辛伐他汀含药血清对u937单核巨噬细胞mmp

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　　辛伐他汀含药血清对U937单核巨噬细胞MMP：刘金来,朱强锋,郝宝顺【摘要】【目的】探讨辛伐他汀含药血清对U937单核细胞源巨噬细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）表达与分泌的影响。【方法】15只新西兰大白兔随机分为正常对照组（NL,n=5）、粥样硬化模型组（AS,n=5）和辛伐他汀含药血清组（SIM,n=5）。通过喂养高脂饲料，建立兔动脉粥样硬化模型后，予辛伐他汀药液灌胃，获得含药血清。分别予不同浓度含药血清（5%、10%、20%）培养U937单核细胞源巨噬细胞24h，应用逆转录聚合酶链反应检测MMP-9mRNA及TIMP-1mRNA的表达，以及应用酶联免疫吸附试验检测MMP-9及TIMP-1蛋白的分泌。【结果】与相同浓度AS组比较，5%、10%、20%SIM组U937单核细胞源巨噬细胞MMP-9mRNA表达均显著性降低（P值为0.005、0.041和0.013）；5%、10%、20%SIM组TIMP-1mRNA表达无显著性差异（P值均>0.05）。而与相同浓度AS组比较，不仅10%、20%SIM组MMP-9分泌显著性减少（P值分别为0.009和0.001），而且10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显著性增加（P值分别为0.017和0.001）。【结论】辛伐他汀可抑制单核巨噬细胞MMP-9的表达和分泌，以及促进TIMP-1的分泌。【关键词】辛伐他汀；巨噬细胞；基质金属蛋白酶-9；金属蛋白酶组织抑制因子-1Abstract:【Objective】Toinvestigatetheeffectsofsimvastatindrug-serumontheexpressionandsecretionofmatrixmetalloproteinase-9andtissueinhibitorofmetalloproteinase-1inU937monocyte-derivedmacrophages.【Methods】FifteenNeizedto3groups,normalcontrolgroup(NL,n=5),atheroscleroticmodelgroup(AS,n=5)andsimvastatindrug-serumgroup(SIM,n=5).Therabbitatheroscleroticmodeledicatedvastatinliquorbygavagetopreparesimvastatindrug-serum.U937monocyte-derivedmacrophagesvastatindrug-serumfor24hours.ThemRNAexpressionandproteinsecretionofMMP-9andTIMP-1econcentrationASgroup,5%,10%,and20%SIMgroupsignificantlyinhibitedtheexpressionofMMP-9mRNAinU937monocyte-derivedmacrophages(P=0.005,0.041,and0.013),andtheexpressiondifferenceofTIMP-1mRNAeconcentrationASgroup,10%and20%SIMgroupnotonlysignificantlyinhibitedthesecretionofMMP-9inU937monocyte-derivedmacrophages(P=0.009and0.001),butalsosignificantlyincreasedthesecretionofTIMP-1(P=0.017and0.001).【Conclusion】Simvastatininhibitstheexpressionandsecretionof MMP-9andenhancesthesecretionofTIMP-1.Keyvastatin;macrophage;matrixmetalloproteinase-9;tissueinhibitorofmetalloproteinase-1冠状动脉粥样硬化斑块由稳定转为不稳定，继而破裂导致血栓形成是急性冠脉综合征最主要的发病机制[1,2]。斑块脂质核心大、纤维帽薄、巨噬细胞多是结构性易损斑块[3]。斑块内单核巨噬细胞聚集，基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMP）增多，金属蛋白酶组织抑制因子（tissueinhibitorofmetalloproteinases,TIMP）减少，导致斑块内胶原降解，纤维帽变薄，是斑块稳定性下降的重要原因[4,5]。临床研究显示他汀对急性冠脉综合征治疗有效，可能与改善内皮功能、抗炎及稳定斑块等调脂以外的作用有关［６］，但其具体机制尚未完全明确。本研究拟观察辛伐他汀含药血清对U937单核细胞源巨噬细胞MMP-9及TIMP-1表达与分泌的影响，以探讨辛伐他汀稳定斑块、治疗急性冠脉综合征的机制。