝为1组，随6机分为实验组和对照组，实验组的乳鼠，以颈部皮下注射2×10TCID50病毒液，对照组的乳鼠，以颈部皮下注射相同剂量的DMEM细胞培养液。乳鼠饲养条件同2.2.3。接种后，每日观察乳鼠的生长情况和症状。在接毒后3、5、8、11、14、16、18、21天各组随机脱颈处死2只乳鼠，并收集各组织器官，于-80℃保存备用。按照2.2.4、2.2.5、2.2.7所述方法，进行后续实验。2.3结果2.3.1CEV病毒的TCID50为了测定实验室保存的羊肠道病毒CEV-JL14的TCID50，按照2.2.2所述的方法，计算出出现CPE的孔数，参考Reed-Muench两氏法计算病毒的TCID50，-8.3结果显示，病毒的TCID50为10/0.1mL（表2.3）。21 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立表2.3CEV-JL14毒株TCID50的测定病毒液细胞孔数累计细胞孔数细胞孔出现CPE孔稀释度出现CPE无CPE出现CPE无CPE总数所占的%-1108062062100（62/62）-2108054054100（54/54）-3108046046100（46/46）-4108038038100（38/38）-5108030030100（30/30）-6108022022100（22/22）-710711411593.3（14/15）-81053741163.6（7/11）-910262101216.7（2/12）-101008018180（0/18）2.3.2CEV易感乳鼠的品系为了确定CEV易感乳鼠的品系，以颈部皮下注射的方式接种ICR、BALB/c、8KM三个品系的每只乳鼠，每只乳鼠接种2×10TCID50病毒液的剂量，而每个品系相对应的各对照组中，每只乳鼠接种相同体积的不含病毒的DMEM培养液。接种病毒5天后脱颈处死各组乳鼠，并收集各组织、器官，提取组织RNA。应用RT-PCR的方法，对乳鼠组织中病毒的基因序列进行了扩增。结果如图2.1所示，仅ICR品系乳鼠扩增出条带，并且条带大小与预期条带大小一致，经过核苷酸序列测定，确定为CEV-JL14毒株。该结果表明，仅ICR乳鼠易感CEV。22 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立图2.1CEV感染乳鼠品系的确定M：DL2000DNAMarker；1-3：分别为接种病毒的ICR、BALB/c和KM乳鼠组织样品；4-6：分别为接种DMEM的ICR、BALB/c和KM乳鼠组织样品；7：阳性对照；8：阴性对照。2.3.3CEV易感乳鼠的途径为了确定CEV感染途径，我们以5种不同感染方式（腹腔注射、肌肉注8射、皮下注射、灌胃、滴鼻）给乳鼠接种2×10TCID50病毒液，于第5天对各器官组织中CEV进行检测。结果如图2.2所示，五种途径接种乳鼠扩增出的条带大小与预期条带大小一致，经过核苷酸序列测定，确定为CEV-JL14毒株。该结果发现腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种的乳鼠均可感染病毒，仍然选取皮下注射进行后续实验。23 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立图2.2CEV乳鼠感染途径的确定M：DL2000DNAMarker；1-5：分别为腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种病毒液的乳鼠组织样品；6-10：分别为腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种DMEM的乳鼠组织样品；11：阳性对照；12：阴性对照。2.3.4CEV易感乳鼠的最低感染剂量为了确定CEV易感乳鼠最低感染剂量，选取4窝3日龄ICR乳鼠，分别命4名为A、B、C和D组，对A、B、C组每只乳鼠分别以颈部皮下注射2×10TCID50、682×10TCID50、2×10TCID50感染剂量的病毒液，对D组每只乳鼠注射相同体积的DMEM细胞培养液。接种5天后处死各组的乳鼠，收集各组织、器官并提取乳鼠组织RNA，再通过RT-PCR检测CEV基因片段，结果如图2.3所示，乳鼠46感染剂量为2×10TCID50病毒时，并未出现目的条带，当感染剂量分别达到2×108TCID50和2×10TCID50时，均出现与预期条带大小相符的条带。因此，本研究6中确定3日龄ICR乳鼠最低感染剂量为2×10TCID50。24 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立图2.3CEV易感乳鼠最低感染剂量的确定4M：DL2000DNAMarker；1：接种210TCID50病毒液的ICR乳鼠组织68样品；2：接种210TCID50病毒液的ICR乳鼠组织样品；3：接种210TCID50病毒液的ICR乳鼠组织样品；4：接种DMEM的ICR乳鼠组织样品；5：阳性对照；6：阴性对照。2.3.5感染乳鼠组织内CEV的分离为了证实病毒成功接种乳鼠组织，用组织研磨器研磨2.2.11实验收集到的组织，悬液经过滤后，接种Vero细胞，盲传3代后，结果如图2.4所示，接种感染乳鼠组织的Vero细胞出现典型的细胞病变现象，细胞表现为皱缩变圆、聚集，细胞的透光性显著增强，最后细胞逐渐脱落、崩解死亡。而接种对照组乳鼠组织的Vero细胞未出现细胞病变。该结果表明，病毒成功接种乳鼠。25 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立图2.4感染乳鼠组织内CEV的分离A：感染乳鼠组织接种细胞结果；B：未感染乳鼠组织接种细胞结果2.3.6感染乳鼠组织内CEV的免疫学鉴定为了验证出现的细胞病变是由CEV引起的，将出现细胞病变的Vero细胞通过IPMA和IFA对其进行鉴定，结果如图2.5所示。在IPMA中，出现细胞病变的细胞能与CEV特异性的多克隆抗体发生反应，经AEC显色后，呈现出红色的细胞为阳性细胞（图2.5A），即为CEV感染的细胞，而对照组的细胞经AEC显色后，无红色细胞出现（图2.5B）。在IFA中，出现细胞病变的细胞能与CEV特异性的多克隆抗体发生反应，表现出特异性的红色荧光（图2.5C），而对照组的细胞没有发出红色荧光（图2.5D）。该结果证实，细胞病变是由CEV引起的，也进一步表明从感染乳鼠组织中成功分离出CEV。26 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立图2.5IPMA和IFA鉴定分离出的CEV病毒A：IPMA检测到CEV病毒结果；B：IPMA对照组检测结果；C：IFA检测到CEV病毒结果；D：IFA对照组检测结果。2.3.7CEV易感乳鼠的带毒与排毒时间为了确定乳鼠组织的带毒时间，选取2窝乳鼠，分别作为实验组和对照组，病毒接种实验组的每只乳鼠，对照组接种相同体积的DMEM细胞培养液。待病毒接种后，每日观察实验组乳鼠的生长情况和临床症状。各组不定期随机脱颈处死2只乳鼠，并收集各组织器官提取乳鼠组织RNA，再通过RT-PCR检测接种病毒乳鼠组织中CEV的特异性基因片段，结果如图2.6所示，在病毒感染乳鼠组织5、11、14、16天时均出现与预期条带大小相符的条带，即检测到病毒的特异性基因片段，而在感染18和21天时没有出现条带，该结果表明，CEV感染ICR乳鼠，乳鼠组织带毒时间至少可持续16天。27 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立图2.6感染乳鼠带毒时间检测结果M：DL2000DNAMarker；1-6分别为感染小鼠第5、11、14、16、18、21天的组织PCR结果；9-14分别为1-6阴性对照小鼠组织PCR检测结果；7：阳性对照；8：阴性对照。2.4讨论EV是引起人类和动物消化道与呼吸道感染的重要病原体。CEV感染是近年来国内外报道的新兴动物疫病。自2012年匈牙利首次报道CEV感染后，许多国家也先后报道本病的暴发与流行。本实验室于2014年在国内首次分离出该病毒，确定国内羊群中也有肠道病毒感染。CEV感染主要以消化道和呼吸道症状为主，发病羊表现出呼吸困难、严重腹泻、口腔黏膜溃疡等症状，发病率和死亡率分别为84%和54%，严重阻碍了养羊业的快速发展。不仅给养殖户造成了经济损失，也给我国养殖业造成了严重的经济损失。由于CEV感染是一种新发的传染病，其致病机理及如何制定有效防控措施仍不清楚。而动物模型在研究病原的致病机制以及疫苗制备具有重要意义。但是直到现在国内外还没有CEV感染的动物模型。前期大量研究报道，小RNA病毒科的病毒主要以小鼠作为感染模型，简单、方便、易于操作、价钱低且发病机理与本体动物相似。因此，本研究首先以病毒28 第二章羊肠道病毒小鼠感染模型的建立感染的乳鼠为研究模型，通过比较不同品系的乳鼠对CEV的敏感性，确定出CEV易感乳鼠品系为ICR乳鼠。