1材料与方法1.1材料准备雄性纯种新西兰大白兔，体质量2.0~2.5kg，购自中山大学动物实验中心。人单核白血病细胞株U937细胞，购自中山大学动物实验中心细胞库。辛伐他汀药片，购自默沙东公司，实验时溶解于蒸馏水灌胃。RPMI1640培养基，购自Gibco公司。新生牛血清，购自PAA公司。佛波酯（PMA），购自Sigma公司。Trizolreagent，购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒，购自Fermentas公司。Taq酶购自Takara公司。PCR反应引物，由上海生工生物技术有限公司合成。人MMP-9、TIMP-1细胞上清ELISA试剂盒，购自RapidBio公司。1.2动脉粥样硬化模型建立及含药血清制备15只新西兰大白兔随机分为3组：正常对照组（normal,NL）、粥样硬化模型组（atherosclerosisgroup,AS）和辛伐他汀含药血清组（simvastatingroup,SIM），每组5只。正常对照组予普通饲料喂养12周，其余各组予高脂饲料（1%胆固醇、10%猪油、89%普通饲料）喂养10周后，每组随机处死1只，证实有大动脉粥样硬化形成后，继续高脂喂养至12周，其中SIM组于第11周起给予辛伐他汀5mg/kg，每天1次，灌胃14d。末次给药前禁食12h，给药后1h颈动脉无菌取血，分离血清，同组动物血清混匀，0.22?滋m滤膜过滤灭菌，-80℃保存备用。1.3细胞培养及干预U937细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI1640培养基中，置于含5%CO2，37℃ 培养箱中，待细胞生长至接近融合时传代，2~3代后用于实验。调整细胞密度为5×106/mL，接种于6孔培养板，加入PMA使终浓度为50ng/mL，培养48h后见悬浮生长的U937细胞分化为巨噬细胞，伸出伪足，贴壁生长。弃去旧培养基，PBS液洗涤后，予不含血清的RPMI1640培养基继续培养24h，弃去培养基。分别加入各含5%、10%、20%正常兔血清，5%、10%、20%粥样硬化兔血清，以及5%、10%、20%辛伐他汀含药血清的RPMI1640培养基，每组设3个平行组，培养24h用于RT-PCR实验。1.4总RNA提取吸净培养基，每孔加入1mL的Trizol液，吹打裂解细胞，收集于无RNA酶离心管中，室温静置5min。加入0.2mL氯仿,剧烈颠倒15s，室温静置3min，4℃，12000×g离心10min。转移上层水相液500?滋L到新的离心管，加入500?滋L异丙醇，室温静置10min，4℃，12000×g离心7min。弃上清，加入1mL无RNA酶水配制的75%酒精，振荡混匀，4℃，7500×g离心5min。重复酒精洗涤沉淀一遍，弃去酒精，室温干燥5min，融解RNA于30?滋L无RNA酶水中，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计测定RNA含量，计算出RT-PCR所需样品量。1.5RT-PCR取总RNA1.5?滋g，按逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA。以β-actin为内参照，进行半定量逆转录聚合酶链式反应。聚合酶链式反应：95℃5min预变性，94℃45s变性，56℃30s退火，72℃45s延伸，共35个循环，最后一次循环在72℃延伸7min。RT-PCR产物用含1.5%琼脂糖凝胶电泳，Labin离心10min，取上清，-80℃保存待检。ELISA采用双抗体夹心法，按照说明书步骤进行，测定细胞上清MMP-9、TIMP-1浓度。1.7统计学处理所有数据均以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，三组间比较用单因素方差分析，两组间比较用LSD-t检验，应用SPSS10.0统计分析软件进行统计分析，P<0.05为差异有显著性。不同浓度间SIM组MMP-9mRNA表达差别无统计学意义（F=1.747，P=0.252）。2.2辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞TIMP-1mRNA表达的影响NL组、AS组和SIM组不同浓度之间TIMP-1mRNA表达无显著差异（表2、图2）。5%、10%和20%SIM组之间TIMP-1mRNA的表达有显著性差异（F= 6.498，P=0.032）。与5%SIM组相比，10%、20%SIM组TIMP-1mRNA的表达显著性增加（P=0.039、0.014），而10%与20%SIM组之间无显著性差异（P=0.446）。2.3辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞MMP-9蛋白分泌的影响与同浓度NL组比较，10%、20%AS组MMP-9分泌均显著性增加（P=0.007、0.002）；5%、10%、20%SIM组MMP-9分泌无显著性差异（P=0.824、0.857、0.658）。与同浓度AS组比较，5%SIM组MMP-9分泌无显著性差异（P=0.427），10%、20%SIM组MMP-9分泌显著性减少（P=0.009、0.001，表3）。