为了进一步研究病毒感染途径对ICR小鼠的影响，我们分别通过腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种ICR乳鼠，结果发现以上途径均可感染ICR乳鼠。然后用不同剂量的病毒液感染分6组后的ICR乳鼠，确定出CEV易感乳鼠的最低感染剂量为2×10TCID50。随后并将感染后小鼠的组织滤液和未感染的小鼠组织滤液分别接种Vero细胞，结果发现，接种感染小鼠组织滤液的细胞出现典型的细胞病变，表明CEV成功感染了小鼠。为了进一步确定引起细胞病变的病原为CEV，我们采用IPMA和IFA方法对病毒进行了鉴定，结果发现，该病原能够与CEV特异性的多克隆抗体发生结合。这些结果表明我们成功建立了CEV感染的乳鼠模型。基于以上研究，我们又对CEV感染后，乳鼠带毒时间进行了研究，结果发现在病毒感染乳鼠组织的第5、11、14、16天，组织内均有病毒存在，然而在第18和21天时并未检测到病毒，表明乳鼠组织带毒时间至少可持续16天。以上实验结果可以为进一步研究羊肠道病毒感染后其在组织器官中的分布、组织嗜性、致病机理及寻找安全、有效的防治方法奠定坚实的理论基础。2.5小结2.5.1.成功建立了CEV感染乳鼠模型。2.5.2应用分子生物学方法和免疫学方法确定出ICR乳鼠是CEV的易感品系，6CEV感染ICR乳鼠的最低感染剂量是2×10TCID50。2.5.3发现CEV经过腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻等途径，均可感染乳鼠。2.5.4测定出ICR乳鼠感染CEV后带毒时间至少可持续16天。29 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究羊肠道病毒（caprineenterovirus，CEV）感染是近年新发的传染病，临床上以呼吸道和消化道症状为特征，病羊表现呼吸困难、发烧、严重腹泻、口腔黏膜有溃疡等症状。由于该病为国内新发疫病，其发病机制及防治并不清楚。小鼠模型在一定程度上不仅表现出与本体动物相似的症状，也表现出相同的组织感染，这为研究CEV-JL14致病机理奠定了重要的理论基础。在本研究中，我们已经成功建立了CEV-JL14感染乳鼠模型，为了进一步研究CEV-JL14的组织嗜性，本研究选取该病毒的易感小鼠品系ICR小鼠为动物模型，将收集到的组织做成石蜡切片。应用免疫组织化学、HE染色、组织病理学等方法确定病毒在小鼠体内的分布情况以及各器官组织的病理学变化，为进一步研究CEV-JL14的致病机理及寻找安全有效的防治方法奠定坚实的基础。3.1材料3.1.1病毒羊肠道病毒CEV-JLI4为本实验室分离，-80℃保存备用。经过2.2.2方法测-8.3定的病毒滴度为10/0.1mL。3.1.2各组织器官2.2.9中收集到的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、脑、肌肉等各组织器官。3.1.3主要试剂甲醇、甲醛、二甲苯、柠檬酸钠、30%H2O2、丙三醇均购自北京化学试剂公司；Tween20、DAB、AEC购自长春尚宝生物有限公司；GoatAnti-Rabbit（HRP）抗体购自华益生物有限公司；中性树胶、Solarbio伊红染色液、Enrlich苏木素均购自长春尚宝生物公司30 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究3.1.4主要仪器立式高压灭菌锅（上海博迅）；高速冷冻离心机（长沙湘智）；-80℃超低温冰箱（SANYO）；水平摇床（QILINBEIERTS-100）；78-1型磁力加热搅拌器（江苏金坛荣华仪器制造有限公司）；CX31OLYMPUS奥林巴斯生物显微镜（日本）；MICROMHM315LEICA轮转切片机；EC350-2石蜡包埋仪；KD-H烘干机、KD-P摊片机（浙江金华科迪仪器设备有限公司）；天孚牌系列电子天平（常熟市金羊砝码仪器有限公司）。3.1.510%中性福尔马林的配制40%的甲醛200mLNa2HPO413gKH2PO48gddH2O1800mL3.1.6苏木精-伊红染色（HE）相关溶液的配制①苏木素染液的配制（用于HE染色）苏木素2gNaIO30.4g明矾50gCH3COOH40mL无水乙醇33mLddH2O630mL甘油300mL先将苏木素溶于无水乙醇，用蒸馏水溶解明矾，甘油再与之充分混合，然后冰乙酸和NaIO3加入其中。31 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究②1%盐酸乙醇浓盐酸1mL70%酒精99mL③0.5%伊红染色液（醇溶）曙红（Eosin）0.5g80%酒精100mL3.1.7免疫组织化学（IHC）相关溶液的配制①10mM柠檬酸钠缓冲溶液的配制（pH6.0，0.05%Tween20）柠檬酸钠2H2O1.47gddH2O500mLTween20250μL在调节pH后，再加入Tween20。②Mayer’s苏木素的配制（用于AEC免疫组化）苏木素0.5g碘酸钠0.1g明矾25gCH3COOH10mLddH2O500mL明矾先溶于ddH2O中，再加入苏木素，使其充分溶解，再加入CH3COOH和NaIO4，加热到100℃，然后自然降到室温，最后进行过滤。③3%过氧化氢（溶液配好后4℃，避光保存）30%过氧化氢20mLddH2O180mL32 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究④磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）NaCl20gKCl0.5gNa2HPO48.95gKH2PO40.675gddH2O2500mL⑤封闭液（5%脱脂奶粉）脱脂奶粉1gddH2O20mL⑥HRP标记羊抗兔IgG稀释：1mLPBS中加入2μLHRP标记羊抗兔IgG，即将其稀释500倍⑦AEC显色液：按照试剂盒说明书将A、B液分别用蒸馏水稀释10倍，然后将等体积A和B液混匀，现配现用。3.2方法3.2.1组织的处理将收集到的心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、肌肉等器官组织置于10%中性福尔马林中固定48h，然后保存到75%的酒精中。固定后的组织用来制备石蜡切片，进行HE染色和免疫组织化学检查，以观察CEV感染乳鼠后，乳鼠体内上述各组织器官的病理变化和抗原分布。3.2.2石蜡切片的制作①固定：组织固定同3.2.1介绍的方法。②脱水：将固定好的组织进行修整，蒸馏水冲洗，然后依次放到50%酒精2h，60%酒精2h，70%酒精1h，80%酒精1h，90%酒精1h，95%酒精Ⅰ1h，95%酒精Ⅱ1h，100%酒精1h。③透明：二甲苯Ⅰ透明1h，二甲苯Ⅱ透明1h。33 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究④浸蜡与包埋：在60-65℃的温箱中进行浸蜡。将组织依次放于二甲苯和石蜡混合液（1:1）、石蜡Ⅰ、Ⅱ中，耗时2h。用加热后的石蜡对放入包埋框中的组织进行包埋，等到石蜡冷却凝固后，再取出石蜡块。⑤切片：切片厚度约为5μm。⑥贴片：将组织粘取在防脱载玻片上，在温度为42℃左右的展片机中进行，最后在60℃温箱中烘烤玻片3h，烘干。3.2.3苏木素-伊红染色（HE染色）①脱蜡：将玻片置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ分别脱蜡10min。②水化：100%酒精（Ⅰ、Ⅱ）各5min；95%酒精5min；90%酒精5min；80%酒精5min；70%酒精5min，自来水冲洗，去除酒精。③染色：苏木素染色15min，蒸馏水洗3次，1%盐酸酒精洗涤7-8s（约提5-8次），自来水冲洗10min，蒸馏水洗，70%酒精2min，80%酒精2min，伊红染色30-60s。④脱水：95%酒精（Ⅰ、Ⅱ）各5min，无水乙醇（Ⅰ、Ⅱ）各5min。⑤透明：二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）各5min。⑥封片：将中性树脂滴在组织上，盖上盖玻片，封片。⑦镜检，拍照片。3.2.4免疫组织化学（IHC）①脱蜡：将玻片按顺序放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10min。②水化：100%酒精（Ⅰ、Ⅱ）各5min；95%酒精5min；90%酒精5min；80%酒精5min；70%酒精5min，50%酒精5min，蒸馏水冲洗，去除酒精。③抗原修复：利用沸热修复法，用电磁炉将装有10mM柠檬酸钠缓冲溶液的烧杯加热到95℃左右，放入玻片，加热15min，然后关闭电源，使装有玻片的烧杯自然冷却到室温。之后用PBS冲洗玻片，每次5min。④消除内源性过氧化物酶的活性：将玻片放入3%过氧化氢溶液中15min。PBS冲洗玻片，每次5min。⑤封闭：滴加适量封闭液，使其充分覆盖组织，然后将玻片放在湿盒中，37℃孵育30min。