SIM组不同浓度之间MMP-9分泌无显著性差异（F=0.985，P=0.427）。2.4辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞TIMP-1蛋白分泌的影响与同浓度NL组比较，AS组TIMP-1分泌均显著性减少（P=0.004、0.044、0.003）；与同浓度NL组比较，5%SIM组TIMP-1分泌减少（P=0.038）。与同浓度AS组比较，10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显著性增加（P=0.017、0.001，表4）。SIM组不同浓度之间TIMP-1分泌有显著性差异（F=6.555，P=0.031）。与5%SIM组相比，10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显著性增加（P=0.038和0.014）。而10%和20%含药血清之间差异无显著性（P=0.456）。3讨论3.1MMP/TIMP与动脉粥样斑块稳定性急性冠状动脉综合征患者是易损病人[1]，通常指在冠状动脉粥样硬化的基础上，斑块破裂，继而血小板粘附聚集和血栓形成，引起完全或不完全的血管阻塞，导致不稳定型心绞痛、非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死及猝死。有报道[7-9]冠脉“罪犯”病变处多是软斑块、以正性重构为主，常伴血栓形成。斑块内细胞外基质过度降解，导致斑块中胶原含量减少，纤维帽变薄，是影响斑块稳定的重要因素。斑块破裂常发生在富含单核巨噬细胞的斑块肩部，此处巨噬细胞可分泌大量MMP，促进纤维帽降解[10]。MMP-9，又称明胶酶B，是巨噬细胞分泌的主要基质金属蛋白酶。TIMP是MMP的抑制物，目前已发现有4种：TIMP-1～TIMP-4，它们均可与激活的MMP呈1∶1结合，从而使MMP失活。用免疫组化方法检测动脉粥样硬化斑块显示TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3显著性增多，且多存在于斑块肩部的巨噬细胞、纤维帽和脂核内，与MMP分布部位一致，部分抑制MMP的活性[11]。急性冠脉综合征患者存在着由炎症反应导致的以MMP-9升高为主的MMP-9/ TIMP-1失衡状态[2]。因此MMP与TIMP之间的平衡，对斑块稳定性的调节具有重要意义。研究还表明[12]，MMP-9在转录水平上受多种细胞因子、生长因子及活性物质的调节，而TIMP的表达很少受细胞因子和生长因子的影响。本实验采用血清药理学方法观察到，与同浓度NL组相比较，5%、10%和20%AS组U937单核源巨噬细胞MMP-9表达均显著性增高（P值均<0.05）。这可能是因为粥样硬化血清中含有较高的低密度脂蛋白胆固醇，以及大量激活的炎性细胞因子、生长因子以及其他活性物质，促进MMP-9的表达。与相同浓度NL组比较，AS组TIMP-1mRNA表达无显著性差异，但TIMP-1的分泌均显著性减少（P<0.05），提示动脉粥样硬化血清不但可使巨噬细胞MMP-9增加，同时还可使TIMP-1分泌增加（翻译后水平）而表达（mRNA水平）并未增加，具体机制尚不清楚。3.2他汀药与MMP/TIMPPROVEIT（TIMI-22）研究[13]显示强化他汀治疗可使ACS患者30d的临床事件减少，在稳定的患者，使临床事件长期降低，但其具体机制尚未完全明确。Luan等[14]报道，西立伐他汀呈剂量依赖性抑制兔平滑肌细胞和巨噬细胞MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9，但对TIMP-1和TIMP-2无影响。本研究显示，与相同浓度AS组相比，5%、10%和20%SIM组MMP-9mRNA表达均显著性降低（P值<0.05）；10%、20%SIM组MMP-9蛋白的分泌显著性减少（P值均<0.01）。与相同浓度AS组相比，SIM组TIMP-1mRNA表达无显著性差异（P>0.05）；但10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显著性增加（P值均<0.01）。与Luan等[14]的报道有所不同，本研究显示辛伐他汀不但在一定剂量范围内可抑制巨噬细胞MMP-9的转录与分泌，而且增加TIMP-1的分泌。这可能是辛伐他汀稳定斑块、减少临床事件的机制之一。他汀具有多效作用（Pleiotropiceffects）[15]，除了调脂作用外，还有抗炎、改善内皮功能等作用。辛伐他汀可能通过抑制巨噬细胞MMP-9的转录与分泌，同时还增加TIMP-1的分泌，从而调节MMP与TIMP之间的平衡，起到稳定斑块的作用。【参考文献】FALKE，SHAHPK，FUSTERV.Coronaryplaquedisruption[J].Circulation，1995，92(3)：657-671.刘金来,关良劲,谢旭晶,等.急性冠状动脉综合征患者血浆基质金属蛋白酶及其抑制因子的变化[J].中国病理生理杂志，2004,20(10)：1921-1922. 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