34 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究⑥一抗：封闭后吸走封闭液，禁止用蒸馏水洗。在组织上滴加兔抗CEV高免血清，覆盖组织，置于湿盒中，37℃孵育60min。之后用PBS冲洗玻片，每次5min。⑦二抗：加适量的HRP标记的羊抗兔IgG二抗，使其充分覆盖组织，将玻片放到湿盒中，37℃放置45min。之后用PBS冲洗玻片，每次5min。一定要冲洗干净。⑧AEC显色：AEC按照产品使用说明书配制，现配现用。将适量的AEC加到组织上，使其充分覆盖组织，置于湿盒中，37℃避光显色10min，显色期间要不断观察显色情况，避免显色过深影响实验结果。显色后，用自来水冲洗玻片10min。⑨苏木素复染：将苏木素滴加在组织上，复染1min，自来水冲洗10min。⑩返蓝：将玻片放在PBS中浸泡10s，自来水冲洗10min，甘油封片，将玻片干燥后，在组织中央滴加一滴甘油，夹起盖玻片使其一边先接触甘油，慢慢放下盖玻片，封片。3.3结果3.3.1CEV感染乳鼠病理组织学变化观察用乳鼠脏器制备的切片，病理组织学发现，不同的组织器官均有不同程度的病理变化。①心脏病理变化：心脏HE切片显示，心肌间质水肿（图3.1I），并且心肌细胞变性，局部有淋巴细胞浸润（图3.1E、M、Q）。②肝脏病理变化：肝脏中有大量的淋巴细胞浸润（图3.1C、O），有炎性细胞浸润（图3.1G、K），肝细胞肿胀，发生颗粒变性和水泡变性（图3.1S）。③脾脏病理变化：淋巴细胞增多，细胞坏死，红髓区有炎性细胞聚集（图3.2M、Q）。④肺脏病理变化：肺泡壁增厚，炎性细胞浸润（3.2C、O），有明显的出血、淤血（3.2G、S）。⑤肾脏病理变化：肾小管上皮细胞颗粒变性（3.3E、M），有淋巴细胞浸润。35 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究⑥小肠病理变化：肠绒毛脱落（3.3C、G），小肠绒毛空泡变性，肠粘膜上皮细胞肿胀。⑦脑病理变化：神经元存在不同程度空泡变性，神经元变性坏死，数量减少（3.4E、I、M），脑室脉络丛大量淋巴细胞浸润（3.4Q）。⑧肌肉病理变化：局部间质水肿，大量淋巴细胞浸润，少量纤维组织增生（3.4G、K）。图3.1CEV不同途径感染乳鼠的心脏和肝脏微观病变（200）A、E、I、M、Q，C、G、K、O、S：分别为病毒经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径感染ICR乳鼠，其心脏和肝脏病理变化结果；B、F、J、N、R，D、H、L、P、T：分别为DMEM经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种ICR乳鼠，其心脏和肝脏阴性对照。36 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究图3.2CEV不同途径感染乳鼠的脾脏和肺脏微观病变（200）A、E、I、M、Q，C、G、K、O、S：分别为病毒经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径感染ICR乳鼠，其脾脏和肺脏病理变化结果；B、F、J、N、R，D、H、L、P、T：分别为DMEM经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种ICR乳鼠，其脾脏和肺脏阴性对照。37 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究图3.3CEV不同途径感染乳鼠的肾脏和小肠微观病变（200）A、E、I、M、Q，C、G、K、O、S：分别为病毒经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径感染ICR乳鼠，其肾脏和小肠病理变化结果；B、F、J、N、R，D、H、L、P、T：分别为DMEM经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种ICR乳鼠，其肾脏和小肠阴性对照。38 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究图3.4CEV不同途径感染乳鼠的脑和肌肉微观病变（200）A、E、I、M、Q，C、G、K、O、S：分别为病毒经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径感染ICR乳鼠，其脑和肌肉病理变化结果；B、F、J、N、R，D、H、L、P、T：分别为DMEM经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种ICR乳鼠，其脑和肌肉阴性对照。3.3.2CEV感染乳鼠的病理组织学病变程度为了更加精确和直观的了解病毒感染乳鼠其各组织器官的病变程度，根据病理评分标准，特列出下表。由此表可见，不同途径接种病毒的同一组织器官，其病变程度也不同。同一接种途径，不同组织器官的病变程度也不同。39 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究表3.1病毒感染引起的组织器官病变程度病毒接种方式各组织器官腹腔注射肌肉注射皮下注射灌胃滴鼻心脏++++++++肝脏+++++++++++脾脏++++++++肺脏++++++++++++肾脏+++++++++小肠+++++++++脑+++++++++肌肉+++++++“+”代表轻度组织病变；“++”代表中度组织病变；“+++”代表严重组织病变。3.3.3CEV在感染乳鼠体内的分布为了了解CEV在乳鼠体内的分布，应用IHC对各器官组织中的病毒抗原进行检测。结果在心肌细胞中，检测到大量的病毒抗原（3.5E、I、Q）。肝脏中，病毒主要位于肝索周围肝板细胞内（3.5O）。脾脏中，量少，主要在脾红髓。在肺脏中主要定位在肺泡管壁的上皮细胞中（3.6C、K、S）。肾脏中，主要定位于远曲小管上皮细胞。病毒弥漫性的分布于肠绒毛，以及肠黏膜的上皮细胞中。少量分布在在脑室脉络丛，也分布于神经胶质细胞中。在肌肉中也呈弥漫性分布。40 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究感染组对照组感染组对照组腹腔肌肉皮下灌胃滴鼻心脏肝脏图3.5CEV不同途径感染乳鼠的心脏和肝脏中抗原分布（200）A、E、I、M、Q，C、G、K、O、S：分别为病毒经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径感染ICR乳鼠，其心脏和肝脏中抗原的分布；B、F、J、N、R，D、H、L、P、T：分别为DMEM经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种ICR乳鼠，其心脏和肝脏阴性对照。41 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究图3.6CEV不同途径感染乳鼠的脾脏和肺脏中抗原分布（200）A、E、I、M、Q，C、G、K、O、S：分别为病毒经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径感染ICR乳鼠，其脾脏和肺脏中抗原的分布；B、F、J、N、R，D、H、L、P、T：分别为DMEM经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种ICR乳鼠，其脾脏和肺脏阴性对照。42 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究图3.7CEV不同途径感染乳鼠的肾脏和小肠中抗原分布（200）A、E、I、M、Q，C、G、K、O、S：分别为病毒经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径感染ICR乳鼠，其肾脏和小肠中抗原的分布；B、F、J、N、R，D、H、L、P、T：分别为DMEM经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种ICR乳鼠，其肾脏和小肠阴性对照。43 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究图3.8CEV不同途径感染乳鼠的脑和肌肉中抗原分布（200）A、E、I、M、Q，C、G、K、O、S：分别为病毒经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径感染ICR乳鼠，其脑和肌肉中抗原的分布；B、F、J、N、R，D、H、L、P、T：分别为DMEM经腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种ICR乳鼠，其脑和肌肉阴性对照。3.3.4CEV在感染乳鼠体内的分布情况为了更加精确和直观的了解病毒经过不同接种方式感染乳鼠其体内病毒的分布，根据免疫组化实验结果的判定标准，特列出下表。由此表可见，乳鼠经腹腔注射接种病毒时，肝脏、肺脏、肌肉中的病毒感染的阳性细胞多。经肌肉注射时，心脏中的病毒感染的阳性细胞多。皮下注射病毒时，肺脏和小肠中的病毒感染的阳性细胞多。经灌胃途径接种病毒时，肝脏中的多。乳鼠经滴鼻途径接种病44 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究毒时，肺脏和肌肉中病毒感染的阳性细胞多。表3.2CEV在组织器官分布情况病毒接种方式各组织器官腹腔注射肌肉注射皮下注射灌胃滴鼻心脏++++++++肝脏++++++++++++脾脏+++++++肺脏+++++++++++++肾脏++++++++小肠+++++++++脑+++++++肌肉++++++++++++“+”代表组织内CEV感染阳性细胞率低；“++”组织内CEV感染阳性细胞率较高；“+++”组织内CEV感染阳性细胞率非常高。3.4讨论CEV感染是国内新发疫病，发病率和死亡率都很高。然而，羊肠道病毒的感染机理尚不清楚，其如何有效防控也是兽医临床需要迫切解决的问题。动物模型在疾病的致病机制研究、药物、疫苗的开发中发挥非常重要的作用。我们前期已经成功建立了CEV-JL14感染的乳鼠模型，为了进一步研究CEV-JL14的组织嗜性。ICR乳鼠通过不同途径接种CEV后，病理组织学结果显示，心肌间质水肿，并且心肌细胞变性，局部有淋巴细胞浸润，结合免疫组化结果，说明该病毒可对心肌造成损伤。肝脏中有大量的淋巴细胞和炎性细胞浸润，肝细胞肿胀，发生颗粒变性和水泡变性，且病毒大量分布于肝脏肝索部位，说明通过损害动物体代谢进而对机体产生影响。脾脏淋巴细胞增多，细胞坏死，红髓区有炎性细胞聚集。肺脏肺泡壁增厚，炎性细胞浸润，有明显的出血、淤血，病毒主要分布在肺泡壁细胞，这与临床上病羊呼吸困难有关。肾脏肾小管上皮细胞颗粒变性，有淋巴细45 第三章羊肠道病毒感染的组织嗜性的研究胞浸润。肠绒毛脱落，小肠绒毛空泡变性，肠粘膜上皮细胞肿胀。脑神经元存在不同程度空泡变性，神经元变性坏死，数量减少，脑室脉络丛大量淋巴细胞浸润，能造成中枢神经系统疾病。肌肉局部间质水肿，大量淋巴细胞浸润，少量纤维组织增生，且病毒在肌肉内大量分布，说明病毒对肌组织有强烈的嗜性，对肌肉有很大的毒性。本研究通过免疫组织化学方法定位感染组织中的病毒，发现在心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、肌肉中均能检测到病毒，这与病理结果一致。但是，病毒量在心肌、肌肉、肝脏、肺脏中要高一些。本研究在脑组织中，发现有炎性细胞和病毒，说明该病毒有一定的嗜神经性。本研究成功建立了羊肠道病毒感染ICR小鼠模型，为CEV致病机制、疫苗研制及药物研究奠定基础。3.5小结3.5.1.应用HE方法确定出CEV感染乳鼠的病理组织学变化，发现在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、脑、肌肉等组织均有不同程度的细胞变性及炎性细胞浸润，其中以肝脏和肺脏病变程度严重。3.5.2.应用IHC方法确定出CEV在感染乳鼠组织的嗜性，发现病毒在各组织器官中均有不同程度的分布，其中以肺脏、肝脏和肌肉组织分布广泛。46 结论结论1.首次在国内建立了羊肠道病毒感染乳鼠的动物模型。确定了ICR乳鼠是羊肠道病毒的易感品系，发现羊肠道病毒经过腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻等途径，均可感染小鼠。确定了羊肠道病毒感染ICR乳鼠的最低感6染剂量为2×10TCID50，测定出ICR乳鼠感染CEV后带毒时间至少可持续16天。2.确定出CEV感染乳鼠病理组织学变化及病毒的组织亲嗜性，为进一步研究该病的致病机理、病毒感染诱导的免疫机理及疫苗研制奠定基础。47 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导师简介导师简介王新平，1963年1月生，博士，教授、博士生导师。现为中国畜牧兽医学会家畜传染病分会理事、中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会理事。1984年7月，毕业于山东农业大学的兽医专业，获农学学士学位；1987年7月，毕业于解放军兽医大学传染病与预防兽医学专业，获农学硕士学位，并留校任教；1996年7月，毕业于解放军农牧大学传染病与预防兽医学专业，获农学博士学位。1998年7月至2002年6月，在美国塞勒姆帝京大学、德州大学医学中心进行博士后研究；2002年6月至2005年10月，任美国伊利诺大学芝加哥分校任研究助理教授；2005年10月至2011年10月，任美国西北大学、芝加哥大学所属埃文斯顿健康研究所研究员；2010年9月-至今，任吉林大学动物医学学院教授。在国外工作期间，率先开展KSHV的分子病毒学及其致肿瘤机制、首次克隆出多种低等动物釉原蛋白基因，并对其功能及进化进行相关研究。在国内率先开展检测牛病毒性腹泻病毒抗原、BVD流行病学与防治、猪流行性腹泻病毒实验感染猪的排毒消长规律、牛新发肠道病毒感染等方面的研究。首次揭示出国内牛、羊和鹿群存在严重的牛病毒性腹泻病毒的感染；首次在国内猪群发现BVDV感染；在国内发病牛群首次分离出E种肠道病毒。先后主持国家自然科学基金、农业部、吉林省科委、解放军农牧大学校长基金等项目7项。作为主要参加者，参与美国国家自然科学基金、NIH等课题10余项。发表论文50余篇，获得军队科技进步二等奖4项，三等奖3项，第三届全国青年畜牧兽医科技工作者优秀论文一等奖1项。参与指导博士后、博士生和硕士生近30名。现为吉林省高层次创新创业人才，吉林大学国家重点学科-预防兽医学引进学术带头人。目前主持国家自然科学基金项目、国家重点研发项目子课题、吉林省重点科技攻关项目等共计四项。59 作者简介作者简介姓名：张群性别：女出生年月：1992年10月籍贯：山东省招远市政治面貌：群众学习经历：2011年9月-2015年6月，青岛农业大学动物医学专业学士；2015年9月-2018年6月，吉林大学兽医公共卫生学专业硕士。攻读学位期间发表的学术论文：[1]张群，鲁海冰，郭昌明，李欣，赵伦凯，胡俊英，王旭，王新平.羊肠道病毒与小反刍兽疫病毒混合感染及流行病学调查[J].中国兽医学报,2018,38(3):464-468.[2]XiaochunGai,QunZhang,HaibingLu,ZhangqingYang,LisaiZhu,XinLi,XinpingWang.AneonatalmurinemodelforevaluationofenterovirusEHY12virusinfectionandpathogenicity.PLOSONE.2018;13:e0193155.[3]刘亚静，李欣，张群，赵又霓，贾英琪，鲁海冰，郭昌明，朱利塞，王新平.吉林省不同地区牛肠道病毒的遗传变异与分析[J].中国兽医学报,2018,36(1):59-63.[4]郭昌明，张群，刘亚静，郭淳光，贾英琪，李欣，王新平.内蒙古乌兰浩特某羊群暴发小反刍兽疫的诊断[J].中国兽医学报,2018,38(04):650-654+661.[5]郭昌明，张群，刘亚静，鲁海冰，邢泽黎，邓颖瑞，朱利塞，郭淳光，王新平.双抗体夹心ELISA检测小反刍兽疫病毒抗原方法的建立及病原流行病学调查[J].中国兽医学报,2017,37(5):799-803.60 致谢致谢三年前，自己一个人拖着行李箱来到和平校区，对未来的研究生生活充满无限希望。一切仿佛还是昨天，直到最后要离开的时候，才会感叹时间飞逝。虽然在吉林大学和平校区只学习生活了三年，但是在这三年里我学到了很多，成长了很多。在这里我要真诚的感谢给我悉心帮助和关怀的人。首先，我要向我的导师王新平教授致以崇高的敬意和由衷的感谢，感谢您在我学习生活中给予的教导和关怀。您严谨而又创新的科研精神一直激励着我们，时刻要求我们实事求是、不断创新；您丰富的专业知识开阔了我们的科研思路，激发了我们对科研的热爱。在这三年里，您给了我很多学习锻炼的机会，我受益颇多，真诚的对您说声：“谢谢您，王老师”。其次，我要感谢师姐朱利塞和鲁海冰，在我最迷茫的时刻，一直耐心的指导我，使我一点一滴的掌握了实验技能。感谢刘丹和何佳师姐对我生活和学习上的帮助。感谢邢泽黎师兄、盖小春和王明月师姐对我实验上的帮助。感谢张泽财师兄耐心的帮我修改论文。感谢曾经帮助过我的郭昌明老师和曹玉峰博士。感谢和我一起奋斗在实验室的师妹们胡俊英、李欣、郑博伟、林倩、邓颖瑞、赵又霓和师弟们王旭、郭淳光、王浴光，感谢你们带给我的快乐和帮助，有你们的日子很开心。感谢提前毕业的同门袁悦和王方，一直开导我、支持我、帮助我。特别感谢与我相依相伴、不离不弃三年的同门刘亚静，你的存在使我的研究生生活不单调，而是更加精彩。最后，感谢我的家人对我的支持，你们是我最坚强的后盾。再次，感谢动物医学学院、人兽共患病研究所的所有领导和老师在我硕士期间给予的培养和关怀。61
